VALIDACIÓN METODOS DE ENSAYO

Q.F. Marco Carmona Baez

Sección Fisicoquimico

2014
 Decreto Supremo MINSAL Nº 03 del año
2010:
• Título II del Registro Sanitario de las Especialidades Farmacéuticas
y otros productos farmacéuticos:
• Art. 32° y 40° Párrafo segundo: De los requisitos del Registro
Sanitario,
• Título VI Laboratorios Farmacéuticos:
• Art. 145° Párrafo quinto: los procedimientos y registros;
• Art. 155º Párrafo sexto: del personal y las responsabilidades;
• Art. 187º Párrafo cuarto: de la exención de control de calidad y del
control de serie
• Norma Técnica N° 131, nominada “Norma que define los criterios
destinados a establecer la equivalencia terapéutica en productos
farmacéuticos en Chile (EQT)” – Decreto Exento MINSAL Nº 27 de
2012.
• Norma Técnica N° 127 de Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) –
Decreto Exento MINSAL Nº 28 de 2012.
• Norma Técnica N° 139 de Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) –
Decreto Exento MINSAL Nº 543 de 2013.
 Definiciones
Método Ensayo (ME)
“Documento que explica detalladamente el conjunto de operaciones necesarias
para efectuar un análisis determinado.”

ME Normalizado (Farmacopéico y/o Compendiado)

“ME publicados por organismos de normalización u organizaciones
internacionales reconocidas en la normativa. Se considera un ME robusto.”

ME Normalizado – Modificado
“ME que ha sido adaptado por el laboratorio a partir de un método normalizado.”

ME No Normalizado
“ME que no se encuentra en normas u otras colecciones de métodos,
correspondería a un nuevo método desarrollado por el propio laboratorio o
adaptado de la bibliografía.”
 Definiciones
Transferencia de Método de Ensayo
“Proceso documentado que califica a un laboratorio (unidad receptora)
para emplear un método de ensayo que se origina en otro laboratorio
(unidad que transfiere).”
Capítulo General <1224>

Verificación Métodos de ensayos

“ Es la evaluación que sirve para determinar si el procedimiento puede ser
utilizado para su propósito previsto, en las condiciones de uso reales para
un fármaco especifico y/o matriz de un producto farmacéutico determinado.”
Capítulo General <1226>

Validación de un método de ensayo

“La validación de un método de ensayo es el proceso por el cual se establece,
mediante estudios de laboratorio, que las características de desempeño del
método cumplen con los requisitos para las aplicaciones analíticas indicadas.”
Capítulo General <1225>
 Validación
• Calificación
• Mantención/Calibración
• Verificación
• Validación ME
• Test Suitability
• Estándar control/ Durante el ensayo
 Etapas para el Desarrollo de un
método analítico
Investigación bibliográfica

Definir las condiciones de trabajo

Reactivos, estándares de referencia, equipos, personal, muestreo

Desarrollar el método
Encontrar las condiciones analíticas optimas
Un método bien desarrollado se valida rápidamente

Estandarizar el método
Hacerlo práctico (considerar tiempo y recursos) e idóneo (preciso,
exacto)
Validar / Verificar /Transferir
Demostrar que el método es confiable y reproducible en la entrega de
los resultados
 Transferencia de Procedimientos Analíticos

USP 37, capitulo general <1224> Transferencia de procedimientos

analíticos.
–Se aplica a la transferencia de un procedimiento no oficial de un
laboratorio a otro.
–Antes de implementar una transferencia, es necesario discutir,
convenir y documentar un protocolo. Dicho documento debe incluir:
• Objetivo
• Alcance
• Responsabilidades de la unidad que transfiere y la unidad que
Recepciona (capacitación, auditoria, transferencia información, etc.)
• Materiales e instrumentos.
• Procedimiento analítico.
• Diseño experimental y
• Criterios de aceptación para todas las pruebas y/o métodos incluidos
en la transferencia.
 Transferencia de Procedimientos Analíticos

–Dos tipos de transferencia de procedimientos analíticos:

• Análisis comparativo: Se transfiere un método previamente validado
por la unidad que transfiere, se realiza el Análisis de muestras del mismo
lote o muestras preparadas especialmente para la prueba.
• Co-validación entre laboratorios: La validación puede ser completa o
parcial.
– Para la elección del tipo de transferencia debe realizarse en base a
un análisis de riesgo.
– Análisis estadístico de datos:
• Recuperación de impurezas en producto con un cantidad agregada
intencionalmente.
• Test comparación de media.
• Intervalos pre establecidos.
• Desviación estándar relativo.
• Evaluación perfiles de disolución (f2)
 Transferencia de Procedimientos Analíticos

–Exención de la Transferencia:

• Composición del producto nuevo y/o la concentración del P.A. es

comparable o similar con un producto existente

• El procedimiento analítico esta descrito en la USP.

• Procedimiento analítico es el mismo o similar.

• Personal a cargo del desarrollo, validación o análisis de rutina del

producto en la unidad que transfiere se traslada a la unidad receptora.

Toda debe quedar registrado en Protocolo

transferencia e Informe final.
 Verificación de Procedimientos Farmacopeicos

• Los métodos publicados en la USP-NF se han validado y cumplen

con los requisitos reglamentarios de las Buenas Prácticas de
Fabricación vigentes….

• Los métodos validados pueden utilizarse para analizar una nueva

formulación (por ej. un nuevo producto, forma de dosificación o
producto intermedio del proceso) únicamente después de verificar
que la nueva formulación no interfiere con la exactitud,
linealidad ni precisión del método. No se puede suponer que un
método validado puede medir correctamente el ingrediente activo de
una formulación que es diferente a la utilizada para establecer la
validez original del método.
 Verificación de Procedimientos Farmacopeicos

– Verificación: Desafiamos el entorno analítico utilizando un método

bien caracterizado

• Analista
• Instrumento
• Reactivos
• Matriz

– Provee información general a los laboratorios acerca de como

verificar procedimientos analíticos que se llevan a cabo por primera
vez.
 Verificación de Procedimientos Farmacopeicos

–La verificación consiste en la evaluación de las características de

desempeño analítico seleccionadas, como las del capitulo general
<1225>.

– No se aplica en forma retroactiva.

– Se aplica a fármacos, productos terminados y excipientes.

– Se aplica a titulaciones volumétricas, procedimientos

cromatográficos, espectroscópicos, etc.

– Pruebas tales como Determinación de agua, Metales pesados o

Pérdida por secado en general no requieren verificación
 APTITUD DEL SISTEMA

• Para determinar la eficacia del sistema operativo final se lo debe

someter a una prueba de aptitud

• Las pruebas de aptitud son una parte integral de los métodos

cromatográficos HPLC/ GC

• Se emplean para verificar que la sensibilidad de detección, la

resolución y la reproducibilidad del sistema son adecuados para el
análisis que se va a realizar

• Las pruebas de aptitud se basan en el concepto de que el equipo, el

sistema electrónico, las operaciones analíticas y las muestras a
analizar constituyen un sistema integral que puede evaluarse
como tal
 Definición del método a Validar
Cuali o Cuanti. – Analito – Matriz – Concentración Principio Activo

Tipo de Método

Si Es un Método No
Normalizado ?

Normalizado Nuevo o Uso hace años

Normalizado
Modificado Desarrollado Laboratorio

No Modificación
Significado?
Validación
Retrospectiva
Si

Verificación Validación Prospectiva

Establecer Parámetros a Evaluar

Continua
 Establecer Pruebas Experimentales

Establecer Criterios de Aceptación

Comparar
Resultados Desarrollar Pruebas Experimentales
V/S Criterios

Evaluación de Resultados

Informe de Validación

Aprobación de la Validación
 Parámetros a Validar
Parámetros Requeridos para la Validación
Parámetros a Categoría Categoría II Categoría Categoría
Evaluar I III IV
Cuantitativo Limite
Exactitud Si Si * * No
Precisión Si Si No Si No
Especificidad Si Si Si * Si
Límite de No No Si * No
Detección
Límite de No Si No * No
Cuantificación
Linealidad Si Si No * No
Rango Si Si * * No
Robustez Si Si Si Si Si
* Pueden requerirse dependiendo de la naturaleza del test.
- Valition of Compendial Methods <1225>
 Parámetros a Validar
Parámetros Requeridos para la Validación
Análisis de impurezas Valoración
Tipo de
disolución (sólo
procedimiento Identificación Ensayos Ensayos
medición)
analítico cuantitativos de límite
contenido/potencia
Exactitud - + -b +
Precisión:
1.Repetibilidad - + - +
1. Precisión
- + - +
Intermedia a
Especificidad + + + +
Límite de
- -b + -
detección
Límite de
- + - -
cuantificación
Linealidad - + - +
Intervalo - Rango - + -b +
+ La característica debe ser evaluada normalmente.
– La característica no se evalúa normalmente;
a La precisión intermedia no es necesaria en casos donde se ha realizado un estudio de reproducibilidad.
b Puede necesitarse en algunos casos.
 Especificidad

ICH Q2A y USP (United States Pharmacopeia):

• La capacidad de evaluar en forma inequívoca al
analito en presencia de los componentes cuya
presencia cabría esperar, tales como impurezas,
productos de degradación y componentes de la
matriz
• La falta de especificidad de un procedimiento
analítico individual puede compensarse mediante
otros procedimientos analíticos de apoyo
 Especificidad
Evaluación:

a.- Se realiza lectura de cada componente de la formulación de la forma

farmacéutica a analiza de manera independiente.

b.- Se realiza lectura del solvente en las misma condiciones de preparación

de la muestra y del estándar.

c.- Se realiza lectura de la mezcla de todos los componentes.

HPLC
- La resolución tiene que ser R > 1.5.
- Cada analito debe tener su tiempo retención característico.
- Evaluación del espectro UV.
- Evaluación de pureza de peak.

19
 Linealidad

• Es esencialmente un proceso mediante el cual, la

respuesta de un sistema de medida (señal analítica)
puede expresarse en términos de una cualidad o
cantidad de interés (concentración de analito).

• Descripción de los puntos que representan la curva

 Linealidad
Función de Respuesta Nombre Técnica (Ej.)
Ley de Beer Espectroscopia de
absorción
Nertst Electroquímica

Scheibe- Espectroscopia de emisión

Lomakin

Wagennar y col. Absorción atómica

Andrews y col. Absorción atómica

Rodbard Radioinmunoensayo
 Linealidad
Mínimos Cuadrados: minimiza la suma al cuadrado de los
residuales
• Variable x este exenta de error.
• La varianza permanece constante en todo el intervalo
de concentraciones.
• Los valores de y presenten una distribución normal
 Linealidad
y = 13762608,94x + 963,46
x y y' y-y'
0,00049 7852 7707,138381 144,861619
0,00049 6215 7707,138381 -1492,13838
0,00049 7464 7707,138381 -243,138381
0,00049 7069 7707,138381 -638,138381
0,00049 7556 7707,138381 -151,138381
0,00147 20026 21194,49514 -1168,49514
0,00147 21297 21194,49514 102,504858
0,00147 21896 21194,49514 701,504858
0,00147 21845 21194,49514 650,504858
0,00147 21237 21194,49514 42,5048582
0,00196 28989 27938,17352 1050,82648
0,00196 27774 27938,17352 -164,173522
0,00196 27162 27938,17352 -776,173522
0,00196 29409 27938,17352 1470,82648
0,00196 32435 27938,17352 4496,82648
0,00245 35190 34681,8519 508,148097
0,00245 33466 34681,8519 -1215,8519
0,00245 33778 34681,8519 -903,851903
0,00245 34494 34681,8519 -187,851903
0,00245 35238 34681,8519 556,148097
0,00294 42244 41425,53028 818,469716
0,00294 40448 41425,53028 -977,530284
0,00294 40010 41425,53028 -1415,53028
0,00294 40586 41425,53028 -839,530284
0,00294 41056 41425,53028 -369,530284

23
 Linealidad
- Se realiza en un mínimo de 5 puntos
- La linealidad debe ser evaluada a través de la inspección visual de un
gráfico de la concentración o contenido del analito versus la señal entregada
por el equipo.

Criterios de aceptación
a.- Principio Activo:
Rango de estudio establecido por tipo de ensayo
El coeficiente de determinación r2 > 0.99; se aplica estadístico “ t “;
El CV < 2.0 % o lo indicado monografía individual y el CVFR < 5.0 %.
Intervalo de confianza del intercepto incluye el cero.
Grafica de los residuos

b.- Impureza:
La curva se realiza en un rango mínimo de + 20 % de la especificación;
El coeficiente de determinación r2 > 0.95; se aplica estadístico “ t “;
El CV < indicado monografía individual y el CVFR < 5.0 %.
Intervalo de confianza del intercepto incluye el cero.
Grafica de los residuos
 Precisión ICH-USP
• Se denomina precisión a la capacidad de un instrumento de dar
el mismo resultado en mediciones diferentes realizadas en las
mismas condiciones.

• Repetibilidad: coincidencia dentro de un periodo corto para el

mismo analista con la misma instrumentación

• Precisión intermedia: coincidencia en los resultados del mismo

laboratorio, pero en días distintos con analistas y equipo
diferentes (según corresponda)

• Reproducibilidad: coincidencia en los resultados entre

laboratorios (como en un estudio colaborativo)
 Precisión
a.- Tanto para la repetibilidad como para la precisión intermedia;

- A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, el

coeficiente de variación (CV) del métodos analíticos debe ser menor o igual
al 2 %.

- Para determinar el coeficiente de variación aceptable para el análisis de

impurezas, elementos trazas, productos de degradación, etc. esta dado por
la ecuación de Hortwitz, la cual queda expresada en la siguiente ecuación:
CV (%) = 2(1 – 0,5 log C)
Donde: C es la concentración de la muestra expresada en concentración (ej.
mg/ml, ppm, M, N etc.).

26
 Exactitud
• Se denomina exactitud a la capacidad de un instrumento
de acercarse al valor de la magnitud real.

• Formas de determinar la exactitud

– Mezcla con excipientes (placebo con una cantidad
agregada conocida de Estándar)
– Método adición de estándar (muestra con cantidad
agregada conocida)
– Se deduce a partir de los datos de especificidad y
linealidad.
– Comparación con un método reconocido como exacto
(método de referencia)
 Limite de Detección y Cuantificación

Región de alta incerteza en la Región de dudosa Región de

medición Cuantificación Cuantificación
LC

LD

0.15 %
0%

Rb Blanco
Analito
Rb + 3Sb Rb + 10Sb
28
 Limite de Detección y Cuantificación

Son posibles diversos enfoques para la determinación del límite de detección y

el limite de cuantificación
a.- Ruido:
Limite Detección = 3 x R
Limite Cuantificación = 10 x R
b.- Se resta el blanco:

Limite Detección = Limite Cuantificación =

c.- No se lee el blanco:

Limite Detección =

Limite Cuantificación =

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 Validación – Verificación
Materia Prima
Parámetro Validación Verificación
• Identidad
IR, UV Exactitud No No
HPLC Precisión No No
• Ensayo de pureza Especificidad Si Tal vez
Perdida por secado,
Residuo por ignición LD No No
Metales pesados
pH LC No No
Sust. Relacionadas
Linealidad No No
• Ensayo
Titulación Rango No No
HPLC
 Validación – Verificación
Materia Prima
Parámetro Validación Verificación
• Identidad
IR, UV Exactitud No No
HPLC Precisión No No
• Ensayo de pureza Especificidad Si No
Perdida por secado,
Residuo por ignición LD Si No
Metales pesados
pH LC No No
Sust. Relacionadas
Linealidad No No
• Ensayo
Titulación Rango No No
HPLC
 Validación – Verificación
Materia Prima
Parámetro Validación Verificación
• Identidad
IR, UV Exactitud Si No
HPLC Precisión Si Tal vez
• Ensayo de pureza Especificidad Si Si
Perdida por secado,
Residuo por ignición LD No No
Metales pesados
pH LC Si Si
Sust. Relacionadas
Linealidad Si No
• Ensayo
Titulación Rango Si No
HPLC
 Validación – Verificación
Materia Prima
Parámetro Validación Verificación
• Identidad
IR, UV Exactitud Si No
HPLC Precisión Si Tal vez
• Ensayo de pureza Especificidad Si Tal vez
Perdida por secado,
Residuo por ignición LD No No
Metales pesados
pH LC No No
Sust. Relacionadas
Linealidad Si No
• Ensayo
Titulación Rango Si No
HPLC
 Validación – Verificación
Producto Terminado
Parámetro Validación Verificación
• Identidad
HPLC Exactitud No No

• Ensayo Especif. Precisión No No

Partículas en iny.
Especificidad Si Si
Uniformidad
Disolución LD No No
• Impureza LC No No
Sust. relacionada
Solv. residuales Linealidad No No
• Ensayo Rango No No
 Validación – Verificación
Producto Terminado
Parámetro Validación Verificación
• Identidad
HPLC Exactitud Tal vez Tal vez

• Ensayo Especif. Precisión Si Si

Partículas en iny.
Especificidad Tal vez Si
Uniformidad
Disolución LD Tal vez No
• Impureza LC Tal vez Tal vez
Sust. relacionada
Solv. residuales Linealidad Tal vez No
• Ensayo Rango Tal vez No
 Validación – Verificación
Producto Terminado
Parámetro Validación Verificación
• Identidad
HPLC Exactitud Si Tal vez

• Ensayo Especif. Precisión Si Si

Partículas en iny.
Especificidad Si Si
Uniformidad
Disolución LD No No
• Impureza LC Si Si
Sust. relacionada
Solv. residuales Linealidad Si No
• Ensayo Rango Si No
 Validación – Verificación
Producto Terminado
Parámetro Validación Verificación
• Identidad
HPLC Exactitud Si Tal vez

• Ensayo Especif. Precisión Si Si

Partículas en iny.
Especificidad Si Si
Uniformidad
Disolución LD No No
• Impureza LC No No
Sust. relacionada
Solv. residuales Linealidad Si No
• Ensayo Rango Si No
 Validación – Uniformidad de Dosis
Parámetro Criterio
Exactitud Promedio recuperación 95 – 105 %
Precisión CV % Recuperación Ind. ≤ 2,5 %
DS residual de la linealidad ≤ 2,5 %
(relacionado con el contenido del 100% del P.A.)

Especificidad Comparación Visual No existe interferencia

con el P.A.
Linealidad DS residual de la linealidad ≤ 2,5 %
(relacionado con el contenido del 100% del P.A.)

Intercepto en “y” ≤ 2,5 %

(relacionado con el contenido del 100% del P.A.)

Coeficiente de Correlación r ≥ 0,997

Estabilidad de la Cambio en respuesta en 24 – ≤2%
solución 36 h
 Validación – Productos de Degradación
Parámetro Criterio
Exactitud Promedio recuperación 80 – 120 %
Precisión CV % Recuperación Ind. ≤ 15 %
DS residual de la linealidad ≤ 15 %
(relacionado con el contenido del 100% del P.A.)

Especificidad Comparación Visual No existe interferencia

con el P.A.
Linealidad DS residual de la linealidad ≤ 15 %
(relacionado con el contenido del 100% del P.A.)

Intercepto en “y” ≤ 25 %
(relacionado con el contenido del 100% del P.A.)

Coeficiente de Correlación r ≥ 0,98

LC 10*DS/m ≤ nivel reportado
Estabilidad de la Cambio en respuesta en 24 – ≤2%
solución 36 h
 Validación – Productos de Degradación
Toxicas

Parámetro Criterio
Exactitud Promedio recuperación 95 – 105 %
Especificidad Comparación Visual No existe interferencia
con el P.A.
Linealidad DS residual de la linealidad ≤4%
(relacionado con el contenido del 100% del P.A.)

Intercepto en “y” ≤ 25 %
(relacionado con el contenido del 100% del P.A.)

Sensibilidad Visual ≤ 0,5 %

(relacionado con el contenido del 100% del P.A.)

Estabilidad de la Cambio en respuesta en 24 – ≤2%

solución 36 h
 Validación – Disolución Q 70 %
Parámetro Criterio
Exactitud Promedio recuperación 90 – 110 %
Precisión CV % Recuperación Ind. ≤4%
DS residual de la linealidad ≤4%
(relacionado con el contenido del 100% del P.A.)

Especificidad Comparación Visual No existe interferencia

con el P.A.
≤ 2,5 %
Linealidad DS residual de la linealidad ≤4%
(relacionado con el contenido del 100% del P.A.)

Intercepto en “y” ≤ 10 %
(relacionado con el contenido del 100% del P.A.)

Coeficiente de Correlación r ≥ 0,985

Estabilidad de la Cambio en respuesta en 24 – ≤3%
solución 36 h
Filtro Diferencia en respuesta ≤4%
 Validación – Disolución 10 %
Parámetro Criterio
Exactitud Promedio recuperación 90 – 110 %
Precisión CV % Recuperación Ind. ≤4%
DS residual de la linealidad ≤4%
(relacionado con el contenido del 100% del P.A.)

Especificidad Comparación Visual No existe interferencia

con el P.A.
≤ 2,5 %
Linealidad DS residual de la linealidad ≤4%
(relacionado con el contenido del 100% del P.A.)

Intercepto en “y” ≤ 10 %
(relacionado con el contenido del 100% del P.A.)

Coeficiente de Correlación r ≥ 0,985

LC 10*DS/m ≤5%
Estabilidad de la Cambio en respuesta en 24 – ≤3%
solución 36 h
Filtro Diferencia en respuesta ≤4%
 CRITERIOS DE REVALIDACIÓN
Los parámetros a realizar en la revalidación dependen de
los cambios o las modificaciones que se realizan o se han
realizado al método de ensayo, pudiendo ser todos o una
parte de estos los que deben quedar establecido en plan
de validación.
• Después de 5 años el método tiene que revalidarse
• Cambio de matriz
• Cambio en el Equipo/Instrumento/Analista
• Transferencia del método
• Modificaciones de parámetros analíticos
GRACIAS