BIO 144 – Bioquímica I Carrera Biología

Labs 3 y 4: Separación y cuantificación de proteínas

Separación y cuantificación de caseína de la leche de vaca

1. INTRODUCCIÓN
En este laboratorio realizaremos un ejercicio simple relacionado con la purificación de proteínas. En la primera parte del
experimento, se aislará caseína a partir de una muestra de leche de vaca. La caseína será separada como un agregado insoluble
mediante acidificación de la leche. La grasa que co-precipita junto con la caseína sera removida al disolverla en alcohol. A
continuación, determinaremos la concentración de proteína aislada (caseína) en el precipitado de leche empleando técnicas de
cuantificación colorimétricas.
1.1. CARACTERÍSTICAS DE LA CASEÍNA
La leche contiene diferentes proteínas en su composición. Entre las más abundantes se encuentran la caseína, las
lactoalbúminas y las lactoglobulinas. Las tres son proteínas globulares que se pliegan sobre si mismas para formar unidades
compactas y casi esféricas que tiene mayor solubilidad en el agua que las proteínas fibrosas.
La caseína, la proteína más abundante en la leche es una fosfoproteína. Los grupos fosfatos se encuentran unidos
covalentemente a los grupos hidroxilos de las cadenas laterales de algunos aminoácidos. En la leche, la caseína se encuentra
formando una sal de calcio, el caseinato de calcio. La estructura de la caseína consiste de tres polipéptidos (caseína α, β y κ) que
difieren en su peso molecular y la cantidad de fosfatos unidos que poseen. Las caseínas α y β son insolubles en soluciones acuosas,
ya sea como proteínas únicas o como una mezcla de ambas. Sin embargo, ambas se solubilizan si es que además se les agrega la
caseína κ.
El caseinato de calcio puede ser separado desde la leche mediante acidificación hasta su punto isoeléctrico (pI=4.6). En
este punto, la proteína pierde solubilidad en el agua ya que tiende a agregarse por interacciones electroestáticas (Figura abajo). Por
otro lado, si una proteína tiene una carga neta positiva
(en condiciones ácidas) o una carga neta negativa (en
condiciones básicas), su solubilidad en el agua
incrementa.
Un ejemplo cotidiano de la precipitación de la caseína puede ser observada en la leche agria. Aquí, algunos
microorganismos como los Lacobacillus rompen la lactosa en sus componentes glucosa-galactosa y llevan a cabo un proceso de
fermentación, en el que se produce lactato, un ácido orgánico que baja el pH de la leche. Cuando ocurre esto, se forman grumos
que corresponden a la precipitación de la caseína.

1.1. CUANTIFICACION DE PROTEÍNAS

La cuantificación de la concentración de proteínas es una solución es de las mediciones más comunes en los laboratorios
de bioquímica. Una de las técnicas clásicas para estimar la concentración de proteínas consiste en medir la cantidad total de
nitrógeno proteico en una muestra sabiendo que este elemento representa en promedio, aproximadamente el 16% del peso de una
proteína. Sin embargo, este método es largo, tedioso y con poca sensibilidad.
Otros métodos, se basan en mediciones colorimétricas que incrementan la rapidez de la medición, asi como su
sensibilidad. Entre estos métodos destacan tres: Biuret, Lowry y Bradford.
1.2.1. Cuantificación por el método de Biuret.
En un medio alcalino, dos o más enlaces peptídicos reaccionan con iones de cobre (Cu + ) y forman un complejo azul-
púrpura. Los átomos de nitrógeno del enlace peptídico forman un enlace de coordinación con el ion metálico. La cantidad de
complejo formado es proporcional al número de enlaces peptídicos presentes. En la práctica, la determinación de la concentración
de proteína se logra a partir de una curva de calibración o estándar hecha con diferentes concentraciones conocidas de una proteína.
El complejo azul-púrpura que se forma de la reacción proteína-Cu+ es medido a una longitud de onda (lambda, λ) de 540nm.
La reacción de Biuret puede ser interrumpida por la presencia de algunos compuestos (ej. Buffer Tris, Buffer Glicina y
otros aminoácidos), sin embargo, son relativamente pocos comparado con otras técnicas de detección. Otra ventaja radica en su
rapidez e independencia del tipo de aminoácido presente en la proteína. Por otro lado, su deventaja está en su baja sensibilidad, ya
que requiere al menos de 1mg de proteína presente.

1.2.2 Cuantificación por el método de Lowry (Folin)

En esta técnica, también se forma un producto coloreado, pero se requiere de un segundo componente (reactivo Folin-
Ciocalteu) que intensifique el color formado. El color azul fuerte que se forma es generado por dos reacciones 1) Formación de un
enlace de coordinación entre los nitrógenos del enlace peptídico con el cobre y 2) reducción del reactivo de Folin mediante los
grupos Tyr de la proteína. Específicamente, la reacción con el grupo fenol de la Tyr genera ácido fosfomolíbdico y fosfotúngstico.
La medición de este producto se realiza a 750nm (para concentraciones <500μg/mL) o 550nm (para concentraciones entre 100 y
2000 μg/mL).

Elaborado por: Dr. Sergio Gutiérrez Cortez IBMB - UMSA

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Labs 3 y 4: Separación y cuantificación de proteínas

La cuantificación por Lowry, al igual que Biuret requiere de la construcción de una curva de calibración empleando
concentraciones conocidas de proteína (la más común es seroalbúmina bovina [BSA]). La ventaja de esta técnica radica en su alta
sensibilidad, siendo capaz de detectar hasta 1μg de proteína. Sin embargo, presenta desventajas ya que es un método que requiere
mucho tiempo, es extremadamente sensible a los tiempos de incubación y además se ve interrumpido por diferentes compuestos
(sulfato de amonio, glycina, mercaptos y otros) que pueden estar presentes en la solución de proteínas. Ya que depende de la
presencia de Tyr para la reacción, la intensidad del color formado también varia con el contenido de Tyr en diferentes proteínas. En
consecuencia, el método funciona mejor cuando se compara la concentración de la misma proteína con la que se realiza la
calibración.

1.2.3. Cuantificación por el método de Bradford

A pesar de ser relativamente reciente, es uno de los ensayos más empleados para medir la concentración de proteínas. El
método se basa en la capacidad que tiene del colorante Coomassie Brillant Blue para unirse a las proteínas en una solución ácida
(mediante fuerzas electroestáticas y de Van der Waals). Esta unión Coomassie-Proteína resulta en un corrimiento del máximo de
absorción del colorante, de 465 a 595nm.
La ventajas del método incluyen su rapidez y alta sensibilidad, siendo capaz de detectar 1-20μg de proteína. Muy pocos
compuestos interfieren con la reacción (funciona en presencia de urea o cloruro de guanidinio). Sin embargo, los detergentes sí
interrumpen su acción. Incluso trazas de detergentes (ej. productos de limpieza) pueden invalidar los resultados. Entre sus
desventajas están su dependencia en la composición de aminoácidos de la proteína y en que tiñe fuertemente las cubetas de
espectrofotometría.

2. OBJETIVOS
• Aplicar los fundamentos de separación en base a la solubilidad de las proteínas para aislar la caseína de la leche de vaca.
• Aplicar un método de cuantificación de proteínas para determinar la concentración de la caseína separada, empleando
ensayos colorimétricos.

3. MATERIALES
• Hornillas • Cubetas de espectrofotometría
• Vasos de precipitado 250mL y 500mL • Seroalbúmina de bovino (BSA) 1mg/mL
• Erlenmeyers 250mL • Gradillas para tubos de ensayo
• pHímetros calibrados • Papel pH
• Termómetros • Micropipeta 20-200μL y tips
• Acido acetico 10% • Parafilm
• Embudos Material que deben traer los estudiantes:
• Espátulas • Leche descremada fluida (cualquier marca) (1L para el
• Balanza • curso)
• Bidón de agua destilada • Papel filtro N°2
• Pisetas para agua destilada • Papel absorbente de cocina (1 para todo el curso)
• Reactivo Lowry • Pañuelos desechables suaves (Kleenex)
• Reactivo de Folin • Detergente de cocina (1 para todo el curso), esponja y
• Tubos de ensayo • cepillo
• Tubos Eppendorfs 2mL • Calculadora
• Espectrofotómetro • Toalla de manos y cocina
• Marcador indeleble de punta fina

4. PROCEDIMIENTO
Antes de comenzar, lave todo su de vidrio con agua y jabón. Enjuague abundantemente con agua de la llave y realice un enjuague
final con agua destilada. Deje secando sobre la toalla de cocina.
4.1 Separación de la caseína
Sesión 1: Lab 3 - miércoles 4 de abril
1. En un vaso de precipitado de 100 mL, agregue el equivalente a 50 g (50mL) de leche descremada y lleve a baño maría (200 mL
de agua de llave en un vaso de precipitado de 500 mL). Agite suavemente la leche.

Elaborado por: Dr. Sergio Gutiérrez Cortez IBMB - UMSA

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2. Con un termómetro controle que la temperatura alcance los 40°C en la leche. Inmediatamente retire el vaso del baño maría,
introduzca el electrodo del pHímetro a la leche, agite suavemente y agregue lentamente ácido acético al 10% hasta llegar a pH 4.6.
Enfríe la leche y observe la formación de un precipitado.
3. Sobre un vaso, coloque un filtro en un embudo y traspase toda la leche precipitada al filtro. Deje filtrar la muestra agitando
suavemente. Descarte el líquido (el filtrado) que cayó en el vaso.
4. Agregue un volumen (50mL) de agua destilada sobre el papel y deje filtrar nuevamente. Realice este paso 2 veces.
5. Deje secar el resto de caseína separada colocando el papel filtro sobre papel absorbente de cocina. Deje a temperatura ambiente
hasta secar completamente. Este material será empleado en la próxima sesión, asi que debe evitar que se pierda.

4.2 Determinación del peso seco y cuantificación de la proteína total

Antes de comenzar esta sesión, asegúrese de que ha leido y comprendido el anexo sobre micropipetas al final de esta guía.
Sesión 2: Lab 4 – miércoles 18 de abril
1. Determine el peso seco de la caseína. Para esto, coloque la proteína seca sobre un papel en la balanza y registre los gramos
presentes. A continuación calcule el % de caseína en la leche utilizando la siguiente fórmula.
% de Caseína = Peso del filtrado (g) x 100
50 g de leche
2. Encienda el espectrofotómetro, este debe estabilizarse al menos por 15 min. Coloque en modo absorbancia y ajuste la longitud
de onda a 550nm.
3. En un tubo Eppendorf coloque 500mg de caseína seca. Complete con agua destilada hasta lograr 1000µL de solución de caseína.
Determine el pH empleando papel pH. Agregue gotas de NaOH 0.1N hasta lograr que la solución llegue a un pH 10. Complete el
volumen del tubo a 2 mL con agua destilada.
4. Prepare sus tubos de acuerdo a la siguiente tabla:

Tubo Vol. H2O Vol. BSA Vol. Caseína Abs 550nm [Proteína]
(mL) 1mg/ml (mL) (mL) µg/mL
1 1.2 - -
2 1.15 0.05 -
3 1.1 0.1 -
4 1.0 0.2 -
5 0.8 0.4 -
6 0.5 0.7 -
7 0.3 0.9 -
8 - 1.2 -
9 0.4 - 0.8 -
10 0.8 - 0.4 -

5. Agregue 6mL del reactivo de Lowry al tubo 1, inmediatamente tape el tubo y agítelo vigorosamente por 5 segundos.
6. Repita el paso 5 para el resto de tubos.
7. Incube los tubos 10 min a temperatura ambiente.
8. Agrege 0.3 mL de reactivo de Folin recién preparado al tubo 1, tape (con un parafilm cortado) y agite vigorosamente por 5
segundos.
9. Incube el tubo 30min (no exceda los 60min de incubación o sus resultados estarán alterados).
10. Repita los pasos 8 y 9 para el resto de tubos
11. Traspase 1.5mL del tubo 1 a una cubeta de espectrofotometría y lleve a cero (blanquear) el valor de absorbancia a 550nm.
12. Traspase 1.5mL del tubo 2 a una cubeta de espectrofotometría y realice la lectura de la absorbancia.
13. Repita el paso 12 para el resto de los tubos.
14. Grafique la absorbancia vs. la concentración de proteína (μg/mL) para los tubos 1 al 8. Ojo, utilice el blanco para restar el
background de abosrbancia de todas las muestras. Determine la ecuación del gráfico y el valor de R2
15. En base a la ecuación del gráfico determine la concentración de la caseína en los tubos 9 y 10.

Elaborado por: Dr. Sergio Gutiérrez Cortez IBMB - UMSA

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Labs 3 y 4: Separación y cuantificación de proteínas

5. CUESTIONARIO
1. La hormona peptídica estimulante de los melanocitos, α-melanotropina, tiene la siguiente secuencia: Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-
Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val. Calcule la carga de la melanotropina a pH 1, 5 y 11. (Utilice los pKa de las tablas provistas en
clase) y su pI.
2. Usted planea utilizar cromatografía de intecambio ionico para separar el péptido con la siguiente secuencia:
GLEKSLVRLGDVQPSLGKESRAKKFQRQ (revisar código de una sola letra). Si usted tiene su péptido a pH 7, sería más
conveniente utilizar una columna con relleno DEAE o CM?
3. Otra forma de determinar la concentración de proteína en una solución consiste en aprovechar la Absorbancia a 280 nm.
Investigue cómo funciona este método y responda a la siguiente pregunta. El coeficiente de
extinción molar de acetilcolinoesterasa es de 5.7x105.. Si el valor de absorbancia colocando la
proteína en una cubeta de espectrofotometría de 1cm de paso de luz es de 0.22 a 280nm, ¿Cual
es la concentración molar de la proteína? (Pista: repase la ley de Lambert-Beer)
4. Si usted combina 10 µL de BSA (200 µg/mL) con 990 µL de agua, ¿cuál es el factor de
dilución (cuantas veces más diluido que el original) aplicado? ¿Cuál será la nueva
concentración de BSA?
5. Usted tiene 200 µL de una solución de pancreatina 100 µg/mL. Para su experimento necesita
prepara 40 µL de una solución de pancreatina 8.5 µg/mL. Calcule el volumen de agua que
necesita para llegar a esta última concentración utilizando la solución de 100 µg/mL.
6. Utilice los siguientes datos de la tabla de la derecha para producir una curva de calibración y
responda las siguientes preguntas: a) ¿Qué ocurre con la forma de la curva a los 20 µg de
proteína? b) Sugiera razones por las que ocurre este cambio en la forma de la curva. ¿Qué
podría haber causado esto en un experimento real? c) ¿Sería conveniente utilizar esta curva para
su experimento? ¿Por qué?
7. Calcule la concentración de proteína que queda en la última columna de la tabla de la sección 4.2.
8. Repase los cálculos para la preparación de soluciones.

ANEXO.
Manejo de microvolúmenes: Uso de micropipetas

Introducción:
El manejo de volúmenes menores a un mililitro (1 mL) es una práctica usual en los laboratorios de Bioquímica. Aún cuando las
pipetas convencionales pueden utilizarse para medir estos volúmenes, el procedimiento resulta engorroso y poco reproducible. Por
este motivo, el uso micropipetas mecanizadas es uno de los procedimientos mas básicos en los laboratorios de Bioquímica. Esta
guía describe los aspectos básicos de la operación de micropipetas.

Micropipetas:
Las pipetas convencionales son tubos delgados de vidrio o plástico y son utilizadas para medir y transferir un volumen determinado
de uno a otro contenedor. Las micropipetas son instrumentos mecánicos utilizados para medir con precisión y repetidamente
volúmenes menores a 1 mililitro (mL = 1000 µL). Existen dos tipos de micropipetas: las de volumen fijo y las ajustables. Las de
volumen fijo, como indica su nombre, vienen preconfiguradas de fábrica para tomar un volumen determinado de muestra líquida.
En cambio, las de volumen ajustable pueden ser configuradas para tomar una amplia gama de volúmenes como por ejemplo, en un
rango de 1-100 µL o de 100-1000 µL. Es por esta flexibilidad en los volúmenes que se pueden medir con este instrumento, que los
laboratorios de bioquímica utilizan las de volumen ajustable. La capacidad de medir y transferir pequeños volúmenes es
fundamental para obtener resultados confiables en el laboratorio.

Las puntas o “tips” son los accesorios plásticos desechables, esenciales para el uso de las micropipetas. NUNCA DEBE
UTILIZAR UNA MICROPIPETA SIN UN TIP. El tip debe ser colocado en el extremo de la micropipeta y ES ÚNICAMENTE EL
TIP EL QUE SE SUMERGE EN EL LÍQUIDO A TRANSFERIR. Para evitar una contaminación cruzada de los líquidos, el tip
debe ser cambiado en cada uso. Si hay duda sobre si el tip es nuevo o no, es mejor cambiarlo. Existe un código de colores estándar
para determinar cuál tip utilizar dependiendo de la capacidad de volumen de la micropipeta y del volumen que necesita medir. Para
volúmenes entre 200-1000 µL, los tips son de color azul. Volúmenes de 5-200 µL utilizan tips de color amarillo. En cambio, los
tips para volúmenes de 0.5-10 µL son transparentes.

Elaborado por: Dr. Sergio Gutiérrez Cortez IBMB - UMSA

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Utilización de micropipetas:
Recuerde: Las micropipetas son instrumentos de laboratorio que tienen un alto costo económico. Cada una de ellas oscila entre
los 200-400 $USD. Por favor trabaje con mucho cuidado haciendo caso a las siguientes
recomendaciones.
1. Al tomar la micropipeta, hágalo con cuidado. Una manipulación brusca puede
generar la descalibración de la micropipeta y por lo tanto compromete su precisión.
Dejar caer las micropipetas les genera un daño irreparable.
2. Jamás fuerce la perilla de ajuste de volúmenes, puede generar un daño
irreparable. Si la perilla muestra resistencia a moverse, probablemente ha
alcanzado el límite de ajuste.
3. Nunca utilice una micropipeta fuera del rango que tiene especificado.
4. Para obtener la mayor precisión de volumen posible, utilice la pipeta de menor
rango posible que pueda tomar el volumen que desea transferir. La precisión se
reduce cuando se utilizan pipetas de un rango superior para volúmenes pequeños.

Instrucciones de uso:
1. Seleccionar la micropipeta más adecuada de acuerdo al volumen
que se desea transferir.
2. De acuerdo al rango de la micropipeta seleccione el tip que
corresponda. Para colocar el tip, empuje firmemente la micropipeta
hacia la caja de tips. Nunca toque el tip con los dedos, puede
contaminar la muestra.
3. Ajuste el volumen a tomar girando la perilla de la micropipeta
hasta alcanzar el valor deseado (Figura derecha).
4. Como muestra la figura de la derecha, antes de sumergir el tip en
la solución, presione la perilla hasta el primer tope.
5. Sumergir el tip aproximadamente 3 mm en la solución a
transferir.
6. LENTAMENTE libere la perilla para que retorne a la posición
inicial. Evite liberar la perilla rápidamente, ya que esto genera
burbujas y estropea la precisión del volumen tomado.
7. Retirar el tip de la solución.
8. Coloque el tip en una de las paredes del contenedor donde se colocará la solución a ser transferida.
9. Presione, LENTAMENTE, la perilla hasta el primer tope, haga una pausa, y siga presionando hasta el siguiente tope.
10. Retire el tip del contenedor y LENTAMENTE retorne la perilla a la posición inicial. No deje que la perilla retorne bruscamente.
11. Retire el tip presionando firmemente el botón eyector.
12. Coloque un nuevo tip y repita el procedimiento.

Observe el vídeo de la siguiente dirección para una referencia más visual de la utilización de micropipetas:
https://www.youtube.com/watch?v=PORQPn0bOoE

Elaborado por: Dr. Sergio Gutiérrez Cortez IBMB - UMSA