ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Revista Latinoamericana de la Papa 22 (1): 12 - 37 ISSN: 1853-4961

http://www.papaslatinas.org/revista.html

Evaluación de bacterias endófitas de papa nativa (Solanum tuberosum L.) y el

desarrollo de un biofertilizante
N. Ortuño1/*, M. Córdoba2, M. Claros2, J.A. Castillo3
Recibido: 24/04/2018
Aceptado: 13/06/2018
Accesible en línea: Junio 2018
Resumen
El desarrollo de biofertilizantes en base a microorganismos benéficos, es una alternativa
ecológica al uso de fertilizantes sintéticos. Por lo cual es importante seleccionar cepas
bacterianas, identificarlas y formularlas. Entre estos microorganismos se encuentran las
bacterias endófitas promotoras de crecimiento vegetal, que tienen la capacidad de estimular
el crecimiento de las plantas a través de diversos mecanismos. Se trabajó con la colección
de la Fundación PROINPA, bacterianas endófitas, aisladas de cultivares de papa nativa, las
cuales fueron seleccionadas para desarrollar un biofertilizante. Inicialmente se
seleccionaron in vitro cepas en base a tres mecanismos funcionales: fijación de nitrógeno,
solubilización de fosfato y producción de acido indol acético, para eso se seleccionó el
87% de las cepas fijan nitrógeno, el 70% solubilizan fosfato y el 34% producen acido indol
acético. Después estas fueron evaluadas en vivero a inoculando plantas de dos cultivares de
papa nativa (Polonia y Huaycha), donde las cepas: 33pa, IVpa, IIpa, IXpb y 2pf,
presentaron los valores más altos en las variables de rendimiento, en las dos cultivares de
papa evaluadas, donde la cepa 33pa destaca con los promedios más altos. Las mejores
cepas seleccionadas fueron identificadas mediante pruebas bioquímicas y técnicas
moleculares como Bacillus pumilus. Luego se optimizó el medio de cultivo para la
producción masiva de la mejor cepa seleccionada, a través de diferentes extractos
preparados con arroz, papa y otros, a los cuales se añadió diferentes fuentes de azúcares,
donde la combinación de extracto de papa con con azúcar morena fue la mejor
combinación. Y finalmente se realizó la formulación del biofertilizante, pelet (granulado)
con la mejor cepa.
Palabras claves adicionales: Bioinsumos, Bacillus, Bacterias fijadoras de nitrógeno,
PGPR.

* Autor para correspondencia. Correo electrónico: n.ortuno@umss.edu.bo

1
Docente Facultad de Ciencias Agrícolas y Pecuarias, UMSS, Cochabamba, Bolivia.
2
Investigadora independiente, Cochabamba, Bolivia.
3
Docente - Investigador Universidad Yachay, Ibarra, Ecuador.
13 Ortuño et al. Revista Latinoamericana de la Papa

Evaluation of native potatoes in double bacteria and the development of a biofertilizer

The development of biofertilizers based on beneficial microorganisms is an ecological
alternative to the use of synthetic fertilizers. Among these microorganisms are endophytic
plant growth promoting bacteria, which have the ability to stimulate the growth of plants
through various mechanisms. We worked with the PROINPA Foundation collection,
bacterial endophytes, isolated from native potato cultivars, which were selected to develop
a biofertilizer. Initially in vitro strains were selected based on three functional mechanisms:
nitrogen fixation, phosphate solubilization and production of indole acetic acid, for which
87% of the strains were selected to fix nitrogen, 70% solubilize phosphate and 34%
produce acetic acid. Later these were evaluated in nursery by inoculating plants of two
native potato cultivars (Poland and Huaycha), where the strains: 33pa, IVpa, IIpa, IXpb
and 2pf, presented the highest values in the yield variables, in the two potato cultivars
evaluated, where the 33pa strain stands out with the highest averages. The best selected
strains were identified by biochemical tests and molecular techniques such as Bacillus
pumilus. Then the culture medium was optimized for the mass production of the best
selected strain, through different extracts prepared with rice, potatoes and others, to which
different sources of sugars were added, where the combination of potato extract with brown
sugar It was the best combination. And finally, the formulation of the biofertilizer, pellet
(granulate) with the best strain was carried out.
Additional keywords: Bioinputs, Bacillus, Nitrogen fixing bacteria, PGPR.
Introducción (bacterias, actinomicetos, hongos) que se
encuentran asociadas a diversos tejidos
El uso intensivo de fertilizantes sintéticos
vegetales, estos presentan una ocurrencia
ha causado alteraciones en el medio
alta en los cultivos de importancia
ambiente y eso se refleja, en la sociedad
agrícola y alta relevancia en sus sistemas
en su conjunto, en exigir productos
de producción (Surette & Sturtz 2003).
agrícolas saludables. Por otro lado hay la
necesidad de aumentar la productividad Entre estos endófitos, están las bacterias
agrícola, pero con menos agroquímicos, promotoras de crecimiento vegetal
debido a eso, en la actualidad, las (PGPB), estos presentan un metabolismo
investigaciones se han orientado hacia el versátil con la capacidad de utilizar
desarrollo de innovaciones biotecnológica diversos sustratos liberados por la planta
para la agricultura. para su desarrollo. Adicionalmente
poseen tiempos cortos de generación, alta
En los últimos años hay un interés
movilidad, fijación biológica de
creciente en los microorganismos
nitrógeno, solubilización de fosfato y
benéficos del suelo, porque éstos pueden
otros nutrientes (Wall 2001), también
promover el crecimiento de las plantas y
poseen la capacidad de colonizar las
en algunos casos también evitar la
raíces y producción de metabolitos
infección del tejido vegetal por
secundarios que pueden regular el
patógenos. Tales microorganismos
crecimiento vegetal y regular las
pueden ser simbióticos o de vida libre
poblaciones microbianas rizósfericas
(Benizri et al. 2001 y Bacilio-Jiménez et
(Kapulnik 2002).
al. 2003). En este primer caso, se
encuentran los endófitos, que son un Estos microorganismos son un grupo
grupo específico de microorganismos específico (bacterias, actinomicetos y
14 Ortuño et al. Revista Latinoamericana de la Papa

hongos) que pueden encontrarse en de cepas compatibles y específicas a los

diferentes tipos de tejidos vegetales diversos cultivos y a las condiciones
incluyendo semillas, frutos, hojas, ambientales prevalecientes (Peña &
tubérculos, tallos, etc. Estos presentan Reyes 2007).
una ocurrencia alta en los cultivos de Por lo indicado, y en búsqueda de
importancia agrícola y alta relevancia en estrategias de manejo sustentable, es
sus sistemas de producción (Surette & importante explorar la microflora, como
Sturtz 2003). Estas muestran actividad las endófitas, aisladas de plantas de papa
como promotoras de crecimiento vegetal nativa, como promotoras de crecimiento
en diferentes cultivos de importancia vegetal, para eso hará la selección de
económica como papa, tomate y arroz. cepas bacterianas endófitas, eficientes
Diversos aislamientos son capaces de como promotores de crecimiento vegetal,
inducir resistencia frente a estrés tanto
provenientes de cultivares de papa nativa,
biótico como abiótico en plantas se harán las caracterizaciones funcionales
inoculadas; también se ha demostrado que in-vitro como fijadoras de nitrógeno,
las comunidades de endófitos disminuyen solubilizadoras de fosfato y productoras
el desarrollo de enfermedades y en de acido indol acético (AIA), luego se
algunas instancias la relación planta- evaluará en vivero, se desarrollarán
endófito ha mostrado especificidad por el medios de cultivo para la multiplicación
tipo de tejido de colonización (Surette &
masiva determinar el mejor material
Sturtz 2003). inerte para la producción de un
Los microorganismos endófitos, al estar biofertilizante.
menos afectados por el estrés ambiental y
Materiales y métodos
más aclimatados con su simbionte (Sturz
y Nowak 2000), podrían representar una Se utilizaron cepas de la colección de
mayor ventaja ecológica. Sin embargo, la bacterias endófitas, del laboratorio de
presencia de bacterias endófitas y su Microbiología Agrícola de la Fundación
papel dependen probablemente del PROINPA, las que fueron aisladas de dos
cultivar y de su coevolución con la cultivares de papa nativa: Polonia (S.
especie microbiana (Yanni et al. 2001). tuberosum subsp. andigena) del
departamento de La Paz y Malcacho (S.
Por otra parte, la capacidad para colonizar tuberosum subsp. andigena) del
las raíces es una condición indispensable departamento de Chuquisaca y Potosí,
para que una bacteria sea considerada
con 26 y 21 cepas, respectivamente. Estos
como una verdadera PGPB, siendo por aislamientos bacterianos fueron
tanto esa capacidad un primer paso y un aislamientos de muestras de raíz.
rasgo crucial para la selección de los
inóculos microbianos a ser usados como El estudio se realizó en cuatro fases: 1)
biofertilizantes, bioplaguicidas, in-vitro, donde se realizaron pruebas
fitoestimuladores o biorremediadores cualitativas en laboratorio, para
(Lugtenberg et al. 2001). Es también un caracterizar las cepas bacterianas de
primer indicio de que el microorganismo acuerdo a tres mecanismos funcionales de
sea capaz de lograr el efecto benéfico promotores de crecimiento vegetal:
esperado. Además de la capacidad de fijación biológica de nitrógeno (FBN),
colonización, el éxito en la utilización de solubilización de fosfato (SP) y
microorganismos promotores del producción de ácido indol acético (AIA);
crecimiento vegetal reside en el estudio 2) vivero, donde se inocularon las cepas
15 Vol 22 (1) 2018 Evaluación de bacterias endófitas de papa nativa

bacterianas en plántulas de dos cultivares Research Institute's phosphate growth

de papa nativa y fueron evaluadas medium (NBRIP) con fosfato tricálcico.
agronómicamente; 3) laboratorio, donde En cada placa se probó cuatro cepas al
se hizo pruebas de optimización de mismo tiempo cada una sembrada en su
medios de cultivo para la producción respectivo cuadrante. Posteriormente las
masiva de la mejor cepa seleccionada; y placas fueron incubadas por 5-15 días a
4) planta de bioinsumos, donde se 30ºC. El tiempo de incubación puede
desarrolló la formulación del variar dependiendo del género de bacteria
biofertilizante, con la mejor cepa con que se trabaje por esta razón se
seleccionada. realizó un seguimiento diario de la
prueba.
Para realizar la caracterización,
primeramente se reactivó las cepas en Se empleó un control positivo y un
estudio, mediante la siembra de estas control negativo, el control positivo
cepas a un nuevo medio TSA (Triptic Soy consistió en una placa petri sembrada con
Agar), y se incubó por 48 horas a 30°C una cepa de Bacillus subtilis
para el crecimiento de las colonias. solubilizadora de fosfato, de la colección
del laboratorio. En la evaluación se tomó
Caracterización funcional
como positivas las cepas que mostraron
La determinación de bacterias endófitas presencia de un halo transparente
fijadores de nitrógeno, se realizó en base alrededor de la colonia.
al protocolo utilizado por Servin y Dion
Para la determinación de bacterias
(2009). Donde se utilizó el medio Burk
endófitas productoras de acido indol
sólido, al cual se añadió azul bromofenol
acético (AIA), se utilizó la metodología
como indicador de pH. Fue autoclavado
propuesta por Gordon (1950), adaptada a
durante 20 min a 121ºC y 20 Psi de
cada tipo de bacteria. Para esta prueba es
presión. El medio se vertió a placas Petri,
muy importante considerar que el AIA es
y las cepas bacterianas fueron sembradas
un metabolito secundario producido por
por extensión. En cada placa se probó
algunas bacterias en el periodo
cuatro cepas al mismo tiempo cada una
estacionario de crecimiento, por esta
sembrada en su respectivo cuadrante.
razón el tiempo de incubación del caldo
Posteriormente las placas fueron
incubadas por 48 horas a 30°C. va a depender de la curva de crecimiento
de la bacteria, se tendrá que dejar el
Se empleó un control positivo y un tiempo suficiente para asegurarse que
control negativo, el control positivo llegue a la fase estacionaria.
consistió en una placa petri sembrada con
Se sembró cada cepa en tubos con medio
una cepa de Bacillus pumilus fijadora de
líquido TSB (Triptic Soy Borth),
nitrógeno de la colección del laboratorio.
suplementado con 5mM de L-Triptofano.
Para su evaluación se observó la
Para esto se preparó primeramente TSB,
presencia de colonias y su acidificación.
después de su autoclavado, se añadió L-
Para determinar bacterias endófitas Triptofano, éste por ser un aminoácido
solubilizadoras de fósforo, se realizó en fue filtrado. Posteriormente se dosificó en
base al protocolo utilizado por Nautiyal tubos de 10 ml a 5 ml de medio por tubo.
(1999). Para eso se sembró cada cepa por Después de sembrar las cepas bacterianas,
extensión en placas petri, que contenían el se incubaron en un agitador orbital con
medio de cultivo National Botanical temperatura controlada, a 28C, 100 rpm,
16 Ortuño et al. Revista Latinoamericana de la Papa

por 7 días. Se empleó un control estudio en medio TSB. Para esto se

positivo y un control negativo, el control dispensó en matraces Erlenmeyer de 25
positivo consistió en un tubo sembrado ml con 15 ml de medio por matraz, y se
con una cepa de Paenibacillus sp. esterilizaron en autoclave.
productora de AIA, de la colección del Posteriormente, en una cámara de flujo
laboratorio. laminar, se sembraron las bacterias, y se
incubó en un agitador orbital con
Transcurrida la semana de incubación, se
temperatura controlada (LABNET) a
procedió a la centrifugación de los caldos
28ºC, 100 rpm, durante una semana.
bacterianos en tubos Eppendorf (un
Después de una semana de incubación, se
Eppendorf por cepa); se colocó 1ml a
estandarizaron las concentraciones
cada tubo, y se centrifugó a razón de 5000
bacterianas, a una concentración de 10 8,
rpm, durante 5 minutos, en una
para esto se realizaron diluciones de 10 -1,
centrifugadora (BIPEE 80-E). Para
10-2, 10-3 y 10-4 por cepa, y se contaron
revelar el AIA en las muestras, se preparó
las bacterias en cámara Neubauer, a
el reactivo Salkowski, en una campana de
través de un microscopio. Cuando las
extracción. Para el revelado, se colocó en
cepas presentaron una menor
pocillos una alícuota de 75 µL del caldo 8
concentración a 10 , se procedió a
bacteriano respectivo (solo se extrajo el
concentrar los caldos, a través del
sobrenadante, el precipitado fue
centrifugado de los mismos, y se preparó
desechado), se adicionó 225 µL del
el inóculo en base al precipitado; en el
reactivo de Salkowski (Fig. 13), y se
caso contrario, cuando las cepas
incubó en oscuridad por 30 minutos. Se
presentaron una mayor concentración a
reportó como positivo si el medio vira de
108, se preparó el inoculo diluyendo con
rosados claros a tonos rojizos.
agua destilada estéril; y cuando las
Evaluación en Vivero bacterias no se multiplicaron en el medio,
En vivero se realizó la inoculación de estas fueron descartadas.
todas las cepas bacterianas en estudio, en Inoculación de plantas con bacterias
dos cultivares de papa nativa: Polonia y endófitas
Huaycha, esta última como planta
La inoculación de plantas con bacterias
indicadora (testigo) por ser el cultivar
más comercial y difundido. endófitas, se realizó en la etapa de
plántula, a los 28 días del trasplante,
Se utilizó plántulas provenientes de después de la fase de la aclimatación. Con
multiplicación in vitro, por lo cual se una micropipeta se inoculó el concentrado
procedió primeramente a su aclimatación. bacteriano de 250 µL por planta, a nivel
Estas fueron trasplantadas en sustrato del cuello de la plántula, para la
estéril, en macetas de capacidad de 2 ½ colonización de la raíz por los endófitos
kg. Posterior al ensayo, se realizo el potenciales. Se cuidó de posibles
análisis químico de los sustratos en el contaminaciones o salpicaduras de una
Laboratorio de Suelos y Aguas de la maceta a otra.
Facultad de Ciencias Agrícolas Pecuarias
Variables de Respuesta. Las variables
Forestales y Veterinaria, UMSS.
de crecimiento fueron medidas cada 15
Inóculo estandarizado días, estas fueron: la altura de la planta, y
La obtención del inoculo, se realizó el número de tallos. Las variables de
mediante la multiplicación de las cepas en rendimiento se midieron en el momento
17 Ortuño et al. Revista Latinoamericana de la Papa

de cosecha, estas fueron principalmente el amilasa, oxidasa, catalasa, KOH y tinción

número de tubérculos y peso de de GRAM.
tubérculos, aunque también se cuantifico
Prueba de identificación de Bacillus sp.
el peso fresco y seco de la parte aérea, y
el peso fresco y seco de la raíz. Primeramente, se colocó 500 μl de agua
destilada estéril, en tubos Eppendorf, los
Los tratamientos fueron estructurados, en cuales fueron inoculados con la muestra
factorial completo, con dos cultivares de bacteriana, y fueron sometidos a un
papa, 47 cepas bacterianas, mas una cepa choque térmico, colocando los tubos en
conocida para los tratamientos positivos baño maría, un tiempo de 12 min. a 80ºC.
(Bacillus subtilis comercial), y los Posteriormente se realizó la siembra de
testigos (cultivares de papa sin cepas). Un estos tubos, en placas con medio TSA, y
total de 98 tratamientos, con tres fueron colocadas en incubación por 48
repeticiones. Sin embargo, el testigo horas. Se reportaron como positivas las
presentó más repeticiones por ajustes a cepas que crecieron sobre el medio.
los bloques del diseño. Presentando un
total de 300 unidades experimentales. Prueba de Amilasa
Se utilizó un diseño de bloques Se preparó el medio agar-almidón, en el
Incompletos en látice triple (Cochran y cual se realizó la siembra de las cepas en
Cox 1965). El análisis estadístico, se cuadrantes. Posteriormente se colocó en
realizó mediante el programa estadístico la incubadora a 30ºC por un día.
SAS versión 9.2. Para el análisis de las Transcurrido este tiempo se realizó el
variables, se realizó el análisis de clúster revelado con Yodo. Se reportó como
utilizando el método Ward, donde la positivo las cepas que presentaron halos.
distancia entre dos clúster se calcula Prueba de Oxidasa
como la suma de cuadrados entre grupos
en el MANOVA sumando para todas las En un portaobjetos desinfectado con
variables. En cada paso se minimiza la alcohol, se colocó los discos de oxidasa,
suma de cuadrados dentro de los clúster sobre los cuales se puso la muestra
sobre todas la particiones posibles bacteriana, con mondadientes
obtenidas fusionando dos clúster del paso esterilizados, y por último se colocó una
anterior. Las sumas de cuadrados son más gota de agua destilada estéril sobre esta
fáciles de entender cuando se expresan muestra. Transcurridos 5 min se observó
como porcentaje de la suma de cuadrados el cambio de coloración. Se reportó como
total. Para medir la distancia entre las positivo, si presentaba un cambio de
accesiones se utilizó la distancia coloración la muestra bacteriana.
Euclidiana. Así, dados dos objetos I1 y I2 Prueba de Catalasa
medidos según dos variables x1 y x2, la
distancia euclídeana entre ambos. Primeramente, en un portaobjetos
desinfectado, se colocó con un monda
Pruebas Bioquímicas diente esterilizado, la muestra bacteriana,
Para la identificación de las cepas y posteriormente se colocó una gota de
bacterianas seleccionadas, se realizó la agua oxigenada al 3% (H2O2) sobre la
caracterización mediante pruebas muestra. Se reportó como positiva la
bioquímicas de manera complementaria presencia de burbujeo.
(Pérez 2004). Se realizaron las pruebas Prueba de KOH
de: identificación de Bacillus spp.,
18 Ortuño et al. Revista Latinoamericana de la Papa

Sobre un portaobjetos desinfectado se relación de 0.75 g en 150 ml de agua

colocó una muestra bacteriana, con una destilada.
micropipeta se dejó caer una gota de Se utilizaron matraces Erlenmeyer de 500
KOH al 10% sobre la muestra. ml, en cada matraz se colocó 150 ml de
Posteriormente se mezcló con un caldo, y se esterilizaron en autoclave por
mordadiente estéril. Se reportó como 15 min a 121ºC y 20 Psi de presión.
positivo, cuando se levantó un hilo Posteriormente se realizó la siembra en
viscoso con el monda diente. los caldos respectivos, con una misma
Tinción de Gram concentración de inóculo, de 108, el cual
se registró como la concentración inicial.
Para la tinción de Gram se realizó la
Los caldos fueron trasferidos a un
extensión, fijación, coloración y el
agitador orbital con temperatura
secado, siguiendo el protocolo estándar
controlada, para su incubación y
para la tinción de Gram. Posteriormente,
multiplicación masiva, por 48 horas, a
se procedió a la observación en el
30ºC y 100 rpm.
microscopio.
Cada caldo presentó tres repeticiones, un
Identificación Molecular
testigo, que consiste en el caldo sin
La identificación molecular, se mandaron inoculación, y un testigo positivo, que
las cepas al laboratorio de Biología consiste en caldo de soya inoculado. La
Molecular de la Fundación PROINPA. evaluación se realizó transcurridas las 48
Primeramente se realizó una horas de incubación, y se tomaron datos
amplificación por PCR del gen que de: a) Concentración bacteriana, la
codifica al ARN ribosomal, 16S. cuantificación se realizó mediante el
Posteriormente se secuenció los conteo en cámara Neubauer, y b)
fragmentos, con la secuencia de ADN se Evaluación del pH, medido a través de
buscó secuencias similares por un pHmetro, como también se tomo el pH
alineamiento en las bases de datos. inicial, es decir, antes de la inoculación.
Evaluación de medios de cultivo para Evaluación de medios de cultivo para
la producción masiva la multiplicación masiva con diferentes
Para la multiplicación masiva de la mejor fuentes de energía
cepa bacteriana seleccionada, se Para optimizar el mejor medio de cultivo
realizaron pruebas en diferentes medios encontrado en la anterior prueba, se
de cultivo. Se probaron medios de realizó pruebas con cuatro diferentes
cultivo o caldos nutrientes de: papa, azúcares: azúcar blanca, azúcar morena,
camote, cebada, trigo, soya y haba. Los glucosa y chancaca.
caldos de papa y camote se obtuvieron a
La metodología empleada para la
través de la cocción de los mismos por 15
preparación, inoculación e incubación de
min, en una relación de 200 g en 600 ml
los medios de cultivo, fue la misma que
de agua destilada. Los caldos de cebada,
se empleó en la prueba anterior.
trigo, haba y soya, se obtuvieron
Exceptuando la adición de los azúcares en
colocando la harina de los mismos en
los medios de cultivo, que fue realizada
agua en su punto de ebullición, en una
en una relación de 20 g del azúcar en 600
ml del medio de cultivo preparado, el cual
19 Ortuño et al. Revista Latinoamericana de la Papa

se realizó antes del autoclavado. La formulación, para definir la proporción

evaluación, se realizó transcurrida las 48 adecuada de insumos a utilizarse en la
horas de incubación, y se tomaron datos mezcla. Por lo que se definió utilizar: una
de: a) Concentración bacteriana, la relación de 300 ml de caldo bacteriano
cuantificación se realizó mediante el con 2844,4 g de medio inerte. El medio
conteo en cámara Neubauer, b) inerte esta compuesto por calcita, caolín
Evaluación del pH, medido a través de granulado y melaza
un pHmetro, como también se tomo el pH Primeramente, en una bolsa plástica
inicial, es decir, antes de la inoculación, y resistente, se realizó una mezcla del caldo
c) Grados Brix, medido a través de un bacteriano con calcita, seguidamente se le
Refractómetro. añadió melaza y se mezcló nuevamente,
Evaluación de medios inertes para la posteriormente se adicionó caolín
formulación del biofertilizante granulado, y se realizó una última mezcla.
La mezcla fue colocada en bandejas, para
Formulación en polvo
el secado en un horno por circulación de
Para la formulación en polvo, se realizó la aire.
mezcla del caldo bacteriano con dos
Posteriormente se realizó la evaluación de
diferentes medios inertes: caolín y calcita.
estas formulaciones, y se evaluó los
Primeramente se realizó cálculos previos
siguientes parámetros: viabilidad
a la formulación, para definir la
(bacterias totales), pH, tiempo de secado,
proporción adecuada de insumos a
consistencia en seco y solubilidad en
utilizarse en la mezcla, por lo que se usó
agua.
la relación de 300 ml de caldo bacteriano
con 500 g de medio inerte, tanto para Evaluación de la viabilidad
caolín como para calcita. El mezclado se La evaluación de la viabilidad, se realizó
realizó en una mezcladora manual, a través, de la siembra por vertido en
pequeña. Posteriormente se colocó en
medio TSA, de las diluciones de ambos
bandejas, para el secado en un horno por formulados, a 10-3 y 10-4, y se colocó en
circulación de aire, a temperatura la incubadora a 30 ºC por 48 horas.
ambiente, y se realizó el molido en un Transcurrido ese tiempo, se realizó el
mortero. conteo de unidades formadoras de
Formulación en pellet colonias.
Para la formulación en pellet, también se
realizaron cálculos previos a la
20 Vol 22 (1) 2018 Evaluación de bacterias endófitas de papa nativa

Resultados y discusión
Pruebas in-vitro secreción de ácidos orgánicos, tales como
el láctico, oxálico y cítrico, por parte de
Las pruebas cualitativas realizadas a las
estos microorganismos. Estos ácidos
cepas en estudio, considerando tres
orgánicos solubilizan formas orgánicas e
mecanismos funcionales, de fijación
inorgánicas de fósforo no disponible, para
biológica de nitrógeno, solubilización de
la asimilación de la planta.
fosfato y producción de ácido indol
acético, mostraron los siguientes Por otra parte, en la prueba de producción
resultados: de ácido indol acético, se observó el
cambio de coloración del medio, de tonos
En la prueba de fijación de nitrógeno, se
rosados a rojizos de las cepas que
observó este mecanismo a través del
producen ácido indol acético. Según Hans
desarrollo de la colonia en el medio Burk,
et al. (1997), esta auxina actúa a nivel
por que este medio tiene la característica
génico regulando la expresión de
de contener poca fuente de nitrógeno, de
múltiples genes. El AIA se une a un
manera que las bacterias que se
receptor de naturaleza proteica, formando
desarrollan bajo este medio tienen la
un complejo receptor-hormona de
capacidad de reducir el nitrógeno gaseoso
carácter reversible, específico, con alta
(N2) para producir NH4+ (amonio), que
afinidad y saturable. Este complejo activa
después sirve para la biosíntesis de
un promotor que controla la expresión de
aminoácidos (Servin & Dion 2009).
los genes que codifican la síntesis de las
Como también, por la adición del enzimas catalizadoras de los compuestos
indicador de pH (azul bromofenol) al de la pared, estimulando de esta manera el
medio Burk, se observó la acidificación crecimiento de la planta.
de este medio por parte de la cepa
Entre las cepas provenientes del cultivar
bacteriana. La acidificación del medio se
Malcacho (Tabla 1), se encontraron que el
evidenció a través del cambio de
80 % de las cepas fijan nitrógeno, el 71 %
coloración, de azul a amarillo, indicando
solubilizan fosfato y el 52 % de las cepas
un pH ácido (Nautiyal 1998).
producen AIA. Las cepas 5pa, 6pc, 6pf,
En la prueba de solubilización de fosfato, 6pg, 7pa, 7pd y 7pe, actúan sobre los tres
se observó un halo transparente alrededor mecanismos, en cambio, la cepa 5pb no
de la colonia de las cepas bacterianas que realiza ninguna de las actividades
solubilizan fosfato. Según Metha & funcionales analizadas. Las cepas 5pa y
Nautiyal (2001), estos halos o zonas 7pe fueron las únicas que acidificaron el
claras alrededor de las colonias, indican medio Burk, en la prueba de fijación de
un viraje en el pH del medio por la nitrógeno.
21 Vol 22 (1) 2018 Evaluación de bacterias endófitas de papa nativa

Tabla 1. Caracterización de cepas aisladas de papa cv. Malcacho.

Fijación de Nitrógeno Solubilización de Producción de
Nº Cepas Presencia de colonia Acidificación Fosfato Acido Indol Acético
1 2pa + - + -
2 2pb + - + -
3 2pc - - - +
4 2pd - - - +
5 5pa + + + +
6 5pb - - - -
7 5pc + - + -
8 6pa + - + -
9 6pb + - - +
10 6pc + - + +
11 6pd + - - +
12 6pe + - - -
13 6pf + - + +
14 6pg + - + +
15 6ph - - + -
16 6pi + - + -
17 7pa + - + +
18 7pb + - + -
19 7pc + - + -
20 7pd + - + +
21 7pe + + + +
+ Reacción positiva; - reacción negativa

En cuanto a las cepas provenientes del realizan los tres mecanismos, en cambio
cultivar Polonia (Tabla 2), el 92 % de las la cepa 33pb, no realiza ninguna de estas
cepas fijan nitrógeno, el 69 % solubilizan funciones analizadas, y las cepas 3pa y
fosfato y el 19 % produce acido indol IIpb, acidificaron el medio Burk, en la
acético. Las cepas 2pf, 3pb, 3pc y IIpb, prueba de fijación de nitrógeno.
22 Vol 22 (1) 2018 Evaluación de bacterias endófitas de papa nativa

Tabla 2. Caracterización de cepas aisladas de papa cv. Polonia.

Fijación de Nitrógeno Solubilización de Producción de

Nº Cepas Presencia de colonia Acidificación Fosfato Acido Indol Acético
1 1pa + - + -
2 1pb + - + -
3 1pc + - + -
4 2pe + - - -
5 2pf + - + +
6 3pa + + + -
7 3pb + - + +
8 3pc + - + +
9 31pa + - + -
10 31pb + - - -
11 31pc + - + -
12 31pd + - - -
13 32pa + - + -
14 32pb + - + -
15 32pc + - + -
16 32pd + - - -
17 32pe + - + -
18 33pa + - + -
19 33pb - - - -
20 Ilpa - - + -
21 Ilpb + + + +
22 Ilpc + - + -
23 IIIpa + - - -
24 IVpa + - + -
25 IXpa + - - -
26 IXpb + - - +
+ Reacción positiva; - reacción negativa

Pruebas en Vivero eficientes. Una vez definidos estos

grupos, se realizó el análisis de varianza
Para la evaluación de todas las cepas
multivariado, considerando las dos
bacterianas como promotores de
variedades de papa, donde se encontraron
crecimiento vegetal, se realizó el
diferencias altamente significativas entre
seguimiento al ensayo implementado en
los cultivares (p=0,01), y diferencias
vivero, y la evaluación correspondiente
significativas en los tratamientos, y la
del ciclo vegetativo de las dos cultivares
interacción cultivar-tratamiento (p=0,05).
de papa (Polonia y Huaycha).
Se obtuvo una gráfica general de
Inicialmente, en base a todas los
agrupamiento de cepas bacterianas, sin
cultivares evaluados, se hizo un análisis
separar los cultivares de papa, realizando
de Cluster, para agrupar las cepas
un corte a una distancia de 0,05 de la
bacterianas y así identificar las más
23 Vol 22 (1) 2018 Evaluación de bacterias endófitas de papa nativa

gráfica de Cluster, se observó cinco peso de los tubérculos) (Tabla 3). El

grupos de cepas bacterianas. El mejor grupo 5 fue seleccionado como el mejor,
grupo fue seleccionado, comparando las porque presentó los valores más altos en
medias de los componentes de las medias de la variable de rendimiento;
rendimiento (número de tubérculos y el donde están ubicadas 19 cepas.

Tabla 3. Medias generales para las variables de crecimiento y rendimiento, de los cultivares Polonia y
Huaycha.
Peso Fresco Peso Altura Nº de Peso Fresco Peso Seco Nº Peso
Grupo Hoja Seco Hoja Planta Tallos Raíz Raíz Tubérculo Tubérculo
1 58,22 5,79 114,03 6,10 26,35 5,11 8,12 32,69
2 67,50 6,36 104,93 6,93 30,71 5,47 9,64 34,29
3 72,29 6,98 118,36 6,50 31,88 5,27 7,67 30,42
4 43,13 4,31 98,50 5,50 26,88 4,49 8,13 23,13
5 54,14 5,35 99,67 6,33 30,79 5,72 9,86 38,75

Por otra parte, también se hizo otros (Tabla 4), porque presentó los mayores
agrupamientos de las cepas bacterianas, valores en número y peso de tubérculo,
para cada cultivar de papa. Realizando un respecto al resto de los otros grupos de
corte a una distancia de 0,05 de sus cepas. En el cultivar Huaycha, el mejor
graficas de Cluster, se observaron 6 grupo fue el 3 (Tabla 5). En ambos casos,
grupos para el cultivar Polonia y 6 grupos se consideraron también los segundos
para el cultivar Huaycha. mejores grupos para la selección de las
mejores cepas.
En base a las variables de rendimiento, en
la var. Polonia, se seleccionó el grupo 3
Tabla 4. Medias para las variables de crecimiento y rendimiento, del cultivar Polonia.
Peso Fresco Peso Seco Altura Peso Fresco Peso Seco Nº Peso
Grupo Hoja Hoja Planta Nº de Tallo Raíz Raíz Tubérculo Tubérculo
1 65,92 6,88 102,91 8,50 41,14 7,28 8,94 26,15
2 49,96 5,34 103,08 7,45 41,14 7,27 8,70 26,30
3 56,30 5,93 86,89 8,70 46,50 7,70 9,31 32,70
4 60,73 6,45 148,76 5,83 21,67 4,40 5,83 16,45
5 59,42 5,88 127,24 7,36 36,07 6,06 7,99 21,43
6 57,22 5,46 114,30 6,17 26,17 5,06 6,68 19,38

Tabla 5. Medias para las variables de crecimiento y rendimiento, de la variedad Huaycha.

Peso
Fresco Peso Seco Altura Peso Peso Seco Nº Peso
Grupo Hoja Hoja Planta Nº de Tallo Fresco Raíz Raíz Tubérculo Tubérculo
1 70,4 6,47 107,46 5,21 25,07 4,36 9,01 42,58
2z 72,9 6,66 129,07 6,5 19,5 3,97 7,62 32,22
3 53,38 4,84 96 5,25 25,31 4,52 12,85 60,15
4 56,3 4,81 70,79 4 21,88 4,32 11,89 53,77
5 30,19 3,31 68,79 4,5 25 3,11 8,32 13,01
6 49,65 5,01 106,36 5 17,86 4,39 9,48 44,55
24 Ortuño et al. Revista Latinoamericana de la Papa

Las mejores cepas bacterianas se IIpa, IXpb y 2pf, como las mejores
seleccionaron, comparando las cepas inductoras de crecimiento (Tabla 6).
bacterianas en los dos cultivares de papa,
y se obtuvieron las cepas: 33pa, IVpa,

Tabla 6. Características de las mejores cepas seleccionadas.

Fijación de Solubilización Producción de Procedencia
Cepa Nitrógeno de Fosfato Acido Indol Acético Departamento Localidad Variedad
33pa + + - La Paz Cariquina Grande Polonia
IVpa + + - La Paz Cariquina Grande Polonia
IIpa - + - La Paz Cariquina Grande Polonia
IXpb + - + La Paz Cariquina Grande Polonia
2pf + + + La Paz Cariquina Grande Polonia

Estas cinco cepas seleccionadas, se todas presentan la misma procedencia, es

comportan de manera diferenciada en decir, el mismo lugar y aisladas del
cuanto al mecanismo funcional de mismo cultivar de papa, Polonia del
promotor de crecimiento. Sin embargo, Altiplano de La Paz.
Las cepas 33pa y IVpa, fijan nitrógeno y número de tubérculo, como también entre
solubilizan fosfato, pero no producen peso fresco hoja y peso seco hoja, entre
AIA, en cambio la cepa IIpa solo número de tallos y peso fresco raíz, entre
solubiliza fosfato, la cepa IXpb, fija peso fresco raíz y peso seco raíz, y se
nitrógeno y produce AIA, y la cepa 2pf encontró una correlación significativa y
realiza los tres mecanismos funcionales. negativa entre la altura de planta y peso
Esto muestra que las bacterias endófitas fresco raíz. Asimismo, en Huaycha, se
de la papa nativa pueden realizar encontró una correlación significativa y
diferentes funciones o una sola, positiva entre peso tubérculo y número de
posiblemente este tipo de tubérculo, entre altura planta y peso seco
microorganismos generan efectos hoja, y entre peso fresco hoja y peso seco
complementarios y aditivos respecto a un hoja. Estas correlaciones demuestran que
factor determinado como las cepas 33pa y los efectos de tratamientos pueden incidir
IVpa con la cepa IIpa respecto a la de diferente forma en los cultivares de
solubilización del fosfato. papa utilizados.
Posteriormente se realizó un análisis de Curvas de Crecimiento
correlación general, se encontró una En base a variables evaluadas
correlación significativa (p=0,01) y periódicamente la altura de planta, a lo
positiva entre el peso fresco hoja, con largo del desarrollo fenológico de las
peso seco hoja, como también entre el plantas en el ensayo, se graficó las curvas
número de tubérculo y peso tubérculo. para las cinco mejores cepas mas el
Para el cultivar Polonia, se detectó una testigo, para su respectiva comparación.
correlación significativa y positiva Se realizaron las regresiones lineales
(p=0,01) entre peso de tubérculo y simples.
25 Vol 22 (1) 2018 Evaluación de bacterias endófitas de papa nativa

140 2pf: y = 1,3x + 9,7

33pa: y = 1,5x + 3,5
120
ALTURA DE PLANTA (cm)

IIpa: y = 1,3x + 6,6

100 IVpa: y = 1,6x - 2,2
IXpb: y = 1,6x - 0,7
80
Test: y = 1,4x + 5
60
2pf
40 33pa

20 IIpa
IVpa
0
IXpb
0 20 40 60 80
Test
TIEMPO (días)

Figura 1. Variación de la altura de planta en el cultivar Polonia a través del tiempo.

La variable de altura planta, mostró una mayor altura de planta. Las plantas con
pendiente ascendente, que indica el menor altura de planta en el cv. Polonia y
crecimiento progresivo de la planta. En Huaycha fueron con la cepa 33pa. En
cv. Polonia (Figura 1), las plantas cambio en las plantas testigo en ambas
inoculadas con la cepa IVpa presentaron variedades presentaron una altura
mayor altura. En cambio el cv. Huaycha promedio de planta.
(Figura 2), fueron con la cepa IIpa las de
140 2pf: y = 1,7x - 7,9
33pa: y = 1,2x + 6,6
120
IIpa: y = 1,6x - 3,4
IVpa: y = 1,2x + 9,6
ALTURA DE PLANTA (cm)

100
IXpb: y = 1,2x + 8
80 Test: y = 1,3x + 7,3

2pf
60
33pa
40 IIpa
IVpa
20 IXpb
Test
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
TIEMPO (días)

Figura 2. Variación de la altura de planta en el cultivar Huaycha a través del tiempo.

Rendimiento en estudio, donde se encontró diferencias
altamente significativas (p=0,01) entre los
Para estimar los rendimientos alcanzados
cultivares de papa, y diferencias
en vivero, se realizó la conversión de
significativas (p=0,05) entre las cepas y
Kg/planta a t/ha, y luego se realizó el
en la interacción del cultivar con la cepa.
análisis de varianza, para todas las cepas
26 Vol 22 (1) 2018 Evaluación de bacterias endófitas de papa nativa

Entre los cultivares de papa evaluadas, el (Figura 3), lo cual se puede explicar a las
cv. Huaycha presentó mayores diferencias debidas al genotipo de cada
rendimientos, a diferencia del cv. Polonia, cultivar.
que presentó menores rendimientos

Figura 3. Efecto de las cepas sobre el rendimiento de los cultivares Huaycha y Polonia.
En el rendimiento para el cultivar Polonia 2pf, 2pd y 1pa. Siendo las más
(Figura 4), 8 cepas presentaron mayores destacables las cepas IIIpa, 33pa, 2pf y
rendimientos que el resto de las cepas, 2pd, por presentar mayor promedio.
estas fueron: IIpb, IIIpa, 7pc, 6pf, 33pa,
2,5
a

2,0 a
RENDIMIENTO (tn/ha)

a a
a a a
1,5 b b b a
b b b b b
b b b b b
b b
b b b b b
1,0 b b b b b
b b b b
b b b b b b
b b
b b
0,5

0,0
IIpc

32pc

31pc
IXpa

IIpa

6pf

33pa

32pa

31pa
2pf
7pc

7pa

6pc

6pa
5pc

5pa
3pc

3pa

2pc

2pa
1pc

1pa
Test

6pi

6pg

32pe
IXpb

7pe

6pe

32pb

31pd

31pb

2pe
IVpa

IIpb

IIIpa

7pd

7pb

6ph

6pd

6pb

5pb

3pb

2pd

2pb

1pb
Basub

CEPAS

Figura 4. Efecto de las cepas sobre el rendimiento en el cv. Polonia.

El cultivar Huaycha (Figura 5), presentó 6pb, 6pe, 6pf, 7pb, 7pd, 7pe, IIpa, IIpc,
mejores rendimientos con 20 cepas: 2pc, IVpa, IXpa y IXpb. Siendo las mas
2pf, 31pb, 31pc, 33pa, 3pa, 3pb, 5pa, 6pa, destacables las cepas 2pf y 6pe por tener
27 Vol 22 (1) 2018 Evaluación de bacterias endófitas de papa nativa

mayor promedio. Por otra parte, la cepa 32pe, presentó el rendimiento mas bajo.

3,5
a a
3,0 a a
RENDIMIENTO (tn/ha)

a a a a
a a a a a
2,5 a a a a b a a
a b
b
b b b
b b b b b b b b b b b
2,0 b b
b b b
1,5 b b b b
1,0
c
0,5
0,0

32pe

6pi

IXpb
Test
1pb

2pb

2pd
2pe

31pb

31pd

32pb

3pb

5pb

6pb

6pd
6pe

6ph

7pb

7pd
7pe

IIIpa

IIpb
31pc

32pc

IIpc
IVpa
IXpa
1pa

1pc
2pa

2pc

2pf
31pa

32pa

33pa
3pa

3pc
5pa

5pc
6pa

6pc

7pc

Basub
6pf

7pa

IIpa
6pg
CEPAS

Figura 5. Efecto de las cepas sobre el rendimiento en el cv. Huaycha.

Sin embargo, por criterios de selección, Pruebas Bioquímicas
no todas estas cepas con rendimientos Con las cepas seleccionadas después de
destacables fueron seleccionadas, porque realizar las pruebas bioquímicas, se
solo se destacaron en uno de los encontraron los comportamientos
cultivares. diferenciados entre ellas (p=0,01), donde
Identificación de cepas seleccionadas el signo (+) indica una reacción positiva
de la cepa. Determinándose que la
Las once mejores cepas seleccionadas,
mayoría de las cepas corresponden al
fueron caracterizadas mediante las
género Bacillus, Gram positivos y
diferentes pruebas bioquímicas, y
catalasa positiva (Tabla 7).
posteriormente fueron identificadas
molecularmente.
28 Vol 22 (1) 2018 Evaluación de bacterias endófitas de papa nativa

Tabla 7. Pruebas Bioquímicas.

Cepa Bacillus Amilasa Oxidasa Catalasa KOH T. GRAM

33pa + + + + - +
IVpa - - - + + +
IIpa - - - + - -
IXpb - - - + - +
2pf + - + + + +
31pc + + + + - +
2pd - - - - + -
1pb + + - + + +
6pf + + - + - +
3pa + + - + - +
6pe + - - + + +

Identificación Molecular confirmándose que la mayoría son del

género Bacillus (Tabla 8). La mejor cepa
Mediante la secuenciación del gen que
33pa, corresponde a la especie Bacillus
codifica al ARN ribosomal 16S, se
pumilus.
identificó las cepas seleccionadas,
Tabla 8. Identificación de las cepas seleccionadas.
Cepa Identidad
33pa Bacillus pumilus
IVpa Bacillus sp.
IIpa Staphylococcus epidermidis
IXpb Bacillus sp.
2pf Bacillus firmus
31pc Bacillus pumilus
1pb Bacillus subtilis
3pa Bacillus sp.
2pd Stenotrophomonas maltophilia
6pe Stenotrophomonas maltophilia
6pf Paenibacillus sp.

Evaluación de medios de cultivo para El caldo de camote reportó la segunda

la multiplicación masiva de la mejor concentración bacteriana más alta, lo que
cepa seleccionada indica, que los caldos con tubérculos y/o
raíces, particularmente la papa, favorecen
Realizado el conteo de bacterias al
más a la multiplicación de la bacteria, a
microscopio, después del crecimiento en
comparación de los cereales y las
los caldos de papa, camote, trigo, cebada,
leguminosas, lo cual se podría explicar a
haba y soya, se encontró mediante el
la procedencia de la bacteria, porque esta
análisis de varianza, diferencias altamente
bacteria fue aislada como endófito del
significativas entre estos caldos (p=0,01).
cultivo de papa cv. Polonia del Altiplano
El mejor medio de cultivo para la
Norte.
multiplicación masiva de la mejor cepa,
fue la papa, presentando la concentración
bacteriana más alta (Figura 6).
29 Ortuño et al. Revista Latinoamericana de la Papa

9,00E+09 a
8,00E+09
CONCENTRACIÓN 7,00E+09
6,00E+09
5,00E+09
4,00E+09
3,00E+09
2,00E+09
b
1,00E+09 c d e
f g
0,00E+00
Trigo Soya (+) Soya Papa Haba Cebada Camote
CALDOS

Figura 6. Efecto de diferentes medios de cultivo sobre la multiplicación de Bacillus pumilus.

Por otra parte, se reportó diferente En cuanto al pH inicial de los diferentes

resultado para B. subtilis, por Angulo y caldos, también se encontraron
Ortuño (2009), cuando probaron diferencias altamente significativas
diferentes caldos (papa, arroz, soya, (p=0,01), el caldo de soya presentó un pH
papa+soya, arroz+soya y TSB), más cercano a la neutralidad, en cambio,
presentando una mayor multiplicación en el pH inicial de la papa fue el más bajo,
el caldo de soya. levemente ácido (Figura 7).
Evaluación del pH

6,9
a
6,8 b
6,7 c c
6,6
d
pH INICIAL

6,5
6,4
e
6,3 f
6,2
6,1
6
5,9
Trigo Soya (+) Soya Papa Haba Cebada Camote
CALDOS

Figura 7. pH inicial de los diferentes caldos.

30 Vol 22 (1) 2018 Evaluación de bacterias endófitas de papa nativa

composición del caldo de papa, puede ser

El pH final de los caldos, también mostró
también un factor determinante en la
diferencias altamente significativas
multiplicación de esta bacteria.
(p=0,01), reportándose al caldo de papa,
con el pH final más alto, con tendencias a En cambio, la acción bacteriana en el
la alcalinidad, por acción de la caldo de camote disminuyó el pH,
multiplicación bacteriana, ya que el caldo llegando a un estado ácido de pH=5,8 a
testigo (sin inoculación) presentó un pH pH=5, siendo lo opuesto para el caldo de
final levemente ácido. Es sabido, que los papa (Figura 8). Los caldos de trigo, soya,
altos niveles de pH pueden ser haba, cebada y sus testigos, presentaron el
importantes en la sobrevivencia, pH final cercano a la neutralidad, y sin
multiplicación y propagación bacteriana cambios considerables respecto a su pH
(Nautiyal 1999), sin embargo, la inicial.

9 a
8 b b
b b b b b b
7 c c d
6 e
pH FINAL

5
4
3
2
1
0

CALDOS

Figura 8. pH final de los diferentes caldos.

El cambio de pH causada por B. pumilus Para mejorar el medio de cultivo

en los diferentes caldos muestra que la seleccionado en el acápite anterior, se
bacteria se comporta de forma realizó pruebas con cuatro diferentes
diferenciada según el medio de cultivo. fuentes de azúcares: azúcar blanca, azúcar
morena, chancaca y glucosa, donde se
Evaluación de medios de cultivo con
encontró diferencias significativas
diferentes fuentes de energía para la
(p=0,05), siendo la chancaca y el azúcar
multiplicación masiva
morena, las que estimularon una mayor
multiplicación de B. pumilus (Figura 9).
31 Vol 22 (1) 2018 Evaluación de bacterias endófitas de papa nativa

Figura 9. Efecto de diferentes fuentes de azúcar sobre la multiplicación de Bacillus pumilus.

Tanto la chancaca como azúcar morena Evaluación del pH inicial

presentan mayores cantidades de El pH inicial o el pH antes de la
minerales como: fosforo, calcio, inoculación de los caldos de papa
magnesio, potasio y hierro, a diferencia
combinado con los diferentes fuentes de
de azúcar blanca y glucosa, que presentan energía, fueron evaluados, donde se
estos minerales en cantidades bajas o presentó diferencias altamente
nulas significativas (p=0,01), siendo el caldo
(http://www.ccbolgroup.com/chancaca.ht con chancaca el que tuvo el pH mas bajo
ml), por lo que la multiplicación de B. (pH=5,9), y el resto de los tratamientos
pumilus, podría estar potenciada por estas presentaron un pH cercano a la
propiedades, sin embargo se requiere mas neutralidad (Figura 10).
estudios para confirmarlo.

Figura 10. Efecto de azúcares sobre el pH inicial en los medios de cultivo.

32 Vol 22 (1) 2018 Evaluación de bacterias endófitas de papa nativa

Evaluación del pH final evidente que B. pumillus en caldo de papa

combinado con los azúcares evaluados,
También se encontraron diferencias
acidifica el medio, pudiendo existir un
altamente significativas (p=0,01), en el
efecto similar en la rizósfera de la planta.
pH final. Los caldos testigos, es decir, los
Similar efecto fue reportado por
que no fueron inoculados con la bacteria,
Dulmage, et al. (1990), con Bacillus
presentaron un pH cercano a la
thuringiensis, que indica que la
neutralidad (pH=6), y los caldos
disminución del pH en los caldos
inoculados presentaron valores por debajo
inoculados, se debe a la producción de
de pH=5,2, siendo la glucosa el caldo con
ácidos orgánicos, por la oxidación de los
el pH más bajo (pH=4,8), por la acción
carbohidratos.
de la bacteria (Figura 11). Quedando

7,00 a a
b b
6,00 c c d e
5,00
pH FINAL

4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
A. Blanca A. Blanca A. Morena A. Morena Chancaca Chancaca Glucosa Glucosa
Test Test Test Test
AZUCAR

Figura 11. Efecto de azúcares sobre el pH final en los medios de cultivo.

Comparando con los resultados del pH Grados Brix

final de los diferentes caldos (Figura 11), En cuanto a la evaluación de los grados
se observó un efecto inverso, el caldo Brix en los diferentes caldos, no se
inoculado presento un pH alcalino
encontraron diferencias significativas, B.
(pH=8,2) respecto a su testigo que pumilus consume de igual forma los
presento un pH levemente ácido diferentes azúcares.
(pH=6,2). Por lo que el caldo de papa con
adición de azúcares, se acidula por acción
de B. pumilus.
33 Vol 22 (1) 2018 Evaluación de bacterias endófitas de papa nativa

4,50
4,40
4,30
4,20

GRADOS BRIX
4,10
4,00
3,90
3,80
3,70
3,60
3,50
A. Blanca A. Blanca A. Morena A. Morena Chancaca Chancaca Glucosa Glucosa
Test Test Test Test
AZUCAR

Figura 11. Efecto de las cepas bacterianas sobre los Grados Brix.

Sin embargo, los caldos testigo, presentan Evaluación de medios inertes para la
promedios más altos, que los caldos formulación del biofertilizante
inoculados (Figura 11), lo cual se puede Realizada la formulación en pellet y en
explicar al consumo del azúcar por parte polvo, con los caldos enriquecidos con
de la bacteria, como fuente de energía, azúcares, se realizó la evaluación de
propia de la desnitrificación heterótrofa viabilidad, donde se encontraron
(http://es.wikipedia.org/wiki/Desnitrificac diferencias altamente significativas
i%C3%B3n). (p=0,01), tanto por el formulado, el tipo
de azúcar, y la interacción de ambos.

Figura 12. Viabilidad en los formulados con los diferentes azúcares.

34 Vol 22 (1) 2018 Evaluación de bacterias endófitas de papa nativa

Existe una mayor viabilidad en la presentan una consistencia en seco, de

formulación en polvo, ya que se granulado y polvo.
encontraron mayor número de unidades Según Boland & Kuykendall (1998), el
formadoras de colonias/ml. Dentro de formulado en polvo, presenta una
cada formulación, en el formulado pellet característica importante, que es el
hay una mayor viabilidad con azúcar tamaño de la partícula del principio
blanca; asimismo, en el formulado en activo, pues cuanto mas pequeño, mejor
polvo existe una mayor viabilidad con es su distribución en la superficie del
chancaca (Figura 12). material que va a proteger, por lo que va a
Estas diferencias en la viabilidad entre el conseguir una mayor eficacia. Y por ser
tipo de formulado, se puede explicar a la una suspensión al ser mezclado con agua
cantidad de insumos inertes utilizados, es (De Piedrahita et al. 1984), puede
decir, en polvo se utilizó menor cantidad utilizarse para su aplicación, una mochila,
de insumos inertes en relación a la u otro equipo, para grandes extensiones
cantidad utilizada en pellet, para la misma de superficie.
cantidad de caldo bacteriano. El formulado en pellet, según Bravo et al.
Por otra parte, al comparar la población (2004), presenta como ventaja, que
bacteriana en el caldo con las mejora la cohesividad y comprensibilidad
formulaciones sólidas, disminuyen, lo que del polvo, debido a que el aglutinante
se podría explicar al método de conteo de cubre las partículas individuales,
la concentración bacteriana, ya que el haciendo que se adhieran unas a otras
conteo en los caldos fue realizado en formando gránulos, mejorando la fluidez,
cámara de Neubauer, donde se realiza el permitiendo la uniformidad del contenido
conteo de todas las bacterias observadas, para formulaciones con bajo contenido de
en cambio el conteo en los formulados, se ingrediente activo. Por lo que su
realiza a través del conteo de unidades aplicación es directa al suelo, para
formadoras de colonias en medio de extensiones limitadas, pero puede ser
cultivo, es decir solo las bacterias viables; mejorado si se dispone de un equipo
como también se puede explicar a la adecuado para distribuir en grandes
dilución del caldo con los medios inertes. extensiones.
Similar resultado fue reportado por el En general, las mejores cepas bacterianas
Laboratorio de Microbiología, PROINPA seleccionadas a través del ensayo en
(2010), donde B. pumilus presentó una vivero, fueron: 33pa, IVpa, IIpa, IXpb y
concentración de 2,5x108 en medio TSB, 2pf, por que presentaron los valores más
y el mismo formulado en polvo presentó altos en las variables de rendimiento, en
una concentración de 6,1x105. Esto los dos cultivares de papa evaluadas. Sin
muestra que se debe explorar medios de embargo, la cepa 33pa, destaca por
cultivo más eficientes y medios inertes de presentar los promedios más altos en las
bajo volumen para optimizar la población variables de rendimiento. Esta cepa
bacteriana después de la formulación. corresponde a la especie Bacillus
Se registró también, el tiempo de secado: pumilus, y se caracteriza por ser
2 kg tardó en secar un día, en ambos solubilizadora de Fósforo y fijadora de
formulados; son solubles en agua, y Nitrógeno.
35 Vol 22 (1) 2018 Evaluación de bacterias endófitas de papa nativa

Para la formulación, el mejor medio de (2004). Bacillus thuringiensis en el

cultivo para la multiplicación masiva de control biológico. Universidad Nacional
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Los autores han cumplido las normas de Castillo, J. A. (2010). Identificación de
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interés en la presente investigación. PROINPA 2010. p irr.
Agradecimientos Castro, S. y Roa, C. (2006). Bacterias
endófitas de Cordia alliodora Oken y
Los autores agradecen a la Fundación
Tabebuia rosea Bertonld D.C. Potencial
PROINPA por el apoyo y las facilidades
como promotoras de crecimiento vegetal
brindadas para la ejecución de esta
en la propagación de su hospedero.
investigación. Asimismo, al Programa
Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá
FONTAGRO-BID por el financiamiento
D.C. Colombia. 10-15p.
proporcionado y su confianza.
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