Manual de Laboratorio de Biotecnología Modificado

Manual de Laboratorio de Biotecnología. Facultad de Química Farmacéutica. UdeA.
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA
FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
SEMESTRE 2011-I 1
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Este manual es una versión corta y modificada de la versión original. Aclaración: la modificación es realizada
con fines docentes, que no pretende violar los derechos del(os) autor(es).
TABLA DE CONTENIDO
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PRÁCTICA N°1: EXTRACCIÓN DE ADN VEGETAL 3
PRÁCTICA N°2: ELECTROFORESIS DE ADN Y PROTEÍNAS 6
PRÁCTICA N°3: CULTIVO DE CÉLULAS Y TEJIDOS VEGETALES 9
PRÁCTICA N°4: FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA CON LEVADURAS 14
PRÁCTICA N°5: OBTENCIÓN DE PENICILINA Y COMPROBACIÓN DE SU
ACCIÓN ANTIBIÓTICA 22
PRÁCTICA N°6: OBTENCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO CON HONGOS 30
PRÁCTICA N°7: DEGRADACIÓN DE COLORANTES CON HONGOS
LIGNINOLÍTICOS 33
PRÁCTICA N°8: CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO Y OBTENCIÓN
DE PROTEASAS 40
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PRÁCTICA N°1: EXTRACCIÓN DE ADN VEGETAL
INTRODUCCIÓN
La extracción de ADN tiene como objetivo principal obtener la mayor cantidad posible del ADN
de alto peso molecular, libre de proteínas, carbohidratos y otros inhibidores de enzimas.
Diferentes métodos de extracción han sido descritos para el aislamiento de ácidos nucleicos,
aquí se trabajara específicamente con la extracción de AND vegetal, la presencia de algunos
metabolitos secundarios y como interfieren estos en el aislamiento del ADN.
En plantas y hongos la pared celular es la primera barreras para la extracción, es necesario

degradarla empleando métodos físicos o químicos. Los métodos físicos son los más empleados,
especialmente la congelación y la maceración. Para bacterias y células desprovistas de pared,
se emplean soluciones ricas en detergentes o enzimas, para destruir las membranas celulares.
Una vez se ha destruido la membrana celular debe emplearse detergentes y soluciones de alta
(o baja) fuerza iónica para permitir que el ADN se libere en el buffer.
La inhibición de nucleasas es un factor crítico, esta se alcanza empleando buffer 1 con pHs poco
óptimos para acción de estas enzimas y adicionando agentes quelantes de iones como el EDTA
(Etilen diamin tetra acetato).
Posteriormente se utilizan sustancias que desnaturalicen y separen las proteínas del ADN como
fenol y cloroformo. Finalmente en ADN es precipitado con alcohol y centrifugación. El ADN libre
de proteínas y otros compuestos celulares se disuelve en un buffer2 .
Algunos tejidos pueden poseer altas concentraciones de polisacáridos, para separarlos de los
ácidos nucleicos se puede emplear mayor cantidad de buffer extracción o sustancias como
CTAB (cetil trimetilamonio) que colabora en la precipitación del ADN.
El pH durante el proceso de extracción debe ser óptimo, que evite la acción de enzimas
degradativas del ácido nucleico. La mayoría de los procedimientos de extracción de ADN
emplean soluciones buffers con pH 7.0-9.0.
Para cuantificación del ADN se hace uso de la espectrofotometría (absorbancia a una longitud
de onda de 260nm), o la observación directa con fluorescencia después de teñir el gel de
extracción con bromuro de etidio.(método de saram wrap, método del plato de agarosa, método
del mini-gel) o por fluorometría.
OBJETIVO GENERAL
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Comprender los procedimientos necesarios para extraer ADN de buena calidad y alta pureza.
EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS
Material del que se extrae el DNA (se recomienda utilizar material fresco previamente
congelado), bisturí, mortero, balanza analítica, tubos de ensayo con tapa, centrífuga refrigerada,
baño agua (60 °C), micropipetas y puntas, viales de 2 mL, espectrofotómetro.
Buffer 1
 50 mM Tris-HCl (pH8.0)
 5 mM EDTA
 350 mM Sorbitol
 0.1% Mercaptoetanol
 10% Polyetilienglicol
Buffer 2
 50 mM Tris- HCl (pH 8.0)

 5 mM EDTA
 350 mM Sorbitol
 0.1% Mercaptoetanol
 1% Sodio Sarkosyl
 710 mM NaCl
 0.1% Cetiltrimetilamonio (CTAB)
Otros reactivos
Cloroformo, alcohol isoamílico, iIsopropanol, etanol 70%.
PROCEDIMIENTO:
 Macerar con ayuda de un mortero una pequeña cantidad del material vegetal.
 Pesar 70mg del tejido vegetal en un vial de 2 mL.
 Agregar 1mL de buffer1 por cada 70mg de la muestra.
 Agitar por inversión.
 Centrifugar a 5000 rpm /10min en frió a 4°C
 Descartar sobrenadante
 Resuspender sólido agregando 500L del buffer2 por cada 70mg de la muestra.
 Incubar a 60 °C por 15 minutos.
 Adicionar un volumen de cloroformo: alcohol isoamílico en una proporción 24:1
 Centrifugar a 5000rpm/10min en frío a 4°C
 Transferir la fase acuosa a otro vial
 Agregar 2 volúmenes de isopropanol frió -20 °C (para precipitar el ADN)
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 Centrifugar y eliminar el isopropanol.

 Lavar con etanol 70%
 Centrifugar y eliminar el etanol adicionar nuevamente etanol y dejarlo overnight -20 °C.
 Resuspender el precipitado en 300l de Tris-Edta, agitar suavemente por inversión.
 Leer en el espectrofotómetro a 260nm. (50g/ml ADN absorbancia de 1) y a 280 nm.
Nota: Para saber que tan puro es el ADN obtenido realizamos la siguiente relación
ADN/Proteína =260nm/280nm
Un valor menor de 1.8 indica contaminación por proteínas.
GLOSARIO
ADN: Ácido desoxirribonucleico (ADN), material genético de todos los organismos celulares y
casi todos los virus. El ADN lleva la información necesaria para dirigir la síntesis de proteínas y
la replicación.
Tris: (hidroximetil amino metano) Es un tampón biológico. Su principal función es mantener el

pH de la solución estable (7.0 8.0).
EDTA: (etilén diamino tetra acético) Es un agente quelante. Se encarga de remover iones de
magnesio que son esenciales para preservar l estructura de la envoltura celular.
Cloroformo: Solvente orgánico que se encarga de remover residuos de lípidos y fenoles en la

muestra. Colabora en la desnaturalización de proteínas.
CTAB: cetil trimetil bromuro de amonio, detergente catiónico que solubiliza las membranas
celulares, dependiendo de la concentración de cloruro de sodio en la solución, permite la
remoción de polisacáridos y otras macromoléculas. El CTAB forma un complejo con el ADN y
por lo tanto puede ser empleado para precipitar ADN selectivamente.
Cloruro de sodio: colabora para equilibrar las fuerzas iónicas.
Mercaptoetanol: antioxidante. Forma enlaces disulfuro, forma disulfuros mixtos con las cadenas
laterales de las proteínas. Evita color pardo en ADN extraído.
Alcohol Isoamílico: antioxidante. Reduce o imposibilita la formación de interfases durante la

extracción de ADN.
Etanol, Isopropanol: alcoholes. En presencia de sales (temperatura de aproximadamente –20

°C) precipita ADN, reduciendo la constante dieléctrica del solvente.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
5
Perea Arango Irene, Pineda Tuirán Rosana, Arango Isaza Rafael, MANUAL DE TÉCNICAS DE
Página
BIOLOGÍA MOLECULAR. 2002. U de A pág. 11-16

Plant Tissue Culture and Biotechnology. June 1998. Vol 4 N° 2 pág. 76 -79
Sambrook, J., Fritsch, EF., Maniatis, T. 1989 Molecular Cloning: A laboratory Manual. 2nd Ed. Cold
Spring harbor Laboratory Press. New York, USA.
PRÁCTICA N°2: ELECTROFORESIS DE DNA Y DE PROTEÍNAS
INTRODUCCIÓN:
Electroforesis es la migración de las moléculas cargadas presentes en una solución acuosa como
respuesta a la presencia de un campo eléctrico, dichas moléculas son atraídas hacia el polo opuesto
a su carga neta. Dos fuerzas de acción opuesta determinan la velocidad de la partícula en cuestión.
Por un lado, la fuerza eléctrica, que la atrae al electrodo, cuya intensidad es directamente
proporcional a la carga, y, de acuerdo a la segunda ley de Newton (F=m x a, entonces a=F/m), le
impone una aceleración directamente proporcional al cociente carga/masa (q/m). Por otro lado, la
fuerza de rozamiento, que se opone a la migración con una intensidad que depende del tamaño y la
forma de la partícula y de las características del medio (viscosidad y estructura, por ejemplo).
La electroforesis se utiliza en el laboratorio para separar macromoléculas en solución, en forma

analítica (es decir, sólo para verlas) o preparativa (para purificarlas). Los ácidos nucleicos tienen un
fosfato cargado negativamente por nucleótido. Como el peso molecular de los cuatro nucleótidos es
similar, la relación q/m es independiente de la secuencia y el tamaño de la molécula. Por lo tanto la
aceleración impuesta por la fuerza eléctrica es igual para cualquier molécula de ácido nucleico. La
única diferencia en velocidad de migración estará dada por diferencias en la fuerza de rozamiento, o
sea de su forma y de su tamaño. En el caso del DNA doble cadena, la forma es la misma para
cualquier molécula, entonces las distintas moléculas tendrán una velocidad que sólo dependerá de
su tamaño, es decir, de su longitud en pares de bases. Sin embargo, si tratáramos de separar
moléculas de DNA doble cadena en una electroforesis en una solución acuosa, nos encontraríamos
con que el rozamiento impuesto por ésta es tan pequeño que todas las moléculas migrarían juntas.
Además, durante la electroforesis, las moléculas se separarían unas de otras por difusión,
impidiendo el análisis. Para lograr una separación eficiente, se utiliza un medio soporte que aumente
considerablemente la fricción recibida por las macromoléculas y reduzca la difusión a un mínimo.
Este medio suele ser una red molecular de algún polímero orgánico, conocida como gel, por su
consistencia gelatinosa. Los más utilizados en laboratorios de biología molecular son de
poliacrilamida, una red molecular estabilizada por uniones covalentes, y agarosa (un derivado del
agar-agar), un polisacárido extraído de un alga que forma, al disolverlo, una red estabilizada por
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interacciones no covalentes. Las mezclas de DNAs de distinto tamaño se hacen migrar

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(desplazarse) a través del gel durante un cierto tiempo y se obtiene una separación en la que la
distancia migrada por una molécula dada es inversamente proporcional al logaritmo de su peso
molecular (o de su longitud en pares de bases). El tamaño de una muestra desconocida puede
estimarse corriendo en paralelo muestras de longitud conocida.
Cuando se hace un análisis electroforético de muestras de ácidos nucleicos que no poseen todos la
misma forma, debido, por ejemplo, a la presencia de estructuras secundarias que dependen del
apareamiento interno, o sea, de la secuencia (RNA o DNA simple cadena), es necesario, para
determinar su peso molecular, homogeneizar su estructura. Para ello se utilizan agentes
desnaturalizantes fuertes que destruyan la estructura secundaria, por ejemplo urea, formamida,
formaldehído o pH básico (para DNA).
En el caso de las proteínas el problema es más complejo porque no sólo distintas moléculas de igual
tamaño (peso molecular) tienen formas distintas sino que además la carga (y con ella el q/m) varía
mucho de una a otra, además, como son compuestos anfotéricos, su carga neta está determinada
por el pH del medio en que se encuentren, en una solución con un pH superior a su punto
isoeléctrico estarán cargadas negativamente y en un campo eléctrico migrarán hacia el ánodo(+)
pero si el pH del medio es inferior a su punto isoeléctrico, migrarán hacia el cátodo(-). Para igualar la
relación q/m y la forma de todas ellas se utiliza un detergente cargado negativamente, el dodecil
sulfato de sodio (SDS), que las desnaturaliza y las recubre en cantidad proporcional al tamaño,
proveyéndoles un gran número de cargas que hacen que las propias sean despreciables y que el
q/m de todas las moléculas se equipare. El SDS envuelve al polipéptido en una relación de masas
1,4:1 y el polipéptido queda cargado negativamente con una carga proporcional a su longitud.
Usualmente es necesario reducir los puentes de disulfuro de las proteínas para permitir la unión
cuantitativa del SDS, esta reducción se lleva a cabo en caliente con 2-mercaptoetanol. Sólo en estas
condiciones es posible determinar el tamaño de un polipéptido en un gel, en el que tendrá una
migración inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular.
OBJETIVO GENERAL:
Preparar, realizar una electroforesis de DNA en gel de agarosa interpretar los resultados y
correlacionarlos con los resultados obtenidos en la práctica de extracción de ADN vegetal.
PROCEDIMIENTO:
Electroforesis de DNA en gel de agarosa:
Buffer Tris-borato (TBE) pH 8.0 sln 5x: Preparación: Disolver 54g de Tris base, 27,5g de ácido
bórico, 20mL de una solución de EDTA 0.5M ajustar pH y ajustar volumen a 1L, guardar en frasco
ámbar bajo refrigeración.
Preparación del molde para preparar un gel horizontal: Sobre una placa de vidrio limpia
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desengrasada de tamaño adecuado haga un marco con cinta de enmascarar para que quede con
una profundidad de mínimo 7mm teniendo la precaución de que quede bien sellado.
Preparación del gel de agarosa: Preparar una solución de agarosa al 0.8% en buffer TBE. Agregar la
cantidad adecuada de agarosa en polvo al volumen de buffer TBE medido, calentar hasta que la
agarosa se disuelva (quede translúcida la solución). Verter la solución en caliente sobre el molde
previamente preparado y colocar la peineta sin traspasar el gel; es decir, teniendo la precaución que
los dientes que formarán los pozuelos queden a una distancia de 0,5-1 mm por encima de la base
del gel para que los pozuelos queden completamente sellados.
Después de que el gel se enfríe y solidifique, retire cuidadosamente la peineta y la cinta de

enmascarar con la que hizo el molde del gel y coloque el gel en el tanque de electroforesis.
Agregue suficiente buffer TBE para cubrir el gel 1mm por encima de su parte superior del gel.
Mezcle las muestras de DNA que están suspendidas en TE con buffer de carga (una solución de
sacarosa al 40% con azul de bromofenol al 0.25% preparado en agua) en una proporción 1:1.
Coloque lentamente las muestras mezcladas con el buffer de carga en los posuelos dentro del gel de
agarosa con la ayuda de una micropipeta con un volumen máximo de 15 μL por pozo.
Complete el montaje teniendo la precaución de que el polo positivo este al lado opuesto del sitio de
siembra, aplique la corriente eléctrica (3-5V/cm) hasta que el color haya migrado casi hasta el final
del gel (unos 10cm), suspenda la corriente eléctrica, retire el gel y sumérjalo 45 minutos en una
solución con bromuro de etidio (en buffer o agua) con una concentración de 0,5 g/mL.
Tenga la precaución de usar guantes cuando manipule el gel o las soluciones ya que el bromuro de
etidio es un poderoso mutagénico.
Coloque luego el gel sobre un transiluminador ultravioleta (UV) y observe las bandas de DNA
protegiendo los ojos de la radiación UV.
NOTA: aunque en esta práctica no se realiza electroforesis de proteínas, es fundamental para una
mejor comprensión de los principios de la técnica de electroforesis, entender los fundamentos de la
electroforesis de proteínas y su aplicación.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
Maniatis, T, Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Seventh

impression. Cold Spring Harbor Laboratory. pp. 150-185. United States of America, 1982. ISBN: 0-
87969-136-0
Perea, I., Pineda, R., Arango, R. Manual de Técnicas de Biología Molecular. Posgrado en
Biotecnología. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. 2002
8
Página
Corzo, J. Curso de doctorado “Electroforesis”. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular,

Universidad de la Laguna. España, 2004. Tomado de:
http://webpages.ull.es/users/fcorzo/electroforesis/listado.htm
Electroforesis en Geles de Poliacrilamida. Métodos en Biología Celular. Universidad de Barcelona.

2004. Tomado de: http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/page.htm
López, C. Electroforesis de proteinas del suero humano en gel de poliacrilamida bajo condiciones
desnaturalizantes (SDS-PAGE). Universidad de Antioquia, departamento de Química, Laboratorio de
Cromatografía CNQ-533. 2004. Tomado de:
http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez/cnq533/cnq533g.html
Electroforesis de DNA plasmídico en gel de agarosa. 2004. Tomado de:

http://orbita.starmedia.com/~animalia/cosas/3electroforesis.htm
Electroforesis de ácidos nucleicos en gel. Diagramas animados de técnicas y procesos bioquímicos.

Complementos de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Alcalá. España. 2004. Tomado
de: http://www2.uah.es/biomodel/biomodel-misc/anim/elfo/electrof_txt.htm
Electroforesis en geles de agarosa. Introducción a la Biología Molecular y Celular. Departamento de

Fisiología, Biología Molecular y Celular, Universidad de Buenos Aires. Argentina. 2004. Tomado de:
http://therion.dna.uba.ar/ibmc/Agarosa.htm
PRÁCTICA N°3: CULTIVO DE CÉLULAS Y TEJIDOS VEGETALES
INTRODUCCIÓN
El cultivo de tejidos se refiere al cultivo de células, tejidos u órganos de plantas en un medio que le
aporte los nutrientes necesarios para su desarrollo. Se parte de la premisa: "toda célula viviente de
un organismo multicelular es capaz de desarrollarse si se le dan las condiciones externas
apropiadas. La célula tiene la habilidad de desarrollarse, regenerando un organismo entero" (Dodds
& Roberts, 1982). La nueva planta será genéticamente idéntica a la planta madre, el desarrollo de
ésta se da en un periodo corto. Al cultivo de tejidos vegetales también se le conoce como cultivo in
vitro, cultivo “aséptico”, micropropagación o propagación vegetal in vitro.
La técnica consiste en tomar una sección de tejido vegetal (explante) y desinfectarlo

superficialmente por inmersión total en una solución de hipoclorito de calcio o sodio y en alcohol
etílico u otros desinfectantes (químicos). Posteriormente el tejido es lavado con agua estéril y éste es
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sembrado en condiciones asépticas dentro de un recipiente de vidrio que contiene un medio nutritivo
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que puede ser líquido o semisólido. Para poder obtener plántulas a partir del tejido, se utiliza un
medio nutritivo, que es una especie de gelatina que contiene los nutrientes: vitaminas,
macronutrientes, micronutrientes, Fe- EDTA y azúcares, complementando con las fitohormonas o
reguladores (auxinas y citoquininas) necesarios para dirigir la formación de las plántulas. La siembra
se realiza dentro de una cámara de flujo laminar, que asegura un ambiente aséptico y
posteriormente se traslada a una cámara de incubación donde proliferan las células.
En el tratamiento de la célula, tejido u órgano que se desarrolla mediante esta técnica, se controlan
aspectos como temperatura y fotoperiodo, con el objetivo de crear las condiciones ideales para un
rápido desarrollo. Básicamente se deben considerar dos grandes grupos de factores que afectan el
correcto desarrollo de la experimentación, que son: la concentración hormonal y el medio de cultivo,
considerando siempre que ambas variables son exclusivas para la especie con que se trabaja.
Concentración hormonal: una fitohormona es un mensajero químico vegetal secretado en un

determinado tejido y actúan en el mismo tejido, o en otro distinto de la planta, considerándoselas
biocatalizadores junto con enzimas y vitaminas. Las hormonas vegetales pertenecen a cinco grupos
cada uno de los cuales exhibe propiedades fuertes de regulación del crecimiento en plantas, posee
su propia estructura y pueden ser activos a muy bajas concentraciones dentro de la planta, estos
grupos son: Auxinas, Citoquininas, Giberelinas, Acido Abscísico y Etileno.
Reglas generales para la acción hormonal en micropropagación:
Mayor concentración auxina / menor concentración citoquinina = raíz adventicia
Concentración auxina = concentración citoquinina = callo
Menor concentración auxina / mayor concentración citoquinina = tallo adventicio
Medio de cultivo: Todos los medios de cultivo contienen carbohidratos como fuente de carbono y
energía (generalmente sacarosa), sumado a minerales y agar (si se trata de un medio semisólido) o
agua (si se trata de un medio líquido), otros contienen vitaminas, aminoácidos y reguladores de
crecimiento, además en algunos casos se agregan suplementos orgánicos complejos (como leche
de coco o extracto de levadura) Además se debe considerar el ambiente al que estará expuesto el
explante, en el que consideran variables como temperatura, humedad, pH y luz, entre otras.
A modo de ejemplo, se puede mencionar que uno de los medios básicos más usados es el MS
(Murashige–Skoog) para plantas herbáceas.
OBJETIVO GENERAL:
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Esta práctica pretende que el estudiante aprenda el manejo de técnicas básicas del cultivo de tejidos
vegetales.
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OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Inducir callo o crecimiento de una parte determinada de la planta a partir de un tejido vegetal
utilizando el medio Murashige-Skoog suplementado con fitohormonas.
Conocer la utilidad y el manejo del equipo básico, instrumentos y herramientas de un laboratorio de

cultivo de tejidos vegetales.
REACTIVOS Y MATERIALES A EMPLEAR:
Ácido 2,4-Diclorofenoxiacético (2,4-D), 6-Benzilaminopurina (BA), Hipoclorito de Sodio, Alcohol

industrial, etanol, agar, sacarosa, medios de cultivo, bisturí, pinzas, mecheros, frascos, placas,
Vidrios, gasa, algodón, papel de aluminio, papel craft, vinilpel, cinta de enmascarar, probetas,
erlenmeyer, pipetas, balanza, pH-metro, agitador magnético, cámara de flujo laminar, guantes,
tapabocas, gorro, material vegetal (fríjol verde, zanahoria, remolacha)
COMPOSICIÓN Y PREPARACIÓN DEL MEDIO MURASHIGE Y SKOOG
Constituyente Concentración de la Volumen de la

solución madre (g/L) solución madre por
litro de medio
Macros
NH4NO3 16,5
KNO3 19 100 ml
CaCl2.2H2O 4,4
MgSO4.7H2O 3,7
KH2PO4 1,7
Micros
MnSO4.H2O 1,69
ZnSO4.7H2O 0,86
H3BO3 0,62 10 ml
KI 0.083
Na2MoO4.2H20 0.025
CuSO4.5H2O 10 ml de sol. 25 mg/100ml
CoCl2.6H2O 10 ml de sol. 25 mg/100ml
Fuente de hierro
FeSO4.7H2O 0.00556 10 ml
Na2EDTA.2H2O 0.00746
Vitaminas
Inositol 10
Nicotínico 0,05 10 ml
HCl-Piridoxina 0,05
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Glicina 0,2
HCl-Tiamina 0,01
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Adicionar al medio 3% de sacarosa y 0.7% de agar para los controles, en el caso de los medios de
cultivo que contienen fitohormonas debe tenerse en cuenta que estas deben adicionarse al final y su
concentración no debe superar las 2 ppm.
PROCEDIMIENTO
1. Preparación del medio de cultivo

Para esta práctica se debe preparar los siguientes medios:
Inducción de callos: preparar 60 ml de MS sin fitohormonas como medio control y 60 ml de MS con

2,4-D (1 ppm) y BA (1ppm).
Crecimiento: preparar 60 ml de MS sin fitohormonas como medio control y 60 ml de MS con 2,4-D (2

ppm) y BA (1ppm).
En un erlenmeyer, según los grupos de trabajo, añadir los macros, micros, vitaminas, Fe-
EDTA, las fitohormonas y luego la sacarosa.
Llevar el volumen hasta con agua destilada.
Ajustar pH entre 5.7-5.8
Completar el volumen calculado.
Servir el medio en frascos de compota adicionando aproximadamente 20 ml

de medio en cada frasco.
Adicionar el agar necesario para cada 20 mL.
Tapar los frascos con papel de aluminio y envolverlos en papel craft.
Esterilizar los medios de cultivo a una presión de 15 psi y a una temperatura

de 121 ºC durante 15 minutos.
2. Proceso de desinfección del material vegetal

Antes de iniciar el proceso de desinfección, se debe retirar cualquier porción de suelo, porciones
muertas, etc, que aun pudiesen quedar, en las plantas o porciones de plantas con las que se trabaje.
Lavar muy bien la planta con agua y jabón yodado, luego se pela para eliminar la capa exterior como
en el caso de la zanahoria. Después de estos pasos, se inicia la desinfección la cual se debe realizar
12
en la cabina de flujo laminar:

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Luego se realiza la desinfección durante 15 minutos en 50 ml hipoclorito de sodio al 2% conteniendo

algunas gotas de Tween 80.
Hacer 3 lavados con agua estéril de 5 minutos cada uno.
Después se puede comenzar a trocear el material vegetal en placas de vidrio estériles, en

condiciones estériles (cámara de flujo laminar), utilizando instrumentos estériles (bañados en alcohol
al 96% y después flameados).
Realizar la siembra en los medios de cultivo.
Tapar los frascos con vinilpel.
Los cultivos para inducción de callo se deben envolver en papel de aluminio.
Llevar los cultivos a la zona de cultivo de tejidos vegetales.
SEGUIMIENTO A REALIZAR EN LA PRÁCTICA
1. Revisar los cultivos de tejidos vegetales una vez por semana y anotar los
avances que estos presenten, como por ejemplo en que semana se inició la inducción de callos.
2. Cada mes, pasar los tejidos vegetales a medios de cultivos nuevos.
GLOSARIO
Auxinas: Grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas), que producen elongación celular, y
en algunos casos división celular; frecuentemente inducen la aparición de raíces adventicias e
inhiben el desarrollo de yemas adventicias (en los vástagos). Ejemplo el ácido 2,4-
diclorofenoxiacético (2,4-D).
Citoquininas: Grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas), que inducen la división celular y
frecuentemente la formación yemas adventicias (en los vástagos). En la mayor parte de los casos
inhiben el desarrollo de raíces adventicias. Las citoquininas disminuyen la dominancia apical.
Ejemplo: 6-benzilaminopurina (BA).
Callo: Tejidos no organizados, formados por células diferenciadas y no diferenciadas, que se dividen
de forma activa y que generalmente se originan en zonas dañadas (por heridas), o en cultivo de
tejidos.
Cámara de flujo laminar: Cámara para inoculación, que se mantiene estéril por medio de un flujo no
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turbulento y continuo de aire estéril.

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BIBLIOGRAFIA
R.L.M. PIERIK. Cultivo in Vitro de las plantas superiores. Ediciones Mundi-Prensa, Madrid. 1990.
Montoya Henao, Luz Marina. Cultivo de tejidos vegetales. Universidad Nacional de Colombia,
Seccional Medellín. Facultad de ciencias agropecuarias. Departamento de agronomía. Medellín,
1991.
farmacia.udea.edu.co/~fsegura/tejidos.zip
PRÁCTICA N°4: FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA CON LEVADURAS
INTRODUCCIÓN
La Fermentación alcohólica de define como el proceso bioquímico por el cual las levaduras
transforman los azúcares del mosto en Etanol y CO2. Para que la fermentación se realice de manera
eficiente, el mosto ha de hallarse en condiciones anaerobias. En condiciones aerobias las levaduras
se multiplican abundantemente con un rendimiento en biomasa muy alto ya que se consiguen 1g de
levadura por cada 4g de azúcar consumidos los productos obtenidos son muy poco etanol, agua y
CO2.
En condiciones anaerobias las levaduras realizan la fermentación; es decir degradan los azúcares
de forma incompleta generando Etanol, CO2 y energía.
En estas condiciones el rendimiento en biomasa es de tan solo 1g de levadura por cada 100g de
azúcares consumidos.
Tanto levaduras como bacterias han sido utilizadas para la producción de etanol. Saccharomyces
cerevisiae es la levadura más comúnmente utilizada. El Etanol es inhibitorio a altas concentraciones
y la tolerancia al alcohol de las levaduras es crítica para obtener rendimientos altos.
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
Existen factores tanto físicos como químicos que inciden positiva o negativamente en el transcurso
de la fermentación alcohólica, ya sea actuando sobre el desarrollo de las levaduras o incidiendo
directamente sobre la propia fermentación. Los más relevantes son los siguientes:
TEMPERATURA: A mayor temperatura la fermentación transcurre mas rápidamente, sin embargo es

menos pura, es decir, se produce menos etanol y mas cantidad de compuestos secundarios.
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Las levaduras a 30°C tienen su temperatura óptima de desarrollo. Por encima de 35°C la actividad
disminuye rápidamente y mueren a antes de 45°C.
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OXÍGENO: Aunque la fermentación es un proceso anaeróbico, las levaduras mantienen una leve
respiración utilizando para ello el oxigeno disuelto en el mosto.
NUTRIENTES: Los azúcares son fuente de energía para las levaduras.
OBJETIVO
Obtener un metabolito primario (alcohol) a partir de una fermentación realizada por la levadura de
Saccharomyces cerevisiae.
MATERIALES Y EQUIPOS
Azúcar, miel, panela o mosto de frutas, levadura, recipiente de vidrio, manguera y tapón,
licuadora, colador, antiespumante, alcoholímetro, agitador mecánico
pHmetro, equipo de destilación, probeta, espátulas, balones de 4-6 L, refractómetro, perlas de
ebullición.
REACTIVOS
KMNO4, Bisulfito de Sodio, Ácido Cromotrópico, H2SO4 concentrado.
DATOS Y OBSERVACIONES
Consideraciones a tener en cuenta en la elaboración del fermento:
Tabla 1: Cantidad de azúcar del mosto para corregir los °Brix
MATERIALES QUE
CANTIDAD (g) AGUA (mL) °BRIX
CONTIENEN AZÙCAR
Azúcar Blanca 10 1000 1
Azúcar Morena 10 1000 1
Miel 10 1000 0,6
Glucosa 10 1000 1
NOTA:
15
No es recomendable utilizar para la práctica frutas tales como: Mango, Papaya, Guanábana y
Guayaba; ya que estas tienen mucho mucílago y son espesantes al trabajar con ellas, complicando
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la fermentación. Además tienen un alto contenido de pectinas.

Se sugiere utilizar frutas tales como: Mora, Uva, Lulo, Maracayá, Naranja.
Tabla 2: %Azúcar en algunas frutas
%AZÚCAR AZÚCAR
FRUTA
(g/L) (g/L)
Anón 25.4 254
Badea Jugo sin semilla 10.1 101
Banano común 23.4 234
Ciruela común 20.8 208
Cereza 16.6 166
Ciruela Claudia 13.0 130
Curaba 6.3 63
Chirimoya 18.2 182
Durazno amarillo 12.0 120
Feijoo sin cáscara 11.9 119
Frambuesa 11.6 116
Fresas enteras 6.9 69
Guayaba común 11.9 119
Guayaba pera 6.8 68
Guanábana pulpa 13.0 130
Higo sin semilla 9.6 96
Kiwi pulpa 14.9 149
Lima 6.0 60
Limón común jugo 8.6 86

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Limón mandarina 5.8 58

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Limón Tahití 7.2 72
Lulo sin semilla 5.7 57
Mamey pulpa 12.4 124
Mandarina Jugo 10.1 101
Manzana Ana 15.0 150
Manzana sin cáscara ni semilla 14.8 148
Maracuyá morado pulpa 13.6 136
Maracuyá amarillo pulpa 14.5 145
Mora castilla pulpa sin semilla 5.6 56
Naranja jugo 10.4 104
Pera sin cascara 8.5 85
Piña jugo 13.0 130
Tamarindo pulpa concentrada 61.3 613
Tomate arbol pulpa semilla 7.0 70
Toronja jugo 9.2 92
Uchuvas enteras 19.6 196
Uva Queen verde 14.0 140
Uva Isabela 15 150
Uva negra 9.6 96
Uva Red Globe 17 170
Uva Ribier 17 170
Uvas pasas sin semilla 75.0 750

17
Zapote pulpa 12.4 124

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Tabla 3: Gramos de azúcar a adicionar por kilo de mosto.
Gramos de azúcar a adicionar por litro de mosto
Alcohol
Densidad 20ºC ºBrix Alcohol 8% Alcohol 10% Alcohol 12%
14%
1.0000 0.0 144.0 180.0 216.0 252.0
1.0050 1.5 129.0 165.0 201.0 237.0
1.0070 2.0 124.1 160.1 196.1 232.1
1.0100 2.7 116.7 152.7 188.7 224.7
1.0110 3.0 114.2 150.2 186.2 222.2
1.0150 4.0 104.4 140.4 176.4 212.4
1.0196 5.0 94.0 130.0 166.0 202.0
1.0200 5.2 92.1 128.1 164.1 200.1
1.0250 6.4 80.0 116.0 152.0 188.0
1.0300 7.6 67.9 103.9 139.9 175.9
1.0350 8.8 55.9 91.9 127.9 163.9
1.0399 10 44.0 80.0 116.0 152.0
1.0441 11.0 34.0 70.0 106.0 142.0
1.0483 12.0 24.0 60.0 96.0 132.0
1.0500 12.4 20.3 56.3 92.3 128.3
1.0525 13.0 14.0 50.0 86.0 122.0
1.0550 13.5 8.6 44.6 80.6 116.6
1.0567 14.0 4.0 40.0 76.0 112.0
1.0610 15.0 0.0 30.0 66.0 102.0

18
1.0653 16.0 20.0 56.0 92.0

Página
1.0696 17.0 10.0 46.0 82.0
1.0740 18.0 0.0 36.0 72.0
1.0784 19.0 26.0 62.0
1.0828 20.0 16.0 52.0
1.0873 21.0 6.0 42.0
1.0918 22.0 0.0 32.0
1.0963 23.0 22.0
1.1009 24.0 12.0
PROCEDIMIENTO A (Producción de Etanol con Células libres)
Preparar un sustrato (tener en cuenta que esté en buen estado en el caso que el sustrato
seleccionado sean frutas), medir los grados Brix y verificar que se encuentren entre 17-20 grados.
En caso de ser necesaria una corrección, se puede adicionar azúcar como fuente de carbono
suplementaria hasta obtener los grados Brix requeridos. Una vez corregidos, se ajusta el pH (3.0-
3.5). Finalizado este proceso, se toman 200mL del mosto y en él, se adiciona la levadura
(aproximadamente 2-4g/L) para su activación a 37°C. Al mosto sobrante, se le agrega Bisulfito de
Sodio (100 ppm) para impedir la proliferación bacteriana y el pardeamiento del medio.
Es necesario dejar un espacio en el recipiente para el control de espuma y la salida del CO2, para
ello se le pone el tapón de caucho con un orificio para la introducción de una manguera
aproximadamente de 1 metro de longitud la cual tiene una salida que llega a un recipiente con agua
donde se observarán las burbujas del CO2 producidas.
Dejar fermentar libremente durante 4 semanas aproximadamente. A lo largo de todo el proceso, se

debe realizar un control periódico de las propiedades fisicoquímicas del material en fermentación,
tales como: pH y grados Brix, las cuales ponen en evidencia el curso que lleva el proceso
(producción ó no de fermentación).
En caso de que los grados Brix bajen puede ser necesaria la adición de más cantidad de azúcar,
proporcional a los grados Brix que se quieran aumentar. VER TABLA 1.
19
Finalizado el proceso de fermentación por parte de la levadura, indicado por la estabilidad de los
grados Brix, se procede a separar el alcohol del material no útil, mediante destilación, para esto se
Página
procede así:
DETERMINACIÓN DEL GRADO ALCOHÓLICO VOLUMÉTRICO
Determinar la temperatura del fermentado.
Transvasar el fermentado al balón de destilación (si se trata de un mosto de frutas debe filtrarse
previamente), adicionar perlas de vidrio y adicionar unas gotas del antiespumante.
Ensamblar el equipo y destilar recibiendo el destilado en un matraz, el cual debe permanecer en

baño de hielo. Recoger el destilado, hasta obtener un volumen aproximadamente igual a ¾ del
volumen inicial.
Determinación de los Grados Alcoholimétricos:
Lectura: colocar el destilado en la probeta, la cual debe mantenerse en perfecta posición vertical. En
el líquido no deben existir burbujas ni partículas flotando. Introducir el alcoholímetro en el líquido,
agitar, dejar en reposo al menos 30 segundos y anotar la temperatura. Leer el grado alcohólico, por
encima del menisco.
PROCEDIMIENTO B (Producción con Células inmovilizadas utilizando como sustrato jarabe

glucosado)
MATERIALES:
Cepa de Saccharomyces cerevisiae mantenida a 4°C en caja petri con agar Sabouraud, agar PDA o
liofilizada.
Medio de cultivo para la activación de la cepa
Componente Cantidad por litro

Fuente de carbono 100.0 g
KH2PO4 2.0 g
(NH4)2SO4 3.0 g
MgSO4· 7 H2O 1.0 g
Extracto de Levadura 4.0 g
Peptona Universal 3.6 g
Agua destilada 1.0 L
PROCEDIMIENTO:
20
Para activar las células de levadura liofilizadas, se preparan 500 mL de el medio de cultivo anterior
en un erlenmeyer de 1L, se esteriliza previamente y se inocula con 2 g de levadura liofilizada el día
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anterior al montaje con células inmovilizadas. Se recomienda agitación a 150 rpm con el fin de tener
un proceso aerobio y mayor eficiencia en la producción de biomasa.
NOTA: También puede partirse de cultivos de la levadura Saccharomyces cerevisiae en cajas de

petri con agar PDA o agar sabouraud de 1 día, incubada a 38°C o levaduras liofilizadas comerciales.
MONTAJE FERMENTACIÓN EN CONTINUO E INMOVILIZACIÓN DE LAS CÉLULAS
MATERIALES: Jeringa estéril, 150 mL de solución isotónica al 0.85 % (p/v) (solución acuosa de
NaCl), 200 mL de solución acuosa de Alginato de sodio al 2 % (p/v) en dos beakers, 400 mL de
solución acuosa de CaCl2 al 3 % (p/v) en dos beakers.
NOTA: Todas las soluciones deben ser esterilizadas.
PROCEDIMIENTO: Se centrifuga el cultivo de Saccharomyces cerevisiae de 24 horas a 5000 rpm

en tubos para centrífuga estériles durante 10 minutos, se descarta el sobrenadante y las células
precipitadas se divide en dos partes aproximadamente iguales, se unen con el alginato de sodio al
2% y de ser necesario se utiliza una mínima cantidad de solución isotónica para ayudar a
resuspender las células. Con la jeringa estéril, succionar la suspensión de levaduras homogenizada
previamente con el alginato de sodio e iniciar a gotear lentamente sobre la solución de cloruro de
calcio, a una distancia no superior a 2 cm y obtener esferas homogéneas de menos de 0,5 cm de
diámetro.
MONTAJE DEL BIOREACTOR
Esterilizar durante 15 minutos y a 15 psi el reactor incluyendo las mangueras y la tapa de este,
además, esterilizar 2 L de medio del cultivo con jarabe glucosado.
En un ambiente estéril (cabina de flujo laminar) llenar completamente el reactor con las esferas de
levadura inmovilizada. Llenar la columna con el medio de cultivo preparado con jarabe y mantener
durante 8 horas el proceso en batch para acondicionar las células inmovilizadas. Pasado este
tiempo, operar el reactor en continuo durante 12 horas a temperatura ambiente (se obtiene más
eficiencia si el proceso se realiza a 38°C).
Para la determinación de los grados alcoholimétricos puede realizarse de manera convencional

convencional con el areómetro y en caso de obtenerse poca cantidad del destilado, la determinación
de los grados alcoholimétricos se realizará por picnometría.
Hacer cálculos de rendimiento en los dos procesos y comparar los resultados.
DETERMINACIÓN DE METANOL
21
Prueba cualitativa
Página
A un tubo de ensayo, adicionar 1 ml de solución de KMNO4 y enfriar en baño de hielo por 15

minutos, agregar 0.5 ml del destilado o de una solución de metanol de 50 ppm (control positivo).
Mantener en baño de hielo por 30 minutos, decolorar la solución con una pequeña cantidad de
NaHSO3 (Bisulfito de Sodio) seco 20 mg, añadir 0,5 ml de ácido cromotrópico y adicionar lentamente
y con agitación 7,5 ml de H2SO4 concentrado. Posteriormente se incuba el tubo de ensayo en un
baño maría a 60°C., durante 15 minutos (para desarrollar color).
La aparición de un halo de color que va del violeta al morado intenso indica la presencia de metanol.
GLOSARIO
GRADOS BRIX: Es el porcentaje de sólidos solubles presentes en el jugo o material fermentecible,

los cuales relacionan la gravedad específica de la solución con la concentración equivalente de
sacarosa pura.
GRADO ALCOHOLIMÉTRICO: Porcentaje de alcohol etílico a 20°C.
BILBLIOGRAFÍA
POTTER, Norman N. La ciencia de los alimentos. Ed. Harla, México. (1978). Pág. 359-376.
JAGNOW, G. Y David W.Bioctenología: inducción con experimentos modelos. Ed. Acribia, Zaragoza-
España (1991).
RAMIREZ L., Gladys. Manual de laboratorio de Bromatología. Medellín, Enero de 1999.
PRÁCTICA N°5: OBTENCIÓN DE PENICILINA Y COMPROBACIÓN DE SU ACCIÓN

ANTIBIÓTICA
Antibióticos
Las sustancias medicinales seguras tienen el poder para destruir el crecimiento de organismos
infecciosos en el cuerpo. Los organismos pueden ser bacterias, virus, hongos, o los animales
minúsculos llamados protozoos. Un grupo particular de estos agentes se constituye de drogas
llamadas antibióticos, desde el griego anti ("contra") y bios ("vida"). Algunos antibióticos se producen
desde organismos vivientes tales como bacterias, hongos y mohos. Los otros son totalmente o en
parte sintéticos, es decir producidos artificialmente. La penicilina es quizás el mejor antibiótico
conocido. Su descubrimiento y desarrollo ha permitido a la profesión médica tratar efectivamente
muchas enfermedades infecciosas, incluyendo algunas que alguna vez amenazaron la vida.
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FABRICACIÓN
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El natural: hace tiempo todos los antibióticos se hicieron desde organismos vivos. Este proceso
conocido como biosíntesis, se usa todavía en la fabricación de algunos antibióticos. Realmente los
organismos fabrican el antibiótico, la gente involucrada solo provee las condiciones favorables para
que los organismos puedan hacer el trabajo y entonces extraen la droga.
Sintético; Todos los tipos de penicilina poseen un núcleo químico idéntico llamado anillo. La cadena
química que es adjunta al anillo es diferente en cada tipo. Cambiando las moléculas de la cadena,
los científicos idean drogas con efectos potencialmente diferentes sobre organismos diferentes.
Algunas de estas drogas son útiles para tratar infecciones, algunas no lo son.
Obtención y separación de antibióticos
Como se hallan y aíslan los microorganismos productores de los antibióticos
La búsqueda directa de antibióticos se puede efectuar de dos maneras, cada una de las cuales tiene
particularidades propias aunque están ligadas entre sí, como veremos de inmediato. Ellas son:
-Examen sistemático de cultivos puros de microorganismos, sea los que se guardan en colecciones
o recogidos al azar.
- La investigación de poblaciones microbianas mezcladas, sea del suelo, cloacas, heces, aire, polvo,
abonos, etc., previa una selección y de acuerdo con los métodos idénticos a los empleados con
cultivos puros.
Los métodos se han dividido en dos grupos, según sea el antagonista cuya capacidad se analiza y el
organismo frente al cual se prueba dicha propiedad. Se pueden cultivar al mismo tiempo
(implantación simultánea) o el organismo de prueba puede sembrarse después que el antagonista
haya desarrollado un cierto tiempo (implantación sucesiva). Esta distinción que pudiera parecer
trivial a primera vista, es importante en la práctica, porque el primero de los métodos no puede
mostrar efectos positivos si se trata de la producción de un antibiótico incapaz de disolver células
antagonista, excepto que el antagonista crezca mucho más rápidamente. Por el otro lado, si el
organismo de prueba se introduce después que el antibiótico se ha producido, será posible observar
efectos tanto si la sustancia activa es bacteriostática, es decir, simplemente capaz de impedir el
desarrollo del microorganismo de prueba, o si es bactericida, es decir que mata a los organismos, o
quizás bacteriolítica, con la propiedad de disolver o lisar las células.
Así mismo pueden subdividirse dichos métodos de acuerdo a si el antagonista está presente o
ausente mientras el microorganismo de prueba se está desarrollando. Este hecho es de mucha
importancia, ya que en determinados casos sólo hay resultados positivos (es el caso de sustancias
muy inestables) cuando el antibióticos se forma continuamente durante el desarrollo del
23
microorganismo de prueba.
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Organismos de prueba: La elección del antagonizado es un punto esencial para poder apreciar en
un estado inicial de las investigaciones cual es el campo de acción del agente activo que se forma.
Hay dos divisiones entre las bacterias comunes respecto a su comportamiento frente a una técnica
de tinción, la de Gram, que permite una separación de notable utilidad en la clasificación de los
microorganismos. Los que retienen el colorante de genciana combinado con un mordiente como
iodo, después de un lavado con alcohol o acetona, se llaman Gram positivos, y los que lo pierden en
iguales condiciones y pueden ser nuevamente coloreados con otro tinte de contraste, se denominan
Gram negativos.
Esta separación demuestra tener profundas bases en la fisiología y estructura de las células y
también en cuanto a la sensibilidad frente a distintos antibióticos, pues hay algunos que obran
solamente sobre organismos Gram positivos, mientras otros (mucho menores en número)
exclusivamente lo hacen sobre Gram negativos. Aunque hay un importante grupo que actúa, en
general sobre ambos grupos de microorganismos.
Modo de acción de los microorganismos
La prescripción o elección de un antibiótico es más efectiva si se conoce la forma de accionar del

microorganismo. Se debe reconocer que los microorganismos actúan según diversos mecanismos.
El conocimiento de los mismos, aplican no solamente la patogenia y la sintomatología de la
enfermedad sino también el éxito de la acción del antibiótico.
El poder de los microorganismos se clasifica de la siguiente manera:
Poder de virulencia: Se define como el poder de un microorganismo para desarrollarse y

reproducirse en la intimidad de los tejidos.
Ejemplo: Neumococo, el cual instalado en el oído o en meninges, provoca abundante supuración.
Muchas bacterias son vulnerables, pero casi todas están acompañadas por otras propiedades; por
ejemplo, presión y temperatura.
Antibiótico: Ejerce su acción contra la virulencia ya fuere porque inmoviliza el microorganismo o lo

destruye, según el mecanismo de acción bacteriostática o bacteriolítica.
Toxinas
-Endotoxinas
-Exotoxinas
24
Las Exotoxinas proceden casi siempre de microorganismos Gram (+). Ejemplo: Clostridium tetanis
que segrega una potente toxina contra el sistema nervioso. En este caso los resultados inmediatos
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con los antibióticos serán posibles, debido a que el tratamiento deberá involucrar suero antitóxico
específico. Frente a toxinas de incorporación externa (botulinum) no hay terapia con antibióticos.
Las endotoxinas proceden casi siempre de bacterias Gram (-), son de naturaleza liposacárida y poco
antigénicas.
Esta se libra con la destrucción o autolisis del microorganismo.
Ejemplo: Bacilo de Eberth. Su destrucción libera endotoxina tífica.
Acción de los antibióticos
Los antibióticos se pueden aplicar por vía oral, parenteral o directamente cutáneo-mucosa y puede
generar dos efectos.
Bacterióstasis: inmoviliza vitalmente al microorganismo, mientras se espera que la inmunogénesis

aporte los elementos defensivos necesarios.
Bacteriólisis: es la destrucción, lisis o muerte del microorganismo.
CLASIFICACIÓN DE LOS ANTIBIÓTICOS
Antibióticos que actúan en la pared bacteriana. Ejemplo: penicilina, la pared bacteriana protege a
la célula contra los cambios osmóticos y contiene elementos patógenos característicos de cada
especie. La pared (micropéptidos) es una unión tridimensional de péptidos acetil-glucosamina y
acetil-murámico. Los Gram (+) 40-90% y los Gram (-) 4-10% de muramil péptidos. Un antibiótico de
este tipo impide la unión de ciertas estructuras químicas del mucopéptido. Como consecuencia, la
célula bacteriana, sin pared no resiste los cambios osmóticos se hincha y estalla.
Antibióticos que actúan sobre la membrana celular: La membrana celular se ubica debajo de la
pared celular y es de gran importancia. Este tipo de antibióticos puede alterar la permeabilidad y
provocan salinidad en el interior de la célula.
Antibióticos que interfieren en la síntesis proteica: Ejemplo: tetraciclinas, la síntesis de proteinas

es de vital importancia en la vida de la bacteria y los diferentes pasos del mecanismo de obtención
pueden ser infectados por los antibióticos. Estos son bacteriostáticos y bactericidas. Sin producción
o con producción alterada mueren.
Antibióticos que impiden la formación de ARN: son los que interfieren a la polimerasa y la
inhabilitan.
Los antibióticos en la conservación de los alimento: Se han obtenido antibióticos de diversos

25
microorganismos, a saber: bacterias no esporuladas, bacterias aerobias esporuladas, actinomicetes

Página
y estreptomicetes, hongos filamentosos, basidiomicetes y algas. Entre ellos pueden citarse:
1. De bacterias no esporuladas, por ejemplo: los pyos I b, Ic, II, III y IV (de la Pseudomona
aeruginosa), la diplococcina (de streptococcus cremoris), etc.
2. De aerobios esporulados: la tirotricina (del B. Brevis), la bacitracina, la subtilina (del B. subtilis), la

gramicidina, la polimixina, entre otros.
3. De actinomicetes: la estreptomicina, la actinomicina, la estreptotricina, la actinopmicetina, la

actinorubina, etc.
4. De algas: la chorellina.
5. De hongos filamentosos: la penicilina (seis variedades), el ácido ponicilinico, la citrinina, el ácido

aspergílico, la flavacidina, la fumigación, etc.
6. De basidiomicetes: la pleutoina, la biformina, la clitocibina, etc.
7. El grupo de estreptomices ha sido el que dio un mayor número de antibióticos y muy valiosos,
principalmente el grupo de las tetraciclinas y la nistatina. Otros son: la higromicina, la
estreptogramina, la ruticina, la carbomicina, la cloromicetina, la nistatina, etc.
Merece especial mención el grupo de las tetraciclinas, por la amplitud de espectro y por ser las de
mayor aplicación en la preservación de alimentos.
Las tetraciclinas son formadas por el Streptomyces aureofaceins y la nistatina por el Streptomyces
noursei.
La penicilina es un antibiótico que pertenece al grupo de los β-Lactámicos; los cuales son inhibidores
de la síntesis de la pared celular bacteriana. Se combinan específicamente con las denominadas
proteínas que unen penicilina de la célula bacteriana e inhiben la actividad enzimática de estas
proteínas produciendo la muerte celular.
Las penicilinas son producidas por muchos hongos, particularmente especies de Penicillium y
Aspergillus.
PENICILINA; FABRICACIÓN INDUSTRIAL
La fabricación de penicilina es un ejemplo del proceso típico de obtención de antibióticos. El hongo

utilizado industrialmente pertenece al grupo del Penicillium chrysogenum y es particularmente activo
sobre el estafilococo, estreptococo y neumococo, así como sobre la mayor parte de los
microorganismos Gram positivos, presentando escasa acción sobre los Gram negativos. La
penicilina es lábil en medio ácido y puede ser inactivada por hidrólisis del anillo β -Lactámico con
26
penicilinasas.
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Las 4 fases principales para la fabricación de penicilina son:
- Fermentación
- Separación del micelio del caldo fermentado y extracción de la penicilina por medio de disolventes
- Purificación con disolventes y formación de la sal sódica de la penicilina
- Ensayos de control y almacenamiento.
PREPARACIÓN:
El caldo de cultivo para la fermentación se obtiene por infusión acuosa de maíz, añadiendo de un 2 a
un 3% de lactosa, y también se adicionan compuestos inorgánicos conteniendo hidrógeno, oxígeno,
fósforo, azufre, potasio, magnesio, nitrógeno y trazas de hierro, cobre y zinc. La adición de ciertos
compuestos que favorecen el crecimiento del hongo debe evitarse, ya que podrían ser tolerados al
administrar el producto, ni su eliminación sería económica. Después de buscar el pH a 4.5-5.0, el
medio de cultivo se pasa al fermentador, que está equipado con un agitador vertical, con un sistema
de introducción de aire esterilizado por filtración y con serpentines para mantener la temperatura
deseada. El hongo se introduce por medio de conducciones estériles y con ayuda de airea presión.
Durante el crecimiento el medio se esteriliza con vapor a presión, y la temperatura se mantiene entre
23 y 25°C.
El aire estéril permite el crecimiento del hongo aerobio, y la agitación facilita su uniforme distribución
en el seno del líquido. Se requiere un volumen de aire por minuto y por volumen de medio de
cultivo. El proceso se controla a intervalos que oscilan entre 3 y 6 horas; al cabo de unas 50 a 90
horas el crecimiento se va haciendo más lento, lo que indica que el hongo se ha desarrollado por
completo. La masa se enfría a 5°C a causa de la inestabilidad de la penicilina a la temperatura
ambiente, y se separa el micelio en un filtro de tambor rotatorio.
Debido a su baja toxicidad pueden ser utilizadas grandes dosis de penicilina; solamente un pequeño
porcentaje de personas desarrollan alergia.
OBJETIVO GENERAL:
Obtención de penicilina por inoculación de esporas de Penicillium chrysogenum previamente

sembradas en agar sabouraud – en medio de cultivo liquido que contiene los nutrientes apropiados
para la generación y crecimiento de la biomasa y formación del metabolito secundario.
MICROORGANISMO
Cultivo en agar inclinado de Penicillium chrysogenum (DSM 1.075), realizado en agar Sabouraud-
glucosa: glucosa: 40.0g, peptona: 10.0g, agar: 15.0g, agua corriente: 1L (pH 5.6)
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MATERIALES
Página
1 jeringa desechable de 5 ml, agua estéril para inyección, algodón, gasa, asa de siembra, papel
indicador del pH (1-7), embudo de vidrio con filtro redondo, mechero Bunsen, erlenmeyer de 500ml.
PREPARACIÓN DEL INÓCULO:
Se debe repicar Penicillium Chrysogenum en un tubo de ensayo que contenga agar sabouraud
inclinado e incubar durante 8 días a temperatura ambiente.
Se preparan 200ml de medio de cultivo para el crecimiento y producción de la penicilina el cual

contiene lactosa: 30.0g, glucosa: 10.0g, extracto de levadura: 40.0g, nitrato sódico: 3.0g,
dihidrogenofosfato sódico: 0.5g, fenilacetato sódico: 0.3g, sulfato magnésico: 0.25g, sulfato de cinc:
20mg, por litro de agua corriente. Todo se mezcla en un erlenmeyer de 500ml, se ajusta a pH entre
5.5 y 6, se tapa con algodón y se esteriliza en autoclave a 121 oC por 15 minutos. Al día siguiente se
procede a la siembra; para ello, se debe limpiar la cabina correctamente, y llevar allí, el medio
autoclavado, guantes quirúrgicos, asa de siembra, jeringa desechable de 5 ml, solución salina estéril
para inyección, aspersor con alcohol, gasa y mechero. Encender el motor de la cabina y la lámpara
germicida y dejar durante 20 minutos, luego apagar la lámpara germicida, encender la lámpara
fluorescente, incluir el inóculo y proceder con la inoculación de la siguiente manera: Extraer 5ml de
solución salina con la jeringa y descárguelos sobre el tubo donde se encuentra el inóculo, agite un
poco con cuidado de no regar nada y luego adicionar en el erlenmeyer donde se encuentra el
medio, realice el mismo procedimiento con 5 mL más y tape con el algodón. Saque todo el material
de la cabina, limpie bien con alcohol y gasa, lleve el medio al agitador orbital (shaker) controle el pH
cada 2 ó 3 días manteniéndolo a pH 5, durante 10 a 15 días. Verifique que el pH se encuentre en un
rango de 6.0-6.5, de ser necesario adicione NaOH.
Cristalización de la penicilina: Filtrar el caldo de cultivo; tomar el filtrado y ajustar el pH a 2.0 con
ácido fosfórico, añadir un volumen igual de éter enfriado en un baño de hielo; luego adicionar unas
puntas de espátula de sulfato sódico anhidro, concentrar a vacío hasta reducir a 1/4 el filtrado, añadir
un poco de solución de éter disuelto en trietilamina. Filtrar y recoger los cristales obtenidos.
Antibiograma: Cortar con perforadora pequeños círculos de papel de filtro e impregnarlos con el
filtrado del medio, luego colocarlos en una caja de petri, la cual previamente ha sido sembrada con
un microorganismo sensible a la penicilina en agar nutritivo, el microorganismo puede ser: Bacillus
subitlis, Escherichia coli y Pseudomonas fluorescens. Incubar a 28ºC por 24 horas; al día siguiente
se comprueba la actividad de la penicilina por la aparición de halos de inhibición alrededor de los
discos de papel.
Preparación de las placas de ensayo

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Microorganismos: Cultivos en agar inclinado de de microorganismos de ensayo: B. subtilis (DSM

402), Micrococcus luteus (DSM 348), Escherichia coli (DSM 348), Pseudomonas fluorescens (DSM
Página
50.090), Agar de ensayo para bacterias indicadoras:
Glucosa 2,0 g
Peptona 10,0 g
Extracto de levadura 1,0 g
Agar 12,0 g
Agua desmineralizada 1L
pH 7
Instrumentos: Asa de siembra y mechero Bunsen, espátula de Drigalski, pipetas desechables (1ml
estériles), solución de NaCl (0,9%, estéril), tubos de ensayo (estériles)
Procedimiento operativo
Suspender un asa de siembra de las bacterias de ensayo en 2ml de solución de cloruro sódico
estéril; pasar 0,1ml de la suspensión bacteriana a la placa con agar de ensayo; extenderla
regularmente con la espátula de Drigalski. Impreganar los papeles de filtro con la solución de
penicilina, dejarlas secar y ubicarlas sobre la placas de agar inoculada con el microoganismo
sensible ayudándose de pinzas esterilizadas en llama, incubar durante 24 horas a 35 ºC.
Control de las placas: se comprueba la actividad de la penicilina por la aparición de halos de

inhibición alrededor de los discos de papel, medir el diámetro del halo con ayuda de regla.
Comparar el tamaño del diámetro obtenido con aquel dado por la penicilina comercial, usando la
misma técnica.
NOTA: La lectura debe realizarse a las 24 horas siguientes.
Resultado
El diámetro del halo de inhibición es una medida de la acción (y concentración) antibiótica de la

penicilina obtenida. Los halos claros se miden con la regla y los datos obtenidos se reúnen en una
tabla. Si se tiene poca práctica, aunque la manipulación haya sido cuidadosa pueden producirse
errores, por lo que es recomendable llevar a cabo cada experiencia por triplicado. Por ello, habría
que realizar la preparación para la cristalización de la sal de penicilina sólo cuando se haya
establecido con certeza la actividad antibiótica con el ensayo con el filtrado de cultivo.
29
GLOSARIO
Página
ANTIBIÓTICO: Sustancia natural de peso molecular relativamente bajo, producida por un

microorganismo, la cual en solución diluida inhibe el crecimiento o destruye otros microorganismos.
HIDRÓLISIS: Rotura catalítica de macromoléculas o polímeros en sus constituyentes con la

incorporación de los elementos del agua.
BIOMASA: Masa celular producida durante la fermentación.
COOMBS, J. Diccionario de biotecnología. Editorial Labor, S.A. 1ª edición 1989. España.
CRUEGUER, Anneliese. Manual de Microbiología Industrial. Editorial Acribia S.A. Zaragoza España.
3ª edición. 1989.
JAGNOW, Gerhard. Biotecnología “Introducción con experimentos modelo”. Editorial Acribia S.A.
Zaragoza España. 1991.
PRÁCTICA N°6: OBTENCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO CON HONGOS
INTRODUCCION:
El ácido cítrico es un ácido orgánico que se obtiene en forma natural de los jugos de las frutas
cítricas y artificialmente por la transformación del azúcar, mediante la intervención de ciertas
especies de hongos correspondientes al género Aspergillus. En 1923 se inició la primera
fermentación práctica para la producción de este ácido orgánico utilizando microorganismos que
crecían sobre la superficie de los cultivos. La fermentación, que utilizaba como fermentadores cubas
profundas, comenzó en los años 30. Aunque en Sudamérica y en Méjico existen pequeñas fábricas
en las que el ácido cítrico se aísla de frutos cítricos no maduros (los limones contienen 7-9% de
ácido cítrico), actualmente más del 99% de la producción mundial de ácido cítrico se produce
microbiológicamente.
Los procesos de fermentación se llevan a cabo sobre la superficie de los cultivos o en fermentadores
de hasta 220 metros cúbicos de volumen. El ácido cítrico se comercializa como ácido cítrico
monohidratado o como ácido cítrico anhidro. La mayor parte del ácido cítrico (60% del total) se utiliza
en las industrias de alimentos y bebidas. El sabor de los jugos de frutas, extractos de jugo de fruta,
caramelos, helados y mermelada se aumenta o se preserva por adición de ácido cítrico. La industria
farmacológica (10% de la utilización total) utiliza citrato de hierro y ácido cítrico como preservativo de
la sangre almacenada, en tabletas, pomadas y en preparaciones cosméticas. En la industria química
(25% del uso total) el ácido cítrico se utiliza como agente antiespumante, como reblandecedor y para
el tratamiento de textiles. En la industria metalúrgica los metales puros se producen como citratos
metálicos. El ácido cítrico está siendo usado cada vez más en la industria de detergentes porque
30
puede reemplazar a los polifosfatos.

Página
OBJETIVO GENERAL:
Obtención de un ácido orgánico (ácido cítrico) por inoculo de esporas previamente sembradas en
agar sabouraud y posterior adición al medio de cultivo liquido enriquecido con sales apropiadas para
la generación y crecimiento de la biomasa, a la cual debe controlarse su pH durante todo el
proceso.
MICROORGANISMO y REACTIVOS:
Cultivo en agar inclinado de Aspergillus Níger (DSM 63.23) realizados en agar-sabuoraud.
MATERIALES:
1 jeringa desechable de 5 ml, agua estéril para inyección, gasa, asa metálica, papel indicador del
pH (1-7), embudo de vidrio con filtro redondo, mechero, erlenmeyer de 500ml
Duración aproximada del proceso de fermentación: 14 a 20 días.
Procedimiento:
PREPARACIÓN DEL INÓCULO:
Repicar el hongo Aspergillus níger en un tubo de ensayo que contenga agar sabouraud inclinado y
dejarlo crecer durante 8 días.
PROCEDIMIENTO OPERATIVO:
Preparar el medio de cultivo (sacarosa: 190.0g, nitrato amónico: 2.3g, dihidrogenofosfato potásico:
1.0 g, sulfato magnésico: 0.3 g, Agua: 1.0L) a pH 2, luego esterilizar en el autoclave a 121 oC y 15
psi durante 15 minutos, dejar enfriar totalmente y al día siguiente sembrar el inóculo en la cabina de
flujo laminar vertical. Para ello, se debe limpiar la cabina correctamente, y depositar en ella, el
medio estéril, guantes quirúrgicos, asa, jeringa desechable de 5 ml, aspersor con alcohol, gasa,
alcohol para flamear, mechero,( no incluir el inóculo), se debe encender el motor de la cabina y la
lámpara ultravioleta durante 20 minutos previo a la inoculación, luego apagar la lámpara germicida.
Para realizar la siembra, tome 5ml de agua estéril con la jeringa y descárguelos sobre el tubo donde
se encuentra el microorganismo, agite levemente y con cuidado, luego adicione este contenido en el
erlenmeyer donde se encuentra el medio de cultivo, repita este procedimiento y tape el erlenmeyer
con algodón. Finalmente, saque todo el material de la cabina , limpie bien con alcohol y gasa, lleve
el medio al agitador orbital (shaker) y controle el pH cada 2 ó 3 días manteniéndolo en 2, durante 14
a 20 días, al cabo de los cuales, se puede obtener el metabolito buscado.
31
Cristalización del ácido cítrico: el líquido una vez terminado el proceso, se lleva a licuar, se filtra
se calienta y se trata con hidróxido de calcio hasta neutralizar, añadir un exceso de hidróxido,
Página
obteniéndose un precipitado insoluble del ácido al estado de citrato de calcio (almacenar en nevera a
4°C hasta la próxima clase). Tratando esta sal con cantidades equivalentes de ácido sulfúrico diluido
(almacenar en la nevera hasta la próxima clase), se libera el ácido orgánico, formándose a
consecuencia de esta reacción un precipitado de sulfato de calcio insoluble, después de filtrar los
cristales, se lavan en frío (agua de hielo).
Consulte: como podría determinarse cualitativamente y cuantitativamente la presencia de ácido

cítrico.
OBSERVACIONES:
Relación entre al área superficial y el volumen: en la fermentación cítrica la conversión del azúcar es
efectuada por las enzimas intracelulares y, por lo tanto, tiene lugar dentro de las células vivas que
constituyen la película de hongos. El azúcar pasa al interior de las células por ósmosis, y, por
consiguiente tanto este proceso de difusión como el enzimático determinan la longitud del periodo de
fermentación. Evidentemente, en un recipiente profundo y de gran capacidad la formación de ácido
será relativamente lenta, puesto que la superficie de la capa de hongos será pequeña en
comparación con el volumen inversamente en el empleo de recipientes de forma plana se consigue
una gran superficie de micelio y la conversión de azúcar a ácido cítrico se efectúa con gran rapidez.
GLOSARIO
CEPA: Conjunto de células o cultivos con un origen común y que poseen una dotación genética
similar; cultivo puro de organismos, compuesto por la descendencia de un único individuo.
INÓCULO: Cultivo iniciador de un organismo, o una mezcla de organismos, añadido a un medio para
iniciar la producción de un número mayor.
MICELIO: Parte vegetativa de un hongo filamentosos. Consta de una masa de hifas.
HIFA: Filamento tubular que constituye la fase vegetativa de la mayoría de los hongos y muchas
algas.
INOCULACIÓN: Introducción de un pequeño número de microorganismos en un medio, con la

perspectiva de que a partir de éstos se desarrolle un número grande de individuos, mediante
crecimiento y reproducción.
CRUEGUER, Anneliese. Manual de Microbiología Industrial. Editorial Acribia S.A. Zaragoza España.
3ª edición. 1989.
32
JAGNOW, Gerhard. Biotecnología “Introducción con experimentos modelo”. Editorial Acribia S.A.
Zaragoza España. 1991.
Página
PRESCOTT, S.C. Microbiología Industrial. Aguilar S.A. Ediciones Madrid.
PRÁCTICA Nº 16 FACULTAD DE QUÍMICA

FARMACÉUTICA
DEGRADACIÓN DE COLORANTES
UTILIZANDO HONGOS Laboratorio de
LIGNINOLÍTICOS Biotecnología
Realizado por: Érika Juliana Obando M. Aprobado por:

Liuda Johana Sepúlveda A. Silvia Luz Jiménez
Objetivo General:
 Evaluar el porcentaje de degradación de un colorante sintético en medio sólido (no

inducido) y en medio líquido (inducido) empleando hongos ligninocelulósicos.
INTRODUCCIÓN:
Entre los hongos filamentosos, los hongos basidiomicetes tienen la capacidad de degradar la
lignina, el componente más recalcitrante de la pared celular de los vegetales. Los hongos que
degradan lignina se clasifican en white-rot fungi u hongos de la podredumbre blanca, los cuales
tienen la capacidad de depolimerizar tanto la lignina como los otros componentes de la
ligninocelulosa (celulosa y hemicelulosa). Otro grupo de hongos degradadores de lignina son los
brown-rot fungi u hongos de la podredumbre café los cuales sólo tienen la capacidad de modificar
la lignina (Sánchez., 2009).
En adición a la lignina, los hongos de la podredumbre blanca tienen la capacidad de degradar una
gran variedad de contaminantes ambientales persistentes, tales como, compuestos aromáticos
clorados, hidrocarbonos aromáticos heterocíclicos, varios colorantes y polímeros sintéticos
(Bennett et al., 2002). La degradación de lignina por los hongos de la podredumbre blanca es un
proceso oxidativo donde las enzimas polifenoloxidasas desempeñan un papel clave (Rabinovich et
al., 2004). Entre estas se enzimas se encuentra las lignino peroxidasas (C.E 1.11.1.14) (LiP),
manganeso peroxidasas (EC 1.11.1.13) (MnP) y lacasas (EC 1.10.3.2) y se han encontrado
especialmente en Botrytis cinerea, P. chrysosporium, Stropharia coronilla, P. ostreatus y Trametes
versicolor (Howard et al., 2003; Martínez et al., 2004). LiP y MnP oxidan los sustratos en dos pasos
consecutivos en los cuales se oxida un electrón, con la formación de un intermediario radical
33
catiónico (Sánchez., 2009). LiP degrada especialmente unidades de lignina no-fenólicas, mientras
MnP genera Mn3+, el cual actúa como un agente oxidante sobre unidades fenólicas y no-fenólicas
Página
de lignina vía reacciones de peroxidación lipídica (Cullen and Kersten, 2004). La enzima lacasa es
una oxidasa de cobre azul que cataliza la oxidación de un electrón de compuestos fenólicos u otro
tipo de sustratos ricos en electrones (Hammel, 1997).
Figura 1: Mecanismo de acción de la MnP (Garzón., 2009)
La enzima MnP, es una hemoproteína que cataliza la oxidación de Mn2+ a Mn3+, la cual es
dependiente de H2O2. El Mn3+, es quelado por diferentes ácidos orgánicos como glicolato u
oxalacetato, y puede oxidar una amplia variedad de compuestos fenólicos, entre ellos anillos
aromáticos de los colorantes azo. El centro activo de la enzima es oxidado por el H2O2, para
generar un intermediario deficiente de un par de electrones (componente I), dicho componente
puede ser reducido ya sea por Mn2+ o por sustratos fenólicos, generando el componente II. El ciclo
es completado cuando el componente II gana un electrón, produciendo que la enzima detenga su
actividad. La MnP es específica en sustratos reductores y solamente el Mn2+ puede completar
eficientemente su ciclo catalítico.
34
Página
Figura 2: Mecanismo de acción de la LiP (Garzón., 2009)
La LiP es oxidada por el H2O2, generando un intermediario deficiente de electrones (compuesto I);
dicho compuesto puede ser reducido ya sea por un donador de electrones o por sustratos
fenólicos, generando el compuesto II el cual regresará a su estado de reposo inicial por medio de
una reducción posterior, que dará como resultado un compuesto fenólico oxidado y agua (Dávila
& Vásquez 2006). Las LiP difieren en los sustratos reductores (AH) que son oxidados por la
transferencia de un electrón a los compuestos I y II.
35
Página
Figura 3: Mecanismo de acción de la Lacasa (Garzón., 2009)
La lacasa pertenece al grupo de las fenoloxidasas, posee un centro activo compuesto por Cobre, el
cual será oxidado por el Oxígeno o por un compuesto aromático, para generar un intermediario
deficiente de un par de electrones. Dicho compuesto será oxidado nuevamente por O2 o por
sustratos fenólicos. El ciclo es completado gracias a cuatro oxidaciones posteriores, lo cual provoca
que la enzima regrese a su estado nativo. La enzima cataliza la remoción de un electrón y un
protón de hidroxilos fenólicos o de grupos amino aromático, para formar radicales libres fenoxilo o
amino respectivamente. Este grupo de enzimas posee cuatro átomos de Cobre que en su estado
de oxidación le confiere un color azul.
La síntesis fúngica de la LiP y la MnP se realiza bajo una alta tensión de oxígeno, se reprime en
agitación o cuando los hongos de la Podredumbre Blanca, se cultivan en medio líquido, sin
embargo la Lacasa se sintetiza sólo en agitación, estas tres enzimas son inespecíficas y se inducen
en condición limitante de nutrientes, como la fuente de nitrógeno, o adicionando sustratos
específicos.
Los tratamientos para la degradación y remoción de colorantes incluyen tratamientos químicos y

biológicos, estos últimos han sido reconocidos como métodos efectivos, amigables con el medio
ambiente y competitivos en cuanto a los costos requeridos (Garzón 2009).
MATERIALES Y METODOLOGIA
1. Preparación de Medios de cultivo (g/L) para cada equipo de trabajo.
Medio Sólido (Sin agentes inductores)

- Glucosa 10
- Extracto de malta 3,5
- Agar-Agar 15
pH 5.6
Medio de mantenimiento líquido

- Igual al medio sólido sin agar-agar
Medio líquido inductor (composición por cada 100 mL)

- Glucosa 1 g
- Tartarato de amonio 0,02 g
- Tween 80 (20μL)
- Alcohol veratrílico 2,5 mmol (0,02 mL de AV de una concentración 1,25 M)
36
- Manganeso 40 ppm (4mL de solución de Manganeso de concentración 1000 ppm)

¿Cómo prepararía una solución de Manganeso a una concentración de 1000 ppm si el
Página
reactivo disponible en el laboratorio es sulfato de manganeso?
- Ácido tartárico 0,3 g

- pH 4,5 previo a la adición del colorante azul de coomassie
Hongo de la podredumbre Blanca a emplear
- Phanerochaete chrysosporium
- Phanerochaete sordida
Colorante sintético
- Azul de Coomassie 50 y 100 ppm
Para realizar las pruebas de degradación de colorantes sintéticos, preparar 100 mL de

medio de sólido, 100 mL de medio de mantenimiento líquido (sin agar-agar) y 100 mL de
medio con agentes inductores, autoclavar a 121ºC durante 15 min.
2. Determinación de la velocidad de crecimiento y Capacidad de Decoloración de los

hongos lignocelulósicos en medio sólido.
Sembrar el hongo de la podredumbre de la madera designado para cada equipo de trabajo

de la siguiente manera:
En cámara de flujo laminar tomar un trozo de 1 cm2 aproximadamente de micelio de

hongo para inocular en el centro los medios sólidos con el colorante azul de coomassie.
Incubar durante 15 días a temperatura ambiente. NOTA: Reservar una caja como control
para cada concentración de colorante.
Luego de inocular los medios de cultivo se procederá a realizar las mediciones

cuantitativas del crecimiento radial y el halo de decoloración en cm del hongo designado
para la determinación de la velocidad de crecimiento y la decoloración de éste. Se
rotularán las cajas petri como se observa en la figura y se realizarán mediciones cada 48
horas del halo de crecimiento y del halo de decoloración (las medidas deben hacerse
siempre por el mismo lugar).
37
Página
Este manual es unaImagen

versióntomada
corta y modificada delaboratorio
de la guía de la versión original. Aclaración:Escuela
de biotecnología, la modificación
de es realizada
microbiología, programa de microbiología industrial Universidad de
Antioquia.
Cada día se tomaran los siguientes datos:
Halo de Decoloración (cm)

Hongo:
Colorante:
Concentración colorante Concentración colorante
Fecha Hora 50 ppm 100 ppm
Caja Caja Caja Caja
inoculada Control inoculada Control
2 2
Halo de Crecimiento(cm)
Hongo:
Colorante:
Concentración colorante Concentración colorante

Fecha Hora 50 ppm 100 ppm
3. Determinación de la Capacidad de Decoloración de los hongos lignocelulósicos en medio

líquido.
Cada grupo tiene un total de cuatro erlenmeyers con 50 mL de medio, dos con medio
líquido de mantenimiento (50 ppm y 100 ppm del colorante) y dos con medio inductor (50
ppm y 100 ppm del colorante).
Inocular los medios de cultivo transfiriendo tres trozos de micelio de 1 cm2

(aproximadamente) y cortados con bisturí. Llevar a agitación en shaker orbital a 100 rpm
hasta observar una decoloración total del medio de cultivo, cada 48 horas se toman 1 mL
de medio de cultivo y se almacenan en un ependorff a 4ºC para un posterior análisis
espectrofotométrico, determinando la Absorbancia a 598nm.
La concentración de los colorantes se determinará por medio de la curva de calibración

elaborada para el colorante, que será construida en clase utilizando las concentraciones
200, 150, 100, 50, 20, 10 y 5 ppm. La gráfica obtenida será Absorbancia vs Concentración
38
del colorante en ppm.

NOTA: En caso de que el valor de Absorbancia sea superior a 2, aplicar diluciones sobre la
Página
muestra.
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN
1. Con los resultados obtenidos con cada hongo evaluado, realizar dos gráficos de barras
donde se muestre el crecimiento micelial en cm/día vs especie fúngica y decoloración en
cm/día vs especie fúngica. Con base en dichos gráficos discutir el comportamiento de
estos hongos, su crecimiento micelial bajo la presencia de este colorante y su capacidad
degradadora a diferentes concentraciones de colorante.
Comparacion capacidad de cremiento

Hongo 1 vs Hongo 2
3.5
CRECIMIENTO MICELIAL
3
2.5
50ppm
(cm/ dia)
2
100ppm
1.5
1
0.5
0
hongo 1 hongo 2
Comparacion capacidad de
decoloracion
Hongo 1 vs Hongo 2
3.5
3
HALO DE DECOLORACION
2.5
50ppm
2
100ppm
(cm/ dia)
1.5
1
0.5
0
hongo 1 hongo 2
2. Además realizar un grafico que permita comparar el comportamiento de los hongos

evaluados en medio liquido, tiempo (días) vs concentración de colorante (ppm) en
cada uno de los medios ensayados y analizar la capacidad degradadora del hongo y
39
observar si éste presenta algún tipo de inhibición.

Página
- Bennett JW, Wunch KG, Faison BD. Use of fungi in biodegradation. In: Hurst CJ, editor. Manual of
Environmental Microbiology.Washington DC: AMS press; 2002. p. 960–71.
- Cullen D, Kersten PJ. Enzymology and molecular biology of lignin degradation. In: Brambl R,
Marzluf GA, editors. The Mycota III. Biochemistry and molecular biologyBerlin-Heidelberg:
Springer-Verlag; (2004) p. 249–73.
- Garzón R. Cinética de degradación de colorantes textiles de diferentes clases químicas por

hongos y bacterias inmovilizadas sobre fibra de Agave tequilana Webber var. Azul. Pontificia
Javeriana Universidad. Facultad de Ciencias. (2009).
- Hammel KE. Fungal degradation of lignin. In: Cadisch G, Giller KE, editors. Plant litter quality and
decomposition. CAB-International; 1997. p. 33–46.
- Howard RL, Abotsi E, Jansen van Rensburg EL, Howard S. Lignocellulose biotechnology: issues of
bioconversion and enzyme production. Afr J Biotechnol 2 (2003) 602–19.
- Martínez G, Larrondo N, Putman N, Gelpke MDS, Huang K, Chapman J, et al. Genome sequence
of the lignocellulose degrading fungus Phanerochaete chrysosporium strain RP78. Nature
Biotechnol 22 (2004) 1–6.
- Rabinovich ML, Bolobova AV, Vasil'chenko. Fungal decomposition of natural aromatic structures
and xenobiotics: a review. Appl Biochem Microbiol 40 (2004) 1–17.
- Sánchez C. Research review paper Lignocellulosic residues: Biodegradation and bioconversion by

fungi. Biotechnology Advances 27 (2009) 185–194.
PRÁCTICA N°8: CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO y OBTENCIÓN DE PROTEASAS
INTRODUCCIÓN
En Biotecnología es muy importante conocer las características de crecimiento de un

microorganismo, ya que de esta manera es posible reproducir los procesos industriales para la
obtención de metabolitos. La palabra crecimiento, se define como un incremento en el número de
células. El crecimiento es un componente esencial de la unción microbiana, ya que en la naturaleza
cualquier célula tiene un periodo de vida finito y la especie de mantiene como resultado del
crecimiento continuo de la población. La bacteria es una máquina sintética capaz de duplicarse a sí
40
misma. En este proceso intervienen infinidad de reacciones, cuya finalidad es generar una serie de
macromoléculas que permitan realizar el ensamblaje de las nuevas estructuras celulares de las
Página
células hijas, como pared celular, membrana citoplasmática, ribosomas, entre otros. En la mayoría
de los procariotes el crecimiento de una célula individual continúa hasta que se divide en dos células
nuevas, en un proceso denominado fisión binaria (formación de dos células a partir de una).
Durante el crecimiento celular de un microorganismo, llevado a cabo en un sistema de fermentación

tipo batch, puede obtenerse una curva de crecimiento típica (Figura 1) y pueden observarse las
distintas fases llamadas: latencia (a), exponencial (b), estacionaria (c) y muerte celular (d).
El crecimiento microbiano se traduce en un incremento en la masa celular, en

donde la velocidad de crecimiento, es el cambio en el número de células o
absorbancia (Abs), experimentado en unidad de tiempo. Durante el crecimiento de los
microorganismos, se generan una serie de productos, llamados metabolitos, que pueden clasificarse
como primarios y secundarios. Los primarios son aquellos que se forman durante la fase de
crecimiento exponencial y además se forman como parte del metabolismo energético de las células,
mientras que los metabolitos secundarios se forman casi al final de la fase exponencial de
crecimiento y son compuestos que no hacen parte del metabolismo energético de la célula. Como
ejemplos de metabolitos se encuentran etanol, proteasas, entre otras.
OBJETIVOS:
Realizar el seguimiento del crecimiento de un microorganismo (Bacillus subtilis) durante el tiempo

requerido, que permita construir una curva típica para un microorganismo.
Determinar la producción de un metabolito durante el crecimiento microbiano.

41
REACTIVOS Y EQUIPOS:
Página
Microorganismo Bacillus subtilis, caldo nutritivo, solución de ácido tricloroacético, caseína (leche),
espectrofotómetro, agitador orbital, centrífuga, baño de agua, erlenmeyer (250 mL), tubos de
ensayo (3), pipetas estériles de 1 y 5 mL, papel milimetrado.
PROCEDIMIENTO:
Sembrar el Bacillus subtilis en 100ml de caldo nutritivo y se lleva a agitador orbital (aprox. 100
r.p.m.). Tomar 2 mL de medio de cultivo (cada dos horas) y medir la absorbancia en un
espectrofotómetro (550-600 nm y registro en un papel milimetrado) hasta que el cultivo entre en fase
de muerte celular.
Para la determinación de la producción del metabolito (proteasas) durante el crecimiento celular, se

pasa el cultivo microbiano a tubos de ensayo de centrífuga, se centrifuga a 4.000 revoluciones por
minuto (rpm) durante 10 minutos. Se separa el sobrenadante del precipitado y se llevar el
sobrenadante al congelador, si la prueba no se va a realizar inmediatamente.
Para realizar la prueba:
Llenar 3 tubos de ensayo con 1 mL de solución de caseína o leche.
Tubo 1 + 1 mL de agua (blanco)
Tubo 2 + 1 mL de medio de cultivo microbiano libre de células
Tubo 3 + 1 mL de medio de cultivo microbiano libre de células, previamente sometido durante 2

minutos a 100ºC.
Llevar los tres tubos a baño de agua (30ºC) durante 30 minutos, finalmente adicionar ácido
tricloroacético (1 ml).
RESULTADOS
Es esta práctica se utilizará como método para determinar el crecimiento

microbiano, la medida de la densidad óptica, para ello se registrarán los
resultados obtenidos en la siguiente tabla:
Lecturas Horas de cultivo Absorbancia (nm)
2
42
3
Página
10
11
12
13
14
Reportar los datos obtenidos a partir de la acción del sobrenadante sobre

la proteína caseína.
GLOSARIO
CRECIMIENTO: incremento en el número de células.
CRECIMIENTO EXPONENCIAL: crecimiento de un microorganismo cuyo número de células se

duplica en un período constante de tiempo.
CULTIVO TIPO BATCH O MONOFÁSICO: cultivo microbiano que funciona como un sistema cerrado
de volumen constante.
FASE ESTACIONARIA: período que sigue al crecimiento exponencial cuando la velocidad de

crecimiento de la población es cero.
FASE LAG. Período anterior a la fase de crecimiento exponencial cuando las células pueden tener
un metabolismo activo pero aún no crecen.
PROTEASAS: enzimas que degradan proteínas por hidrólisis.

43
Página
Jagnow, G., David, W. Bitecnología. Introducción con experimentos. 1991.

Editorial Acribia. Zaragoza, España. 251p.
Madigan, M., Martinko, J., Prker, J. 2004. Brock. Biología de los

Microorganismos. Décima edición. Pearson Education S.A. Madrid. 1011p.
Martínez, M., Carrascal, A., Martínez, P. 1999 Manual de Laboratorio.

Introducción a la Biotecnología. Facultad de ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá. 81p.
44
Página
45
Página

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Manual de Laboratorio de Biotecnología. Facultad de Química Farmacéutica. UdeA.

MANUAL DE LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA

FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA

PRÁCTICA N°1: EXTRACCIÓN DE ADN VEGETAL 3

PRÁCTICA N°2: ELECTROFORESIS DE ADN Y PROTEÍNAS 6

PRÁCTICA N°3: CULTIVO DE CÉLULAS Y TEJIDOS VEGETALES 9

PRÁCTICA N°4: FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA CON LEVADURAS 14

PRÁCTICA N°5: OBTENCIÓN DE PENICILINA Y COMPROBACIÓN DE SU

PRÁCTICA N°6: OBTENCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO CON HONGOS 30

PRÁCTICA N°7: DEGRADACIÓN DE COLORANTES CON HONGOS

PRÁCTICA N°8: CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO Y OBTENCIÓN

PRÁCTICA N°1: EXTRACCIÓN DE ADN VEGETAL

En plantas y hongos la pared celular es la primera barreras para la extracción, es necesario

EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

 50 mM Tris- HCl (pH 8.0)

Cloroformo, alcohol isoamílico, iIsopropanol, etanol 70%.

 Centrifugar y eliminar el isopropanol.

Un valor menor de 1.8 indica contaminación por proteínas.

Tris: (hidroximetil amino metano) Es un tampón biológico. Su principal función es mantener el

Cloroformo: Solvente orgánico que se encarga de remover residuos de lípidos y fenoles en la

Cloruro de sodio: colabora para equilibrar las fuerzas iónicas.

Alcohol Isoamílico: antioxidante. Reduce o imposibilita la formación de interfases durante la

Etanol, Isopropanol: alcoholes. En presencia de sales (temperatura de aproximadamente –20

BIOLOGÍA MOLECULAR. 2002. U de A pág. 11-16

PRÁCTICA N°2: ELECTROFORESIS DE DNA Y DE PROTEÍNAS

La electroforesis se utiliza en el laboratorio para separar macromoléculas en solución, en forma

interacciones no covalentes. Las mezclas de DNAs de distinto tamaño se hacen migrar

Electroforesis de DNA en gel de agarosa:

Después de que el gel se enfríe y solidifique, retire cuidadosamente la peineta y la cinta de

Maniatis, T, Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Seventh

Corzo, J. Curso de doctorado “Electroforesis”. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular,

Electroforesis en Geles de Poliacrilamida. Métodos en Biología Celular. Universidad de Barcelona.

Electroforesis de DNA plasmídico en gel de agarosa. 2004. Tomado de:

Electroforesis de ácidos nucleicos en gel. Diagramas animados de técnicas y procesos bioquímicos.

Electroforesis en geles de agarosa. Introducción a la Biología Molecular y Celular. Departamento de

PRÁCTICA N°3: CULTIVO DE CÉLULAS Y TEJIDOS VEGETALES

La técnica consiste en tomar una sección de tejido vegetal (explante) y desinfectarlo

Concentración hormonal: una fitohormona es un mensajero químico vegetal secretado en un

Reglas generales para la acción hormonal en micropropagación:

Mayor concentración auxina / menor concentración citoquinina = raíz adventicia

Concentración auxina = concentración citoquinina = callo

Menor concentración auxina / mayor concentración citoquinina = tallo adventicio

Conocer la utilidad y el manejo del equipo básico, instrumentos y herramientas de un laboratorio de

REACTIVOS Y MATERIALES A EMPLEAR:

Ácido 2,4-Diclorofenoxiacético (2,4-D), 6-Benzilaminopurina (BA), Hipoclorito de Sodio, Alcohol

COMPOSICIÓN Y PREPARACIÓN DEL MEDIO MURASHIGE Y SKOOG

Constituyente Concentración de la Volumen de la

1. Preparación del medio de cultivo

Inducción de callos: preparar 60 ml de MS sin fitohormonas como medio control y 60 ml de MS con

Crecimiento: preparar 60 ml de MS sin fitohormonas como medio control y 60 ml de MS con 2,4-D (2

Llevar el volumen hasta con agua destilada.

Ajustar pH entre 5.7-5.8

Completar el volumen calculado.

Servir el medio en frascos de compota adicionando aproximadamente 20 ml

Adicionar el agar necesario para cada 20 mL.

Tapar los frascos con papel de aluminio y envolverlos en papel craft.

Esterilizar los medios de cultivo a una presión de 15 psi y a una temperatura

2. Proceso de desinfección del material vegetal

en la cabina de flujo laminar: