Laboratorio de Espectrofotometría

Centro Educacional Padre Alberto Hurtado
Módulo: técnicas de análisis instrumental

Prof: Felipe Soto
Laboratorio de espectrofotometría
Objetivos: - Aprender a usar el espectrofotómetro

- Realizar un barrido del espectro
- Realizar curva de calibración y determinar concentración de muestra problema
Introducción
La espectrofotometría es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un

compuesto en solución. Se basa en que las moléculas que absorben las radiaciones
electromagnéticas y a su vez la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la
concentración. Además es usada para identificar compuestos por su espectro de absorción y
conocer la concentración de un material o sustancia, esto último, permite seguir el curso de
reacciones químicas y enzimáticas así como determinar enzimas y proteínas e incluso ácidos
nucleicos.
Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, como ya sabemos es un

equipo de laboratorio que mide la cantidad de luz que pasa por medio de una longitud de
onda especifica. La cantidad de luz absorbida por un medio es proporcional a la concentración
del soluto presente, es entonces así que la concentración de un soluto colorido en solución
puede ser determinada en el laboratorio mediante la medición de su absorción de luz a una
longitud de onda específica.
En espectroscopia el termino luz no solo se aplica a la forma visible de radiación

electromagnética, sino también a la forma UV e IR, que son invisibles. En espectrofotometría
de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano, de 195-400 nm) y el visible
(400- 780nm). La luz UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm, es
una región de energía muy alta.
En la región visible apreciamos el color visible de una solución y que corresponde a las
longitudes de onda de la luz transmite, que no se absorbe. El color que absorbe es el
complementario al color que transmite.
Por tanto, para realizar mediciones de absorción es necesario utilizar la longitud de onda en la
que absorbe luz la solución coloreada.
La fuente de radiación visible suele ser una lámpara de tungsteno y no proporciona suficiente
energía por debajo de 320 nm
La transmitancia (T) de una solución en la solución es la radiación entre la cantidad de luz

transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra y la absorbancia (A) es
un concepto más relacionado con la muestra puesto que nos indica la cantidad de luz
absorbida por la misma.
Prof: Felipe Soto
Ley de Lamber-Beer
Esta ley se expresa la relación entre la absorbancia de luz monocromática ( de longitud de

onda fija) y concentración de un cromóforo en solución:
A = log I/I0 o A = ε c l
La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración, a mayor

número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas; también depende de la distancia
que recorre la luz por la solución, a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la luz
por la muestra más moléculas se encontrará; por último, depende de ε, una constante de
proporcionalidad denominada coeficiente de extinción, y es específica para cada cromóforo
Se debe trabajar con soluciones muy diluidas debido que la ley de lamber-Beer sufre una
desviación negativa a concentraciones más elevadas por lo tanto, solo se pueden extrapolar
datos en la zona lineal de la grafica
El espectrofotómetro
Este equipo cuenta con una lámpara o fuente de luz, esta emite radiación en distintas
longitudes de onda, el colimador centra los rayos de luz y los concentra en la zona del
monocromador. El monocromador tiene como función aislar una longitud de onda en
específico, este haz de luz monocromático es el que atraviesa la muestra para llegar al
detector el cual calcula la intensidad del haz de luz que logro atravesar la muestra.
Figura 1: se muestra un espectrofotómetro

convencional de laboratorio de docencia
Firgura 1:
Prof: Felipe Soto
Figura 2: diagrama de las

partes de un
espectrofotómetro
Materiales
Espectrofotómetro y cubetas
Solución rojo congo 0,001% p/v
6 tubos de ensayo por grupo
Gradilla
Pipeta volumétrica
Propipeta
Papel milimetrado
Agua destilada
Metodología
Preparación de soluciones
De la muestra que le entregara el profesor la cual está al 0,001 % m/v usted tomara 5 mL con
la pipeta volumétrica, procurando en todo momento realizar la medición más exacta posible y
los trasvasijará a un tubo de ensayo, al tubo de ensayo le añadirá 5 mL de agua destilada. De la
dilución preparada en el tubo, tomara otros 5mL y los depositara en un nuevo tubo de ensayo
y nuevamente agregara 5mL de agua destilada a este nuevo tubo, así sucesivamente hasta
obtener 6 tubos con distintas diluciones.
Calcule la concentración de cada uno de los tubos y regístrela.
Espectro de absorción
Con la muestra de uno de sus tubos realice un barrido desde los 340 nm a los 670 nm de
longitud de onda; midiendo los valores de 340nm, 405nm, 500nm, 546nm, 578nm, 620nm, y
670nm. Registre los valores de la absorbancia y determine cuál es la longitud de onda más
óptima de trabajo.
Curva de calibración
Para realizar la curva de calibración se debe medir la absorbancia de las muestras de

concentración conocida de cada tubo, de esta manera obtener los punto necesarios para
graficar la curva de calibración y poder determinar el valor del coeficiente de extinción molar.
Prof: Felipe Soto
Determinación de la concentración de la muestra problema.
Ahora que tiene su curva de calibración proceda a medir la absorbancia de la muestra

problema y realizar los cálculos necesarios para determinar la concentración extrapolando el
dato en la curva de calibración
Resultados
Concentración de disoluciones
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 Muestra

problema
Barrido del espectro
Longitud de onda Absorbancia

340
405
500
546
578
620
670
Grafico del barrido: graficar en papel milimetrado
Curva de calibración
muestra Absorbancia
1
2
3
4
5
6
Grafica curva de calibración: graficar en papel milimetrado
Muestra problema: leer y anotar la absorbancia y calcular la concentración

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Calcule la concentración de cada uno de los tubos y regístrela.

Para realizar la curva de calibración se debe medir la absorbancia de las muestras de

Determinación de la concentración de la muestra problema.

Ahora que tiene su curva de calibración proceda a medir la absorbancia de la muestra

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