PRODUCCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS POR CULTIVOS IN VITRO

1) INTRODUCCIÓ N Y OBJETIVOS
………………………………………………….
En este trabajo se describen los principales metabolitos secundarios producidos por
cultivo in vitro y las estrategias ingenieriles asociados con el fin de contribuir a
incrementar la producció n de los metabolitos secundarios por cultivo in vitro.
2) JUSTIFICACIÓ N
3) ANTECEDENTES
Se han reportado numerosos procesos exitosos para la producció n de metabolitos
secundarios mediante el cultivo de tejidos (Vanisree y Tsay, 2004), es por eso que
alrededor del mundo se estudia la posibilidad de elaborar, mediante esta tecnología,
compuestos como: colorantes, antioxidantes, aceites esenciales, fá rmacos, bioplaguicidas,
entre muchos otros productos de interés humano.
Castro, (2014) en su trabajo tuvo como objetivo establecer cultivos in vitro de Datura spp.
Se generó un protocolo para el establecimiento de cultivos asépticos de Datura spp,
utilizando semillas como explantes. Las semillas fueron sembradas en diferentes medios
de cultivo. Se utilizó medio MS está ndar como control, medio MS suplementado con
diferentes reguladores del crecimiento vegetal y medio MS suplementado con una alta
concentració n de micronutrientes. En cada tratamiento se registró el porcentaje y tiempo
de germinació n, la morfología de las plá ntulas obtenidas, así como el porcentaje de
formació n de callo. A partir de las plá ntulas generadas, se tomaron diferentes explantes
(raíz, hojas e hipocó tilos), con la finalidad de inducir la formació n de callo en los mismos.
Obteniéndose los mejores resultados en los medios de cultivo suplementados con 1.0
mg/L de 2,4-D y 1.0 mg/L de BAP (92.63%), siendo los fragmentos de hipocó tilo y hoja los
mejores explantes para este fin. La biomasa obtenida (callos), fue subcultivada en varias
ocasiones con la finalidad de generar suficiente para ser utilizada en los aná lisis
fitoquímicos programados. La biomasa fue secada en una estufa y posteriormente se
sometió a una extracció n solido-liquido con dos diferentes solventes, etanol y cloroformo.
Una vez obtenidos ambos extractos, fueron sometidos a una serie de pruebas fitoquímicas
encaminadas a la identificació n de alcaloides. Lográ ndose observar en todas las muestras
analizadas la presencia de alcaloides del tipo tropá nicos. Se llegó a la conclusió n de que los
cultivos de callo de Datura spp retienen su característica natural de producir compuestos
alcaloideos, por lo que la técnica de cultivo de tejidos vegetales se presenta como una
alternativa importante en la generació n y producció n de este tipo de metabolitos
secundarios. Asimismo (Consuelo et al., 2014) producieron metabolitos secundarios en
cultivo de raíces in vitro y suspensiones celulares de Ipomoea carnea spp. Carnea Jacpq.
Los cultivos de raíces fueron en medio MS con diferentes concentraciones de AIB, sacarosa
y combinaciones de AIB-sacarosa. Diversos explantes obtenidos de plá ntulas in vitro y
plantas silvestres se cultivaron en diferentes combinaciones de 2,4-D, AIA, ANA y BAP,
para inducir callos friables, dependiendo del tipo de explante y los reguladores de
crecimiento. Suspensiones celulares se establecieron a partir de callos y estudiaron en su
crecimiento y acumulació n de metabolitos secundarios. Los metabolitos secundarios
identificados en cultivo de raíces y suspensiones celulares fueron fenoles, diversos
flavonoides y la cumarina escopoletina. También (Arias,2002) estudió la susceptibilidad de
Lepidium peruvianum a las técnicas del cultivo de tejidos como herramienta de producción de
metabolitos secundarios. Se realizó la inducción de callos en diferentes ex plantes de L.
peruvianum utilizando la auxina 2,4-D y la citoquinina Kinetina, en un factorial de medios con
diferentes concentraciones auxina/citoquinina. Se obtuvieron callos en la mayoría de los
medios usados, la relación de hormonas más eficiente fue 1 µM auxina/citoquinina. Se evaluó
la presencia de glucosinolatos y alcaloides en los callos obtenidos y se compararon con
muestras control de hipocótilos de maca. Se observó la presencia variable de dos fracciones de
glucosinolatos en los callos, en la mayoría de los casos las manchas tuvieron una coloración
más intensa en los callos que en los controles. De otro lado se observó una alta variabilidad en
la presencia de alcaloides y otros metabolitos no identificados en los callos obtenidos en este
trabajo. También se evaluó cualitativamente la presencia de mirosinasas en los callos
obtenidos, observándose bandas positivas en los callos y las muestras de plantas de maca. Por
último, (Arias et al.,2009) abordaron diferentes aspectos ingenieriles del cultivo de células
vegetales concernientes a la producción de metabolitos secundarios.
4) MARCO TEÓRICO
4.1) METABOLISMO PRIMARIO: Procesos químicos que intervienen en forma directa
en la supervivencia, crecimiento y reproducció n de las plantas.
a) METABOLITOS PRIMARIOS: Son compuestos producidos por casi todas las
plantas por ser esenciales para las vías bioquímicas que controlan el
crecimiento (divisió n, alargamiento y diferenciació n, celular), la fotosíntesis, la
respiració n, transporte de asimilados, asimilació n de nutrientes, la floració n, la
maduració n de los frutos, etc. En otras palabras, son indispensables para la
vida de la planta (y los microorganismos). Estas sustancias incluyen
carbohidratos, glucó sidos, aminoá cidos, proteínas, lípidos, á cidos nucleicos y
vitaminas. (Gottlieb et al. 2001 y Martin, 2000).

4.2) METABOLISMO SECUNDARIO: Comprende aquellos procesos químicos que son

ú nicos para una planta dada, y no son universales, ademá s que no son necesarios para
el crecimiento, reproducció n y supervivencia de las plantas pero que cumplen roles
muy importantes como defensa, atracció n de polinizadores etc.
b) METABOLITOS SECUNDARIOS: Son compuestos que no participan de forma
directa en el crecimiento y en el desarrollo de vegetales y que no tienen una
funció n
aparente en el metabolismo primario, pero sí tienen una implicació n ecoló gica
como defensa contra herbívoros, virus, hongos, bacterias. (Bourgaud et al.,
2001). Ademá s, son una fuente importante de principios activos de
medicamentos y de valiosos productos químicos (Goossens et al., 2003). Se
consideran 3 tipos de metabolitos tales como Terpenos, Fenoles y Compuestos
Nitrogenados.
Los metabolitos secundarios son químicamente reactivos; es decir, son aptos
para ingresar en los sistemas vivos, interactuar y cambiar la estructura de un
receptor o blanco molecular, y penetrar celularmente donde pueden afectar
varios procesos fisioló gicos. De allí deriva su actividad bioló gica o
farmacoló gica (Anaya y Espinosa, 2006). Las plantas producen decenas de
miles de metabolitos secundarios, algunos se consideran productos naturales o
drogas (con sus derivados y aná logos) y representan alrededor del 25% de los
productos con uso medicinal. Su empleo puede ser directo o bien como
precursores y modelos para la síntesis o semi-síntesis de fá rmacos (Anaya y
Espinosa, 2006). Las raíces acumulan, secretan y sintetizan una gama diversa
de metabolitos secundarios. Se conoce que la actividad de biosíntesis en las
raíces también se mantiene en cultivos in vitro.

4.3) CULTIVOS IN VITRO: El cultivo de tejidos como técnica consiste en aislar una
porció n de planta y proporcionarle las condiciones apropiadas para que las células
expresen su potencial intrínseco o inducido. Es en realidad un conjunto de diversas
técnicas mediante las cuales un explante, es decir una parte separada de la planta, se
cultiva asépticamente en un medio de composició n definida y se incuba en condiciones
ambientales controladas. (Roca y Mroginski, 1991).
Los primeros intentos de establecer cultivos de tejidos vegetales fueron realizados por
el botá nico alemá n G.Haberlandt en 1902 (Gautheret, 1982) quien trabajo con células
de palizada, pelos glandulares de estambres de Tradescandia; pero aunque logró que
las células sobrevivieran entre 20 a 27 días, no tuvo crecimiento celular,
probablemente a que eligió nutrientes relativamente simples y a que eligió altamente
diferenciadas (Dodds y Roberts, 1982).

4.4) CLASES DE CULTIVO IN VITRO: Existen fundamentalmente tres formas de realizar

cultivos in vitro: células en suspensió n, células inmovilizadas o como tejidos u ó rganos.
La clase de cultivo afecta, entre otras cosas, el crecimiento celular, la formació n de
producto, su purificació n y el tipo de biorreactor que puede ser utilizado.

a) Cultivo en suspensión: En las suspensiones, las células individuales se

distribuyen en forma homogénea a través del medio de cultivo y por estar
rodeadas del mismo, se facilita la transferencia de nutrientes y oxígeno hacia el
citoplasma. Este tipo de cultivo presenta la ventaja de permitir el control
relativamente sencillo de variables como temperatura, pH y oxígeno disuelto; sin
embargo, pueden verse modificadas algunas características de las células
presentes en las plantas como su diferenciació n y la comunicació n intercelular
(SCHLATMANN, et al., 1996), lo que implica en muchos casos la disminució n en la
producció n de metabolitos secundarios, pues se ha reportado que en algunas
especies la síntesis de ciertos metabolitos requiere la coexistencia de diferentes
tipos celulares o la compartimentalizació n intracelular. (TREJO-TAPIA y
RODRÍGUEZMONROY, 2007).

b) Cultivo de células inmovilizadas: Esta es una alternativa que ha mostrado en

muchos casos la estimulació n del metabolismo secundario, debido probablemente
a una tasa de crecimiento má s lenta que favorece un mayor flujo de nutrientes y
energía hacia este metabolismo, un mayor contacto célula-célula y un mayor grado
de diferenciació n, haciendo que el ambiente físico-químico sea má s parecido al de
la planta (PRAKASH y SRIVASTAVA, 2005)
Las células inmovilizadas presentan una mayor limitació n a la transferencia de
masa, debido a la resistencia aportada por el soporte; ademá s, se ha reportado la
inducció n de cambios morfoló gicos y fisioló gicos, que pueden estimular no só lo la
producció n, sino también la liberació n de metabolitos secundarios al medio,
posiblemente por la permeabilizació n de la membrana celular (DÖ RNENBURG,
2004).
La utilizació n de sistemas con células inmovilizadas presenta la ventaja de
mantener retenido el biocatalizador, permitiendo su reutilizació n y la operació n
del proceso de manera continua, usando altas tasas de dilució n sin que ocurra
lavado celular. Adicionalmente, cuando el metabolito es liberado por la célula al
medio, se ven simplificados los procesos de purificació n de los metabolitos de
interés, reduciendo el costo del proceso (SAJC, et al, 2000).

c) Cultivo de órganos: La producció n de ciertos metabolitos está asociada a células

muy especializadas o a la interacció n de células en la planta, que en algunos casos
pueden ser de diferentes tipos celulares (TREJO-TAPIA y RODRÍGUEZMONROY,
2007); en estos casos resulta ú til cultivar el ó rgano o tejido completo (YEOMAN y
YEOMAN, 1996). Existen dos tipos de ó rganos que usualmente son cultivados para
la producció n de metabolitos secundarios: raíces y brotes; éstos se caracterizan
por tener un patró n metabó lico muy similar al de los ó rganos en la planta y en la
planta y pueden o no estar transformados genéticamente; en el caso de células no
trasformadas el tejido se obtiene a partir de un explante y la diferenciació n se logra
utilizando una combinació n apropiada de hormonas; los ó rganos transformados se
obtienen utilizando Agrobacterium rizhogenes, en el caso de raíces, o
Agrobacterium tumefaciens en el caso de brotes (RAY y JHA, 1999). Los ó rganos
transformados tienen varias ventajas con respecto a los ó rganos sin transformar y
a los cultivos en suspensió n, ya que requieren medios má s simples sin reguladores
de crecimiento, mantienen la estabilidad genética y la producció n del metabolito
de interés por má s tiempo, crecen rá pidamente acumulando metabolitos
secundarios durante la fase de crecimiento y se pueden cultivar a altas densidades
de biomasa (GIRI y LAKSHMI, 2000). Sin embargo, es importante tener en cuenta
las limitaciones a la transferencia de oxígeno y nutrientes dentro de los ó rganos,
por lo que es necesario optimizar las operaciones de transferencia de masa para
 evitar la necrosis (SCHLATMANN, et al., 1996), aspectos importantes en el escalado
de los procesos (MARTIN y VERMETE, 2005).

4.5) CONDICIONES DE UN CULTIVO IN VITRO: Existen mú ltiples condiciones que el

explante (tejido u ó rgano vegetal) requerirá para poder desarrollarse a lo largo del
periodo de siembra, cada una de ellas permitirá que los cultivos vegetales puedan
crecer de una mejorar manera, sin mencionar el hecho de que estas plantas crecerá n
en un ambiente diferente al que normalmente se desarrollarían. Entre ellos tenemos:
- Esterilidad: El cultivo de las especies vegetales in vitro debe mantenerse
altamente desinfectado y libre de agentes pató genos, las condiciones tienen que
ser ó ptimas para evitar que los cultivos puedan contaminarse, por lo que
regularmente debe realizarse una desinfecció n minuciosa dentro del laboratorio al
igual que un monitoreo del ambiente que permita conocer la cantidad de UFC
(unidades formadoras de colonias) tanto bacterianas como fú ngicas que puedan
existir en las diferentes á reas. (Lozano et al., 2015).
- Temperatura: La temperatura ideal para el crecimiento de cultivos vegetales por
lo general puede oscilar entre los 25 - 30ºC, ideal para que el crecimiento de estos
tejidos se pueda dar (9,10).
- Humedad Relativa: Los cultivos vegetales in vitro necesitan una humedad relativa
entre el 50% y el 80 % frente al ambiente, para que la planta pueda desarrollarse.
Segú n el tipo de características que requiera la planta la humedad puede variar,
algunos estudios muestran como la albahaca requiere una humedad relativa entre
el 70% y el 80% (11), mientras que, para otros tipos de cultivos, como en el caso
del café, la humedad relativa varía entre el 50% y 60% (5).
- Ciclo de luz: Usualmente las plá ntulas crecidas in vitro deben permanecer durante
18 horas en un ciclo de luz constante y 6 horas de oscuridad para que puedan
realizar el intercambio de luz necesario para su crecimiento, como, por ejemplo, en
el caso del cultivo de la albahaca se emplea principalmente un fotoperiodo de luz
como el que se mencionó antes, al igual que el recomendado por la Organizació n de
las Naciones Unidas (11,12)
- pH: Debe oscilar entre 5.6 y 5.8 para evitar estrés durante su cultivo. Por ejemplo,
los cultivos de cañ a de azú car requieren un pH menor, debido a que de forma
natural crecen en ambientes má s á cidos (12).

4.6) TECNICAS DE CULTIVOS IN VITRO: Dentro del cultivo in vitro de especies

vegetales existen muchas técnicas que permiten lograr el objetivo de cultivar
exitosamente un explante, aunque esto dependerá del tipo de planta que se desee
propagar de acuerdo a su morfología. Estas herramientas permitirá n al investigador
controlar de manera directa las características que pueden llegar a necesitar en el
momento de evaluar las condiciones y el estado en que se requiere la planta para la
investigació n. Se conocen 6 tipos de técnicas de cultivo vegetal dentro de las cuales
hay:
- Embriogénesis somática directa: En este tipo de propagació n, lo que se busca es
obtener un nuevo organismo a partir de un embrió n vegetal, que puede llegar a ser
extraído de cualquier tipo de semilla dicotiledó nea. La idea de esta técnica consiste
en aumentar la proliferació n de las células madre contenidas en el embrió n
vegetal. (23)
- Embriogénesis somática indirecta: Usualmente se emplea la siembra de semillas
que puedan generar un nuevo individuo, se busca aumentar el proceso de
crecimiento vegetal de las semillas y del embrió n por medio de la aplicació n de
algunos reguladores de crecimiento. (24)
- Organogénesis directa: Consiste en la obtenció n de un nuevo individuo a partir
de la siembra de un ó rgano vegetal, que en este caso puede llegar a ser extraído de
 un vá stago, una hoja e incluso una raíz que presente las características
fenotípicamente estables para llevar a cabo su propagació n. (25)
- Organogénesis indirecta: se realiza a partir de la siembra de un tejido vegetal que
pueda ser capaz de generar la producció n de células meristemá ticas, en este caso,
lo que se busca es aumentar el nú mero de células vegetales presentes en el medio y
que, por medio de estas, puedan generar, un nuevo ó rgano vegetal que continú e
con el proceso de crecimiento. (26)
- Siembra de meristemos: es la mejor técnica de propagació n vegetal in vitro, ya
que no involucra ningú n tipo de desinfecció n que exponga al explante, en este caso,
es la célula meristemá tica propiamente dicha la que es sembrada en el medio de
cultivo, la dificultad de esta técnica depende del tipo de método que se emplee
durante la extracció n del meristemo, ya que es la parte má s importante a la hora
realizar dicho procedimiento. Es una técnica que por involucrar directamente a las
células vegetales no requiere ningú n tipo de desinfecció n debido a que estas
células se encuentran totalmente aisladas y, por ende, 100% libres de agentes
pató genos que puedan dificultar la siembra, este procedimiento logra abarcar un
gran nú mero de utilidades para la conservació n y preservació n de especies
vegetales. (16).
- Micropropagación: consiste en la propagació n de plá ntulas in vitro, es un método
que ú nicamente requiere de un banco de germoplasma previo para su realizació n

4.7) APLICACIONES DE LOS CULTIVOS IN VITRO DE VEGETALES:

Los metabolitos secundarios presentes en diferentes especies vegetales son capaces de

ser usados en la creació n de nuevos antibió ticos o fá rmacos que puedan contribuir al
tratamiento de enfermedades, como se ha sugerido en algunas investigaciones que
mencionan la posibilidad de extraer algunos metabolitos secundarios por medio de
técnicas de purificació n y extracció n.

La manipulació n de especies vegetales agrícolas también destaca en el mejoramiento

de la calidad en el á mbito de la industria, como en el caso del plá tano bocadillo, el cual
para la industria colombiana presenta una gran utilidad a nivel comercial en el á mbito
biotecnoló gico, esta especie se ha podido cultivar de una manera mucho má s
controlada.

4.8) ESTRATEGIAS INGENIERILES PARA EL DESARROLLO DE CULTIVOS IN VITRO

- Agregación:
Las células vegetales, como ya se ha mencionado, tienen una tendencia natural a
formar agregados cuando son cultivadas en suspensió n; este hecho es de gran
importancia pues puede afectar tanto las características metabó licas del cultivo
como la reología de los caldos; esta ú ltima variable es influenciada por el tamañ o
de los agregados y por la forma de los mismos, observá ndose que agregados
esféricos resultan en caldos Newtonianos mientras que células elongadas resultan
en comportamientos no Newtonianos (TREJO, G. et al,. 2001)

- Agitación y estrés hidrodinámico:

La agitació n es una operació n física que aumenta la homogeneidad del medio de

cultivo, disminuyendo los gradientes de concentració n y temperatura, evitando la
sedimentació n de las células y controlando el tamañ o de los agregados celulares
(ZHONG, JJ. Et al., 2002). La agitació n, al igual que la aireació n, genera fuerzas
hidrodiná micas sobre las células en suspensió n, lo que se traduce en una respuesta
metabó lica que depende del tiempo, la intensidad de la exposició n y las
características fisioló gicas de estas células. En los procesos de agitació n es posible
mantener constante la velocidad del impulsor o el tiempo de mezcla. (KIERAN, P. et
al., 1997)

- Aireación y transferencia de oxígeno

La composició n y concentració n de ciertos compuestos gaseosos (oxígeno, dió xido

de carbono y etileno, entre otros) en el medio de cultivo, es determinante en el
crecimiento celular y la síntesis de metabolitos secundarios (LEE-PARSONS C. y
SHULER M., 2005); estas concentraciones dependen de varios factores, como la
temperatura, la presió n, el flujo de aireació n y la composició n de los gases de
alimentació n. El papel de la aireació n en un cultivo celular puede entonces
entenderse desde tres perspectivas: en primer lugar, se encarga de suplementar el
oxígeno necesario, en segundo lugar, incrementa la homogenizació n del medio de
cultivo y finalmente es responsable de la desorció n de metabolitos volá tiles como
el CO2 y el etileno (TRUNG N., 2006). De este modo es fundamental en el diseñ o de
un biorreactor hacer consideraciones referentes tanto a los requerimientos de
oxígeno del cultivo, como a la necesidad de mantener los metabolitos volá tiles en
las concentraciones que estimulan la síntesis de metabolitos secundarios.

- Diseño del biorreactor:

Los biorreactores para el cultivo de células vegetales se diseñ an usualmente
mediante adaptaciones y modificaciones de fermentadores convencionales,
teniendo en cuenta características de este tipo de sistemas como la sensibilidad al
estrés de corte, la dificultad para mantener la homogeneidad de la suspensió n y los
requerimientos de transferencia de masa (KIERAN, P. et al., 1997). El biorreactor
de tanque agitado (STR) ha sido comú nmente utilizado; sin embargo, es
importante destacar que es de difícil escalado y presenta alto riesgo de
contaminació n por la presencia de partes mó viles; ademá s, cuando éste es
empleado debe de garantizarse tanto la homogeneidad de la suspensió n como una
buena dispersió n del gas en el líquido. El estudio del desempeñ o de diferentes
tipos de agitadores ha mostrado que las turbinas de paleta inclinada con flujo axial
ofrecen importantes ventajas en sistemas en los que la agitació n está limitada por
la resistencia al estrés de corte de las células; otro tipo de impulsores como las
turbinas de disco con paleta curvada y también podrían ofrecer algunas ventajas
(DORAN P., 1999)
 - Modelamiento del proceso:

El crecimiento celular puede describirse mediante modelos que, dependiendo de

có mo consideran la població n y la estructura de la célula, pueden ser segregados o
no segregados y estructurados o no estructurados. Los modelos segregados
consideran la heterogeneidad de la població n, distinguiendo entre diferentes tipos
celulares, mientras que los no segregados, consideran que la població n es
completamente uniforme. En los modelos estructurados, se consideran los eventos
intracelulares específicos, mientras los no estructurados definen a la biomasa
como una variable simple de composició n constante, asumiendo crecimiento
balanceado.

- Escalado:

Actualmente existen pocos procesos de obtenció n de metabolitos secundarios por

cultivo de células vegetales a nivel industrial, debido principalmente a la baja
productividad, la inestabilidad de las líneas celulares y a los problemas
concernientes al escalado. El escalado del cultivo de células vegetales presenta tres
complicaciones principales: la sensibilidad al estrés de corte, el suministro de
oxígeno y la remoció n de compuestos volá tiles con la aireació n. Varios estudios
muestran que dichos parámetros afectan el cultivo de manera especie-específica e
inclusive
dependiendo de la línea celular que es empleada (PAN ZW. et al., 2000).

LINKS:

- file:///C:/Users/DELIANA/Downloads/2222-Texto%20del%20art%C3%ADculo-6151-1-
10-20180309.%20Cultivo%20in%20vitro.pdf
- https://www.redalyc.org/pdf/496/49611942011.pdf
- https://www.revista-
agroproductividad.org/index.php/agroproductividad/article/download/1236/1005/230
5#:~:text=Hallazgos%2Fconclusiones%3A%20Los%20cultivos%20in,producci%C3%B3n
%20y%20comercializaci%C3%B3n%20de%20f%C3%A1rmacos
- http://147.96.70.122/Web/TFG/TFG/Memoria/KRISTIN%20CHAVDAROVA
%20KAMENOVA.pdf
REFERENCIAS
Anaya L.A.L., Espinosa G.F.J. (2006). La química que entreteje a los seres vivos. Ciencias. 83:4-13.
ARIAS, MARIO; AGUIRRE, ANA; ANGARITA, MÓ NICA; MONTOYA, CAROLINA; RESTREPO, JUAN
ASPECTOS INGENIERILES DEL CULTIVO IN VITRO DE CÉ LULAS VEGETALES PARA LA
PRODUCCIÓ N DE METABOLITOS SECUNDARIOS. Dyna, vol. 76, nú m. 157, marzo, 2009, pp. 109-
121
Bourgaud, F, Gravot A, Milesi S, Gontier E (2001) Production of plant secondary metabolites: a
historical perspective. Plant Science 161:839-851
DORAN P. Design of mixing systems for plant cell suspensions in stirred reactors. Biotechnology
Progress. 1999; 15(3):319-335.
DÖ RNENBURG, H. (2004). Evaluation of immobilization effects on metabolic activities and
productivity in plant cell processes. Process Biochemistry. 39(11):1369-1375.
GIRI, A. y LAKSHMI, M. (2000). Transgenic hairy roots: recent trends and applications.
Biotechnology Advances. 18(1): 1-22.
Goossens, A., Häkkinen, S., Laakso I, Seppä nenLaakso T, Biondi S, De Sutter V, Lammertyn F,
Nuutila AM, Sö derlund H, Zabeau M, Inze D, Oksman-Caldentey K. (2003). A functional genomics
approach toward the understanding of secondary metabolism in plant cells. Proc Natl Acad Sci
USA 100:8595-8600
Gottlieb, GR., Kaplan M., Borin, R. (2001). Biodiversidad. Un enfoque integrado entre la química y
la biología. Traducido al españ ol por Alicia B. Pomillo. Buenos Aires, Argentina. 239 p.
LEE-PARSONS C, SHULER M. Sparge gas composition affects biomass and ajmalicine production
from immobilized cell cultures of Catharanthus roseus. Enzyme and Microbial Technology. 2005;
37(4):424-434.
Lozano G, Lorena D, Neftalí ML, Guerrero O, Lily M. (2015). Estandarizació n del protocolo de
desinfecció n para la micropropagació n de Aspidosperma polyneuron Standardization of the
disinfection protocol for the micropropagation of Aspidosperma polyneuron. XVII (2).
Martin, GJ. (2000). Etnobotá nica. Manual de métodos. Traducido del inglés por Ana E. Guyer.
Editorial NORDAN-Comunidad. WWW-UK, UNESCO, Royal Botanic Gardens, Kew.Montevideo,
uruguay. 240 p.
MARTIN, Y. y VERMETE, P. (2005). Bioreactors for tissue mass culture: design, characterization,
and recent advances. Biomaterials. 26(35):7481-7503.
KIERAN P, MACLOUGHLIN P, MALONE D. Plant cell suspensions cultures: some engineering
considerations. Journal of Biotechnology. 1997; 59(1): 39-52.
PAN ZW, WANG HQ, ZHONG JJ. Scale-up study on suspension cultures of Taxus chinensis cells for
production of taxane diterpene. Enzyme and Microbial Technology. 2000; 27(9): 714-723.
PRAKASH, G. y SRIVASTAVA, A. (2005). Statistical media optimization for cell growth and
azadirachtin production in Azadirachta indica (A. Jyss) suspension cultures. Process Biochemistry.
40(12): 3795-3800.
RAY, S. y JHA, S. (1999). Withanolide synthesis in cultures of Withania somnifera transformed with
Agrobacterium tumefaciens. Plant Science. 146(1):1-7.
Roca, W. y Mroginski, L. (1991). Establecimiento de un laboratorio para el cultivo de tejidos
vegetales. En: Cultivo de tejidos en la Agricultura. (Ed. por W. Roca y L. Mroginski). CIAT. Cali. 211-
238.
SAJC, L., GRUBISIC, D. y VUNJAKNOVAKOVIC, G. (2000). Bioreactors for plant engineering: an
outlook for further research. Biochemical Engineering Journal. 4(2): 89-99.
SCHLATMANN, J., HOOPEN, H. y HEIJNEN, J. (1996). Large-scale production of secondary
metabolites by plant cell cultures. En: DiCosmo F, Misawa M, Editores. Plant cell culture secondary
metabolism: toward industrial application. New Cork: CRS Press. p.11-52.
TREJO-TAPIA G, JIMÉ NEZ-APARICIO A, VILLAREAL L, RODRÍGUEZ-MONROY M. (2001). Broth
rheology and morphological analysis of Solanum chrysotrichum cultivated in a stirred tank.
Biotechnology Letters; 23(23):1943- 1946.
TREJO-TAPIA y RODRÍGUEZMONROY. (2007). La agregació n celular en la producció n de
metabolitos secundarios en cultivos vegetales in-vitro. Interciencia. 32(10):669-674.
TRUNG N, MURTHY HN, YU K, JEONG CS, HAHN EJ, PAEK KY. Effect of oxygen supply on cell
growth and saponin production in bioreactor cultures of Panax ginseng. Journal of Plant
Physiology. 2006; 163(12):1337-1341.

Vanisree, M. N. y Tsay, H. S. (2004) Plant cell cultures-an alternativeand efficient source for the
production of biologically important secondary metabolites. International Journal of Applied Science
and Engieneering. pp.: 1, 29-48.

YEOMAN, M. y YEOMAN, C. (1996). Manipulating secondary metabolism in cultured plant cells.

New Phytologist. 134 (4):553-569.
ZHONG JJ, PAN ZW, WANG ZY, WU J, CHEN F, TAGAKI M, ET AL Effect of mixing time on taxoid
production using suspension cultures of Taxus chinensis in a centrifugal impeller bioreactor.
Journal of Bioscience and Bioengineering. 2002; 94(3):244-250.

ANTECEDENTES:
En la actualidad se conocen pocos procesos industriales para la producción de metabolitos
secundarios utilizando esta estrategia de cultivo; algunos de los procesos exitosos han sido
la obtención de paclitaxel, una droga anticancerígena obtenida de suspensiones celulares
de especies del género Taxus por la empresa Alemana Phyton hasta volúmenes de 75000
litros; la obtención de shikonina por suspensiones celulares de Lithospermum
erythrorhizon y berberina a partir de suspensiones de Coptis japonica por la empresa
japonesa Mitsui Petrochemical Industries Ltd. y finalmente la obtención de extractos de la
planta Panax ginseng en reactores de hasta 25000 litros por la empresa japonesa Nitto
Denko Corporation.