Metodologia para Tesis

METODOLOGIA
ENUMERACION DE MICROORGANISMOS AEROBIOS VIABLES

De la muestra orgánica se sacara 10 ml y se deposita en un matraz de 90 ml de
-1
caldo peptonado al 0.1 % que va ser la dilución 10 ., luego se saca un 1 ml y se
-2
lleva a un tubo con caldo peptonado con 9 ml que va ser la dilución 10 de igual
-3
modo para la dilución 10 y 10 -4 dela ultima dilución se saca un inoculo de 1ml y
se lleva a una placa esterilizada vacia por duplicado se le adiciona el Agar Play
count .Se homogeniza 5 veces a la derecha y 5 veces a la izquierda y formando el
numero 8 y dejar solidificar e incubar a temperatura 37 °C por 24-48 horas.Hacer
el conteo en el contador de colonias y aplicar la siguiente formula :
m.o /ml de agua =N ° de colonias x inoculo de siembra x factor de dilución
Se saca promedio de las 2 placas y se encuentra el número de m.o
ENUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS COLIFORMES TOTALES

Método Número más Probable
De la muestra orgánica se saca 10 ml a un matraz de 90 ml de caldo peptonado

que va ser dilución 10-1 , luego se saca 1 ml para dilución 10 -2 .Para la prueba
presuntiva se reparte 1ml en 3 tubos de Caldo Brilla con su tubito de DURHAM
invertidos para las diluciones 10 -3 y 10-4 de igual manera se lleva a 35°C - 37°C
por 24 - 48 horas ;se verifica la producción de gas en los DURHAM cada 24
horas .Se determina el índice NMP de la tabla y se calcula NMP por 100 ml con la
formula :
Indice NMP ( TABLA ) X DILUCION INTERMEDIA

NMP/100 ml =
100
Para la prueba confirmada se utiliza tubos con 9 ml de caldo lactosado con tubitos
de DURHAM invertidos. Se toma una asada de los tubitos de Brilla positivos a gas
y se repica en caldo lactosado y se llevan a incubación a 35°C – 37°C por 24 - 48
horas .Se determina el índice encontrado.Para la prueba completada los tubos
positivos se siembran en medios sólidos, EMB, ENDO O MACCONKEY .Se lleva
a incubación a 37°C por 24 horas. Si aparece colonias lactosa positiva son
coliformes.
ENUMERACIÓN DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES

(Escherichia Coli Termotolerantes)
Método Número más Probable
Se saca 10 ml de la muestra orgánica y se llevó a un matraz de 90 ml de caldo
peptonado al 0.1 % va ser la dilución 10 -1 luego se saca 1 ml para dilución 10 -2
para la prueba presuntiva se siembra en 3 tubos con 9 ml de caldo lactosa Bilis
Verde Brillante (Brila) caldo triptosa o lauril sulfato y tubito de DURHAM invertidos
hasta la dilución 10-4 se lleva a incubar a 35°C o 37°C por 24 - 48 horas .Se
verifica la producción de gas en los tubitos DURHAM cada 24 horas.
Para la prueba confirmada se utiliza tubos con 9 ml de caldo E.C. (E. coli) con
tubitos DURHAM invertidos. Se toma una asada de los tubos Brila positivos a gas
y se repica en caldo E .C. Se lleva a incubación a 44.5 °C – 45.5 ° C por 24 - 48
horas; se observa la producción de gas atrapado en los DURHAM .Se determina
el índice de NMP de la tabla y se calcula NMP por 100 ml con la fórmula:
Indice NMP ( TABLA ) X DILUCION INTERMEDIA

NMP/100 ml =
100
Para la prueba completada de los tubos positivos se siembran en EMB, ENDO,

MACCONKEY y se lleva a incubación a 37°C por 24 horas. L as colonias lactosa
positiva con brilla metálico se repica en medios del IMVIC y TSI si los son Indol +,
RM+, VP –, CITRATO -, TSI A/A gas +H2S es Escherichia Coli.
DETERMINACIÓN DE SALMONELLA
De la muestra orgánica se saca 10- 25 ml y se deposita en un matraz de 90 - 225
ml de caldo peptonado al 1 % y se lleva a incubar a 37°C por 24 - 48 horas que va
ser la prueba de pre enrrequicimiento.
Para la prueba de enrrequicimiento selectivo se saca 10 ml y se siembra en caldo
tetrationato y caldo celenita CISTINA y se incuba los matraces entre 42 -43 ° C
por 24 - 48 horas verificar su desarrollo.
Para la prueba selección se siembra con aza en plazas con : A gar verde brillante
con rojo de fenol(VBRF) y/o agar sulfito de bismuto (SB) por duplicado incubar por
24 - 48 horas A 37° C se puede utilizar el agar SS ,Salmonella shiguella.En el agar
SS se observa colonias no fermentosadas de lactosa con el centro oscuro.
Para la prueba de confirmación presuntiva se repica en TSI si da como resultado

K/A gas (burbujas9 positivo H2S (color negro) positivo es Salmonella.
Para la prueba confirmación bioquímica se repica sobre medios de identificación
bioquímica Indol (-) , RM (+) ,VP (-) ,UREA (-) ,CITRATO (+) ,LIA
Descarboxilación positivo (color púrpura) K/k .
DETERMINACIÓN DE STAPHYLOCOCUS AUREOS

De la muestra orgánica se saca 10 ml y se lleva a un matraz de 90 ml de caldo
-1
peptonado al 0.1 % que va ser la dilución 10 .Se saca un 1 ml y se deposita en
-2
un tubo con 9 ml de caldo peptonado al 0.1 % que va ser la dilución 10 de igual
-3
manera para la dilución 10 de la última dilución sembrar con el aza de siembra
un inoculo 0.25 ml en placas de manitol salado por estrías e incubar a 37°C por 24
-48 horas.Hacer la lectura si hay fermentación del manitol ,se observa colonias
amarillas que va ser Staphylococcus áureos ; si son colonias blanquecinas son
Staphylococcus Epidermides; Se hace la lectura presencia y/o ausencia.
DETERMINACION DE VIBRION CHOLERAEA

De la muestra orgánica se toma 10 ml y se deposita en un matraz con 90 ml de
-1
cloruro de sodio al 4% que va ser la dilución 10 ,luego se saca 1 ml y se lleva a
-2
un tubo con 9ml de NaCl que va ser la dilución 10 de igual modo para la dilución
-3
10 ; luego hacer el proceso de incubación en tubos de caldo GSTB por cada
dilución incubar a 35°C por 18 horas.
Sembrar en Agar de sucrosa sal filar ,citrato y tiosulfato (TCBS) por estrias por 24 -
48 horas.Verificar los resultados colonias redondas de 2 -3 mm con centro azul o
verde o amarillos.Hacer el conteo con presencia y ausencia ; en los ensayos
bioquímicos sembrar en agar TSI (-) si gas ,sin H2S.
ENUMERACION DE FUNGI(mohos y levaduras)

De la muestra orgánica se sacara 10 ml y se deposita en un matraz de 90 ml de
-1
caldo peptonado al 0.1 % que va ser la dilución 10 , luego se saca un 1 ml y se
-2
lleva a un tubo con caldo peptonado con 9 ml que va ser la dilución 10 de igual
-3 -4
modo para la dilución 10 y 10 dela ultima dilución se lleva a placas vacías
esterilizadas un inoculo de 1ml ;luego se adiciona 20 ml de Agar Saburaud
glucosado 4% y antibiótico ; dejat sodificar las placas con el medio Saburaud,llevar
a incunbacion las placas de agar saburoud a incubar a temperatura ambiente de
24 a 72 horas.Verificar presencia de colonias fungi y calcular el numero de fungi
aplicando la formula:
m.o fungi = N° colonias x inoculo de siembra x factor dilucion
MICROCULTIVO PARA IDENTIFICAR FUNGI
Para la identificación de los fungi se identificará por medios del microcultivo que
consiste en una placa Petri contenido un soporte de vidrio en forma de herradura
un porta y un cubre objeto todos esteriles.
La placa petri con medio Agar de Saburaud glucosado 4 % dividido en cubitos de

20 x20 x10 mm cada cubico ; se colocará sobre el porta dentro de la placa de
microcultivo. S e necesitara el cultivo primario de un fungi aislado de la muestra de
investigación.Se elige la colonia de fungi con la ayuda de una aza micológica,
tomar un inoculo de la misma y trasladarla sobre el cubito del medio de saburaud
que se ha colocado sobre el prta dentro de la placa de microcultivo .Colocar el
cubre sobre el cubito de Agar ,ponerdentro de laplaca un algodón húmedo .La
placa de microcultivo se lleva a incubación a Temperaturs ambiente por 3 a 5 dias
cada dia se debe verificar si el algodón todavía sigue húmedo. Al término de la
incubación retirar suavemente con ayuda de una pinza el cubre de la placa de
microcultivo y colocarla sobre un porta limpio y desengrosado a el que se le ha
colocado previamente 2 a 3 gotas de azul de amma con papel secante absorber
el exceso de colorante .Sellar los lados laterales con bálsamo de canada diluido o
esmalte de uña trasparente.Luego eliminar el cubito de medio saburaud llevándole
a un recipiente con solución sulfocronica retirar el porta de la placa de microcultivo
y agregarl 2 a 3 gotas de azul de amma ,añadir un cubre limpio y desengrosado
con papel secante absorber el exceso de colorante .Sellar los lados laterales con
bol como de cansada diluido o con esmalte de uña transparente .observar con el
objetivo 40x en el microoscopio.
AISLAMIENTO DE BACTERIA
De la muestra procesada se sacara 10 ml y se deposita en un matraz de 90 ml de
caldo peptonado al 1% o caldo BHI.Luego se lleva a incubar a una temperatura de
37 °C a 2-4 horas.Luego sembrar en los medios de cultivo agar manitol
salado,agar macconkey ,agar cleed por estrías; incubar a una temperatura
ambiente 37°C por 24 a 48 horas, verificar los resultados por placa y hacer
pruebas bioquímicas de las colonias que crecen en el agar macconkey ,agar cleed
en los medios de diferenciación bioquímica Indol, rojo de metilo ,voges
poskauer,citrato de simons,TSI,LIA,malonato ,agar urea.
Sembrar en los diferentes medios de cultivo con su método de siembra; los caldos
se siembra por enjuague,los picos de flauta se siembra por puntura y estrías los
tubos inclinados en columna por puntura. Luego se incuba a temperatura 37°C por
24 a 48 horas. Verificar los resultados, para la prueba Indol se adiciona 2 a 3 gotas
del reactivo de KOVAC, para la prueba de rojo de metilo se adiciona 2 a 3 gotas
del reactivo de rojo de metilo para la prueba voges poskauer el KOH al 4 % mas
alfanaptol y las demás pruebas de acuerdo a su reacción. Para los resultados se
compara con la tabla de diferenciación bioquímica.

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ENUMERACION DE MICROORGANISMOS AEROBIOS VIABLES

m.o /ml de agua =N ° de colonias x inoculo de siembra x factor de dilución

Se saca promedio de las 2 placas y se encuentra el número de m.o

ENUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS COLIFORMES TOTALES

De la muestra orgánica se saca 10 ml a un matraz de 90 ml de caldo peptonado

Indice NMP ( TABLA ) X DILUCION INTERMEDIA

ENUMERACIÓN DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES

Indice NMP ( TABLA ) X DILUCION INTERMEDIA

Para la prueba completada de los tubos positivos se siembran en EMB, ENDO,

Para la prueba de confirmación presuntiva se repica en TSI si da como resultado

DETERMINACIÓN DE STAPHYLOCOCUS AUREOS

DETERMINACION DE VIBRION CHOLERAEA

ENUMERACION DE FUNGI(mohos y levaduras)

m.o fungi = N° colonias x inoculo de siembra x factor dilucion

MICROCULTIVO PARA IDENTIFICAR FUNGI

La placa petri con medio Agar de Saburaud glucosado 4 % dividido en cubitos de

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