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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA
FACULTAD DE QUÍMICA E INGENIERÍA QUÍMICA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA ANALÍTICA

LABORATORIO DE ANÁLISIS INTRUMENTAL

PRÁCTICA N°6

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

ANÁLISIS DE CAFEÍNA EN BEBIDA ENERGIZANTE

Horario: viernes (8am – 12pm)

Docente: Mg. Quím. DE LAMA CARRILLO GERARDO
Alumno: Hernández Bravo Walter Salvador
Código: 17070093

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ÍNDICE

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 3

FUNDAMENTO DEL MÉTODO DE ANÁLISIS ................................................................................... 4

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA EMPLEADA..................................................................................... 4

CÁLCULOS DETALLADOS................................................................................................................ 7

TABLAS DE RESULTADOS ............................................................................................................... 9

DISCUSIÓN DE RESULTADOS ......................................................................................................... 9

Conclusiones ............................................................................................................................... 10

Recomendaciones ....................................................................................................................... 10

Apéndice...................................................................................................................................... 11

BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................. 14

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INTRODUCCIÓN
La cromatografía es un método de separación de los componentes de una muestra según su
capacidad para distribuirse entre una fase móvil, que contiene la muestra, y una fase
estacionaria. Cuando la fase móvil es un líquido hablamos de cromatografía de líquidos.
La cromatografía de líquidos clásica fue la primera en aplicarse y se llevaba a cabo
en columnas de vidrio rellenas de partículas granulares sólidas en las que el flujo se
producía por gravedad. Si los gránulos eran los suficientemente pequeños para conseguir
una buena separación, los tiempos de separación se hacían demasiado grandes. Si se
disminuía el tamaño de las partículas o se forzaba el flujo mediante una bomba o por la
presión de un gas, se aumentaba la rapidez, pero a costa de un aumento considerable de la
altura de plato teórico y, en consecuencia, una disminución de la eficacia de la separación.

(Figura N°1 – Flujo de

partículas granulares
sólidas para separación)

Además de los métodos de cromatografía de líquidos en columna existen otros,

denominados métodos de cromatografía en plano, en los cuales la fase móvil asciende
por capilaridad a través de una fase estacionaria sólida. Entre ellos, distinguimos
la cromatografía en papel y la cromatografía en capa fina.

(Figura N°2 –
Descripción de la
cromatografía de
papel)

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FUNDAMENTO DEL MÉTODO DE ANÁLISIS

En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna
que contiene a la fase fija. La separación cromatográfica en HPLC es el resultado de las
interacciones específicas entre las moléculas de la muestra en ambas fases, móvil y
estacionaria
A diferencia de la cromatografía de gases, la cromatografía de líquidos de alto rendimiento
(HPLC, de high-performance liquid chromatography) no está limitada por la volatilidad o
la estabilidad térmica de la muestra.
La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales
lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto
peso molecular. Con una fase móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra
disponible para la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa.
La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama
de estas interacciones selectivas y más posibilidades para la separación.
HPLC preparativa
Es la técnica escogida para aislamiento y purificación de productos de valor en las industrias
químicas y farmacéuticas, así como en la biotecnología y la bioquímica. La cromatografía
preparativa comprende un amplio rango de aplicaciones, desde el aislamiento de 1µg de
muestra para identificación espectroscópica hasta el aislamiento de un compuesto puro de
una mezcla de 100 g.
La cromatografía de líquidos, es la técnica de separación más ampliamente empleada,
gracias a su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas, en muchos campos de la
ciencia y para la sociedad en general. En la cromatografía líquida los componentes de una
mezcla son llevados a través de una fase estacionaria, fijada dentro de una columna mediante
el flujo de una fase móvil líquida. Las separaciones están basadas en las diferencias de la
velocidad de migración entre los componentes de la muestra, que vienen condicionadas por
la naturaleza de los analitos y su interacción con las fases.
Este método permite determinar el contenido de cafeína en bebidas energéticas. La
disolución que contiene la cafeína es sometida al HPLC. La cafeína contenida es
cuantificada por comparación con una solución estándar tratada similarmente.

Cromatografía de Fase Normal

Este método usa, una fase estacionaria polar (agua, soluciones amortiguadoras de pH,
acetonitrilo, metanol) y una fase móvil no polar (hexano, tetracloruro de carbono, benceno),
que se usa cuando el analito es polar, éste es retenido por la fase estacionaria, que es polar.
La partición aumenta con la polaridad del analito y la interacción entre el analito y la fase
estacionaria polar (en comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de retención.
La utilización de disolventes más polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención
de los compuestos mientras que los disolventes más hidrofóbicos tienden a aumentar el
tiempo de retención.

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Cromatografía de Fase Reversa

Se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de
repulsión entre un disolvente relativamente polar (agua, soluciones amortiguadoras de pH,
acetonitrilo, metanol) y una fase estacionaria apolar (generalmente sílica unida con cadenas
de grupos orgánicos de 8 y 18 átomos de carbón (C8 y C18)).
El efecto hidrofóbico disminuye con la adición de disolvente apolar a la fase móvil, esto
modifica el coeficiente de partición de forma que el compuesto se mueve por la columna y
eluye.
Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de cromatografía es la sílica tratada
con RMe2SiCl, donde la R es una cadena alquil tal como C18H37 o C8H17. El tiempo de
retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar, mientras que las moléculas de
carácter polar eluyen más rápido.
La cromatografía de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin
ninguna especificación adicional. Más del 90% de las aplicaciones HPLC de compuestos de
bajo peso molecular se hacen en cromatografía de partición en fase reversa.
El pH puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto. Por este motivo, la mayoría de
métodos utilizan un tampón como el fosfato de sodio para controlar el valor del pH, Pero
también neutralizan la carga a cualquier resto de sílica de la fase estacionaria que haya
quedado expuesta y actúan como contraiones que neutralizan la carga del compuesto. El
efecto de los tampones sobre la cromatografía puede variar, pero en general mejoran la
separación cromatográfica.
Muchas columnas de fase reversa están formadas por sílica modificada con cadenas alquil y
no se deben utilizar con bases en medio acuoso puesto que dañarían el esqueleto de sílica
subyacente. Las columnas se pueden utilizar en ácidos en medio acuoso, pero no deberían
estar expuestas demasiado tiempo al ácido porque puede corroer las partes metálicas del
aparato de HPLC.

(Figura N°3 –
Esquema de un
cromatógrafo de
líquidos)

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DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA EMPLEADA

Procedimiento:
Preparación de Soluciones

Fase móvil: Vertimos 200mL de metanol grado HPLC en fiola de 500mL. Agregamos
2.5mL de ácido fosfórico al 85%, mezclando, si la solución se calienta, dejar enfriar,
enrasamos con agua grado HPLC, dejando enfriar. Esta solución tiene la concentración de
0.5% H3PO4, 40% metanol y 59.5% agua.

Solución stock 1000ppm cafeína: Pesamos exactamente 0.1000g de cafeína y disolverlo

con agua grado HPLC en fiola de 100mL, tapamos y homogenizamos por inversión.

Preparación de la muestra: Destapar la bebida que se encuentra a temperatura ambiente.

Desgasificar la muestra colocando una cantidad en un vaso y dejándola reposar o por
agitación.

Tomar 5mL de la solución y verterlo rápidamente en una fiola de 25mL, enrazar con la fase
móvil, tapar y homogenizar por inversión. Tomar una determinada cantidad de la solución
y filtrar usando un filtro de jeringa de 0,45μm, verter la solución en un vial de 1,5 ó de
2mL, inyectar 20 ó 25μL de la solución en el equipo HPLC.

Condiciones experimentales:

Detector: UV Volumen de inyección: 10 – 25 μL

Temperatura: 25°C Flujo: 1mL/min

Longitud de onda: 254nm Tiempo de corrida: 15 minutos.

Columna: RP18 (150mm x 4,6mm ID x

5μm)

Análisis (curva de calibración y lectura de la muestra):

Identificar el tiempo de retención de los componentes. Inyectar 20μL, de cada uno de los
componentes por separado. Identificar el tiempo de retención de cada uno de los
componentes.

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CÁLCULOS DETALLADOS
A) Preparación de estándares (Curva de calibración)
100𝑚𝑔 𝑐𝑎𝑓
𝐶𝑐𝑎𝑓𝑒í𝑛𝑎 = = 1000𝑝𝑝𝑚
0.1𝐿

Para el Estándar N°1:

𝑉1 𝑥 𝐶1 = 𝑉2 𝑥 𝐶2

1𝑚𝐿 𝑥 1000𝑝𝑝𝑚 = 50𝑚𝐿 𝑥 𝐶2

𝐶2 = 20𝑝𝑝𝑚

Para el Estándar N°2:

𝑉1 𝑥 𝐶1 = 𝑉2 𝑥 𝐶2

2𝑚𝐿 𝑥 1000𝑝𝑝𝑚 = 50𝑚𝐿 𝑥 𝐶2

𝐶2 = 40𝑝𝑝𝑚

Para el Estándar N°3:

𝑉1 𝑥 𝐶1 = 𝑉2 𝑥 𝐶2

3𝑚𝐿 𝑥 1000𝑝𝑝𝑚 = 50𝑚𝐿 𝑥 𝐶2

𝐶2 = 60𝑝𝑝𝑚

Con estos datos, llevados al cromatógrafo, determinamos las áreas de cada estándar que,
graficándola en Excel, arroja la siguiente ecuación:

𝑦 = 18031𝑥 − 20849

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Área de la muestra = 525401

Reemplazando:

525401 = 18031𝑥 − 20849

𝐶𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = 30.3𝑝𝑚

Aplicando el Factor de dilución:

50𝑚𝐿 330𝑚𝑔 𝑐𝑎𝑓𝑒í𝑛𝑎
𝐶𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = 30.3𝑝𝑝𝑚 𝑥 = 330𝑝𝑝𝑚 =
5𝑚𝐿 1000𝑚𝐿
Determinaremos la concentración en un envase de 240mL que contiene 76.8mg de
cafeína.

330𝑚𝑔 𝑐𝑎𝑓𝑒í𝑛𝑎
𝑥 240𝑚𝐿 = 79.2𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑓𝑒í𝑛𝑎 𝑒𝑛 240𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑣𝑎𝑠𝑒
1000𝑚𝐿

Hallando el porcentaje de error:

76.8𝑚𝑔 − 79.2𝑚𝑔
| | 𝑥100 = 3.12%
76.8

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TABLAS DE RESULTADOS

TABLAS USADAS EN EL MÉTODO DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN

Tabla N°1 (Datos para la curva de calibración)

Tiempo de
Concentración (ppm) Área
retención (s)
20 6.092 337042

40 6.148 705820

60 6.277 1058267

DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Área vs Concentración
1200000

1000000 y = 18031x - 20849

R² = 0.9998
800000
Área

600000

400000

200000

0
0 10 20 30 40 50 60 70
Concentración (ppm)

Á𝑟𝑒𝑎 = 18031𝐶 − 20849

De la Tabla N°1 se obtuvieron los valores de las áreas de los estándares, la muestra
analizada arrojó un valor de área de 525401 que utilizando la ecuación anterior se obtuvo
una concentración de 79.2mg de cafeína en la bebida analizada que comparando con el
valor de 76.8mg en el envase, el porcentaje de error resulta de un 3%, lo que indica una
buena precisión en la obtención de los resultados de la experiencia.

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Conclusiones
- A diferencia de la cromatografía gaseosa, la cromatografía HPLC contiene una
fase móvil no gaseosa que viaja bajo la fase estacionaria que trae a lo largo de
los componentes de la muestra separada durante la cromatografía. La acción
recíproca entre las moléculas de la muestra y el ambiente de la cromatografía se
puede basar en varios factores tales como la carga, el flujo, el burbujeo o la
hidrofobicidad.
- Del análisis utilizando el cromatógrafo obtuvimos picos alto o bandas más
amplias haciendo que tengamos por resultado menores resoluciones.

Recomendaciones
- Eliminar las burbujas que se pueden generar al momento de inyectar la fase
móvil, puesto que al estar presentes estas burbujas, se pueden generar picos que
pueden alterar los resultados.

- Para poder acelerar el proceso de eliminación de burbujas, es recomendable

colocar un flujo mayor al estándar mientras no se esté analizando estándares o
muestras-

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Apéndice

Determinación por cromatografía Liquida (HPLC) el contenido de ácido

fólico y hierro en una bebida láctea fermentada tipo yogurt enriquecida a
partir de materias primas naturales.

Se desarrolló una metodología para cuantificar Hierro en soja y ácido fólico en el melón,
soya y lentejas, ya que contienen gran cantidad de dicha vitamina según literatura, para
luego adicionar al yogurt el porcentaje de hierro y ácido fólico que una madre gestante
necesita. El hierro se determinó por método gravimétrico y por absorción atómica. Se
comparó la extracción de la vitamina por tres métodos: agitación magnética, ultrasonido y
radiación de microondas. Las muestras para ácido fólico se analizaron por HPLC en fase
reversa en un cromatógrafo liquido Agilent 1100, a partir de un estándar con ácido fólico
(MERCK 98%). Las extracciones se llevaron a cabo por triplicado para evaluar la precisión
del método. Como resultado se obtuvo que la soya tiene mayor concentración de ácido
fólico con relación al melón y las lentejas, el cual se adicionó al yogurt y se determinó su
cantidad por el análisis ya mencionado.
CUANTIFICACION
A partir de un estándar con ácido fólico (MERCK 98%) se prepararon 6 soluciones patrón entre
0.800 y 100 ppm usando como solvente Buffer fosfato (pH 6.5). Se analizan por triplicado estos
patrones con las mismas condiciones cromatográficas teniendo así la curva de calibración
respectiva (factor de correlación: 0.99988).

ANALISIS CROMATOGRAFICO
Las muestras se analizaron por HPLC en fase reversa en un cromatógrafo liquido Agilent 1100 con
bomba cuaternaria, columna Agilent Zorbax Eclipse XDB C8 (150 mm * 4.6 mm * 0.5 µm) a
temperatura ambiente (18ºC); la fase móvil utilizada fue Acetonitrilo: Buffer Acetato pH 3.5 en una
relación 10:90 hasta 24:76 en 9 minutos, con un flujo de 0.5 mL/min.; se utilizó también un detector
UV con arreglo de diodos y se cuantificó el compuesto de interés a 290 nm. Las extracciones se
llevaron a cabo por triplicado para evaluar la precisión del método. La curva de calibración se hizo
utilizando un patrón de ácido fólico marca MERCK (98%), con inyección por triplicado de 20 µL.
El nivel mínimo de detección del método cromatográfico fue 100ppb.
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BIBLIOGRAFÍA

Páginas de consulta:
- http://laboratoriotecnicasinstrumentales.es/analisis-qumicos/cromatografa-de-lquidos-
hplchttps://www.jove.com/science-education/10201/mtodo-de-adicin-
estndar?language=Spanish
- https://www.news-medical.net/life-sciences/Liquid-Chromatography-versus-Gas-
Chromatography-(Spanish).aspx
- https://www.redalyc.org/pdf/903/90350204.pdf

Libros:
 Skoog D., Holler. Nieman T. Principios de Análisis Instrumental- 5ta Ed. Mc. Graw
Hill. España 2001.
 Owen Tony, Fundamentos de Espectroscopia UV – Visible Moderna, Copyright
Agilent. 2000.
 Métodos Instrumentales de Análisis. - Por H.H. Williard L.L. Merrit J.A. Dean
Nueva edición revisada, corregida y aumentada.

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