Detección, aislamiento e identificación de Salmonella spp.

en muestras de

alimentos

(Procedimiento según International Standard ISO 6579: 2002)

1. OBJETIVO

El presente procedimiento tiene como objetivo describir la metodología llevada a cabo por el
Laboratorio de Microbiología para realizar la detección, aislamiento e identificación de
Salmonella spp. en muestras de alimentos.

2. ALCANCE

Este procedimiento se aplica para realizar la detección, aislamiento e identificación de

Salmonella spp. en muestras de alimentos.

La confirmación de Salmonella spp. se realiza por propiedades bioquímicas y serológicas.

NOTA: las cepas aisladas deben ser enviadas al Centro de Referencia Instituto Nacional de
Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S "Dr. Carlos G. Malbrán", para una mayor tipificación.

3. DESARROLLO

3.1. Medios de cultivo, reactivos, materiales y equipos

3.1.1. Agua peptona bufferada (BPW)

3.1.2. Caldo Rappaport - Vassiliadis con soja (caldo RVS)

3.1.3. Caldo Müller - Kauffmann tetrationato + novobiocina (MKTTn)

3.1.4. Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)

3.1.5. Segundo medio sólido selectivo: a elección del laboratorio. Se deben

seguir las instrucciones del laboratorio para su preparación

3.1.6. Agar nutritivo (AN)

3.1.7. Agar triple sugar iron (TSI)

3.1.8. Agar urea (según Christensen)

3.1.9. Caldo lisina decarboxilasa

3.1.10. Reactivo para la detección de ß-galactosidasa (o discos siguiendo las instrucciones del
fabricante)

3.1.11. Reactivos para la reacción de Voges-Proskauer (VP)

3.1.12. Reactivos para la reacción de Indol

3.1.13. Agar nutritivo semisólido

3.1.14. Solución salina fisiológica

3.1.18. Autoclave

3.1.19. Horno o cabina de secado, ventilada por convección, capaz de operar entre 37°C y 55°C
3.1.20. Estufa de incubación a 37°C ± 1°C

3.1.21. Baño de agua o estufa de incubación a 41.5°C ± 1°C 3.1.22. Baño de agua capaz de
operar entre 44°C a 47°C 3.1.23. Baño de agua a 37°C ± 1°C

3.1.24. Ansa de platino o niquel de aprox. 3 mm de diámetro o 10 μl. 3.1.25. Peachimetro

calibrado con exactitud de 0.1 unidad de pH a 20°C a 25°C.

3.1.26. Pipetas graduadas o automáticas de 10 ml y 1 ml de capacidad nominal, graduadas en

0.5 ml y 0.1 ml respectivamente. 3.1.27. Tubos o frascos de capacidad apropiada.

3.1.28. Placa de Petri de vidrio o plástico de 90 a 100 mm de diámetro y de 140mm de

diámetro.

3.2. Principio El método está basado en las siguientes etapas:

3.2.1. Pre-enriquecimiento en medio líquido no selectivo: La muestra se siembra en agua

peptona bufferada (BPW) a temperatura ambiente y luego se incuba a 37°C ± 1°C durante 18 h
+ 2 h. Para ciertos tipos de alimentos se utilizan enriquecimientos específicos. (3.3.1.)

3.2.2. Enriquecimiento en medio líquido selectivo: La muestra obtenida en la etapa 3.2.1. se

inocula en los siguientes medios líquidos:

Caldo Rappaport - Vassiliadis con Soja (RVS): se incuba a 41.5°C ± 1°C durante 24 h±3h.

Caldo Muller - Kauffmann tetrationato/ novobiocina (MKTTn): se incuba a 37°C ± 1°C durante
24 h± 3 h.

3.2.3. Aislamiento en medio selectivo y diferencial: Del cultivo obtenido en la etapa 3.2.2 se
inoculan dos medios sólidos selectivos Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)

Otro medio sólido selectivo, complementario al XLD, apropiado para el aislamiento de

Salmonella lactosa positiva y cepas de Salmonella Typhi y Paratyphi. El laboratorio debe elegir
el medio a utilizar.

El agar XLD se incuba a 37°C ± 1°C durante 24h ± 3h. El segundo medio selectivo es incubado
de acuerdo a las recomendaciones del fabricante.

Nota: Como segundo medio selectivo se puede utilizar el agar verde brillante o agar bismuto
sulfito.

3.2.4. Confirmación de colonias presuntivas aisladas: Las colonias sospechosas de Salmonella

son reaisladas y su confirmación se realiza por propiedades bioquímicas y serologia.

3.3. Procedimiento

3.3.1. Preenriquecimiento Para la preparación de la suspensión inicial se utiliza en general

como diluyente Agua Peptona Bufferada (BPW). Si la cantidad de la porción a analizar es mayor
de 25 g utilizar la cantidad necesaria del diluyente de preenriquecimiento para llevar a una
dilución 1/10.

NOTA: Preparación de muestras compuestas (pool)

Cuando se necesita analizar más de una porción de 25 g de un lote específico o un alimento y

cuando existe evidencia disponible que la formación de pools no afecta los resultados de una
muestra en particular, se pueden analizar muestras compuestas. Por ejemplo, en caso de
analizar 10 muestras de 25 g. combinar las 10 muestras para formar una muestra de 250 g y
agregar 2,25 1 del caldo de preenriquecimiento. Alternativamente 0.1ml (en 10 ml de caldo
RVS) y 1 ml (en 10 ml de MKTTn) del caldo de preenriquecimiento provenientes de 10
muestras separadas pueden ser combinadas para un enriquecimiento en 100 ml del caldo para
enriquecimiento selectivo.

Enriquecimiento para chocolate y alimentos que contienen chocolate (ej. más de un 20%):
agregar al BPW 50 g/l de caseína (evitar el uso de caseína ácida) o 100 g/l de leche en polvo
descremada estéril. Después de 2 horas de incubación agregar 0.018 g/l de verde brillante si el
alimento es sospechoso de tener una alta contaminación con flora Gram positiva.

Enriquecimiento para alimentos ácidos: asegurarse que el pH no caiga por debajo de 4.5
durante el preenriquecimiento. En este caso el pH es más estable si se utiliza agua peptona
bufferada (BPW) doble concentración. Incubar el preenriquecimiento a 37°C ± 1°C durante 18
h ± 2 h.

3.3.2. Enriquecimiento selectivo Transferir 0.1 ml del cultivo obtenido en 3.3.1. a un tubo con
10 ml de caldo RVS e incubar a 41.5 C° ± 1°C durante 24 h ± 3 h. Transferir 1 ml del cultivo
obtenido en 3.3.1. a un tubo con 10 ml de caldo MKTTn e incubar 37°C ± 1°C durante 24 h ± 3
h.

Nota: Se recomienda utilizar baño de agua o estufa de incubación con aire forzado para
asegurar que la temperatura máxima no exceda los 42.5°C.

3.3.3. Aislamiento e identificación Tomar un ansada de los cultivos obtenidos en 3.3.2. (caldo
RVS y MKTTn) y estriar en una placa de agar XLD. Utilizar las placas de Petri grandes ó 2 del
menor tamaño usando el mismo ansa. Proceder de la misma manera con el segundo agar
selectivo. Incubar las placas de XLD a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 3 h y el segundo agar selectivo
de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Examinar las placas después de la incubación para la determinación de la presencia de colonias

típicas de Salmonella y colonias atípicas que podrían ser Salmonella (ver nota).

Las colonias típicas de Salmonella en el agar XLD son transparentes, del mismo color del medio
con centro negro.

Nota: las colonias de Salmonella H₂S negativo (ej. S. Paratyphi A) en el XLD son rosadas con un
centro rosa oscuro y las de Salmonella lactosa positivas son de color amarillo con o sin centro
negro.

3.3.4. Confirmación bioquímica

Para la confirmación por propiedades bioquímicas pueden utilizarse kits comerciales para los
cuales deben seguirse las instrucciones del fabricante. Para la confirmación tomar de cada
placa de Petri (2 placas del menor tamaño o una del mayor tamaño) de cada medio selectivo
(ver 3.3.3.) al menos una colonia típica o sospechosa de Salmonella y 4 colonias más si la
primera es negativa.

En el caso de estudios epidemiológicos se recomienda tomar al menos 5 colonias para la

confirmación. Si en algunas de las placas hay menos de 5 colonias sospechosas confirmar todas
las colonias sospechosas.
Seleccionar las colonias sospechosas y estriar por agotamiento en superficie en placas de agar
nutritivo para obtención de colonias aisladas. Incubar las placas a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 3
h.

Para la confirmación bioquímica y serológica utilizar cultivos puros.

Agar TSI: con una aguja de inoculación hacer una punción en el fondo y estriar el pico de
flauta. Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 3 h. Interpretación:

Fondo: amarillo: glucosa positivo rojo o sin cambio: glucosa negativo egro: formación de H₂S

burbujas o ruptura de agar: formación de gas a partir de la glucosa

Pico de flauta: amarillo: lactosa y/o sucrosa positivo

rojo o sin cambio: lactosa y sucrosa negativo.

Las cepas típicas de Salmonella dan reacción alcalina (color rojo) en el pico de flauta y ácida
(color amarillo) en el fondo, con formación de gas y

(en aproximadamente en el 90% de los casos) formación de H₂S (ennegrecimiento del agar).

En presencia de una Salmonella lactosa positiva el pico de flauta del TSI es de color amarillo.
Por esto la confirmación preliminar de Salmonella no debe basarse solamente en los
resultados del TSI.

Agar urea: Con un aguja de inoculación estriar el pico de flauta.Incubar a 37°C ± 1°C durante 24
h ± 3 hy examinar en intervalos.

Reacción positiva: por hidrólisis de la urea se libera amonio que vira el color del indicador rojo
de fenol a rosa y luego a color cereza. La reacción generalmente aparece después de 2 h a 4 h.

Caldo L-Lisina decarboxilasa: a partir del cultivo puro inocular con una aguja de inoculación por
debajo de la superficie del caldo. Incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.

Reacción positiva: coloración violeta

Reacción negativa: coloración amarilla

B- Galactosidasa: Utilizar discos siguiendo las instrucciones del fabricante.

Medio para Voges- Proskauer (VP): Resuspender un ansada de la colonia sospechosa en un

tubo estéril con 3 ml de caldo VP, Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 3 h después de la
incubación agregar 2 gotas de la solución de creatina, 3 gotas de la solución alcohólica de 1-
naftol y 2 gotas de la solución de KOH; agitar después del agregado de cada reactivo.

Medio para reacción de indol: Resuspender una ansada de la colonia sospechosa en un tubo
estéril con 5 ml de caldo triptona - triptofano. Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 3 h. Después
de la incubación agregar 1 ml de reactivo de Kovacs.

Reacción positiva: formación de un anillo rojo

Reacción negativa: formación de un anillo amarillo - marrón.

suspensión turbia y homogénea. Mover la placa de vidrio en circulos por 30 a 60 segundos.

Observar el resultado contra un fondo oscuro preferiblemente con ayuda de una lupa. Si se
observa aglutinación la reacción es considerada
positiva.

3.3.5.5. Determinación del antigeno H: Inocular un agar nutritivo semisólido con el cultivo
puro, incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 3 h. Utilizar este cultivo para determinación del
antigeno H.

Colocar una gota del suero anti H en una placa de vidrio, con un ansa dispersar parte de la
colonia para obtener una suspensión turbia y homogénea. Mover la placa de vidrio en circulos
por 30 a 60 segundos. Observar el resultado contra un fondo oscuro preferiblemente con
ayuda de una lupa. Si se observa aglutinación la reacción es considerada positiva.

3.3.6. Interpretación de reacciones bioquímicas y serológicas

Reacciones Auto - aglutinación Reacciones Iterpretacion

bioquímicas serológicas
Típica No O,Vi o H positivo Considerada
Salmonella
Típica No Todas las reacciones Puede ser
negativas Salmonella
Típica Si No testeado Puede ser
Salmonella
No Típica No/si O,Vi o H positivo Puede ser
Salmonella
NO Típica No/si Todas las reacciones No es considerado
negativas Salmonella

3.3.7. Tipificación

Una vez identificado el microorganismo como Salmonella spp. por propiedades bioquímicas y
serológicas, la cepa debe ser enviada al Centro de Referencia Instituto Nacional de
Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S "Dr. Carlos G. Malbrán", para una mayor tipificación.

3.3.8. Expresión de los resultados

De acuerdo a los resultados de la interpretación (3.3.6) indicar presencia o ausencia de
Salmonella en la cantidad de muestra analizada (por gramos o mililitros para muestras
líquidas)

3.3.9. Control positivo

Junto con la muestra realizar un control positivo con un inóculo de una cepa de Salmonella
spp. de referencia y proceder de la misma manera que la muestra para demostrar que el
cultivo positivo es recuperado.

4. ANEXOS

ANEXO 1: Diagrama de flujo del procedimiento para la detección de Salmonella spp.

Preenriquecimiento: X g de muestra + 9 X ml de BPW (dil. 1/10). Incubar a 37°C ± 1°C, 18 h ± 2

h

Enriquecimiento selectivo:

transferir 0.1 ml de BPW en 10 ml de caldo RVS. Incubar a 41.5°C +1°C, 24 h ±3h.

transferir 1 ml de BPW en 10 ml de caldo MKTT. Incubar a 37°C ± 1°C, 24 h ± 3h

Aislamiento: a partir de RVS y MKTT sembrar una ansada por agotamiento en superficie en
agar XLD y en el segundo agar elegido. Incubar a 37°C ± 1°C, 24 h ± 3 h.

↓
Seleccionar colonias típicas y estriar en agar nutritivo. Incubar a 37°C ± 1°C, 24 h ± 3 h.

Confirmación por propiedades bioquímicas y serología

Interpretación de resultados