Espectrofotometría UV / VIS

1. Introducción:
Además del análisis químico, la caracterización de las mezclas puras y de sustancias se logra con
métodos físicos. Entre otras técnicas, como la determinación del punto de fusión, el índice de
refracción y la densidad, la espectroscopia óptica en el rango de luz ultravioleta y visible (UV /
VIS) se aplica ampliamente en casi todos los segmentos de mercado y lugares de trabajo en
investigación, producción y control de calidad para Clasificación y estudio de sustancias. La
espectroscopia UV / VIS se basa en la absorción de luz por una muestra. Dependiendo de la
cantidad de luz y su longitud de onda absorbida por la muestra, se puede obtener información
valiosa, como la pureza de la muestra. Además, la cantidad de luz absorbida está relacionada con
la cantidad de muestra y, por lo tanto, el análisis cuantitativo es posible por espectroscopia óptica.
Durante muchos años, METTLER TOLEDO ha proporcionado soluciones instrumentales para la
caracterización de la muestra (por ejemplo, valores térmicos, pH, conductividad, índice de
refracción, densidad), así como para la determinación del contenido por titulación. Con la
introducción de una nueva técnica analítica, la potencia de aplicación y las posibilidades de los
instrumentos METTLER TOLEDO se extienden aún más a determinaciones más completas de
parámetros múltiples.
Los nuevos espectrofotómetros UV / VIS Excellence admitirán adicionalmente el flujo de trabajo
del cliente con instrumentos analíticos confiables, fáciles de usar y rápidos. Esta guía proporciona
al lector un conocimiento fundamental sobre esta técnica, así como consejos y sugerencias de
aplicación para obtener resultados precisos y precisos en el uso diario.

2. Espectroscopia UV / VIS:
2.1 ¿Qué es la espectroscopia UV / VIS?
La espectroscopia óptica se basa en la interacción de la luz con la materia. La siguiente figura
ilustra lo que sucede cuando la luz brilla sobre un objeto:

Figura 1 y 2: la luz que no es absorbida por el objeto se refleja y puede ser vista por el ojo.

Ambos objetos están iluminados por luz visible o blanca, que está representada por un arco
iris: los diferentes colores representan los diferentes componentes de la luz visible. Cuando
los rayos de luz brillan sobre un objeto, pueden ser absorbidos por el objeto, en particular,
uno o más componentes de luz (es decir, sus colores) se absorben específicamente.
Se reflejan los colores que no son absorbidos por los objetos. En nuestro ejemplo, la luz roja
se refleja en la cáscara roja del tomate (Fig. 1), mientras que la luz verde se refleja en la
superficie verde del calabacín (Fig. 2). Todos los otros colores son absorbidos por los dos
objetos. Luego, los ojos ven la luz reflejada: el tomate se ve en rojo mientras que los
calabacines son verdes.
En términos físicos, la luz es un tipo de energía que se propaga en el espacio a una velocidad
muy alta. Más específicamente, la luz se entiende como una onda electromagnética que viaja
al espacio: es energía radiante. La energía de la luz oscila periódicamente entre un mínimo y
un máximo en función del tiempo, como una onda. La distancia entre dos máximos o dos
mínimos, respectivamente, de la onda electromagnética se define como la longitud de onda,
dada en nanómetros (nm).
 Figura 3: la energía de una onda electromagnética aumenta al disminuir la longitud de
onda, y viceversa.

Cada color tiene una longitud de onda específica, por ej. la luz roja tiene una longitud de onda
de 660 nm, mientras que la luz verde tiene una longitud de onda de 520 nm. Así, los diferentes
componentes de la luz se caracterizan por una longitud de onda específica. La suma de todos
los componentes, es decir, de todas las longitudes de onda, se denomina espectro. Más
específicamente, un espectro representa una distribución de energía radiante. Por ejemplo, el
espectro electromagnético de la luz visible varía desde aproximadamente 390 nm hasta
aproximadamente 780 nm.

Figura 4: el espectro visible (390 - 780 nm) representa solo una pequeña porción de todo el
espectro electromagnético.

Tenga en cuenta que la energía de las ondas electromagnéticas está relacionada con sus
longitudes de onda; cuanto más corta es la longitud de onda, mayor es la energía. Por ejemplo,
la luz violeta tiene una longitud de onda más corta que la luz roja y, por lo tanto, un nivel de
energía más alto, mientras que la luz infrarroja tiene menos energía que la luz visible debido
a su longitud de onda más larga.

Absorción de la luz como herramienta analítica.

La absorción de luz se puede utilizar en química analítica para la caracterización y
determinación cuantitativa de sustancias. La espectroscopia UV / VIS es una técnica basada
en la absorción de luz por una sustancia desconocida o por una muestra desconocida. Aquí, la
muestra se ilumina con rayos electromagnéticos de varias longitudes de onda en el visible
(VIS, es decir, los diferentes colores) y rangos adyacentes, es decir, ultravioleta (UV) y parte
de la región infrarroja inferior (cerca de IR) del espectro. Dependiendo de la sustancia, la luz
se absorbe parcialmente. La luz restante, es decir, la luz transmitida, se registra como una
función de la longitud de onda por un detector adecuado, proporcionando el espectro UV /
VIS de la muestra.
 Como resultado, dado que cada sustancia absorbe la luz de una manera diferente, existe una
relación única y específica entre la sustancia y su espectro UV / VIS. El espectro se puede
usar para identificar o cuantificar una sustancia.

Figura 5: La luz que pasa a través de una solución de muestra es parcialmente absorbida
por los componentes.

La espectroscopia UV / VIS se aplica generalmente a moléculas orgánicas, iones inorgánicos

o complejos en soluciones, aunque también se pueden analizar materiales sólidos como
películas o vidrio. Los espectros UV / VIS obtenidos son muy útiles para mediciones
cuantitativas de un compuesto específico. De hecho, la concentración de un analito en
solución se puede determinar midiendo la absorbancia en una longitud de onda específica. A
partir del valor de absorbancia de la muestra, se puede calcular su concentración, consulte la
descripción en el capítulo 2.4.
La espectroscopia UV / VIS es una técnica de medición en la que el registro de los espectros
de absorción de diferentes muestras utilizando luz ultravioleta (UV) y visible (VIS) se logra
mediante un espectrofotómetro, es decir, un instrumento capaz de medir el espectro de una
muestra en el UV. / VIS gama.

2.2 Principio de medición:

Un espectrofotómetro UV / VIS mide la intensidad de la luz que pasa a través de una solución
de muestra en una cubeta y la compara con la intensidad de la luz antes de que pase a través
de la muestra. Los componentes principales de un espectrofotómetro UV / VIS son una fuente
de luz, un soporte de muestra, un dispositivo dispersivo para separar las diferentes longitudes
de onda de la luz (por ejemplo, un monocromador) y un detector adecuado.

Figura 6: Principio de medición en espectroscopia UV / VIS.

El principio de funcionamiento de un espectrofotómetro se basa en los siguientes pasos:

Blanco (medida de la intensidad de la luz transmitida a través del solvente):

1. El disolvente (por ejemplo, agua o alcohol) se agrega a un recipiente adecuado, transparente
y no absorbente: una cubeta.
2. Un haz de luz emitido por la fuente de luz pasa a través de la cubeta con el solvente.
3. La intensidad de la luz transmitida a diferentes longitudes de onda se mide luego por un
detector colocado después de la cubeta con el solvente y se registra.
Esto se conoce como el blanco, que se necesita para la medición de la muestra.
 Determinación de la muestra:
1. Se disuelve una muestra en el solvente y se agrega a la cubeta.
2. Un haz de luz emitido por la fuente de luz pasa a través de la cubeta con la muestra.
3. Al pasar a través de la cubeta, la luz es parcialmente absorbida por las moléculas de muestra
en la solución.
4. La luz transmitida es medida por el detector.
5. El cambio de intensidad de luz en diferentes longitudes de onda se calcula dividiendo la
intensidad transmitida de la solución de muestra por los valores correspondientes del
blanco. Esta relación es finalmente almacenada por una grabadora.

2.3 Transmitancia y absorbancia.

El detector en un espectrofotómetro UV / VIS mide la intensidad de la luz después de pasar a
través de la solución de muestra. Esta fracción de luz captada por el detector se llama
intensidad de transmisión, I. La intensidad de la luz de transmisión es atenuada por la solución
de la muestra debido, por ejemplo, a la absorción de luz en longitudes de onda específicas.
Por lo tanto, su valor es más bajo que la intensidad original I0 en la fuente de luz.

Figura 7: Atenuación de la luz por absorción de moléculas de muestra en solución.

La relación entre las dos intensidades I / I0 se define como la transmitancia T, y su unidad

es%.

Figura 8: La transmitancia es la relación entre la intensidad transmitida I y la intensidad

original I0.

La transmitancia es el valor principal determinado por la espectroscopia UV / VIS, pero no es

el único. De hecho, la absorbancia A representa un resultado adicional ampliamente utilizado
al registrar espectros UV / VIS. Se define como el logaritmo negativo de la transmitancia y
tiene una gran ventaja, que veremos en el siguiente capítulo.

Figura 9: La absorbancia es el logaritmo negativo del valor de transmitancia.

Tenga en cuenta que la absorbancia A no tiene ninguna unidad de medida. En otras palabras,
es un valor adimensional. Sin embargo, a menudo se representa mediante la letra "A" o como
AU para unidades de absorbancia. Por ejemplo, 0,3 A o 0,3 unidades de absorbancia
respectivamente.

El resultado de una medición con un instrumento UV / VIS se muestra en la siguiente figura:

 Figura 10: Espectro de transmitancia de la solución de holmio en función de la longitud de
onda.

El espectro de transmitancia de una muestra se registra como una función de la longitud de

onda. En este ejemplo particular, la muestra absorbe la luz principalmente en cuatro
longitudes de onda diferentes, es decir, a aprox. 370, 450, 480 y 540 nm. La absorción de luz
está marcada por una fuerte disminución de la transmitancia en estas longitudes de onda.
En la siguiente figura, el espectro de absorbancia de la misma muestra se da en función de la
longitud de onda. Tenga en cuenta los picos de absorción que se encuentran en las mismas
longitudes de onda. En este caso, el grado de absorción de luz está indicado por valores de
absorbancia más altos.

Figura 11: Espectro de absorbancia de la solución de holmio en función de la longitud de

onda.

En general, un espectro UV / VIS se representa gráficamente como absorbancia en función

de la longitud de onda. La ventaja de esta representación es obvia; la altura de los picos de
absorción es directamente proporcional a la concentración de la especie.

2.4 Ley de Lambert-Beer:

Al pasar por una cubeta transparente llena de solución de muestra, la intensidad de la luz se
atenúa proporcionalmente a la concentración de la muestra. En otras palabras, una solución
de muestra más concentrada absorberá más luz. Además, la atenuación también es
proporcional a la longitud de la cubeta; una cubeta más larga conducirá a una mayor absorción
de luz.
Figura 12: La atenuación de la intensidad de la luz es proporcional a la concentración de la
solución de la muestra, así como a la longitud de la cubeta.

Ambos factores se pueden resumir expresando la absorbancia A en función de la

concentración y de la longitud de la cubeta. En particular, la absorbancia A es igual al
producto del coeficiente de extinción ε, la concentración c y la longitud de la trayectoria d:

Esta relación se llama la ley de Lambert-Beer donde:

1. La concentración de la muestra c se da en mol / L o g / mL, respectivamente.
2. La longitud del camino d de la cubeta se da en cm,
3. El coeficiente de extinción ε (épsilon) es una constante específica de la muestra que
describe cuánto se está absorbiendo la muestra en una longitud de onda determinada (en L /
(cm * mol) o mL / (cm * g), respectivamente).

Cuando la longitud del recorrido es de 1 cm y la concentración es del 1% p / v, el coeficiente

de extinción se llama absorbancia específica (E)

La ley de Lambert-Beer permite la determinación de la concentración de la muestra a partir

del valor de absorbancia medido. Si se conocen el coeficiente de extinción ε y la longitud del
trayecto d, entonces la concentración c se puede calcular a partir de la absorbancia A como se
indica a continuación:

Para resultados de medición óptimos y para cumplir con la Ley de Lambert-Beer, la

absorbancia debe estar en el rango lineal del instrumento. El rango adecuado para las
mediciones óptimas, es decir, el rango de medición en el que la absorbancia es directamente
proporcional a la concentración, se da como 0.3 <A <2.5. Por lo tanto, se recomienda evitar
valores de absorbancia muy altos (A> 2.5) así como valores de absorbancia muy bajos (A
<0.3) que pueden conducir a un comportamiento no lineal de la línea de calibración. Esto se
muestra en la siguiente figura, donde los valores medidos por encima de A = 2.5 y por debajo
de A = 0.3 (línea roja punteada) se desviarían de la línea de calibración teórica (verde):

Figura 13: No linealidad: los valores medidos en rojo fuera del rango lineal se desvían de la
línea de calibración teórica verde.
 La resolución del instrumento, la relación señal a ruido y la interferencia de la luz parásita son
las principales contribuciones que pueden limitar la linealidad del instrumento. Además, las
limitaciones pueden derivar de la propia muestra como sigue:

• Soluciones de muestra altamente concentradas:

→ Utilice concentraciones del orden de 0.01 M para mediciones óptimas
• Alta concentración de sal en la muestra:
→ diluir la muestra para evitar una concentración de sal demasiado alta
• Las interacciones entre las moléculas en solución pueden llevar a una no linealidad,
especialmente a altas concentraciones y en presencia de enlaces de hidrógeno.
• El índice de refracción puede cambiar en el caso de grandes cambios de concentración,
reduciendo la linealidad
• El cambio de equilibrio químico puede tener lugar, como disociaciones y asociaciones de
moléculas, o debido a reacciones químicas.

3. Espectroscopia UV / VIS en Química Analítica.

3.1 ¿Por qué medimos los espectros UV / VIS?
Hay cinco razones principales para medir los espectros UV / VIS:
• Los espectros UV / VIS permiten identificar los componentes presentes en la
solución de muestra. Más precisamente, la posición y, en cierta medida, el perfil
de los picos de absorción permiten identificar compuestos específicos. Por
ejemplo, los compuestos orgánicos pueden identificarse por sus espectros, o la
pureza del solvente se puede verificar fácilmente mediante espectroscopia UV /
VIS.
• Se pueden utilizar picos de absorción para cuantificar la muestra investigada.
Por ejemplo, la concentración de la muestra se puede calcular a partir del valor
de absorbancia del pico:

Figura 14: Una mayor concentración conduce a un mayor valor de absorbancia

 Sobre la base de la relación entre la absorbancia y la concentración de la muestra, la

espectroscopia UV / VIS se aplica como una técnica analítica cuantitativa en segmentos de
mercado como, por ejemplo, Análisis de agua, alimentos y bebidas, industria farmacéutica,
química y biotecnológica.
 La posición de los picos en el espectro revela información sobre la estructura molecular de
la muestra. Por ejemplo, los grupos funcionales específicos de una estructura molecular,
como el carbono-oxígeno, C = O, o los enlaces dobles de carbono, C = C, absorben en
longitudes de onda características específicas.
 El espectro puede revelar propiedades físicas específicas de las moléculas de la muestra. Por
ejemplo, a partir del espectro UV / VIS es posible:
 - Calcular el coeficiente de extinción de la muestra.
- calcule el punto de fusión de proteínas y ácidos nucleicos midiendo los espectros UV
/ VIS a diferentes temperaturas
- Determinar la velocidad de una reacción mediante el monitoreo de los espectros de
absorción en función del tiempo (también conocido como mediciones cinéticas).
• Finalmente, la posición y el perfil de los picos en el espectro pueden proporcionar
información sobre el entorno microscópico de las moléculas de la muestra. Como ejemplo,
la presencia de impurezas u otros disolventes en la solución de la muestra tiene un efecto en
la posición y en el perfil de los picos. En otras palabras, los picos pueden ser más amplios o
han cambiado debido a las impurezas.
Las aplicaciones de la espectroscopia UV / VIS se centran principalmente en el análisis
cualitativo y cuantitativo, que se tratará con más detalle en el siguiente capítulo.

3.2 Análisis cualitativo: Identificación:

En el análisis cualitativo, la espectroscopia UV / VIS se puede utilizar como una herramienta
para identificar si el analito es puro y no se descompuso. Por ejemplo, esta técnica se utiliza
para el control de calidad de la materia prima entrante y para el control de pureza de
compuestos biológicamente relevantes, como los ácidos nucleicos, el ADN y el ARN.
Además, el punto de fusión del ADN se puede determinar registrando su espectro UV / VIS
a diferentes temperaturas. Finalmente, por medio de la espectroscopia UV / VIS es posible
diferenciar entre los ácidos grasos saturados e insaturados presentes en el aceite de oliva, y
así monitorear su calidad.
El análisis cualitativo se basa en la especificidad de la espectroscopia UV / VIS. De hecho,
las muestras absorben la luz de una o más longitudes de onda distintas, con valores de
absorbancia máxima específicos. Por esta razón, cada muestra tiene un espectro UV / VIS
característico y único que puede usarse para su identificación. En particular, esto se logra
comparando el espectro de la muestra con espectros de compuestos puros conocidos.
Como ejemplo del espectro UV / VIS, el espectro de clorofila a se muestra a continuación.
Esta molécula, responsable del color verde de las hojas y el pasto, tiene características
características de fuertes bandas de absorción en las regiones violeta, azul y roja de su espectro
UV / VIS.

Figura 15: Espectro UV / VIS de clorofila a

 Como segundo ejemplo, el espectro de absorción del betacaroteno se da en función de la
longitud de onda. El betacaroteno, un pigmento natural de color rojo anaranjado intenso y
muy abundante en plantas y frutas como zanahorias, calabazas y batatas, se caracteriza por
una banda de absorción única, amplia y fuerte en la región azul-violeta del espectro. Según la
USP, la solución de muestra muestra un hombro a aproximadamente 427 nm, un máximo de
absorción a aproximadamente 455 nm y un segundo máximo de absorción a aproximadamente
483 nm, mientras que la relación de absorbancia a 455 y 483 nm A (455) / A (483). ) está
entre 1.14 y 1.18. Tenga en cuenta que estas tres bandas de absorción y la relación A (455) /
A (483) permiten una identificación clara de beta caroteno como la molécula presente en la
solución. Como resultado de la absorción en estas longitudes de onda, se observa un intenso
color rojo anaranjado cuando el beta caroteno está presente.

Figura 16: Espectro UV / VIS del betacaroteno: un compuesto presente en las zanahorias

Finalmente, los espectros UV / VIS de tres compuestos diferentes se dan en la siguiente

figura. Todos ellos tienen un espectro distintivo porque todas estas moléculas tienen una
estructura química diferente. Esto permite la identificación de las muestras mediante
espectroscopia UV / VIS.

Figura 17: Cada muestra tiene un espectro UV / VIS específico. Esta relación única permite caracterizar
la muestra. En este caso, los compuestos malvidina, clorofila a y clorofila b pueden reconocerse fácilmente
por sus espectros individuales.
 3.3 Análisis cuantitativo: determinación de la concentración.
Sobre la base de la Ley de Lambert-Beer, la concentración de un compuesto en una solución
se puede determinar cuantitativamente mediante espectroscopia UV / VIS. Para realizar eso,
primero se determina una línea de calibración midiendo la absorción de varias soluciones
estándar de concentración conocida. De esta manera, se puede determinar la concentración de
muestras tales como ADN, ARN, proteínas, carbohidratos o compuestos orgánicos.

Figura 18: la atenuación del haz de luz permite determinar la concentración de la muestra.
La relación lineal entre la absorbancia y la concentración de una muestra abre la puerta a una
variedad de análisis cuantitativos. En la siguiente tabla, se dan tres aplicaciones principales de
la ley de Lambert-Beer:
Analito / Parámetro Segmento de mercado
- Iones metálicos, por ejemplo. hierro, cobre, níquel - Pharma
Determinación de - Iones inorgánicos, por ejemplo. nitrato - Agua
concentración - Demanda química de oxígeno (DQO) - Alimentos y bebidas
- Galvanoplastia
Cinética enzimática: determinación de la velocidad de catálisis.
- La glucosa oxidasa cataliza la oxidación de la β-D-glucosa por el
oxígeno (725 y 415 nm)
Monitoreo de la - Oxidación y reducción de los nucleótidos de piridina.
concentración de analitos - (NAD + / NADH, 340 nm). - Farma (Cinética)
en función del tiempo - Tasa de oxidación del colesterol por catálisis con colesterol
oxidasa (500 nm)
- Prueba cinética colorimétrica de GPO para los triglicéridos (520
nm)
- Constante de disociación ácida pKa
- Constante de formación de complejos Kf - Pharma
Parámetros fisicoquímicos
- Coeficiente de partición / distribución logP / logD - Investigación
- Pruebas de disolución.

3.3.1.línea de calibración:
Para determinar una concentración desconocida de una solución de muestra mediante
espectroscopia UV / VIS, primero se debe crear una línea de calibración. Esto se realiza
midiendo la absorción de luz de varias soluciones estándar de diferentes concentraciones
conocidas en una longitud de onda fija y predefinida. En el siguiente ejemplo, se midieron
5 soluciones estándar de concentraciones crecientes a una longitud de onda predefinida:

Figura 19: El paso de calibración y la lista estándar para determinar la línea de calibración se indican en la pantalla del instrumento.
Se obtuvo una línea de calibración trazando los valores de absorbancia en función de la concentración.
Finalmente, una regresión lineal de los valores medidos da la línea de calibración:

Figura 20: Se determinan los valores de absorbancia de las soluciones estándar. Una regresión lineal de
los puntos de datos da la línea de calibración.
3.3.2 Determinación de la muestra:
Usando la línea de calibración, ahora se puede determinar una muestra desconocida a
partir de su absorbancia:

Figura 21: Determinación de concentración:

La absorbancia de una solución de muestra desconocida se mide y se compara con la línea de calibración
para determinar su concentración

4. Diseño del espectrofotómetro:

Un espectrofotómetro generalmente consta de cuatro componentes:
1. Una fuente de luz adecuada que cubra el espectro de interés UV / VIS. En general, se usa una
lámpara que contiene un gas como el xenón, o una combinación de dos lámparas diferentes,
como el tungsteno / deuterio.
2. Se necesita un portamuestras adecuado para sostener la muestra.
- Las muestras de líquidos se colocan en cubetas, que pueden estar hechas de cuarzo, vidrio de
borosilicato o plástico acrílico. Sin embargo, el vidrio y el plástico acrílico no transmiten luz
UV y solo deben usarse para mediciones en el rango de luz visible.
- Las muestras sólidas se pueden montar en un soporte adecuado para colocarlas en la
trayectoria óptica del espectrofotómetro para medir la luz transmitida.
 3. Se necesita un elemento de dispersión para distribuir la luz en longitudes de onda separadas.
Puede ser un prisma de cuarzo o una rejilla de difracción, es decir, un componente óptico con
una estructura periódica capaz de difractar la luz.
4. Finalmente, la intensidad de la luz transmitida se registra mediante un detector adecuado, como
un fotomultiplicador, una matriz multicanal (por ejemplo, una matriz de fotodiodos o PDA) o
un dispositivo de carga acoplada (CCD), similar a una cámara digital. Los detectores PDA y
CCD utilizan un material semiconductor fotosensible para convertir la luz en una señal
electrónica que luego es grabada por el instrumento.

4.1 Comparación de diseño:

Los espectrofotómetros UV / VIS se pueden clasificar de acuerdo con la geometría de los
componentes que forman el óptico.Sistema de grabación de espectros. Las siguientes dos
configuraciones se utilizan generalmente en espectroscopia UV / VIS:
• Espectrofotómetro de barrido
• Espectrofotómetro de matriz

4.1.1 Espectrofotómetro de barrido:

El principio de funcionamiento de un espectrofotómetro de barrido convencional se basa en
la medición del valor de transmitancia en cada longitud de onda. La luz se dispersa primero
en longitudes de onda individuales mediante una rejilla de reflexión. La rejilla se gira para
seleccionar individualmente cada longitud de onda que luego se envía a través de una cubeta.
Se registra la transmitancia en esta longitud de onda específica. Todo el espectro se obtiene
cambiando continuamente la longitud de onda de la luz (es decir, escaneando) que llega a la
solución de muestra girando la rejilla:

Figura 22: Espectrofotómetro de barrido: los haces de luz de longitudes de onda específicas
se dirigen a la cubeta.

Tenga en cuenta que la exploración de los espectrofotómetros requiere algo de tiempo para
realizar una exploración completa del espectro, ya que la rejilla debe ser girada
mecánicamente por un motor. El proceso de exploración también puede llevar a una
disminución en la precisión y reproducibilidad de la selección de la longitud de onda,
dependiendo de la velocidad de exploración del espectrofotómetro.
4.1.2 Espectrofotómetro de matriz:
En esta configuración, la muestra está iluminada por un haz de luz que consta de todos los
componentes espectrales de la gama UV / VIS, un continuo. En otras palabras, la muestra
en la cubeta absorbe simultáneamente diferentes longitudes de onda de la luz. La luz
 transmitida es difractada luego por una rejilla de reflexión ubicada después de la cubeta,
como se muestra en el diagrama a continuación.

Figura 23: Espectrofotómetro de matriz: la luz de todo el rango espectral se dirige hacia la
cubeta de muestra.

Este diseño también se conoce como "óptica inversa"; Solo después de pasar la muestra, la
luz es difractada por la rejilla. Posteriormente, la luz difractada de varias longitudes de onda
se dirige hacia el detector. El detector, con su amplia gama de material semiconductor
fotosensible, permite la medición simultánea de todas las longitudes de onda del haz de luz
transmitido.
Con esta configuración, medir todo el espectro UV / VIS es generalmente más rápido que
usar un espectrofotómetro de escaneo convencional, ya que el espectro se registra
simultáneamente en todas las longitudes de onda. Además, un detector de matrices tiene una
función integradora que acumula mediciones individuales para mejorar la señal, lo que lleva
a una fuerte relación señal / ruido, y por lo tanto a una mejor calidad de la señal del espectro
medido.
Los espectrofotómetros de matriz presentan un enfoque innovador para acelerar el escaneo
de espectro completo basado en tecnología de óptica inversa. El diseño robusto sin partes
ópticas móviles garantiza un rendimiento óptico muy bueno.

4.1.3 Vías ópticas:

Los espectrofotómetros UV / VIS pueden tener una vía óptica de haz simple o doble, es
decir, la forma en que un haz de luz de la lámpara pasa a través de la cubeta de muestra
para llegar al detector.

• Configuración de haz único:

La configuración de haz único es la configuración más simple y fácil para la espectroscopia
UV / VIS. El haz de luz se guía directamente a través de la muestra hacia el detector. Una
cubeta que contiene solo el solvente debe medirse primero para determinar el valor en
blanco (vea el capítulo anterior). Después de medir el valor en blanco, la cubeta de solvente
se reemplaza por una cubeta que contiene la muestra. Lo último se mide para obtener el
espectro de absorción de la muestra.

Figura 24: vía óptica de haz simple.

 • Configuración de doble haz:
En una configuración de doble haz, el haz de luz se divide en una referencia y un haz de
muestra. Hay dos opciones diferentes disponibles para la vía óptica.

- Simultánea en el tiempo:
El haz de luz de la lámpara se divide en dos haces de intensidades iguales. Cada rayo pasa
a través de una cubeta diferente; la cubeta de referencia, que se llena solo con solvente,
mientras que la segunda cubeta contiene la solución de muestra. Las intensidades de ambos
haces se miden simultáneamente por dos detectores.

- Alternando en el tiempo:
Esta configuración se logra dirigiendo la trayectoria de la luz con un cortador óptico (OC),
que es un espejo seccional giratorio. La luz se dirige alternativamente a través de una
muestra y una celda de referencia. Un detector único mide ambos haces de luz uno tras
otro.

Figura 25: Vía óptica de doble haz: 1. Simultánea en el tiempo, y 2. Alternando en el

tiempo con un cortador óptico (OC).

4.2 Espectroscopia UV / VIS a base de cubeta:

Mettler-Toledo desarrolló un espectrofotómetro de matriz de un solo haz que permite
mediciones rápidas y precisas en el rango UV / VIS. La fuente de luz consiste en una
lámpara de flash de xenón para las regiones de longitud de onda de luz ultravioleta (UV)
y visible (VIS) y de infrarrojo cercano que cubren un rango espectral desde 190 hasta 1100
nm. Los flashes de la lámpara se enfocan en una fibra de vidrio que impulsa el haz de luz
hacia una cubeta que contiene la solución de muestra. El haz pasa a través de la muestra y
las longitudes de onda específicas son absorbidas por los componentes de la muestra.

Figura 26: Espectrofotómetro de haz de haz único basado en cubeta:

El haz de luz de la lámpara pasa a través de la muestra, se difracta mediante la rejilla y se dirige al
detector de matrices.
La luz restante se recoge después de la cubeta por una fibra de vidrio y se conduce a un espectrógrafo.
El espectrógrafo consta de una rejilla de difracción que separa la luz en las diferentes longitudes de
onda y un sensor CCD para registrar los espectros, respectivamente. Todo el espectro se mide
simultáneamente, lo que permite una grabación rápida.

4.3 Micro-volumen de espectroscopia UV / VIS:

Mettler-Toledo proporciona un espectrofotómetro capaz de realizar mediciones de micro-volumen
UV / VIS. Este instrumento es capaz de medir volúmenes muy pequeños y muestras altamente
concentradas. El método es bastante sencillo. La muestra se pipetea directamente en la plataforma de
medición, sin dilución adicional. Por lo tanto, se evitan los errores de manipulación. Además, la
selección de una longitud de trayectoria específica permite la medición en un amplio rango de
concentración con tan solo 1 μL de muestra.
Las mediciones se realizan en la plataforma de micro-volumen cubierta por un brazo móvil montado
en la parte superior del instrumento. El espectrofotómetro tiene tanto una plataforma de micro-
volumen como un soporte para cubetas. Dependiendo de la aplicación seleccionada, la luz puede
dirigirse hacia la plataforma de micro volumen o la cubeta de 1 cm.
La luz transmitida luego se enfoca en la rejilla donde ocurre la difracción. Los haces de luz difractados
de diferentes longitudes de onda se dirigen luego hacia el detector.

Figura 27: espectrofotómetro de matriz de micro-volumen:

El haz de luz se dirige a pasar la muestra en la plataforma de micro volumen. Alternativamente, la
viga puede ser dirigida en una cubeta de 1 cm.

Cuando el brazo está en posición abierta, se puede acceder fácilmente a la plataforma de micro-
volumen con una pipeta desde el lado izquierdo o derecho. La tapa curvada en la parte superior del
instrumento permite un posicionamiento conveniente de la mano del operador para guiar con
seguridad la punta de la pipeta. Durante la medición, el brazo se bloquea de forma segura a una
longitud de recorrido definida con precisión y no se puede abrir hasta que se complete la medición.
 Figura 28: espectrofotómetro de matriz de micro-volumen:
La muestra se agrega con una pipeta en la plataforma de micro-volumen. El brazo móvil se cierra
para la medición.

5. Aplicaciones
5.1 Longitud de onda fija:
La medición de longitud de onda fija (FW) es la aplicación más simple de un espectrofotómetro. Es
una medición de longitud de onda única o múltiple y, como para todos los demás tipos de medición,
el resultado se puede informar en absorbancia o la transmisión. Se pueden realizar otros cálculos para
obtener el resultado final, por ejemplo, una concentración de una sustancia.

5.1.1 Aplicación de FW en alimentos y bebidas.

En la industria de alimentos y bebidas, la espectrofotometría UV / VIS se usa para monitorear y
mejorar la calidad y consistencia del producto. Además, con este método también se puede observar
la influencia del material de embalaje y los estabilizadores, así como los procesos de deterioro y
degradación química.
Una aplicación típica en este segmento de mercado es la verificación de la pureza del aceite de oliva,
que permite que el producto se clasifique como "Virgen Extra", "Virgen" o simplemente "Aceite de
oliva". Existen normas para la evaluación del aceite de oliva en función de las características de
absorbancia de ciertas moléculas en el espectro UV / VIS. El aceite de oliva contiene
aproximadamente 98% de triglicéridos. Los ácidos grasos insaturados en el aceite son susceptibles
de descomposición y oxidación. La oxidación de los ácidos grasos libres provoca la formación de
peróxidos. Esto lleva a la rancidez y degradación del aceite de oliva a lo largo del tiempo. Además
de otros parámetros, este efecto se evalúa mediante di-enes conjugados y tri-enes de ácidos grasos
insaturados (enlaces dobles C = C conjugados) que absorben en el rango de 230 a 270 nm.
Los estándares de aceite de oliva del Comité Internacional de la Oliva (COI) especifican exactamente
el umbral de medición que se debe cumplir para los aceites para que se califiquen como virgen extra,
virgen, etc. La calidad del aceite se determina observando el comportamiento de absorbancia de una
solución al 1% en isopropanol entre 200 y 400 nm. Los niveles elevados de absorbancia en el rango
espectral de 200 a 400 nm indican un aceite oxidado (de peor calidad). La absorbancia a K232 nm,
K270 nm y ΔK se correlaciona con el estado de oxidación al detectar compuestos oxidados
específicos y también detecta una posible adulteración con aceites refinados. En la siguiente figura
podemos ver los espectros ultravioleta del Aceite de Oliva Virgen Extra de buena calidad que no
muestran picos, en comparación con los picos obvios de un aceite de oliva de mala calidad,
presentados como muestras de aceite de oliva 4 y 5.
 Figura 29: Absorción medida en una solución al 1%, de aceite de oliva virgen extra (azul) y aceite
de oliva virgen (verde)

Figura 30: Aceite de oliva.

Los valores bajos se correlacionan con el aceite de alta calidad, ya que la absorbancia UV detecta
los estados tempranos y posteriores de oxidación. Esto se puede observar de acuerdo con la tabla a
continuación, que está regulada según el reglamento de la CEE (Comunidad Económica Europea;
Consejo de las Comunidades Europeas):

5.1.2 Aplicación de FW en la industria química:

La espectroscopia de absorción UV es uno de los mejores métodos para determinar la pureza de las
soluciones orgánicas. Se pueden observar picos adicionales que aparecen en longitudes de onda
específicas debido a las impurezas en la muestra.
Un ejemplo en la industria química es el control de pureza en el alcohol. El alcohol puede estar
contaminado por benceno, que absorbe la luz a 280 nm, mientras que el alcohol absorbe a 210 nm.
La medición del espectro UV / VIS puede indicar fácilmente si la muestra está contaminada si
existe un pico adicional a 280 nm.

5.2 Determinación de la concentración por cuantificación:

La cuantificación o la determinación de la concentración de una sustancia mediante espectroscopia
UV / VIS se basa en la Ley de Lambert-Beer, descrita en el capítulo 2.4, que establece que la
absorbancia de una solución es directamente proporcional a la concentración de la sustancia
absorbente en la solución y Longitud de recorrido de la cubeta. Por lo tanto, para una longitud de
trayectoria fija, la espectroscopia UV / VIS se puede usar para determinar la concentración de la
sustancia absorbente en una solución. Sin embargo, es necesario saber cuánto cambia la absorbancia
con la concentración. Esto puede tomarse de referencias, como tablas de coeficientes de extinción, o
más fácilmente, a partir de una curva de calibración.
El primer paso en un análisis cuantitativo es seleccionar una longitud de onda adecuada. La longitud
de onda se elige normalmente en un pico máximo, es decir, en el pico de la banda de absorción,
porque el cambio en la absorbancia para un cambio de concentración dado es máximo, lo que lleva a
una mayor sensibilidad y precisión en las mediciones. El efecto relativo de otras sustancias o
impurezas es por lo tanto menor. Además, la velocidad de cambio de la absorbancia con la longitud
de onda es menor, y la medición no se ve tan gravemente afectada por pequeños errores en el ajuste
de la longitud de onda.
El siguiente paso de la cuantificación es la medición de estándares conocidos en la longitud de onda
elegida. La absorbancia de los estándares se grafica contra la concentración como se muestra en la
figura del capítulo 3.3.1. La curva de calibración para un análisis espectrofotométrico debe aproximar
la muestra lo más cerca posible y abarcar un rango adecuado de concentraciones de sustancias.
Idealmente, se necesitan al menos tres concentraciones diferentes de la sustancia, aunque se puede
aplicar una sola. En la práctica, cinco concentraciones diferentes producirán una curva de calibración
más precisa. La absorbancia presenta una relación lineal con la concentración y puede ajustarse una
curva de regresión de primer orden a los puntos de datos.
Una muestra de una concentración desconocida puede determinarse entonces utilizando la curva de
calibración.

5.2.1 Determinación de la concentración en institutos de salud.

La espectroscopia UV / VIS se ha utilizado eficazmente en la ciencia médica para el análisis de rutina
de muestras de sangre y orina. Las diferencias espectrales entre sangre sana y sangre enferma pueden
compararse fácilmente.
La cuantificación de la hemoglobina en sangre ha sido un parámetro diagnóstico clave para diversas
enfermedades como la anemia, la policitemia y la deshidratación. La hemoglobina está formada por
cuatro cadenas peptídicas, cada una de las cuales lleva un grupo hemo. Es transportado por los
glóbulos rojos y transporta oxígeno desde los pulmones a los tejidos periféricos para mantener la
viabilidad de las células.

Figura 31: curva estándar con hemoglobina recién preparada.

Para verificar el contenido total de hemoglobina en la sangre, el plasma se elimina de la sangre

anticoagulada y los eritrocitos se suspenden en una solución de sodio isotónica. La eritrólisis se
realiza antes de que la absorbancia pueda medirse a una longitud de onda de 400 nm. La
hemoglobina también se analiza en muestras de orina.

5.2.2 Determinación colorimétrica del fosfato:

El fósforo es el undécimo elemento más abundante en la superficie de la tierra y se encuentra más
comúnmente como fosfato. Juega un papel importante en los procesos bioquímicos y es un factor
clave en las aguas superficiales. El aumento de las concentraciones de fosfato está relacionado con el
aumento de las tasas de crecimiento de las plantas. Por lo tanto, el análisis del fósforo es muy
importante en muchos campos, incluidas las ciencias médicas y clínicas, la agricultura, la metalurgia
y la ciencia ambiental. Además, en los últimos años se han usado grandes cantidades de fosfato en
bebidas, detergentes, fertilizantes y también en las industrias azucareras. En este contexto, la
determinación colorimétrica del fosfato en varias muestras de diferentes segmentos de mercado se
realiza mediante espectrofotometría UV / VIS. La base de la técnica colorimétrica es la relación
directa entre la intensidad del color de una solución y la concentración del componente coloreado (la
especie de analito) que está contenida.
El fosfato reaccionará fácilmente con el molibdato de amonio en presencia de agentes reductores
adecuados para formar un complejo de color azul, cuya intensidad es directamente proporcional a la
concentración de fosfato en la solución. El contenido de fosfato de una muestra desconocida puede
obtenerse trazando primero las absorbancias de una serie de soluciones estándar contra las
concentraciones correspondientes, dando así una curva de calibración. La concentración desconocida
de fosfato en la muestra puede determinarse a partir del gráfico.

Figura 32: Serie de soluciones estándar de fosfato preparadas.

Figura 33: Espectros de absorbancia trazada de las concentraciones correspondientes.

Figura 34: Valores de absorbancia a 880 nm frente a la concentración de cada solución estándar que
conduce a la curva de calibración.
La concentración desconocida de fosfato en la muestra se puede determinar a partir de la curva de
regresión lineal.
5.3 Escaneo:
En contraste con la medición de longitud de onda fija, las mediciones de barrido espectral determinan
la absorbancia o transmitancia de una muestra en un rango de longitud de onda específico o en todo
el rango del espectro, típicamente de 190 a 1100 nm. Tras la medición de la exploración, el análisis
más aplicado es la detección de picos y valles en el espectro. Un pico es donde la absorbancia alcanza
un máximo y un valle es donde la absorbancia es más pequeña entre dos picos. La altura y la ubicación
de los picos y valles son interesantes, ya que dan una indicación de la composición y pureza de la
muestra. Por ejemplo, a partir de la ubicación de los picos y la combinación de picos, se puede
concluir si el compuesto está saturado o insaturado. Además, la identificación de un compuesto.puede
gestionarse comparando el espectro con un espectro compuesto conocido de una base de datos.
Escaneo UV / VIS Se pueden usar métodos para caracterizar compuestos aromáticos y olefinas
aromáticas.

5.3.1 Aplicación de escaneo de nicotinamida en alimentos y bebidas

A modo de ejemplo, el espectro de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) se muestra a
continuación. La NAD es una coenzima importante que se encuentra en todas las células vivas.
Debido a la presencia de varios anillos aromáticos en la base de adenina, absorbe la luz en el rango
UV. La ejecución de un análisis de exploración con una muestra de NAD muestra que la absorbancia
máxima se produce a 260 nm. El valor de absorbancia al máximo en el siguiente ejemplo es 1.

Figura 35: Espectro de NAD + que muestra la absorbancia máxima a 260 nm y la absorbancia
resultante de aproximadamente uno.

Normalmente, dos parámetros son importantes y se registran de un espectro UV / VIS:

- Lambda max: la longitud de onda del analito donde se alcanza la absorbancia máxima.
- La cantidad de luz absorbida en unidades de absorbancia, detectada en lambda máx.

5.3.2 Análisis de protectores solares en la industria cosmética.

La creciente conciencia de los riesgos del cáncer de piel con la exposición al sol requiere que los
productos de protección solar se prueben y etiqueten adecuadamente. Las diversas formulaciones de
protección solar disponibles en el mercado exigen un método de análisis sofisticado.
Los filtros solares reflejan o absorben la radiación ultravioleta (UV) antes de que lleguen a la piel.
La región espectral que debe bloquearse en los productos de protección solar es la región UV-A y
UV-B, que está entre 280 y 400 nm. La luz UV-C más enérgica ya está bloqueada por el oxígeno
diatómico (de 100 a 200 nm) o por el ozono (oxígeno triatómico) (200 - 280 nm) en la atmósfera. El
ingrediente activo de la protección solar que protege la piel de la luz solar debe estar presente en
cantidad y uniformidad suficientes para garantizar el bloqueo de los rayos UV-A y UV-B para que
la piel no se queme con el sol.
El método tradicional para la efectividad del análisis de pantalla solar se basa en un análisis
cuantitativo de una muestra diluida. Se miden una serie de estándares basados en diferentes
 concentraciones del ingrediente activo y se desarrolla un método cuantitativo basado en la Ley de
Lambert-Beer. Los espectros representativos de dos formulaciones de protector solar diferentes se
presentan en la siguiente figura.

Figura 36: Escaneo espectral de protección solar. Formulación A (azul) con mayor
absorbancia de la luz ultravioleta en comparación con la formulación B (verde) en
el rango de 280nm a 350nm.
La primera formulación, visualizada en azul, absorbe la mayor parte de la radiación UV entre 280 y 350
nm, lo que indicaría que esta formulación de protección solar sería un protector fuerte. En contraste, la
segunda formulación, representada en verde en el espectro, absorbe solo alrededor del 60% de la radiación
entre 280 y 350 nm.
La formulación del protector solar final se puede medir directamente utilizando dos placas de vidrio
transparente UV entre las cuales se extiende una capa delgada del producto. Las placas de vidrio
exprimido se colocan en un soporte de muestra sólido en el compartimiento de la muestra antes de la
medición del espectro.
5.3.3 Identificación de cianocobalamina (vitamina B12) en la industria farmacéutica
La espectroscopia de absorción ultravioleta y visible es una técnica útil para la identificación de
compuestos farmacéuticos. Varios ejemplos de ensayos espectroscópicos de un solo componente de
vitaminas como la cianocobalamina (vitamina B12), riboflavina, ácido fólico y vitamina A se incluyen en
la Farmacopea de EE. UU. (2015). La cianocobalamina a menudo se identifica mediante
espectrofotometría UV / VIS mediante el modo de longitud de onda de exploración. Además, la
determinación de la concentración mediante una cuantificación utilizando el estándar de referencia USP
de cianocobalamina se realiza a 361 nm. El contenido de cianocobalamina se calcula teniendo en cuenta
la absorbancia específica (E = 207), el coeficiente de extinción para una solución al 1% medida en una
cubeta de 1 cm.
Para la identificación y caracterización de la cianocobalamina, se selecciona el rango espectral entre 200
y 700 nm y se identifican los picos. La solución estándar muestra 3 máximos de absorción, a 278, 361 y
550 nm. Los criterios de aceptación del espectro de absorción se indican a continuación: 278 ± 1 nm, 361
± 1 nm y 550 ± 2 nm. La relación de absorbancia A361 / A278 es de 1.70 a 1.90, y la relación de
absorbancia A361 / A550 es de 3.15 a 3.40 para cumplir con los criterios de aceptación.
 Figura 37: Se presenta el espectro de 3 mg / 100 ml de cianocobalamina. Se pueden observar tres
máximos de absorción a 278.5 nm, 361.5 nm y 550.9 nm.

5.4 Cinética:
La espectrofotometría UV-Vis se usa a menudo para monitorear el cambio de la concentración del reactivo
o los productos por absorbancia a una longitud de onda específica a lo largo del tiempo. Esta es una
reacción en función del tiempo y, por lo tanto, a menudo se denomina mediciones de frecuencia. Las
mediciones cinéticas se utilizan para investigar la actividad de la enzima o las tasas de reacción, así como
la afinidad de la interacción enzima-sustrato. Este tipo de análisis es especialmente frecuente en el campo
de la biotecnología, la medicina y los alimentos, así como en la química. Los métodos cinéticos son
particularmente útiles para muestras en las que algunos componentes interferentes están presentes en
concentraciones variables de muestra a muestra. Por ejemplo, la espectroscopia de absorción UV / VIS se
aplica en muestras de color como sangre entera, refrescos embotellados / enlatados y jugos. Se puede
realizar un análisis específico midiendo la velocidad de cambio en la absorbancia de una muestra sin tener
que realizar una química complicada y lenta para eliminar el fondo de color interferente o aplicar algún
método de separación.
La aplicación más extendida de las mediciones de la velocidad espectrométrica es el estudio de las enzimas
(proteínas que funcionan como catalizadores). Se pueden realizar mediciones directas de la enzima y la
concentración, pero como esto es muy elaborado y los productos químicos son costosos, las enzimas son
analizadas más bien por sus propiedades catalíticas y la reacción que catalizan. La detección y medición
indirectas de enzimas pueden realizarse mediante moléculas que son modificadas por las enzimas o
sustratos, así como por moléculas que cooperan con las enzimas, también denominadas coenzimas. Las
enzimas son altamente específicas y sensibles, lo que permite el análisis cuantitativo con poca o ninguna
preparación de la muestra.
5.4.1 Determinación enzimática de glucosa en productos alimenticios:
Las aplicaciones típicas en el segmento de alimentos y bebidas son la determinación enzimática
cuantitativa de carbohidratos como sacarosa, glucosa, fructosa, almidón y fibra dietética total. Dado que
las enzimas son altamente específicas para una molécula en particular, las mediciones son reproducibles,
rápidas y son adecuadas para el análisis cuantitativo sin la necesidad de ninguna preparación de muestra,
como la purificación.
Muchas reacciones enzimáticas se producen simultáneamente con el siguiente sistema enzimático: un
sistema de coenzima dinucleótido nicotinamida adenina en el que la forma reducida de dinucleótido
adenina nicotinamida, abreviada como NADH, muestra el máximo de absorción a 340 nm con un
coeficiente de extinción de 6'220 mol ⁄ (L *cm). La forma oxidada de la molécula, NAD +, no se absorbe
en esta longitud de onda, pero ambos, NAD + y NADH, presentan una absorbancia máxima a 260 nm.
NAD + tiene un coeficiente de extinción de 16'900 mol ⁄ (L * cm). La siguiente figura muestra los
espectros de ambos compuestos con el espectro NADH en azul y el sustrato NAD + en rojo.

Figura 38: Espectro de absorbancia de NAD + y NADH

Los carbohidratos se pueden determinar por una reacción enzimática en un enfoque cinético. Para el
análisis enzimático de la glicosa, se usan típicamente dos enzimas del proceso de glucólisis. La glucólisis
es la degradación de la glucosa y un proceso importante en todas las criaturas vivientes. El primer paso
de la glucólisis es la fosforilación de la glucosa por la enzima hexocinasa, donde se utiliza el ATP y se
convierte en ADP.

Posteriormente, la glucosa-6-fosfato se oxida luego a 6 fosfogluconato en presencia de NAD + oxidado

en una reacción catalizada por glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Durante esta oxidación, una cantidad
equimolar de NAD + se reduce a NADH. El consiguiente aumento de la absorbancia a 340 nm es
directamente proporcional a la concentración original de glucosa en la muestra.
Esta detección enzimática indirecta de glucosa se puede aplicar igualmente para la detección de ATP.
Ambas sustancias se pueden determinar a través de esta reacción acoplada de la hexocinasa y la glucosa-
6-fosfato deshidrogenasa.
5.4.2 Actividad de la enzima fosfatasa alcalina:
Las fosfatasas alcalinas son un grupo de enzimas de la clase Hydrolase que separan un grupo fosfato
terminal de un éster orgánico en solución alcalina. Su pH óptimo es generalmente alrededor de pH 10,
pero esto varía con el sustrato particular y la isoenzima. Estas enzimas difieren en la secuencia de
aminoácidos pero catalizan la misma reacción química y generalmente muestran diferentes parámetros
cinéticos o diferentes propiedades reguladoras. Las fosfatasas alcalinas están disponibles en casi todos los
tejidos del cuerpo y los niveles séricos de esta enzima son de interés en el diagnóstico de varias
enfermedades.
La fosfatasa alcalina cataliza la hidrólisis del fosfato de ρ-nitrofenilo (pNPP) en ρ-nitrofenol. Cuando la
enzima fosfatasa alcalina reacciona con pNPP, se producen el fosfato inorgánico y el nitrofenol ρ. El
pNPP es incoloro pero el ρ-nitrofenol tiene una fuerte absorbancia a 405 nm, presentando un color
amarillo estable en una solución alcalina. En el máximo de absorción, se puede medir la concentración de
sustrato [S] y la velocidad [v]. La velocidad de formación de ρ-nitrofenol se mide como un aumento de la
absorbancia a 405 nm que es proporcional a la actividad de la enzima en la muestra.
El procedimiento se estandariza en las condiciones especificadas por el coeficiente de extinción molar de
ρ-nitrofenol 18.75 mol ⁄ (L * cm) a 405 nm. Los resultados se basan en el cambio en la absorbancia por
unidad de tiempo. La Unidad Internacional IU / L se define como la cantidad de enzima que cataliza la
transformación de un micromol de sustrato por minuto en condiciones específicas.
Esta aplicación se utiliza principalmente en diagnósticos médicos. La fosfatasa alcalina se encuentra en
altas concentraciones en el hígado, en el epitelio del tracto biliar y en los huesos. Los niveles normales
dependen de la edad y aumentan durante el desarrollo del hueso. El aumento de los niveles en comparación
con los niveles normales se asocia principalmente con enfermedades hepáticas y óseas. Las muestras
típicas son plasma y suero heparinizados, que están libres de hemólisis.
5.4.3 Oxidación de yoduro por peróxido de hidrógeno.
La cinética de una reacción, la evolución de una reacción química en función del tiempo, se describe
mediante leyes de velocidad y constantes de velocidad. Para aplicar la ley y las constantes correctas a una
reacción química específica, es necesario conocer su orden, es decir, la relación entre la concentración y
la velocidad de la reacción. Cuando la velocidad de reacción es directamente proporcional a la
concentración del reactivo, la reacción es de primer orden con respecto a este reactivo. De manera similar,
cuando la concentración de un reactivo no tiene influencia en la velocidad de reacción, es de orden cero
con respecto a este reactivo. Las reacciones de segundo orden tienen una velocidad de reacción que es
proporcional al cuadrado de la concentración de un reactivo y así sucesivamente.
El objetivo de este estudio es determinar el orden de reacción de la oxidación del yoduro por peróxido de
hidrógeno en solución ácida. El curso de la reacción se controla mediante la formación de tri-yoduro (I3−):

La determinación de los órdenes de reacción de los reactivos se logra al realizar una serie de experimentos
en los cuales la concentración de uno de los reactivos varía, mientras que las concentraciones de los otros
reactivos permanecen constantes. La cinética de la reacción se siguió midiendo la intensidad de la banda
de absorción a 353 nm que está relacionada con la formación de tri-yoduro. La siguiente figura muestra
el aumento de la absorbancia a 353 nm en función del tiempo para cuatro muestras con concentraciones
crecientes de peróxido.

Figura 39: Valores de absorbancia a una longitud de onda fija de 353 nm en función del tiempo para
aumentar las concentraciones de peróxido: azul claro = 0,004 M, azul oscuro = 0,006M, verde = 0,008M
y naranja = 0,01 M de peróxido,
Se deben realizar mediciones similares variando la cantidad de los otros dos reactivos, el yoduro y el
ácido. Las órdenes de reacción pueden determinarse a partir de la medición de las velocidades de reacción
iniciales. Si la velocidad de reacción es proporcional a la concentración del reactivo, una gráfica de la
velocidad inicial (V0) en función de la concentración será lineal.

Figura 40: Tasas iniciales en función del volumen de reactivo para los tres reactivos; iones de peróxido
(arriba), yoduro (medio) e hidronio para varias concentraciones de ácido (abajo).

La figura anterior muestra gráficos de tasas iniciales en función del volumen de reactivo para los tres
reactivos: peróxido H2O2, yoduro I y ion hidronio H3O +:
(a) la tasa inicial aumenta linealmente con la concentración de peróxido
(b) la tasa inicial aumenta linealmente con la concentración de yoduro
(c) la velocidad inicial aumenta linealmente con la concentración de ácido, pero a una concentración
cero, la velocidad inicial no es cero.
A partir de estas observaciones, la relación experimental entre la velocidad de reacción inicial y las
concentraciones de reactivos (la concentración se expresa con los corchetes) se puede definir como
sigue:

Esto también se puede escribir en una forma de cinética química más común:

k y k 'son las constantes o coeficientes de velocidad.

La ley de velocidad en este caso consta de dos términos: el primer término es de primer orden con
respecto a la concentración de peróxido de hidrógeno y yoduro, mientras que es de orden cero con
respecto a la concentración de ácido y, por lo tanto, es de segundo orden en general. El segundo término
es de primer orden con respecto a la concentración de todos los reactivos y, por lo tanto, es de tercer
orden en general. Finalmente, la ley de velocidad indica que el ácido actúa como un catalizador en la
oxidación del yoduro por peróxido de hidrógeno.
Conociendo esta ley de velocidad, se puede aplicar la descripción correcta de la ley de velocidad para
ajustar las mediciones y determinar las constantes de velocidad de la reacción.
5.5 Bio Aplicaciones:
5.5.1 Aplicación de FW en ciencias de la vida.
La espectroscopia de absorbancia UV / VIS es el método preferido para estimar la concentración de ácido
nucleico como el ADN o ARN y para analizar la pureza de una preparación debido a su facilidad de uso.
Las purinas y pirimidinas en los ácidos nucleicos naturalmente absorben la luz a un máximo de 260 nm.
En el uso rutinario, para muestras puras, generalmente se acepta que el uso de una longitud de trayectoria
de 10 mm y una unidad de absorción de 1 A es igual a una concentración de 50 μg / ml de ADN y 40 μg
/ ml para el ARN. Para los oligonucleótidos, la concentración es de alrededor de 33 µg / ml, pero esto
puede variar con la longitud de la secuencia de la cadena y la base. Por lo tanto, se recomienda una
calculadora de oligo para obtener un resultado más preciso para el concentración.
Un indicador de la pureza de la muestra de ácido nucleico es la relación de la absorbancia a 260 nm sobre
la absorbancia a 280 nm. Las proteínas absorben a 280 nm y, por lo tanto, el ADN contaminado con
proteína reducirá el valor de la relación de 260/280. Las fuentes típicas de contaminación en la preparación
de ácido nucleico son etileno-diamina-tetra-acético (abreviado como EDTA), sales caotrópicas y fenol,
que producen picos en el rango de 220 a 230 nm región. Por esta razón, a menudo se aplica la relación de
la absorbancia a 260 nm sobre 230 nm.
Como podemos ver en el siguiente gráfico, las proteínas muestran su máximo de pico a 280 nm. Ni las proteínas
ni los ácidos nucleicos absorben la luz a una longitud de onda de 320 nm y, por lo tanto, se usa la absorbancia a
320 nm para aplicar una corrección de fondo.

Figura 41: Espectro de absorción de ADN (azul) a 260 nm y proteína BSA (verde) a 280 nm

5.5.2 Determinación de la concentración de ácido nucleico y pureza según Christian Warburg

El método de Christian Warburg se utiliza para determinar la concentración de ácido nucleico en presencia de
contaminación de proteínas. El método se basa en el hecho de que los ácidos nucleicos muestran su máximo de
absorbancia + a 260 nm, mientras que las proteínas a 280 nm. Una solución de ácido nucleico contaminada por
proteínas mostrará una lectura más alta a 260 nm, que se puede compensar con la lectura a 280 nm.

Originalmente, Warburg y Christian desarrollaron un método para determinar la concentración de proteínas

utilizando la proporción de 260/280 para compensar la contaminación de ácidos nucleicos.

Los coeficientes de extinción generalmente aceptados para 1 mg / ml de ADN de doble hebra y 1 mg / ml de

proteína se dan en la siguiente tabla considerando una longitud de trayectoria de 1 cm para ambas longitudes de
onda en A260 así como A280 nm:
Por lo tanto, se espera que los ácidos nucleicos tengan una absorbancia más alta a 260 nm que a 280 nm, mientras
que las proteínas exhiben el comportamiento opuesto. Se espera que las muestras de ácido nucleico puro tengan
una proporción de 2.0, mientras que las proteínas tienen una proporción de 0.57 respectivamente. Las mezclas
que contienen proteínas y ácidos nucleicos diferirán de estas proporciones. Teóricamente, la relación 260/280 de
una solución que contiene proteínas y ácidos nucleicos se puede calcular de la siguiente manera:

% P: porcentaje de proteína,

% N: porcentaje de ácido nucleico

Los subíndices p y n son los coeficientes de extinción para las moléculas correspondientes.

Cabe señalar que la absorbancia de la proteína a 280 nm depende solo de los aminoácidos aromáticos
triptófano, tirosina y fenilalanina. Por lo tanto, la lectura puede ser inexacta y depende en gran medida de la
composición de aminoácidos de la proteína.

La fórmula de Christian Warburg se usa para muestras que contienen proteínas y ácidos nucleicos. En el
siguiente ejemplo, la cantidad total de concentración de ácido nucleico se determina restando la concentración
de interferencia de proteínas:

Las constantes 62.9 y 36.0 se refieren a los coeficientes de extinción específicos utilizados por Warburg y
Christian. Para una mejor precisión, los factores deben determinarse para la proteína particular que afecta el
análisis.

5.5.3 Mediciones directas de la concentración de proteínas a A280 nm

Al igual que con el ADN, las proteínas absorben la luz ultravioleta a una longitud de onda específica, lo que
permite la medición directa utilizando un espectrofotómetro. Los aminoácidos aromáticos tirosina y triptófano
muestran una absorción específica a A280 nm, lo que permite la medición directa de las concentraciones de
proteínas. Esto se visualiza en la siguiente figura.

Figura 42: Espectro de absorbancia de tirosina (verde) y triptófano (azul)

La composición química de la proteína afectará la absorción, la cantidad y el tipo de aminoácidos causarán
variación.

Si el coeficiente de extinción para la proteína de interés está disponible, la absorbancia de la solución de proteína
se puede medir directamente utilizando una medición de longitud de onda fija a la absorbancia de 280 nm. Las
ventajas de esta técnica son que no se requieren reactivos especiales, por lo tanto, la proteína no se modifica ni
desactiva durante el proceso. No se requiere un período de incubación, por lo que las mediciones son rápidas y
altamente reproducibles, lo que hace que esta sea una técnica increíblemente sencilla.

La desventaja es que este método se basa en tener un coeficiente de extinción preciso para la proteína medida.
Al igual que con los ácidos nucleicos, cada proteína tiene su propio factor de conversión.

El estándar común, la proteína albúmina de suero bovino (BSA), tiene un factor de 1.552. La concentración se
puede calcular de la siguiente manera (según la ley de Lambert-Beer en el capítulo 2.4):

Concentración (μg / mL) = Abs280 × Factor / Longitud del camino

La relación A260 / A280 se puede utilizar como una guía para la pureza de la muestra de proteína.

5.5.4 Determinación de ácido nucleico usando el tinte fluorescente PicoGreen®

Como hemos visto anteriormente, la medición directa de ácidos nucleicos y proteínas depende en gran medida
del coeficiente de extinción de la sustancia en particular, lo que hace que estas mediciones sean más una
aproximación rápida que un resultado preciso. Todos los tipos de ácidos nucleicos, dsADN, ssADN y ARN, muestran
un máximo de absorbancia a 260 nm y, por lo tanto, difícilmente pueden distinguirse por métodos fotométricos,
porque la única diferencia entre ellos es que los ácidos nucleicos monocatenarios muestran absorbancias más
altas que los ácidos nucleicos bicatenarios ( ver la figura de abajo). Este efecto también se conoce como
hipercromicidad. Sin embargo, no permite la distinción entre las moléculas. En los casos en que no se alcanza un
cierto umbral, la cantidad de moléculas de muestra a veces no se puede distinguir de los artefactos. En el caso de
concentraciones altas y bajas, la cuantificación específica de la molécula interesada es difícil si están presentes
otras moléculas de ácido nucleico.
Hay otros métodos fotométricos disponibles que utilizan moléculas de tinte y dan como resultado una mayor precisión.

Figura 43: Hipercromicidad para diferentes ácidos nucleicos; dsDNA en azul, ssDNA en naranja y RNA en verde.

Los ácidos nucleicos pueden determinarse por moléculas de tinte que se unen específicamente a la molécula de
interés antes de la determinación, por ejemplo. Unión a dsDNA pero no a ssDNA. Como ejemplo, la cuantificación
de dsDNA se puede realizar utilizando el tinte fluorescente PicoGreen. PicoGreen detecta casi exclusivamente
dsDNA.

La preparación de la muestra es muy simple; La solución de tinte PicoGreen se agrega a la muestra y luego de un
tiempo de espera de 5 minutos se puede leer la muestra etiquetada.
5.5.5 Cuantificación de proteínas en biotecnología.

Las proteínas están compuestas de bloques de construcción de aminoácidos. La absorbancia de proteínas se mide
a aproximadamente 280 nm debido a sus aminoácidos aromáticos, como se explicó anteriormente. Como la
cantidad de cadenas laterales aromáticas varía mucho de una proteína a otra, a menudo se usan técnicas más
precisas para determinar la concentración de proteínas, que se basan en los colorantes. El colorante unido a la
proteína forma un complejo coloreado que puede analizarse en la región visible. Los tres procedimientos más
comunes para el análisis de proteínas son los ensayos de biuret, Bradford y ácido bicincinínico (BCA).

Figura 44: Estructura de la proteína BSA

La prueba de Bradford es una aplicación típica en el segmento de mercado de la biotecnología. Este ensayo es
uno de los métodos colorimétricos más utilizados para determinar la concentración de proteínas.

El ensayo de Bradford se basa en el cambio de color de un reactivo azul brillante de Coomassie cuando se une a
una proteína. El color comienza como rojo con un máximo de absorbancia a 470 nm, y termina en azul con el
máximo de absorbancia a 595 nm. Este cambio de color ocurre cuando la unión de proteínas tiene lugar en el
medio ácido. La reacción depende de la concentración de aminoácidos básicos (principalmente arginina, lisina e
histidina). El número de ligandos de colorante de Coomassie unidos a cada molécula de proteína es
aproximadamente proporcional al número de cargas positivas encontradas en la proteína.

La concentración de proteínas de muestras desconocidas se puede cuantificar, utilizando una curva de calibración
creada típicamente a partir de muestras de albúmina de suero bovino (BSA). Esta cuantificación da como resultado
una aproximación, ya que la proporción de aminoácidos cargados positivamente es diferente de proteína a
proteína.

El reactivo de Bradford, que contiene el tinte en una solución ácida, es marrón y cambia a color azul cuando se
une a una proteína.

Figura 45: La estructura molecular del reactivo de colorante azul brillante de Coomassie.

5. Consejos y sugerencias para mediciones UV / VIS precisas y precisas:

El siguiente capítulo le proporcionará consejos y sugerencias desde un punto de vista aplicativo para
asegurar mediciones precisas y precisas de UV / VIS.
Además del rendimiento del instrumento que se analizará en el capítulo 7, las principales fuentes de
error en espectrofotometría están relacionadas con el manejo de la muestra. El espectro de absorción
de una sustancia puede verse influido por el disolvente, el pH de la solución, la temperatura, las altas
concentraciones de electrolitos y la presencia de sustancias interferentes. Los efectos de estas
variables deben ser conocidos y las condiciones para el análisis deben elegirse de manera que la
absorbancia no se vea afectada por pequeñas variaciones descontroladas en sus magnitudes. Los
efectos más importantes serán descritos en los siguientes párrafos.

6.1 Espectroscopia UV / VIS a base de cubeta.

La cubeta utilizada para medir una muestra es parte del sistema óptico del espectrofotómetro. Por lo
tanto, la posición y la geometría de la cubeta pueden influir en la precisión y exactitud de las
mediciones de absorbancia y deben controlarse cuidadosamente.
Para una mejor práctica de medición, la cubeta debe permanecer en el soporte de la cubeta entre las
mediciones. Si se retira, se debe tener cuidado de colocar siempre la cubeta en la misma dirección en
el soporte de la cubeta, es decir, con la etiqueta hacia la fuente de luz. Esto asegura que los efectos
ópticos sean idénticos para las mediciones de referencia y de muestra.
Además, para obtener los mejores resultados, las mediciones de referencia y de muestra deben
realizarse utilizando el mismo tipo de cubeta. Las cubetas deben tener ventanas fabricadas de un
material que sea transparente en la región espectral de interés. Para obtener los mejores resultados
de las mediciones en el rango UV, se debe usar vidrio transparente a UV, como el vidrio de cuarzo o
el vidrio suprasil. Las cubetas desechables, hechas de metacrilato de metilo, se absorben en el rango
UV y actúan como un filtro de corte, lo que hace que las mediciones en el rango UV sean inexactas y
solo deben considerarse para mediciones dentro del rango visible.
En los sistemas ópticos, como la espectroscopia UV / VIS, la limpieza de las cubetas tiene un efecto
importante en los resultados.
Las ventanas de la cubeta, a través de las cuales pasa la luz, deben limpiarse antes de cada uso con
pañuelos sin pelusa (para evitar que se raye la pelusa en la superficie). Las absorbancias más altas se
miden si los residuos, como las huellas dactilares o la grasa, se depositan en las ventanas de la cubeta
debido a que existen componentes absorbentes adicionales. Esto se puede evitar con una limpieza
profunda antes y después del uso. Se debe tener cuidado adicional para evitar tocar las ventanas
después de completar la limpieza.
Finalmente, las partículas flotantes en la celda desviarán el haz de luz y conducirán a una absorbancia
de fondo. Esta desviación de la luz también se conoce como dispersión de la luz.

6.2 Selección del solvente:

Un disolvente para la espectroscopia UV / VIS debe ser transparente en toda la región aplicada y debe
disolver una cantidad suficiente de la muestra para obtener picos bien definidos. Cada solvente tiene
una longitud de onda de corte de absorbancia UV / VIS. El corte de solvente es la longitud de onda
por debajo de la cual el solvente absorbe toda la luz. Por lo tanto, cuando se elige un solvente, es
importante conocer su corte de absorbancia y el lugar donde se espera que absorba el compuesto
bajo investigación. Si están cerca, se debe elegir un disolvente diferente.
Se debe tener cuidado al trabajar por debajo de 300 nm, donde la absorción de solvente puede ser
tan alta que la absorción incremental debida a la muestra es pequeña en comparación con la
absorción total. La siguiente tabla enumera los solventes comunes y el límite inferior de su rango de
longitud de onda útil.
Solvente UV corte de absorbancia (nm)
Acetona 329
Benceno 278
Dimetilformamida 267
Etanol 205
Tolueno 285
Agua 180
En general, los disolventes no polares y las moléculas no polares tienen el menor efecto entre sí. Sin embargo, las
moléculas polares muestran diferencias bastante drásticas cuando interactúan con un disolvente polar como el
agua, los ésteres de alcoholes y las cetonas. La interacción entre el soluto y el solvente conduce a la ampliación
de la banda de absorción y la consiguiente reducción de la resolución estructural y el coeficiente de extinción
máximo. Tienden a destruir estructuras vibratorias y, por lo tanto, deben evitarse cuando se desea un detalle
espectral.

La siguiente figura ilustra el efecto del isooctano y el etanol en el espectro del fenol. Al cambiar de un disolvente
no polar (isooctano) a uno polar (etanol), la estructura fina debida a las vibraciones del fenol se atenúa. En general,
los espectros registrados en solventes no polares son más cercanos a los obtenidos a partir de muestras de gas.

Figura 46: Espectro de fenol en isooctano y etanol. Los disolventes polares como el etanol muestran una
resolución espectral mucho menor.

6.3 Concentración de la muestra:

Para obtener resultados de medición óptimos y cumplir con la ley de Lambert-Beer, la absorbancia se determinará
en el rango lineal del instrumento. Por lo tanto, es mejor evitar valores de absorbancia muy altos (> 2,5 UA) y muy
bajos (<0,3 UA) que pueden conducir a la no linealidad.

Sin embargo, a diferencia de otras técnicas analíticas, las muestras con bajas concentraciones, como 0.01mol / L,
se pueden medir usando UV / VIS. Un ejemplo común de esto se ve en los análisis de agua donde se deben
determinar concentraciones muy bajas.

Cuando un analito interactúa (asociación, disociación) o reacciona con el solvente, se crean nuevas especies
químicas que conducen a un cambio en el comportamiento de absorción. Por lo tanto, se recomienda utilizar un
disolvente que no interactúe y una baja concentración de analito para evitar reacciones secundarias.

6.4 Selección de longitud de onda:

Para obtener la máxima sensibilidad, las mediciones de absorbancia espectrofotométrica se realizan a una
longitud de onda correspondiente a un pico de absorción. La importancia de medir la absorbancia precisamente
en la longitud de onda ubicada en lambda max se demuestra en la siguiente figura. El ajuste de la longitud de
onda dentro de la banda estrecha indicada en el pico no tendría un efecto significativo en la absorbancia medida
en el pico. Sin embargo, una banda con el mismo ancho desplazado a una longitud de onda más corta introduciría
la posibilidad de un error mayor, dependiendo del punto preciso dentro de la banda en la que se toma la medida.

Los errores debidos al ajuste de la longitud de onda o la calibración del instrumento serán mínimos cuando las
mediciones se realicen en la longitud de onda de máxima absorción.
Figura 47: Izquierda: el cambio en la absorbancia por el cambio de longitud de onda tiene un efecto significativo
en la Banda B, mientras que en la Banda A el cambio es muy pequeño y despreciable. Derecha: El cambio afecta
la concentración calculada de una muestra en el caso B.

6.5 Análisis de mezclas:

La absorbancia total de una solución en cualquier longitud de onda dada es igual a la suma de las absorbancias de
los componentes individuales en la solución. Esta relación hace posible, en principio, determinar las
concentraciones de los componentes individuales de una mezcla, incluso si existe una superposición total en sus
espectros. Para analizar la mezcla, los coeficientes de extinción molar para los componentes individuales deben
determinarse primero en longitudes de onda específicas, las longitudes de onda óptimas se seleccionan de
manera que los coeficientes de los componentes difieran significativamente. Por ejemplo, en una mezcla de dos
componentes, el coeficiente de extinción del componente A en la longitud de onda λ1 es mucho mayor que el
coeficiente de extinción del componente B en la longitud de onda λ1. Para una segunda longitud de onda λ2, esto
debería ser lo contrario. Las concentraciones estándar de los componentes A y B abarcarán el rango de
absorbancia de la mezcla para seguir la ley de Lambert-Beer y abarcar la mezcla de la muestra.

Para completar el análisis, la mezcla se mide en la longitud de onda λ1 y λ2. Con los valores de absorbancia
conocidos, los coeficientes de extinción y la longitud de trayectoria utilizada, se puede calcular la concentración.

6.6 Espectroscopia UV / VIS basada en micro-volumen:

En una plataforma de microvolumen, se pueden medir muestras con volúmenes muy pequeños, como microlitros.
Las muestras altamente concentradas también se pueden medir fácilmente sin ninguna dilución adicional debido
a la disponibilidad de la longitud de la trayectoria en 0,1 o 1 mm. Esta técnica de medición se aplica principalmente
para muestras de ADN y proteínas.
Se recomienda una limpieza inicial de ambas superficies de medición con dH2O antes de realizar la medición en
blanco para evitar interferencias con las mediciones. NO utilice una botella con atomizador para aplicar agua o
cualquier otro líquido a la superficie del instrumento.
Recomendaciones de limpieza adicionales son las siguientes:
• Entre las mediciones, se recomienda limpiar la muestra de las plataformas superior e inferior con un paño de
laboratorio limpio, seco y sin pelusas.
• Se recomienda una limpieza final de ambas superficies de medición de la plataforma de micro volumen con
dH2O después de la última medición de la muestra. Dependiendo de la muestra, se puede usar una solución de
isopropanol al 60%, etanol o agua ultrapura para limpiar la plataforma de micro-volumen. Si es necesario, se
puede aplicar el disolvente utilizado para disolver la muestra. Cuando las muestras se secan en la plataforma, se
puede realizar una limpieza adicional utilizando 3 μL de HCl 0,5M. Finalmente, después de que se hayan aplicado
todas las demás soluciones de limpieza, la plataforma se limpia con una alícuota de 3 μL de dH2O.
• Si se usan detergentes o alcohol isopropílico al 100%, siga con 3 μL de dH2O como paso final de limpieza.
• La superficie pulida permite la aplicación de gotas de soluciones acuosas con alto ángulo de contacto. Si la gota
se aplana, es posible que después de cerrar el brazo de micro volumen, la medición se realice a través del aire,
lo que dará lugar a resultados de medición erróneos. Esto se visualiza en las siguientes imágenes:
 Figura 47: Gotitas hacia arriba (izquierda). Gotita aplanada (derecha)

• Para la descontaminación, se puede aplicar una solución como hipoclorito de sodio al 0,5% (solución de lejía
comercial diluida 1:10) a la plataforma de micro-volumen. Una limpieza adicional con agua desionizada debe
seguir.
7. Verificación de rendimiento:
El rendimiento instrumental es el factor principal que afecta directamente a la precisión y reproducibilidad de las
mediciones. Para mediciones de UV / VIS críticas, especialmente en el control de calidad clínico, farmacéutico o
industrial, es crucial que el instrumento funcione de acuerdo con las especificaciones. En los laboratorios que
trabajan de acuerdo con la farmacopea, es importante que el rendimiento del instrumento se controle
regularmente y que la evidencia documental esté presente. Además, esto es obligatorio para los laboratorios
que ofrecen un servicio de medición acreditado (por ejemplo, de acuerdo con la norma ISO 17025). La validación
también es un requisito clave para que los laboratorios trabajen de acuerdo con las Buenas Prácticas de
Laboratorio (BPL). Los siguientes párrafos describen los requisitos de las regulaciones principales y los
procedimientos para medir los parámetros clave de desempeño instrumental.

7.1 Requisitos reglamentarios:

Los requisitos de calidad se han vuelto más influyentes en los últimos años. Para obtener mediciones de calidad
consistentemente precisas, es crucial que los instrumentos analíticos midan de acuerdo con las especificaciones.
Algunas industrias incluso requieren un monitoreo regular y documentación del desempeño del instrumento.
En varios organismos reguladores, se describen las pruebas de verificación de rendimiento para
espectrofotómetros UV / VIS. Especialmente dentro de las principales Farmacopeas, que exigen la verificación
de calificación de los espectrofotómetros utilizados, así como pruebas sobre cómo realizarlos. También
recomiendan el uso de materiales de referencia certificados (CRM) de proveedores acreditados. Dichos
instrumentos calificados cumplirán las demandas para el análisis de los productos químicos farmacéuticos
descritos en las monografías de las farmacopeas.
Las diferentes farmacopeas comparten muchas de las mismas pruebas, pero también contienen algunas
diferencias al requerir pruebas y límites adicionales.

7.1.1 Farmacopea de los Estados Unidos (USP)

La Farmacopea de los Estados Unidos (USP), edición 38, en la sección 857 de UV / VIS describe la verificación del
rendimiento en el contexto de la Calificación de instalación (IQ), la Calificación operacional (OQ) y la Calificación
de rendimiento (PQ). En el capítulo "Calificación operacional", describe la verificación de desempeño como la
preparación de un instrumento para que sea "apto para su propósito", o en otras palabras, para estar listo para
realizar mediciones confiables. La farmacopea enumera y describe las pruebas a realizar y establece los límites
que deben cumplirse.
El cambio más importante en esa versión de la USP es un cambio fundamental de la prueba para medir la luz
parásita (energía radiante perdida).

7.1.2 Farmacopea Europea (EP):

Los requisitos que rigen los espectrofotómetros UV / VIS utilizados para los análisis farmacéuticos en Europa se
encuentran en la Farmacopea Europea (EP).
Comparable a la USP el EP en la versión EP8. proporciona algunas definiciones que son importantes para las
mediciones de UV / VIS y enumera las pruebas y los límites que deben cumplirse. Muchas de estas pruebas son
idénticas a las de la USP. Las mayores diferencias entre las dos son una prueba adicional para la precisión
fotométrica en el rango visible (430 nm), así como la prueba de la luz artificial.
7.1.3 Otras regulaciones:
Muchos otros países tienen regulaciones nacionales específicas, que a menudo están basadas y son parcialmente
idénticas a la USP o al EP. Algunos de ellos son:
- Reino Unido: Farmacopea Británica (BP)
- Alemania: Deutsches Arzneimittelbuch (DAB)
- Suiza: Farmacopea Helvética (Ph. Helv.)
- Australia: Administración de Productos Terapéuticos (TGA)
- China: Farmacopea de la República Popular de China (PPRC)

También la Organización Mundial de la Salud (OMS) emite una farmacopea que es la Farmacopea Internacional
(Ph. Int.).

7.1.4 Método de prueba estándar estadounidense:

American Standard Testing Methods (ASTM) International, es una de las organizaciones internacionales de
desarrollo de estándares más grandes del mundo. Mejoran el rendimiento y ayudan a todos a tener confianza en
las cosas que compran y usan.

7.1.5 Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST):

El Instituto Nacional de Estándares y Tecnología de EE. UU. (Anteriormente National Bureau of Standards, NBS)
es un laboratorio de estándares de medición. La preparación de muchos CRM empleados para las pruebas de
rendimiento se describe en el NIST. También producen materiales base de CRM como base para la producción de
cubetas CRM para UV / VIS.

7.2 Pruebas de verificación de rendimiento:

Las pruebas de verificación de rendimiento evalúan la calidad de las mediciones. Para mediciones UV / VIS
específicamente, este es el espectro. Las pruebas tienen que garantizar:
• que las posiciones de longitud de onda (eje x) son correctas (precisión de longitud de onda) y estables
(repetibilidad de longitud de onda)
• que las intensidades, absorbancias o transmitancias (eje y) se miden correctamente (precisión fotométrica)
y estable (repetibilidad fotometrica)
• que la forma medida del espectro es correcta y no está distorsionada (resolución tolueno, luz parásita).

7.2.1 Precisión de la longitud de onda:

La precisión de la longitud de onda es un parámetro de rendimiento importante, especialmente cuando se
comparan mediciones en diferentes instrumentos. La precisión de la longitud de onda se verifica normalmente
mediante el uso de un estándar de referencia certificado que tiene una serie de líneas de transmitancia estrechas
en todo el rango ultravioleta y visible. Un estándar usado comúnmente es el perclorato de holmio que se disuelve
en ácido perclórico. En el rango de longitud de onda de 200 a 700 nm, una serie de líneas estrechas permiten
verificar la precisión de la longitud de onda en el UV, así como en el rango espectral visible. Para los instrumentos
de matriz de diodos, solo se requiere una medición de precisión de longitud de onda, y no es necesario realizar
una determinación de precisión, ya que no hay partes ópticamente móviles disponibles. Los instrumentos de
matriz de diodos son extremadamente reproducibles, estables y sin partes móviles, no hay componentes
mecánicos para ajustar o recalibrar.
La diferencia entre el valor certificado y medido del CRM no debe exceder de ± 1 nm en la región UV (200 – 400
nm), y en la región visible (400 - 700 nm) no debe exceder de ± 2 nm.
La precisión de la longitud de onda se define como la desviación de la lectura de la longitud de onda de una banda
de absorción en comparación con la longitud de onda conocida de la banda. Una desviación de la longitud de onda
puede causar errores en los resultados cualitativos y cuantitativos de la medición UV / VIS. Es bastante obvio que
si el espectrofotómetro no puede mantener una escala de longitud de onda precisa, el espectro de la muestra
medido por el instrumento será inexacto y la verdadera λmax del analito no se puede caracterizar con precisión.
7.2.2 Precisión fotométrica:
La precisión fotométrica es el criterio más importante para el análisis cuantitativo cuando se utilizan los
coeficientes o factores de extinción, así como para la identificación espectral y el control de la pureza. La precisión
fotométrica está determinada por la diferencia entre la absorbancia medida y el valor estándar establecido. Una
solución de dicromato de potasio (60 mg / L) en ácido sulfúrico (0.01 N) se usa más comúnmente para verificar la
exactitud de la absorbancia. El método prueba la absorbancia en cuatro longitudes de onda; 235, 257, 313 y 350
nm.

7.2.3 Luz parásita:

La luz dispersa es la radiación que emerge de las imperfecciones en el elemento dispersante o en otras superficies
ópticas, de los efectos de difracción, otras aberraciones ópticas o de componentes dañados o desgastados. La luz
perdida causará desviaciones de la ley de Lambert-Beer. A valores de absorbancia altos, la relación lineal entre
absorbancia y concentración se ve fuertemente afectada por el factor de la luz parásita. Introduce un sesgo
sistemático para disminuir las absorbancias a concentraciones crecientes. La luz parásita también es la principal
influencia en el límite superior del rango dinámico lineal para un análisis. Vea las figuras a continuación con
algunos efectos de luz dispersos visualizados.

Figura 49A: Factor de limitación de luz parásita B: Efecto de luz parásita visualizado en el pico máximo.

Para detectar la luz dispersa en longitudes de onda específicas, se aplican soluciones de nitrito de sodio (340 nm),
yoduro de sodio (220 nm) y cloruro de potasio (200 nm) en agua. Estas soluciones tienen un corte muy agudo en
la región UV. Esto significa que si se detecta luz en una longitud de onda en la que se supone que la muestra se
absorbe por completo, se debe a que la luz parásita que llega al detector desde otra fuente sin pasar por la
muestra. Estos filtros se aplican principalmente en el rango ultravioleta debido a que la luz difusa es más intensiva
en este rango.

7.2.4 Resolución:
El rendimiento de un espectrofotómetro depende principalmente del poder de resolución del instrumento, en
otras palabras, de su resolución. La resolución es un factor crítico para determinar dos picos cercanos. Se requiere
una resolución de instrumento suficiente para poder distinguir entre diferentes picos de absorbancia en el
espectro UV / VIS de una muestra. Si la resolución espectral no es suficiente, entonces las bandas de absorción se
vuelven "no resueltas" y no se pueden distinguir claramente unas de otras. Por lo tanto, la identificación de los
picos de absorbancia se vuelve muy desafiante y el valor de absorbancia será más bajo que el valor verdadero. El
efecto de alta y baja resolución se ilustra en los siguientes dos gráficos:
Figura 50A: Instrumento de alta resolución con picos claramente resueltos B: Resolución baja donde los picos no
se pueden resolver.

En el gráfico de la izquierda, se presenta un ejemplo de un instrumento con alta resolución en el que dos picos de
absorbancia son claramente visibles a lo largo del espectro. La resolución del instrumento es lo suficientemente
alta como para separar fácilmente las dos bandas de absorción diferentes. A la derecha, el instrumento tiene una
resolución demasiado baja y los dos picos de absorbancia no se pueden resolver. El instrumento no puede
diferenciar las dos bandas de absorción diferentes.
La capacidad de diferenciar entre picos se indica mediante la resolución espectral. La resolución espectral de un
instrumento es la medida de la capacidad de un instrumento para diferenciar entre dos longitudes de onda
adyacentes en el espectro registrado.
Para lograr espectros donde las bandas de absorción están claramente definidas, se debe seleccionar un ajuste
de parámetro de alta resolución. En el siguiente ejemplo, el espectro de benceno en la fase gaseosa se muestra
en tres configuraciones de resolución diferentes en el espectrofotómetro. Este parámetro se llama ancho de
banda espectral.
En el espectro de alta resolución de la izquierda, con el ancho de banda más bajo, se definen claramente varios
picos de absorción. En los espectros de resolución media y baja a la derecha, con un ancho de banda creciente, el
detalle se pierde progresivamente. En el gráfico de la derecha, con la resolución más baja, solo se muestra una
banda de absorción amplia y única.

Figura 51: El mismo espectro presentado utilizando diferente ancho de banda. Izquierda: los picos se definen
claramente con un ancho de banda bajo. Con el aumento del ancho de banda, la resolución se pierde y se ven
menos detalles espectrales. A la derecha: un gran ancho de banda de 10 nm presenta una única banda de
absorción de los 5 picos que fueron visibles utilizando un ancho de banda de 1.6 nm

Este ejemplo ilustra claramente la importancia de seleccionar la resolución correcta del instrumento para una
medición precisa de un espectro UV / VIS.

Por lo tanto, la resolución es un factor crítico para determinar la forma de los picos medidos. Si la resolución
instrumental no es suficiente, el valor de absorbancia será inferior al valor verdadero.
Las pruebas de resolución de la farmacopea de EE. UU. Y la UE consisten en la medición de una solución de tolueno
en hexano al 0,02% p / v. Se calcula la relación de la absorbancia máxima cerca de 269 nm a la del mínimo cerca
de 266 nm. Cuanto mayor sea la relación, mejor es la resolución. La siguiente tabla da la relación para una
temperatura de 25 ° C:

7.2.5 Ruido fotométrico

El ruido fotométrico se mide a través del detector de luz CCD y se deriva de las fluctuaciones a corto plazo causadas
por la fuente de luz y los componentes electrónicos. El ruido es el factor principal que afecta la precisión de las
mediciones de absorbancia. La cantidad de ruido fotométrico definirá la precisión y el límite de detección mínimo
del espectrofotómetro.
El ruido de fotones proveniente de la fuente de luz es especialmente evidente a niveles bajos de absorbancia,
mientras que el ruido electrónico proveniente de componentes electrónicos afecta la precisión de las mediciones
a alta absorbancia. El ruido se mide normalmente con una absorbancia cero, es decir, sin muestra en la trayectoria
de la luz.
Un método común para calcular el ruido es tomar el cuadrado medio de la raíz (RMS) de varias mediciones en una
longitud de onda definida.
El ruido aumenta con los tiempos de medición más cortos y disminuye con los tiempos de medición más largos.
Además, el ruido varía de longitud de onda a longitud de onda. Esto se debe al hecho de que la intensidad de las
fuentes de luz y las características del detector varían con la longitud de onda.

7.2.1 Deriva fotométrica:

Se espera que la señal medida sea estable en una escala de tiempo larga. Esto se mide con la prueba de deriva
fotométrica. La desviación del instrumento se mide comúnmente con una absorbancia cero sin muestra en la
trayectoria de la luz. Se toma una medida cada minuto durante una hora a una longitud de onda definida.
Idealmente esto le da una línea horizontal. Las desviaciones se caracterizan por un ajuste lineal de la curva que
da una pendiente como una indicación de la dirección de la deriva.

7.2.2 Planitud basal:

Idealmente, para una caracterización adecuada de un instrumento, sus características de ruido deben medirse en
todas las longitudes de onda. Sin embargo, esto sería extremadamente lento. Una forma de obtener una visión
general del nivel de ruido relativo en todas las longitudes de onda es medir la uniformidad de la línea de base.
También revela longitudes de onda con problemas instrumentales resultantes del cambio de filtros o intercambios
de fuentes de luz.
El instrumento se pone a cero automáticamente sin que haya nada en el compartimiento de la muestra en su
rango de trabajo y el aire se mide simplemente como la muestra para la medición de la línea base. El cuadrado
medio de la raíz del espectro de línea de base en el rango definido da una indicación de la planeidad de la línea
de base.

7.3 Autopruebas instrumentales:

La verificación de rendimiento completa requerida para el cumplimiento de la farmacopea de un
espectrofotómetro se realiza normalmente en intervalos determinados. Estos intervalos se determinan de
acuerdo con la estabilidad del instrumento. Para garantizar que se detecten las desviaciones del rendimiento que
se producen entre estas verificaciones, el instrumento debe proporcionar autopruebas. Las autopruebas son para
el análisis de rutina del rendimiento del instrumento que se puede ejecutar diariamente. Estas pruebas deben
incluir una verificación de funcionamiento óptica y electrónica del espectrofotómetro, así como también
verificaciones de precisión de longitud de onda con la línea de xenón para verificar el rendimiento de la lámpara
instalada. Por lo tanto, la deriva para la estabilidad, la precisión de la longitud de onda y la repetibilidad con la
lámpara de xenón se implementan adicionalmente al ruido fotométrico y las pruebas de planitud de referencia,
que ya se describieron. Encontrará más detalles sobre la autoprueba instrumental en los documentos de servicio.

7.4 Materiales de referencia certificados para espectrofotometría:

Los materiales de referencia certificados o los estándares de calibración cumplen con los requisitos de las
principales farmacopeas (EP, USP). Esto permite realizar la calificación del instrumento de acuerdo con los
requisitos reglamentarios y garantizar que el instrumento cumpla con las exigencias de calidad. Estos materiales
están certificados para el valor de absorbancia en varias longitudes de onda en las regiones espectrales UV y
visible.
Los materiales de referencia certificados se clasifican en filtros líquidos y sólidos (vidrio).

7.4.1 Filtros de vidrio:

Los filtros de vidrio son materiales de referencia certificados hechos de vidrios específicos y fabricados
específicamente para su calibración. Estos filtros son robustos y sólidos, lo que hace que el manejo sea fácil y
directo. Además, son relativamente insensibles a la temperatura y tienen una buena estabilidad a lo largo del
tiempo. Sin embargo, para estándares sólidos, no se puede asegurar la homogeneidad de un lote a otro. Por lo
tanto, cada estándar debe calibrarse en un espectrofotómetro de referencia. Debido a este paso que lleva mucho
tiempo, los estándares sólidos tienden a ser caros. Los filtros de vidrio se pueden montar simplemente en un
soporte de una sola celda. Tales filtros sólidos permiten calificar el espectrofotómetro para la precisión
fotométrica (absorbancia) y también para la precisión de la longitud de onda.

Figura 52: Filtros de vidrio de densidad neutra de Starna Scientific Ltd

Los filtros disponibles son filtros de vidrio de densidad neutra para verificar la precisión fotométrica, como se
muestra en el ejemplo anterior. El certificado de Starna, uno de los fabricantes acreditados de materiales de
referencia, se entrega en la memoria USB.
Además, los filtros de vidrio Didymium están disponibles para la prueba de precisión de longitud de onda. Hay
filtros de vidrio de Holmio para evaluar la precisión de la escala de longitud de onda en la región visible y UV de
los espectrofotómetros. Estos producen picos característicos al igual que su contraparte líquida.
Estos filtros son trazables a los estándares primarios del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST).

7.4.2 Filtros de líquidos:

Los filtros líquidos son materiales de referencia certificados, que se preparan estrictamente con materiales
primarios sólidos NIST y se fabrican en las concentraciones de solución de acuerdo con las publicaciones de NIST.
El llenado de estas referencias se realiza en condiciones controladas con todas las celdas herméticamente y
permanentemente selladas por fusión de calor y los valores certificados.
Los filtros de líquido tienen la ventaja de ser equivalentes a las aplicaciones de medición real.
Con un filtro de líquido certificado, los siguientes parámetros del espectrofotómetro se pueden calificar de
acuerdo con los requisitos de la farmacopea:
• Exactitud fotométrica
• Precisión de longitud de onda
• Resolución
• Luz extraviada
 Figura 53: Filtros de líquidos de Starna Scientific Ltd

Los filtros de líquido se insertan en el soporte de una sola celda del espectrofotómetro donde se mide la
absorbancia en la longitud de onda indicada en el certificado de calibración. Los valores de medición resultantes
se comparan con los valores de referencia publicados en la Farmacopea o en el certificado de filtro
correspondiente. La prueba se considera como aprobada o fallida de acuerdo con los criterios de aceptación. Los
filtros líquidos son menos estables que los estándares sólidos; por lo tanto, tienen que ser recalibrados más a
menudo, lo que aumenta los costos de dicho material estándar.

7.5 Pruebas de verificación de rendimiento con CertiRef ™:

CertiRef ™ es un accesorio compatible con EUP y USP Pharmacopeia, que permite una calibración automática y
pruebas de rendimiento de los instrumentos METTLER TOLEDO UV7, UV5 y UV5Bio.
El CertiRef consta de un cambiador de cubetas de 8 lugares que contiene materiales de referencia certificados
(CRM) en cubetas selladas. Se ofrecen dos conjuntos diferentes de módulos para los usuarios que trabajan según
la Farmacopea Europea EUP y la Farmacopea de los Estados Unidos USP.
Todos los CRM están fabricados y certificados por Starna Scientific Ltd (Inglaterra). Los datos de los certificados
necesarios para las pruebas son accesibles desde un chip en el módulo CertiRef.
Los datos en el chip contienen información sobre el tipo de CertiRef, es decir, si es un CertiRef según EUP o USP,
el CRM establece el número de serie para rastrearlo hasta el certificado, la fecha de certificación y la fecha de
caducidad y la información sobre cada uno de los CRM. pruebas
El certificado entregado es válido por un período de dos años a partir de la fecha de emisión. Aunque las
referencias están cubiertas por garantías de por vida, esto está sujeto a una recertificación regular.
Cuando sea necesario volver a certificar o inspeccionar los materiales de CertiRef por cualquier motivo, después
de 2 años de certificación, comuníquese con su representante de servicio local de Mettler-Toledo. La siguiente
lista muestra los CRM junto con su posición en el módulo CertiRef:
 Buena práctica de medición Cinco pasos para mejorar los resultados de medición

Los cinco pasos de todas las directrices de Buenas prácticas de medición comienzan con una
evaluación de las necesidades de medición de sus procesos y sus riesgos asociados. Con esta
información, las buenas prácticas de medición proporcionan recomendaciones sencillas para
seleccionar, instalar, calibrar y operar equipos y dispositivos de laboratorio.
• Calidad garantizada.
• Cumplimiento de la normativa, auditorías seguras.
• Mayor productividad, menores costos.
• Cualificación profesional y formación.