Sem 14-Práctico. CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL
CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
Ing. SAMIA L. J. FERNANDEZ GÜIMAC
FACULTAD DE INGENIERA CIVIL Y AMBIENTAL
UNIVERSIDAD NACIONAL TORIBIO RODRÍGUEZ DE MENDOZA, AMAZONAS, PERÚ

1. Propósito /Objetivo (de la práctica):
• Conocer los fundamentos de las
principales técnicas de conteo de
microorganismos presentes en una
muestra, con énfasis en la técnica de la
cámara de Neubauer.
2. Fundamento Teórico
• Se denomina crecimiento al incremento en el número de
células en una población o al incremento de la masa
celular.
• Existen diversos métodos para evaluar el
tamaño de la población bacteriana presente
en una muestra determinada.
• Algunos de ellos son directos y otros
indirectos, en función de que cuenten
microorganismos o calculen otros parámetros
a partir de los cuales se puede inducir la
magnitud de la población microbiana.
MÉTODOS INDIRECTOS
• Se determina el número de células viables en una muestra.
• Requieren al menos 24 horas para el cultivo y la
interpretación de resultados.
• Se emplean medios de cultivo generales, enriquecidos,
selectivos y diferenciales. dependiendo de los
microorganismos a cuantificar.
a) Métodos de recuento de bacterias viables en placa

• Consiste en realizar diluciones sucesivas seriadas de la
muestra en agua, caldo o solución salina, etc (esterilidad)
con objeto de sembrar después, y la posterior incubación
(24-48 h) a la T° apropiada.
• Se usa una amplia serie de diluciones (por ejemplo 10 -4 a 10
-10) debido a que el número exacto de bacterias vivas en la
muestra suele ser desconocida.
• Se utiliza mucho el término: unidades formadoras de colonias
(U.F.C.).
• se establece que las condiciones óptimas de conteo se dan
cuando desarrollan entre 30 y 300 colonias por placa para
que sea un resultado estadísticamente confiable.
✓ Más de 300 colonias: TNTC (too numerous to count) (Muy
pegados)
✓ Menos de 30 colonias: (TFTC, too few to count)
(Estadísticamente no aceptable).
• Estos métodos se utilizan principalmente para la
cuantificación de bacterias, levaduras y hongos filamentosos.
• El número de unidades formadoras de colonias (UFC) de una
suspensión bacteriana puede determinarse mediante dos
técnicas: Siembra en superficie y siembra incorporada.
a.1 Siembra en superficie
Se deposita en la superficie de las placas que ya contienen el medio
de cultivo adecuado para cada microorganismo en estudio, 0.1 mL o
100 µl de cada dilución. Se realiza duplicado para cada dilución.
a.2 Siembra incorporada
Se procede de la dilución mayor a la menor, y se deposita 1 mL de
cada dilución en placas estériles, vacías, por duplicado.
Se agrega a cada placa 15 a 20 mL del medio de cultivo a emplear,
previamente fundido y mantenido a 45°C en baño o estufa.
Resultados de Recuento en placa:
El conteo de las colonias se
realiza con la ayuda de una
lupa como se observa en la
siguiente figura.
El tamaño de la población se calcula usando la siguiente fórmula:

Donde:
UFC : unidades formadoras de colonias.
N : número promedio de colonias
obtenidas para una dilución dada.
vol: volumen de inóculo (ml)
Inversa de dilución: Inversa de la dilución
Ejemplos:
1. Por el método de incorporación se obtuvo el siguiente resultado: 142
colonias en promedio de 3 cajas en la dilución 10 -4 . Calcular UFC/ml.
2. Suponiendo que la placa de dilución 10-6 se contaron 130 colonias.

Cuantas bacterias hay en 1 ml de muestra original?
b) Número más probable (NMP)
• Se basa en la determinación de la presencia o ausencia de un
determinado tipo de microorganismo (en función de que crezcan
o de que produzcan determinada reacción en el medio).
• Según el tipo de microorganismo que se desea contar se utilizan
medios de enriquecimiento selectivos, o medios de propagación
c) Filtros por membrana

• consiste en hacer pasar un volumen determinado de muestra
líquida, o solución en agua o en solvente apropiado a través de
un filtro de membrana estéril (diámetro 50 mm, poro 0.45 um)
en un equipo de filtración.
• Luego de enjuagar con soluciones estériles apropiadas se retira el
filtro, y se lo coloca sobre la superficie de una placa de Petri con
el medio de cultivo a utilizar y se incuba. Transcurrido el tiempo
de incubación, se cuentan las colonias desarrolladas en el filtro.
MÉTODO DIRECTOS
• Se determina el número total de células presentes (viables y
no viables) en una muestra.
• Permite determinar el número de células microbianas, por
observación a través del microscopio.
• Se basa en contar microorganismos utilizando frotis
coloreados o cámaras de recuento como de Neubauer.
• Son técnicas comunes, rápidas y baratas que utiliza un
equipamiento fácilmente disponible en un laboratorio de
microbiología.
• La muestra puede utilizarse sin diluir (leche, o cultivos puros
en medio líquido), o puede prepararse una dilución tal como
se realiza para otros métodos de recuento.
a) Metodo de Breed:
• Técnica de laboratorio que se utiliza para el recuento de
microorganismos en la leche.
• Consiste en que un volumen conocido de la muestra (0.01 ml)
se extiende sobre un portaobjetos normal en una superficie
conocida.
• Se examina en un microscopio calibrado, donde se conoce el
diámetro del campo del microscopio.
b) Contador electrónico:
Se utiliza el contador Coulter, recuenta el número de células
suspendidas en un líquido, a su paso por un orificio por donde fluye
la corriente eléctrica.
Se puede determinar a su vez el tamaño de las células pero NO
distingue entre viables, muertas o partículas.
Ofrece resultados precisos con
células grandes, pero no es eficaz
para el conteo de bacterias debido a
la interferencia con partículas
pequeñas.
Permite realizar recuentos de
bacterias, levaduras no filamentosas
y protozoarios, pero no de hongos y
microorganismos filamentosos o
miceliares.
c) Camara de Petroff-Hausser:
Son portaobjetos excavados modificados sobre cuya superficie está
marcada una rejilla con pequeños cuadrados de área conocida.
Se utilizan para contar el número de células por unidad de
volumen de suspensiones bacterianas.
Para trabajar se cubre con un portaobjetos y por capilaridad se
introduce la muestra .
d) Camara de Neubauer:
• Es una cámara que está diseñada de manera de contener una
cantidad fija de líquido.
• Consta de un cuadrado central de 1 mm de lado dividido en 25
cuadraditos. Cada uno de ellos está, a su vez, dividido en 16
cuadrados.
• Se coloca un cubreobjetos sobre la zona cuadriculada, de
manera que queda una distancia de 0.1 mm entre el
cubreobjetos y la cámara.
• Esto determina que el líquido quede contenido en toda la
cámara un volumen es de 0.1 mm3.
• Vol. del cuadrado chico= área (mm2) x altura (mm)
= 0,0025 mm2 x 0,1 mm = 2,5 x 10-4 mm3
= 2,5 x 10-7 mL
• Vol. del cuadrado mediano = 2,5 x 10-7 x 16 = 4.0 x10-6 mL
Fórmula:
Células/mL= V * C * FCuL * FCmL * DL
V= Número de células viables contadas
C= Número de cuadrantes = 5
FCuL= Factor de conversión a uL= 10
FCmL= Factor de conversión a mL= 10000
DL= Dilución = 1x101= 10
Técnica de cuenta directa encámara de Neubauer
1. Se coloca 1 mL de la muestra en un tubo de ensayo a 9 mL solución
de Tween 80 al 0.1%.
2. Mezclar y dejar en reposo durante 5-10 minutos.
3. Lavar cuidadosamente la cámara de Neubauer sin frotar la zona
brillante del centro y el portaobjetos. Secar con papel suave.
4. Colocar el portaobjetos sobre la zona central limitada por dos
excavaciones laterales, donde se aprecian una zona cuadriculada a
simple vista.
5. Homogeneizar perfectamente la muestra en un vórtex, tomar
inmediatamente una muestra con una pipeta, y depositar una gota
entre la cámara y el cubreobjetos por el borde de la cámara.
6. Dejar que la muestra se distribuya por capilaridad, evitando el exceso
que dificultará la evaluación precisa de la población microbiana.
7. Dejar reposar durante 5 minutos.
8. Colocar la cámara en la platina del microscopio y localizar con el
objetivo 10X la zona cuadriculada.
9. Ubicar con 40X y leer el cuadro del centro.

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a) Métodos de recuento de bacterias viables en placa

El tamaño de la población se calcula usando la siguiente fórmula:

2. Suponiendo que la placa de dilución 10-6 se contaron 130 colonias.

c) Filtros por membrana

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