UNIVERSIDAD DE GRANADA

INSTITUTO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIÓN DEL AGUA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

Memoria presentada por la Licenciada en Biotecnología Dña. Imane Uad para aspirar al
grado Doctor por la Universidad de Granada

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VοBο de los Directores:

Fdo. Fdo. Fdo.

Dña. Concepción Calvo Saínz D. Jesús González López D. Maximino Manzanera
Catedrática de Universidad Catedrático de Universidad Investigador contratado
Dpto. de Microbiología Dpto. de Microbiología Ramón y Cajal
Universidad de Granada Universidad de Granada Instituto Universitario de
Investigación del Agua
Universidad de Granada

3
Editor: Editorial de la Universidad de Granada
Autor: Imane Uad
D.L.: GR 1225-2012
ISBN: 978-84-695-1168-8
4
 Esta Tesis Doctoral ha sido parcialmente subvencionada por la Agencia Española de

Cooperación Internacional (A.E.C.I.), por la empresa Repsol YPF mediante la financiación del

proyecto de investigación “Estudio de viabilidad del fuel del Prestige” y por el grupo de

investigación del PAI “Microbiología Ambiental (RNM270)”

5
6
Durante el periodo de la presente Tesis Doctoral se han realizado las siguientes publicaciones

y comunicaciones a congresos:

Publicaciones en revistas internacionales (Anexo II):

Uad, I., Silva-Castro, G. A., Pozo, C. González- López, J. and Calvo, C. (2010). Biodegradative
potential and characterization of bioemulsifiers of marine bacteria isolated from samples of
seawater, sediment and fuel extracted at 4000m of depth (Presige wreck). International
Biodeterioration and Biodegradation: 511-518.

Calvo, C., Manzanera, M., Silva-Castro, G.A., Uad, I., and González-López, J. (2009).
Application of bioemulsifiers in soil oil bioremediation processes. Future prospects. Sc. Total
Environ. 407: 3634-3640

Calvo, C. Silva-Castro, G. A. Uad, I., García Fandiño, C., Laguna, J. and González-López, J.
(2008). Efficiency of the EPS emulsifier produced by Ochrobactrum anthropi in different
hydrocarbon bioremediation assays. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 35: 1493–1501

Capítulos de libro

Calvo, C., Silva-Castro, G.A., Uad, I., Manzanera, M., Perucha, C., Laguna, J., GonzálezLópez,
J. 2010. Biostimulation combined treatments for remediation of diesel contaminated soil. In:
Environmental Toxicology III. (Eds V. Popov and C.A. Brebbia) ISBN: 978-1-84564-438-3.
WITpress. Southampton. UK.

Calvo, C., Silva-Castro, G.A., Uad, I., González-López, J. 2008. When can surfactants enhance
Hydrocarbons biodegradation in oil biotreatments?. Environmental Toxicology II (Eds A.G.
Kungolos, C.A. Brebbia, M. Zamorano) ISBN: 978-1-84564-114-6. WITpress. Southampton. UK.

Comunicaciones a congresos nacionales e internacionales:

Uad, I., Toledo, F.L., Pozo, C., Silva-Castro, G. A., González- López, J. y Calvo, C.
Caracterización de bacterias productoras de bioemulgentes aisladas de ambientes marinos.
XXI Congreso Nacional de Microbiología, Sevilla, 2007.

Calvo, C. Uad, I., Pozo, C., Silva-Castro, G.A., Manzanera, M., and González, J.
Characterization of oil Hydrocarbon degrading bacteria Isolated from samples of sediment,
Seawater and fuel extracterd at 4000 m of depth. 14th International bioremediation and
Biodeterioration symposium. Messina.Italy, 2010.

Uad, I., Nuñez-Lechado, M.C., Silva-Castro, G. A., Pozo, C., Manzanera, M., González- López,
J. y Calvo, C. Influencia de la salinidad y tiempo de incubación en la productividad y
actividad emulgente de los biopolímeros sintetizados por cepas de Halomonas aisladas de
fondos oceánicos. XXIII Congreso Nacional de Microbiología. Salamanca, 2011.

7
8
 A Abdelghani
A mis padres Mohammed y Fatima Z.
A herman@s Ikram, Abdellah y Omar

9
10
 AGRADECIMIENTOS

Ya han pasado años desde que un buen día llegué a Granada. Para hacer un balance resumido de lo
que han supuesto todos estos años para mi, he de decir en mi primer lugar que Granada se ha convertido sin
lugar a dudas en mi casa, mi otra casa. La experiencia que me llevo de todos estos años no podría ser mejor.
Creo que he aprendido muchas cosas, pero aún más importante es que he conocido a grandes amigos y a
grandes personas, algunas de las cuales las llevaré conmigo para siempre…
En primer lugar quiero agradecer a mis Directores de Tesis todo el apoyo y la ayuda que me han
ofrecido durante el desarrollo de este trabajo.
A la Dra. Concepción Calvo, le agradezco la oportunidad que me brindó para iniciar esta
investigación, la confianza que depositó en mí desde el primer momento para llevar a cabo este proyecto que
me entusiasmó y también su enorme amabilidad y disponibilidad en todo momento, sus sabios consejos, la
experiencia profesional que me ha transmitido y la dedicación y el cariño que me ha mostrado durante todo
este tiempo.
Al Dr. Jesús Gonzáles López, le agradezco por haberme hecho sentir parte de un grupo y, quisiera
aprovechar esta oportunidad para agradecerle el trato tan afectuoso que siempre me ha ofrecido.
En el Dr. Maximino Manzanera Ruiz he encontrado siempre una gran ayuda y orientación
científica. Sus conocimientos en el mundo de la genética y de la biología molecular han enriquecido de forma
considerable mi investigación. Gracias por ayudarme a resolver tantísimo problemas.
Muchas gracias por todo el tiempo dedicado a resolver mis consultas y dudas, y por la ayuda y el
apoyo que incondicionalmente me han demostrado a lo largo de la realización de esta Tesis Doctoral. Y sobre
todo, quiero agradecer a los tres su enorme calidad humana.
Agradezco enormemente el Dr. Antonio Luís Extremera, la oportunidad que me brindó de iniciar mi
actividad investigadora en el Instituto Universitario de Investigación del Agua de la Universidad de
Granada.
A las Dras. Clementina Pozo, Mª Victoria Martínez, Belén Rodelas, Belén Juárez y Mª Angustias
Rivadeneyra, de las que he recibido siempre un trato valioso y un generoso apoyo.
Aunque a veces el tiempo conlleva el olvido, espero en mi caso recordar siempre y con la misma
gratitud como hasta ahora, a todos mis compañeros y amigos que cuando empecé me acompañaban en el
laboratorio. Fuisteis unos grandes maestros y demostrasteis una enorme paciencia con la principiante:
Gracias a Lucia, por su amabilidad y gentileza, a Kadiya, Cinta, Jessica, Paqui, Marisa, Almudena, Chiara,
Fede, Camino, Juan Jesús, Ginés, Patricia, Paula, Rafael, Isabel, Alejandro, Ignacio, Luís, María por
vuestra colaboración y simpatía, por vuestra disposición y por hacerme el trabajo más agradable.
Quiero agradecer enormemente a la persona con la que compartí horas y horas y horas en el
laboratorio, con la que compartí momentos buenos y otros duros, la persona que me acompaño durante todos

11
estos años, mi compañera Andrea, Gracias por tu generoso apoyó, por tu ayuda y por animarme en cada
momento durante los 6 años, muchas gracias.
Quiero agradecer de manera muy especial el apoyo, la acogida y la amistad que me prestaron mis
amigas Mar y Carmen. Siempre recordaré los buenos momentos que hemos pasado juntas.
Por último pero como en los artículos, los más importantes, los verdaderos responsables de que hoy
esté aquí. A mis padres porque este es un buen momento para dejar por escrito mi agradecimiento por la
ilusión y el interés que siempre han manifestado por mi trabajo y por todo lo que conseguía, por los sacrificios
y esfuerzos que habéis realizado a lo largo de… siempre. Sois unos padres estupendos. Os quiero papa y
mamá…
Agradecer también desde estas páginas a toda mi familia, en especial a mi hermana KoKi con la que
he compartido tantas cosas, a Abdeljebar, a Abdelah-karim y Paqui por su generoso apoyo en todos los
momentos y por estar siempre a mi lado, a mi querido Omar, a Dina y Ahmad. A Mamakhadoj, Salwa,
Otman, Khalil, Ahmed y Adam por la alegría e interés que siempre me han transmitido. A todos los otros titos
y primos, por su apoyo y afecto.
A mi marido Abdelghani “mi Ghnino”, quien sin duda ha sido mi mayor apoyo, por la gran confianza
que ha depositado en mí, por haberme aguantado durante todo este tiempo, por su paciencia y apoyo que sin
cuyo generoso apoyo esta Tesis jamás hubiese visto la luz.
Si la vida son experiencias creo que aquí he vivido mucho. Si alguien me pregunta “¿Cómo fue la
experiencia de tu Tesis?”. Yo no podré más que responder, “Inolvidable”.
A todos… Muchas gracias.

Para Mohammed y Fátima Z. …

12
Investigar es ver lo que todo el mundo ha visto y pensar lo que nadie más ha pensado

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Albert von Szent-Györgyi

13
14
 ÍNDICE

ABREVIATURAS----------------------------------------------------------------------------------------------- 19
RESUMEN ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 21
1. INTRODUCCIÓN --------------------------------------------------------------------------------------- 23
1.1 Problemática de la contaminación con hidrocarburos-------------------------------------------- 25
1.2 Composición química del petróleo-------------------------------------------------------------------- 26
1.3 Biorremediación ------------------------------------------------------------------------------------------- 28
1.3.1 Microorganismos degradadores ----------------------------------------------------------------------- 31
1.3.2 Rutas metabólicas de la biodegradación ------------------------------------------------------------- 35
1.3.3 Genética de la biodegradación de hidrocarburos-------------------------------------------------- 38
1.3.4 Genes catabólicos para la degradación de los HPAs---------------------------------------------- 38
1.4 Exopolisacáridos (EPS)----------------------------------------------------------------------------------- 40
1.4.1 Descripción y concepto ---------------------------------------------------------------------------------- 40
1.4.2 Composición química de los exopolisacáridos ----------------------------------------------------- 41
1.4.3 Estructura de los exopolisacáridos -------------------------------------------------------------------- 42
1.4.4 Biosíntesis de los Exopolisacáridos ------------------------------------------------------------------- 43
1.4.5 Condiciones de cultivo para la producción de los EPS ------------------------------------------- 45
1.4.6 Funciones de los EPS microbianos -------------------------------------------------------------------- 45
1.4.7 Bioemulgentes --------------------------------------------------------------------------------------------- 46
1.4.8 Aplicaciones biotecnológicas de los EPS microbianos -------------------------------------------- 49
2. OBJETIVOS------------------------------------------------------------------------------------------------ 51
3. MATERIAL Y MÉTODOS ----------------------------------------------------------------------------- 55
3.1 Cepas bacterianas ----------------------------------------------------------------------------------------- 57
3.2 Medios de cultivo ----------------------------------------------------------------------------------------- 58
3.3 Antibióticos------------------------------------------------------------------------------------------------- 60
3.4 Conservación de microorganismos ------------------------------------------------------------------- 60
3.5 Genética y manipulación de ADN -------------------------------------------------------------------- 60
3.5.1 Construcción de librería de clones -------------------------------------------------------------------- 60
3.5.1.1 Plásmido utilizado ----------------------------------------------------------------------------------- 61
3.5.1.2 Aislamiento de ADN plasmídico: Método “Qiapreps”-------------------------------------- 61
3.5.1.3 Extracción rápida de ADN bacteriano total ---------------------------------------------------- 61
3.5.1.4 Aislamiento a gran escala de ADN bacteriano total------------------------------------------ 62
3.5.1.5 Transferencia de plásmidos por electroporación---------------------------------------------- 62
3.5.1.6 Restricción de ADN---------------------------------------------------------------------------------- 63
3.5.1.7 Desfosforilación de ADN plasmídico con fosfatasa alcalina ------------------------------- 64
3.5.1.8 Ligación de ADN------------------------------------------------------------------------------------- 64
3.5.1.9 Conservación de la librería de clones------------------------------------------------------------ 64
3.5.2 Electrofóresis de ADN en geles de agarosa --------------------------------------------------------- 64
3.5.3 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) -------------------------------------------------------- 65
3.5.3.1 PCR-16S------------------------------------------------------------------------------------------------- 65
3.5.3.2 PCR-GFP ----------------------------------------------------------------------------------------------- 66

15
3.5.4 Purificación y secuenciación de fragmentos de ADN -------------------------------------------- 66
3.5.5 Análisis filogenético -------------------------------------------------------------------------------------- 67
3.5.6 Construcción de árboles filogenéticos ---------------------------------------------------------------- 67
3.6 Estudio fenotípico----------------------------------------------------------------------------------------- 67
3.6.1 Metabolitos para microorganismos Gram positivos ---------------------------------------------- 68
3.6.2 Metabolitos para microorganismos Gram negativos --------------------------------------------- 69
3.7 Estudio del espectro-salino y crecimiento en salinidad ------------------------------------------ 70
3.8 Producción de exopolisacáridos (EPS) --------------------------------------------------------------- 70
3.8.1 Composición química de los EPS: Análisis colorimétrico---------------------------------------- 71
3.8.1.1 Contenido en carbohidratos totales -------------------------------------------------------------- 71
3.8.1.2 Contenido en proteínas ----------------------------------------------------------------------------- 72
3.8.2 Actividad emulgente ------------------------------------------------------------------------------------- 74
3.9 Degradación de hidrocarburos------------------------------------------------------------------------- 74
3.9.1 Crecimiento en medio sólido con HPA -------------------------------------------------------------- 74
3.9.2 Crecimiento en medio líquido con naftaleno ------------------------------------------------------- 75
3.9.2.1 Determinación de la cantidad óptima del disolvente para la extracción de naftaleno 75
3.9.2.2 Curva patrón de naftaleno ------------------------------------------------------------------------- 76
3.9.2.3 Extracción y cuantificación de naftaleno-------------------------------------------------------- 76
3.9.3 Crecimiento en presencia de crudo Kirkuk --------------------------------------------------------- 77
3.9.3.1 Extracción de crudo---------------------------------------------------------------------------------- 78
3.9.3.2 Determinación del contenido en hidrocarburos totales (TPH)----------------------------- 78
3.10 Ensayo catecol-dioxigenasa ----------------------------------------------------------------------------- 78
3.11 Programas estadístico empleados --------------------------------------------------------------------- 79
4. RESULTADOS -------------------------------------------------------------------------------------------- 81
4.1 CAPÍTULO I. CARACTERIZACIÓN FILOGENÉTICA Y FENOTÍPICA DE LAS CEPAS--
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 83
4.1.1 Caracterización filogenética de las cepas ------------------------------------------------------------ 83
4.1.1.1 Identificación filogenética de las cepas seleccionadas --------------------------------------- 83
4.1.1.2 Estudio de la relación evolutiva entre las cepas seleccionadas ---------------------------- 85
4.1.2 Caracterización fenotípica de las cepas -------------------------------------------------------------- 86
4.1.2.1 Utilización de metabolitos por las cepas seleccionadas ------------------------------------- 86
4.1.2.2 Perfiles metabólicos obtenidos -------------------------------------------------------------------- 87
4.1.2.3 Interrelación de los distintos perfiles metabólicos de las cepas objeto de estudio y sus
cepas tipo ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 89
4.1.2.4 Crecimiento en salinidad --------------------------------------------------------------------------- 93
4.2 CAPÍTULO II. CARACTERIZACIÓN Y PRODUCCIÓN DE BIOEMULGENTES
(EXOPOLISACÁRIDOS)--------------------------------------------------------------------------------------- 98
4.2.1 Características de los bioemulgentes sintetizados ------------------------------------------------- 98
4.2.2 Estudio de las propiedades emulgentes de los exopolisacáridos -----------------------------104
4.2.3 Índice de calidad bioemulgente-----------------------------------------------------------------------109
4.2.4 Análisis estadístico---------------------------------------------------------------------------------------111
4.3 CAPÍTULO III. DEGRARADACIÓN DE HIDROCARBUROS -------------------------------113
4.3.1 Degradación de hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPAs)-------------------------------113
4.3.1.1 Crecimiento en medio sólido con HPAs -------------------------------------------------------113

16
4.3.1.2 Relación entre las cepas y su utilización de los HPAs --------------------------------------114
4.3.1.3 Crecimiento en medio líquido con naftaleno -------------------------------------------------115
4.3.2 Degradación de crudo Kirkuk-------------------------------------------------------------------------120
4.3.2.1 Crecimiento en presencia de crudo Kirkuk ---------------------------------------------------121
4.3.2.2 Capacidad degradadora de las cepas -----------------------------------------------------------123
4.3.2.3 Relación entre los resultados obtenidos en los estudios de degradación de
hidrocarburos----------------------------------------------------------------------------------------------------125
4.4 CAPÍTULO IV. ESTUDIO DE GENES CATABÓLICOS ----------------------------------------127
4.4.1 Construcción de genoteca ------------------------------------------------------------------------------127
4.4.2 Selección de clones con potencial inserto para eliminación de aromáticos -----------------130
5. DISCUSIÓN GENERAL-------------------------------------------------------------------------------133
6. CONCLUSIONES ---------------------------------------------------------------------------------------145
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ---------------------------------------------------------------149
LISTA DE FIGURAS Y TABLAS --------------------------------------------------------------------------169
ANEXO I ------------------------------------------------------------------------------------------------------177
ANEXO II ------------------------------------------------------------------------------------------------------189

17
18
 ABREVIATURAS

ADN: ácido desoxirribonucleico

ARN: ácido ribonucleico
BSA: seroalbúmina bovina
dNTP: deoxinucleotido trifosfato
Amp: ampicilina
Tc: tetraciclina
MY: Moraine y Rogovin
MMS: medio mínimo marino sintético
TE: Tampón de elución
UFC: unidades formadores de colonias
HPAs: hidrocarburos policíclicos aromáticos (Polycyclic aromatic hydrocarbons)
TPH: hidrocarburos totales del petróleo (Total Petroleum Hydrocarbon)
PCR: reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)
P: poducción
Pr: proteínas
C: carbohidratos
t: tiempo de incubación
S: concentración de sales o salinidad
AE: actividad emulgente
E: emulsión
Ic: Índice de calidad bioemulgente
BE: bioemulgente
BS: biosurfactante
p/v: relación de peso por volumen
v/v: relación de volumen por volumen
p/p: relación de peso por peso
rpm: revoluciones por minuto
SDS: dodecilsulfato sódico
GFP: Green Fluorescent Protein
ác.: ácido
y col.: y collaboradores

19
20
 RESUMEN
Este proyecto de investigación presenta el estudio de 18 cepas bacterianas, aisladas de

muestras de agua y sedimentos marinos procedentes de la zona del hundimiento del

petrolero Prestige, así como de muestras de fuel que se encontraba en los tanques de

almacenamiento del pecio. Las muestras analizadas fueron obtenidas a 4.000 m de

profundidad por los equipos de operaciones marinas de Repsol YPF en septiembre de 2003. El

análisis de dichas muestras permitió el aislamiento de 133 cepas bacterianas de las cuales se

seleccionaron las 18 incluidas en la presente memoria de tesis doctoral debido a su potencial

biotecnológico en la biorremediación de ecosistemas contaminados con hidrocarburos. Así en

una primera aproximación se observó que estos microorganismos eran capaces de proliferar

en presencia de hidrocarburos y de producir exopolisacáridos con actividad emulgente.

Se realizó la caracterización fisiológica y molecular de los microorganismos objeto de

estudio y se determinó su eficacia para producir biopolímeros con actividad emulgente así

como su capacidad para crecer en presencia de diferentes hidrocarburos.

Los resultados obtenidos indicaron que las 18 cepas objeto de estudio pertenecieron a

los géneros Bacillus (siete cepas), Brevibacterium (una cepa), Halomonas (cuatro cepas),

Thalassospira (dos cepas), Marinobacter (una cepa), Pseudomonas (dos cepas) y Pseudoaltermonas

(una cepa).

El estudio fenotípico de dichos microorganismos puso de manifiesto la variabilidad

metabólica dentro de las cepas del género Bacillus. Por otro lado y dentro de esta

caracterización fisiológica, se estudió la tolerancia de las cepas a distintas concentraciones de

sales, demostrándose que las cepas de los géneros Bacillus, Brevibacterium, Pseudomonas y

Pseudoalteromonas proliferaban en un rango de salinidad comprendido entre 0,5 y 10% (p/v) de

sales, mientras que para las cepas pertenecientes a los géneros de Halomonas, Thalassospira y

Marinobacter, este efecto estaba comprendido entre el 0,5 y el 15% (p/v) de sales.

Asimismo se estudió la capacidad de estos microorganismos para producir

bioemulgentes tanto a nivel cuantitativo como cualitativo, obteniéndose producciones

superiores a 1g/l de bioemulgente con las cepas Bacillus thuringiensis W1, Bacillus pumilus W15,

F20 y S22, Brevibacterium casei F2, Halomonas alkantarctica W3, Halomonas variabilis W4 y W10,

Halomonas sp. W12, Thalassospira sp. W5 y W7, Marinobacter sp. W8, Pseudoalteromonas elyakovii

W18, Pseudomonas fluorescence S21 y Pseudomonas grimontii S24.

21
 Los biopolímeros producidos se caracterizaron por poseer una actividad emulgente

superior al 25% de emulsión frente a 7 sustancias hidrófobas. Con objeto de comparar la

eficacia de las cepas productoras y determinar las mejores condiciones de producción se

desarrolló un índice de calidad bioemulgente (Ic) que relacionara la productividad con la

actividad emulgente. La aplicación de este índice identificó a los bioemulgentes producidos

por Halomonas alkantarctica W3, Halomonas variabilis W4 y W10, Halomonas sp. W12 como los

poseedores de las mejores características bioemulgentes.

Con respecto al crecimiento de las 18 cepas seleccionadas en presencia de los

hidrocarburos policíclicos aromáticos (naftaleno, fenantreno, antraceno y pireno), se observó

que las cepas Bacillus thuringiensis W1, Bacillus pumilus W15, W16, F17 y F20, Brevibacterium

casei F2, Thalassospira sp. W5 y W7 y Marinobacter sp. W8 fueron las únicas capaces de

proliferar en presencia de estos cuatro compuestos aromáticos. Por otro lado, el crecimiento

en presencia de naftaleno en medio líquido mostró que las cepas más eficientes en la

degradación de naftaleno al 1% (p/v) fueron las cepas Halomonas variabilis W10 con 10% de

eliminación y Marinobacter sp. W8 con 14% de eliminación. Asimismo se demostró que B.

pumilus F17, Halomonas sp. W12, Pseudoalteromonas elyakovii W18 y Pseudomonas grimontii S24

fueron las cepas más eficientes para eliminar las distintas fracciones de crudo Kirkuk.

Asimismo y como base para el desarrollo de futuras herramientas biotecnológicas, en

el presente trabajo se inició el estudio de la caracterización de los promotores de uno de los

microorganismos incluidos en este trabajo, para su uso como modelo de búsqueda de

promotores que respondieran a señales de contaminación, en este caso a la presencia de

hidrocarburos policíclicos aromáticos. Para ello, se seleccionó la cepa Halomonas variabilis W10

por ser una cepa Gram negativa y similar al fondo que queríamos utilizar como herramienta

molecular. Se construyó una genoteca de clones para la búsqueda de promotores que

respondieran a la presencia de naftaleno, utilizando como fondo genético la cepa Escherichia

coli XL1Blue y utilizando como vector el plásmido p18GFP para futuras selecciones en base al

uso de citometría de flujo. La librería construida en este estudio presentó una variabilidad de

37,5% y algunos clones se identificaron por presentar promotores que se inducen en presencia

de de hidrocarburos policíclicos aromáticos. En la presente memoria de tesis doctoral se

presentan y se discuten los resultados obtenidos durante este trabajo de investigación.

22
11.. IIN
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DUUCCCCIIÓÓN
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23
24
Introducción

1.1 Problemática de la contaminación con hidrocarburos

En la actualidad, uno de los problemas medioambientales más preocupantes son los

vertidos de petróleo en el mar con la consiguiente contaminación de la costa (Gentili y col.,

2006). Los accidentes que provocan vertidos masivos, son espectaculares y reciben gran

atención y preocupación tanto de las autoridades como de la opinión pública, pero

afortunadamente ocurren en raras ocasiones (Swannell y col., 1996), y aunque representen

una cantidad importante del total de hidrocarburos contaminantes, se producen liberaciones

de menor entidad, debidas a operaciones rutinarias de trasiego, limpieza de buques y

embarcaciones, pequeños vertidos etc. que globalmente suponen una mayor contaminación

para el ecosistema marino (Head y Swannell, 1999). Así, cuando estas operaciones se efectúan

sin el control necesario dan lugar a una contaminación continua, progresiva y acumulativa,

que puede llegar a comprometer no solamente el equilibrio ecológico del medio receptor sino

también aquellas actividades humanas habituales en la zona (González-Doncel y col., 2008).

En 1967, el gran petrolero Torrey Canyon se hundió en la costa sur de Inglaterra,

contaminando 180 km de costas inglesas y 80 km de costas francesas, provocando un desastre

ecológico sin precedentes. Esto hizo que la comunidad científica, de forma dramática, centrara

sus esfuerzos en combatir el efecto de la contaminación (Atlas, 1981). En 1978 el Amoco Cadiz

descargó unas 220.000 toneladas de crudo a lo largo de la bahía de Morlaix en la costa

británica, tras zozobrar debido a un temporal (Gómez Gesteira y col., 2003). Años más tarde

en 1989, en la bahía Prince William Sound, el hundimiento del petrolero Exxon Valdez, liberó al

mar 37.000 toneladas de hidrocarburos (Swannell y col., 1996). En 1991 y 1993 se repetió el

desastre. Los petroleros Haven y Braer se hundieron frente a las costas italianas, liberando

140.000 toneladas de crudo el primero y en la costa de las Islas Shetland contaminando con

80.000 toneladas de petróleo el segundo. También se pueden citar ejemplos de derrames

deliberados, por ejemplo, durante la Guerra del Golfo en 1991, se vertieron en Kuwait 820.000

toneladas de fuel, lo que amenazó de gravedad el ecosistema de la zona y varias plantas de

desalado (Swannell y col., 1996). En España, sobre todo en el área de A Coruña, se han

producido 3 grandes desastres de este tipo. En 1972, la ruptura del casco del petrolero

Urquiola, produjo un vertido de 100.000 toneladas de crudo procedente de la zona del Golfo,

que afectaron a 215 km de costa. Posteriormente el hundimiento del petrolero Mar Egeo en

1992, en el exterior del puerto de A Coruña, provocó el derrame de 79.000 toneladas de crudo,

25
Introducción

que debido a los fuertes vientos contaminó rápidamente 200 km de costas. El tercer gran

desastre tuvo lugar el 13 de noviembre de 2002 con el hundimiento del petrolero Prestige

(Gómez Gesteira y Dauvin, 2005; Del Corral y col., 2005).

Existe un listado de artículos que detallan los efectos nocivos que el petróleo o alguno

de sus componentes o derivados tienen sobre el medio ambiente y sobre los organismos vivos

(Gómez Gesteira y col., 2003; Varela y col., 2006; Alonso-Álvarez y col., 2007; Banks y col.,

2008; Lobon y col., 2008; Martin-Skilton y col., 2008; Sanpera y col., 2008; Joly-Turquin y col.,

2009), incluso sobre la salud de aquellas personas que colaboran en las tareas de limpieza de

los grandes desastres, como los grandes derrames de crudo (Rodríguez-Trigo y col., 2007).

Los microorganismos con capacidad de degradar los hidrocarburos del petróleo están

presentes en la naturaleza. Es por este motivo por el que se les considera como una

herramienta útil en el tratamiento y limpieza de zonas afectadas con derrames de petróleo

(Harayama y col, 2004; Igwo-Ezikpe y col., 2010).

1.2 Composición química del petróleo

El petróleo, así como sus derivados, es un conjunto complejo de compuestos químicos

en el que coexisten fases sólidas, líquidas y gaseosas (Henry, 1998). En la bibliografía existen

varias publicaciones acerca de la composición del petróleo y a medida que se mejoran las

técnicas analíticas de separación e identificación, se consigue identificar nuevos componentes

(King, 1988; Postanogova, 1991; Henry, 1998). Está compuesto básicamente por carbono e

hidrogeno, y algunos hetero-átomos, principalmente nitrógeno, azufre y oxígeno (Alajbeg y

col., 2000), formando hidrocarburos; moléculas altamente reducidas y con un gran potencial

químico (kenney y col., 2002).

Los compuestos del petróleo que pueden ser separados mediante cromatografía de

adsorción se dividen en cuatro fracciones: saturados, aromáticos, asfaltenos y resinas

(Harayama y col., 1999). Además, no todos los tipos de crudo son iguales, la composición

concreta de cada tipo de petróleo varía en función de la combinación de sus condiciones de

formación (Fernández-Valera y col., 2008)

 Hidrocarburos saturados
Los hidrocarburos saturados son aquellos que no poseen dobles enlaces (Figura 1.1).

26
Introducción

Alcanos lineales Alcanos ramificados

Figura 1.1. Algunos ejemplos de hidrocarburos saturados que forman parte de la mezcla de
hidrocarburos de petróleo. Se muestran ejemplos de hidrocarburos tanto lineales como ramificados.

Los hidrocarburos se dividen en función de su estructura química en alcanos o

parafinas y cicloalcanos o naftalenos. Los alcanos se pueden dividir a su vez en ramificados o

no ramificados en función de su estructura química lineal y están definidos por la formula

general CnH2n+2 (Harayama y col., 1999). Los cicloalcanos tienen al menos un anillo de átomos

de carbono, aunque el número de anillos es muy variable. Su formula general es CnH2n y la

presencia a lo largo de sus estructura de sustituyentes del tipo alquilo es relativamente común

(Haramaya y col., 1999).

 Hidrocarburos aromáticos
Los hidrocarburos aromáticos son aquellos que poseen uno o más anillos aromáticos, y

pueden estar sustituidos, o no, por radicales alquilo (Figura 1.2). El petróleo incluye

compuestos que poseen de uno a cinco anillos aromáticos. Estos compuestos son más estables

que los cicloalcanos, debido a la compartición de sus electrones por los enlaces (Eweis y col.,

1999). El benceno es el más simple, y junto al tolueno, el etilbenceno y los tres xilenos son

conocidos como BTEX, un conjunto de compuestos relativamente solubles en agua, y por

tanto son de los más móviles de la gasolina. Además estos compuestos poseen un potencial

contaminante elevado, especialmente el benceno al ser cancerígeno (Eweis y col., 1999), y por

ello se suelen utilizar como indicadores de contaminación.

Los hidrocarburos con varios anillos aromáticos también conocidos como

poliaromáticos (HPA), como el antraceno y el fenantreno, son productos de diversas

operaciones industriales a altas temperaturas como el refinado del petróleo. En general son

poco solubles en agua y poco volátiles, y los incrementos en la masa molecular y el número de

anillos, decrece aun más su volatilidad y solubilidad.

27
Introducción

Naftaleno Antraceno Fenantreno

Figura 1.2. Algunos ejemplos de hidrocarburos presentes en la fracción aromática del petróleo.

 Resinas y asfaltenos
La fracción del crudo conocida como resina y asfaltenos, a diferencia de las anteriores,

contiene compuestos polares no hidrocarbonados (Haramaya y col., 1999). Son compuestos en

general de alto peso molecular que además de carbono e hidrogeno, contienen oxigeno,

nitrógeno y azufre (Figura 1.3). Su estructura puede incluir ramificaciones policíclicas

aromáticas, incluso en ocasiones forman complejos con metales pesados como níquel y

vanadio. Son compuestos recalcitrantes, debido a su insolubilidad y a que poseen grupos

funcionales que les protegen de ataques microbianos, como las estructuras de anillos

aromáticos (Eweis y col., 1999). Para discriminar entre resinas y asfaltenos se utiliza el

parámetro de solubilidad en disolventes similares al n-heptano. Los asfaltenos son insolubles,

mientras que las resinas, son compuestos que se disuelven en este tipo de disolventes

(Haramaya y col., 1999).

Benzofurano

Pirrol
Asfalteno
Figura 1.3. Ejemplos de asfalteno y resinas.

1.3 Biorremediación
La biorremediación es una tecnología que utiliza el potencial metabólico de los

microorganismos (su capacidad de degradación) para recuperar los ecosistemas acuáticos y/o

terrestres contaminados (Watanabe, 2001). También se puede definir como un grupo de

tratamientos, para la remediación de un ecosistema, que aplica sistemas biológicos para

catalizar la mineralización o transformación de compuestos químicos en otros menos tóxicos

(Atlas y Unterman, 1999; Hughes y col., 2000).

28
Introducción

La biorremediación de contaminantes orgánicos es posible gracias a que la mayoría de

estos contaminantes son biodegradables e incluye los procesos que llevan su transformación

en productos menos tóxicos o sin toxicidad. La microbiota autóctona del ecosistema

contaminado suele poseer la capacidad de biodegradar el contaminante y en general la propia

contaminación induce el enriquecimiento de las poblaciones degradadoras (Singh y col.,

2008). En concreto, cuando se refiere a petróleo, la biorremediación consiste en un proceso

para acelerar la degradación normal de los contaminantes, es decir en una solución natural

para que los contaminantes causen el menor impacto ecológico posible, dado el alto número

de compuestos que forman el petróleo y su alta complejidad estructural, la biodegradación

del petróleo produce un incremento en la resistencia a una posterior biodegradación de la

mezcla residual (Atlas, 1995a; Esin y Aiten, 2011). El crudo de petróleo no llega nunca a

degradarse completamente, y siempre deja algunos residuos complejos. Sin embargo, estos

residuos, que contienen principalmente asfaltenos, tienen una toxicidad muy baja y terminan

convirtiéndose en residuos inertes sin efecto ecológico (Atlas, 1995b; Franco y col., 2004).

Existen varias clasificaciones que dividen la biorremediación en tipos distintos en función de

una serie de parámetros.

Si atendemos al lugar en el que se aplica el proceso de biorremediación, existen dos

modelos diferentes. El primero de ellos, es aquel en el que la acción se lleva a cabo en el

mismo lugar, sin apenas modificar el ambiente. Este proceso es conocido como

biorremediación in situ e incluye como ventajas su bajo coste de transporte, la escasa

modificación del entorno y baja generación de residuos. Presenta como inconvenientes, el bajo

control de variables y la dilución de biomasa y nutrientes, aunque existen algunos métodos

para evitar estos problemas, como la inmovilización de biomasa (Gentili y col., 2006). Si se

traslada el material contaminado a un lugar distinto, se dice que la estrategia llevada a cabo es

ex situ. A pesar de que se controlan las variables, los elevados costes de transporte y de

equipamiento hacen que estos métodos sean menos utilizados que los que se realizan in situ.

Las técnicas de biorremediación pueden utilizar dos tipos de herramientas, la

bioestimulación y el bioaumento. La bioestimulación es considerada en forma casi unánime

como un procedimiento casi esencial para mejorar los niveles de eliminación de los

contaminantes (Delille y col., 2008; Nikolopoulou y Kalogerakis, 2009). Por el contrario el

bioaumento es la introducción en el medio natural de microorganismos que degraden

29
Introducción

específicamente los compuestos contaminantes (Bouchez y col., 2000), y puede incluir la

estimulación ex situ de biomasa nativa, la introducción de organismos o de cultivos mixtos de

cepas silvestres no nativa, que degraden o co-metabolicen el contaminante, o la introducción

de cepas modificadas genéticamente (Scow y Hicks, 2005).

Como la biorremediación está limitada por la biodegradación es importante

diferenciar algunos conceptos, como biotransformación y biodegradación o mineralización.

Con el término “mineralización” se define la transformación de un compuesto en CO2, agua y

formas inorgánicas por la acción de los seres vivos, por lo que implica la alteración estructural

de un compuesto y la formación de intermediarios metabólicos antes de la oxidación final. La

“biotransformación” es el proceso a través del cual un microorganismo modifica un

compuesto sin llegar a mineralizarlo, de manera que pueden llegar a formarse productos

intermedios no mineralizables, en algunos casos más tóxicos y perjudiciales que la sustancia

de partida (Ramos y Rojo, 1990).

Hay numerosos factores que pueden limitar la biodegradación, como la temperatura,

el contenido y disponibilidad de oxígeno, el pH, el contenido de nutrientes, etc. Se considera

que la biodegradación en el medio ambiente está restringida, fundamentalmente por i). La

población autóctona de microorganismos, ii). La biodisponibilidad del compuesto a degradar,

iii). La toxicidad de los metabolitos.

La biorremediación tiene también inconvenientes y limitaciones. Por ejemplo, la

biodegradación incompleta puede generar intermediarios metabólicos inaceptables, con un

poder contaminante similar o incluso superior al producto de partida. Por otra parte, algunos

compuestos, son resistentes o inhiben la biorremediación. El tiempo requerido para un

tratamiento adecuado puede ser difícil de predecir y el seguimiento y control de la velocidad

y/o extensión del proceso es laborioso.

La biodegradación de hidrocarburos por poblaciones naturales de microorganismos es

una de las vías por las cuales se elimina el crudo de zonas contaminadas. Las cepas

bacterianas capaces de degradar algunos de los compuestos presentes en el petróleo son

ubicuas en la naturaleza. Es por este motivo que la biorremediación se considera una

herramienta útil en la limpieza de derrames de petróleo. Sin embargo estos microorganismos

dependen de diversos nutrientes para su supervivencia (Leahy y Colwell, 1990). A pesar de

que los requerimientos son diferentes en función del tipo de microorganismo de que se trate,

30
Introducción

todos necesitan nitrógeno, fósforo y carbono. En la descomposición del fuel, la fuente de

carbono no representa ninguna limitación ya que proviene de las propias moléculas orgánicas.

Existe cierta confusión y conflicto cuando se analiza la limitación de la biodegradación de

petróleo debido a la disponibilidad de nitrógeno y fósforo en agua de mar. Mientras que un

gran número de investigadores han afirmado que se trata de nutrientes limitantes (Head y

Swannell, 1999); aunque con distintas conclusiones a cerca de la proporción C/N, C/P idónea,

otros han llegado a la conclusión opuesta, debido a la baja solubilidad de los hidrocarburos

que imposibilita que se dé una relación C/N o C/P desfavorable (Atlas, 1981).

Además de estos factores nutricionales, existen varias variables ambientales que

influyen en la degradación de los contaminantes orgánicos, tanto en sistemas terrestres como

acuáticos. Estas variables incluyen la temperatura, pH, salinidad y, en particular la

disponibilidad de oxígeno. Entre los factores fisicoquímicos, se incluyen aquellas propiedades

del contaminante, que pueden afectar la biodegradación. La composición y estructura química

del contaminante (tipo de compuesto, elementos químicos constituyentes, grado de

ramificación, grado de insaturación, naturaleza y efecto de los sustituyentes, peso molecular,

etc.), la concentración y sus propiedades físicas como: solubilidad, viscosidad, volatilidad y

densidad, determinarán la interacción del contaminante con la comunidad microbiana

presente (Eweis y col., 1999). En aquellos casos en los que la concentración de hidrocarburos

es demasiado elevada se produce una reducción en la cantidad de oxígeno y nutrientes

disponibles. Esto crea una situación de estrés, para los microorganismos, que puede reducir

su capacidad para degradar los hidrocarburos.

1.3.1 Microorganismos degradadores

La contaminación del ambiente marino con hidrocarburos es uno de los problemas

mundiales más frecuentes (Alquati y col., 2005). Muchos microorganismos han sido capaces

de evolucionar para adquirir la capacidad de utilizar las moléculas de hidrocarburos como

fuente de carbono y energía (Yakimov y col., 2007). A mediados del siglo XX se desarrollaron

las primeras investigaciones encaminadas a estudiar el potencial de los microorganismos para

biodegradar contaminantes (Zobell, 1946; Davis, 1956). Estas investigaciones proporcionaron

una base sólida de conocimientos acerca de la biodegradación de hidrocarburos,

especialmente de alcanos y se identificaron una gran cantidad de microorganismos capaces de

utilizar estos compuestos orgánicos altamente reducidos.

31
Introducción

Se ha descrito que las bacterias marinas degradadoras de hidrocarburos pertenecen a

más de 20 géneros distribuidos a través de varios grupos: Alfa-, Beta-, y Gamma-

proteobacteria, Gram positivas, Flexibacter, Citofaga, Bacteroides (Gauthier y col., 1992;

Yakimov y col., 2007; van Beilen y Funhoff, 2007; Kodama y col., 2008).

El género Pseudomonas es un grupo de bacterias gram negativas que se encuadran

dentro del grupo γ-proteobacterias. Se han aislado bacterias de este género tanto en suelos

limpios como en suelos contaminados por productos biogénicos y xenobióticos. También son

microbiota predominante en la rizosfera y en la filosfera de plantas. Del mismo modo, se han

aislado de ambientes acuáticos, tanto de agua dulce como de aguas marinas. Este género es

uno de los más proclives a la degradación de compuestos orgánicos, especialmente cepas de la

especie Pseudomonas putida. El amplio potencial catabólico de los componentes del género

viene dado en muchos casos por la presencia de determinantes plasmídicos y transposones

autotransmisibles. Además de su uso en biodegradación las especies del género Pseudomonas

se emplean en distintos procesos industriales. La posición taxonómica de las distintas especies

del género se encuentra sujeta a revisión. Además, las cepas de este género han sido descritas

por numerosos autores por su capacidad de utilizar los hidrocarburos policíclicos aromáticos

(Darvishi y col., 2011). Asimismo el género Pseudoalteromonas presenta un grupo de bacterias

aeróbicas Gram negativas aisladas de ambientes marinos. Este género fue descrito por

primera vez por Zobell y Upham (1944), además Hedlund y Staley (2006) describieron la

identificación de una cepa del género Pseudoalteromonas con capacidad de crecer con

hidrocarburos policíclicos aromáticos.

Asimismo, se han identificado cepas capaces de degradar hidrocarburos,

especialmente, alcanos pertenecientes a los género Bacillus, Geobacillus y Thermus (Meintanis y

col., 2006; van Beilen y Funhoff, 2007). El género Bacillus presenta el grupo de bacterias bacilos

Gram positivas presentes en hábitat terrestres y agua dulce asi como se encuentran

ampliamente distribuidos en ambientes marinos (Oguntoyinbo, 2007). Los microorganismos

marinos de este género son bacterias halotolerantes capaces de propagar en condiciones

marinas (Oguntoyinbo, 2007). Yousefi-Kebira y col (2009) caracterizaron una cepa nueva del

género Bacillus con capacidad de degradar el diesel.

El género Brevibacterium es un grupo de bacterias Gram positivas que fue descrito por

primera vez por Breed (1953). Las especies de este género fueron aislados de distintos hábitat

32
Introducción

(Gavrish y col., 2004; Lee, 2006). Pavitran y col (2004) describieron una cepa DSM20657

identificada como Brevibacteriun casei que estaba implicada en la degradación de

hidrocarburos.

El género Halomonas incluye las bacterias halófilas moderadas y las bacterias

halotolerantes, la mayoría de estos microorganismos fueron aislados tanto de ambientes

terrestres como ambientes marinos e hipersalinos. Poli y col (2007) describieron una especie

nueva del género Halomonas con capacidad de producir exopolisacáridos. Algunas cepas

pertenecientes a los géneros Pseudoalteromonas y Halomonas fueron aisladas de ambientes

salinos y presentaron alta capacidad de degradar y hidrocarburos (Martinez-Checa y col.,

2007).

El género Marinobacter es un grupo representante de las bacterias marinas Gram

negativas, este género fue descrito por primera vez por Gauthier (1992), este grupo fue

descrito también como género de especies degradadoras de hidrocarburos. Roh y col (2008)

describieron una cepa degradadora de HPAs perteneciente al género Marinobacter, aislada de

agua de mar con capacidad de proliferar en presencia de un rango de concentración de NaCl

de 1-25% (p/v). Asimismo, el género Thalassospira presenta el grupo de bacterias marinas

Gram negativas, este género fue descrito por Liu y col (2007), por Kodama y col (2008) y por

Zhao y col (2010) como un grupo de bacterias degradadoras de hidrocarburos policíclicos

aromáticos.

Entre los microorganismos eucariotas, muchos hongos y levaduras y algunas algas y

cianobacterias han sido descritos como degradadores de hidrocarburos (van Beilen y col.,

2003). En consecuencia se puede afirmar que muchos microorganismos poseen la capacidad

de utilizar diferentes compuestos contaminantes como única fuente de carbono y se

encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza. Estos se encuentran sin embargo en

bajas concentraciones en áreas no contaminadas y se incrementan en ambientes sometidos a

impactos crónicos del contaminante (Madigan y col., 2004).

Por otro lado, numerosos estudios basados en técnica no dependientes de cultivo

encaminadas a analizar los cambios en la estructura de las comunidades microbianas en

ambientes marinos afectados por derrames de petróleo han demostrado que tras la llegada del

hidrocarburo, la diversidad dentro de la comunidad microbiana puede ser substancialmente

reducida debido a una fuerte selección de un número limitado de especies degradadores de

33
Introducción

hidrocarburos (Vila y col., 2010, Röling y col., 2002; McKew y col., 2007). Principalmente

pertenecientes a la clase Gamma-proteobacterias. (Yakimov y col., 2007).

La mayoría de los sistemas de biorremediación en aguas marinas están desarrollados

para condiciones de aerobiosis. No obstante, la transferencia de oxígeno en el medio puede no

ser suficiente para mantener el metabolismo, por lo que la degradación anaerobia de los

hidrocarburos puede alcanzar una importancia relativamente considerable (Head y Swannell,

1999).

En ecosistemas marinos, las bacterias constituyen un componente esencial en la cadena

trófica, las cuales a través de su interacción con otros seres, modifican los ambientes, y llegan

a ser capaces de crecer en ambientes contaminados. En sedimentos marinos, las bacterias

juegan un papel ecológico dentro del ecosistema de gran importancia, ya que pueden

degradar compuestos contaminantes de origen orgánico (Liu y col., 2009).

La capacidad de las comunidades bacterianas para biodegradar compuestos en forma

natural está limitada por factores ambientales como el oxígeno molecular y los nutrientes

(fosfato, amonio, nitrato, nitrito y compuestos orgánicos del nitrógeno). Sin embargo, diversos

autores han encontrado la degradación de petróleo en condiciones que no son aptas para el

desarrollo bacteriano (Michaud y col., 2004).

La biodegradación de una mezcla de hidrocarburos de una zona contaminada con

petróleo depende de la especificidad metabólica de los microorganismos presentes en la zona

y de la regulación de la misma en presencia de diferentes sustratos. La inducción y

especificidad del metabolismo de compuestos aromáticos puede tener una gran importancia

en la biodegradación de estos compuestos, mientras que la co-oxidación puede ser el principal

mecanismo para la limpieza de la zona contaminada con hidrocarburos de petróleo (Baldwin

y col., 2005).

Aunque la mayoría de los hidrocarburos contaminantes se encuentran en el ambiente

formando parte de mezclas complejas, los estudios de biodegradación se centran,

generalmente, en cada compuesto de forma individual. Las bacterias aisladas de estas zonas,

como Pseudomonas aeruginosa, Weeksella sp., Acinetobacter calcoaceticus, Burkholderia cepacia,

Xylella fastidiosa y Rhodococcus sp., son generalmente, especies frecuentes en zonas

contaminadas aunque pueden presentar algunas características, como la resistencia al

34
Introducción

vanadio, que son, probablemente una adaptación a la presencia del contaminante (Yuste y

col., 2000; Röling y col., 2002).

Poco se sabe de las poblaciones microbianas involucradas en la eliminación de

hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPAs) de los ambientes marinos contaminados con

mezclas complejas de hidrocarburos sin embargo, recientes estudios sugieren que el género

Cicloclasticus podría desempeñar un papel importante (McKew y col., 2007). En un estudio

previo sobre la biorremediación del fuel del Prestige se obtuvo un consorcio de bacterias

marinas degradadoras de fuel (UBF) que originó una gran degradación de las fracciones

alifáticas y aromáticas del fuel de Prestige (Fernández-Álvarez y col., 2006, 2007).

1.3.2 Rutas metabólicas de la biodegradación

La mayoría de los componentes del crudo de petróleo son biodegradables. Los

hidrocarburos se diferencian en su susceptibilidad a la degradación microbiana. Los alcanos

lineales son considerados compuestos del crudo de petróleo con mayor susceptibilidad a la

biodegradación. Se ha demostrado que existe degradación microbiana incluso por encima de

C44, en general, los compuestos más susceptibles son los saturados, seguidos de los aromáticos

ligeros y por último los aromáticos de alto peso molecular y los compuestos polares, que

muestran tasas muy bajas de degradación (Colwell, 1977; Leahy y Colwell, 1990).

Además, el petróleo, posee moléculas con cierta resistencia a la biodegradación, como

son los compuestos con níquel o con vanadio, y la concentración de estos varía en función de

cómo ha sido generado cada tipo concreto de crudo de petróleo, por ejemplo, de la

temperatura a la que es generado y expulsado de las rocas (Head y col., 2003). Este no es un

orden universal, ya que algunos autores han demostrado en casos concretos distintos grados

de degradación diferentes. Por ejemplo, existe una mayor degradación de naftaleno que de

hexano en sedimentos, o una importante biodegradación de alquiloaromáticos antes de

observar degradación de alcanos lineales en algunos sedimentos marinos (Leahy y colwell,

1990).

Se debe considerar asimismo, que la presencia de alcanos con un número reducido de

carbonos, generalmente entre C5 y C10, en altas concentraciones, inhibe la biodegradación del

resto de compuestos, ya que actúan como potentes solventes apolares rompiendo la

membrana lipídica de los microorganismos.

35
Introducción

 Metabolismo de los alcanos

La degradación de alcanos llevada a cabo por microorganismos, puede tener lugar a

través de rutas monoterminales, subterminales o diterminales (Sharma y Pant, 2000).

Generalmente, la degradación de alcanos comienza con la activación mediante la oxidación

del carbono terminal, obteniendo el correspondiente alcohol primario y que posteriormente es

oxidado por una alcohol y aldehído deshidrogenasa (Figura 1.4). Los ácidos grasos obtenidos

entran en el metabolismo general mediante procesos de β-oxidación.

Algunos alcanos de cadena corta y excepcionalmente alcanos de cadena media,

pueden ser degradados además a través de la oxidación del carbono en posición subterminal.

El alcohol secundario es oxidado a una cetona, y posteriormente a través de una

monooxigenasa a un éster. El éster es hidrolizado por una esterasa a un alcohol y ácido graso.

En algunos casos muy concretos, los dos carbonos terminales del alcano son oxidados para

obtener ácidos dicarboxílicos (van Beilen y col., 2003).

Alc ano monooxig enas a

s ubterminal

Alc ano-
1-monooxig enas a Alc ohol des hidrog enas a

Alc ohol des hidrog enas a

Monooxig enas a de
Aldehido des hidrog enas a
B aeyer-V illig er

ω- monooxig enas a de
ác ido gras o
E s teras a

Alc ohol des hidrog enas a

β-oxidación
Aldehido des hidrog enas a
C arbono y energía

Rutas de degradación de alcanos a través de las vías de oxidación terminal, subterminal y

biterminal. Esquema adaptado de van Beilen y col. (2003).

Dependiendo de la longitud de la cadena del alcano, se requieren sistemas enzimáticos

diferentes y especializados para poder llevar a cabo la primera de las oxidaciones del sustrato

y comenzar el proceso de biodegradación. Esquematizando, los alcanos entre metano y

butano son oxidados por enzimas del tipo metano monooxigenasa, los alcanos entre C5 y C16

(n-pentano a n-hexadecano) son degradados por enzimas integrales de membrana, con hierro

36
Introducción

en forma o hemo, o del tipo citocromo P450, y los alcanos por encima de C17, son oxidados por

un sistema enzimático no conocido aún en profundidad (Rojo, 2009). Los rangos de sustratos

de estos sistemas enzimáticos se solapan y a menudo incluyen diferentes grupos de alcanos

(van Beilen y Funhoff, 2007).

 Metabolismo de los aromáticos

Los hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPAs) se degradan muy lentamente,

posiblemente por su baja solubilidad, su naturaleza inhibitoria y por la elevada energía de

resonancia de sus estructuras su degradación ocurre a partir de la ruptura del anillo.

En las últimas décadas se ha estudiado extensamente la ruta biodegradativa del

naftaleno en bacterias pertenecientes al género Pseudomonas y de forma más concreta en la

especie Pseudomonas putida. En estos organismos, los genes degradativos (a menudo

denominados genes nah) se encuentran localizados en dos operones: la vía degradativa

superior que codifica para la conversión de naftaleno a salicilato, y la vía degradativa inferior

que codifica para la transformación de salicilato a metabolitos centrales vía catecol (Figura 1.5)

(Smith, 1990).

Figura 1.4. Ruta metabólica de degradación de naftaleno por Pseudomonas aeruginosa (Smith,
1990). El último paso en la degradación de poliaromáticos finaliza en ciclo de ácidos tricarboxílicos
(CAT) vía catecol como compuesto intermediario.

La reacción inicial en la degradación de naftaleno es catalizada por un sistema

enzimático multi-componente que agrega dos átomos de oxígeno al anillo aromático para

formar cis-1,2-dihidroxi-1,2-dihidronaftaleno. Este sistema enzimático consiste en una

reductasa, una ferredoxina y un componente catalítico oxigenasa. El componente catalítico,

37
Introducción

llamado naftaleno 1,2-dioxigenasa (NDO), es un hexámero α3β3. La subunidad α de la NDO

(NDOα), contiene el sitio activo y la subunidad β más pequeña quizás tenga solamente un rol

estructural (Boyd y col., 2001).

1.3.3 Genética de la biodegradación de hidrocarburos

Las dioxigenasas responsables de la primera reacción de la oxidación aerobia de

naftaleno presentan muchas similitudes dentro de un mismo género, lo que sugiere que

presentan un origen evolutivo común, aunque distante. Además se considera que las

dioxigenasas de diferentes géneros y especificidades tienen un origen independiente (Xia y

col., 2005).

Más recientemente se han comenzado a caracterizar las rutas biodegradativas en otros

géneros de bacterias capaces de degradar HPAs de bajo peso molecular, diferentes de

Pseudomonas. En algunos casos, los genes biodegradativos clonados a partir de estas bacterias

muestran secuencias con muy baja homología con los genes tipo nah característicos de

Pseudomonas, sugiriendo un origen diferente de estos genes o una divergencia temprana a

partir de un ancestro común, este es el caso de los genes clonados a partir de especies de

bacterias Gram positivas como por ejemplo Rhodococcus o a partir de bacterias marinas como

Cycloclasticus (Uz y col., 2000). Existe además evidencia que en algunas bacterias

degradadoras de naftaleno, como Ralstonia sp. U2, Comamonas testosteroni o Rhodococcus, la

ruta biodegradativa no ocurre utilizando el catecol como intermediario, sino gentisato (Zhou

y col., 2001). La biodegradación de HPAs de alto peso molecular también está siendo

estudiada. Estos compuestos son en general más persistentes en el ambiente, debido a una

mayor hidrofobicidad y a una mayor estabilidad molecular que los HPAs de dos o tres anillos,

se han aislado varias bacterias con la capacidad de degradar HPAs de alto peso molecular,

aunque en muchos casos la biodegradación de estos compuestos es consecuencia de un

proceso de cometabolismo (Kanaly y Harayama, 2000).

1.3.4 Genes catabólicos para la degradación de los HPAs

Muchos contaminantes ambientales son degradados eficientemente por

microorganismos, sin embargo otros persisten y constituyen un riesgo a la salud pública. En

algunas instancias, la persistencia es una consecuencia del inadecuado potencial catabólico de

los microorganismos disponibles. La tecnología de la construcción de librería de clones

aunada a un sólido conocimiento de las vías catabólicas y de la fisiología microbiana, capacita

38
Introducción

el desarrollo experimental de actividades nuevas o mejoradas sobre esos contaminantes (Atlas

y col., 2006).

Los microorganismos constituyen el mayor reservorio de diversidad genética en

nuestro planeta. La biotecnología puede ayudar a remediar esta situación mediante el

desarrollo de técnicas biológicas para reciclar, desintoxicar o mineralizar aquellos compuestos

que por su persistencia puedan alterar el equilibrio ecológico de la naturaleza. Para progresar

en el desarrollo de estas técnicas primeramente es necesario identificar los compuestos que

resisten en los actuales sistemas biológicos de tratamiento de residuos, y posteriormente

proponer nuevos mecanismos de biodegradación basados en un mejor conocimiento de su

estructura química (Uchiyama y col., 2007).

Asimismo, se deben conocer las rutas degradativas existentes en los diferentes

microorganismos conocidos y los sucesivos pasos por los que el compuesto inicial se

transforma en los productos finales. Entre los microorganismos capaces de crecer a expensas

de compuestos aromáticos como fuente de carbono y energía se encuentran muchas bacterias

aerobias y anaerobias facultativas, algunas levaduras y ciertos hongos. Todos estos

organismos asimilan dichos compuestos a través de vías catabólicas que convergen en las

rutas centrales del metabolismo. Los genes catabólicos para la degradación de HPAs

generalmente se encuentran codificados en plásmidos autotransmisibles aunque en algunos

casos pueden encontrarse localizados en el cromosoma. Debido a la localización de estos

genes mayoritariamente en plásmidos, no existe una congruencia filogenética directa entre las

secuencias de los genes catabólicos y del gen ARNr 16S (Mirdamadian y col., 2010).

En la degradación de compuestos aromáticos el tipo de inducción suele ser secuencial,

de esta manera los microorganismos economizan y sintetizan sus enzimas de forma gradual.

Los genes de las enzimas inducibles que están coordinadas se encuentran adyacentes en el

genoma bacteriano y forman parte de una unidad reguladora u operón con un promotor y un

operador (Das y Chandran, 2011). Uchiyama y col (2005) describieron un método denominado

SIGEX que se basa en el hecho de que la expresión de genes catabólicos es generalmente

inducida por sustratos o metabolitos de enzimas catabólicas, y que la expresión de genes

catabólicos se controla con elementos de regulación situados aproximados, en muchos casos.

Los clones seleccionados con el método SIGEX suelen ser expresados en presencia de

sustratos y no se expresan en ausencia del sustrato. Para que el rendimiento de este método

39
Introducción

SIGEX sea alto se construyó un vector con operon-trampa (p18GFP), en el que el sitio de

clonación divide el promotor lac y el gen ´gfp. Además, Yun y col (2005) demostraron la

práctica para la detección de genes catabólicos usando inductores apropiados o sustratos, y la

posibilidad de SIGEX para producir más clones activos.

1.4 Exopolisacáridos (EPS)

1.4.1 Descripción y concepto
Los polisacáridos son moléculas complejas formadas por unidades simples

repetitivas de azúcares, unidas mediante enlaces glucosídico, dando lugar a una estructura

lineal o ramificada que puede llegar a estar constituida por miles de unidades de

monosacáridos.

El término exopolisacárido (EPS) fue descrito por primera vez por Sutherland (1972)

para describir polímeros carbohidratados de alto peso molecular producidos por bacterias

marinas. Este término ha sido ampliamente utilizado para aquellos polisacáridos localizados

en la superficie externa de las células microbianas entre los que se han encontrado polímeros

de composición química y propiedades físicas diversas. Para designar a este tipo de sustancias

se ha acuñado el término EPS, que se usa para hacer referencia a los “polisacáridos

extracelulares”, “exopolisacáridos” o “exopolímeros” (Wingender y col., 1999)

Muchos microorganismos producen estos polímeros extracelulares para superar o

resistir las adversidades de las condiciones extremas que suponen el medio en el que viven,

influyendo en el ambiente fisicoquímico en las proximidades de la célula bacteriana. Son

excretados al medio o bien quedan adheridos a la célula en forma de cápsula (Vicent y col.,

1991; Mancuso Nichols y col., 2005 a, b; Margesin y Schinner, 2001).

La presencia de exopolisacáridos asociados a las células bacterianas se reconoce por

la formación de colonias mucosas en el crecimiento del microorganismo en medio sólido, o

bien por un aumento de viscosidad e incluso a veces la formación de un gel en medios

líquidos (Sutherland, 1988). Para la detección y visualización de los exopolisacáridos se

utilizan diversas técnicas. Mediante microscopia óptica es posible distinguir estas estructuras

utilizando colorantes apropiados teniendo en cuenta la naturaleza aniónica de muchos de

estos polisacáridos. En otros casos se realizan tinciones negativas que ofrecen la ventaja de

poder distinguir entre los polisacáridos capsulares y aquellos más dispersos. Otras técnicas

40
Introducción

utilizadas con éxito son la microscopía electrónica de barrido (SEM) y la microscopía

electrónica de transmisión (TEM) (Mata, 2006).

1.4.2 Composición química de los exopolisacáridos

Los EPS están compuestos principalmente por carbohidratos, formando homo o

heteropolímeros, que además pueden contener diversos sustituyentes orgánicos e

inorgánicos. Los EPS homopolisacáridos están compuestos por un solo tipo de monosacárido,

aunque difieran en su estructura y propiedades. Los EPS heteropolisacáridos están

compuestos normalmente por unidades repetidas que varían en tamaño, desde disacáridos

hasta compuestos por 24 tipos de monosacáridos y muchos de ellos, además, contienen

grupos acilos adicionales (Sutherland, 2001).

 Carbohidratos

Existe una gran diversidad entre los carbohidratos constituyentes de los polisacáridos

de origen microbiano. En la mayor parte de los EPS bacterianos están presentes los azúcares

D-glucosa, D-galactosa y D-manosa; y se encuentran también con gran frecuencia los

monómeros L-fucosa, L-ramnosa y las 6-desoxihexosas (Lindberg, 1990). Es frecuente

encontrar ribosa asociada a los polisacáridos bacterianos. En un principio se pensó que su

presencia podía deberse a una contaminación con ARN, sin embargo en la actualidad se

considera, al menos en algunos casos, que es un componente propio de la estructura de dichos

polímeros. Además de los monosacáridos más comunes, algunos polisacáridos pueden

contener azúcares más raros, entre los que podemos citar las L-hexosas o la glucosa y

galactosa en su forma furanosa. Dentro de este grupo de azúcares menos extendidos se

encuentran también los aminoazúcares de algunos polisacáridos como N-acetil-D-

glucosamina y N-acetil D-galactosamina. La mayoría de EPS son de naturaleza polianiónica,

debido a la presencia en muchos de ellos de ácidos urónicos, componentes habituales de las

moléculas polisacarídicas. El más común es el ácido D-glucurónico (Sutherland, 2001).

 Sustituyentes orgánicos

En la composición de los EPS también aparecen diferentes sustituyentes orgánicos,

como los restos acetato, que no contribuyen a la carga total de la macromolécula, aunque

están implicados en su conformación molecular. Estos sustituyentes contribuyen a la

naturaleza lipofílica del polisacárido, lo cual le permitirá ser útil para determinadas

aplicaciones industriales (Sutherland, 2001; Calvo y col., 2004; 2009). En muchos

41
Introducción

exopolisacáridos, los grupos acetilos se encuentran en proporción estequiométrica con los

monosacáridos presentes, aunque no siempre ocurre así. En el caso concreto de los alginatos

bacterianos o la goma de xantano, un determinado monosacárido puede estar multi-acetilado,

lo cual determina un contenido total de acetilos bastante elevado. Los alginatos presentan del

orden del 15-20% (p/p) de acetilos y únicamente se encuentran acetilados los restos de ácido

manurónico. Los restos piruvato que junto a los ácidos urónicos confieren naturaleza aniónica

al EPS, suelen estar presentes en proporción estequiométrica con los azúcares integrantes del

polímero y usualmente se encuentran unidos a una hexosa neutra. De forma ocasional se han

localizado unidos a un resto urónico o una metilpentosa (Lindberg, 1976). En general la carga

aniónica total de la molécula polisacarídica se debe a la presencia de ácidos urónicos y restos

piruvato.

 Sustituyentes inorgánicos

Los sustituyentes inorgánicos cuya presencia se encuentra más extendida, son los

grupos fosfato aunque estos sustituyentes no se han encontrado en polisacáridos producidos

por bacterias Gram negativas como Pseudomonas (Sutherland, 1994). Aunque en un principio

se pensó que la presencia de grupos sulfato era exclusiva de los polisacáridos de organismos

eucariotas, se ha demostrado la existencia de estos grupos en algún exopolisacárido

microbiano. Así, además de estar presentes en polímero de ciertas especies de cianobacterias,

también se han encontrado en los EPS H28, H96 y V2-7, producidos por bacterias halófilas

moderadas como Halomonas eurihalina (Béjar y col., 1998; Martínez-Checa y col., 2007; Calvo y

col., 1998; 2002; 2008), Halomonas ventosae (Martínez-Cánovas y col., 2004c), Halomonas maura

(Arias y col., 2003; Bouchotroch y col., 2001) o algunas bacterias marinas del género

Pseudomonas (Matsuda y col., 1993). Los cationes también forman parte de la estructura de los

EPS y se encuentran especialmente en polímeros polianiónicos. Así, algunos alginatos llevan

fuertemente unidos cationes divalentes como Ca2+, Ba2+, Sr2+. Estos iones quedan adheridos al

polisacárido durante su producción, pero pueden ser desplazados por procesos tales como

intercambio iónico, electrodiálisis, etc.

1.4.3 Estructura de los exopolisacáridos

Las causas de la enorme variedad de exopolisacáridos son la diversidad de unidades

básicas que los constituyen, la cantidad en que están presentes y los distintos tipos de enlaces

que determinan la configuración final. Los homopolisacáridos se pueden clasificar en función

42
Introducción

del tipo de enlace en β-D-glucanos y α-D-glucanos. Los β-D-glucanos son polímeros lineales

formados por moléculas neutras unidas mediante un solo tipo de enlace (curdlano y celulosa)

y polímeros que presentan ramificaciones y dos tipos de enlaces (escleroglucano y levano).

Los α-D-glucanos son polímeros que presentan ramificaciones en sus estructuras y tres o más

tipos de uniones (dextrosa).

Los heteropolisacáridos están constituidos por unidades repetidas que varían en

cuanto a su naturaleza y tamaño (disacáridos, tetrasacáridos, pentasacáridos, etc.) en las

unidades repetidas (Figura 1.6), cada hexosa puede presentar un enlace de tipo α ó β, o los

dos a la vez (heparina), además de estar presente en su forma piranósica o furanósica. El

punto de enlace de los azúcares varía también entre las posiciones 2, 3, 4 ó 6.

Figura 1.5. Estructura del heteropolisacárido xantano producido por Xanthomonas campestres.

1.4.4 Biosíntesis de los Exopolisacáridos

La biosíntesis de los exopolisacáridos microbianos es un proceso que en líneas

generales se asemeja al de la síntesis del peptidoglucano y lipopolisacárido de la pared celular

bacteriana (Figura 1.7). Se pueden distinguir cinco etapas:

1. Síntesis de precursores activados: Uno de los primeros pasos en la biosíntesis de EPS

tiene lugar cuando el sustrato entra en la célula original o tras la fosforilación (Sutherland,

1977). El EPS es sintetizado cerca de la membrana plasmática y utiliza precursores activadores

y moléculas transportadoras. La enzima UDP-glucosa es un enzima clave para producir el

precursor de la biosíntesis de EPS en la pared celular de muchos microorganismos

(Sutherland, 1977). Algunas enzimas participantes en la síntesis nucleotídica se encuentran en

la membrana y otras, para el caso de las bacterias Gram-negativas, en el citoplasma

(Whitfield, 1988). Sin embargo, no se sabe aún claramente si estos subproductos se producen

libremente en el citoplasma o son producidos en sus proximidades por las enzimas

responsables.

43
Introducción

2. Ensamblaje de las unidades: Tiene lugar la formación de un glucolípido intermediario por

acción de glicosil-transferasas específicas, situadas probablemente sobre la cara interna de la

membrana citoplasmática donde los precursores se encuentran disponibles (Reuber y Walker,

1991). Se produce una transferencia secuencial de los correspondientes precursores activados

a un lípido aceptor intermediario, localizado en la membrana plasmática (Leigh y Coplin,

1992).

Exportación

Polimerización azúcar activado

Ensamblaje de las unidades Lípido transportador

Molécula lipídica terminal

Síntesis de precursores

Figura 1.6. Etapas generales de la biosíntesis de exopolisacáridos (EPS), cápsulas y

lipopolisacáridos en bacterias Gram negativas.

3. Adición de sustituyentes: El acetato y el piruvato son transferidos a partir de acetil-CoA y

fosfoenolpiruvato (PEP) mediante la acción de las enzimas acetiltransferasas I y II y

cetalpiruvato-transferasas (Ielpi y col., 1981; 1983).

4. Polimerización: Estudios in vitro indicaron que este proceso se realiza por transferencia de

la cadena en crecimiento al extremo reductor de una nueva unidad básica que se encuentra

unida al transportador (Ielpi y col., 1993). El transportador lipídico es eliminado de la

molécula en crecimiento durante la reacción de adición por desfosforilación, proporcionando

así energía para la polimerización. Estas reacciones tienen lugar en la cara interna de la

membrana citoplasmática.

5. Exportación del polisacárido a la superficie celular: Esta etapa es la menos conocida.

Algunos autores creen que existen sistemas de translocación específicos como proteínas

transportadoras, a través de la cuales los polímeros son conducidos en sus formas más

extendidas o casi lineales. Otros autores consideran que la secreción del EPS ocurre al mismo

tiempo que la polimerización de sus unidades, ya que ésta última se vería impedida por el

tamaño del mismo (Ielpi y col., 1993).

44
Introducción

1.4.5 Condiciones de cultivo para la producción de los EPS

La naturaleza química del EPS desempeña un papel importante en su función activa.

Sin embargo, ésta depende no sólo de la cepa productora sino también de las condiciones

ambientales y nutricionales del medio de cultivo: naturaleza de las fuentes de carbono y

nitrógeno, la proporción C:N, limitaciones nutricionales y parámetros físicos (Temperatura,

aireación y pH), que influyen no sólo en la cantidad sino también en la calidad del polímero

producido. Estas condiciones, que determinan la producción óptima del biopolímero, varían

de unas especies microbianas a otras e, incluso, entre cepas bacterianas de la misma especie.

Así, las condiciones de cultivo pueden influir de manera importante en el rendimiento de

producción y en la composición química y estructura de los exopolímeros microbianos (Calvo

y col., 2009).

La posibilidad de crecimiento bajo condiciones controladas de laboratorio de una cepa

aislada representa una aproximación adecuada para investigar la producción de EPS

microbianos. Sin embargo, no existe un medio de cultivo específico que garantice altas

productividades, ya que los microorganismos difieren en requerimientos de temperatura y

pH óptimo. Además, es posible modular la masa molecular, el número de residuos y el grado

de ramificaciones de EPS usando un control fisiológico. De hecho, las condiciones

nutricionales y ambientales (condiciones de cultivo) pueden afectar a la productividad y

calidad de los EPS microbianos (Kumar y col., 2007).

1.4.6 Funciones de los EPS microbianos

Las propiedades físicas de los polisacáridos están profundamente influenciadas por

la manera en que los monosacáridos son enlazados unos a otros y por el ensamblaje de las

cadenas simples de polímeros (Van hooren y Van damme, 1998).

El papel fisiológico de los EPS depende del nicho ecológico y del ambiente natural

del cual han sido aislados los microorganismos. De hecho, la producción de EPS es un proceso

que requiere un coste de energía notable de más del 70%, representando un gasto de carbono

importante para los microorganismos. Sin embargo, los beneficios relacionados con los EPS

son significativamente más altos que el coste de producción considerando el incremento de

crecimiento y la supervivencia del microorganismo en presencia de éstos (Wolfaardt y col.,

1999; Poli, 2007).

45
Introducción

Indudablemente, poseen una naturaleza protectora; los EPS, formando una capa

alrededor de la célula, proporcionan una protección eficaz frente a temperaturas extremas,

elevada salinidad, desecación, o frente a posibles predadores. Son esenciales en la formación

de agregados, en los mecanismos de adhesión superficial y a otros organismos, en la

formación de biopelículas y en la captación de nutrientes (Alldredge, 2000; Holmstrom y

Kjelleberg, 1999; Decho y Herndl, 1995; Mancuso Nichols y col., 2005a). En particular, en

estudios de comunidades microbianas de los mares helados se han encontrado bacterias

fuertemente asociadas a partículas y han indicado que los EPS microbianos desempeñan un

importante papel en la crioprotección (Junge y col., 2004; Krembs y col., 2002). Los EPS

presentan un papel importante en la matriz de las biopelículas, en las interacciones

bioquímicas entre la bacteria y las células circundantes (Decho, 1990; Logan y col., 1987). Se ha

comprobado que las cepas aisladas de fuentes hidrotermales de aguas profundas muestran

resistencia a los metales pesados y sus EPS purificados presentan la capacidad de inmovilizar

metales y sustancias tóxicas (Loaec y col., 1997; 1998).

En su ambiente natural, la mayoría de las bacterias viven en agregados microbianos

cuya integridad estructural y funcional está basada en la presencia de una matriz de

sustancias poliméricas extracelulares y la producción de EPS parece ser esencial para su

supervivencia (Wingender y col., 1999). En concreto, los polisacáridos marinos, junto con otras

macromoléculas como proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, constituyen la matriz orgánica

presente en el espacio intracelular de las biopelículas microbianas, que representan uno de los

mayores reservorios de carbono de la Tierra (Wingender y col., 1999; McCarthy y col., 1996).

Además muchos de estos microorganismos producen polímeros con propiedades

bioemulgentes para facilitar la solubilidad de los compuestos hidrofóbicos en el ambiente y

que así puedan ser utilizables como sustratos (Margesin y Schinner, 2001; Oliveira y col.,

2003). Se ha sugerido que la presencia de moléculas superficialmente activas en la superficie

de la célula microbiana incrementa la hidrofobicidad de la célula y ayuda a la supervivencia

en ambientes hidrofóbicos (Perfumo y col., 2010).

1.4.7 Bioemulgentes
Numerosos microorganismos sintetizan una amplia variedad de moléculas de alto y

bajo peso molecular con propiedades emulgentes y/o surfactantes. Son sustancias de origen

biológico que facilitan la solubilización de compuestos hidrófobos y por ello son útiles en los

46
Introducción

procesos de biorremediación. Se ha demostrado que la aplicación de biosurfactantes (BS) y

bioemulgentes (BE) acelera el proceso de biodegradación de hidrocarburos al aumentar la

biodisponibilidad de estos contaminantes (Margesin y Schinner, 2001).

Los polímeros de alto peso molecular son polisacáridos anfipáticos, proteínas,

lipopolisacáridos, lipoproteínas o mezclas complejas de estos biopolímeros. En general se

asocian con la capacidad de estabilizar emulsiones. Estos compuestos de alto peso molecular

están asociados a la producción de emulsiones estables, pero la disminución de la tensión

superficial no es un rasgo habitual de ellos, en consecuencia son considerados como

bioemulgentes (Bognolo, 1999). En la Tabla 1.1 se recogen algunos ejemplos de BE/BS y su

correspondiente microorganismo productor.

Tabla 1.1. Algunos ejemplos de bioemulgentes y sus microorganismos productores. (Banat y col.,
2000; Sutherland, 2001; Calvo y col., 2004)
Grupo Bioemulgente Microorganismo productor

Ramnolípidos Pseudomonas aeruginosa

Glicolipidos

Rhodococcus erytropolis

Trehalolipido Arthorobacter sp.

Mycobacterium sp

Soforolípidos Torulopsis bombicola

Lipopéptidos y

lipoproteínas

Péptido-lípidos Bacillus lichniformis

Viscosina Pseudomonas fluorescens

Surfactina Bacillus subtilis

Fosfolípidos Acinetobacter sp

RAG-1 emulsano Acinetobacter calcoaceticus RAG-1

BD4 emulsano Acinetobacter calcoaceticus BD4-13

Surfactantes Poliméricos

Alasano Acinetobacter radioresistens KA53

Biodispersano Acinetobacter calcoaceticus

Liposano Candida lipolytica

Complejo proteico Mycobacterium thermoautotrophium

Emulgente termofílico Bacillus stearothermophilus

Acetilheteropolisacárido Sphingomonas paucimobilis

Emulgente alimentario Candida utilis

Polisacarido sulfatado Halomonas eurihalina

Durante la última década los BE/BS han sido objeto de estudio como potenciales

sustituyentes de surfactantes sintéticos y tienen un interés considerable debido a su baja

47
Introducción

toxicidad, naturaleza biodegradable y diversidad. El rango de aplicaciones potenciales

industriales y medioambientales incluyen la mejora en recubrimientos de “las gotas de

aceite”, extracción de petróleo crudo, lubricantes, biorremediación generalizada de

contaminantes insolubles, aplicaciones en salud, industria farmacéutica/cosmética y

procesado de alimentos. Todas estas aplicaciones están relacionadas con la actividad

emulgente, la capacidad de formación de espuma, detergentes, espesantes, coagulantes,

adhesión, estabilizantes, humectación, dispersión y solubilización de compuestos hidrofóbicos

(Desai y Banat, 1997; Banat y col., 2000; Kumar y col., 2007; Satpute y col., 2010).

En resumen, de acuerdo a su estructura química, los BS/BE pueden ser clasificados en

los siguientes grupos:

- Glucolípidos: Los carbohidratos como la soforosa, trehalosa o ramnosa están unidos a una

larga cadena ácido alifática o lipopéptido. Por ejemplo, el ramnolípido sintetizado por P.

aeruginosa consiste en una o dos partes de azúcar unidas a una o dos partes de ácido caprílico

por un enlace glucosídico (Rosenberg y Ron, 1999; Lang y Wullbrandt, 1999).

- Aminoácidos: Los bioemulgentes como surfactina producida por Bacillus subtilis, compuesto

de siete anillos de aminoácidos acoplados con una molécula de ácido 3-hidroxi-13-

metiltetradecanoico.

- Complejos polisacárido-lipídicos: Las sustancias como el emulsano sintetizado por

Acinetobacter calcoaceticus RG-1, que es un heteropolisacárido extracelular polianiónico

(Rosenberg y col., 1979). Los exopolisacáridos se incluyen en este grupo y pueden deber su

actividad emulgente a su capacidad viscosizante o a una simple asociación de una fracción

proteica al polímero.

- Grupos proteicos: Las sustancias como liposano producido por Candida lipolitica, compuesto

por proteínas y carbohidratos.

Se han propuesto tres funciones para los bioemulgentes en general: i). Incrementar el

área de superficie entre dos fases inmiscibles, el agua y una fase oleosa o sustrato insoluble.

ii). Incrementar la biodisponibilidad de sustratos hidrofóbicos mediante el aumento de su

solubilidad. iii). Regular la adhesión y separación de los microorganismos respecto a las

superficies (Rosenberg y Ron, 1999).

Los biopolímeros que contienen polisacáridos, uniones de polisacáridos con lípidos, o

polisacáridos unidos a proteínas, han sido descritos como agentes emulgentes eficientes frente

48
Introducción

a numerosos hidrocarburos (Plaza y col., 2005, Calvo y col., 2002). En este sentido, los

exopolímeros, moléculas de alto peso molecular que frecuentemente presentan propiedades

biosurfactantes y/o bioemulgentes, se ofrecen como sustancias propicias para su empleo en la

bioestimulación.

1.4.8 Aplicaciones biotecnológicas de los EPS microbianos

En los últimos años el aumento de la demanda de polímeros de origen natural para

industrias farmacéuticas y alimentarias entre otras, ha despertado un notable interés hacia el

aislamiento e identificación de nuevos polisacáridos microbianos que puedan tener

aplicaciones innovadoras como gelificantes, emulgentes y agentes estabilizantes (Sutherland,

2001). Estos biopolímeros han surgido como nuevos materiales poliméricos con características

físicas nuevas y únicas y por lo tanto se han encontrado muchas y variadas aplicaciones.

El empleo de los EPS, fuera de las aplicaciones clínicas y en alimentación, refleja varios

de sus atributos físicos. Es en el sector de la industria del petróleo donde los EPS han sido

realmente aceptados en competencia con gomas de plantas, sus derivados y compuestos

químicos sintéticos (Sutherland, 1982). Entre las aplicaciones en este sector se incluyen la

biorremediación/dispersión de los vertidos accidentales, tanto terrestres como marinos,

eliminación/movilización de fangos de petróleo desde los tanques de almacenamiento y la

mejora de la recuperación del petróleo (Georgiou y col., 1992).

Se han aislado más de 10.000 metabolitos de diferentes hábitats marinos con amplio

espectro de actividad biológica producidos por microorganismos marinos con capacidad de

sintetizar exopolímeros en diversos campos tecnológicos (Fusetani, 2000; Kelecom, 2002),

algunos de ellos se recogen en la Tabla 1.2.

El hábitat marino proporciona una magnífica oportunidad para identificar nuevos

compuestos como antibióticos, enzimas, vitaminas, fármacos, biosurfactantes (BS),

bioemulgentes (BE) y otros compuestos de importante valor comercial (Austin, 1989; Lang y

Wagner, 1993; Jensen y Fenical, 1994; Romanenko y col., 2001). Entre estos compuestos

bioactivos marinos, los BS/BE son de gran importancia debido a su diversidad estructural y

funcional y a sus aplicaciones industriales (Banat y col., 1991; Banat, 1995 a, b; Rodríguez y

col., 2006).

49
Introducción

Tabla 1.2. Relación de algunos microorganismos marinos productores de EPS.

Cepa productora Procedencia Propiedades Referencia
Bacillus B3-15 Aguas superficiales farmaceúticas Maugeri y col., 2002
Bacillus B3-72 Aguas superficiales farmacéuticas Nicolaus y col., 2000
B. licheniformis Isla Volcano antiviral Arena, 2004
B. thermoantarcticus Sedimento marino farmacéuticas Nicolaus y col., 2000
Planococcus maitriensis Aguas costeras degradación HPAs Kumar y col., 2007
Enterobacter cloacae Sedimento marino emulgente Iyer y col., 2005
Alteromonas sp.1545 Mar abierto emulgente Vicent y col., 1994
Pseudoalteromonas sp.CAM025 Antártida adsorción metales Gutiérrez y col., 2008
Pseudoalteromonas SM913 Sedimento aguas profundas floculante Li y col., 2008
Rhodococcus erythropolis Isla Okinawa 1000m prof. degradación alcanos Urai y col., 2007
Zoogloea sp Aguas submarina emulgente Lim y col., 2007
Vibrio alginolytics Fuente hidrotermal farmacéuticas Jayaraman y Seetharaman, 2003
Hyphomonas MHS-3 Sedimento marino adhesivas Quintero y Weiner, 1995
Flavobacterium uliginosum Aguas marinas antitumoral Umezawa y col., 1983
Haloferax mediterranei Mar Mediterraneo recuperación petróleo Antón y col., 1988
Beobacillus thermodenitrificans Fuente hidrotermal antiviral Antón y col., 1988
Hahella chejuensis Sedimento marino biosurfactante Ko y col., 2004.
Halomonas variabilis W10 Agua de mar Bioemulgente Uad y col., 2010

50
22.. OOBBJJE
ETTIIV
VOOSS

51
52
Objetivos

Los hidrocarburos derivados del petróleo suponen un gran problema de

contaminación de ecosistemas acuáticos y terrestres. La contaminación por petróleo en los

ambientes marinos y estuarios ha recibido gran atención en los últimos años, y sobre todo en

los aspectos del destino y los efectos tóxicos del petróleo derramado. Hay certeza de que la

incidencia de los derrames resultantes del transporte marino y terrestre, de los accidentes de

petroleros, de las operaciones de exploración y explotación y de las actividades asociadas, se

incrementarán en los años venideros en, tanto la demanda de petróleo como el principal

recurso energético del planeta siga en aumento.

La existencia de microorganismos degradadores y el descubrimiento de nuevos genes,

enzimas y rutas metabólicas han hecho que la biorremediación constituya una opción muy

válida para el tratamiento de los emplazamientos contaminados con hidrocarburos.

Basándonos en estas premisas y teniendo en cuenta el interés creciente por los

procesos de biorremediación, nos propusimos realizar el estudio taxonómico de los

microorganismos aislados de muestras de agua, fuel y sedimentos marinos aislados a 4.000 m

de profundidad en la zona del hundimiento del buque Prestige. Además y dentro de este

mismo contexto general, nos planteamos conocer las propiedades funcionales y la

composición química de los bioemulgentes producidos por estos microorganismos con el

claro objetivo de establecer las posibles aplicaciones biotecnológicas de biorremediación que

estos biopolímeros pudieran aportar.

Teniendo en cuenta todo lo anterior, los objetivos específicos planteados en esta tesis

doctoral se detallan en los siguientes puntos:

I. Caracterización taxonómica de las cepas productoras de EPS y

degradadoras de hidrocarburos mediante el análisis filogenético de las

mismas.

II. Caracterización fenotípica y/o nutricional de las cepas mediante la

evaluación del perfil metabólico de las mismas, así como estudiar su

capacidad de crecimiento en un amplio rango de concentraciones salinas.

53
Objetivos

III. Estudiar la capacidad de las cepas seleccionadas para degradar

hidrocarburos policíclicos aromáticos (naftaleno) y mezclas complejas

(crudo Kirkuk).

IV. Generar una genoteca y validar su calidad para su posible uso en estudios

de caracterización de los genes incluidos en la biodegradación de

compuestos recalcitrantes.

V. Estudiar la producción de EPS con potencial bioemulgente y determinar su

composición química estableciendo un índice de calidad bioemulgente.

54
33.. M
MAATTE
ERRIIA
ALL YY M
MÉÉTTOOD
DOOSS

55
56
Material y Métodos

3.1 Cepas bacterianas

El aislamiento de las 18 cepas objeto de estudio se realizó a partir de muestras de agua y

sedimentos marinos extraídos a 4.000 m de profundidad en las proximidades del hundimiento del

petrolero Prestige, así como de muestras de fuel del mencionado petrolero tras su naufragio. Estas

bacterias fueron seleccionadas en base a su capacidad para crecer en presencia de diferentes

hidrocarburos y/o de producir exopolisacáridos con actividad emulgente, de un total de 133 cepas

bacterianas aisladas en nuestro laboratorio durante el proyecto de investigación realizado para

determinar la viabilidad de biorremediación del fuel del Prestige (Proyecto de investigación

concerniente al estudio de viabilidad de biorremediación de fuel del Prestige: Fase II).

En una primera etapa, a partir de las placas de aislamiento utilizadas para el recuento de

microorganismos heterótrofos mesófilos y psicrófilos presentes en las muestras de agua,

sedimentos y fuel anteriormente mencionadas, se realizó una selección de 133 aislados, de los

cuales se seleccionaron 18 cepas bacterianas atendiendo a su capacidad para proliferar en

presencia de diferentes hidrocarburos y/o de producir exopolisacáridos. Se empleó la cepa

Escherichia coli XL1-Blue como fondo genético para la búsqueda de promotores que respondan a la

presencia de naftaleno (Tabla 3.1).

Tabla 3.1. Cepas bacterianas empleadas en el presente trabajo. Se indica el nombre y el origen de
cada cepa objeto de estudio y sus referencias. También se indican las características más relevantes de
las cepas aisladas así como las cepas Escherichia coli y Pseudomonas putida utilizadas como control en
otros ensayos.
Cepa Procedencia Genotipo Referencia

W1- W3- W4- W5- W7- W8- W10- Muestras de

W12- W15- W16- W18 agua de mar
F2- F17- F20 Muestras de fuel Uad y col., 2010

-
S21- S22- S24- S27 Muestras de
sedimento
marinos
Escherichia coli XL1-Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 Bullock y col., 1987
_ hsdR17 supE44 re1A1 lac
[F´proAB lac1q Z M∆15
Tn10 (Tetr)]
Pseudomonas putida KT2440 _ hsdMR, Ben+ Franklin y col., 1981

57
Material y Métodos

3.2 Medios de cultivo

 Medio MY
El medio MY (Moraine y Rogovin, 1966) se empleó para determinar el efecto de la

concentración de sales sobre el crecimiento de las cepas objeto de estudio, para la producción de

los exopolisacáridos y para la conservación de las cepas. Se recoge su composición en g/l en la

Tabla 3.2. Para la preparación de medio MY sólido se adicionó agar Difco a una concentración

final de 1,8% (p/v).

Tabla 3.2. Composición del medio de cultivo MY. Se indica la composición del medio MY en gramos
por litro de agua destilada c.s.p.
Glucosa (Panreac®) 10

Extracto de levadura (Difco®) 3

Proteasa peptona (Difco® ) 5

Extracto de malta (Panreac®) 3

 Solución stock de sales

Como solución de sales para la preparación de los medios de cultivo a distintas

concentraciones de sales, se empleó una solución stock de sales propuesta por Rodríguez-Valera y

col. (1981), al 30% (p/v). Dicha solución presentó una composición de sales similar a la del agua de

mar, es decir posee un carácter talasohalino (Tabla 3.3).

Tabla 3.3. Solución de sales al 30% (p/v). Se indica la composición de stock de sales gramos por litro de
agua destilada c.s.p.
NaCl (Panreac ) 234

MgSO4 7H2O (Merk) 59,8

MgCl2 6H2O (Merk) 41,6

KCl (Merk) 6

CaCl2 2H2O (Merk) 1,1

FeCl3 6H2O (Merk) 0,1

NaBr (Merk) 0,65

NaHCO3 (Merk) 0,2

58
Material y Métodos

 Medio Tripticasa Soja Agar (TSA)

Este medio se utilizó para los estudios de caracterización genética de los

microorganismos. Se empleó el medio TSA Difco cuya composición en g/l fue la siguiente:

40 g de TSA (Disco) en 1000 ml de agua destilada c.s.p.

 Medio Caldo Tripticasa Soja (TSB)

El medio TSB se utilizó para los estudios de caracterización genética de los

microorganismos. Se empleó el medio TSB Difco cuya composición en g/l fue la siguiente:

30g de TSB (Disco) en 1000 ml de agua destilada c.s.p.

 Medio mínimo S4

Para la preparación del medio S4 se siguió la metodología descrita por Abril y col.

(1991), modificada. Este medio mínimo se empleó para los estudios de la determinación de

crecimiento de las cepas en presencia de HPAs (naftaleno, fenantreno, antraceno y pireno), la

composición se detalla en la Tabla 3.4.

Tabla 3.4. Medio Mínimo S4 (Abril y col., 1991)
10x M9 100 ml

Subow (30x) 33 ml

Agua destilada 1000 ml

Para la preparación de medio S4 sólido se adicionó bacto-agar Difco a una

concentración final de 2,25% (p/v).

 Solución 10xM9

Para la elaboración del medio 10xM9, se utilizó una modificación del medio M9

(Sambrook y col., 1989) cuya composición fue la siguiente: Solución 10xM9: 100 ml; Solución

A9 “Goodies”: 2,5 ml; MgSO4 1M: 1 ml; citrato férrico amónico 6‰ (p/v): 1 ml; y agua

destilada hasta 1 litro. Las soluciones empleadas en este medio se prepararon y esterilizaron

por separado en autoclave.

La solución 10xM9 se preparó con la siguiente composición: Na2HPO4 7H2O: 70 g;

KH2PO4: 30 g; NH4Cl: 5 g y agua destilada hasta 1 litro.

 Solución A9

La solución A9 se preparó con la siguiente composición: HBO3: 300 mg; ZnCl2: 50 mg;

MnCl2 4H2O: 30 mg; CoCl2: 200 mg; CuCl2 2 H2O: 10 mg; NiCl2 6H2O: 20 mg; NaMO4 2H2O:

59
Material y Métodos

30 mg y agua destilada hasta 1 litro. Todos los medios fueron preparados con agua destilada,

el pH se ajustó a 7.3 con NaOH (Panreac).

 Medio mínimo marino sintético (MMS)

Este medio fue utilizado para los estudios de degradación de naftaleno y crudo en

medio líquido. La composición se detalla en la Tabla 3.5.

Tabla 3.5. Medio Marino Sintético (MMS). Se indica la composición en gramos por litro de agua
destilada c.s.p.
NH4NO3 (Merk®) 8

Na2HPO4 (Merk®) 14

Solución de sal 1% (p/v)

3.3 Antibióticos
Para la selección y mantenimiento de los transformantes de Escherichia coli XL1 Blue,

los medios de cultivo fueron suplementados con ampicilina y tetraciclina, para lo cual se

prepararon soluciones concentradas de los antibióticos según las indicaciones citadas en la

bibliografía (Sambrook y col., 1989).

- Ampicilina (Amp100): Se preparó una solución concentrada de ampicilina (Sigma) 100

mg/ml en H2O bidestilada y se esterilizó por filtración. La concentración final de uso fue de

50-100 µg/ml.

- Tetraciclina (Tc): Se preparó una solución concentrada de tetraciclina (Sigma) 12,5 mg/ml

en metanol al 50%. Se esterilizó por filtración. La concentración final de uso fue de 15 µg/ml.

3.4 Conservación de microorganismos

La conservación, para el uso cotidiano, de los microorganismos empleados para

desarrollar el presente trabajo se realizó a temperatura de 4°C en medio sólido MY al 3%

(p/v) de sales y pH de 7 – 7.3 (Moraine y Rogovin, 1966).

Para la conservación a largo plazo, los microorganismos se mantuvieron a –80°C

utilizando el mismo medio de cultivo y glicerol al 40% (v/v) como crioprotector.

3.5 Genética y manipulación de ADN

3.5.1 Construcción de librería de clones

60
Material y Métodos

3.5.1.1 Plásmido utilizado

Como vector de clonación, se utilizó el plásmido p18GFP (Uchiyama y col., 2005),

plásmido derivado de pUC18 que se representa en la siguiente Figura 3.1.

BamHI
XbalI

KnpI
SacI
PstI
SalI
plac

Ampr ´gfp
´gfp
p18GFP
2.7Kb

Figura 3.1. Esquema del plásmido p18GFP. La expresión del gen ´gfp está bajo el control del
promotor Plac. Se muestran el sitio de clonación múltiple que incluye el sitio BamHI.

3.5.1.2 Aislamiento de ADN plasmídico: Método “Qiapreps”

Para el aislamiento y la preparación rápida del ADN plasmídico se utilizó el kit

comercial “Qiapreps spin plasmid” (Qiagen, ref. 27104) libre de ARN, partiendo de un

volumen de cultivo de 3 ml y siguiendo las instrucciones del fabricante. Este ADN

plasmídico se empleó para reacciones posteriores de secuenciación y/o clonación.

3.5.1.3 Extracción rápida de ADN bacteriano total

La extracción rápida del ADN total bacteriano se llevó a cabo mediante la lisis de las

células empleando una solución de lisis cuya composición fue la siguiente: 200 µl de SDS

(Sigma) (10%), 150 µl de NaOH (2N) y agua bidestilada estéril hasta 1 ml. Esta solución fue

de preparación extemporánea.

Se partió de un cultivo de 24 horas en medio sólido MY al 3 % (p/v) de sales

(MY3%). Se resuspendió la biomasa en 20 µl de la solución de lisis y se incubó durante 15

minutos a 95°C. A continuación se añadieron 180 µl de agua bidestilada estéril y se

centrifugó a 13.500 rpm durante 5 minutos, esta solución que contiene el ADN, se conservó a

-20°C hasta su posterior uso.

61
Material y Métodos

3.5.1.4 Aislamiento a gran escala de ADN bacteriano total

Para la preparación de ADN total se utilizó el método modificado descrito por Kado

y Liu (1981). Se partió de cultivos en medio TSB tras 24 horas 28°C en agitación. Se recogieron

1,5 ml de las células de dicho cultivo por centrifugación a 14.500 rpm durante 15 minutos.

Tras retirar el sobrenadante las células se resuspendieron en 425 µl de TE, al que se le

añadieron 22 µl de SDS al 10% y 2 µl de proteínasa K (20 mg/ml). Las muestras se incubaron

durante 1 hora a 37°C. Posteriormente se añadieron 225 µl de la solución de lisis, se

homogenizaron y se les añadieron 4,5 µl de ARNasa (30 unidades). Seguidamente se trataron

con un volumen de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico en proporción 25:24:1(v/v), para

eliminar proteínas, membranas y restos celulares. La fase acuosa se separó de la fase orgánica

por centrifugación a 14.500 rpm durante 15 minutos y se volvió a tratar con fenol, cloroformo

y alcohol isoamílico otras dos veces de forma análoga a la descrita anteriormente. Para

eliminar los restos de fenol de la fase acuosa, ésta se trató con una mezcla de cloroformo y

alcohol isoamílico en proporción 24:1 (v/v). Posteriormente a la fase acuosa se le añadió un

décimo del volumen de acetato sódico 3M, pH 4,8 y un volumen de isopropanol frío. Las

muestras se incubaron a -20°C durante 30 minutos y se centrifugaron a 14.500 rpm durante

15 minutos. El precipitado se lavó de sales con un volumen de etanol frío (70%). Tras

decantar el sobrenadante y secar el precipitado, éste se resuspendió en 60 µl de TE. Las

soluciones empleadas en este procedimiento fueron las siguientes:

- TE: Tris-HCl (pH 8), 10mM y EDTA 1mM. Esta solución se esterilizó en la autoclave y se

almacenó a 4°C.

- Solución de lisis: 200 µl de SDS (10%), 150 µl de NaOH (2N) y agua bidestilada esterilizada

hasta 1ml de volumen total. Esta solución fue de preparación extemporánea.

- Acetato sódico 3M pH 4,8: a 60 ml de una solución de acetato sódico 5M se le añadieron

11.5 ml de ácido acético glacial y H2O destilada hasta 100 ml. Cuando fue necesario, el pH se

ajustó a 4,8 con ácido acético glacial. La solución se esterilizó en autoclave y se conservó a

4°C.

3.5.1.5 Transferencia de plásmidos por electroporación

La transformación de células de E coli XL1 Blue se realizó mediante el método de

Enderle y Farwell (1998). Para ello se partió de un cultivo saturado de E coli XL1 Blue en

62
Material y Métodos

medio líquido TSB suplementado con el antibiótico (Tc). De este preinóculo se utilizaron 2,5

ml para inocular 10 ml del mismo medio que se incubaron a 37°C hasta alcanzar la fase

semilogarítmica, se recogieron las células del cultivo por centrifugación a 14.500 rpm durante

1 minuto, tras lo que se eliminó el sobrenadante. Las células presentes en el sedimento se

resuspendieron en 0,5 ml de agua destilada estéril a 4°C. La suspensión bacteriana se

centrifugó durante 30 segundos a 14.500 rpm. El precipitado se volvió a resuspender en 0,5

ml de H2O destilada estéril, recogiéndose en las mismas condiciones. Posteriormente se

resuspendieron en 120 µl de H2O destilada estéril y a partir de este momento todas la células

se mantuvieron en hielo hasta el pulso eléctrico. Las células preparadas según se ha descrito,

se mezclaron con 5-15 ng de ADN limpio de sales y esta mezcla se transfirió a una cubeta de

electroporación de 0,1 cm de espacio entre electrodos (Bio-Rad cat. nº 1652089) donde

recibieron un pulso eléctrico mediante un electroporador Gene Pulser (Bio-Rad, ref.165-2098).

Tras el pulso eléctrico se añadieron 400 µl de TSB a temperatura ambiente. Posteriormente las

células se incubaron a 37°C durante 1 hora en las cubetas de electroporación tras lo cual se

sembró en TSA con el antibiótico Amp100 selectivo para p18GFP.

Para eliminar las sales del ADN se realizó una diálisis de 20 µl de muestra utilizando

membranas de tamaño de poro de 0,22 µm de Millipore (cat. nº GVWP02500) durante 1 hora

en agua calidad milliQ a temperatura ambiente.

3.5.1.6 Restricción de ADN

Las digestiones de ADN se realizaron con enzimas de restricción en las condiciones

óptimas para cada enzima fijadas por el fabricante. Las reacciones contenían habitualmente

0,5 µg de ADN, 0,1 volúmenes del tampón de restricción correspondiente suministrado por

la casa comercial (10 veces concentrado), y 0,5-10 unidades del enzima de restricción, en

volúmenes finales de 10-30 µl completados con H2O bidestilada estéril. Las digestiones del

plásmido p18GFP y sus derivados se llevaron a cabo empleando el enzima de restricción

BamHI e incubando la mezcla de reacción durante 3 horas a 37°C (temperatura óptima del

enzima), mientras que para las restricciones de ADN total se realizaron restricciones parciales

para lo que se emplearon diluciones seriadas del enzima de restricción Sau3AI y se incubaron

las mezclas de reacción a 37°C durante 1 hora. Trascurrido el tiempo de reacción los enzimas

se inactivaron por calor incubándolas a 65°C durante 20 minutos.

63
Material y Métodos

3.5.1.7 Desfosforilación de ADN plasmídico con fosfatasa alcalina

Con objeto de aumentar la eficiencia de clonación, rutinariamente se desfosforiló el

ADN del vector linearizado con fosfatasa alcalina de gamba ártica (USB. Amersham, ref.

70092). Para ello el ADN ya digerido con enzimas de restricción se mezcló con entre 0,1 y 5

unidades de fosfatasa alcalina de gamba ártica, por cada 1 pmol de extremos de ADN. Tras

una incubación de 1 hora a 37°C la fosfatasa se inactivó por calor, con una incubación

adicional de la reacción a 65°C durante 5 minutos.

3.5.1.8 Ligación de ADN

Para la ligación de moléculas de ADN se partió de fragmentos lineales obtenidos por

digestión con enzimas de restricción en sitios compatibles para la ligación. El vector

linearizado y el fragmento de ADN obtenido por digestión con uno o varios enzimas de

restricción y purificado (empleando el QIAquick PCR Purification Kit para la purificación de

ADN), se mezclaron en una proporción de al menos el doble de inserto que de vector a los

que se añadió 0,1 volumen de tampón de ligación (suministrado por el fabricante) y 1U de

ADN-ligasa (ligasa Roch ref. 62309) en un volumen final de 15 µl completados con H2O. La

mezcla se incubó a 14°C durante 8-14 horas, tras lo que se transfirió a la cepa receptora por el

método de electroporación descrito anteriormente.

3.5.1.9 Conservación de la librería de clones

La librería obtenida se conservó en glicerol al 20% a -20°C, adicionando 350 µl de

glicerol al 80% a 400 µl de la librería a conservar.

3.5.2 Electrofóresis de ADN en geles de agarosa

La separación y visualización tanto de fragmentos de PCR, así como de ADN

cromosómico se realizó mediante electroforesis en geles de agarosa. Por cada 5 µl de muestra

a analizar se añadió 1 µl de tampón de carga, y esta mezcla se depositó en un pocillo de gel

de agarosa al 0,7% (p/v) en TAE 1x, sumergido en una cubeta con el mismo tampón. La

separación se realizó por electroforesis horizontal sometida a un voltaje constante de 70 V

durante 40 minutos aproximadamente. Las moléculas de ADN se tiñeron con bromuro de

etidio, del que se añadió 0,5 µl (bromuro de etidio al 1% (p/v)) a 30 ml de solución de agarosa

en TAE 1x, previamente fundida. El ADN se visualizó mediante exposición del gel a luz

64
Material y Métodos

ultravioleta (254 nm). El registro fotográfico se realizó con un equipo de documentación de

imágenes Volver Lourmat, modelo DOC-print II.

3.5.3 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

3.5.3.1 PCR-16S

Éste método se utilizó para la amplificación del gen ADNr 16S partiendo de ADN de

las cepas obtenido mediante la lisis celular y disuelto en agua bidestilada. Las condiciones de

reacción de PCR se efectuaron en un volumen final de 50 µl. las condiciones de reacción,

perfil de temperaturas y ciclos han sido descritos por Vinuesa y colaboradores (1998). Las

reacciones se efectuaron utilizando 80 ng de ADN molde; 5 µl de tampón de PCR 10x y 3µl

MgCl2 25 mM (suministrado con la enzima Taq ADN polimerasa); 200 µM de cada uno de los

desoxinucleótidos dATP, dGTP, dCTP y dTTP; 50-100 pmoles de cada uno de los cebadores;

0,5 U/100 µl de Taq ADN-polimerasa. Los cebadores se describen en la Tabla 3.6.

Tabla 3.6. Lista de los cebadores empleados en este estudio. Oligonucleótidos usados en la
amplificación y la secuenciación del gen ADNr 16 S y los oligonucleótidos diseñados y usados en la
amplificación y la secuenciación del gen que codifica para la expresión de la enzima catecol 2,3
dioxigenasa.
Cebador Secuencia 5´→ 3´ Referencia

fD1 CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG

rD1 GGCTGGATCACCTCCTTAAGCTTGGATCCCGGG Weisburg y col., 1991

fD2 GTGCCAGCAGCCGCGGTAATAC

rD2 GGATTAGATACCCTGGTAGTC

UP-F1 GTTTTCCCAGTCACGAC

RV AACAGCTATGACCATG (Lobet y col., 1989)

Cebador de 16 mer diseñado en

UP-F´2 CAGTGAAGAGTTCTTC este estudio

Las condiciones estándar para la reacción de amplificación fueron las siguientes:

Fase de inicialización a 95°C durante 3 minutos, que fue seguida por 25 ciclos compuestos de

fase de desnaturalización (30 segundos a 95°C), fase de hibridación con los cebadores (30

segundos a 56°C), y fase de elongación (2 minutos a 72°C). Finalmente se incluyó un paso de

10 minutos a 72°C para terminar de extender posibles cadenas incompletas. La conservación

del producto de PCR en el termociclador Bioer xP ciclop® se realizó a 10°C, por tiempo

indefinido. (Figura 3.2).

65
Material y Métodos

ºC 95 º C

´ 30 ´´
72 º C 72 º C

2´ 10 ´

56 º C

30 ´´

95 º C
10

25 ciclos

Figura 3.2. Esquema de la reacción de PCR-16S. Condiciones de amplificación del gen que
codifica ADNr 16S.
Tras la reacción de PCR-16S se tomaron fracciones de alícuotas de 5 µl para su

electroforesis en gel de agarosa al 0,7%, con el objetivo de comprobar la presencia de bandas

amplificadas del tamaño esperado (1,5 – 1,6 kb).

3.5.3.2 PCR-GFP

La amplificación del promotor del gen que codifica la expresión de la enzima catecol

2,3 dioxigenasa para la degradación de catecol, se realizó mediante una reacción de

polimerización denominada PCR-GFP. Las reacciones de PCR se efectuaron de forma

análoga a la descrita en el apartado anterior utilizando los cebadores UP-F1, RV y UP-F´2

(Tabla 3.6). El programa de PCR fue análogo al anteriormente descrito pero con una

temperatura de hibridación de 43°C.

3.5.4 Purificación y secuenciación de fragmentos de ADN

Los productos de PCR se purificaron utilizando dos Kit comerciales. Para la

purificación realizada directamente a partir del producto de PCR se empleó el Kit PCR

QuiKClean (MBL), según las recomendaciones del fabricante. Mientras que para las bandas

extraídas a partir del gel de agarosa, se empleo el Kit comercial QIAEX II Agarose Gel

).
Extraction (QIAGEN

La secuenciación del producto final de PCR purificado se llevó a cabo en el servicio de

secuenciación del Instituto de Parasitología y Biomedicina López-Neyra (C.S.I.C.) de

Granada, utilizando un aparto Applied Biosystems (modelo 373 STRECHT). El método de

secuenciación fue el comercializado por Perkín Elmer, ABI PRISM TM “Big Dye

Terminators”, que se basa en la reacción de extensión de la enzima AmpliTaq DNA

polymerase (ref., 402122) y que emplea dideoxinucleotidos marcados con cromóforos

66
Material y Métodos

fluorescentes. Los oligonucleótidos empleados como iniciadores en la secuenciación, fueron

los mismos cebadores usados en la reacción de amplificación.

3.5.5 Análisis filogenético

Los cromatogramas de las secuencias obtenidas fueron comprobados visualmente

para corregir los posibles errores e indeterminaciones. Una vez inspeccionadas las

secuencias, éstas se compararon con las secuencias de los genes ARNr 16S disponibles en la

base de datos GenBank y EMBL obtenidas de la base del Centro Nacional para Información

Biotecnológica (NCBI) usando el programa BLASTsearch (Altschul y col., 1990), cuyos

resultados de similaridad entre secuencias se basan en alineamientos locales de las mismas.

3.5.6 Construcción de árboles filogenéticos

Para establecer la relación filogenética procedimos en primer lugar al alineamiento

múltiple de las secuencias de los genes ARNr 16S de los microorganismos objeto de estudio

con las especies de referencia. Con este fin empleamos los programas informáticos Clustal_X

(Thompson y col., 1997) y MEGA 4. (Kumar y col., 2004). El alineamiento obtenido por

Clustal_X se utilizó en otro programa, MEGA 4, para generar el dendograma filogenético, tal

y como propone Arahal y col. (2007), y la relación filogenética se estableció por la

metodología de los “Vecinos próximos” más conocido como “Neighbour-Joining” (Nei y

Kumar, 2000).

La consistencia de una determinada relación filogenética se evaluó, por un lado, por

su permanencia independientemente del algoritmo usado (Chelo y col., 2007). Por otro lado,

por el valor de replicas o “bootstrap” de la agrupación, mediante el cual se comprobó

estadística y aleatoriamente si el orden en que se habían introducido las secuencias afectaba a

las características del modelo empleado (Felsenstein, 1985). El valor de “bootstrap” fue

calculado por el mismo programa MEGA 4 y se basó en 1000 réplicas.

3.6 Estudio fenotípico

Para realizar la caracterización metabólica de las cepas bacterianas objeto de estudio

se utilizó el kit comercial Biolog MicroPlateTM Cat. No. 1014 empleando el GP2 MicroPlateTM

para bacterias Gram positivas y el GN2 MicroPlateTM para las bacterias Gram negativas

(Figura 3.3). Es un ensayo colorimétrico basado en la reducción del tetrazolium. Cada una de

las microplacas incluye 95 fuentes de carbono, los metabolitos vienen ya depositados en la

67
Material y Métodos

microplaca (de A2 a H12) conteniendo cada pocillo una fuente de carbono distinta, siendo el

pocillo A1 para el control.

a) b)

Figura 3.3. Microplacas MicroPlateTM. (a) Microplacas GN2/GP2 empleadas en la cuantificación de

la utilización de fuentes de carbono, (b) Fotografía de Microplaca con pocillos coloreados o no según el
uso de la fuente de carbono, el cambio de coloración corresponde al uso de la fuente de carbono por el
microorganismo.

Para preparar el inóculo y siguiendo las instrucciones del fabricante, se partió de un

cultivo bacteriano en MY3% durante 12-16 horas, del cual se tomó una cantidad aproximada

de 30 mg evitando arrastrar el agar del medio. Se resuspendió la masa celular en 15 ml de la

solución GN/GP-IF proa. No. 72101, y se le adicionó 3 gotas de una suspensión concentrada

de tioglicolato. Tras esto se ajustó la suspensión a un valor de tramitancia de 20% ± 2%. El

tioglicolato actúa disminuyendo la producción de cápsulas para que las cepas bacterianas

den patrones más consistentes. Una vez alcanzada dicha tramitancia se depositaron 150 µl de

la suspensión bacteriana en cada pocillo y se incubaron las placas a 28°C durante 24 horas.

Transcurrido este periodo de incubación se procedió a la lectura de los resultados utilizando

un lector de fluorescencia en microplacas BMG, modelo Fluostar Óptima a la longitud de

onda de 585 nm, a las 24 horas. Los resultados de las cepas Tipo empleadas en este estudio

fueron obtenidos a partir de la base de datos del BiologTM.

3.6.1 Metabolitos para microorganismos Gram positivos

Los metabolitos que constituyen la microplaca GP2 utilizada para los

microorganismos Gram positivos son: α-ciclodextrina (A2), β-ciclodextrina (A3), dextrina

(A4), glucógeno (A5), inulina (A6), manano (A7), tween 40 (A8), tween 80 (A9), N-acetil-D-

glucosamina (A10), N-acetil-D-manosamina (A11), amigladina (A12), L-arabinosa (B1), D-

arabitol (B2), D-arbutina (B3), D-celobiosa (B4), D-fructosa (B5), L-fructosa (B6), D-galactosa

(B7), ácido D-galacturónico (B8), gentibiosa (B9), ácido D-glucónico (B10), α-D glucosa (B11),

68
Material y Métodos

m-inositol (B12), α-D-lactosa (C1), lactulosa (C2), maltosa (C3), maltotriosa (C4), D-manitol

(C5), D-manosa (C6), D-melezitosa (C7), D-melibiosa (C8), α-metil D-galactosidasa (C9), β-

metil D-galactosidasa (C10), 3-metil glucosa (C11), α-metil D-glucósida (C12), β-metil D-

glucosida (D1), α-metil D-manosida (D2), palatinosa (D3), D-psicosa (D4), D-rafinosa (D5), L-

ramnosa (D6), D-ribosa (D7), salicina (D8), seudoheptulosa (D9), D-sorbitol (D10) estaquiosa

(D11), sacarosa (D12), D-tagatosa (E1), D-trehalosa (E2), turanosa (E3), xilitol (E4), D-xilosa

(E5), ácido acético (E6), ácido α-hidroxibutírico (E7), ácido β-hidroxibutírico (8), ácido γ-

hidroxibutírico (E9), ácido ρ-hidroxibutírico (E10), α-cetoglutárico (E11), ácido α-cetovalérico

(E12), lactamida (F1), ácido metil éster D-láctico (F2), ácido L-láctico (F3), ácido D-málico (F4),

ácido L-málico (F5), metil piruvato (F6), mono metil succinato (F7), ácido propiónico (F8),

ácido pirúvico (F9), ácido succinámico (F10), ácido succínico (F11), ácido N-acetil-L-

glutámico (F12), L-alaninamida (G1), D-alanina (G2), L-alanina (G3), L-alanil glicina (G4), L-

asparragina (G5), ácido L-glutámico (G6), ácido glicil L-glutámico (G7), ácido L-proglutámico

(G8), L-serina (G9), putrescina (G10), 2,3-butanadiol (G11), glicerol (G12), adenosina (H1), 2´-

deoxiadenosina (H2), inopina (H3), timidina (H4), uridina (H5), adenosina 5´-monofosfato

(H6), timidina-5´-monofosfato (H7), uridina 5´-monofosfato (H8), fructosa-6-fosfato (H9),

glucosa-1-fosfato (H10), glucosa-6-fosfato (H11), D-L-α-glicerolfosfato (H12).

3.6.2 Metabolitos para microorganismos Gram negativos

La fuente de carbono que ocupa cada uno de los 95 pocillos de la microplaca GN2

son: α-ciclodextrina (A2), dextrina (A3), glucógeno (A4), tween 40 (A5), tween 80 (A6), N-

acetil-D-galactosamina (A7), N-acetil-D-glucosamina (A8), adonitol (A9), L-arabinosa (A10),

D-arabitol (A11), D-celobiosa (A12), eritritol (B1), D-fructosa (B2), L-fructosa (B3), D-

galactosa (B4), gentibiosa (B5), α-D-glucosa (B6), m-inositol (B7), α-D-lactosa (B8), lactulosa

(B9), maltosa (B10), manitol (B11), D-manosa (B12), D-melibiosa (C1), β-metil D-glucósida

(C2), D-psicosa (C3), D-rafinosa (C4), L-ramnosa (C5), D-sorbitol (C6), sacarosa (C7), D-

trehalosa (C8), turanosa (C9), xilitol (C10), ácido pirúvico metil éster (C11), ácido succínico

mono-metil- éster (C12), ácido acético (D1), Cis-ácido aconítico (D2), ácido cítrico (D3), ácido

fórmico (D4), ácido D- galactónico lactona (D5), ácido D-galacturónico (D6), ácido D-

glucónico (D7), ácido D-glucosamínico (D8), ácido D-glucurínico (D9), ácido α-

hidroxibutírico (D10), ácido β-hidroxibutírico (D11), ácido γ-hidroxibutírico (D12), ácido p-

hidroxifenilacético (E1), ácido itacónico (E2), ácido α-ceto butírico (E3), ácido α-ceto glutarico

69
Material y Métodos

(E4), ácido α-ceto valérico (E5), ácido D,L- láctico (E6), ácido malónico (E7), ácido propiónico

(E8), ácido quínico (E9), ácido D-sacárico (E10), ácido sebácico (E11), ácido succínico (E12),

ácido bromosuccínico (F1), ácido succinámico (F2), glucoronamida (F3), L-alaninamida (F4),

D-alanina (F5), L-alanina (F6), L-alanil-glicina (F7), L-aspargina (F8), ácido L-aspártico (F9),

ácido glutámico (F10), ácido glicil-L- aspártico (F11), ácido glicil-L- glutámico (F12), L-

histidina (G1), hidroxi-L-prolina (G2), L-leucina (G3), L-ornitina (G4), L-fenilalanina (G5), L-

prolina (G6), ácido L- piroglutámico (G7), D-serina (G8), L-serina (G9), L-treonina (G10), D,L-

carnitina (G11), γ-ácido amino butírico (G12), ácido urocánico (H1), inosina (H2), uridina

(H3), timidina (H4), fenil-etil-amino (H5), putrescina (H6), 2-aminoetanol (H7), 2,3-

butanediol (H8), glicerol (H9), D, L-α-fosfato glicerol (H10), α-D-glucosa 1-fosfato (H11), D-

glucosa-6-fosfato (H12).

3.7 Estudio del espectro-salino y crecimiento en salinidad

El efecto de la concentración salina sobre el crecimiento microbiano se determinó en

un rango de salinidad comprendido entre 0,5 y 30% (p/v) de sales (0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 10;

15; 20; 25 y 30% (p/v)). Para ello, se inoculó 1 ml de cultivo de 18 horas de cada una de las

cepas objeto de estudio a 100 ml de medio líquido MY a la concentración de sal a estudiar, en

matraz Erlenmeyer de 250 ml. Los matraces se incubaron a 28°C durante 72 horas con

agitación constante de 100 rpm.

3.8 Producción de exopolisacáridos (EPS)

Los exopolisacáridos, recibieron como denominación las mismas siglas que los

microorganismos que los producen, y se obtuvieron según la metodología descrita por Calvo

y col. (2002). La producción de EPS se realizó en medio MY a aquellas concentraciones

salinas a las que el microorganismo objeto de estudio presentó un crecimiento óptimo.

Matraces Erlenmeyer de 500 ml que contenían 100 ml de medio MY fueron inoculados con 1

ml de un cultivo de 18 horas de cada una de las cepas a estudiar. Posteriormente los

matraces fueron incubados a 28°C con agitación constante a 100 rpm., durante 7, 15, 21 y 30

días. Transcurrido el tiempo de incubación, los cultivos bacterianos se centrifugaron a 9.000

rpm durante 45 minutos (Centrifuga Beckman Avanti-J25). Al sobrenadante se le adicionaron

tres volúmenes de etanol 96 % (v/v) frío (-80°C) y tras 24 horas se recogió el precipitado del

material extracelular (EPS) mediante centrifugación a 7.500 rpm durante 15 minutos a 4°C

70
Material y Métodos

con el fin de eliminar los restos del alcohol. A continuación, se dejaron evaporar totalmente

los posibles restos de etanol en el precipitado y este se solubilizó en agua destilada.

Posteriormente, la solución se dializó empleando membranas de diálisis Midicell de 12-14

kDa de tamaño de poro durante 24 horas en agua destilada y por último, se liofilizó y se

determinó la producción por gravimetría (Figura 3.4).

La productividad de cada cepa se expresó en gramos de EPS (producto final liofilizado) por

litro de medio de cultivo.

Células

1 ml

Cepa bacteriana
(Halomonas variabilis W10) MY3% (p/v) MY3% (p/v) 28ºC/ Sobrenadante
28ºC /24 h 7,15, 21 y 30 días 9.000 rpm / 45 min

Sedimento (EPS)
Exopolisacárido
Liofilización
7.500 rpm / 15 min Precipitación
Alcohólica
Diálisis 4ºC/24 h

Figura 3.4. Esquema del proceso de extracción de los exopolisacáridos (EPS). Se muestran las
distintas fases para el proceso de purificación.

3.8.1 Composición química de los EPS: Análisis colorimétrico

Los exopolisacáridos de las distintas cepas objeto de estudio, obtenidos bajo las

condiciones de producción anteriormente citadas, fueron analizados químicamente. Estos

estudios se llevaron a cabo mediante ensayos colorimétricos utilizando un espectrofotómetro

HITACHI U-2000.

3.8.1.1 Contenido en carbohidratos totales

La determinación del contenido de carbohidratos totales se realizó siguiendo la

metodología descrita por Dubois y col (1956). Este método se basa en la presencia de ésteres

metílicos en los mono, oligo, y polisacáridos así como en sus derivados, los cuales son grupos

potencialmente reductores que dan una coloración amarillo-anaranjada estable cuando se

tratan con fenol y ácido sulfúrico. El ácido sulfúrico provoca la hidrólisis del polisacárido de

modo que al quedar los monómeros libres reaccionan con el fenol y se obtiene la coloración

que servirá para la cuantificación de los carbohidratos presentes en la muestra.

71
Material y Métodos

Los reactivos utilizados fueron:

- Ácido sulfúrico de pureza 95-98 % (v/v) (Panreac)

- Solución de fenol en agua al 5 % (p/v) (Sigma).

Así, a partir de una suspensión de 1 mg/ml de exopolisacárido en agua destilada, se

tomaron 30 µl y se completó hasta 200 µl con agua destilada. A esta mezcla se adicionaron

200 µl de fenol al 5 %, se agitó vigorosamente y se añadió bruscamente 1 ml de ácido

sulfúrico, con objeto de que la solución entrara en ebullición para que la reacción

transcurriera correctamente. Tras 10 minutos de incubación a temperatura ambiente se

registró la absorbancia de las muestras a una longitud de onda de 490 nm. La curva patrón

(Figura 3.5) se preparó a partir de una solución de glucosa (Sigma) en agua destilada a

concentración de 1 mg/ml a partir de la cual se realizaron una serie de diluciones (Tabla 3.7).

Tabla 3.7. Composición de las soluciones de la curva patrón de carbohidratos.

Tubo 1 2 3 4 Blanco

Solución madre (µl) 10 15 20 30 0

Agua destilada (µl) (p/v) 190 185 180 170 200

Fenol 5% (µl) (p/v) 200 200 200 200 200

Ácido sulfúrico (ml) 1 1 1 1 1

y = 0,0465x
1,5
Absorbancia 490 nm

R2 = 0,9993

0,5

0
0 5 10 15 20 25 30

Glucosa (mg/ml)

Figura 3.5. Representación de una de las curvas patrón de carbohidratos totales. En ordenadas se
representa la absorbancia a 490 nm de 4 concentraciones distintas de Glucosa sometidas al ensayo con
fenol y ácido sulfúrico.

3.8.1.2 Contenido en proteínas

Para la determinación del contenido en proteínas se siguió la metodología descrita

por Bradford (1976), esta técnica está basada en la formación de un compuesto azulado

72
Material y Métodos

debido a la formación de un complejo entre proteínas y el reactivo colorante “Azul de

coomassie”. Se trata de un método más sensible que el tradicional de Lowry (Lowry y col.,

1951) que permite detectar pequeñas cantidades de proteínas. El reactivo utilizado fue:

Reactivo de Bradford o Azul de coomassie (coomassie Brillant Blue 250) (Sigma).

Técnicamente se partió de una suspensión de 1 mg/ml de exopolisacárido en agua

destilada, se tomaron 200 µl y se completaron hasta 800 µl con agua destilada. A esta solución

se le añadieron 250 µl del reactivo de Bradford, agitando la muestra vigorosamente para

finalmente medir la absorbancia de las muestras a una longitud de onda de 590 nm. El

reactivo empleado origina una coloración azul con las proteínas que permanece estable al

menos durante una hora, a partir de la cual el complejo tiende a agregarse pudiendo aparecer

un precipitado que provoca la alteración de las medidas, Así, para mayor precisión de la

determinación, la medida de absorbancia de las muestras debe realizarse entre 5 y 20

minutos siguientes de la adición del reactivo.

Se preparó una solución de 1 mg/ml de albúmina sérica bovina (Sigma) (Tabla 3.8), a partir

de la cual se realizó una dilución de 1/10 (100 mg/ml) que constituyó la solución madre para

llevar a cabo la curva patrón (Figura 3.6).

Tabla 3.8. Composición de las soluciones de la curva patrón de proteínas.
Tubo 1 2 3 4 5 Blanco

Solución madre (µl) 20 30 50 70 80 0

Agua destilada (µl) 780 770 750 730 720 800

Reactivo Bradford (µl) 200 200 200 200 200 200

0,5

0,4 y = 5,0416x
Absorbancia 590nm

R2 = 0,9971
0,3

0,2

0,1

0
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08

Albúmina (mg/ml)

Figura 3.6. Representación de una de las curvas patrón de proteínas. En ordenadas se representa la
absorbancia a 590 nm de 6 concentraciones distintas de albúmina sometidas al ensayo de Bradford.

73
Material y Métodos

3.8.2 Actividad emulgente

Para determinar la actividad emulgente del material extracelular se siguió la

metodología descrita por Cooper y Goldenberg (1987). En el ensayo se utilizaron tubos con

fondo plano, en los que se dispusieron 3 ml de la fase oleosa y 3 ml de la fase acuosa, que

consiste en una preparación del biopolímero al 0,5 % (p/v). El ensayo se llevó a cabo a

temperatura ambiente, y las sustancias hidrófobas estudiadas fueron:

• Hidrocarburos alifáticos: n-octano

• Hidrocarburos aromáticos: tolueno y xileno

• Aceites minerales: ligero y pesado.

• Mezclas complejas: crudo Kirkuk (Repsol)

• Mezclas de compuestos derivados del petróleo: Diesel

Para la determinación del porcentaje de emulsión, los tubos se agitaron

vigorosamente durante un minuto en vortex para poner en contacto ambas fases, acuosa y

oleosa. Tras la agitación las muestras se dejaron reposar, tomándose las medidas del

porcentaje de la fase emulsionada a la hora y a las 24 horas, para determinar la actividad

emulgente y la estabilidad de las preparaciones. La actividad emulgente representa la

fracción emulsionada (la altura de la misma) respecto al volumen total de la muestra (altura

en el tubo).

Altura emulsión
% Actividad emulgente = x 100
Altura mezcla

3.9 Degradación de hidrocarburos

3.9.1 Crecimiento en medio sólido con HPA
Para determinar el crecimiento de las cepas seleccionadas en presencia de HPA. Se

utilizó el medio S4 suplementado del HPA al 1% (p/v), la composición del medio se describió

anteriormente en el apartado 3.2 de esta sección (Tabla 3.4). Para ello se partió de un cultivo

bacteriano de 18 horas en el medio MY 3%, del cual se tomó una cantidad de la masa celular

aproximada de 30 mg, y se resembró por triplicado en placas del medio S4 adicionado de

naftaleno, fenantreno, antraceno o pireno al 1% (p/v). Las placas se incubaron a 28°C durante

48 horas, la aparición de colonias en la superficie del agar se evaluó como resultado positivo.

74
Material y Métodos

3.9.2 Crecimiento en medio líquido con naftaleno

La evaluación de la capacidad de utilización de naftaleno como única fuente de

carbono por las 18 cepas seleccionadas se llevó a cabo siguiendo la metodología propuesta

por Soeder y col (1996). Para la elaboración del medio mínimo marino sintético (MMS), cuya

composición se ha descrito en el apartado 3.2 de esta sección, se utilizó una solución stock de

sales, de composición similar a la del agua del mar que se emplea de forma habitual en los

estudios de bacterias marinas y halófilas, a una concentración del 1% (p/v) suplementada con

NH4NO3 (Merk®) y Na2HPO4 (Merk®) para adecuar la relación C/N/P. La concentración de

sal seleccionada fue del 1% (p/v) para evitar acumulaciones de sales que se puedan originar a

nivel de la columna del cromatógrafo HP1050. Para ello, se utilizaron matraces Erlenmeyer

de 250 ml con 50 ml de medio mínimo marino sintético (MMS) que fueron inoculados con 0,5

ml de un cultivo de 18 horas (28°C, 100 rpm) de cada una de las cepas a estudiar, el naftaleno

(HPA) se adicionó a una concentración de 1% (p/v) y los matraces Erlenmeyer se incubaron a

28°C con agitación constante de 100 rpm durante 72 horas. Los recuentos de

microorganismos junto con las extracciones del naftaleno se realizaron, por triplicado, a las 0,

24, 48 y 72 horas. Para el recuento microbiano, se tomaron 0,1 ml de cada erlenmeyer y se

sembró en placas de MY al 1% (p/v) de sales, las placas se incubaron a 28°C durante 48 horas.

3.9.2.1 Determinación de la cantidad óptima del disolvente para la extracción de

naftaleno

El disolvente utilizado para la extracción de naftaleno en el medio mínimo marino

sintético (MMS) al 1% de sales (p/v) fue metanol (calidad HPLC). Para la determinación de la

cantidad óptima del mismo para la obtención del mayor rendimiento de extracción del

hidrocarburo policíclico aromático (HPA) se utilizaron cantidades crecientes de disolvente en

50 ml de medio MMS al 1% (p/v) de sales y adicionado de naftaleno al 1 % (p/v). Las

cantidades de metanol empleadas fueron: 25, 50, 75, 100, 150 y 175 ml. Los valores obtenidos

se muestran en la Figura 3.7. Tras el estudio de los resultados obtenidos, se consideró la

adición de 150 ml de metanol (disolvente) como cantidad óptima para realizar las

extracciones del hidrocarburo.

75
Material y Métodos

20000

15000

Área de pico
10000

5000

0
0 50 100 150 200
Me tanol (ml)

Figura 3.7. Cantidades de metanol adicionadas para una mayor extracción de naftaleno. Valores
obtenidos mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

3.9.2.2 Curva patrón de naftaleno

Para la determinación cuantitativa de la concentración de naftaleno se elaboró una

curva patrón a partir de soluciones de naftaleno en el medio MMS a las concentraciones de

0,05%; 0,125%; 0,25%; 0,5%; 0,75% y 1% (p/v).

La ecuación de la recta a partir de la cual se han interpolado los datos de este trabajo fue:

y=17459x, siendo x la concentración de naftaleno expresada por los valores de las áreas

obtenidas al someter las muestras a HPLC (Figura 3.8).

20000
y = 17459x
15000 R2 = 0,9988
Área de pico

10000

5000

0
0 0,25 0,5 0,75 1
Metanol (ml)

Figura 3.8. Representación de una de las curvas patrón de naftaleno. Valores obtenidos mediante
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

3.9.2.3 Extracción y cuantificación de naftaleno

La determinación de la cantidad de naftaleno utilizada por los microorganismos

seleccionados se realizó por Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC), en un

cromatógrafo HP1050 dotado de una columna de fase reversa C-18 Spherisob ODS-1 (125 x

76
Material y Métodos

4mm) y un detector diode array (DAD) (Figura 3.9). Como fase móvil se utilizó acetonitrilo

80% y agua bidestilada 20% mediante un flujo isocrático de 1 ml/min.

Figura 3.9. Fotografía de un cromatógrafo HP-1050.

Para realizar la extracción, se adicionaron 150 ml de metanol al matraz con 50 ml de

cultivo, el conjunto se sometió a ultrasonidos durante 15 minutos para facilitar la

solubilización del hidrocarburo. A continuación se centrifugaron durante 30 minutos a 6.000

rpm, tras lo que se tomó 1 ml del sobrenadante para el estudio en HPLC. Posteriormente se

analizaron las áreas de los distintos picos obtenidos en los cromatogramas, tras su

integración. La degradación del hidrocarburo policíclico aromático se determinó en base a la

disminución producida en las áreas de los picos a los diferentes tiempos de incubación.

3.9.3 Crecimiento en presencia de crudo Kirkuk

Para evaluar la influencia de las mezclas complejas de hidrocarburos se determinó el

efecto de crudo sobre el crecimiento microbiano siguiendo la metodología descrita por Déziel

y colaboradores (1996). El crudo utilizado fue de tipo “Kirkuk”, suministrado por la refinería

Repsol de Puertollano (Ciudad Real), cuyas características más relevantes se presentan en la

Tabla 3.9.
Tabla 3.9. Características más relevantes del crudo Kirkuk
Densidad 15 ºC 0,848 g/ml

Viscosidad 20 ºC 10,05 CST

Punto de congelación -20 ºC

Tipo Parafinico

Procedencia Irak

Para el estudio de la capacidad degradadora del crudo Kirkuk por las 18 cepas

seleccionadas se empleó el medio MMS al 1% (p/v) de sales, para ello, se añadieron 100 ml de

medio MMS al 1% de sales en matraces Erlenmeyer de 500 ml. A cada matraz se le adicionó

77
Material y Métodos

el crudo a una concentración del 1% (v/v). Los matraces se inocularon con 1 ml de un

preinóculo de 18 horas de cada una de las cepas objeto de estudio en medio MY 1%. Los

matraces Erlenmeyer se incubaron durante 15 días a 28°C con agitación constante de 100

rpm. Los recuentos de las unidades formadoras de colonias se realizaron por triplicado en

placas de MY 1% a las 0h, 24h, 48h, 72h, 7 días y 15 días, y la extracción del crudo se realizó a

tiempo inicial (0 horas) y tiempo final (15 días).

3.9.3.1 Extracción de crudo

La extracción de crudo se realizó empleando la mezcla hexano-acetona (1:1)

siguiendo la metodología EPA 8015 (US EPA, 1996). La primera etapa consistió en la adición

de 50 ml de la mezcla Hexano-Acetona (1:1) al matraz que contenía el cultivo en presencia de

crudo que a continuación fue sometido a agitación durante 5 minutos, la segunda etapa

consistió en la decantación de la mezcla mediante embudo de decantación para facilitar la

separación de las dos fases oleosa y acuosa. El procedimiento se repitió un par de veces para

extraer el resto de hidrocarburos que quedaba adherido a las paredes del matraz. Así, se

recuperó la fase oleosa en matraces de bola y se llevó a un rotavapor a una temperatura de

50°C con agitación constante de 90 rpm. Por último se recuperó el crudo con 1 ml de

cloroformo en un vial para su posterior análisis por Cromatografía de

Gases/Espectrofotometría de Masas (GC/MS).

3.9.3.2 Determinación del contenido en hidrocarburos totales (TPH)

La determinación de hidrocarburos alifáticos, alicíclicos, bencénicos y policíclicos

aromáticos se realizó mediante GC/MS con previa extracción con Hexano-Acetona y

Cloroformo. Los análisis se realizaron en un cromatógrafo Hewlett Packard 6890,

Espectrofotómetro de Masas Hewlett Packard HP 5973, utilizando una librería de espectros:

Wiley 275. Las variaciones en la composición del hidrocarburo se establecieron en términos

de variación del área respecto al experimento control.

3.10 Ensayo catecol-dioxigenasa

Las enzimas catecol-dioxigenasas catalizan la transformación de catecol a ácido cis,

cis-mucónico de color amarillo. Para determinar si esta enzima estaba implicada en el

metabolismo del naftaleno se siguió la metodología descrita por Patil y col (2004). Para este

78
Material y Métodos

ensayo se pulverizaron las placas con una solución de catecol a 0,5 M. Se seleccionaron como

positivas aquellas colonias que mostraron un cambio de coloración hacia el amarillo-marrón

después de 5 minutos. Posteriormente, en placa con medio TSA adicionado de Amp100, se

sembró la colonia que reaccionó con la solución de catecol debido a la expresión de la enzima

catecol 2,3 dioxigenasa la placa sembrada a continuación se incubó a 37°C durante 24 horas.

3.11 Programas estadístico empleados

Los resultados obtenidos se analizaron estadísticamente, empleando los programas

estadísticos: CANOCO 4,5, Primer 6 y SPSS15.0 para Windows. Los análisis realizado

mediante estos programas estadísticos consistieron por una parte en calcular la media de las

tres replicas analizadas y obtener su desviación estándar para todos los parámetros

estudiados y por otra parte obtener comparaciones entre los distintos resultados obtenidos

mediante conglomerados jerárquicos y los análisis multivariable de redundancia (RDA). Con

cada uno de los tres programas estadísticos se realizaron los siguientes análisis:

 SPSS15.0 para Windows

 Calculo de la media de las tres replicas de todos los parámetros estudiados.

 Test de DHS de Tukey entre las medias para la determinar las comparaciones múltiples

de los parámetros estudiados así como determinar la influencia de los factores de variación

en los análisis.

 CANOCO 4,5

 Análisis multivariable de redundancia (RDA) que permitió explicar de forma general los

resultados obtenidos utilizando más de una variable independiente.

 Primer 6
 Análisis de los resultados obtenidos mediante un estudio multivariante y

multidimensional que permite visualizar como se agrupan los diferentes variables

dependientes de los parámetros estudiados.

79
44.. RRE
ESSU
ULLTTA
ADDOOSS

81
80
Resultados

4.1 CAPÍTULO I. CARACTERIZACIÓN FILOGENÉTICA Y FENOTÍPICA DE

LAS CEPAS
La biorremediación de hidrocarburos es una de las líneas de investigación

abordada por el grupo de Microbiología Ambiental de la UGR desde hace más de 10 años.

En estos estudios y de forma rutinaria se realiza el aislamiento de cepas bacterianas

potencialmente útiles para su aplicación biotecnológica en la recuperación de ecosistemas

contaminados. En este sentido, la selección de las mismas se hizo de acuerdo con su

capacidad para proliferar en presencia de diferentes hidrocarburos y para producir

biopolímeros con actividad emulgente y/o biosurfactante, ya que, los microorganismos que

son capaces de proliferar en presencia de hidrocarburos, frecuentemente producen

biopolímeros con actividad emulgente, esta propiedad se atribuye a una estrategia biológica

para facilitar la biodisponibilidad de compuestos hidrofóbicos. En este trabajo de

investigación se han caracterizado 18 cepas bacterianas que habían sido seleccionadas en

estudios previos por su capacidad para crecer en medios con hidrocarburos y/o producir

exopolisacáridos con actividad emulgente, tal y como se ha mencionado anteriormente en el

apartado 3.1 de la sección de Material y Métodos.

4.1.1 Caracterización filogenética de las cepas

4.1.1.1 Identificación filogenética de las cepas seleccionadas
La amplificación del gen ARNr 16S se realizó siguiendo el protocolo mencionado

en el apartado material y métodos para todas las cepas estudiadas en la presente memoria

de tesis doctoral. Los resultados de la PCR y la electroforesis del ADN bacteriano se

muestran en la Figura 4.1.

Como se puede apreciar en la Figura 4.1, la amplificación del ADNr 16S de las

cepas originó fragmentos de ADN de aproximadamente 1.400-1.500 pb en consonancia con

el tamaño esperado de 1.500 pb, estas reacciones se purificaron mediante el Kit comercial

PCR Quick Clean (QIAGEN) para las cepas W1, F2, W3, W4, W7, W12, W16, W18, F20,

S21, S22, S24 y S27 y el kit comercial QIAEX II Agarose Gel Extraction (QIAGEN®) para las

cepas W5, W8, W10, W15 y F17, el producto de PCR purificado fue secuenciado

posteriormente.

83
Resultados

W1 F2 W3 W4 W5 W7 W8 W10 W12 W15 W16 F17 W18 F20 S21 S22 S24 S27 C+ C-

2.000
1.500

500

300

100

Figura 4.1. Producto de reacción de PCR tras la amplificación del fragmento del gen ADNr 16S de
1.500 pb. (C-: control negativo; C+: control positivo (ADN genómico de Escherichia coli)).

Tras la búsqueda en la base de datos GenBank mediante programa BLASTX search,

las bandas secuenciadas de las 18 cepas objeto de este estudio presentaron porcentajes de

identidad generalmente del 99% con las secuencias de las especies de referencia, lo que

indica que estamos trabajando con los datos adecuados para el posterior análisis

filogenético. La Tabla 4.1 recoge la identificación taxonómica y los porcentajes de identidad

de cada cepa incluida en este estudio.

Tabla 4.1. Porcentaje de identidad y longitud de los fragmentos del gen ADNr 16S
secuenciados
Cepas Secuencia del gen 16S ARNr Identidad (%) Secuencia (pb)

W1 CP000485 Bacillus thuringiensis 99 1448

W15 GU980767 Bacillus pumilus 99 1480

W16 EU869282 Bacillus pumilus 99 1428

F17 GU980767 Bacillus pumilus 99 1480

F20 EU660365 Bacillus pumilus 99 1511

S22 EU221329 Bacillus pumilus 99 1549

S27 EU221329 Bacillus pumilus 99 1549

F2 EU086802 Brevibacterium casei 99 1448

W3 AJ564880 Halomonas alkantarctica 99 1518

W4 AJ294347 Halomonas variabilis 99 1352

W10 AJ294347 Halomonas variabilis 98 1352

W12 EU864257 Halomonas spp 98 1495

W5 EU864264 Thalassospira sp. 99 1463

W7 EU864264 Thalassospira sp. 99 1463

W8 EF685677 Marinobacter sp. 99 1459

W18 DQ665792 Pseudoalteromonas elyakovii 98 1361

S21 EF552157 Pseudomonas fluorescens 98 1423

S24 AF268029 Pseudomonas grimontii 99 1501

84
Resultados

4.1.1.2 Estudio de la relación evolutiva entre las cepas seleccionadas

Para establecer las relaciones evolutivas entre los distintos microorganismos

caracterizados en este trabajo de investigación, realizamos un breve estudio filogenético

cuyos resultados se muestran en la Figura 4.2.

99 F2
Actinobacteria
Brevibacterum casi (EU086802)

85 99 W1
Bacillus thuringiensis (CP000485)

65 W15

85 F17
S27
Bacillus pumilus (GU980767)
99
Bacillus pumilus (EU869282)
Firmicutes
Bacillus pumilus (EU221329)
W16
F20
S22
Bacillus pumilus (EU660365)

89 W5
W7 Alfa-Proteobacteria
96
Thalassospira sp. (EU864264)

91 W18
Pseudoalteromonas elyakovii (DQ665792)
S24
S21
70 Pseudomonas fluorescens (EF552157)
100
Pseudomonas grimontii (AF268029)
Halomonas sp. (EU864257) Gamma-Proteobacteria
W3
Halomonas alkantarctica (AJ564880)
W12
80
56 W4
W10
64
100 Halomonas variabilis (AJ294347)
W8
91 Marinobacter sp. (EF685677)

0.05
Figura 4.2. Árbol filogenético basado en la secuencia del gen ARNr 16S obtenido mediante el
método Neighbour-Joining. Los números de acceso en la base de datos Gen Bank de las secuencias
de las especies de referencia son dados entre paréntesis. La barra indica un 5% de divergencia. Se
indican los valores de “bootstrap” mayores del 50%.

Basándonos en los resultados obtenidos, se puede observar que los

microorganismos se encuadran en tres grupos taxonómicos: i) Firmicutes, ii) (α- y γ-)

Proteobacteria y iii) Actinobacteria. El primer grupo incluyó siete cepas del género Bacillus

incluyendo la cepa W1 identificada como Bacillus thuringiensis con 99% de identidad, y las

85
Resultados

cepas W15, W16, F17, F20, S22 y S27 identificadas como Bacillus pumilus con 99% de

identidad.

Por otra parte, dentro del grupo γ-proteobacteria, se identificaron 4 cepas

pertenecientes al género Halomonas: W3 identificada como Halomonas alkantarctica con 99%

de identidad, W4 y W10 como Halomonas variabilis con un porcentaje de identidad del 99% y

98%, respectivamente, y la cepa W12 que fue identificada como Halomonas sp. con un

porcentaje de identidad del 98%. Asimismo, dentro de este grupo fueron incluidas las cepas

W18 identificada como Pseudoalteromonas elyakovii con 98% de identidad, S21 clasificada

como Pseudomonas fluorescens con 98% de identidad y S24 identificada como Pseudomonas

grimontii con 99% de identidad y W8 identificada como Marinobacter sp. con 99% de

identidad. Por otro lado, dentro del grupo α-proteobacteria se obtuvieron W5 y W7

identificadas como Thalassospira sp. con 99% de identidad. Por último, la cepa F2 fue

identificada como Brevibacterium casei con 99% de identidad y perteneció al tercer grupo

actinobacteria que incluye los microorganismos Gram positivos con alto G+C.

4.1.2 Caracterización fenotípica de las cepas

4.1.2.1 Utilización de metabolitos por las cepas seleccionadas
Durante este trabajo de investigación se realizó el estudio de la caracterización

metabólica, tanto para los microorganismos Gram positivos como para aquellos Gram

negativos incluidos en este estudio, frente a 95 fuentes de carbono utilizando el kit BiologTM

descrito anteriormente en el apartado 3.6 de la sección de Material y Métodos. La

interpretación de los resultados se realizó considerando como resultado positivo el cambio

de coloración obtenida en cada pocillo de la microplaca GN2 y GP2 del sistema BiologTM,

generado por los microorganismos Gram positivos y Gram negativos caracterizados. Los

resultados del análisis colorimétrico basado en el uso del Kit comercial BiologTM, para las

distintas cepas Gram positivas seleccionadas se reflejan en la Tabla I, anexo I. Estos datos

indicaron que la cepa Brevibacterium casei F2 fue la única capaz de utilizar como fuente de

carbono todos los compuestos ensayados. Por otro lado destacar que los compuestos α-D

glucosa, Maltotriosa y D-ribosa fueron utilizados por las 8 cepas Gram positivas estudiadas.

Los compuestos utilizados por las bacterias Gram negativas como fuentes de

carbono se resumen en la Tabla II, anexo I. Estos resultados mostraron la capacidad

metabólica de las cepas Gram negativas seleccionadas en este estudio para utilizar los

86
Resultados

distintos compuestos como fuente de carbono. Así, obtuvimos que de las 10 cepas Gram

negativas ensayadas, solamente 2 de ellas (Marinobacter sp. W8 y Pseudomonas fluorescens

S21) fueron capaces de utilizar todos los compuestos como fuente de carbono. De los

resultados obtenidos cabe destacar el compuesto L-arabinosa que fue utilizado por todas las

cepas Gram negativas seleccionadas.

4.1.2.2 Perfiles metabólicos obtenidos

Los patrones metabólicos para los microorganismos Gram positivos se obtuvieron

a partir de la interpretación de la intensidad de la coloración obtenida en cada pocillo de la

microplaca GP2, de la cual se realizaron las medidas de los niveles de coloración en un

lector de placas de micro-titulación a una longitud de onda de 585 nm.

Las 7 cepas del género Bacillus (Figura 4.3) presentan un patrón metabólico

homogéneo, dentro de los cuales se pudo diferenciar dos perfiles relativamente distintos: un

primer perfil metabólico presentado por la cepa Bacillus thuringiensis W1 y el segundo perfil

presentado por las cepas Bacillus pumilus W15, W16, F17, F20, S22 y S27.
1200

1000

800 B. pumilus W15

Absorbancia585nm

B. pumilus W16

600 B. pumilus F17

B. pumilus F20
B. pumilus S22
400
B. pumilus S27
B. thuringiensis W1
200

0
A1

A7

B1

B7

C1

C7

D1

D7

E1

E7

F1

F7

G1

G7

H1

H7

Metabolitos

Figura 4.3. Patrón de absorbancia de las cepas W1, W15, W16, F17, F20, S22 y S27 del género
Bacillus. Oxidación/fermentación de las distintas fuentes de carbono ensayadas en la microplaca
GP2.
Por otra parte, dentro del mismo grupo de bacterias Gram positivas, la cepa

Brevibacterium casei F2 (Figura 4.4) presentó un perfil metabólico totalmente distinto, ya que

este microorganismo fue capaz de metabolizar todos los compuestos ensayados.

87
Resultados

1200

1000

800

Absorbancia585nm
Brevibacterium casei F2

600

400

200

H1
H7
A1
A7
B1
B7
C1
C7
D1
D7
E1
E7
F1
F7
G1
G7
Metabolitos

Figura 4.4. Patrón de absorbancia de la cepa F2 del género Brevibacterium.

Oxidación/fermentación de las distintas fuentes de carbono ensayadas en la microplaca GP2.

En cuanto a los microorganismos Gram negativos, se obtuvieron perfiles

metabólicos diferentes, debido fundamentalmente a que las cepas bacterianas pertenecían a

5 géneros distintos. Los patrones metabólicos obtenidos por las 4 cepas del género

Halomonas (Figura 4.5) presentaron tres perfiles distintos, un perfil presentado por las cepas

W4 y W10 identificadas como Halomonas variabilis, el segundo perfil metabólico fue

presentado por la cepa Halomonas sp. W12 y el perfil metabólico presentado por la cepa

Halomonas alkantarctica W3.

1200

1000
Absorbancia585nm

800 Halomonas alkantarctica W3

600 Halomonas variabilis W4

Halomonas variabilis W10
400
Halomonas sp. W12
200

0
C5
C1
D7
E2
E9
F4
F1
G6
H1
H8
B3
B1
A1
A8

Metabolitos
Figura 4.5. Patrón de absorbancia de las cepas W2, W4, W10 y W12 del género Halomonas.
Oxidación/fermentación de las distintas fuentes de carbono ensayadas en la microplaca GN2.

Para las cepas W5 y W7 pertenecientes al género Thalassospira, los perfiles

obtenidos fueron similares, mientras que el perfil metabólico obtenido por la cepa W8 del

género Marinobacter se mostró diferente (Figura 4.6).

88
Resultados

1200

1000

Absorbancia585nm
800
Thalassospira sp. W5
600
Thalassospira sp. W7
Marinobacter sp. W8
400

200

C1

C7

D1

D7

E1

E7

F1

F7

G1

G7

H1

H7
B1

B7
A1

A7

Metabolitos

Figura 4.6. Patrón de absorbancia de las cepas W5, W7 del género Thalassospira, W8 del género
Marinobacter. Oxidación/fermentación de las distintas fuentes de carbono ensayadas en la
microplaca GN2.

Respecto a los perfiles metabólicos obtenidos para las cepas Pseudomonas fluorescens

S21, Pseudomonas grimontii S24 y Pseudoalteromonas elyakovii W18 (Figura 4.7), indicar que los

3 perfiles metabólicos distintos indicativos de la diversidad metabólica descrita para estas

especies bacterianas.
1200

1000
Pseudoalteromonas elyakovii W18
Absorbancia585nm

800
Pseudomonas fluorescens S21

600
Pseudomonas grimontii S24

400

200

0
A1
A7

B1
B7

C1
C7

D1
D7
E1

E7
F1

F7
G1

G7
H1

H7

Metabolitos

Figura 4.7. Patrón de absorbancia de las cepas W18 del Pseudoalteromonas, S21 y S24 del género
Pseudomonas. Oxidación/fermentación de las distintas fuentes de carbono ensayadas en la
microplaca GN2.

4.1.2.3 Interrelación de los distintos perfiles metabólicos de las cepas objeto

de estudio y sus cepas tipo
Para representar la similitud entre los perfiles metabólicos obtenidos se realizó un

análisis de conglomerados jerárquicos (SPSS14.0 para MS-Windows) que agrupa los

resultados dependiendo de la distancia o diferencia entre los resultados de los perfiles

metabólicos obtenidos. El resultado de este análisis para las bacterianas Gram positivas se

presenta en la Figura 4.8. El análisis de agrupamientos de los patrones metabólicos para

Gram positivos mostró 2 grandes agrupaciones, en la primera agrupación se englobaron las

89
Resultados

cepas W1, W15, W16, F17, F20, S22 y S27 pertenecientes al género Bacillus y la segunda

agrupación incluyó la cepa F2 perteneciente al género Brevibacterium.

Distancia media entre los grupos

0 5 10 15 20 25
Num +---------+---------+---------+---------+---------+

B.pumilus F17 òûòòòø

B.pumilus F20 ò÷ ùòòòòòø
B.pumilus S27 òòòòò÷ ùòø
B.pumilus W16 òòòòòòòòòòò÷ ùòòòòòòòø
B.thuringiensis W1 òòòòòòòòòòòòò÷ ùòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòø
B.pumilus W15 òòòòòòòòòòòûòòòòòòòòò÷ ó
B.pumilus S22 òòòòòòòòòòò÷ ó
Brevibacterium casei F2 òòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòò÷

Figura 4.8. Dendograma de análisis de clúster de los patrones metabólicos de microplaca GP2-
BiologTM de los microorganismos Gram positivos.

Respecto a los microorganismos Gram negativos, el dendograma obtenido reflejó 3

grupos (Figura 4.9). El primero englobó las cepas Marinobacter sp. W8 y Pseudomonas

fluorescens S21, la segunda agrupación incluyó las cepas W5 y W7 del género Thalassospira y

el tercer grupo incluyó las cepas W3, W4, W10 y W12 del género Halomonas y las cepas S24 y

W18 pertenecientes a los géneros Pseudomonas y Pseudoalteromonas, respectivamente.

Distancia media entre los grupos

0 5 10 15 20 25
Num +---------+---------+---------+---------+---------+

Marinobacter sp.W8 òûòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòø

P. fluorescens S21 ò÷ ó
Thalassospira sp.W5 òòòòòòòòòòòòòòòòòûòòòòòòòòòòòòòø ó
Thalassospira sp.W7 òòòòòòòòòòòòòòòòò÷ ó ó
H.variabilis W10 òòòûòø ó ó
Halomonas sp.W12 òòò÷ ùòø ùòòòòòòòòòòòòòòòòò÷
H. variabilis W4 òòòòò÷ ùòòòòòø ó
P.grimontii S24 òòòòòòò÷ ùòòòòòòòø ó
P.elyakovii W18 òòòòòòòòòòòòò÷ ùòòòòòòòòò÷
H.alkantarctica W3 òòòòòòòòòòòòòòòòòòòòò÷

Figura 4.9. Dendograma de análisis de clúster de los patrones metabólicos de la microplaca GN2-
BiologTM de los microorganismos Gram negativos.

Cuando se compararon los patrones metabólicos con la clasificación filogenética, se

constató la concordancia entre ambos tipos de clasificación para los microorganismos Gram

positivos. En Gram negativos se puso de manifiesto la mayor versatilidad del género

Pseudomonas.

90
Resultados

Por otro lado, con objeto de conocer la similitud de cada una de las cepas incluidas

en este estudio con la cepa tipo representativa del fenón correspondiente, se realizó un

estudio multivariante y multidimensional (Primer 6).

Respecto a los resultados obtenidos por los microorganismos Gram positivos

incluidos en este estudio, se realizó el análisis multidimensional mencionado anteriormente

para visualizar como se agruparon las diferentes cepas Gram positivas según los perfiles

metabólicos obtenidos junto con los perfiles metabólicos para las cepas tipo

correspondientes a cada especie. La representación en dos dimensiones obtenida en este

caso se ilustra en la Figura 4.10.

W16

F20
F17

S27
S22 W15
Cepa Tipo B. pumilus W1

Cepa Tipo B. thuringiensis

F2
Cepa Tipo B. casei

Figura 4.10. Representación gráfica en dos dimensiones de la correlación obtenida mediante el

análisis multidimensional. Se muestran las agrupaciones de las cepas del género Bacillus y
Brevibacterium juntos con las cepas tipo correspondientes.

Los resultados obtenidos mostraron que las cepas Bacillus pumilus W15, S22 y S27 se

encuentran en el mismo grupo junto con la cepa tipo Bacillus pumilus. Lo que indica que

dichas cepas metabolizan los mismos compuestos que la cepa tipo correspondiente. Por otra

parte la cepa Brevibacterium casei F2 se encuentra en el mismo grupo con la cepa tipo

correspondiente Brevibacterium casei, lo que indica el comportamiento similar de dicha cepa

con su cepa tipo, en cuanto a la utilización de los metabolitos. Por el contrario, la cepa B.

thuringiensis W1 y las cepas B. pumilus W16, F17 y F20 se encontraron en grupos distintos a

las cepas tipo correspondientes.

Con respecto a los resultados del ensayo BiologTM obtenidos por los

microorganismos Gram negativos incluidos en este estudio, se realizó de forma análoga el

análisis multidimensional que nos permitió visualizar como se agruparon las diferentes

cepas Gram negativas para cada género junto con las cepas correspondientes. La

91
 Resultados

representación en dos dimensiones obtenida para las cepas del género Halomonas se ilustra

en la Figura 4.11.

2D Stress: 0 1
Cepa Tipo Halomonas Halomonas alkantarctica W3
Cepa Tipo Halomonas alkantarctica
alkantarctica
Halomonas variabilis W4
Halomonas variabilis W10
W10 Halomonas sp, W12
Cepa Tipo Halomonas alkantarcticaDSM 15686T
Cepa Tipo Halomonas variabilis DSM 3051T
W12
W3 W4

Cepa Tipo Halomonas variabilis

Cepa Tipo Halomonas variabilis

Figura 4.11. Representación gráfica en dos dimensiones de la correlación obtenida mediante el

análisis multidimensional. Se muestran las agrupaciones de las cepas del género Halomonas juntos
con las cepas tipo correspondientes.

Los resultados obtenidos para las cepas del género Halomonas mostraron

agrupamientos distintos, por un lado, entre las 4 cepas y por otro lado entre las cepas objeto

de estudio y las cepas tipo correspondientes.

Asimismo, se realizó el mismo análisis para las cepas los géneros Thalassospira y

Marinobacter y se obtuvieron los resultados que se muestran en la Figura 4.12. Los

resultados obtenidos mostraron que, según el perfil metabólico obtenido, de las tres cepas

analizadas cabe destacar las cepas W5 y W7 del género Thalassospira que se encontraron en

el mismo grupo que las cepas tipo correspondientes. Por el contrario la cepa Marinobacter se

encontró en un grupo distinto a la cepa tipo Marinobacter lipolyticus empleada.

Cepa Tipo
Cepa Marinobacter
Tipo lipolyticus2D Stress: 0
Marinobacter ipolyticus 1
Thalassospira sp. W5
Thalassospira sp. W7
Cepa Tipo Thalassospira xianhensis sp. nov P-4T
Marinobacter sp, W8
Cepa Tipo Marinobacter lipolyticus SM19T

Cepa
CepaTipo
Tipo Thalassospira xianhensis
Thalassospira xianhensis
W5
W7

W8

Figura 4.12. Representación gráfica en dos dimensiones de la correlación obtenida mediante el

análisis multidimensional. Se muestran las agrupaciones de las cepas del género Thalassospira y
Marinobacter juntos con las cepas tipo correspondientes.

92
Resultados

Por otra parte, se realizó el análisis para las cepas del género Pseudomonas y

Pseudoalteromonas y se obtuvieron las agrupaciones que se muestran en la Figura 4.13. De los

resultados obtenidos cabe destacar la cepa Pseudomonas fluorescens S21 que se agrupó con la

cepa tipo correspondiente.

2D Stress: 0 1
Pseudoalteromonas elyakovii W18
S24
S24 Cepa Tipo P.grimontii
Cepa Tipo Pseudomonas grimontii sp. novCIP 1066645T
Cepa Tipo Pseudoalteromonase elyakovii KMM 162T
W8
W18 Pseudomonas fluorescens S21
Pseudomonas grimontii S24
Cepa Tipo P. fluorescens
Cepa Tipo Pseudomonas grimontii sp. novCIP 1066645T

Cepa TipoCepa
Pseudoalteromonase
Tipo P. elyakovii elyakovii KMM 162T
Cepa
Cepa S21
TipoTipo
P. fluorescens
P. fluorescens

S21

Figura 4.13. Grafica en dos dimensiones de la correlación obtenida mediante el análisis de

escalonamiento multidimensional. Se muestran las agrupaciones de las cepas del género
Pseudomonas y Pseudoalteromonas juntos con sus cepas Tipo.

4.1.2.4 Crecimiento en salinidad

Las bacterias marinas generalmente están adaptadas a los rangos de salinidad que

presenta su ambiente (±3,5% (p/v) de sales). Cambios moderados en salinidad pueden

generar cambios morfológicos y fisiológicos. Durante la presente investigación se realizó el

estudio de crecimiento en presencia de distintas concentraciones de sales con el fin de

evaluar la influencia de la salinidad sobre las 18 cepas incluidas en este trabajo. A

continuación se presentan los resultados obtenidos.

En la Figura 4.14 se reflejan los resultados del efecto de la concentración de sales

sobre el crecimiento de la cepa B. thuringiensis W1. Se puede observar que se obtuvo la

mínima influencia de la salinidad, ya que el crecimiento fue similar con todas las

concentraciones de sales ensayadas, mostrándose un crecimiento máximo de 1,6

logaritmos, al 3% (p/v) de sales a las 48 horas de incubación.

93
Resultados

Bacillus thuringiensis W1

10

LogUFC/ml
8

5
0 24 48 72

Tiempo (horas)

0,5% 1% 2% 3% 4%
5% 6% 7% 8% 10%

Figura 4.14. Crecimiento de Bacillus thuringiensis W1 a distintas concentraciones de sales (p<0,05).

La cepa B. casei F2 (Figura 4.15) presentó un crecimiento similar para todas

las concentraciones de sales ensayadas, mostrándose su máximo entre 3 y 4% (p/v) de sales

a las 24 horas con un crecimiento de 1,77 y 1,63 logaritmos, respectivamente.

Brevibacterium casei F2

10

9
logUFC/ml

5
0 24 48 72

Tiempo (horas)
0,5% 1% 2% 3% 4%
5% 6% 7% 8% 10%

Figura 4.15. Crecimiento de Brevibacterium casei F2 a distintas concentraciones de sales (p<0,05).

De las cepas B. pumilus W15, W16, F17, F20, S22 y S27 (Figura 4.16) destacamos la

cepa W16, en cuyo crecimiento se observó la mayor influencia de la concentración de sales,

con valores óptimos de salinidad comprendidos entre 2 y el 4%, tras 24 horas de incubación.

94
Resultados

Bacillus pumilus W15 Bacillus pumilus W16

10
10
9
9
LogUFC/ml

LogUFC /ml
8
8

7 7

6 6

5 5
0 24 48 72 0 24 48 72

Tiempo (horas) Tiempo (horas)

0,5% 1% 2% 3% 4%
0,5% 1% 2% 3% 4%
Bacillus pumilus F17 5% 6% Bacillus7% 8%
pumilus F20 10%
5% 6% 7% 8% 10%
10
10
9 9
LogUFC/ml

LogUFC/ml
8 8
7
7
6
6
5
5 4
0 24 48 72 0 24 48 72
Tiempo (horas)
Tiempo (horas)
0,5% 1% 2% 3% 4%
5% 6% 7% 8% 10% 0,5% 1% 2% 3% 4%
Bacillus pumilus S22 5% Bacillus
6% pumilus
7% S27 8% 10%
10

10 9
9
8
Lo g U F C /m l

LogUFC/ml

8
7 7

6 6
5
5
4
4
0 24 48 72
0 24 48 72
Tiempo (horas) Tiempo (horas)
0,5% 1% 2% 3% 4%
0,5% 1% 2% 3%0,5% 4% 1% 2% 3% 5% 4%
6% 7% 8% 10%
5% 6% 7% 8% 10%
5% 6% 7% 8% 10%

Figura 4.16. Crecimiento de Bacillus pumilus W15, W16, F17, F20, S22 y S27 a distintas
concentraciones de sales (p<0,05).

Los resultados del estudio del efecto de la concentración de sales sobre el

crecimiento para las cepas del género Halomonas W3, W4, W10 y W12 (Figura 4.17),

mostraron que la influencia de la concentración de sales fue mayor en comparación con las

cepas del género Bacillus y Brevibacterium. Estos resultados mostraron que H. alkantarctica

W3 y H. variabilis W10 alcanzaron un máximo de crecimiento al 3% (p/v) de sales con un

incremento de 2,8 y 3 logaritmos, respectivamente. H. variabilis W4 presentó un crecimiento

superior a 2 logaritmos a las 48 horas de incubación a concentraciones de sales

95
Resultados

comprendidas entre el 1 y el 4% (p/v). Asimismo, la cepa Halomonas sp. W12 mostró su

máximo crecimiento a las 48 horas de incubación con las concentraciones 2, 3, 4 y 10% (p/v)

de sales, presentando un crecimiento de 2,5 logaritmos.

Las 4 cepas seleccionadas del género Halomonas mostraron mayores tasas de

crecimiento en un rango de salinidad que varió entre el 1 y el 4% (p/v) de sales con un

óptimo al 3% (p/v) de sales.

Halomonas alkantarctica W3 Halomonas variabilis W4

10
10
9
9
logUFC/ml

LogUFC/ml
8

7
7

6
6

5 5
0 24 48 72
0 24 48 72
Tiempo (horas)
Tiempo (horas)

Halomonas variabilis W10 Halomonas sp. W12

10
10
9
9
LogUFC/ml

8
logU FC /m l

8
7
7
6
6

5
5
0 24 48 72
0 24 48 72
Tiempo (horas) Tiempo (horas)

0,5% 1% 2% 3% 4% 5%
0,5% 1% 2% 6%3% 7% 4% 8% 5%10% 15%

6% 7% 8% 10% 15%

Figura 4.17. Crecimiento de W3, W4, W10 y W12 perteneciente al género Halomonas a distintas
concentraciones de sales (p<0,05).

Las cepas W5 y W7 pertenecientes al género Thalassospira mostraron el óptimo de

crecimiento al 3% (p/v) de sales. En Marinobacter sp. W8 se destacó la mayor influencia de la

concentración de sales en su cinética de crecimiento (Figura 4.18).

96
Resultados

Thalassospira sp. W5 Thalassospira sp. W7

10
10

9
9
LogUFC/ml

L o gU FC /m l
8

7
7

6
6

5
5
0 24 48 72
0 24 48 72
Tiempo (horas)
Tiempo (horas)

Marinobacter sp. W8
10

9
LogUFC/ml

5
0 24 48 72

Tiempo (horas)

0,5% 1% 2% 3% 4% 5%
6% 7% 8% 10% 15%

Figura 4.18. Crecimiento de Thalassospira sp. W5 y W7 y Marinobacter sp. W8 a distintas

concentraciones de sales (p<0,05).

Las cepas P. fluorescens S21 y P. grimontii S24 (Figura 4.19) presentaron crecimientos

similares para todas las concentraciones ensayadas. Sin embargo la cepa P. elyakovii W18

(Figura 4.19) se caracterizó con un crecimiento influenciado por la salinidad, con óptimos al

2 y 3% (p/v) de sales.

97
Resultados

Pseudomonas fluorescens S21 Pseudomonas grimontii S24

10 10

9 9
LogUFC/ml

LogUFC/ml
8 8

7 7

6 6

5 5
0 24 48 72 0 24 48 72

Tiempo (horas) Tiempo (horas)

Pseudoalteromonas elyakovii W18

10

9
LogUFC/ml

5
0 24 48 72

Tiempo (horas)

0,5% 1% 2% 3% 4%
5% 6% 7% 8% 10%

Figura 4.19. Crecimiento de W18 perteneciente al género Pseudoalteromonas y S21 y S24

pertenecientes al género Pseudomonas a distintas concentraciones de sales (p<0,05).

4.2 CAPÍTULO II. CARACTERIZACIÓN Y PRODUCCIÓN DE

BIOEMULGENTES (EXOPOLISACÁRIDOS)
4.2.1 Características de los bioemulgentes sintetizados
Las condiciones de cultivo influyen en la cantidad, las características y en las

propiedades de los biopolímeros sintetizados. En este estudio analizamos la influencia de la

concentración de sales y del tiempo de incubación en la producción y actividad emulgente

de los biopolímeros obtenidos. Todos los microorganismos estudiados presentaron una

capacidad de proliferar y de producir EPS en presencia de las distintas concentraciones de

sales ensayadas.

Dada la importancia de esta etapa previa a una futura producción de

exopolisacáridos con potencial biotecnológico, se estudió las condiciones óptimas de

98
Resultados

producción para cada uno de los biopolímeros sintetizados durante este trabajo de

investigación, teniendo en cuenta básicamente como criterios de selección, el tiempo de

producción y la concentración de sales, como se ha descrito anteriormente. En las figuras

que a continuación se presentan se muestra el efecto del tiempo de incubación y de la

concentración de sales sobre la producción y la composición química del EPS sintetizado

por cada una de las 18 cepas objeto de estudio. En total se han analizado 133 biopolímeros y

se denominaron igual que las cepas productoras.

Los resultados obtenidos por la cepa B. thuringiensis W1 (Figura 4.20) mostraron

que esta cepa fue capaz de producir bioemulgentes (BE) a las 3 concentraciones de sales

ensayadas alcanzando producciones que variaron entre 0,5 y 1,69 g/l. El BE producido por

W1 al 3% (p/v) de sales, se caracterizó por elevados porcentajes de carbohidratos y

proteínas.

W1

100 5
% de Carbohidratos y proteínas

80 4

g EPS/l de cultivo
60 3

40 2

20 1

0 0
7 15 7 15 21 30 7 15

1% 3% 7%

Tiempo (días) y % salinidad

Carbohidratos Proteínas Producción

Figura 4.20. Efecto del tiempo de incubación y de la concentración de sales sobre la producción y
la composición química del biopolímero W1 sintetizado por la cepa B. thuringiensis W1 (p<0,05).

Los BE sintetizados por la cepa B. casei F2 (Figura 4.21), se caracterizaron por

contener porcentajes de carbohidratos y proteínas relativamente elevados, con máxima

producción al 3% (p/v) de sales de 1,04 g/l, a los 30 días de incubación.

99
Resultados

F2

100 5

% Carbohidratos y Proteínas
80 4

g EPS/l de cultivo
60 3

40 2

20 1

0 0
7 15 7 15 21 30 7 15

1% 3% 7%
Tiempo (días) y % salinidad
Carbohidratos Proteínas Producción
Figura 4.21. Efecto del tiempo de incubación y de la concentración de sales sobre la producción y
la composición química del biopolímero F2 sintetizado por la cepa B. casei F2 (p<0,05).

Respecto a las cepas B. pumilus W15, W16, F17, F20, S22 y S27 (Figura 4.22),

destacamos el BE producido por la cepa S22 a los 7 días de incubación y al 3% (p/v) de sales

que alcanzó máxima producción de 2,28 g/l, y el BE sintetizado por la cepa F20 que mostró

su máximo de producción de 1,12 g/l al 7% (p/v) de sales y 7 días de incubación.

Asimismo, destacamos los BE sintetizados por las cepas W15, W16 y F17 que se

caracterizaron por una composición química con valores de carbohidratos superiores a 30%

(p/p) y de proteínas de alrededor de 15% (p/p).

En general se detectaron cambios importantes tanto en la producción como en el

porcentaje de carbohidratos y proteínas, dependiendo de las condiciones de cultivo,

asimismo la influencia de estos parámetros dependió de la cepa productora.

100
Resultados

W15
W16

% Carbohidratos y Proteínas

% Carbohidratos y Proteínas
100 5 100 5

g EPS/l de cultivo
g EPS/l de cultivo
80 4 80 4
60 3 60 3
40 2 40 2
20 1 20 1
0 0 0 0
7 15 7 15 21 30 7 15 7 15 7 15 21 30 7 15

1% 3% 7% 1% 3% 7%
Tiempo (días) y % salinidad Tiempo (días) y % salinidad
F20
Carbohidratos F17 Proteínas Producción Carbohidratos Proteínas Producción

% Carbohidratos y Proteínas
100 5

g EPS/l de cultivo

g EPS/l de cultivo
% Carbohidratos y

100 5 80 4
80 4
proteínas

60 3
60 3
40 2 40 2
20 1 20 1
0 0 0 0
7 15 7 15 21 30 7 15 7 15 7 15 21 30 7 15

1% 3% 7% 1% 3% 7%

Tiempo (días) y % salinidad Tiempo (días) y % salinidad

S22 Carbohidratos S27

Proteínas Producción
Carbohidratos Proteínas Producción
100 5
% Carbohidratos y Proteínas
% C a rbohid ra tos y P roteína s

100 5
g EPS/l de cultivo

g EPS/l de cultivo
80 4
80 4
60 3 60 3
40 2 40 2
20 1 20 1
0 0 0 0
7 15 7 15 21 30 7 15 7 15 7 15 21 30 7 15

1% 3% 7% 1% 3% 7%
Carbohidratos Tiempo (días)
Proteínas
y % salinidad Producción
Tiempo (días) y % salinidad

Figura 4.22. Efecto del tiempo de incubación y de la concentración de sales sobre la producción y
la composición química de los biopolímeros W15, W16, F17, F20, S22 y S27 sintetizado por las
cepas W15, W16, F17, F20, S22 y S27 del género Bacillus (p<0,05).

En cuanto a las cepas W3, W4, W10 y W12 del género Halomonas, la Figura 4.23

muestra los resultados obtenidos, de lo cuales destacamos los BE sintetizados por la cepa H.

variabilis W10 a los 15 días de incubación al 1% (p/v) de sales que produjo 4,93 g/l de BE, y a

los 30 días de incubación al 3% (p/v) de sales y que se caracterizó por contar con una

producción de 3 g/l. Por otra parte destacamos los BE sintetizados por H. variabilis W4 a los

30 días en medio con 3% (p/v) de sales con una producción máxima de 3,08 g/l, así como el

BE producido por la cepa Halomonas sp. W12 que alcanzó una producción de 2,44 g/l a los

21 días en presencia de 3% (p/v) de sales.

101
Resultados

W3 W4

100 5 100 5
% Ca rboh idratos y Proteín as

% Carbohidratos y Proteín as
80 4 80 4

g de EPS/l de cultivo

g de EPS/l de cultivo
60 3 60 3

40 2 40 2

20 1 20 1

0 0 0 0
7 15 7 15 21 30 7 15 7 15 7 15 21 30 7 15
1% 3% 7%
1% 3% 7%
Tiempo (días) y % salinidad
Carbohidratos W10
Proteínas Producción Tiempo (días) y % salinidad
Carbohidratos W12
Proteínas Producción

100 5 100 5
% Ca rboh id ra tos y Proteín as

% Carboh idratos y Proteín as

80 4 g EPS/l de cultivo 80 4

g EPS/l de cultivo
60 3 60 3

40 2 40 2

20 1 20 1

0 0 0 0
7 15 7 15 21 30 7 15 7 15 7 15 21 30 7 15

1% 3% 7% 1% 3% 7%
Tiempo (días) y % salinidad Tiempo (días) y % salinidad
Carbohidratos Proteínas Producción
Figura 4.23. Efecto del tiempo de incubación y de la concentración de sales sobre la producción y
la composición química de los biopolímeros W3, W4, W10 y W12 sintetizados por las cepas W3,
W4, W10, W12 del género Halomonas (p<0,05).

Respecto a las cepas del género Thalassospira W5 y W7 (Figura 4.24), hemos de

destacar que mientras W5 sintetizó BE en todas las concentraciones de sales ensayadas, la

cepa W7 solo sintetizó BE al 3% (p/v) de sales, señalando que para las dos cepas de este

género bacteriano la máxima producción se detectó al 3% (p/v) de sales y tras 21 de

incubación.

La cepa Marinobacter sp. W8 (Figura 4.24) sintetizó BE en todas las concentraciones

de sales ensayadas y presentó máxima producción de 1,27 g/l, a los 21 días de incubación y

en presencia de 3% (p/v) de sales.

102
Resultados

W5

100 5
W7
% Carbohidratos y Proteinas
100 5

% Carohidratos y Proteinas
g de EPS/l de cultivo
80 4
80 4

g EPS/l de cultivo
60 3
60 3
40 2
40 2
20 1
20 1
0 0
0 0
7 15 7 15 21 30 7 15
7 15 7 15 21 30 7 15
1% 3% 7%
1% 3% 7%
Tiempo (días) y % salinidad
Tiempo (días) % salinidad
Carbohidratos Proteínas Producción
Carbohidratos Proteínas Producción
W8
100 5
%Carbohidratos y Proteinas

80 4

g EPS/l de cultivo
60 3

40 2

20 1

0 0
7 15 7 15 21 30 7 15

1% 3% 7%

Tiempo (días) y % salinidad

Figura 4.24. Efecto del tiempo de incubación y de la concentración de sales sobre la producción y
la composición química de los biopolímeros W5, W7 sintetizados por Thalassospira sp. (W5 y W7)
y el biopolímero W8 sintetizado por Marinobacter sp. W8 (p<0,05).

Sin embargo, P. elyakovii W18, P. fluorescens S21 y P. grimontii S24 (Figura 4.25),

produjeron BE con porcentajes bajos de carbohidratos aunque se obtuvieron altas tasas de

producción, lo que parece indicar que la mayor parte de los mismos fueron impurezas. De

forma similar, mencionar que la alta productividad del BE obtenido por la cepa W18 tras 21

días de incubación y en presencia de un 3% (p/v) de sales, estaba caracterizado por muy

bajos porcentajes de carbohidratos y proteínas, lo que se atribuye a la acumulación de sales.

103
Resultados

S21
S24
100 5 100 5

g EPS/ l de cultivo
% Carbohidratos y

g E P S /l d e c u ltiv o
% C a r b o h i d r a to s y
80 4 80 4
Proteinas

P r o te í n a s
60 3 60 3
40 2 40 2
20 1 20 1
0 0 0 0
7 15 7 15 21 30 7 15 7 15 7 15 21 30 7 15

1% 3% 7% 1% 3% 7%
Tiempo (días) y % salinidad Tiempo (días) y % salinidad

Carbohidratos Proteínas Producción

W18 Carbohidratos Proteínas Producción

100 5
%Ccarbohidratos y Proteínas

80 4

g EPS/l de cultivo
60 3

40 2

20 1

0 0
7 15 7 15 21 30 7 15

1% 3% 7%

Tiempo (días) y % salinidad

Carbohidratos Proteínas Producción
Figura 4.25. Efecto del tiempo de incubación y de la concentración de sales sobre la producción y
la composición química de los biopolímeros W18, S21 y S24 sintetizados por las cepas del los
géneros Pseudoalteromonas y Pseudomonas (p<0,05).

4.2.2 Estudio de las propiedades emulgentes de los exopolisacáridos

Uno de los objetivos de esta investigación era la obtención de bioemulgentes que

fueran útiles como herramienta para la biorremediación de zonas contaminadas con

hidrocarburos. En consecuencia y una vez determinadas las condiciones de producción, se

procedió a determinar la capacidad de los biopolímeros obtenidos para formar emulsiones

estables frente a siete sustancias hidrófobas (xileno, octano, tolueno, diesel, crudo Kirkuk,

aceite mineral ligero y aceite mineral pesado). Ya que esta propiedad sería de gran

importancia para la utilización de estos microorganismos o sus bioproductos en los

tratamientos de descontaminación de petróleo y productos derivados.

En las siguientes tablas se recogen las actividades emulgentes de los BE sintetizados,

a una concentración de 0,5% (p/v), sobre las distintas fases oleosas ensayadas. Los

resultados son la media de tres determinaciones e indican el porcentaje emulsionado de la

mezcla agua-fase oleosa, las medidas fueron realizadas tras dejar la emulsión en reposo 24

horas a temperatura ambiente con el objetivo de evaluar la estabilidad de las mismas.

104
 Resultados

La Tabla 4.2 muestra los porcentajes de emulsión obtenidos por los BE sintetizados

por las cepas del género Bacillus incluidas en este estudio. Los resultados mostraron que

dentro de los BE sintetizados por este género cabe destacar los BE: W16-1, W16-5, W16-6 y

F17-2 por su capacidad para emulsionar el AML, xileno, tolueno, octano y crudo Kirkuk con

porcentajes superiores al 40%. Por el contrario el AMP no fue emulsionado por ningún BE

sintetizado por este grupo de bacterias.

Tabla 4.2. Actividad emulgente frente a AML, AMP, diesel, xileno, octano, tolueno y crudo
Kirkuk, de los biopolímeros sintetizados por las cepas W1, W15, W16, F17, F20, S22 y S27 del
género Bacillus. Expresada en porcentajes de emulsión (p<0,05).
Denom. BE Sustratos
Cond. Cultivo AMLa AMPb Diesel Xileno Octano Tolueno Crudo

W1-1 W1(1%-7dc) 0 0 9.14±0,18 16.11±0.20 14.22±0.19 47.05±2.14 55.01±2.19

W1-2 W1(1%-15d) 0 0 10.22±0,30 37.18±1.32 25.23±1.20 56.14±2.14 60.14±3.44
W1-3 W1(3%-7d) 0 0 16.35±1,13 43.21±2.14 67.12±3.14 66.23±2.88 72.12±4.19
W1-4 W1(3%-15d) 0 0 8.41±0,99 34.19±2.61 55.23±2.65 60.23±2.64 100.00±5.78
W1-5 W1(3%-21d) 0 0 1.05±0,22 30.14±2.01 52.14±2.47 65.40±2.78 54.11±2.18
W1-6 W1(3%-30d) 0 0 2.33±0,05 15.33±1.65 18.14±1.61 15.14±1.12 53.12±3.14
W1-7 W1(7%-7d) 0 0 9.15±0.17 32.21±2.14 25.33±1.88 36.01±2.36 50.25±2.02
W15-1 W15(1%-15d) 0 0 11.44±0.61 0 15.15±1.4 0 72.33±3.08
W15-2 W15(3%-7d) 4.12±0.20 0 13.62±0.64 0 42.07±2.02 61.23±1.25 76.14±3.3
W15-3 W15(3%-15d) 0 0 9.12±0.12 0 26.31±1.23 8.13±0.75 68.21±2.9
W15-4 W15(3%-21d) 0 0 9.15±1.30 10.11±0.15 36.33±1.88 21.01±1.26 83.23±2.4
W15-5 W15(3%-30d) 0 0 5.14±1.10 0 17.14±1.16 0 80.14±2.7
W15-6 W15(7%-7d) 34.05±0.5 0 12.05±1.02 13.12±0.97 29.05±1.25 63.12±2.75 62.05±2.66
W15-7 W15(7%-15d) 22.15±1.60 0 15.09±1.03 11.10±1.11 40.11±3.2 33.14±3.12 55.04±2.5
W16-1 W16(1%-7d) 55.17±2.71 0 9.10±1.15 52.11±2.56 65.10±2.3 59.10±2.14 62.14±2.99
W16-2 W16(3%-7d) 0 0 17.33±1.21 45.22±2.84 55.10±5.30 65.22±2.89 67.14±3.01
Bacillus

W16-3 W16(3%-15d) 5.05±0.32 0 12.15±1.41 0 38.33±1.30 17.12±1.45 53.21±3.51

W16-4 W16(3%-21d) 5.14±0.72 0 10.11±1.19 0 19.24±2.11 5.23±0.52 92.14±3.80
W16-5 W16(3%-30d) 44.14±1.82 0 8.12±1.21 26.22±2.63 61.22±2.65 54.11±1.64 71.15±3.70
W16-6 W16(7%-7d) 65.33±2.30 0 3.03±0.55 38.23±2.18 55.15±1.45 62.10±3.28 57.12±2.81
W16-7 W16(7%-15d) 0 0 3.52±0.64 15.14±1.14 49.12±1.32 30.23±1.21 55.14±1.61
F17-1 F17(1%-15d) 0 0 2.32±0.58 13.33±1.60 44.22±2.10 65.15±2.91 45.05±1.20
F17-2 F17(3%-7d) 59.16±1.51 0 11.25±0.64 54.11±2.71 56.36±3.11 74.05±4.75 49.36±1.32
F17-3 F17(3%-15d) 0 0 8.24±0.97 33.10±2.31 55.13±3.40 43.03±2.65 80.54±1.10
F17-4 F17(3%-21d) 0 0 6.11±0.92 0 50.12±2.10 15.05±1.30 78.12±3.63
F17-5 F17(3%-30d) 5.10±0.21 0 4.02±0.51 0 57.23±2.80 16.12±1.40 100.23±4.91
F17-6 F17(7%-7d) 0 0 11.33±0.6 12±1.3 66.25±1.25 40.11±2.15 56.11±3.51
F17-7 F17(7%-15d) 8.11±0.10 0 8.12±0.54 14±1.1 43.10±2.75 21±1.141 54.10±1.50
F20-1 F20(1%-7d) 0 0 0 0 12.14±0.88 25.11±1.65 55.12±3.51
F20-2 F20(1%-15d) 0 0 0 0 25.12±1.25 15.10±1.25 39.14±2.51
F20-3 F20(3%-7d) 0 0 0 0 35.17±3.62 50.10±2.14 0
F20-4 F20(3%-15d) 7.10±0.51 0 0 0 22.23±1.32 69.24±1.33 67.11±1.65
F20-5 F20(3%-21d) 0 0 0 0 26.36±1.56 30.13±2.14 33.10±2.14
F20-6 F20(3%-30d) 10.31±0.97 0 0 0 19.14±1.58 11.32±1.10 89.12±3.64
F20-7 F20(7%-7d) 0 0 0 0 10.01±1.47 35.11±1.32 29.21±2.60

105
 Resultados

Tabla 4.2 (Continuación)

F20-8 F20(7%-15d) 0 0 0 0 15.11±1.12 16.05±1.11 15.13±1.30
S22-1 S22(1%-7d) 0 0 0 0 2.06±0.22 0 100.55±5.36
S22-2 S22(1%-15d) 0 0 0 0 5.14±0.51 3.11±0.12 87.00±2.69
S22-3 S22(3%-7d) 0 0 0 0 7.14±0.63 50.25±1.97 100.41±2.65
S22-4 S22(3%-15d) 0 0 0 0 2.12±0.72 14.33±0.88 55.22±3.14
S22-5 S22(3%-21d) 0 0 0 0 1.01±0.10 0 50.11±1.20
S22-6 S22(3%-30d) 0 0 0 0 0 42.14±2.55 65.28±1.65
S22-7 S22(7%-7d) 0 0 0 0 0 68.23±3.16 63.22±2.50
S22-8 S22(7%-15d) 0 0 0 0 0 0 49.15±1.65
S27-1 S27(1%-7d) 0 0 0 0 29.33±1.22 0 25.12±1.22
S27-2 S27(1%-15d) 0 0 0 0 30.12±1.91 7.33±0.86 92.33±1.65
S27-3 S27(3%-7d) 0 0 0 22.23±1.97 45.14±1.87 50.12±2.52 25.14±2.14
S27-4 S27(3%-15d) 0 0 0 0 35.22±1.25 14.05±0.15 63.23±1.65
S27-5 S27(3%-21d) 0 0 0 0 33.05±3.40 15.19±0.64 25.11±2.14
S27-6 S27(3%-30d) 0 0 0 20.31±1.54 54.33±3.12 36.33±1.2 100.12±5.65
S27-7 S27(7%-7d) 13.21±1.10 0 0 0 35.31±3.65 0 25.23±3.16
S27-8 S27(7%-15d) 16.11±1.63 0 0 25.21±1.64 31.22±3.43 61.21±2.56 23.15±1.54
a , Aceite mineral ligero; , Aceite mineral pesado, , días.
b c

Asimismo, la Tabla 4.3 muestra los porcentajes de emulsión obtenidos por los BE

sintetizados por la cepa Brevibacterium casei F2, esta cepa se caracterizó por producir 8 BE,

los cuales emulsionaron el crudo kirkuk con porcentajes de emulsión superior a 45 %. Los

aceites minerales ligero y pesado fueron los sustratos más difíciles de emulsionar por estos

BE.
Tabla 4.3. Actividad emulgente frente a AMP, AML, diesel, xileno, octano, tolueno y crudo
Kirkuk, de los biopolímeros sintetizados por la cepa Brevibacterium casei F2. Expresada en
porcentajes de emulsión (p<0,05).
Denom. BE Sustratos
Cond. Cultivo AML a AMP b Diesel Xileno Octano Tolueno Crudo
F2-1 F2(1%-7dc) 0 0 21.09±1.12 18.01±1.12 20.33±1.21 27.22±2.31 100.01±4.65
F2-2 F2(1%-15d) 0 0 18.16±1.64 53.44±2.15 16.22±2.40 7.12±1.10 56.00±2.45
Brevibacterium

F2-3 F2(3%-7d) 0 0 36.21±2.15 67.12±3.61 52.21±2.72 34.14±2.30 55.12±2.52

F2-4 F2(3%-15d) 0 0 20.33±2.64 52.19±3.30 47.12±2.54 64.05±4.31 79.14±2.65
F2-5 F2(3%-21d) 0 0 18.33±1.69 41.32±1.21 36.15±3.11 67.09±2.51 45.12±1.54
F2-6 F2(3%-30d) 0 0 9.05±0.88 29.15±1.11 27.33±2.11 28.17±2.92 51.15±3.65
F2-7 F2(7%-7d) 0 0 19.14±0.64 51.65±1.50 20.41±1.74 67.18±2.65 45.11±2.14
F2-8 F2(7%-15d) 0 0 10.12±1.1 25.23±1.60 20.51±1.43 38.28±1.21 56.10±2.21
a , Aceite mineral ligero; , Aceite mineral pesado, , días.
b c

La Tabla 4.4 muestra los resultados de emulsión obtenidos por los BE sintetizados

por las cepas pertenecientes al género Halomonas, la actividad emulgente (AE) obtenida por

los BE sintetizados por las cepas W3, W4, W10 y W12, frente a los 7 sustratos ensayados, se

caracterizó con porcentajes de emulsión considerables.

106
 Resultados

Tabla 4.4. Actividad emulgente frente a AMP, AML, diesel, xileno, octano, tolueno y crudo
Kirkuk, de los biopolímeros sintetizados por las cepas W3, W4, W10 y W12 del género Halomonas.
Expresada en porcentajes de emulsión (p<0,05).
Denom. BE Sustratos
Cond. Cultivo AML a AMP b Diesel Xileno Octano Tolueno Crudo
W3-1 W3(1%-7dc) 65.12±2.30 25.32±2.14 11.11±1.61 36.18±1.25 45.12±2.45 56.21±1.30 76.23±3.01
W3-2 W3(1%-15d) 56.14±3.41 34.36±2.51 7.10±0.45 25.12±1.75 51.15±2.15 58.24±2.61 68.23±3.02
W3-3 W3(3%-7d) 25.11±1.60 18.31±3.01 16.23±1.48 41.14±2.14 47.05±1.64 57.03±1.57 34.15±1.25
W3-4 W3(3%-15d) 71.05±2.22 53.33±4.65 11.15±0.77 29.12±2.02 54.15±1.12 67.04±1.26 0
W3-5 W3(3%-21d) 67.22±1.41 34.05±3.12 10.24±0.97 34.05±2.64 25.24±1.64 63.09±2.46 63.11±2.51
W3-6 W3(3%-30d) 0 0 5.07±0.65 19.10±1.89 41.33±2.01 29.11±2.45 73.23±2.65
W3-7 W3(7%-7d) 58.10±1.51 22.22±2.15 9.09±0.85 26.22±2.33 56.41±2.14 61.14±2.89 100.00±4.32
W3-8 W3(7%-15d) 57.00±1.02 19.14±1.14 7.19±0.64 18.18±1.18 31.51±2.45 22.24±2.54 97.12±1.98
W4-1 W4(1%-7d) 14.11±1.44 43.22±2.19 7.29±0.99 30.33±2.47 45.12±2.45 61.36±2.56 93.25±2.58
W4-2 W4(1%-15d) 64.12±2.80 29.14±0.18 4.28±0.15 33.01±2.56 62.52±2.89 61.14±2.36 63.15±2.64
W4-3 W4(3%-7d) 74.41±3.14 74.11±2.14 18.18±1.60 74.33±3.54 76.22±2.54 74.41±2.65 54.10±2.78
W4-4 W4(3%-15d) 10.30±1.01 54.55±2.55 16.16±1.50 18.20±0.64 30.02±1.78 37.21±1.26 86.00±1.65
W4-5 W4(3%-21d) 0 35.05±1.25 10.05±1.21 0 44.14±1.44 0 0
W4-6 W4(3%-30d) 0 30.03±1.97 8.00±1.11 0 31.21±1.45 5.10±0.44 93.12±3.85
Halomonas

W4-7 W4(7%-7d) 17.12±0.15 25.08±2.75 12.12±1.06 12.01±0.54 56.33±1.14 67.05±1.23 30.01±2.10

W4-8 W4(7%-15d) 69.12±2.88 27.55±1.12 16.17±1.08 28.00±1.14 62.14±2.84 66.15±2.21 78.02±4.65
W10-1 W10(1%-7d) 15.11±1.04 25.16±3.15 7.19±1.10 45.12±2.54 65.16±2.51 63.14±2.35 88.11±3.66
W10-2 W10(1%-15d) 65.22±2.64 30.21±1.05 6.13±0.58 30.15±1.49 55.31±2.14 58.23±2.45 63.33±3.01
W10-3 W10(3%-7d) 64.14±2.40 51.12±2.14 51.24±2.65 51.14±1.35 61.21±1.97 61.28±2.65 50.25±2.17
W10-4 W10(3%-15d) 4.05±0.91 35.55±1.20 45.39±2.75 18.33±1.40 44.64±1.58 21.34±1.41 78.25±2.56
W10-5 W10(3%-21d) 14.01±0.78 6.05±0.14 13.11±2.14 1.01±0.40 36.22±1.45 7.07±0.88 100.33±6.81
W10-6 W10(3%-30d) 0 3.01±0.02 8.05±0.97 6.21±0.21 13.11±1.18 11.19±1.12 78.14±1.65
W10-7 W10(7%-7d) 7.33±0.11 29.33±1.1 6.11±0.40 46.07±3.12 68.12±1.65 60.24±2.45 85.18±2.50
W10-8 W10(7%-15d) 60.23±2.14 55.25±2.01 4.16±0.13 16.09±2.92 46.05±2.15 31.31±3.25 68.22±2.90
W12-1 W12(1%-15d) 71.12±3.56 0 8.31±0.87 35.11±2.51 66.11±1.59 62.05±2.75 45.35±3.20
W12-2 W12(3%-7d) 24.27±1.56 42.23±2.15 25.22±1.44 34.10±2.32 43.10±3.45 55.14±1.25 48.22±3.51
W12-3 W12(3%-15d) 7.52±0.61 13.12±1.11 18.19±1.98 11.11±1.31 56.00±2.60 15.37±1.66 70.12±3.41
W12-4 W12(3%-21d) 0 11.01±1.30 5±.050.91 34.21±2.14 73.54±1.78 63.41±3.41 100.12±2.65
W12-5 W12(3%-30d) 11.05±0.71 5.00±0.15 15.15±0.54 11.12±1.12 66.23±1.32 19.22±1.18 100.13±4.65
W12-6 W12(7%-7d) 72.06±1.88 0 23.33±1.40 74.22±2.54 75.14±2.51 61.11±3.64 74.11±2.58
W12-7 W12(7%-15d) 57.25±1.12 0 13.23±1.11 17.14±0.97 61.32±2.88 16.17±2.14 67.02±3.97
a , Aceite mineral ligero; b, Aceite mineral pesado, c, días.

La Tabla 4.5 muestra los resultados de la capacidad de emulsión de los BE

sintetizados por las cepas W5 y W7 pertenecientes al género Thalassospira, se puede observar

que los sustratos xileno, octano y tolueno y crudo fueron los más fácilmente emulsionados

por estos BE, los valores de emulsión en este caso alcanzaron el 70%, asimismo de estos BE

destacamos el W5-2 capaz de emulsionar el AML con 40% de emulsión.

107
 Resultados

Tabla 4.5. Actividad emulgente frente a AMP, AML, diesel, xileno, octano, tolueno y crudo
Kirkuk, de los biopolímeros sintetizados por las cepas W5 y W7 del género Thalassospira.
Expresada en porcentajes de emulsión (p<0,05).
Denom. BE Sustratos
Cond. Cultivo AMLa AMP b Diesel Xileno Octano Tolueno Crudo
W5-1 W5(1%-7dc) 7.07±0.19 0 0 12.10±0.88 15.12±1.07 7.58±1.01 78.11±1.20
W5-2 W5(1%-15d) 40.31±1.56 0 0 2.01±0.25 14.33±1.90 60.33±2.55 57.17±2.50
W5-3 W5(3%-7d) 0 0 0 20.22±1.14 28.10±1.35 0 34.22±3.60
W5-4 W5(3%-15d) 45.15±2.61 0 0 5.03±0.31 10.31±0.99 23.14±1.34 71.21±3.64
Thalassospira

W5-5 W5(3%-21d) 0 0 0 0 11.10±0.15 15.01±0.99 25.17±1.23

W5-6 W5(3%-30d) 0 0 0 0 8.11±0.44 0 0
W5-7 W5(7%-7d) 0 0 0 13.10±1.10 8.08±0.98 19.32±1.13 27.21±2.11
W5-8 W5(7%-15d) 0 0 0 0 5.05±0.33 5.61±0.14 16.16±0.19
W7-1 W7(3%-7d) 0 0 44..52±2.36 76.33±1.75 73.21±2.17 74±.112.17 34.03±1.45
W7-2 W7(3%-15d) 7.01±0.15 0 13.24±1.19 32.12±1.45 58.41±2.65 47.12±1.3 60.05±4.32
W7-3 W7(3%-21d) 0 0 11.01±1.28 45.16±1.88 72.10±2.77 62.02±2.08 100.00±2.67
W7-4 W7(3%-30d) 0 0 10.12±1.11 28.36±1.15 36.10±2.31 17.22±1.10 100.06±2.55
a , Aceite mineral ligero; b, Aceite mineral pesado, c, días.

En cuanto a los BE sintetizados por la cepa del género Marinobacter, destacamos los

BE: W8-2, W8-7 que fueron capaces de emulsionar el AML con porcentajes de emulsión

superiores al 40% (Tabla 4.6).

Tabla 4.6. Actividad emulgente frente a AMP, AML, diesel, xileno, octano, tolueno y crudo
Kirkuk, de los biopolímeros sintetizados por la cepa Marinobacter sp. W8. Expresada en
porcentajes de emulsión (p<0,05).
Denom. BE Sustratos
Cond. Cultivo AML a AMP b Diesel Xileno Octano Tolueno Crudo
W8-1 W8(1%-7dc) 0 0 0 45.25±1.88 62.17±3.01 60.07±2.54 0
W8-2 W8(1%-15d) 57.10±1.45 0 0 12.00±1.31 55.01±3.42 27.05±1.22 72.17±2.61
Marinobacter

W8-3 W8(3%-7d) 0 0 11.02±1.62 76.05±2.16 76.12±3.56 74.41±2.64 59.11±2.84

W8-4 W8(3%-15d) 7.02±0.55 0 9.11±1.31 31.01±0.15 56.30±2.52 31.23±2.51 100.01±2.98
W8-5 W8(3%-21d) 0 0 9.00±1.07 0 45.30±1.64 0 0
W8-6 W8(3%-30d) 0 0 5.40±0.57 0 56.24±1.32 14.23±0.22 85.12±2.15
W8-7 W8(7%-7d) 61.05±3.30 0 5.12±0.66 18.12±1.60 66.12±1.85 20.20±1.01 0
W8-8 W8(7%-15d) 44.04±1.88 0 3.12±0.55 29.22±0.12 56.22±2.17 30.10±2.17 0
a , Aceite mineral ligero; b, Aceite mineral pesado, c, días.

Respecto a los BE sintetizados por las cepas S21, S24 del género Pseudomonas, los

resultados obtenidos se muestran en la Tabla 4.7. De estos BE sintetizados destacamos los

BE; S21-3 y S21-4 que fueron capaces de emulsionar el AML con porcentajes de emulsión de

69%.

108
 Resultados

Tabla 4.7. Actividad emulgente frente a AMP, AML, diesel, xileno, octano, tolueno y crudo
Kirkuk, de los biopolímeros sintetizados por las cepas S21 y S24 del género Pseudomonas.
Expresada en porcentajes de emulsión (p<0,05).
Denom. BE Sustratos
Cond. Cultivo AMLa AMP b Diesel Xileno Octano Tolueno Crudo
S21-1 S21(1%-7dc) 0 0 0 0 33.41±2.70 14.22±1.45 0
S21-2 S21(3%-7d) 0 0 0 12.22.±0.99 34.32±3.10 25.10±1.31 95.14±2.21
S21-3 S21(3%-15d) 69.31±1.80 0 0 10.00±0.21 33.01±1.64 75.10±2.87 89.28±2.64
S21-4 S21(3%-21d) 69.57±1.11 0 0 0 38.23±2.11 67.11±2.54 88.12±2.20
S21-5 S21(3%-30d) 33.13±2.21 0 0 0 28.15±1.14 41.02±1.64 0
S21-6 S21(7%-7d) 0 0 0 0 0 30.00±1.25 5.10±1.01
Pseudomonas

S21-7 S21(7%-15d) 5.01±0.21 0 0 0 0 11..01±0.33 43.33±1.26

S24-1 S24(1%-7d) 11.14±0.30 0 0 0 22.22±1.33 5.28±0.12 51.10±2.51
S24-2 S24(1%-15d) 0 0 0 12.11±0.30 14.10±1.12 37.14±3.14 74.12±1.75
S24-3 S24(3%-7d) 0 0 0 14.44±0.12 45±2.11 25.47±2.41 73.22±2.25
S24-4 S24(3%-15d) 13.04±0.50 0 0 0 11.00±0.33 13.54±1.30 100.01±3.75
S24-5 S24(3%-21d) 0 0 0 0 0 20.11±1.84 45.55±2.31
S24-6 S24(3%-30d) 0 0 0 0 0 6.01±.142 39.45±1.12
S24-7 S24(7%-7d) 0 0 0 0 12.14±0.81 0 55.12±1.15
S24-8 S24(7%-15d) 6.12±0.85 0 0 0 9.41±1.03 0 50.05±1.11
a , Aceite mineral ligero; b, Aceite mineral pesado, c, días.

Asimismo, la capacidad de los BE sintetizados por la cepa Pseudoalteromonas

elyakovii W18 de emulsionar los siete sustratos ensayados se muestran en la Tabla 4.8. De

estos BE cabe destacar el BE; W18-2 capaz que se caracterizó con valores de emulsión

considerable frente al tolueno (50%) y el BE; W18-5 que fue capaz de emulsionar el crudo

Kirkuk con 100% de emulsión.

Tabla 4.8. Actividad emulgente frente a AMP, AML, diesel, xileno, octano, tolueno y crudo
Kirkuk, de los biopolímeros sintetizados por la cepa Pseudoalteromonas elyakovii W18. Expresada
en porcentajes de emulsión (p<0,05).
Denom. BE Sustratos
Cond. Cultivo AML a AMP b Diesel Xileno Octano Tolueno Crudo
W18-1 W18(1%-7d )c 0 0 0 0 12.01±1.09 0 0
Pseudoalteromonas

W18-2 W18(3%-7d) 0 0 0 0 25.5±1.20 50.21±2.60 0

W18-3 W18(3%-15d) 0 0 0 0 10.11±1.01 25.70±1.30 0
W18-4 W18(3%-21d) 0 0 0 0 9.00±0.60 13.01±0.21
W18-5 W18(3%-30d) 0 0 0 0 5.10±0.40 0 100.03±3.45
W18-6 W18(7%-7d) 0 0 0 0 6.00±0.30 0 0
W18-7 W18(7%-15d) 0 0 0 0 4.01±0.12 0 0
a , Aceite mineral ligero; b, Aceite mineral pesado, c, días.

4.2.3 Índice de calidad bioemulgente

El estudio de la caracterización de los biopolímeros microbianos para su posterior

utilización a nivel industrial es un proceso que normalmente comienza con la producción

del biopolímero en matraces de laboratorio. Según Sutherland (1994; 2001), el

109
Resultados

microorganismo debe ser cultivado bajo diferentes condiciones, para seleccionar aquellas

que determinan una producción óptima y rentable desde el punto de vista de los sustratos

empleados, así como unas propiedades adecuadas del biopolímero que se correspondan con

un producto final de calidad. En general, estos estudios requieren la comparación de

numerosos datos que dificultan en ocasiones la selección de las condiciones más idóneas

para obtener un biopolímero de interés.

Con objeto de realizar una selección de los BE sintetizados con mayor interés así

como las condiciones idóneas de producción, se ha establecido un índice que hemos

denominado índice de calidad bioemulgente (Ic), el cual está condicionado por la actividad

emulgente, el número de sustratos emulsionados, la cantidad de polímeros sintetizados, el

tiempo requerido para su producción y el medio de cultivo para la producción.

Para el desarrollo de este índice se valoró en primer lugar la actividad emulgente

considerando todos los sustratos ensayados y determinando el valor de la media, así

establecimos que aquellos BE con capacidad para emulsionar mayor números de sustrato

presentaban un mayor interés dado su mayor potencial de aplicación. Para ponderar este

factor desarrollamos ΣAE tal y como se refleja en la siguiente fórmula:

AEAML+ AEAMP+ AEDiesel+ AEXileno+ AEOctano+ AETolueno+ AECrudo

Σ AE =
n

donde n es el número de sustratos ensayados (en este caso n=7)

Puesto que otro factor importante es la producción (P), se ha considerado este

valor teniendo en cuenta la cantidad de biopolímero sintetizado (expresado en g de

biopolímero sintetizado / l de medio de cultivo) y la composición química del mismo (K) en

términos de carbohidratos (C) y proteínas (Pr). Dado que la calidad de BE está condicionada

por la presencia de carbohidratos y proteínas, de manera que los BE con mayor porcentaje

de carbohidratos y proteínas tienen mayor calidad.

%C+%Pr
K=
100

Como parámetros inversamente relacionados se han incluido el tiempo de

incubación necesario (t) para producir el BE y la concentración de sales (S). Ya que desde el

punto de vista industrial, es más rentable obtener la producción en el menor tiempo posible

110
 Resultados

y con el menor gasto de reactivos para la producción. Teniendo en cuenta todos estos

parámetros se ha desarrollado la siguiente fórmula:

Σ AE _ t + [S] .δ
Ic = P.K +
100
10

donde:

P: producción en g/l de BE
K: factor de composición química de BE
AE: porcentaje de la media de actividad emulgente de BE
δ: número de sustratos emulsionados por el BE
t: tiempo de incubación en días para la producción de BE
S: concentración de sales (p/v)

Se aplicó el índice Ic a todos los BE sintetizados en este estudio. Los resultados

obtenidos se recogen en la Tabla III, anexo I, de estos resultados destacamos los

biopolímeros sintetizados por las cepas del género Halomonas, de los cuales cabe mencionar

aquellos sintetizados por las cepas H. alkantarctica W3, H. variabilis W4 y W10 y Halomonas

sp. W12 (Tabla 4.9), estas cepas han mostrado ser capaces de sintetizar BE más eficientes, ya

que los BE sintetizados por estas cepas originaron emulsiones estables frente a más de 5

sustratos, con porcentajes de emulsión que alcanzaron el 70%.

Tabla 4.9. Características más relevantes de los BE seleccionados según el índice de calidad
bioemulgente
Grupo de BE Ic AE Producción Composición química (%)
cepas Denom. Cond. cultivo Ea (%) nº Sustratos g/l Cb Pc ND
productoras
W3-7 7%-7dd 3,2 54 6 0,91 42 30 27
W4-3 3%-7d 4,0 71 6 0,65 62 12 26
W4-8 7%-15d 3,1 55 6 0,74 30 24 46
Halomonas
W10-2 1%-15d 3,9 50 6 4,93 37 8 55
W10-3 3%-7d 3,9 56 7 0,2 77 4 19
W12-7 7%-7d 3,5 63 6 0,89 32 34 33
a , Emulsión; b, Carbohidratos; c, Proteínas; d, días; ND: No determinado.

4.2.4 Análisis estadístico

Para establecer las posibles relaciones entre los biopolímeros sintetizados por las 18 cepas

objeto de estudio y los distintos parámetros estudiados, se realizó el análisis multivariable de

redundancia (RDA) (CANOCO 4.5) utilizando la salinidad y el tiempo de incubación como dos

variables independientes.

111
Resultados

El análisis de redundancia (RDA) presentado como gráfico triplot se muestra en la Figura

4.26. Este gráfico triplot representa la distribución de los resultados obtenidos en dos dimensiones.

Así, los resultados obtenidos fueron caracterizados con una significancia de p=0,05. El primer eje

(horizontal) describe un 2,4% de la variabilidad de los bioemulgentes sintetizados mediante las

variables consideradas en el análisis y un 3,9% de variabilidad de todo el sistema. El parámetro más

determinante este eje fue la fracción de los carbohidratos (C). El segundo eje (vertical) describe un

61,1% de la variabilidad de los bioemulgentes obtenidos explicable mediante los parámetros

considerados en el análisis y un 100% de la variabilidad total del sistema. En este eje la fracción de

proteínas (Pr) fue el parámetro más determinante.

El análisis realizado mostró que los bioemulgentes sintetizados se agruparon según las

variables independientes, tiempo de incubación (t) y la concentración de sales (S). Los grupos (I) y

(II) englobaron los bioemulgentes sintetizados al 1% (p/v) de sales a los 7 y 15 días de incubación,

respectivamente. Los grupos (III), (IV), (V) y (VI) incluyeron los bioemulgentes sintetizados al 3%

(p/v) de sales a los 7, 15, 21 y 30 días de incubación, respectivamente y los grupos (VII) y (VIII)

agruparon los bioemulgentes sintetizados al 7% de sales durante 7 y 15 días de incubación,

respectivamente.
1.0

75 51 35 743
83 59 20 13
110 67 27 132
98 90
117 124

tT (VII)
94
86
79 120
47
31
113 39 100 55
23
106 71
128 3 16
9
21 28 63
111 133 36 (III)
14
44
52 60 76
68
84 91 99 Pr
118 Ic
IUB
125
(VIII) C

56 80 112 37 45 77
64
119 1 53
P 87 129 24 40
17 95 126 92 15 69
E
10 48121 104 29
72 61
114 32 4
115 18 57 101 107
122 25 (I)
11 (IV)
49 130
108 5 73
41 33 65 102
97 81 88 96
123 42 34 58
74
10319 26 116 (V)
50 82 131 66 38
89 6 109 105
12
8 93
127 22
46 2
(VI) 54
30 85
S 62 70 78 (II)
-1.0

-1.0 1.0
Figura 4.26. Gráfico triplot del análisis de redundancia (RDA) para los bioemulgentes
producidos por las 18 cepas incluidas en este estudio. Se muestran las dos variables independientes:
tiempo de incubación y salinidad.

112
Resultados

El análisis de redundancia (RDA) reveló por un lado, que el tiempo de incubación

(t) se correlacinó directamente y positivamente con las fracciones de carbohidratos (C) y

proteínas (Pr) de los BE analizados, mientras que esta variable se correlacionó

negativamente con la emulsión (E). La segunda variable estudiada fue la concentración de

sales (S), esta última se correlacionó directamente y positivamente con la productividad (P)

y negativamente con el índice de calidad bioemulgente propuesto (Ic). Por otro lado, los BE

de los grupos (I) y (II) fueron influenciados directamente por la emulsión (E), los BE del

grupo (III) fueron influenciados por el índice Ic. Asimismo, los BE de los grupos (IV), (V) y

(VI) fueron influenciados por la productividad (P). Por último los BE de los grupos (VII) y

(VIII) fueron influenciados por los carbohidratos (C) y proteínas (Pr).

Este análisis puso de manifiesto que tanto la concentración de sales (S) como el

tiempo de incubación (t) fueron parámetros importantes, que influyeron en la síntesis y en

las propiedades de los bioemulgentes sintetizados (P<0,05).

4.3 CAPÍTULO III. DEGRARADACIÓN DE HIDROCARBUROS

4.3.1 Degradación de hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPAs)
4.3.1.1 Crecimiento en medio sólido con HPAs
Para llevar a cabo este estudio se realizó el crecimiento de las 18 cepas seleccionadas

en presencia de los HPAs al 1% (p/v), para determinar la capacidad de estas cepas para

crecer en presencia de dichos HPAs. Los compuestos aromáticos empleados fueron:

naftaleno (C10H8), fenantreno (C14H10), antraceno (C14H10) y pireno (C16H10). Se consideró

como resultado positivo la formación de colonias en placas utilizando los compuestos

aromáticos como única fuente de carbono. Los resultados obtenidos se recogen en la Tabla

4.10. Basándonos en los resultados obtenidos se pudo observar que las 18 cepas proliferaron

en medio sólido adicionado de naftaleno, mientras que este número de cepas fue menor

cuando el medio sólido contenía fenantreno, antraceno y pireno. Asimismo las cepas F2 del

género Brevibacterium, W5 y W7 del género Thalassospira y W8 del género Marinobacter

mostraron crecimiento positivo que fue interpretado por la aparición de colonias en la

superficie del medio sólido adicionado del HPAs como única fuente de carbono. Por el

contrario, las cepas W3, W4, W10 y W12 del género Halomonas proliferaron en presencia de

naftaleno, fenantreno y pireno a una concentración del 1% (p/v).

113
Resultados

Tabla 4.10. Capacidad de las cepas seleccionadas para crecer en presencia de 4 HPAs al 1% (p/v).
Se indican los resultados positivos del crecimiento en placas con HPAs (+) y ausencia de crecimiento
(-).

Cepas Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos (HPAs)

Naftaleno Fenantreno Antraceno Pireno

W1 + + + +

W15 + + + +

W16 + + + +

F17 + + + +
Bacillus
F20 + + + +

S22 + + + -

S27 + + - +

Brevibacterium F2 + + + +

W3 + + - +

W4 + + - +
Halomonas W10 + + - +

W12 + + - +

Thalassospira W5 + + + +

W7 + + + +

Marinobacter W8 + + + +

S21 + - - -
Pseudomonas
S24 + - - -

Pseudoalteromonas W18 + + - -

4.3.1.2 Relación entre las cepas y su utilización de los HPAs

Los resultados de capacidad de crecimiento de las cepas en medio sólido

adicionados de HPAs, obtenidos durante los experimentos realizados en este trabajo, fueron

analizados mediante el estudio multivariante y multidimensional (Primer 6) que permite

visualizar como se agrupan las 18 cepas incluidas en este estudio según sus capacidades de

crecer en medio sólido S4 adicionado de HPAs como variables dependientes de los

parámetros estudiados. Como resultado de este análisis obtuvimos la representación

bidimensional que presenta la correlación de las variables. Dichos resultados representan

las posibles agrupaciones entre las 18 cepas basándose en el crecimiento en presencia de los

HPAs. En la Figura 4.27 se muestran los resultados obtenidos.

114
Resultados

S21
S24
S21
I
2D Stress: 0
muestras
S24 Bacillus thuringiensis W1
Bacillus pumilus W15
Bacillus pumilus W16
II
Bacillus pumilus F17
W3
W4 Bacillus pumilus F20
W10
W12 Bacillus pumilus S22
S27 W10
S27
W4
W3
W12
Bacillus pumilus S27
Brevibacterium casei F2
Halomonas alkantarctica W3
W18 Halomonas variabilis W4
W 18

Halomonas variabilis W10

III Halomonas sp W12
Thalassospira sp. W5
W1 Thalassospira sp. W7
W15 W8 Marinobacter sp. W8
W16 W5
F17 W7 Pseudomonas fluorescens S21
F20
F17
W16
WF2
7

S22 W15
W1
F20
W5
W8

S22
Pseudomonas grimontii S24
S21
F2
Pseudoalteromonas elyakovii W18

Figura 4.27. Representación gráfica en dos dimensiones de la correlación obtenida mediante el

análisis de escalonamiento multidimensional.

Los resultados obtenidos mostraron 3 agrupaciones, en el primer grupo (I) incluyó

las cepas con capacidad de utilizar un sólo HPA, en este grupo se encontraron las dos cepas

S21 y S24 del género Pseudomonas, el grupo (II) incluyó las cepas con capacidad de utilizar

tres HPAs, en este grupo encontramos las 4 cepas W3, W4, W10 y W12 pertenecientes al

género Halomonas y la cepa S27 perteneciente al género Bacillus. En el grupo (III) se

incluyeron las cepas con capacidad de utilizar cuatro HPAs, en este grupo se encontraron

las cepas W1, W15, W16, F17, F20 pertenecientes al género Bacillus, W5 y W7 del género

Thalassospira, Marinobacter sp. W8 así como Brevibacterium casei F2. De los tres grupos

caracterizados destacamos las cepas del grupo (III) que se identificaron capaces de utilizar

los HPAs naftaleno, fenantreno, antraceno y pireno como única fuente de carbono.

4.3.1.3 Crecimiento en medio líquido con naftaleno

Una vez seleccionadas las bacterias en función de su tolerancia a los HPAs

anteriormente descritos, se procedió a determinar su crecimiento en medio líquido con

naftaleno al 1% (p/v), realizando el estudio de forma comparativa entre la el crecimiento de

las bacterias y la capacidad degradadora del naftaleno en el medio líquido MMS (mínimo

marino sintético) donde el HPA fue la única fuente de carbono para el crecimiento. Los

resultados obtenidos permitieron conocer qué cepas bacterianas desarrollarían un proceso

de biodegradación y, por consiguiente, que cepas debían ser seleccionadas para posteriores

estudios y caracterización.

115
Resultados

Los resultados obtenidos mostraron que la cepa B. thuringiensis W1 presentaba el

máximo de crecimiento en el medio mínimo (MMS) con naftaleno (1% (p/v)) a las 48 horas

de incubación del orden de 1 logaritmo. Este crecimiento fue acompañado de una

disminución de 0,74 g/l de naftaleno (Figura 4.28).

W1

11 8
g de naftaleno/l de cultivo

LogUFC/ml
10

9
5

8 4
0 24 48 72

Tiempo (horas)

Concentración de naftaleno Control de e liminación de naftale no LogUFC/ ml de cultivo

Figura 4.28. Crecimiento y capacidad degradadora de la cepa Bacillus thuringiensis W1 (p<0,05).

La cepa B. casei F2 (Figura 4.29) mostró un máximo de crecimiento de 0,6 logaritmos

a las 48 horas de incubación, este crecimiento fue acompañado de una eliminación de

naftaleno de 0,62 g/l respecto a la concentración inicial del naftaleno en el medio de cultivo.

F2
11 8
g de naftaleno/l de cultivo

7
10
LogUFC/m l

9
5

8 4
0 24 48 72
Tiempo de incubación (horas)

Concentración de naftaleno Control de eliminación de naftaleno LogUFC/ml cultivo

Figura 4.29. Crecimiento y capacidad degradadora de la cepa Brevibacterium casei F2 (p<0,05).

116
Resultados

Con respecto al crecimiento de las cepas B. pumilus W15, W16, F17, F20, S22 y S27

en presencia de 10 g/l de naftaleno (Figura 4.30), puede observarse que la cepa W15

presentó un crecimiento lento acompañado de una disminución de 0,86 g/l de la

concentración de naftaleno a las 24 horas de incubación, mientras que la cepa W16 mostró

un crecimiento superior a 1 logaritmo a las 24 horas de incubación, originando una

eliminación de 0,73 g/l en la concentración de naftaleno. Respecto a la cepa F17 aunque el

crecimiento fue de 0,65 logaritmos, el rendimiento de la eliminación de naftaleno fue similar

a las otras cepas anteriormente comentadas. Por el contrario, las cepas F20, S22 y S27

mostraron menor capacidad de eliminación del hidrocarburo.

W15
11 8 11 W16 8
g de naftaleno/l de cultivo

g de naftaleno/l de cultivo
10 7 7
10

LogUFC/ml
LogUFC/ml

9 6 6

9
8 5 5

7 4 8 4
0 24 48 72 0 24 48 72
Tiempo de incubación (horas) Tiempo de incubación (horas)

F17
11 8 F20
11 8
g de naftaleno/l de cultivo
g de naftaleno/l de cultivo

7
7
LogUFC/ml

10
10

LogUFC/ml
6 6

9 9
5 5

8 4 8 4
0 24 48 72 0 24 48 72
Tiempo de incubación (horas)
Tiempo de incubación (horas)

S22 S27
11 8
11 8
g de naftaleno/l de cultivo

g de naftaleno/ l de cultivo

7
7
10
10
LoUFC/ml

LogUFC/ml

6
6

9
9
5
5

8 4 8 4
0 24 48 72 0 24 48 72
Tiempo de incubación (horas) Tiempo de incubación (horas)

Concentración de naftaleno Control de eliminación de naftaleno

Figura 4.30. Crecimiento y capacidad degradadora de las cepas W15, W16, F17, F20, S22 y S27
pertenecientes al género Bacillus (p<0,05).

117
Resultados

Respecto al género Halomonas (Figura 4.31), se observó que H. alkantarctica W3 y H.

variabilis W10 mostraron un máximo de crecimiento a las 48 horas de incubación, este

crecimiento vino acompañado de una eliminación de naftaleno de 0,83 g/l para W3 y de

0,97g/l para W10. Por otra parte la cepa H. variabilis W4 mostró máximo crecimiento a las 48

horas de incubación acompañado de una disminución de 0,7 g/l de la concentración de

naftaleno. Respecto a la cepa Halomonas sp. W12 presentó un crecimiento más lento y menor

eficacia en la eliminación del HPA (0,53 g/l) (Figura 4.31).

W3 W4

11 8 11 8
g de naftaleno/l de cultivo

g de nfataleno/l de cultivo

LogUFC/ml
10 10

6 LogUFC/ml 6

9 9
5

8 4 8 4
0 24 48 72 0 24 48 72
Tiempo de incubación (horas)
Tiempo de incubación (horas)

W10 W12
11 8 11 8

10 7
g de naftaleno/l de cultivo

10 7
g de naftaleno/l de cultivo

LogUFC/ml

LogUFC/ml
9 6 9 6

8 5 8 5

7 4 7 4
0 24 48 72 0 24 48 72
Tiempo de incubación (horas)
Tiempo de incubación (horas)

Concentración de Naftaleno Control de eliminación de naftaleno

Figura 4.31. Crecimiento y capacidad degradadora de las cepas W3, W4, W10 y W12
pertenecientes al género Halomonas (p<0,05).

Las cepas Thalassospira sp. W5 y W7 (Figura 4.32) mostraron menor crecimiento con

una eliminación de 0,71 g/l de naftaleno obtenida por W7. Con respecto a la cepa

Marinobacter sp. W8, se observó un buen crecimiento que alcanzó 1,41 logaritmos a las 24

horas de incubación, este crecimiento fue acompañado de una disminución de 1,44 g/l de la

concentración del naftaleno en el medio de cultivo.

118
Resultados

W5 W7

11 8
11 8
g de naftaleno/l de cultivo

7 7

g de naftaleno/l de cultivo

LogUFC/ml
10 10

LogUFC/ml
6 6

9 9
5 5

8 4
8 4
0 24 48 72 0 24 48 72

Tiempo de incubación (horas) Tiempo de incubación (horas)

W8
11 8

7
g de naftaleno/l de cultivo

10

LogUFC/ml
6

9
5

8 4
0 24 48 72
Tiempo de incubación (horas)

Concentración de naftaleno Control de eliminación de naftaleno LogUFC/ml cultivo

Figura 4.32. Crecimiento y capacidad degradadora de las cepas W5, W7 pertenecientes al género
Thalassospira y la cepa W8 perteneciente al género Marinobacter (p<0,05).

La Figura 4.33 representa el crecimiento en presencia de naftaleno de las cepas

Pseudoalteromonas elyakovii W18, Pseudomonas fluorescens S21 y Pseudomonas grimontii S24 y la

capacidad de dichas cepas para eliminar el HPA. De los resultados obtenidos destacamos la

cepa Pseudomonas grimontii S24 con la cual se obtuvo una eliminación de 0,86 g/l de la

concentración del naftaleno, dicha tasa de eliminación fue la concentración de eliminación

más alta para este grupo de cepas.

119
Resultados

S21 S24
g de Naftaleno / l de cultivo 11 8 11 8

g de naftaleno/l de cultivo
7 7
10 10

LogUFC/ml

LogUFC/ml
6 6

9 9
5 5

8 4 8 4
0 24 48 72 0 24 48 72

Tiempo de incubación (horas) Tiempo de incubación (horas)

W18
11 8
g de naftaleno/l de cultivo

7
10

LogUFC/ml
6

9
5

8 4
0 24 48 72
Tiempo de incubación (horas)
Concentración de naftaleno Control de eliminación de naftaleno LogUFC/ml cultivo

Figura 4.33. Crecimiento y capacidad degradadora de la cepa W18 perteneciente al género

Pseudoalteromonas y las cepas S21 y S24 pertenecientes al género Pseudomonas (p<0,05).

Como resumen de este primer apartado, puede concluirse que de las 18 cepas

seleccionadas, las cepas H. variabilis W10 y Marinobacter sp. W8 fueron las dos cepas capaces

de originar una eliminación del HPA superior a 1 g/l, tras 72 horas de incubación.

4.3.2 Degradación de crudo Kirkuk

Con objeto de estudiar la capacidad de las 18 cepas incluidas en este trabajo de

investigación para utilizar el crudo como sustrato de crecimiento, se realizaron ensayos

encaminados a estudiar el crecimiento en medio mínimo con crudo a una concentración del

1% (v/v).

120
Resultados

4.3.2.1 Crecimiento en presencia de crudo Kirkuk

Se analizó la velocidad de crecimiento de las 18 cepas en presencia de crudo Kirkuk

al 1% (p/v) como único sustrato de crecimiento, tal y como se describió en el apartado 3.9.3

de la sección de Material y Métodos.

De los resultados obtenidos por las cepas W1, W15, W16, F17, F20, S22 y S27

(Figura 4.34a) pertenecientes al género Bacillus, destacamos que la cepa W16 desarrollo un

crecimiento importante de 2,07 logaritmos a los 4 días de incubación. Las cepas F17 y F20

mostraron un máximo crecimiento a los 2 días de incubación mientras que para las otras

cepas del género Bacillus el crecimiento fue menor que aquel obtenido por las tres cepas

comentadas anteriormente. Asimismo, para la cepa F2 del género Brevibacterium se mostró

un máximo crecimiento de 1,89 logaritmos a los 4 días de incubación.

Las cepas W3, W4, W10 y W12 (Figura 4.34b) pertenecientes al género Halomonas,

mostraron un máximo de crecimiento, superior a 1 logaritmo en presencia de crudo a los 4

días de incubación.

Las cepas Thalassospira sp. W5 y W7 y la cepa Marinobacter sp. W8 (Figura 4.34c)

mostraron un crecimiento similar en presencia del hidrocarburo. El crecimiento fue de 2

logaritmos a los 2 días de incubación.

Con respecto a las cepas P. elyakovii W18, P. fluorescens S21 y P. grimontii S24

(Figura 4.34d), el crecimiento en presencia de crudo Kirkuk al 1% (v/v) fue superior a 1

logaritmo para las cepas W18 y S21 mientras que el crecimiento de la cepa S24 en presencia

del hidrocarburo fue mucho menor.

121
Resultados

10 (a)

LogUFC/ml
Bacillus thuringiensis W1 Bacillus pumilusW15
7
Bacillus pumilus W16 Bacillus pumilus F17

6 Bacillus pumilus F20 Bacillus pumilus S22

Bacillus pumilus S27 Brevibacterium casei F2

5

4
0 3 6 9 12 15

Tiempo de incubación (días)

10

9 (b)
Halomonas alkantarctica W3
8
Halomonas variabilis W4
LogUFC/ml

7
Halomonas variabilis W10

6 Halomonas sp W12

4
0 3 6 9 12 15

Tiempo de incubación (días)

10 (c)

8 Thalassospira sp. W5
LogUFC/ml

7 Thalassospira sp. W7

6
Marinobacter sp. W8

4
0 3 6 9 12 15

Tiempo de incubación (días)

10
(d)
9

Pseudolateromonas elyakovii W18

8
LogUFC/ml

Pseudomonas fluorescens21
7
Pseudomonas grimontii S24
6

4
0 3 6 9 12 15

Tie mpo de incubación (días)

Figura 4.34. Crecimiento en presencia de crudo Kirkuk al 1% (p/v). Se muestra el crecimiento de las
18 cepas incluidas en este estudio, en medio MMS (p<0,05).

122
Resultados

4.3.2.2 Capacidad degradadora de las cepas

El rendimiento de la degradación de hidrocarburos fue evaluado mediante la

determinación de Hidrocarburos Totales (TPH), alcanos lineales, alcanos ramificados y las

fracciones aromáticas presentes en el crudo.

La Figura 4.35 resume los porcentajes de eliminación de hidrocarburos totales (TPH)

determinados por gravimetría para cada una de las 18 cepas objeto de estudio. Se puede

observar que después de 15 días de incubación en el medio mínimo MMS adicionado de

crudo Kirkuk al 1% (v/v) como único sustrato de crecimiento, las cepas B. pumilus F17, H.

alkantarctica W3 y Marinobacter sp. W8 mostraron los porcentajes más altos de eliminación

de TPH que fueron 42, 64 y 45%, respectivamente. Por otro lado, para el resto de las cepas

los porcentajes de eliminación de TPH fueron comprendidos entre 7% (porcentaje de

eliminación obtenido por B. casei F2) y el 34% (porcentaje obtenido por H. variabilis W4 y B.

thuringiensis W1).
100
90
80
% degradación de TPH

70 64%

60
50 45%
42%
40 34% 34%
32%
28%
30 22% 24%
19% 21% 20% 21% 20%
17%
20
10%
8% 7%
10
0
F17

F20

S22

S27

F2

S21

S24
W1

W15

W16

W3

W4

W10

W12

W5

W7

W8

W18

Cepas
Figura 4.35. Porcentaje de degradación de hidrocarburos totales TPH obtenidos por las 18 cepas
objeto de estudio después de 15 días de incubación (p<0,05).

Durante la presente investigación se estudió la capacidad de las 18 cepas

bacterianas seleccionadas para crecer sobre una mezcla compleja de hidrocarburos, como es

el crudo tipo Kirkuk y determinar la actividad de los cultivos microbianos de eliminar las

fracciones mayoritarias de dicho sustrato.

La Tabla 4.11 refleja los porcentajes de eliminación de las distintas fracciones

analizadas de crudo Kirkuk, obtenidos por las 18 cepas objeto de estudio.

123
Resultados

Tabla 4.11. Porcentajes de eliminación de las fracciones de hidrocarburos después de la

inoculación de cepas. (p<0,05)
Cepas Alcanos Alcanos Aromáticos Alcanos Alcanos
<C20 >C20 ramificados cíclicos
W1 00.00 75.23±0.12 44.33±0.51 00.00 100.12±0.51
W15 10.23±1.4 20.12±0.22 100.12±0.33 00.00 100.11±0.23
Bacillus W16 4.10±0.97 63.12±0.45 100.14±0.14 00.00 87.23±0.01
F17 93.11±0.04 98.51±0.1 100.12±0.12 00.00 87.14±0.02
F20 00.00 00.00 83.31±0.05 34.51±0.61 93.6±0.72
S22 66.81±0.35 00.00 54.30±2.40 00.00 100.21±0.88
S27 26.92±0.42 00.00 88.31±2.50 21.61±0.12 100.12±0.03
Brevibacterium F2 00.00 82.33±0.14 74.11±0.03 00.00 100.33±0.05
W3 5.05±0.05 76.25±0.16 77.10±0.05 00.00 100.13±1.31
W4 0.41±0.14 71.12±0.12 100.05±0.04 00.00 100.28±1.22
Halomonas W10 0.34±0.05 67.18±0.02 100.13±0.01 00.00 100.14±0.87
W12 49.11±0.62 88.19±0.01 91.11±0.11 00.00 100.01±2.01
Thalassospira W5 4.12±0.25 70.13±1.04 100.14±1.33 00.00 100.15±1.23
W7 17.12±1.11 69.22±0.05 100.21±1.60 00.00 100.12±1.33
Marinobacter W8 12.13±1.06 64.34±1.18 97.31±1.21 00.00 100.11±2.21
Pseudoalteromonas W18 77.91±0.04 7.23±1.32 80.30±0.02 86.51±0.05 100.10±1.21
S21 37.41±0.18 00.00 91.81±1.41 25.50±0.54 100.11±0.41
Pseudomonas S24 40.29±0.24 00.00 88.80±0.03 73.61±1.2 94.71±0.78
a , porcentaje inicial de las fracciones que constituyen el crudo Kirkuk

Se puede observar que el crudo Kirkuk se constituyó de alcanos C10-C20, alcanos >C20,

fracciones aromáticas, alcanos ramificados y alcanos cíclicos. Así, los compuestos

aromáticos y los alcanos cíclicos que constituyen el crudo Kirkuk fueron las fracciones

eliminadas por las 18 cepas con porcentajes de eliminación considerables, asimismo, las

cepas B. pumilus F17 y S22, Halomonas sp. W12 y P. elyakovii W18 produjeron una

eliminación superior al 50% en la fracción de alcanos <C20, mientras que los alcanos >C20

fueron eliminados también en porcentaje superior al 50% por las cepas B. thuringiensis W1,

B. pumilus W16 y F17, B. casei F2, H. alkantarctica W3, H. variabilis W4 y W10, Halomonas sp.

W12, Thalassospira sp. W5 y W7 y Marinobacter sp. W8. Por otro lado destacar que las

fracciones aromáticas fueron eliminadas en más del 90% por las cepas B. pumilus W15, W16,

F17, H. variabilis W4, W10, Halomonas sp. W12, Thalassospira sp. W5, W7, Marinobacter sp. W8

y P. fluorescens S21, siendo está la fracción de hidrocarburo más eficazmente eliminada. Los

alcanos ramificados fueron eliminados por P. grimontii S24 y P. elyakovii W18 con

porcentajes de eliminación superiores al 70%, y los alcanos cíclicos fueron eliminados por

las 18 cepas estudiadas con porcentajes de eliminación superiores al 80%.

Los resultados obtenidos indicaron que de las 18 cepas estudiadas, cabe destacar las

cepas B. pumilus F17, Halomonas sp. W12, P. elyakovii W18 y P. grimontii S24 que mostraron

124
Resultados

porcentajes de eliminación considerables, de las distintas fracciones analizadas. Para ello

podemos sugerir que estas cuatro cepas parecen ser de mayor interés en la degradación de

hidrocarburos.

Asimismo, se realizó un análisis de comparaciones múltiples utilizando el

estadístico Tukey con un grado de significancia de 0,05 para determinar si existía una

diferencia estadísticamente significativa entre los resultados obtenidos. El método Tukey

consiste en la ordenación de las medias de modo que todas las comparaciones son referidas

a la misma diferencia mínima. Según este análisis de comparaciones múltiples (Diferencias

Honestamente Significativas de Tukey) los resultados presentaron una significancia de

p<0,05 (p=0,00). Así, cabe destacar que las fracciones aromáticas fueron totalmente

eliminadas por las cepas B. pumilus W15, W16 y F17, H. variabilis W4 y W10 y Thalassospira

sp. W5 y W7, con una significación de (p<0,05). Las fracciones de alcanos ramificados fueron

mejor eliminadas por las cepas P. elyakovii W18 y P. grimontii S24, siendo el 86,5% alcanzado

por la cepa W18, el porcentaje de eliminación más elevado obtenido, este resultado presentó

una significancia de p=0,00 (p<0,05). Los alcanos cíclicos fueron eliminados por todas las

cepas con un porcentaje de eliminación superior al 87% (p<0,05).

4.3.2.3 Relación entre los resultados obtenidos en los estudios de degradación de

hidrocarburos
Durante el presente trabajo se analizaron los resultados obtenidos en los

experimentos de crecimientos en presencia de crudo, con el fin de verificar el grado de

eliminación de los TPH. Se realizó un análisis de conglomerados jerárquicos. El resultado de

este análisis se muestra en el siguiente dendograma (Figura 4.36).

Se puede observar en el siguiente dendograma que se establecieron dos grupos de

cepas, el primer grupo englobó las cepas W1, W15, W16, F20, S22, S27 del género Bacillus,

las cepas W4, W10, W12 del género Halomonas, las cepas W5, W7 del género Thalassospira,

las cepas S21, S24 del género Pseudomonas, las cepas F2 y W18 pertenecientes a los géneros

Brevibacterium y Pseudoalteromonas, respectivamente. Este grupo de cepas resultó ser el

grupo de cepas con menos porcentajes de eliminación de TPH, los porcentajes obtenidos en

este caso fueron comprendidos entre el 7 y el 34%. El segundo grupo englobó las tres cepas

con mayor porcentajes de eliminación de los TPH, que son las cepas Halomonas alkantarctica

W3, Marinobacter sp. W8 y Bacillus pumilus F17.

125
Resultados

Distancia media entre los grupos

0 5 10 15 20 25
Num +---------+---------+---------+---------+---------+

B.pumilus S27 7 òø
P.fluorescens S21 17 òú
B.pumilus S22 6 òú
Thalassospira sp W7 14 òú
B.pumilus W16 3 òú
Thalassospira sp W5 13 òôòòòòòø
P.grimontii S24 18 òú ó
Halomonas sp W12 12 ò÷ ùòòòòòòòø
B.thuringiensis W1 1 òø ó ó
H.variabilis W4 10 òú ó ó
H.variabilis W10 11 òôòòòòò÷ ùòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòø
P.elyakovii W18 16 ò÷ ó ó
B.pumilus F20 5 òø ó ó
B.casei F2 8 òôòòòòòòòòòòòòò÷ ó
B.pumilus W15 2 ò÷ ó
B.pumilus F17 4 òûòòòòòòòòòòòòòòòòòø ó
Marinobacter sp W8 15 ò÷ ùòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòò÷
H.alkantarctica W3 9 òòòòòòòòòòòòòòòòòòò÷
Figura 4.36. Dendograma de análisis de clúster de los resultados de eliminación de los
hidrocarburos totales TPH para las 18 cepas objeto de estudio.

Asimismo, se realizó otro análisis de conglomerados jerárquicos que agrupa los

resultados dependiendo de la distancia o diferencia entre los resultados de eliminación de

las fracciones de hidrocarburos obtenidos. El resultado de este análisis se representa a

continuación en el dendograma de la Figura 4.37.

Distancia media entre los grupos
0 5 10 15 20 25
Num +---------+---------+---------+---------+---------+

H.variabilis W4 11 òø
Thalassospira sp W5 14 òú
H.variabilis W10 12 òú
Thalassospira sp W7 15 òôòø
Marinobacter sp W8 16 òú ó
B.pumilus W16 4 ò÷ ùòòòòòòòòòø
B.casei F2 9 òø ó ó
H.alkantarctica W3 10 òôò÷ ùòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòø
Halomonas sp W12 13 ò÷ ó ùòø
B.thuringiensis W1 2 òòòòòòòòòòòòò÷ ó ó
B.pumilus F17 5 òòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòò÷ ó
P.elyakovii W18 17 òòòòòòòòòûòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòø ó
P.grimontii S24 19 òòòòòòòòò÷ ó ó
B.pumilus S27 8 òûòòòòòø ùòòòòòòòòòòòòòòò÷
P.fluorescens S21 18 ò÷ ùòø ó
B.pumilus F20 6 òòòòòòò÷ ùòòòòòòòòòòòòòø ó
B.pumilus W15 3 òòòòòòòòò÷ ùòòòòòòòòò÷
B.pumilus S22 7 òòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòò÷

Figura 4.37. Dendograma de análisis de clúster de los resultados de eliminación de las

fracciones de hidrocarburos para las 18 cepas incluidas en este estudio

126
Resultados

Se puede observar que el siguiente dendograma separa cuatro grupos de cepas, el

primer grupo está constituido por W1, W16 del género Bacillus, W3, W4, W10, W12 del

género Halomonas, W5, W7 del género Thalassospira, F2 del género Brevibacterium y W8

perteneciente al género Marinobacter. El segundo grupo representó la cepa B. pumilus F17, el

tercer grupo se constituyó por las cepas P. grimontii S24 y P. elyakovii W18 y el último grupo

incluyó las cepas W15, F20, S22, S27 del género Bacillus y S21 del género Pseudomonas.

Analizando estos resultados de degradación de crudo Kirkuk, destacar las cepas

Bacillus pumilus F17, Pseudomonas grimontii S24 y Pseudoalteromonas elyakovii W18 por su

mayor capacidad de eliminación de las distintas fracciones de hidrocarburo crudo Kirkuk.

4.4 CAPÍTULO IV. ESTUDIO DE GENES CATABÓLICOS

El empleo de microorganismos para la biorremediación de sitios contaminados con

hidrocarburos es una opción viable por ser una tecnología sencilla y de bajo costo. Por otra

parte, el estudio de genes catabólicos nos permite caracterizar el metabolismo y la respuesta

a cambios en el medio ambiente así como realizar mejoras génicas en los microorganismos,

para incrementar la eficiencia de los procesos de biorremediación.

4.4.1 Construcción de genoteca

En este capítulo hemos estudiado la caracterización genética de uno de los

microorganismos aislados en este trabajo para su uso como modelo de búsqueda de

promotores que respondan a la presencia de petróleo o de sus derivados. En esta búsqueda

seguimos una estrategia análoga a la planteada por Uchiyama y col. (2005). Para dicho

estudio se seleccionó la cepa Halomonas variabilis W10 (asilada a partir de muestras de agua

de mar), por ser una cepa Gram negativa y similar al fondo que queríamos utilizar como

herramienta molecular. Como fondo genético para la búsqueda de promotores que

respondan a la presencia de naftaleno se utilizó la cepa Escherichia coli XL1Blue y como

vector se utilizó el plásmido p18GFP que es un derivado del plásmido pUC18 y que

contiene un sitio de clonación múltiple precedido de codones de parada de la transcripción,

un promotor PlacZ, corriente arriba, y el gen de expresión ´gfp bajo control del promotor Plac

corriente abajo (Figura 4.38).

127
Resultados

HindI
Ecl136II
SalI EcoRI
Eco24I
PstI XmiI
Xbal BamHI Kpnl SacI XapI
5´
GGC CAG TGC CAA GCT TGC ARG CCT GCA GGT CGA CTC TAG AGG ATC CCC GGG TAC CGA GCT CGA ATT CGT AAT CAT GGT CAT AGC TGT TTC CTG3´
Leu Ser Ala His Arg Cys Thr Ser Glu Leu Pro Asp Gly Pro Val Ser Ser Ser Asn Thr LLe Met Thr Met

BamHI
XbalI

KnpI
SacI
PstI
SalI
plac

Ampr ´gfp
p18GFP
2.7Kb

Figura 4.38. Plásmido p18GFP. Los sitios de restricción para las enzimas son únicos. Se señalan
además el gen de resistencia a ampicilina y el gen ´gfp que se encuentra bajo control del promotor Plac.
Se muestra en detalle la secuencia de nucleótidos (5´→3´) así como la secuencia de los aminoácidos a
la que da lugar la lectura de los correspondientes codones (cada aminoácido se indica debajo de la
base central del codón que lo codifica). Las flechas indican el sentido de la trascripción de los genes.

Para la construcción de una genoteca basada en el ADN total de la cepa H. variabilis

W10, se purificó el ADN total partiendo de un cultivo saturado en MY3%. La purificación se

realizó siguiendo el método modificado descrito por Kado y Liu (1981) y el resultado de

dicha purificación se analizó por electroforesis en gel de agarosa al 0,7% en TAE 1x (Figura

4.39a). A continuación se digirió parcialmente 84 ng de este ADN con concentraciones

decrecientes de la enzima de restricción Sau3A1. Para ello se realizaron restricciones a

tiempo constante para lo que se emplearon diluciones seriadas; 1/2, 1/4, 1/6, 1/8, 1/10, 1/12,

1/16 y 1/32 de la enzima de restricción a una concentración inicial de 0,05 U/µl y se

incubaron a 37°C durante 1 hora. Para comprobar el resultado de estas restricciones se

analizó nuevamente por electroforesis cada una de las diluciones de las restricciones

realizadas (Figura 4.39b). Se seleccionó la dilución 1/8 como la más adecuada al presentar el

rango de tamaño requerido.

128
Resultados

a) b) W 10 1/8
ADN W10 -
-

10 kb

Figura 4.39. Electroforesis del ADN cromosómico de Halomonas variabilis W10. Se muestra el
estado del ADN antes (a) y después (b) de la restricción con Sau3A1.

Para la correcta inserción de los insertos, se linearizó p18GFP con BamHI Para ello se

tomaron 4 µl del plásmido p18GFP y se digirieron con 0,5 U de la enzima de restricción

BamHI durante 3 horas de incubación a 37°C (Figura 4.40a). A continuación el vector, tras el

protocolo de restricción, fue desfosforilado con 1U de la fosfatasa alcalina de gamba ártica

(Figura 4.40b). La reacción de defosforilación se inactivó por calor a 65°C durante 5 minutos

de incubación.

a) b)

p18GFP
p18GFP sin
sin desfosforilar
defosforilar
defosforilar

4kb p18GFP
p18GFP desfosforilado
defosforilado
defosforilado
4kb 3kb
p18GFP (Bam H1)
3kb
2kb p18GFP plasmido

Figura 4.40. Electroforesis del plásmido p18GFP restringido con Bam HI y defosforilado con
fosfatasa alcalina.

Una vez preparadas las restricciones del ADN total de H. variabilis W10 y del

plásmido p18GFP, se procedió a la ligación de los dos tipos de fragmentos de ADN para

obtener el plásmido transformado con el material genético de la cepa Halomonas variabilis

W10 utilizando 1U de ADN-ligasa como se ha descrito anteriormente en el apartado 3.5.1.8

de la sección de material y métodos. Tras el periodo de reacción de ligación se dializaron 15

µl de ligación utilizando membranas de 0,22 µm de Millipore (cat. nº GVWP02500) durante

1 hora en agua calidad milliQ a temperatura ambiente.

129
Resultados

Del producto de la reacción de diálisis se transformaron 60 µl de células competentes

de E. coli XL1 Blue con 0,5 µl del producto mediante choque eléctrico tal y como se ha

descrito en el apartado 3.5.1.5 de la sección material y métodos. Las células resultantes de

esta transformación se incubaron 1 hora a 37°C y se conservaron en glicerol al 40% para su

posterior uso. A esta librería se le denominó “I1”.

Para conocer la calidad de la librería obtenida se sembraron 100 µl del producto de la

transformación en placa con medio TSA adicionado de Ap100. Tras incubación a 37°C

durante 24 horas, se tomaron 40 colonias que se cultivaron en 3 ml de TSB con Ap100 durante

24 horas y a las cuales se les realizó una extracción de ADN plasmídico mediante el método

Miniprep con el fin de estudiar la variabilidad de los clones y así determinar la calidad de la

librería construida (Figura 4.41).

10 kb
5 kb

2 kb

1.25 kb

Figura 4.41. Electroforesis de ADN plasmídico de 40 clones de la librería I1. Se muestra el

marcador de peso molecular ladder 10Kb (a la izquierda) y el producto de los aislamientos
plasmídicos de las 40 colonias.

Los resultados obtenidos mostraron que de los 40 clones seleccionados, al

menos 15 clones presentaban plásmidos con distintos tamaños, lo que parecía

indicar una suficiente variabilidad en los insertos de los distintos clones obtenidos.

En base a estos resultados se estimó una variabilidad de al menos 37,5% para la

librería construida.

4.4.2 Selección de clones con potencial inserto para eliminación de

aromáticos
Dada la capacidad de Halomonas variabilis W10 para proliferar en hidrocarburos

policíclicos aromáticos, supusimos que una de las rutas potenciales para la eliminación de

estos sustratos podría pasar por la conversión de catecol en ácido cis, cis- mucónico, cuyo

130
Resultados

color marrón puede servir como indicador de la presencia de enzimas como la catecol 2,3

dioxigenasa.

En este trabajo se procedió a estudiar algunas características que pudiese presentar

los clones de la librería construida. Se realizó un estudio para la selección de clones con

potencial inserto de eliminar aromáticos. Así pretendíamos estudiar si en algunos de los

clones de la genoteca I1 se podría identificar la capacidad para transformar catecol.

Para poner de manifiesto la capacidad de los clones para transformar catecol

realizamos un estudio previo para conocer si la cepa H. variabilis W10 en medio MY3%

sólido adicionado de 0,5 M de catecol era capaz de producir ácido cis, cis- mucónico, como

ya se ha descrito en el apartado 3.10 de la sección Material y Métodos. Así se utilizó E. coli

XL1 Blue como control negativo y P. putida KT2440 con TOL (pWW0) como control positivo.

Como se puede observar en la Figura 4.42 y como resultado de este ensayo se observó

cambio a coloración marrón para las cepas P. putida y H. variabilis W10, pero no así para E.

coli XL1 Blue, lo que parece indicar la presencia de catecol 2,3 dioxigenasa en H. variabilis

W10.

E. coli XL 1 Blue P. Putida KT2440 H. Variabilis W10

Figura 4.42. Fotografías de placas con medio sólido rociado con 0,5 M de catecol. Se muestran las
reacciones de las cepas H. variabilis W10 junto con los dos controles P. putida KT2440 (+) y E. coli XL 1
Blue (-).

Para identificar si se había clonado el gen codificante para la catecol 2,3 dioxigenasa

en la genoteca I1, se realizaron diluciones seriadas de la librería de clones obtenida (10-1, 10-2,

10-3, 10-4, 10-5, 10-6) y se sembraron en placas de medio TSA adicionado de Amp100, con el fin

de identificar la dilución donde se obtendrían aproximadamente 1.000 colonias por placa.

Así se escogió la dilución 10-4, debido al número de colonias obtenido en la placa con el

medio TSA adicionado de Amp100.

Una vez obtenidas 10 placas con aproximadamente 1.000 colonias, cada una de las

placas se rociaron con una solución de catecol al 0,5 M. Transcurridos 5 minutos se

observaron dos colonias (de dos clones), las cuales presentaron un cambio de color a

131
Resultados

“marrón”. Posteriormente se les realizó una PCR-GFP para caracterizar el inserto donde los

resultados de esta amplificación se muestran en la Figura 4.43.

p18GFP

C-1

C-2
4kb

2kb

Figura 4.43. Electroforesis de la reacción PCR-GFP de los dos clones que dieron reacción positiva
con el catecol. De izquierda a derecha se indica en la primera calle el plásmido p18GFP sin inserto,
las calles 2 y 3 indican el plásmido que contiene los insertos de las dos colonias obtenidas y la última
calle contiene el marcador de peso molecular Ladder 10Kb.

Los resultados obtenidos en este capítulo representan un estudio preliminar para la

caracterización de los microorganismos con capacidad de catabolizar los compuestos

aromáticos, ya que la librería construida I1 presentaba una variabilidad de 37,5% y algunos

clones de la misma presentaron características de inducir operones para la degradación de

aromáticos. Así sería conveniente realizar estudios futuros para una mejor caracterización

de la genoteca I1 en base a citometría de flujo con SORTER como se propone por Uchiyama

y col. (2005). Estos estudios se están llevando acabo en estos momentos por el Lcdo. Luca

Bianchi en nuestro grupo.

132
55.. D
DIISSCCU
USSIIÓÓN
NGGE
ENNE
ERRA
ALL

133
134
Discusión General

Los vertidos de fuel al mar debidos a accidentes de grandes petroleros causan

importantes daños ecológicos, que no se limitan a las zonas del derrame, la contaminación

puede alcanzar las zonas costeras y afectar grandes extensiones del litoral. Se ha demostrado

que los microorganismos degradadores de hidrocarburos y compuestos relacionados del

petróleo son ubicuos en los ambientes marinos (Sutiknowati y col., 2007). Asimismo, se ha

puesto de manifiesto que cuando llega una contaminación por hidrocarburos, se producen

cambios en las poblaciones microbianas autóctonas con un enriquecimiento de los

microorganismos degradadores (Syakti y col., 2008).

En noviembre del 2002, el petrolero Prestige que transportaba 77.000 toneladas de

petróleo, se partió en dos y derramó unas 50.000 toneladas de fuel al mar (Fernández-Álvarez

y col., 2006). Este desastre, unido a las implicaciones políticas por el accidente, provocó una

movilización masiva en la opinión pública y en la comunidad científica. El gobierno español

encargó a la empresa Repsol YPF el estudio y ejecución del proyecto de la recuperación del

fuel que quedó en los contenedores del petrolero Prestige. Dentro de este gran proyecto, la

empresa Repsol YPF consideró como última fase del mismo evaluar la viabilidad de

biorremediación del fuel que pudiera quedar como remanente en el interior del barco

hundido una vez realizadas todas las tareas de extracción. Dicho estudio fue realizado en el

Instituto Universitario de Investigación del Agua de la Universidad de Granada, por

investigadores del grupo de investigación de Microbiología Ambiental (RNM 270).

Teniendo en cuenta la gran diversidad microbiana de los mares y océanos y el gran

potencial biotecnológico descrito para los microorganismos de origen marino, uno de los

primeros objetivos del proyecto de “viabilidad de biorremediación del fuel del Prestige” fue

el aislamiento y caracterización de bacterias degradadoras de hidrocarburos a partir de

muestras obtenidas en las proximidades de la zona del hundimiento del petrolero (Uad y

col., 2010).

En el presente trabajo de investigación, los microorganismos incluidos en este estudio

se seleccionaron por presentar dos características de gran importancia para su posterior

aplicación, de forma individualizada o en consorcio, en técnicas de bioaumento para la

remediación de ecosistemas contaminados con hidrocarburos. Estas propiedades fueron la

capacidad para crecer en presencia de distintos hidrocarburos y la capacidad de la mayoría

de ellas de producir biopolímeros con actividad emulgente. Así, destacamos que estas cepas

135
Discusión General

fueron aisladas de muestras de aguas y sedimentos con bajos niveles de contaminación,

extraídas de la zona del hundimiento, así como de muestras de fuel de los contenedores del

pecio donde la concentración de hidrocarburos era muy elevada.

Los resultados del análisis comparativo de la secuenciación del gen ADNr 16S

pusieron de manifiesto que las 18 cepas seleccionadas pertenecían a los géneros Bacillus,

Pseudomonas, Pseudoalteromonas, Marinobacter, Thalassospira, Halomonas y Brevibacterium,

géneros que en la bibliografía han sido frecuentemente relacionados con la degradación de

hidrocarburos y aislados de hábitats diversos (Melcher y col., 2002; Pavitran y col., 2004;

Wongesa y col., 2004; Liu y col., 2007; Roh y col., 2008). El 38,9% (7 de 18 cepas) de las cepas

seleccionadas pertenecieron al género Bacillus; una cepa identificada como B. thuringiensis y 6

como B. pumilus. El género Bacillus se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza,

siendo aislado con frecuencia de ambientes contaminados (Ijah y Antai, 2003), este género

bacteriano se ha demostrado nuevamente con capacidad de colonizar ecosistemas

contaminados con hidrocarburos (Yousefi-Kebira y col., 2009), además, se han descrito cepas

del género Bacillus aisladas de aguas y sedimentos marinos (Bull y col., 2000; Zhuang y col.,

2003).

Respecto a la cepa F2 aislada de muestras de fuel, se identificó como B. casei. De este

género bacteriano han sido descritos bacterias aisladas a partir de muestras contaminadas

con diesel, aceites hidráulicos o efluentes altamente contaminados y han mostrado su eficacia

en la biodegradación de efluentes contaminados (Pavitran y col., 2004; Vieira y col., 2007).

Por otra parte, el género Halomonas se caracterizó por colonizar suelos y aguas salinos,

pudiendo tolerar desde concentraciones inferiores al 1% (p/v) hasta valores próximos al 30%

(p/v). Dentro de este género es importante resaltar, que se ha descrito la capacidad de estos

microorganismos de producir exopolisacáridos con actividad emulgente sobre hidrocarburos

del petróleo (Calvo y col., 2002; Martinez-Checa y col., 2002; 2007). En este estudio 4 de las

cepas estudiadas (22%) pertenecieron al género Halomonas, y fueron identificadas como H.

alkantarctica W3, H. variabilis W4 y W10 y Halomonas sp. W12, con un porcentaje de identidad

superior a 98% (Uad y col., 2010), todas se aislaron de muestras de agua de mar obtenida a

4.000 m de profundidad.

El género Thalassospira fue descrito por primera vez por López-López y col (2002). En

el presente estudio se caracterizaron las cepas W5 y W7 como Thalassospira sp. con un

136
Discusión General

porcentaje de identidad de 99%. Kodama y col (2008) aislaron de agua de mar contaminada

con hidrocarburos, una nueva especie degradadora de HPA, la cual fue identificada como T.

tepidiphila, asimismo Liu y col (2007) describieron otras bacterias; T. xiamenensis y T.

profundiamaris que fueron aisladas de agua superficial contaminada y de sedimentos marinos

contaminados con hidrocarburos, respectivamente.

Así, W8 aislada de muestras de agua, identificada como Marinobacter sp., mostró una

elevada capacidad para eliminar HPAs. El género Marinobacter fue descrito por primera vez

como género característico de microorganismos marinos degradadores de HPAs, en este

sentido, se describió una nueva especie M. goseongensis, halotolerante, capaz de proliferar en

presencia de hidrocarburos Policíclicos aromáticos. Esta especie fue aislada de agua de mar

del este de Corea (Gauthier y col., 1992; Roh y col., 2008).

Por otra parte, el género Pseudomonas se encuentra frecuentemente asociado a

ambientes contaminados con hidrocarburos (Norman y col., 2002). Se conoce por su

capacidad para crecer sobre una amplia variedad de hidrocarburos del petróleo como

benceno, naftaleno, tolueno (Haigler y col., 1992), gasolina, queroseno y diesel (Wongesa y

col., 2004). También se han estudiado los complejos enzimáticos y los plásmidos relacionados

en la asimilación y degradación de estos hidrocarburos (Smits y col., 2002). Las cepas del

género Pseudomonas incluidas en este estudio fueron aisladas de sedimentos marinos e

identificadas como P. fluorescens (S21) y P. grimontii (S24) con porcentajes de identidad

superiores al 98%, estas cepas mostraron gran eficacia en la degradación de distintas

fracciones de crudo Kirkuk.

Asimismo, se identificó la cepa W18 como P. elyakovii con un 99% de identidad, esta

cepa fue aislada de muestras de agua. Los microorganismos de este género bacteriano fueron

descritos por su capacidad de utilizar hidrocarburos (Melcher y col., 2002; Pucci y col., 2009),

asimismo los ensayos realizados por Röling y col (2002) demostraron la alta capacidad de las

cepas del género Pseudoalteromonas de mantenerse durante 26 días en microcosmos

construidos con sedimentos marinos.

Durante el presente trabajo de investigación se realizó la caracterización fenotípica de

las 18 cepas incluidas en este estudio. Los resultados obtenidos mostraron la variabilidad

metabólica dentro de las cepas del género Bacillus, así destacamos las cepas B. casei F2,

Marinobacter sp. W8 y P. fluorescence S21, como las únicas capaces de utilizar los 95

137
Discusión General

metabolitos como fuente de carbono, además cabe mencionar que las cepas B. casei F2 y P.

fluorecens S21 presentaron resultados de patrones metabólicos similares a aquellos obtenidos

por las cepas tipo correspondientes, consultadas en la base de datos del sistema Biolog TM

(www.biolog.com). Mientras que las cepas W8 de Marinobacter, W3, W4, W10 y W12 de

Halomonas, S24 de Pseudomonas y W18 de Pseudoalteromonas se alejaron de los patrones

metabólicos de las cepas tipo de referencia, ello sugiere que alguna de estas cepas podría ser

clasificada como especie nueva.

En este trabajo de investigación se ha estudiado también la capacidad de las 18 cepas

objeto de estudio, de sintetizar exopolisacáridos y la eficacia de los mismos sobre la emulsión

de diferentes hidrocarburos. Los biosurfactantes y bioemulgentes son sustancias de origen

biológico que facilitan la solubilización de compuestos hidrófobos y presentan un creciente

interés para la industria del petróleo debido a su diversidad, características funcionales y baja

toxicidad en comparación con otros sintéticos (Kumar y col., 2007; Nerurkar y col., 2009;

Satpute y col., 2010). Teniendo en cuenta que las características de los biopolímeros

sintetizados dependen no solo de los microorganismos productores, sino también de las

condiciones de producción, en este estudio se evaluó la influencia de dos parámetros: tiempo

de incubación y concentración de sales sobre la cantidad y la calidad de los biopolímeros

sintetizados.

Los resultados obtenidos en este trabajo, pusieron de manifiesto que las 18 cepas

incluidas en este estudio fueron capaces de producir biopolímeros en un rango de salinidad

comprendido entre el 1 y el 7% de sales (p/v), si bien el 3% (p/v) fue en la mayoría de los

casos el óptimo, tanto en cantidad de polímero sintetizado como en calidad del mismo. Esta

propiedad supondría una ventaja a la hora de utilizar estos microorganismos o sus

biopolímeros en la descontaminación de ambientes salinos.

Respecto a la actividad emulgente de los biopolímeros obtenidos, tras el análisis de

los valores de emulsión alcanzados por los BE sintetizados por las 18 cepas, hay que destacar

que los sustratos: crudo Kirkuk, xileno, octano y tolueno fueron los sustratos mejor

emulsionados, mientras que el AML y el AMP fueron los sustratos más difíciles de

emulsionar, asimismo se puso de manifiesto que los BE sintetizados en este estudio,

alcanzaron valores elevados de la actividad emulgente frente al crudo Kirkuk, en

comparación con la actividad emulgente obtenida por los surfactantes químicos tween 80 y

138
Discusión General

triton x100 según los datos referenciados por Martínez-Checa y col (2002). Esto supone

igualmente una ventaja importante, teniendo en cuenta que la contaminación sobre todo por

derrames accidentales suele estar producida por mezclas complejas de hidrocarburos como

son los crudos o el fuel (Atlas y col., 1995b; Pavitran y col., 2004).

En cuanto al estudio de la productividad, en el presente trabajo de investigación, se

constató que la producción de los biopolímeros sintetizados por las cepas del género Bacillus,

osciló entre 0,14 y 2,28 g/l de cultivo. La cantidad de los polímeros sintetizados fue muy

variable. Así, destacamos los biopolímeros W1-5, W15-3 y S22-3 sintetizados al 3% (p/v) de

sales con una producción superior al 1 g/l, siendo esta concentración de sal el óptimo de

crecimiento para dichos microorganismos productores de EPS. Estos polímeros se

caracterizaron con una media de 57% (p/p) de carbohidratos y 12% (p/p) de proteínas así, se

obtuvieron valores elevados de actividad emulgente frente a más de un sustrato (≥50%).

Estos resultados concuerdan con aquellos referenciados por numerosos autores quienes

describieron que las cepas pertenecientes al género Bacillus se caracterizaron por producir

biopolímeros con elevada actividad emulgente (Maugeri y col., 2002; Toledo y col., 2008; Liu

y col., 2010; Mnif y col., 2011).

Para el género Brevibacterium, se ha descrito una cepa Met-1 perteneciente al género

Brevibacterium, con capacidad de producir bioemulgente con elevada actividad emulgente

(Pavitran y col., 2004). Así, en el presente estudio se ha mostrado que los biopolímeros

sintetizados por la cepa F2 del género Brevibacterium se caracterizaron igualmente por

producciones muy variables que no superaron 1,04 g/l de cultivo (producción del

biopolímero F2-6). Los 8 biopolímeros sintetizados por F2 se caracterizaron con alto

contenido en carbohidratos, alcanzando 80% (p/p) de carbohidratos para el biopolímero F2-7,

mientras que los porcentajes de proteínas oscilaron entre 7 y 15% (p/p). Para este grupo de

biopolímeros la actividad emulgente varió entre 34 y 55% frente a menos de 5 hidrocarburos.

Respecto al género bacteriano Halomonas, se ha descrito que este género se aisla de una

gran diversidad de hábitat salinos y ha sido caracterizado por su capacidad para producir

exopolisacáridos con aplicaciones biotecnológicas, entre ellas la actividad emulgente de esos

biopolímeros y su uso potencial en la biorremediación de ambientes contaminados con

hidrocarburos (Béjar y col., 1998; Calvo y col., 2002, Martínez-Checa y col., 2002, 2007). En

este estudio se ha mostrado que las cepas del género Halomonas se caracterizaron por valores

139
Discusión General

elevados de producción, hay que destacar la producción máxima de 4,93 g/l de cultivo, del

biopolímero W10-2 sintetizado por H. variabilis W10, al 1% (p/v) de sales y 15 días de

incubación. Y como se ha descrito en la bibliografía, la composición química de estos

biopolímeros estuvo fuertemente influenciada por las condiciones de cultivo (Martínez-

Checa 2002; 2007; Kumar y col., 2007), así, el porcentaje de carbohidratos osciló entre 27 y

77% (p/p) y el valor de proteínas varió entre el 2 y el 34 % (p/p). En cuanto a la actividad

emulgente, se alcanzaron valores elevados frente a más de 6 sustratos, así destacamos los BE

W4-3 y W10-3 por su capacidad de emulsionar con más de 50% de emulsión, los sustratos

AML y AMP que como se ha comentado en esta memoria han sido los más difícilmente

emulsionables. En este contexto se han descrito numerosas cepas pertenecientes al género

Halomonas, con capacidad de producir bioemulgentes con elevada actividad emulgente

(Martínez-Checa, 2002; 2007; Satpute y col., 2010; Mnif y col., 2009; 2011)

Respecto al género Thalassospira, existe poca bibliografía referenciada en cuanto a la

producción de los bioemulgentes sintetizados por este género bacteriano, así en el presente

estudio se demostró que las cepas W5 y W7 pertenecientes al género Thalassospira fueron

capaces de producir biopolímeros y la producción de los mismos osciló entre 0,28 y 1,78 g/l

de cultivo, la composición química, en términos de carbohidratos y proteínas presentó

valores elevados. Estos biopolímeros fueron capaces de emulsionar octano, tolueno y crudo

Kirkuk, de ellos, hay que destacar el biopolímero W7-5 con 1,78 g/l de cultivo de producción

y que alcanzó valores de 70% de emulsión frente a xileno, octano, tolueno y crudo Kirkuk.

Asimismo, se ha demostrado que la cepa Marinobacter sp. W8 fue capaz de producir

biopolímeros con actividad emulgente, la producción de estos biopolímeros se caracterizó

por valores bajos que no superaron 1,27 g/l de cultivo. La composición química osciló entre

35 y 73% (p/p) de carbohidratos y entre 6 y 13% (p/p) de proteínas, no obstante, los

biopolímeros sintetizados por la cepa W8 emulsionaron el octano con valores que alcanzaron

76% de emulsión, estos resultados concuerdan con otros referenciados por Al-Mallah y col

(1990) y Satpute y col (2010), quienes describieron cepas del género Marinobacter con

capacidad de producir biopolímeros con actividad emulgentes.

Para el género Pseudomonas, Bonilla y col (2005) describieron el primer

exopolisacárido con propiedades emulgentes producido por la cepa Pseudomonas putida ML2.

Así, se ha descrito un bioemulgente con actividad emulgente sintetizado por la cepa CAM025

140
Discusión General

del género Pseudoalteromonas aislada de agua marinas (Mancuso Nichols y col., 2004). En el

presente estudio, se ha demostrado que las cepas S21, S24 y W18 pertenecientes a los géneros

Pseudomonas y Pseudoalteromonas, fueron capaces de producir biopolímeros que, en general,

se caracterizaron con una producción que osciló entre 0,1 y 2,71 g/l de cultivo. De ellos,

destacamos los biopolímero W18-3, S21-3 y S24-3, todos ellos producidos al 3% (p/v) de sales

y 7 días de incubación con más de 1g/l de cultivo, además estos biopolímeros se

caracterizaron con porcentajes de carbohidratos elevados, y valores de 9, 13 y 27 % (p/p) del

contenido en proteínas, respectivamente, así, se pudo constatar que W18-3 emulsionó solo el

tolueno mientras que S21-3 y S24-3 emulsionaron el octano, tolueno y crudo Kirkuk.

Respecto a la composición química de los biopolímeros obtenidos, en el presente

estudio se caracterizaron los carbohidratos y proteínas de los 133 biopolímeros sintetizados.

Se constató que los BE W3-1, W3-2, W3-7, W4-8, W10-8, W12-7, W12-8 y S24-3, alcanzaron

valores elevados de actividad emulgente, lo cual podría explicarse por el alto contenido en

proteínas presente en estos biopolímeros, en este contexto, se ha descrito que la calidad del

BE está relacionada directamente con su composición proteica (Shepherd y col., 1995;

Rosenberg y Ron, 1999), asimismo, los ensayos realizados por Kavita y col (2011) señalaron

que la naturaleza proteica de los bioemulgentes sintetizados por bacterias marinas aisladas

de costa Tamil Nadu (India) podría influir en la actividad emulgente de dichos biopolímeros.

Así, hay que señalar que los biopolímeros sintetizados por las cepas F20, S22 del género

Bacillus, W18 del género Pseudoalteromonas, S21 y S24 del género Pseudomonas, se

caracterizaron con valores de carbohidratos relativamente bajos, lo cual nos llevó a pensar

que estos biopolímeros podrían contener otras fracciones no determinadas en el presente

estudio. Por otra parte, pudo comprobarse que el tiempo de incubación y la salinidad

influyeron en las características de los biopolímeros sintetizados y esta respuesta dependía

del microorganismo productor. En general los BE sintetizados a los 7 días de incubación y 3%

(p/v) de sales se caracterizaron con porcentajes de carbohidratos y proteínas relativamente

elevados. Asimismo los resultados obtenidos del análisis estadístico RDA mostraron que la

calidad de los BE sintetizados, en términos de carbohidratos y proteínas fue directamente

influenciada por el tiempo de incubación y la concentración de sales.

Con objeto de facilitar la selección de los bioemulgentes con posibles aplicaciones

biotecnológica, se ha propuesto un índice de calidad bioemulgente (Ic) cuyo objetivo es

141
Discusión General

identificar aquellos biopolímeros que presentan una actividad emulgente elevada y valores

óptimos de producción. Los resultados obtenidos mostraron que de los 133 bioemulgentes

incluidos en este estudio, seis de ellos presentaron valores de Ic superiores a 3. Los

biopolímeros W3-7, W4-3, W4-8, W10-2, W10-3 y W12-7 fueron sintetizados por especies del

género Halomonas, produjeron emulsiones estables con la mayoría de los sustratos ensayados

y su producción fue superior a la de otros biopolímeros referenciados (Martínez-Checa y col.,

2002; 2007; Calvo y col., 1998).

Diversos autores han descrito la producción de bioemulgentes por especies de

Halomonas bajo distintas condiciones de cultivo, demostrando al igual que en nuestra

investigación, la influencia de las condiciones de producción en la composición química y en

las características de los polímeros sintetizados. En este mismo sentido, si comparáramos

nuestros resultados con otros referenciados en la bibliografía (Calvo y col 1998, Martinez-

Checa y col 2007; 2002) podríamos comprobar que el índice Ic propuesto en esta memoria

puede ser un criterio útil para el establecimiento previo de utilidad bioemulgente. Podemos

sugerir por tanto, que el índice de calidad bioemulgente desarrollado en el presente estudio,

puede facilitar la selección de los biopolímeros ya que nos permitió evaluar la calidad de los

bioemulgentes sintetizados por las 18 cepas incluidas en este estudio y por lo tanto evaluar la

posible aplicación biotecnológico de los mismos. No obstante es necesario establecer que este

criterio debe de ser mas ampliamente contrastado en posteriores estudios.

Respecto a la degradación de HPAs, en la presente memoria se muestran los

resultados obtenidos, en primer lugar se realizó el estudio de la capacidad de las 18 cepas de

crecer en presencia de los HPAs al 1% (p/v) en medio sólido S4. En este sentido, se ha

descrito que los géneros bacterianos como Pseudomonas y Bacillus son capaces de utilizar a la

vez más de un hidrocarburo (Zhuang y col., 2002; Toledo y col., 2006). Los resultados

obtenidos en este estudio mostraron que todas las cepas seleccionadas resultaron capaces de

proliferar en presencia de naftaleno al 1% (p/v), cabe mencionar que las cepas W1, W15, W16,

F17 y F20 del género Bacillus, la cepa F2 del género Brevibacterium, las cepas W5, W7 del

género Thalassospira y la cepa W8 del género Marinobacter se mostraron con capacidad de

crecer en presencia de naftaleno, antraceno, fenantreno y pireno como única fuente de

carbono.

142
Discusión General

Por otra parte se realizó el estudio de la capacidad de las 18 cepas para cerecer en

medio líquido MMS adicionado de naftaleno al 1% (p/v) como única fuente de carbono. Este

compuesto aromático es el menos complejo de los HPAs, por lo que es más fácilmente

degradable, en general, la tasa de biodegradación disminuye a medida que aumenta el

número de átomos de carbono y el número de radicales (Toledo y col., 2006). Asimismo, los

géneros Halomonas y Marinobacter han sido descritos como grupos de microorganismos

marinos degradares de HPAs (Calvo y col., 2002; Melchor y col., 2002; Rho y col., 2008; Mnif

y col., 2009). En esta memoria se ha demostrado que las cepas Marinobacter sp. W8 y H.

variabilis W10 alcanzaron valores considerables de eliminación de naftaleno, 10% para W10 y

14 % para W8. Estos resultados concuerdan con los ensayos realizados por Vila y col (2010)

quienes describieron una cepa Marinobacter aislada de un consorcio obtenido de un cultivo

enriquecido en agua marina artificial con el fuel del Prestige, y que se caracterizó por

presentar alta capacidad de eliminar hidrocarburos de ambientes marinos contaminados.

Para concluir, basándonos en estos resultados obtenidos se pudo sugerir que Marinobacter sp.

W8 y H. variabilis W10 podrían tener una aplicación en la recuperación de zonas

contaminadas con altas concentraciones de HPAs.

Durante el presente trabajo de investigación se realizó también el estudio de la

capacidad de las 18 cepas de crecer en medio líquido MMS adicionado de crudo Kirkuk al 1%

(v/v) como única fuente de carbono. Este compuesto es una mezcla compleja de

hidrocarburos, por lo que su estudio permite una mayor aproximación al modelo

experimental que pueda derivarse de una contaminación real. Los resultados obtenidos, en

este estudio, mostraron que los valores de eliminación de los TPH oscilaron entre 7 y 64%.

No obstante, analizando los resultados de la degradación de crudo, cabe mencionar que las

cepas B. pumilus F17, Halomonas sp. W12, P. elyakovii W18 y P. grimontii S24 fueron capaces de

eliminar valores considerables de las distintas fracciones de hidrocarburo que constituyen el

crudo Kirkuk. Así, en los estudios realizados por Calvo y col (2004), se ha aislado de residuos

de petróleo una cepa B. pumilus con capacidad de crecer en presencia de crudo, asimismo

Yousefi-Kebira y col. (2009), describieron B. cereus y B. thuringienesis con capacidad de

degradar el diesel por, estas dos cepas fueron aisladas de suelos iraníes contaminados con

hidrocarburos. También se ha descrito una cepa P29 perteneciente al género

Pseudoalteromonas que fue capaz de eliminar los alcanos de cadena corta con un porcentaje de

143
Discusión General

eliminación próximo al 90% (Lin y col., 2009), y otra cepa ZJU perteneciente al género

Pseudomonas fue descrita por Tang y col (2007), como microorganismo con capacidad

considerable de degradar el crudo, asimismo Mnif y col (2011) describieron una cepa

perteneciente al género Halomonas con capacidad de degradar con porcentajes considerables

el hidrocarburo crudo.

Como resumen de este apartado puede concluirse que las cepas Halomonas variabilis

W10, Marinobacter sp. W8, Bacillus pumilus F17, Halomonas sp. W12, Pseudoalteromonas elyakovii

W18 y Pseudomonas grimontii S24 presentaron un comportamiento óptimo y que podrían

tener aplicación en distintos ámbitos de la industria petrolera como la limpieza de tanques y

la recuperación de zonas contaminadas.

Por último, en este trabajo de investigación se abordó el estudio de genes catabólicos,

estos avances se han logrado gracias al desarrollo de nuevas técnicas en genética molecular

(Song y Ward, 2005; Breinig y col., 2000; Heinaru y col., 2000). Para ello, hemos iniciado el

estudio de algunas características genéticas de uno de los microorganismos aislados en este

estudio, y como resultado de dicho estudio, se construyó la librería de clones la cual está

basada en el ADN total de la cepa H. variabilis W10 utilizando Escherichia coli XL1Blue y el

vector p18GFP, para la búsqueda de promotores que respondan a la presencia de naftaleno.

Cabe mencionar que librería de clones construida presentó una variabilidad de 37,5% y

algunos clones presentaron características de inducir operones para la degradación de

compuestos aromáticos. No obstante, según los resultados obtenidos en nuestra

investigación, sería conveniente futuros estudios para una mejor caracterización de la

genoteca construida (I1). Estos estudios nos permitirán por una parte comprender los

mecanismos que regulan la expresión de las rutas involucradas en la eliminación de estos

compuestos y por otra parte realizar mejoras génicas en estos microorganismos, para

incrementar los procesos de biorremediación. Así pues, la construcción de genotecas con

sistemas de identificación de la respuesta de los promotores ante señales ambientes puede ser

un nuevo reto para la biología molecular, ayudando de este forma al desarrollo de

herramientas biotecnológicas para poder, de esta forma, utilizar estas cepas de la manera más

adecuada.

144
66.. CCOON
NCCLLU
USSIIOON
NEESS

145
146
Conclusiones

Los resultados obtenidos en el presente trabajo de investigación, permiten establecer

las siguientes conclusiones:

1. El aislamiento de microorganismos a partir de muestras de agua y sedimentos,

obtenidos de fondos marinos donde en la actualidad se localiza el petrolero Prestige, a

4.000 m de profundidad, nos ha permitido disponer de una colección de bacterias

degradadoras de hidrocarburos y productoras de bioemulgentes. Esto sugiere la

capacidad de estos hábitats para la biotransformación natural de hidrocarburos.

2. De las 18 cepas seleccionadas el 61% fueron aisladas de muestras de agua y fueron

clasificadas dentro de los géneros Bacillus, Halomonas, Thalassospira, Marinobacter y

Pseudoalteromonas. El 22% de los aislados se realizó de muestras de sedimentos y fueron

clasificados como Bacillus y Pseudomonas. Finalmente de las muestras de fuel se aislaron

sólo bacterias Gram positivas, pertenecientes a los géneros Bacillus y Brevibacterium.

Podemos concluir por tanto la amplia biodiversidad de microorganismos degradadores

de hidrocarburos presente en las muestras analizadas.

3. Las cepas degradadoras de hidrocarburos aisladas en las muestras obtenidas del

entorno del Prestige son capaces de crecer en un amplio rango de salinidad, pudiéndose

establecer su optimo próximo al 3% (p/v) de sales.

4. Los perfiles metabólicos obtenidos mediante el estudio fenotípico en base al kit

BiologTM, demuestran importantes diferencias metabólicas entre las cepas objeto de

estudio y sus cepas tipo. Ello sugiere la existencia de nuevas especies bacterianas entre

los aislamientos realizados.

5. Todas las cepas aisladas presentaron la capacidad de producir bioemulgentes a

distintas concentraciones salinas y a distintos tiempos de incubación. No obstante,

mientras que el rendimiento de producción está directamente relacionado con la cepa, la

calidad del biopolímero obtenido expresado depende directamente de los parámetros:

tiempo de incubación y salinidad.

6. El índice de calidad bioemulgente (Ic) propuesto en este estudio, puede ser de utilidad

en la selección preliminar de bioemulgentes sintetizados por bacterias.

7. Todas las cepas crecieron en medio sólido y líquido adicionado de HPAs al 1% (p/v).

Ello indica el interés de estos microorganismos para su uso como herramientas en

147
Conclusiones

procesos de bioaumento para el tratamiento de ambientes contaminados con

hidrocarburos.

8. El crudo Kirkuk, es un sustrato fácilmente asimilable por las bacterias objeto de estudio,

destacando que B. pumilus F17, Halomonas sp. W12, P. elyakovii W18 y P. grimontii S24

consiguieron tasas de degradación de las distintas fracciones del hidrocarburo

superiores al 50% después de 15 días de incubación. Lo que sugiere el uso de estas

bacterias para la construcción de consorcios microbianos para futuros estudios de

degradación de hidrocarburos.

9. La librería de clones construida I1 presenta una variabilidad suficiente para proponer su

uso en la caracterización de promotores con capacidad de responder a presencia de

hidrocarburos, ello permitirá el futuro diseño de biosensores y la caracterización de las

rutas de degradación de estos compuestos.

148
77.. RRE
EFFE
ERRE
ENNCCIIA
ASS BBIIBBLLIIOOG
GRRÁ
ÁFFIICCA
ASS

149
150
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powerful carbon source utilization and chemical sensitivity assay technology accurately identifies
aerobic bacteria by production of a characteristic pattern or “Phenotypic Fingerprint” from discrete test
reactions performed within a 96 wellmicroplate.

168
 AD
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169
170
 Lista de Figuras
Figura 1.1. Algunos ejemplos de hidrocarburos saturados que forman parte de la mezcla de
hidrocarburos de petróleo. Se muestran ejemplos de hidrocarburos tanto lineales como
ramificados. -------------------------------------------------------------------------------------------------27
Figura 1.2. Algunos ejemplos de hidrocarburos presentes en la fracción aromática del
petróleo. -------------------------------------------------------------------------------------------------28
Figura 1.3. Ejemplos de asfalteno y resinas. --------------------------------------------------------------28
Figura 1.4. Ruta metabólica de degradación de naftaleno por Pseudomonas aeruginosa
(Smith, 1990). El último paso en la degradación de poliaromáticos finaliza en ciclo de ácidos
tricarboxílicos (CAT) vía catecol como compuesto intermediario. -----------------------------------37
Figura 1.5. Estructura del heteropolisacárido xantano producido por Xanthomonas campestres.
----------------------------------------------------------------------------------------------43
Figura 1.6. Etapas generales de la biosíntesis de exopolisacáridos (EPS), cápsulas y
lipopolisacáridos en bacterias Gram negativas.-----------------------------------------------------------44
Figura 3.1. Esquema del plásmido p18GFP. La expresión del gen ´gfp está bajo el control del
promotor Plac. Se muestran el sitio de clonación múltiple que incluye el sitio BamHI. -----------61
Figura 3.2. Esquema de la reacción de PCR-16S. Condiciones de amplificación del gen que
codifica ADNr 16S. ----------------------------------------------------------------------------------------------66
Figura 3.3. Microplacas MicroPlateTM. (a) Microplacas GN2/GP2 empleadas en la
cuantificación de la utilización de fuentes de carbono, (b) Fotografía de Microplaca con
pocillos coloreados o no según el uso de la fuente de carbono, el cambio de coloración
corresponde al uso de la fuente de carbono por el microorganismo. --------------------------------68
Figura 3.4. Esquema del proceso de extracción de los exopolisacáridos (EPS). Se muestran las
distintas fases para el proceso de purificación.------------------------------------------------------------71
Figura 3.5. Representación de una de las curvas patrón de carbohidratos totales. En
ordenadas se representa la absorbancia a 490 nm de 4 concentraciones distintas de Glucosa
sometidas al ensayo con fenol y ácido sulfúrico. ---------------------------------------------------------72
Figura 3.6. Representación de una de las curvas patrón de proteínas. En ordenadas se
representa la absorbancia a 590 nm de 6 concentraciones distintas de albúmina sometidas al
ensayo de Bradford. ---------------------------------------------------------------------------------------------73
Figura 3.7. Cantidades de metanol adicionadas para una mayor extracción de naftaleno.
Valores obtenidos mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).-------------------76
Figura 3.8. Representación de una de las curvas patrón de naftaleno. Valores obtenidos
mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).-------------------------------------------76
Figura 3.9. Fotografía de un cromatógrafo HP-1050.---------------------------------------------------77
Figura 4.1. Producto de reacción de PCR tras la amplificación del fragmento del gen ADNr
16S de 1.500 pb. (C-: control negativo; C+: control positivo (ADN genómico de Escherichia coli)).
-------------------------------------------------------------------------------------------------84
Figura 4.2. Árbol filogenético basado en la secuencia del gen ARNr 16S obtenido mediante el
método Neighbour-Joining. Los números de acceso en la base de datos Gen Bank de las

171
secuencias de las especies de referencia son dados entre paréntesis. La barra indica un 5% de
divergencia. Se indican los valores de “bootstrap” mayores del 50%. -------------------------------85
Figura 4.3. Patrón de absorbancia de las cepas W1, W15, W16, F17, F20, S22 y S27 del género
Bacillus. Oxidación/fermentación de las distintas fuentes de carbono ensayadas en la
microplaca GP2. -------------------------------------------------------------------------------------------------87
Figura 4.4. Patrón de absorbancia de la cepa F2 del género Brevibacterium.
Oxidación/fermentación de las distintas fuentes de carbono ensayadas en la microplaca GP2.88
Figura 4.5. Patrón de absorbancia de las cepas W2, W4, W10 y W12 del género Halomonas.
Oxidación/fermentación de las distintas fuentes de carbono ensayadas en la microplaca GN2. -
-------------------------------------------------------------------------------------------------88
Figura 4.6. Patrón de absorbancia de las cepas W5, W7 del género Thalassospira, W8 del
género Marinobacter. Oxidación/fermentación de las distintas fuentes de carbono ensayadas en
la microplaca GN2. ----------------------------------------------------------------------------------------------89
Figura 4.7. Patrón de absorbancia de las cepas W18 del Pseudoalteromonas, S21 y S24 del
género Pseudomonas. Oxidación/fermentación de las distintas fuentes de carbono ensayadas en
la microplaca GN2. ----------------------------------------------------------------------------------------------89
Figura 4.8. Dendograma de análisis de clúster de los patrones metabólicos de microplaca
GP2- BiologTM de los microorganismos Gram positivos.------------------------------------------------90
Figura 4.9. Dendograma de análisis de clúster de los patrones metabólicos de la microplaca
GN2-BiologTM de los microorganismos Gram negativos. -----------------------------------------------90
Figura 4.10. Representación gráfica en dos dimensiones de la correlación obtenida mediante el
análisis multidimensional. Se muestran las agrupaciones de las cepas del género Bacillus y
Brevibacterium juntos con las cepas tipo correspondientes. ---------------------------------------------91
Figura 4.11. Representación gráfica en dos dimensiones de la correlación obtenida mediante el
análisis multidimensional. Se muestran las agrupaciones de las cepas del género Halomonas
juntos con las cepas tipo correspondientes. ----------------------------------------------------------------92
Figura 4.12. Representación gráfica en dos dimensiones de la correlación obtenida mediante el
análisis multidimensional. Se muestran las agrupaciones de las cepas del género Thalassospira
y Marinobacter juntos con las cepas tipo correspondientes.---------------------------------------------92
Figura 4.13. Grafica en dos dimensiones de la correlación obtenida mediante el análisis de
escalonamiento multidimensional. Se muestran las agrupaciones de las cepas del género
Pseudomonas y Pseudoalteromonas juntos con sus cepas Tipo.-------------------------------------------93
Figura 4.14. Crecimiento de Bacillus thuringiensis W1 a distintas concentraciones de sales
(p<0,05). -------------------------------------------------------------------------------------------------94
Figura 4.15. Crecimiento de Brevibacterium casei F2 a distintas concentraciones de sales
(p<0,05). ----------------------------------------------------------------------------------------------94
Figura 4.16. Crecimiento de Bacillus pumilus W15, W16, F17, F20, S22 y S27 a distintas
concentraciones de sales (p<0,05). ----------------------------------------------------------------------------95
Figura 4.17. Crecimiento de W3, W4, W10 y W12 perteneciente al género Halomonas a distintas
concentraciones de sales (p<0,05). ----------------------------------------------------------------------------96

172
Figura 4.18. Crecimiento de Thalassospira sp. W5 y W7 y Marinobacter sp. W8 a distintas
concentraciones de sales (p<0,05). ----------------------------------------------------------------------------97
Figura 4.19. Crecimiento de W18 perteneciente al género Pseudoalteromonas y S21 y S24
pertenecientes al género Pseudomonas a distintas concentraciones de sales (p<0,05). ------------98
Figura 4.20. Efecto del tiempo de incubación y de la concentración de sales sobre la
producción y la composición química del biopolímero W1 sintetizado por la cepa B.
thuringiensis W1 (p<0,05).---------------------------------------------------------------------------------------99
Figura 4.21. Efecto del tiempo de incubación y de la concentración de sales sobre la
producción y la composición química del biopolímero F2 sintetizado por la cepa B. casei F2
(p<0,05). ----------------------------------------------------------------------------------------------- 100
Figura 4.22. Efecto del tiempo de incubación y de la concentración de sales sobre la
producción y la composición química de los biopolímeros W15, W16, F17, F20, S22 y S27
sintetizado por las cepas W15, W16, F17, F20, S22 y S27 del género Bacillus (p<0,05). --------- 101
Figura 4.23. Efecto del tiempo de incubación y de la concentración de sales sobre la
producción y la composición química de los biopolímeros W3, W4, W10 y W12 sintetizados
por las cepas W3, W4, W10, W12 del género Halomonas (p<0,05). ---------------------------------- 102
Figura 4.24. Efecto del tiempo de incubación y de la concentración de sales sobre la
producción y la composición química de los biopolímeros W5, W7 sintetizados por
Thalassospira sp. (W5 y W7) y el biopolímero W8 sintetizado por Marinobacter sp. W8 (p<0,05).-
----------------------------------------------------------------------------------------------- 103
Figura 4.25. Efecto del tiempo de incubación y de la concentración de sales sobre la
producción y la composición química de los biopolímeros W18, S21 y S24 sintetizados por las
cepas del los géneros Pseudoalteromonas y Pseudomonas (p<0,05). ----------------------------------- 104
Figura 4.26. Gráfico triplot del análisis de redundancia (RDA) para los bioemulgentes
producidos por las 18 cepas incluidas en este estudio. Se muestran las dos variables
independientes: tiempo de incubación y salinidad.---------------------------------------------------- 112
Figura 4.27. Representación gráfica en dos dimensiones de la correlación obtenida mediante el
análisis de escalonamiento multidimensional. ---------------------------------------------------------- 115
Figura 4.28. Crecimiento y capacidad degradadora de la cepa Bacillus thuringiensis W1
(p<0,05). -------------------------------------------------------------------------------------------- 116
Figura 4.29. Crecimiento y capacidad degradadora de la cepa Brevibacterium casei F2 (p<0,05). -
-------------------------------------------------------------------------------------------- 116
Figura 4.30. Crecimiento y capacidad degradadora de las cepas W15, W16, F17, F20, S22 y S27
pertenecientes al género Bacillus (p<0,05).---------------------------------------------------------------- 117
Figura 4.31. Crecimiento y capacidad degradadora de las cepas W3, W4, W10 y W12
pertenecientes al género Halomonas (p<0,05). ------------------------------------------------------------ 118
Figura 4.32. Crecimiento y capacidad degradadora de las cepas W5, W7 pertenecientes al
género Thalassospira y la cepa W8 perteneciente al género Marinobacter (p<0,05). -------------- 119
Figura 4.33. Crecimiento y capacidad degradadora de la cepa W18 perteneciente al género
Pseudoalteromonas y las cepas S21 y S24 pertenecientes al género Pseudomonas (p<0,05).------ 120

173
Figura 4.34. Crecimiento en presencia de crudo Kirkuk al 1% (p/v). Se muestra el crecimiento
de las 18 cepas incluidas en este estudio, en medio MMS (p<0,05). ------------------------------- 122
Figura 4.35. Porcentaje de degradación de hidrocarburos totales TPH obtenidos por las 18
cepas objeto de estudio después de 15 días de incubación (p<0,05). ------------------------------- 123
Figura 4.36. Dendograma de análisis de clúster de los resultados de eliminación de los
hidrocarburos totales TPH para las 18 cepas objeto de estudio.------------------------------------- 126
Figura 4.37. Dendograma de análisis de clúster de los resultados de eliminación de las
fracciones de hidrocarburos para las 18 cepas incluidas en este estudio-------------------------- 126
Figura 4.38. Plásmido p18GFP. Los sitios de restricción para las enzimas son únicos. Se señalan
además el gen de resistencia a ampicilina y el gen ´gfp que se encuentra bajo control del
promotor Plac. Se muestra en detalle la secuencia de nucleótidos (5´→ →3´) así como la secuencia
de los aminoácidos a la que da lugar la lectura de los correspondientes codones (cada
aminoácido se indica debajo de la base central del codón que lo codifica). Las flechas indican
el sentido de la trascripción de los genes. ---------------------------------------------------------------- 128
Figura 4.39. Electroforesis del ADN cromosómico de Halomonas variabilis W10. Se muestra el
estado del ADN antes (a) y después (b) de la restricción con Sau3A1. ---------------------------- 129
Figura 4.40. Electroforesis del plásmido p18GFP restringido con Bam HI y defosforilado con
fosfatasa alcalina.----------------------------------------------------------------------------------------------- 129
Figura 4.41. Electroforesis de ADN plasmídico de 40 clones de la librería I1. Se muestra el
marcador de peso molecular ladder 10Kb (a la izquierda) y el producto de los aislamientos
plasmídicos de las 40 colonias.------------------------------------------------------------------------------ 130
Figura 4.42. Fotografías de placas con medio sólido rociado con 0,5 M de catecol. Se muestran
las reacciones de las cepas H. variabilis W10 junto con los dos controles P. putida KT2440 (+) y
E. coli XL 1 Blue (-). -------------------------------------------------------------------------------------------- 131
Figura 4.43. Electroforesis de la reacción PCR-GFP de los dos clones que dieron reacción
positiva con el catecol. De izquierda a derecha se indica en la primera calle el plásmido
p18GFP sin inserto, las calles 2 y 3 indican el plásmido que contiene los insertos de las dos
colonias obtenidas y la última calle contiene el marcador de peso molecular Ladder 10Kb.- 132

174
 Lista de Tablas
Tabla 1.1. Algunos ejemplos de bioemulgentes y sus microorganismos productores. (Banat y
col., 2000; Sutherland, 2001; Calvo y col., 2004) -----------------------------------------------------------47
Tabla 1.2. Relación de algunos microorganismos marinos productores de EPS. ---------------50
Tabla 3.1. Cepas bacterianas empleadas en el presente trabajo. Se indica el nombre y el
origen de cada cepa objeto de estudio y sus referencias. También se indican las características
más relevantes de las cepas aisladas así como las cepas Escherichia coli y Pseudomonas putida
utilizadas como control en otros ensayos.------------------------------------------------------------------57
Tabla 3.2. Composición del medio de cultivo MY. Se indica la composición del medio MY en
gramos por litro de agua destilada c.s.p. -------------------------------------------------------------------58
Tabla 3.3. Solución de sales al 30% (p/v). Se indica la composición de stock de sales gramos
por litro de agua destilada c.s.p.------------------------------------------------------------------------------58
Tabla 3.4. Medio Mínimo S4 (Abril y col., 1991) -------------------------------------------------------59
Tabla 3.5. Medio Marino Sintético (MMS). Se indica la composición en gramos por litro de
agua destilada c.s.p. ---------------------------------------------------------------------------------------------60
Tabla 3.6. Lista de los cebadores empleados en este estudio. Oligonucleótidos usados en la
amplificación y la secuenciación del gen ADNr 16 S y los oligonucleótidos diseñados y usados
en la amplificación y la secuenciación del gen que codifica para la expresión de la enzima
catecol 2,3 dioxigenasa. -----------------------------------------------------------------------------------------65
Tabla 3.7. Composición de las soluciones de la curva patrón de carbohidratos. ---------------72
Tabla 3.8. Composición de las soluciones de la curva patrón de proteínas. ---------------------73
Tabla 3.9. Características más relevantes del crudo Kirkuk -----------------------------------------77
Tabla 4.1. Porcentaje de identidad y longitud de los fragmentos del gen ADNr 16S
secuenciados ------------------------------------------------------------------------------------------------------84
Tabla 4.2. Actividad emulgente frente a AML, AMP, diesel, xileno, octano, tolueno y crudo
Kirkuk, de los biopolímeros sintetizados por las cepas W1, W15, W16, F17, F20, S22 y S27 del
género Bacillus. Expresada en porcentajes de emulsión (p<0,05). ----------------------------------- 105
Tabla 4.3. Actividad emulgente frente a AMP, AML, diesel, xileno, octano, tolueno y crudo
Kirkuk, de los biopolímeros sintetizados por la cepa Brevibacterium casei F2. Expresada en
porcentajes de emulsión (p<0,05). -------------------------------------------------------------------------- 106
Tabla 4.4. Actividad emulgente frente a AMP, AML, diesel, xileno, octano, tolueno y crudo
Kirkuk, de los biopolímeros sintetizados por las cepas W3, W4, W10 y W12 del género
Halomonas. Expresada en porcentajes de emulsión (p<0,05).----------------------------------------- 107
Tabla 4.5. Actividad emulgente frente a AMP, AML, diesel, xileno, octano, tolueno y crudo
Kirkuk, de los biopolímeros sintetizados por las cepas W5 y W7 del género Thalassospira.
Expresada en porcentajes de emulsión (p<0,05).-------------------------------------------------------- 108
Tabla 4.6. Actividad emulgente frente a AMP, AML, diesel, xileno, octano, tolueno y crudo
Kirkuk, de los biopolímeros sintetizados por la cepa Marinobacter sp. W8. Expresada en
porcentajes de emulsión (p<0,05). -------------------------------------------------------------------------- 108

175
Tabla 4.7. Actividad emulgente frente a AMP, AML, diesel, xileno, octano, tolueno y crudo
Kirkuk, de los biopolímeros sintetizados por las cepas S21 y S24 del género Pseudomonas.
Expresada en porcentajes de emulsión (p<0,05).-------------------------------------------------------- 109
Tabla 4.8. Actividad emulgente frente a AMP, AML, diesel, xileno, octano, tolueno y crudo
Kirkuk, de los biopolímeros sintetizados por la cepa Pseudoalteromonas elyakovii W18.
Expresada en porcentajes de emulsión (p<0,05).-------------------------------------------------------- 109
Tabla 4.9. Características más relevantes de los BE seleccionados según el índice de calidad
bioemulgente---------------------------------------------------------------------------------------------------- 111
Tabla 4.10. Capacidad de las cepas seleccionadas para crecer en presencia de 4 HPAs al 1%
(p/v). Se indican los resultados positivos del crecimiento en placas con HPAs (+) y ausencia de
crecimiento (-). ----------------------------------------------------------------------------------------------- 114
Tabla 4.11. Porcentajes de eliminación de las fracciones de hidrocarburos después de la
inoculación de cepas. (p<0,05)------------------------------------------------------------------------------- 124

176
A
ANNE
EXXOO II

177
178
 Tabla I. Fuentes de carbono utilizadas por las cepas Gram positivas seleccionadas. W1:
Bacillus thuringiensis; F2: Brevibacterium casei; W15; W16; F17, F20; S22; S27: Bacillus
pumilus.
METABOLITOS W1 W15 W16 F17 F20 S22 S27 F2

α-ciclodextrina - - - - - - - +

β-ciclodextrina - - - - - - - +

Dextrina - + - - - + + +

Glicógeno - - - - - + - +

Inulina - - - - - - - +

Manan - - - - - - - +

Tween40 - + + - - + - +

Tween80 - + + - - + - +

N-acetil-D-glucosamina - + - - - + - +

N-acetil-D-manosamina - + - - - + - +

Amigladina - + - - - + - +

L-arabinosa - - + + + + - +

D-arabitol + - - - - - - +

D-arbutina - + + + + + + +

D-celobiosa - + + - - + + +

D-fructosa - + + + + + + +

L-fructosa - - - - - + - +

D-galactosa - + - - - + - +

Acido D- galacturonico - - - - - - - +

gentiobiosa - + + + + + + +

Acido D- gluconico - - - - - - - +

α-D glucosa + + + + + + + +

m-inositol - - - - - - - +

α-D-lactosa - - - - - - - +

Lactulosa - - - - - - - +

Maltosa + - + - - - - +

Maltotriosa + + + + + + + +

D-manitol - + + + + + + +

D-manosa - + + + + + + +

D-melezitosa - - - - - - - +

D-melibiosa - - - - - - - +

α-metil D-galactosida - - - - - - - +

β-metil D-galactosida - - - - - - - +

179
 Tabla I. (Continuación)
3-metil glucosa - + + + - + + +
α-metil D-glucósido - - - - - - - +

β-metil D-glucosida - + + + + + + +

α-metil D-manosida - - - - - - - +

Palatinosa - - + - - + - +

D-psicosa - + + + + + + +

D-rafinosa - + + - - + - +

L-ramnosa - - - - - + - +

D-ribosa + + + + + + + +

Salicina - + + + + + + +

Sedoheptulosa - - + - - - - +

D-sorbitol - + - - + + + +

Estaquiosa - - + - - - - +

Sacarosa - + - + + + + +

D-tagatosa - + - - - + + +

D-trehalosa + + - + + + + +

Turanosa - - - - - + - +

Xilitol - - - - - - - +

D-xilosa + + + + + + - +

Acido acético - - - - - - - +

Acido α-hidroxibutirico - - - - - - - +

Acido β-hidroxibutirico - - - - - - - +

Acido γ-hidroxibutirico - - - - - - - +

Acido ρ-hidroxibutirico - - - - - - - +

α-cetoglutarico - - - - - + - +

Acido α- cetovalerico + + - - - + + +

lactamida - - - - - - - +

Acido metil ester D-lactico - - - - - - - +

Acido L-láctico - - - - - - - +

Acido D-málico - - - - - - - +

Acido L-málico - + - + + + + +

Metil pirúvato + + - - - - + +

Mono metil succinato - + - + - + + +

Acido propiónico - - - - - - + +

Acido pirúvico + + - - - - + +

180
Tabla I. (Continuación)
Acido succinámico - - - - - + - +
Ácido succínico - - - - - - - +

Acido N-acetil- L-glutámico - - - - - + - +

L-alaninamida - - - - - + - +

D-alanina - - - - - + - +

L-alanina - + - - - + - +

L-alanil glicina + - - - - + - +

L-asparagina - + - + + + + +

Acido L-glutámico - + - - - - + +

Acido glicil L-glutámico - - - - - + - +

Acido L-proglutámico - - - - - + - +

L-serina - + - + - - + +

Putrescina - - - - - - - +

2,3-butanadiol - - - + - + + +

Glicerol - + - + - + - +

Adenosina - + - + - + + +

2´-deoxiadenosina - + - - - + + +

Inopina - + - + + + + +

Timidina - + - - - + - +

Uridina - + - - - + - +

Adenosina 5´-monofosfato - - - - - + - +

Timidina-5´-monofosfato - + - - - + - +

Uridina 5´-monofosfato - - - - - + - +

Fructosa-6-fosfato - - - - - - - +

Glucosa-1-fosfato - - - - - - - +

Glucosa-6-fosfato - - - - - - - +

D-L-α-glicerolfosfato + + - - - + - +

181
 Tabla II. Fuentes de carbono utilizadas por las cepas Gram negativas seleccionadas. W3:
Halomonas alkantarctica; W4, W10: Halomonas variabilis; W12: Halomonas sp.; W5, W7:
Thalassospira sp.; W8: Marinobacter sp.; W18: Pseudoalteromonas elyakovii; S21: Pseudomonas
fluorescens; S24: Pseudomonas grimontii.
METABOLITOS W3 W4 W10 W12 W5 W7 W8 W18 S21 S24

α-ciclodextrina - - - + - - + + + -

Dextrina - - - + - - + + + +

Glucógeno - - - + + + + + + -

Tween40 + + + + - - + + + +

Tween80 + + + + - - + + + +

D-galactosamina + - - - - - + + + -

N-acetil-D-glucosamina + - - - + + + + + -

Adonitol + - - - + + + + + -

L-arabinosa + + + + + + + + + +

D-arabitol - - - - - + + - + -

D-celobiosa - - - - - + + - + +

i-eritritol - - - - - - + + + -

D-fructosa - + - + + - + - + +

L-fructosa - - - - + + + - + -

D-galactosa - - - - + + + - + -

Gentibiosa - - - - + + + + + +

α-D-glucosa - + - - - - + - + +

m-inositol - - - - - - + - + -

α-D-lactosa - - - - - - + - + -

Lactulosa - - - - + + + - + -

Maltosa - - - - + + + - + -

Manitol - - - - + + + + + -

D-manosa - - - - - - + - + -

D-melibiosa - - - - - - + - + -

β-metil D-glucósido + - - - + - + + + +

D-psicose + - - - + - + + + +

D-rafinosa - - - - + + + - + -

L-ramnosa - - - - + + + - + -

D-sorbitol - - - - + + + + + +

Sacarosa - - - - - - + + + +

D-trehalosa - - - - - - + + + -

Turanosa + - - - - - + - + -

182
Tabla II. (Continuación)
Xilitol + - - - - - + - + -

A. pirúvico metil ester + + - - + + + - + -

A. succínico metil- ester + + - - - - + - + -

Acido acético + - - - + + + - + -

Cis-acido acnítico - - - - - - + - + -

Acido cítrico - - - - - - + - + -

Acido fórmico - - - - + + + - + -

D-a. galactónico lactona - - - - + + + - + -

D-a. galacturónico - - - - - - + - + -

D-a. glucónico + - - - - + + - + -

D-a. glucosamínico - - - - + + + + + -

D-a. glucurínico - - - - - - + - + -

α-A. hidroxibutírico - - - - + + + - + -

β-A. hidroxibutírico + - - - - - + - + -

γ-A. hidroxibutírico - - - - + + + - + -

p-A. hidroxifenilacético - - - - - + + - + -

A. itacónico - - - - + + + - + -

α-keto a. butírico - - - - + + + - + -

α-keto a. glutarico + - - - - - + - + -

α-keto a. valérico + - - - - + + - + -

D,L- A.lactico + - - - + - + - + -

A. malónico - - - - - - + - + -

A. propiónico - - - - - - + - + -

A. quínico - - - - - - + - + -

D-a. sacárico - - - - - - + - + -

A. sebácico - - - - - - + - + -

A. succínico + + - - - + + + + -

A. bromosuccínico + + - - - - + - + -

A. succinámico + + - - - - + - + -

Glucoronamide - - - - - - + - + -

L-alaninamide - - - - + + + - + -

D-alanina - - - - + + + - + -

L-alanina + - - - - + + - + -

L-alanil-glicina - - - - + + + + + -

L-aspargina + - - - - - + + + +

183
Tabla II. (Continuación)
L-a. apartico + - - - - - + - + -

Acido glutámico + + - - - - + - + -

Glicil-L-a. aspartico - - - - - - + - + -

Glicil-L-a. glutámico - - - - - - + - + -

L-histidina - - - - - - + - + -

hidroxi-L-prolina - - - - - - + - + -

L-leucina - - - - - + + - + -

L-ornitina - - - - + + + - + -

L-fenilalanina + - - - + + + - + -

L-prolina + - - - + + + - + -

L-acido piroglutámico - - - - - - + - + -

D-serina - - - - - - + - + -

L-serina - - - - + + + - + +

L-treonina - - - - - - + - + -

D,L-carnitina - - - - - + + - + -

γ-A.amino butirico + - - - + + + - + -

A. urocanico - - - - + + + - + -

Inosina - - - - + + + - + -

Uridina - - - - + + + - + -

Timidina - - - - - + + - + -

fenil-etil-amino - - - - - + + - + -

2-aminoetanol - - - - - + + - + -

D-6 fosfato glucosa - - - - + + + - + -

184
 Tabla III. Índice de utilidad biotecnológica y características más relevantes de los
bioemulgentes sintetizados por las 18 cepas seleccionadas

BE Ic AE Producción Composición química (%)

Denom. Cond. cultivo E (%) nº Sustratos g/l Ca Pb ND
W1-1 W1(1%-7d )c 0,4 51 2 0,22 65 6 28
W1-2 W1(1%-15d) 1,0 45 4 0,132 45 13 42
W1-3 W1(3%-7d) 1,6 62 4 0,5 75 17 8
W1-4 W1(3%-15d) 1,6 62 4 0,82 55 12 33
W1-5 W1(3%-21d) 1,4 50 4 1,08 65 12 23
W1-6 W1(3%-30d) 0,3 53 1 1,69 77 5 18
W1-7 W1(7%-7d) 0,9 36 4 0,45 47 8 44
W15-2 W15(1%-15d) 0,1 72 1 0,3 54 5 41
W15-3 W15(3%-7d) 1,1 60 3 1,05 75 17 8
W15-4 W15(3%-15d) 0,4 47 2 0,61 47 13 39
W15-5 W15(3%-21d) 0,7 47 3 0,84 35 12 53
W15-6 W15(3%-30d) 0,1 80 1 0,6 33 10 57
W15-7 W15(7%-7d) 1,2 47 4 0,2 47 4 49
W15-8 W15(7%-15d) 1,0 37 4 0,54 44 14 42
W16-1 W16(1%-7d) 2,2 59 5 0,49 45 10 45
W16-3 W16(3%-7d) 1,6 58 4 0,65 66 9 25
W16-4 W16(3%-15d) 0,4 46 2 0,81 52 10 38
W16-5 W16(3%-21d) 0,4 55 2 0,76 36 12 52
W16-6 W16(3%-30d) 1,9 51 5 0,85 39 8 53
W16-7 W16(7%-7d) 2,0 55 5 0,23 33 9 58
W16-8 W16(7%-15d) 0,6 45 3 0,47 32 7 61
F17-2 F17(1%-15d) 0,7 51 3 0,14 23 5 72
F17-3 F17(3%-7d) 2,2 58 5 0,22 49 9 42
F17-4 F17(3%-15d) 1,2 53 4 0,2 60 10 30
F17-5 F17(3%-21d) 0,4 64 2 0,4 55 13 32
F17-6 F17(3%-30d) 0,5 79 2 0,3 52 10 38
F17-7 F17(7%-7d) 0,8 54 3 0,51 34 4 62
F17-8 F17(7%-15d) 0,6 39 3 0,3 31 14 55
F20-1 F20(1%-7d) 0,3 40 2 0,19 19 9 72
F20-2 F20(1%-15d) 0,2 32 2 0,2 14 5 81
F20-3 F20(3%-7d) 0,3 43 2 0,7 34 10 55
F20-4 F20(3%-15d) 0,7 53 3 0,81 15 13 72
F20-5 F20(3%-21d) 0,3 30 3 0,42 15 9 76
F20-6 F20(3%-30d) 0,3 54 2 0,27 16 14 70
F20-7 F20(7%-7d) 0,2 32 2 1,12 13 4 83
F20-8 F20(7%-15d) - 0 0 0,27 13 12 75
S22-1 S22(1%-7d) 0,1 100 1 0,21 10 2 89
S22-2 S22(1%-15d) 0,1 87 1 0,22 9 5 86
S22-3 S22(3%-7d) 0,6 75 2 2,28 32 7 62
S22-4 S22(3%-15d) 0,1 55 1 0,74 21 5 74
S22-5 S22(3%-21d) 0,1 50 1 0,21 25 4 71
S22-6 S22(3%-30d) 0,3 54 2 0,22 20 7 73
S22-7 S22(7%-7d) 0,4 65 2 0,5 16 26 58
S22-8 S22(7%-15d) 0,1 49 1 0,36 12 9 79
S27-1 S27(1%-7d) 0,2 27 2 0,34 9 9 82

185
Tabla III. (Continuación)
S27-2 S27(1%-15d) 0,3 61 2 0,16 13 5 82
S27-3 S27(3%-7d) 0,8 36 4 0,24 43 10 47
S27-4 S27(3%-15d) 0,3 49 2 0,17 32 12 56
S27-5 S27(3%-21d) 0,2 29 2 0,28 28 7 65
S27-6 S27(3%-30d) 1,1 52 4 0,36 26 14 60
S27-7 S27(7%-7d) 0,2 30 2 0,64 16 12 71
S27-8 S27(7%-15d) 0,9 35 4 0,62 15 8 78
F2-1 F2(1%-7d) 0,9 49 3 0,405 65 12 23
F2-2 F2(1%-15d) 0,4 55 2 0,23 51 6 43
F2-3 F2(3%-7d) 1,8 49 5 0,32 76 15 9
F2-4 F2(3%-15d) 1,5 35 4 0,26 46 10 45
F2-5 F2(3%-21d) 1,2 47 4 0,63 55 7 38
F2-6 F2(3%-30d) 1,0 34 4 1,04 55 7 38
F2-7 F2(7%-7d) 1,5 41 5 0,35 80 7 13
F2-8 F2(7%-15d) 0,8 35 4 0,2 56 8 37
W3-1 W3(1%-7d) 2,7 50 6 0,24 44 23 34
W3-2 W3(1%-15d) 2,8 49 6 0,72 44 24 32
W3-3 W3(3%-7d) 2,1 41 5 1,15 67 10 24
W3-4 W3(3%-15d) 2,2 55 5 0,82 41 12 47
W3-5 W3(3%-21d) 2,9 48 6 1,13 70 10 20
W3-6 W3(3%-30d) 1,3 41 4 1,49 66 14 20
W3-7 W3(7%-7d) 3,2 54 6 0,91 42 30 27
W3-8 W3(7%-15d) 2,3 41 6 0,9 43 15 43
W4-1 W4(1%-7d) 2,2 54 5 0,48 44 9 47
W4-2 W4(1%-15d) 2,7 52 6 0,6 27 8 65
W4-3 W4(3%-7d) 4,0 71 6 0,65 62 12 26
W4-4 W4(3%-15d) 1,9 45 5 0,74 34 13 53
W4-5 W4(3%-21d) 0,3 39 2 0,84 59 8 33
W4-6 W4(3%-30d) 1,3 51 3 3,08 55 14 31
W4-7 W4(7%-7d) 1,2 45 4 0,23 36 17 46
W4-8 W4(7%-15d) 3,1 55 6 0,74 30 24 46
W10-1 W10(1%-7d) 2,4 57 5 0,61 67 4 29
W10-2 W10(1%-15d) 3,9 50 6 4,93 37 8 55
W10-3 W10(3%-7d) 3,9 56 7 0,2 77 4 19
W10-4 W10(3%-15d) 2,4 40 6 1,68 33 5 62
W10-5 W10(3%-21d) 0,6 68 2 0,8 66 5 29
W10-6 W10(3%-30d) 0,4 78 1 3 63 14 24
W10-7 W10(7%-7d) 2,2 57 5 0,86 26 2 71
W10-8 W10(7%-15d) 2,1 52 5 0,78 29 25 46
W12-2 W12(1%-15d) 2,1 56 5 0,69 39 6 56
W12-3 W12(3%-7d) 2,8 39 7 0,59 32 13 55
W12-4 W12(3%-15d) 0,9 48 3 0,88 33 12 55
W12-5 W12(3%-21d) 1,9 67 4 2,44 24 9 67
W12-6 W12(3%-30d) 1,0 62 3 0,82 64 8 28
W12-7 W12(7%-7d) 3,5 63 6 0,89 32 34 33
W12-8 W12(7%-15d) 1,1 62 3 1,19 34 23 44
W5-1 W5(1%-7d) 0,2 78 1 0,36 53 12 34
W5-2 W5(1%-15d) 0,7 52 3 0,6 21 7 72
W5-3 W5(3%-7d) 0,4 27 3 0,3 77 19 3
W5-4 W5(3%-15d) 0,6 46 3 0,31 22 2 76

186
Tabla III. (Continuación)
W5-5 W5(3%-21d) 0,03 25 1 1,43 25 5 70
W5-6 W5(3%-30d) - 0 0 1,32 22 4 74
W5-7 W5(7%-7d) 0,2 23 2 0,58 58 12 30
W5-8 W5(7%-15d) - 0 0 0,84 27 7 67
W7-3 W7(3%-7d) 2,3 60 5 0,42 66 12 22
W7-4 W7(3%-15d) 1,3 49 4 0,75 33 4 64
W7-5 W7(3%-21d) 1,9 70 4 1,78 39 5 56
W7-6 W7(3%-30d) 1,0 45 4 0,28 39 6 55
W8-1 W8(1%-7d) 0,7 56 3 0,19 43 9 48
W8-2 W8(1%-15d) 1,3 53 4 0,29 52 6 42
W8-3 W8(3%-7d) 1,8 71 4 0,36 73 7 20
W8-4 W8(3%-15d) 1,4 54 4 0,35 69 13 19
W8-5 W8(3%-21d) 0,1 45 1 1,27 55 9 36
W8-6 W8(3%-30d) 0,5 71 2 0,76 35 12 53
W8-7 W8(7%-7d) 1,0 41 4 0,47 53 7 40
W8-8 W8(7%-15d) 0,9 40 4 0,31 52 13 34
W18-1 W18(1%-7d) - 0 0 0,13 18 9 73
W18-3 W18(3%-7d) 0,3 38 2 1,12 30 9 61
W18-4 W18(3%-15d) 0,05 25 1 0,7 17 8 74
W18-5 W18(3%-21d) - 0 0 4,24 14 8 78
W18-6 W18(3%-30d) 0,1 100 1 0,25 13 5 81
W18-7 W18(7%-7d) - 0 0 0,85 12 4 84
W18-8 W18(7%-15d) - 0 0 0,22 12 12 77
S21-1 S21(1%-7d) 0,1 33 1 1,48 11 11 78
S21-3 S21(3%-7d) 1,0 51 3 2,71 22 13 65
S21-4 S21(3%-15d) 1,7 67 4 0,88 31 13 56
S21-5 S21(3%-21d) 1,5 65 4 1,03 16 8 76
S21-6 S21(3%-30d) 0,4 34 3 0,39 20 9 72
S21-7 S21(7%-7d) 0,05 30 1 0,48 12 9 79
S21-8 S21(7%-15d) 0,1 43 1 0,32 19 9 72
S24-1 S24(1%-7d) 0,3 37 2 0,3 18 14 68
S24-2 S24(1%-15d) 0,4 55 2 0,45 20 8 72
S24-3 S24(3%-7d) 1,0 48 3 2,13 32 27 41
S24-4 S24(3%-15d) 0,2 100 1 0,51 33 8 59
S24-5 S24(3%-21d) 0,1 33 2 0,1 15 3 82
S24-6 S24(3%-30d) 0,03 39 1 0,22 13 2 85
S24-7 S24(7%-7d) 0,1 55 1 0,5 13 7 80
S24-8 S24(7%-15d) 0,1 50 1 0,22 15 7 78
a , días b; Carbohidratos; c, Proteínas

187
188
 A
ANNE
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Arrttííccuullooss PPuubblliiccaaddooss

189
 International Biodeterioration & Biodegradation 64 (2010) 511e518

Contents lists available at ScienceDirect

International Biodeterioration & Biodegradation

journal homepage: www.elsevier.com/locate/ibiod

Biodegradative potential and characterization of bioemulsifiers of marine

bacteria isolated from samples of seawater, sediment and fuel extracted
at 4000 m of depth (Prestige wreck)
I. Uad, G.A. Silva-Castro, C. Pozo, J. González-López, C. Calvo*
Environmental Microbiology Group, Department of Microbiology, Institute of Water Research, University of Granada, Ramón y Cajal no 4,
Edificio Fray Luis de Granada, 18071 Granada, Spain

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history: Seawater, sediments and fuel samples extracted from a small area of the Prestige wreck (4000 m deep)
Received 3 May 2010 were studied to check the microbial activity of the area, the occurrence of indigenous hydrocarbon-
Received in revised form degrading bacteria and the presence of bacteria able to produce bioemulsifiers. Twenty-one strains with
26 May 2010
the capacity to degrade hydrocarbons and/or produce useful bioemulsifiers were selected. Phylogenetic
Accepted 1 June 2010
Available online 8 July 2010
affiliation of these isolates placed them in the genus Bacillus (8 strains), Pseudomonas (3 strains), Hal-
omonas (4 strains), Pseudoalteromonas (1 strain), Brevibacterium (2 strains), and Marinobacter (1 strain)
and 2 strains were identified as marine bacterium. Hydrocarbon degradation was established by
Keywords:
Bioemulsifiers
determining the amount of alkanes and polycyclic aromatic hydrocarbons by GC/MS analyses. In this
Hydrocarbon-degrading marine bacteria study, Pseudomonas, Bacillus and Brevibacterium strains were the most efficient hydrocarbon-degrading
Biodegradation marine bacteria. In contrast, Halomonas strains produced the highest amount of efficient biopolymers
Bacillus with emulsifying activity. The yield, chemical composition and functional properties of these bio-
Brevibacterium emulsifiers were affected by the incubation time required for production. In addition, supplementation of
Pseudomonas the hydrocarbon culture medium with bioemulsifiers (S22-BE, S24-BE and AD2-BE) clearly stimulated
Halomonas the growth of strains S25, S28 and S29 and enhanced the ability of these strains to biodegrade alkanes,
alkenes and aromatic compounds.
Ó 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1. Introduction indigenous bacteria from contaminated ecosystems also produce

biosurfactants. Biosurfactants produced by hydrocarbon-degrading
Marine environments are frequently contaminated with bacteria can emulsify hydrocarbonewater mixtures, which enables
hydrocarbons as a result of industrial activity (Oren, 2000; them to grow on the oil droplets. Emulsification properties have
Margesin and Schinner, 2001). Contamination of these habitats also been demonstrated to enhance hydrocarbon degradation in
constitutes a serious environmental problem mainly due to the the environment, making such bacteria potential tools for oil spill
high toxicity exhibited by some petroleum compounds. Thus, pollution-control (Krepsky et al., 2007).
polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), which are prevalent in In 2002, the Prestige accident polluted thousands of kilometres
many fuel mixtures, exhibit toxic, mutagenic and/or carcinogenic of coastline and more than one thousand beaches on the Spanish
properties. They are listed by the US Environmental Protection and French coast. This accident represents one of the largest
Agency as priority pollutants (Sudip et al., 2002; Zeinali et al., environmental catastrophes to have occurred in European waters.
2008). The breakage of the Prestige tanker and its sinking at a depth of
Remediation processes include treating petroleum pollutants 3850 m led to the spillage of large quantities of fuel oil for several
with hydrocarbon-degrading microorganisms that are generally months afterwards. Repsol YPF was appointed by the Spanish
ubiquitous in nature and are able to use different types of hydro- Government to recover the fuel oil remaining in the wreck, via the
carbons as a carbon and energy source (Liu et al., 2009). Some “Prestige wreck fuel recovery project” (Del Corral et al., 2005). The
final phase of this project was bioremediation for the remaining
Prestige fuel oil, during which Repsol YPF planned to enhance the
* Corresponding author. Tel.: þ34 958 248 021/243 093; fax: þ34 958 243 094. natural process of bioremediation in order to neutralize the oil
E-mail address: ccalvo@ugr.es (C. Calvo). remaining after extraction, which was coating the internal walls of

0964-8305/$ e see front matter Ó 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/j.ibiod.2010.06.005
512 I. Uad et al. / International Biodeterioration & Biodegradation 64 (2010) 511e518

the tank (Hernán et al., 2005). Experiments to evaluate the viability 2.3. Growth on polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)
of bioremediation of the remaining Prestige fuel were conducted at solid media
the Institute of Water Research of the University of Granada by our
research group (Environmental Microbiology). These studies were To evaluate the growth of isolated strains on naphthalene,
developed in three phases: the first one included characterization phenanthrene, anthracene and pyrene, aliquots of each bacterial
of the native microbiota to establish the presence of active bacteria culture were spread on solid minimal medium amended with 1%
at the site; in the second stage, bioremediation tests were carried (w/v) of PAHs. The composition per litre of M9 medium was as
out in controlled conditions to assess the ability of indigenous follows: 10 M9 solution (100 ml), A9 solution (“Goodies”) (2.5 ml),
bacteria to biodegrade the Prestige fuel; and in the third phase MgSO4 1 M (1 ml) and ferric ammonium citrate 6% (w/v) (1 ml)
different stimulation systems were studied to select the most (April et al., 1991).
adequate nutrient conditions to accelerate the biodegradation The 10 M9 solution was composed of g L1: 70
process. In the current study we have characterized 21 bacterial Na2HPO4  7H2O, 30 KH2PO4, 10 NH4Cl and 5 NaCl. The A9
strains isolated during the first stage of the above-mentioned (“Goodies”) solution was composed of (mg L1): 300 HBO3, 50
research, and we describe their hydrocarbon-degrading capabilities ZnCl2, 30 MnCl2  4H2O, 200 CoCl2, 10 CuCl2  2H2O, 20
as well as the characteristics of bioemulsifiers synthesized by some NiCl2  6H2O, 30 NaMoO4  2H2O. Inoculated agar plates were
of these bacteria. incubated at 28  C for 48 h.

2. Materials and methods 2.4. Production and characterization of bioemulsifiers

2.1. Sampling sites and bacterial strains EPS biopolymer production with bioemulsifier activity from
isolated bacterial strains was tested according to the method
Seawater and sediment samples were taken by Repsol YPF from previously reported by Calvo et al. (2002). To collect the extracel-
the surroundings of the Prestige wreck at 4000 m of depth along lular polysaccharides (EPS), isolated strains were grown in MY
with samples of fuel from a fuel container from the wreck. These broth medium (Moraine and Rogovin, 1966) with 3% salt, for 7, 15,
samples were sent to our laboratory to be preserved and analysed. 21 and 30 days under agitation (100 rpm) at 28  C. Cultures were
The 21 bacterial strains included in this study were selected centrifuged at 9000 rpm in a Beckman Avanti-J25 refrigerated
from 133 strains isolated from the above-mentioned sediment, centrifuge at 4  C for 45 min. Supernatants were precipitated with
seawater and fuel samples, due to their capacity to grow on the cold ethanol. The biopolymer precipitated from the supernatant
surface of Prestige fuel agar plates. was dissolved in distilled water, dialyzed against distilled water,
Strains were maintained on MY solid medium slopes (Moraine lyophilized and weighed. The protein and carbohydrate content of
and Rogovin, 1966) supplemented with 3% (w/v) NaCl at 4  C and the biopolymer obtained was determined by colorimetric analyses
routinely streaked on agar plates from tubes every two months to following the methodology proposed by Bradford (1976) and
control purity and viability. Selected bacteria were also preserved by Dubois et al. (1956), respectively.
freezing cell suspensions at 80  C in MY broth to which 80% (v/v)
glycerol was added. 2.5. Emulsification measurement

2.2. Identification of strains The emulsification activity of the biopolymer was detected by
a modified version of the procedure described by Cooper and
PCR amplification, sequencing and phylogenetic analysis of 16S Goldenberg (1987). Test tubes (105  15 mm) were amended
rDNA from active bacterial isolates were carried out as previously with 3 ml of exopolymer diluted in distilled water (0.5%, w/v) and
described by Weisburg et al. (1991). The full length of each 3 ml of a hydrophobic substrate (n-octane, xylene, toluene, light
amplification product was sequenced using universal primers fD1, mineral oil, heavy mineral oil, diesel or Prestige fuel oil). Then, the
rD1, fD2 and rD2. A fresh cultured colony of each strain grown on MY tubes were shaken vigorously to ensure homogeneity and left to
agar medium supplemented with 3% salt was lysed by the addition stand for 24 h. Emulsification activity was defined as the height of
of 20 ml of a mixture of NaOHe2N and SDS-5% (w/v) and then the emulsion layer divided by the total height and expressed as
boiling for 15 min at 95  C. The lysates were adjusted to 200 ml with a percentage.
sterile bidistilled water and centrifuged at 13,000 rpm for 5 min in
a tabletop centrifuge. Cleared lysates (4 ml) were used as a template 2.6. Growth in Prestige fuel oil liquid media
for amplification. The PCR reactions were set up by adding the
lysate to 10 PCR buffer, 1.5 mM MgCl2, 200 mM dNTPs (Roche Growth in oil media was determined in 250 ml Erlenmeyer
Molecular Biochemicals, Germany), 20 pmol of each primer and 1 U flasks containing marine synthetic medium (marine broth DifcoÒ)
of Taq polymerase (Genecraft, Germany). The final volume of the amended with 0.1% (v/v) Prestige fuel oil. These flasks were inoc-
reaction tubes was adjusted to 50 ml (Vinuesa et al., 1998). Reactions ulated with 1 ml of an overnight culture and incubated at 28  C
were run in a BIOER XP cycler. The PCR products were purified with with gentle agitation (100 rpm) for 28 days. Viable cells were
a Quick cleaner extraction kit (MBL) according to the manufac- counted using the dilution-plate technique on Marine Agar
turer’s instructions. Each sequence was then used as a query in medium (Difco). The inoculated agar plates (three replicates) were
a BLASTn search (Pearson and Lipman, 1988) and further aligned to incubated at 28  C for 48 h. The Prestige fuel oil used was obtained
the most similar orthologous sequences retrieved from the data- from the Prestige wreck and was provided by Repsol YPF.
base using the program Clustal X (Thompson et al., 1994). Align- In addition, to evaluate the effect of different bioemulsifiers (BE)
ments were checked manually, corrected and then analysed using on bacterial growth, Prestige fuel oil culture media were supple-
the neighbour-joining method (Saitou and Nei, 1987) according to mented with 0.05% of bioemulsifier S22-BE, S24-BE and AD2-BE.
the model of Jukes-Cantor distances. A phylogenetic tree was Bioemulsifiers S22-BE and S24-BE were isolated during this
constructed using the MEGA 3.1 (Molecular Evolutionary Genetics investigation (Table 3), and AD2-BE was previously isolated in our
Analysis) software (Kumar et al., 2004). laboratory (Calvo et al., 2008).
 I. Uad et al. / International Biodeterioration & Biodegradation 64 (2010) 511e518 513

2.7. TPH, n-alkanes and PAH determinations layer and cultured on Prestige fuel agar plates with the objective of
recovering indigenous microorganisms able to degrade Prestige fuel.
Total petroleum hydrocarbons were extracted from bacterial In this step, 133 bacterial strains were selected according to their
cultures with a mixture of hexane:acetone 1:1 (v/v) and deter- ability to grow on the surface of Prestige fuel agar plates and their
mined using a modified version of the gravimetric analysis proce- ability to produce mucous colonies. In a second step, these micro-
dure described by Aguilera-Vazquez et al. (2001). Analysis of organisms were grown in Prestige fuel liquid media and analysed
n-alkanes and polycyclic aromatic hydrocarbons was carried out for bioemulsifier production. The results obtained led us to select
using a HewlettePackard 6890 GC system equipped with an HP-5- 21 bacterial strains for further identification and characterization.
MS-capillary column (30  0.32 mm I.D.). Helium (1.6 ml/min) was Three of these were obtained from fuel samples, 11 from seawater
utilized as the carrier gas. N-alkanes and PAH were detected using samples and 7 from sediment samples.
a mass detector 5872 (HewlettePackard) and the Wiley 275 library. With regards to the phylogenetic results, the strategy used to
sequence the 16S rDNA gene of each strain produced a continuous
stretch of nucleotides representing >95% of the primary 16S rDNA
3. Results and discussion sequence. The similarity values were obtained after pair-wise
alignment of 16S rDNA sequences of studied strains and EMBL
Microbial biodegradation is known to be an efficient process in database sequences, and the sequences giving the highest scores
the decontamination of oil-polluted environments. Common steps were retrieved to construct the phylogenetic tree.
in establishing in situ bioremediation processes include the search Phylogenetic identification showed affiliation of the selected
for hydrocarbon-degrading indigenous microorganisms and the strains obtained from deep seawater, fuel and sediment samples to
optimization of conditions promoting biodegradation in situ by three bacterial phylogenetic branches: the g-subdivisions of Pro-
indigenous microbiota. teobacteria, Firmicutes and the gram-positive branch (high G þ C
In order to determine the viability of biodegradation of the content Actinobacteria) (Fig. 1).
remaining fuel adhering to the tank walls and the top of the Prestige The majority of the isolated strains (8 strains) belonged to the
wreck and identify the best process for accelerating the natural genus Bacillus; W1 was identified as Bacillus thuringiensis, with 98%
biodegradation of fuel, samples of fuel from the Prestige tank sequence identity. The other 7 strains (W15, W16, F17, F20, S22, S25
container, and samples of seawater and sediments extracted by and S27) were identified as Bacillus pumilus and the sequence
Repsol YPF from the area were sent to our laboratory to be conserved homology ranged from 96 to 100%. Strains F2 and S28 were affili-
and analysed. The study of these samples demonstrated that the area ated to Brevibacterium casei and Brevibacterium sanguinis, respec-
around the wreck had an active and diverse microbiota (data not tively, with 99% sequence homology. Strain W3 was identified as
shown). More than 300 colonies were picked from the agar surface Halomonas alkantarctica and W4 was identified as Halomonas

Brevibacterium sanguinis (AJ564859)

F2
S28 Actinobacteria
Brevibacterium casei (EU086802)
W1
Bacillus thuringiensis (CP000485)
S25
S27
S22
W15 Firmicutes
W17
F20
Bacillus pumilus (EU660365)
Bacillus pumilus (EU874254)
W16
W5
W7
Marine bacterium (EU7770407)
Pseudoalteromonas elyak ovii (DQ665792)
W18
W8
Marinobacter spp. (EF685677)
Halomonas alk antarctica (AJ564880)
Halomonas spp. (EU864257) Gamma-proteobacteria
W3
Halomonas variabilis (AJ294347)
W12
W10
W4
S29
S21
Pseudomonas brennerii (AF268968)
S24
Pseudomonas grimontii (AF268029)

0.1

Fig. 1. Phylogenetic relationship based on 16S rDNA sequences of 21 selected marine strains.
514 I. Uad et al. / International Biodeterioration & Biodegradation 64 (2010) 511e518

Table 1 Table 3
Identity and 16S rDNA gene sequence affiliation of 21 bacterial strains to their closest Yield of biopolymers synthesized by isolated strains after different periods of
phylogenetic neighbours. production at 3% salt concentration.

Strain Next relative by Gen Bank alignment (%) Identity Yield (g l1)a
number (AN, Organism)a
3% (w/v) salinity
W1 CP000485 Bacillus thuringiensis 98
F2 EU086802 Brevibacterium casei 99 Strain 7 Days 15 Days 21 Days 30 Days
W3 AJ564880 Halomonas alkantarctica 98 W1 0.5  0.12 0.8  0.13 1.08  0.23 1.69  0.15
W4 AJ294347 Halomonas variabilis 98 F2 0.32  0.02 0.26  0.01 0.63  0.02 1.04  0.01
W5 AF359545 Marine bacterium 99 W3 1.15  0.15 0.82  0.14 1.13  0.24 1.49  0.33
W7 AF359545 Marine bacterium 99 W4 0.65  0.13 0.74  0.15 0.84  0.13 3.08  0.15
W8 AJ294359 Marinobacter spp. 98 W5 0.3  0.12 0.31  0.25 1.43  0.25 1.32  0.35
W10 AJ294347 Halomonas variabilis 97 W7 0.42  0.13 0.75  0.14 1.78  0.18 0.28  0.14
W12 EU864257 Halomonas spp. 97 W8 0.36  0.1 0.35  0.1 1.27  0.16 0.76  0.16
W15 AY741720 Bacillus pumilus 97 W10 0.2  0.03 1.68  0.09 0.8  0.1 3  0.26
W16 EU869282 Bacillus pumilus 99 W12 0.59  0.19 0.88  0.16 2.44  0.23 0.82  0.1
F17 EU874254 Bacillus pumilus 98 W15 1.05  0.12 0.61  0.1 0.84  0.14 0.6  0.14
W18 DQ665792 Pseudoalteromonas elyakovii 99 W16 0.65  0.14 0.81  0.26 0.76  0.31 0.85  0.16
F20 EU660365 Bacillus pumilus 96 F17 0.22  0.1 0.2  0.14 0.4  0.1 0.3  0.12
S21 AF268968 Pseudomonas brennerii 98 W18 0.1  0.11 0.72  0.01 4.24  0.12 0.25  0.21
S22 EU221329 Bacillus pumilus 99 F20 0.70  0.16 0.81  0.14 0.42  0.11 0.27  0.11
S24 AF268029 Pseudomonas grimontii 100 S21 2.71  0.3 0.88  0.16 1.03  0.15 0.39  0.11
S25 EU221329 Bacillus pumilus 100 S22 2.28  0.98 0.74  0.23 0.21  0.1 0.22  0.23
S27 EU221329 Bacillus pumilus. 99 S24 2.13  0.22 0.51  0.14 0.1  0.2 0.22  0.25
S28 AJ564859 Brevibacterium sanguinis 99 S27 0.24  0.23 0.17  0.12 0.28  0.34 0.36  0.13
S29 AF268968 Pseudomonas brennerii 99 a
Grams of EPS per litre of culture medium. Each value is the mean of three
a
AN:Accession number. determinations.

these genera have been demonstrated to be efficient hydrocarbon

variabilis, the sequence identity of both being 98%. W10 was degraders (Stapleton et al., 2000; Zhuang et al., 2002; Pavitran
identified as H. variabilis and W12 was identified as Halomonas spp. et al., 2004).
with 97% sequence identity. W8 was identified as Marinobacter spp. In this investigation, we also studied the capacity of selected
with 98% sequence identity. S21 and S29 were identified as Pseu- strains to grow in the presence of various PAHs (naphthalene,
domonas brennerii with 98% and 99% sequence identity, respec- phenanthrene, anthracene and pyrene) as the sole carbon and
tively. W18 was identified as Pseudoalteromonas elyakovii with 99% energy source; the results are depicted in Table 2. Eighteen strains
sequence identity. Finally, S24 was affiliated with Pseudomonas grew well on naphthalene media, 14 of them on phenanthrene and
grimontii with 100% sequence identity. Only W5 and W7 were pyrene and 12 on anthracene media. It was noted that 18 of the 21
affiliated to marine bacteria with 99% sequence identity. The studied strains were able to use more than three PAHs. Prestige oil
different bacterial genera identified in this study are shown in is classified as fuel oil No 6, containing 50% aromatic hydrocarbons
Table 1. The direct isolation method is often used to isolate the (PAH), 22% saturated hydrocarbons and 28% resins and asphalth-
dominant members in a microbial community. Bacillus, Pseudo- enes (Laffon et al., 2006). Some of the PAH contained in Prestige oil
monas and Brevibacterium are frequently isolated from hydro- (naphthalene, anthracene and pyrene) have been catalogued by the
carbon-contaminated environments and many strains belonging to IARC as possible or probable human carcinogens and are part of the

Table 2
Characterization of bacterial strains isolated from seawater, sediments and fuel samples.

Strains Source Bioemulsifiers Growth on PAH solid media

Naphthalene Phenanthrene Anthracene Pyrene

Bacillus thuringiensis W1 Seawater þ þ þ þ þ
Brevibacterium casei F2 Prestige fuel þ þ þ þ þ
Halomonas alkantarctica W3 Seawater þ þ e þ þ
Halomonas variabilis W4 Seawater þ þ e þ þ
Marine bacterium W5 Seawater þ þ þ þ þ
Marine bacterium W7 Seawater þ þ þ þ þ
Marinobacter spp. W8 Seawater þ þ þ þ þ
Halomonas variabilis W10 Seawater þ þ þ e þ
Halomonas spp. W12 Seawater þ þ þ þ þ
Bacillus pumilus W15 Seawater þ þ þ þ þ
Bacillus pumilus W16 Seawater þ þ þ þ þ
Bacillus pumilus F17 Prestige fuel þ þ þ þ þ
Pseudoalteromonas elyakovii W18 Seawater þ þ þ e e
Bacillus pumilus F20 Prestige fuel þ þ þ þ þ
Pseudomonas brennerii S21 Sediment BC1 þ þ e e e
Bacillus pumilus S22 Sediment BC1 þ þ þ þ e
Pseudomonas grimontii S24 Sediment BC4 þ þ e e e
Bacillus pumilus S25 Sediment BC4 e þ þ þ þ
Bacillus pumilus S27 Sediment 200146 þ þ þ e þ
Brevibacterium sanguinis S28 Sediment 200146 e þ þ þ þ
Pseudomonas brennerii S29 Sediment BC1 e þ þ þ þ
 I. Uad et al. / International Biodeterioration & Biodegradation 64 (2010) 511e518 515

100
90
80
70
60

7
50
40
30
20
10
0

100
90
80
70
% of Carbohydrates and Proteins

60

15
50
40
30

Time (days)
20
10
0

100
90
80
70
60

21
50
40
30
20
10
0

100
90
80
70
60

30
50
40
30
20
10
0
W1 W15 W16 F17 F20 S22 S27 W3 W4 W10 W12 S21 S24 W18 W5 W7 W8 F2

Strains
Carbohydrates Proteins

Fig. 2. Carbohydrate and protein composition of biopolymers synthesized by isolated strains at different incubation times in MY medium at 3% (w/v) salt concentration. Error bars
represent one standard deviation.

Table 4
Stability of emulsifying activity of bioemulsifiers (0.5% w/v) with various hydrophobic substrates.

BE Hydrophobic substrates

Xylene Toluene Octane Heavy oil Light oil Prestige fuel Diesel
W1-BE 43.3a  2.89* 65.8  2.3 66.6  2.8 0 0 71.6  1.1 16.5  1.25
F2-BE 56  1.25 34  2.25 0 0 0 60  1.25 0
W3-BE 56.3  1.25 56.9  0.6 8.1  0.6 45  0.2 25  0.28 33.7  1.2 66.6  0.34
W4-BE 73.7  1.25 73.7  1.2 76.2  1.2 73.7  1.2 73.7  1.2 53.7  1.2 73.7  1.25
W5-BE 0 0 0 0 0 34  1.75 0
W7-BE 76  1.25 74  1.75 73  2.25 0 0 34  1.25 44  0.74
W8-BE 76  1.25 74  1.75 6  0.55 0 0 59  2.75 11  1.25
W10-BE 51.2  1.25 61.2  1.2 61.2  1.2 61.2  1.2 63.7  1.2 50  2.5 51.2  1.25
W12-BE 34  1.5 55  2.5 43.4  0.9 42.2  2.2 23.7  0.9 47.5  2.5 25.1  0.6
W15-BE 0 61  1.25 42  2.25 0 4  0.99 76  1.25 13  1.12
W16-BE 45  1.25 65  1.25 55  1.75 0 0 67  2.25 17  0.87
F17-BE 66  1.75 74  1.25 11  0 59  2.25 49  1.25 26  1.75
W18-BE 0 50  1.2 25  0.7 0 0 0 0
F20-BE 50  0.75 50  0.7 50  0.7 0 0 0 0
S21-BE 0 25  0.2 0 0 0 95  1.2 50  0.7
S22-BE 50  0.75 50  0.7 0 0 0 100  0.2 25  0.7
S24-BE 50  0.75 25  0.2 25  0.25 0 0 73.3  0.2 25  0.7
S27-BE 25  0.25 50  1.2 0 0 0 25  0.25 0

*Values are mean  standard error of three replicates. BE: Bioemulsifier.

a
Results are expressed as percentages of total height occupied by the emulsion; values are means of three determinations.
516 I. Uad et al. / International Biodeterioration & Biodegradation 64 (2010) 511e518

16 PAH designated by the United States Environmental Protection demonstrated the ability of species of Halomonas to produce exo-
Agency (USEPA) as primary contaminants (IARC, 1989; USEPA, polymers with emulsifying activity (Calvo et al., 1998, 2002;
2000). Our study showed that all isolated strains grew on naph- Martinez-Checa et al., 2002).
thalene, 81% of them on phenanthrene, 76% on anthracene and 81% Prestige fuel was one of the more easily emulsified substrates,
on pyrene. In addition, 62% of strains were able to grow on the four with remarkably stable emulsions formed by the BE synthesized by
PAH tested and 24% were capable of using three of them. P. brennerii S21, B. pumilus S22 and P. grimontii S24. For this reason
It is well known that microorganisms growing on hydrocarbons S21-BE, S22-BE and S24-BE were added to Prestige fuel liquid
frequently produce biopolymers with emulsifying activity. This medium to determine if these polymers would enhance the
property is considered to be a biological strategy to facilitate the biodegradation of Prestige oil hydrocarbons.
availability of hydrophobic compounds (Toledo et al., 2008). These To evaluate the bioremediation of Prestige fuel by indigenous
can stimulate the growth of hydrocarbon-degrading bacteria and bacteria, the isolated strains were grown in liquid media amended
improve their ability to utilize these substances. These biopolymers with Prestige fuel as the sole carbon and energy source. The results
can either be low molecular weight polymers such as glycolipids showed that the majority of strains were able to grow and degrade
(Rosenberg and Ron, 1999) or high molecular weight polymers such fuel hydrocarbons. Moreover, it was observed that the biodegrada-
as alasan (Navon-Venezia et al., 1995). We found that 18 isolates tion capacity was generally enhanced by the addition of bio-
were able to produce an exopolymer with emulsifying activity, with emulsifiers. Fig. 3 shows the behaviour of B. pumilus S25, B. sanguinis
3% (w/v) salt being the most suitable concentration for bio- S28 and P. brennerii S29, the most efficient degrading bacteria.
emulsifier (BE) production.
It is well known that the culture conditions of biopolymer
production generally modify both the yield and chemical compo- a 9

sition of the polymer obtained (Sutherland, 2001; Toledo et al.,

8
2008). In this study, the chemical composition in terms of carbo-

LogCFU/m l
hydrates and proteins and the amount of biopolymer synthesized
7
varied not only with the incubation time for production (Fig. 2) but
also with the selected strain (Table 3). Thus, the highest amount of
BE produced by strain W4 after 30 days of incubation was 3.08 g/l, 6

while strains S21, S22 and S24 showed the highest production rate
after 7 days of culture. Also, as mentioned earlier, the BE recovered 5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
after shorter incubation times had a higher percentage of carbo-
hydrates than proteins; however some strains of Halomonas (W3, Incubation time (days)

W4 and W10) produced a high amount of biopolymer with more S25 strain S25 strain + AD2 BE
than 70% of carbohydrates and only 10% of proteins at 30 days. S25 strain + S22 BE S25 strain + S24 BE
The growth of microorganisms on oil hydrocarbons has often
been related to their capacity to produce polymers with surfactant
or emulsifying activity. However, the synthesis of exopoly-
b 9

saccharides (EPS) with surfactant and emulsifying activity is not 8

LogCFU/m

always a consequence of microbial growth in hydrocarbons; for

example Halomonas eurihalina produces the maximal EPS yield in 7
media with glucose as the carbon and energy source and these
biopolymers efficiently emulsify oil hydrocarbons (Calvo et al., 6
1998, 2002, 2009; Martinez-Checa et al., 2002). Our results
showed that 85.7% (18 out of 21) of isolates produced exopolymers 5
with emulsifying activity (BE), all were synthesized with glucose as 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
the carbon source, and they were mainly composed of carbohy- Incubation time (days)
drates and proteins.
S28 strain S28 strain + AD2 BE
The BE-producing strains belonged to the genus Bacillus, Hal-
S28 strain+ S22 BE S28 strain + S24 BE
omonas, Pseudoalteromonas, Marinobacter and Pseudomonas.
Several authors have reported that strains isolated from marine
environments belong to these genera and have the capacity to c 9

produce efficient bioemulsifiers (Calvo et al., 2002; Zhuang et al.,

8
2002; Maneerat and Phetrong, 2007; Das et al., 2008).
logCFU/m l

Our results have demonstrated that the BE produced by strains

W1 (B. thuringiensis), W3 (H. alkantarctica), W4 and W10 (H. varia- 7

bilis), W5 and W7 (marine bacterium), W8 (Marinobacter), W12

(Halomonas sp.), W15, W16 and F17 (B. pumilus) contain substantial 6

amounts of carbohydrates and proteins (Fig. 2). Toledo et al. (2008)

reported that bioemulsifiers of high molecular weight, which are 5
produced by a large number of bacteria, are highly efficient as 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

emulsifiers, exhibiting considerable substrate specificity. Toluene, Incubation time (days)

xylene, n-octane, mineral oil (heavy and light) diesel and Prestige fuel S29 strain S29 strain + AD2 BE
oil were used to evaluate the emulsifying capacity of BE produced by S29 strain+ S22 BE S29 strain+ S24 BE
bacterial strains isolated in this research. Our data showed that all the
Fig. 3. Cell growth of strains S25, S28 and S29 combined with AD2-EPS, S22-EPS and
BE assayed produced stable emulsions with the majority of hydro- S24-EPS and in un-combined condition (control) in synthetic marine liquid medium
carbons tested (Table 4), especially exopolymers synthesized by amended with 0.1% (v/v) Prestige fuel oil as the sole source of carbon and energy. Error
Halomonas strains W3, W4, W10 and W12. Previous reports have bars represent one standard deviation.
 I. Uad et al. / International Biodeterioration & Biodegradation 64 (2010) 511e518 517

The growth curves of these strains cultured in Prestige fuel liquid and qualitative aspects of which depend on the nature and amount
medium showed that the addition of efficient bioemulsifiers, such as of the oil or hydrocarbons present, the ambient and seasonal envi-
S22-BE, S24-BE and AD2-BE, successfully enhanced their growth. ronmental conditions, and the composition of the autochthonous
Also, as can be seen in Fig. 4, the hydrocarbon removal capacity was microbial community. The present work has shown that indigenous
enhanced in culture when BE were added. In this context, Pseudo- bacteria isolated from the deep sea ocean are capable of growing on
monas, Bacillus and Brevibacterium have frequently been found at and degrading hydrocarbons, particularly B. pumilus S25, B. sanguinis
sites polluted by petroleum and petroleum derivatives, suggesting S28 and P. brennerii S29, which were able to remove high percent-
that these genera effectively metabolize hydrocarbon molecules and ages of different hydrocarbons fractions of Prestige fuel, suggesting
that they are an effective agent for the degradation of hydrocarbons that bioremediation of Prestige fuel remaining in the container of the
(Zhuang et al., 2002; Pavitran et al., 2004; Calvo et al., 2004; Vieira wreck would be carried out by indigenous microorganisms.
et al., 2007). Furthermore, this study has established the remarkable ability of
In summary, the biodegradation of petroleum and other hydro- isolated microorganisms to synthesize biopolymers with emulsi-
carbons in the environment is a complex process, the quantitative fying activity, which increases the bioavailability of the hydrocar-
bons in order to use them as a carbon and energy source. For
example, strains W3, W4 and W10 of Halomonas were efficient
a 100 bioemulsifier-producing bacteria with potential application in
industry. Thus, the BE produced by Halomonas strains could poten-
80 tially be used in biotechnology applications within extreme envi-
% Hydrocarbon degradation

ronmental conditions, such as the bioremediation of oil pollution

within soil and marine environments.
60

40
Acknowledgements

This work was supported by the Technological Centre of Repsol

20 YPF (CTR), and by a grant from the Spanish Environmental Ministry
(MMA.A4872007/20-01.1). Additional partial support came from
the Spanish Agency of International Cooperation (A.E.C.I.).
0
S25 strain S25 strain+S22 BE S25 strain+S24 BE S25 strain+AD2 BE

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a v a i l a b l e a t w w w. s c i e n c e d i r e c t . c o m

w w w. e l s e v i e r. c o m / l o c a t e / s c i t o t e n v

Review

Application of bioemulsifiers in soil oil bioremediation

processes. Future prospects

C. Calvo⁎, M. Manzanera, G.A. Silva-Castro, I. Uad, J. González-López

Environmental Microbiological Research Group, Department of Microbiology, Institute of Water Research, University of Granada,
C/ Ramón y Cajal no. 4. 18071, Granada, Spain

AR TIC LE I N FO ABS TR ACT

Article history: Biodegradation is one of the primary mechanisms for elimination of petroleum and other
Received 7 April 2008 hydrocarbon pollutants from the environment. It is considered an environmentally acceptable
Received in revised form 7 July 2008 way of eliminating oils and fuel because the majority of hydrocarbons in crude oils and refined
Accepted 8 July 2008 products are biodegradable. Petroleum hydrocarbon compounds bind to soil components and
Available online 22 August 2008 are difficult to remove and degrade. Bioemulsifiers can emulsify hydrocarbons enhancing their
water solubility and increasing the displacement of oily substances from soil particles. For
Keywords: these reasons, inclusion of bioemulsifiers in a bioremediation treatment of a hydrocarbon
Bioemulsifier polluted environment could be really advantageous.
Biodegradation There is a useful diversity of bioemulsifiers due to the wide variety of producer microorganisms.
Hydrocarbon Also their chemical compositions and functional properties can be strongly influenced by
Bioremediation environmental conditions.
The effectiveness of the bioemulsifiers as biostimulating agent in oil bioremediation processes
has been demonstrated by several authors in different experimental assays. For example, they
have shown to be really efficient in combination with other products frequently used in oil
bioremediation such as they are inorganic fertilizer (NPK) and oleophilic fertilizer (i.e. S200C).
On the other hand, the bioemulsifiers have shown to be more efficient in the treatment of soil
with high percentage of clay. Finally, it has been proved their efficacy in other biotechnological
processes such as in situ treatment and biopiles. This paper reviews literature concerning the
application of bioemulsifiers in the bioremediation of soil polluted with hydrocarbons, and
summarizes aspects of the current knowledge about their industrial application in
bioremediation processes.
© 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.

Contents

1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3635
2. Chemical composition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3635
3. Use of biosurfactant in oil bioremediation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3636
4. Future prospects. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3638

⁎ Corresponding author. Tel.: +34 958 248021/243874; fax: +34 958 243094.
E-mail address: ccalvo@ugr.es (C. Calvo).

0048-9697/$ – see front matter © 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.scitotenv.2008.07.008
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Acknowledgments. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3639
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3639

1. Introduction Corynebacterium (MacDonald et al., 1981) Candida (Kawashima

et al., 1983) or Rhodococcus (Martin et al., 1991). However, the syn-
Bioremediation involves the acceleration of natural biodegra- thesis of exopolysaccharides (EPS) with surfactant and emulsify-
dation processes in contaminated environments. It usually ing activity is not always consequence of microbial growth in
consists of the application of nitrogenous and phosphorous hydrocarbons, for example the synthesis of EPS with emulsifying
fertilizers, adjusting the pH and water content, and is often activity by strains of Halomonas eurihalina is not a consequence
accompanied with the addition of bacteria. Besides, when the of their growth on hydrophobic substances since maximal EPS
pollutants have poor water solubility, addition of emulsifiers yields are obtained when cultured in media with glucose as sole
and surface-active agents enhances the biodegradation rate carbon source (Calvo et al., 1998; Martínez-Checa et al., 2002, 2007).
by increasing the bioavailability of the pollutant. The main objective of this article was to review the basic
Biological treatment techniques fall into two categories, concept of the application of bioemulsifiers as biostimulating in
biostimulation and bioaugmentation. Biostimulation refers to oil bioremediation processes, with particular emphasis on the
the addition of specific nutrients to a waste situation with the current knowledge of its importance in biological treatment
hope that the correct, naturally indigenous microbes were techniques.
present in sufficient numbers and types to break down the
waste effectively. This assumes that every organism needed to
accomplish the desired treatment results is present. But how 2. Chemical composition
can we be certain that these organisms present are the most
suitable to degrade all the materials present? And, if the Microbial bioemulsifiers are produced by a wide variety of
naturally occurring organisms present were truly effective in diverse microorganisms and have very different chemical
achieving complete waste (i.e. hydrocarbons) breakdown, then structures and surface properties. Table 1 shows some
why are there problems at sites? example of bioemulsifiers and the producing microorganisms.
An alternative approach is to use bioaugmentation, which Microorganisms are capable of making two different types of
is the scientific approach to achieve controlled, predictable, bioemulsifiers, one type consists of low molecular weight
and programmed biodegradation. Bioaugmentation involves molecules that efficiently lower surface tension and interfacial
the addition of specifically formulated microorganisms to a tension, the other type consists of high molecular weight
waste situation. It is done in conjunction with the develop- polymers that bind tightly to surfaces. Within the first group it
ment and monitoring of an ideal growth environment, in is worth mentioning the rhamnolipids (see below) produced by
which these selected bacteria can live and work. Pseudomonas species, composed of two molecules of rhamnose
Hydrocarbons are hydrophobic compounds with low water and two molecules of 3-hydroxyacides. Also remarkable are
solubility, thus microorganisms have developed several the trehalolipids produced by several species of Rhodococcus,
mechanisms to increase the bioavailability of these compounds Arthrobacter and Mycobacterium composed of trehalose, non
in order to use them as carbon and energy source. Therefore one hydroxylated fatty acid and mycolic acids and the sophoroli-
of the major factors limiting the degradation of hydrocarbons pids produced by Candida and Torulopsis, in which sophorose is
such as n-alkanes is their low availability to the microbial cells. combined with long-chain hydroxyacid. The second group of
Microorganisms employ several strategies to enhance avail- biopolymers with high molecular weight consists of highly
ability of those hydrophobic pollutants, such as biofilm forma- efficient emulsifiers that work at low concentration, exhibiting
tion and biosurfactant production (Bognolo, 1999; Christofi and considerable substrate specificity. Among other molecules,
Ivshina, 2002). this group is composed of polysaccharides, proteins, lipopoly-
In this sense, growth of microorganisms on oil hydrocarbons saccharides, lipoproteins or complex mixture of these biopo-
has often been related to their capacity of producing polymers lymers (Banat et al., 2000; Sutherland, 2001). Biopolymers
with surfactant activity named biosurfactant. These biopoly- containing polysaccharides, polysaccharides attached to
mers can either be low molecular weight polymers such as lipids; or polysaccharides attached to proteins have been
glycolipids (Guerra-Santos et al., 1986; Rosenberg and Ron, 1999) described as efficient emulsifying agents of numerous hydro-
and lipopeptide (Javaheri et al., 1985; Wilkinson and Galbraith, carbon compounds (Plaza et al., 2005; Iyer et al., 2006;
1975) or high molecular weight polymers such as emulsan Ashtaputre and Shah, 1995; Calvo et al., 2002; Toledo et al., in
(Zuckerberg et al.,1979), alasan (Navon-Venezia et al., 1995) or press). These high molecular weight microbial bioemulsifiers
biodispersan (Rosenberg et al., 1988). are synthesized by a wide variety of microorganisms. Exam-
The first description of a biotechnological application of bio- ples of both types of polymers are depicted in Fig. 1.
emulsifiers in hydrocarbon bioremediation processes reported by Summarizing, according to their chemical structure, bioe-
Itoh and Suzuki (1972) showed that a rhamnolipid producing mulsifiers may be classified into the following main groups:
strain of Pseudomonas aeruginosa stimulated the growth of this
microorganism when grown in hydrocarbon culture media. 1. The glycolipids, in which carbohydrates such as sophorose,
Similar results have been described for microorganisms such as trehalose or rhamnose are attached to a long-chain aliphatic
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Table 1 – Some of the most important bioemulsifiers and their producing microorganisms (Calvo et al., 2004).
Biosurfactant Producing microorganisms

Glycolipids Rhamnolipids Pseudomonas aeruginosa

Trehalolipids Rhodococcus erytropolis
Arthrobacter sp.
Mycobacterium sp.
Sophorolipids Torulopsis bombicola
Lipopeptides and lipoproteins Peptide–lipid Bacillus licheniformis
Viscosin Pseudomonas fluorescens
Surfactin Bacillus subtilis
Phospholipids Acinetobacter sp.
Polymeric surfactants RAG-1 emulsan Acinetobacter calcoaceticus RAG-1
BD4 emulsan Acinetobacter calcoaceticus BD413
Alasan Acinetobacter radioresistens KA53
Biodispersan Acinetobacter calcoaceticus
Liposan Candida lipolytica
Protein complex Mycobacterium thermoautotrophium
Thermophilic emulsifier Bacillus stearothermophilus
Acetylheteropolysaccharide Sphingomonas paucimobilis
Food emulsifier Candida utilis
Sulfated polysaccharide Halomonas eurihalina

acid or lipopeptide. For example, the rhamnolipids synthe- stance added to culture media. These changes in EPS
sized by P. aeruginosa consist of one or two sugar moieties composition originated noticeable modifications in the emul-
joined to one or two caprilic acid moieties via a glycosidic sifying activity. Thus, it could be suggested that the chemical
linkage (Rosenberg and Ron, 1999; Lang and Wullbrandt, composition of biopolymers produced dependent of the
1999). different hydrophobic compounds added to culture media
2. Amino-acid containing bioemulsifiers like surfactin pro- (Table 2). Moreover, these differences in composition result in
duced by Bacillus subtilis composed of seven amino-acid ring differences in emulsifying activity (Table 3).
structure coupled to one molecule of 3-hydroxy-13-methyl Sutherland (2001) reported that the content of some
tetradecanoic acid. chemical groups attached to the carbohydrates structures
3. Polysaccharide–lipid complexes. For example, the emulsan could vary widely depending on the growth and nutrient
synthesized by Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 is an extra- conditions. In this sense, we have demonstrated that in the
cellular heteropolysaccharide polyanionic complex (Rosen- bioemulsifier produced by H. eurihalina strain H96, the ratio of
berg et al., 1979). uronic acid and sulphate content increased when biopolymer
4. Protein-like substances such as liposan produced by Can- was synthesized with hydrocarbon compounds and that the
dida lipolytica composed of protein and carbohydrates. different chemical structures of the bioemulsifiers were
translated into different functional properties (Calvo et al.,
The high diversity of biosurfactant produced by numerous 1998). In summary biosurfactant, being complex organic
microorganisms is noteworthy (Rosenberg and Ron, 1999). In molecules with a broad range of functional properties that
this sense the chemical nature of a biosurfactant/bioemulsi- includes emulsification and de-emulsification, phase separa-
fier plays an important role in its function. However, the tion, wetting, foaming, solubilization, corrosion inhibition and
chemical composition and emulsifying activity of the biosur- reduction of viscosity. These properties have received con-
factant depend not only on the producer strain but also on the siderable attention in recent years for the potential applica-
culture conditions. Thus, the nature of the carbon and tion of biosurfactant for bioremediation processes,
nitrogen sources, C:N ratio, nutritional limitations and physi- particularly for bioremediation of oil-contaminated sites.
cal parameters (i.e. temperature, aeration and pH) influence
not only the amount but also the types of polymer produced.
This play an important role on the yield and structure of 3. Use of biosurfactant in oil bioremediation
microbial bioemulsifiers, changing the substrate often alters
the structure of the product, thus altering their properties. The fact that biosurfactants have a biological origin implies a
For example, we have studied the influence of the addition better biocompatibility and good microbial biodegradability;
of hydrocarbons and other oil related substances to culture consequently there is large number of potential applications
media in the chemical composition and in the emulsifying for this type of surfactants. This biological origin is of great
activity of the exopolysaccharides (EPS) synthesized by strains interest, especially when there is extensive interference with
of H. eurihalina, Alcaligenes faecalis, B. subtilis, or Ochrobactrum the environment, for example for tertiary petroleum recovery,
anthropi (Calvo et al., 1998; Martínez-Checa et al., 2002, 2007; for the decontamination of oil-polluted areas, for crop
Toledo et al., in press). Our results demonstrated that the protection and for the cosmetic and pharmaceutical sectors
amount of carbohydrates and proteins of the biopolymer (Banat et al., 2000). It is therefore not surprising that a number
obtained was strongly influenced by the hydrophobic sub- of investigations in the laboratory (Banat, 1995; Barkay et al.,
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It is generally observed (Kosaric, 2001) that the degradation

time and particularly the adaptation time, for microbes are
clearly shortened.
The specific assembly of the soil particles, known as soil
structure, determines the transfer ability of the soil with
regard to water, and nutrients to the bioactive areas. Conse-
quently, presence of biosurfactants in soil may produce a
positive effect in form of stimulation of dissolution or
desorption rates, solubilization or even emulsification of
hydrocarbons. Norman et al. (2002) have clearly showed that
rhamnolipids stimulate different processes involved in degra-
dation of organic substrates. The efficiency of the biodegrada-
tion process and the specific mechanism of action of
rhamnolipid may depend on how the substrate is presented.
In this sense, this group showed that rhamnolipid and several
other surfactants stimulated the degradation of hexadecane
to a greater extent when it was entrapped in matrices with
pore-sizes larger than 300 nm rather than in matrix with
smaller pore-sizes or in sea sand.
According to Norman et al. (2002) degradation of hydro-
carbon can only be enhanced by surfactant when the process
is under rate limiting conditions. Another important factor in
soil bioremediation is the variety and balance of nutrients in
the soil. Addition of nutrients to the soil, in form of nitrogen,
phosphorous and if necessary carbon compounds, allows the
native microbial population to develop and augment. Thus
such addition is translated in an increase of microorganisms
capable of metabolising the pollutant, therefore enhancing the
biodegradation rate. This principle prompted us to study the
effect of addition of the bioemulsifier AD2-EPS in combination
with two different nutrient additives: the inorganic NPK
fertilizer and the S200C oleophilic commercial product (from
IEP Europe) in oil bioremediation process using soil micro-
cosms. Our results showed that addition of AD2 EPS + S200C
Fig. 1 – Chemical structure of rhamnolipid as low (A) and enhanced hydrocarbon biodegradation over an untreated
emulsan as high (B) molecular weight bioemulsifiers. control or treated soils amended with AD2-EPS, S200C or
NPK alone, suggested that AD2-EPS enhanced the solubility
and consequently the bioavailability of hydrocarbon com-
1999) and in the field have been described on these areas pounds to specific oil degrader microorganisms previously
(Christofi and Ivshina, 2002; Kosaric, 2001). stimulated by the S200C product (Calvo et al.; unpublished
Biodegradation of hydrocarbons in soil can be efficiently data). Similar results have been previously reported by other
enhanced by addition or by in situ production of biosurfactants. authors (Kosaric, 2001; Providenti et al., 1995).

Table 2 – Yield production and chemical composition of EPS synthesized by Halomonas eurihalina strain F2-7 growing in MY
medium with glucose, n-tetradecane, n-hexadecane, n-octane, xylene, mineral light oil, mineral heavy oil, petrol or crude
oil, and in control medium.
Substrates
a
Glucose Octane Xylene Light oil Heavy oil Petrol Crude oil
b
Yield production 1.3 ± 0.11 0.76 ± 0.13 1 ± 0.15 1.45 ± 0.11 0.96 ± 0.18 0.58 ± 0.13 0.68 ± 0.13
Chemical compositionc
Carbohydrates 36.89 ± 1.35 22.53 ± 1.71 29.62 ± 0.97 27.77 ± 0.81 25.92 ± 1.24 26.81 ± 0.09 28.28 ± 1.11
Proteins 7.27 ± 0.94 2.12 ± 0.31 1.93 ± 0.54 4.18±0.27 6.94 ± 0.73 3.38 ± 0.28 2.10 ± 0.22
Uronic acids 1.32 ± 0.16 3.16 ± 0.21 2.35 ± 0.19 2.17 ± 0.08 2.81 ± 0.05 2.91 ± 0.17 2.57 ± 0.28
Acetyl residues 0.43 ± 0.01 0.94 ± 0.03 1.27 ± 0.23 1.01 ± 0.07 1.57 ± 0.37 1.23 ± 0.21 1.07 ± 0.07
Sulfates 7.15 ± 0.95 14.72 ± 1.18 13.70 ± 1.05 21.73 ± 2.01 15.60 ± 1.16 28.16 ± 1.25 20.66 ± 1.02
a
MY medium with glucose.
b
Data are expressed in grams of EPS per liter of culture medium.
c
Results are expressed as percentages of total dry weight of the polymers, values are means of at least three determinations.
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Table 3 – Emulsifying activity of EPS V2-7 of Halomonas eurihalina on n-octane, xylene, mineral light oil, mineral heavy oil,
petrol and crude oil (Martínez-Checa et al., 2007).
EPS-emulsifier Substrates
b
Octane Xylene Light oil Heavy oilb Petrol Crude oil

Glucose-EPS 57.58 ± 1.74a 69.23 ± 1.23 61.53 ± 1.46b 57.59 ± 1.94 57.67 ± 0.99 71.15 ± 1.23
Octane-EPS 63.46 ± 1.14 47.11 ± 0.76 30.76 ± 1.21 61.23 ± 2.19 35.41 ± 1.15 88.46 ± 0.85
Xylene-EPS 42.30 ± 1.27 71.15 ± 1.97 28.84 ± 0.44 23 ± 3.16 19.23 ± 1.01 55.76 ± 1.66
Light oilb-EPS 60.83 ± 1.81 40.38 ± 1.21 67.30 ± 1.19 48.07 ± 1.26 36.53 ± 0.17 76.92 ± 1.37
Heavy oilb-EPS 56.73 ± 2.18 9.61 ± 1.18 35.19 ± 0.29 62.56 ± 1.51 38.17 ± 1.04 65.38 ± 1.25
Petrol-EPS 54.8 ± 0.58 8.65 ± 0.92 33.65 ± 1.12 55.79 ± 2.25 62.50 ± 1.75 75 ± 0.95
Crude-EPS 55.76 ± 1.77 46.15 ± 2.17 33.65 ± 0.99 47.11 ± 1.63 38.46 ± 0.43 75.96 ± 1.44
a
Emulsifying activity was expressed as the percentage of the total height occupied by the emulsion.
b
Mineral oil.

Soil hydrocarbon degradation may also be limited by the degradation. On the other hand, when oil-contaminated soils
available water for microbial growth and metabolism. A are subjected to very low temperatures such as those on polar
decrease in moisture content results in a decrease in microbial areas, emulsifiers or biosurfactants are of paramount impor-
activity, while rewetting causes a large and rapid increase in tance because they can counter the increased viscosity and
activity (Ayotamuno et al., 2006). Generally, optimum activity decreased water solubility of the hydrocarbons at lower
occurs when the soil moisture is 50–80% of saturation. temperatures (Aislabie et al., 2006).
Experimental assays in our laboratory indicated that addition
of surfactant to sandy soil increased retention of soil moisture
in the long time. 4. Future prospects
Bioemulsifiers have been often reported as enhancers of
hydrocarbon biodegradation in liquid media, soil slurries and Regardless of the different chemical composition and applica-
water and soil microcosms (Providenti et al., 1995; Ron and tions that bioemulsifiers show the main field of research
Rosenberg, 2002; McKew et al., 2007). In soil microcosms, nowadays is focused on the mass production of these com-
treatment of waste crude oil with Halomonas bioemulsifiers pounds to an industrial scale. Currently a deep understanding
produced a selective enhancing of indigenous hydrocarbon is needed for optimal production of glycolipids, lipopeptide,
degrading bacteria suggesting the utility of bioemulsifiers as emulsan, alasan and biodispersan. In this regard the following
biostimulating agent of a bioremediation process (Calvo et al., studies are of key importance to achieve the desired produc-
2002). tion yield. With respect to the glycolipids as bioemulsifiers,
In oil-contaminated mud flats, the elimination of poly- rhamnolipids are considered as the best studied type of glyco-
cyclic aromatics from the crude oil Arabian light was due to lipids. Many research (Lang and Wullbrandt, 1999; Wang et al.,
wave action and to microbial degradation, addition of 2006) papers have been published showing improved methods
trehalose lipid biosurfactant stimulated the biodegradation for rhamnolipids production. A recent study (Chen et al., 2007)
rate caused the completed elimination within six months focused on optimization of rhamnolipid production from a
(Kosaric, 2001). In soil slurry reactors sophorolipids signifi- P. aeruginosa S2 strain in various carbon and nitrogen sources.
cantly enhanced biodegradation of naphthalene (Norman These authors (Chen et al., 2007) used the relationships
et al., 2002). On the other hand, results obtained in our between several exploratory variables and one or more
laboratory have shown high efficiency of hydrocarbon biode- response variable (Response Surface methodology, RSM) to
gradation in biopiles assays amended with AD2-EPS bioemul- identify optimal C and N source in form of optimal concentra-
sifier plus activated sludge (Calvo et al. unpublished data). As tion of glucose and NH4NO3, concluded that the optimal C/N
above-mentioned, the low availability of the hydrocarbons to ratio was approximately 11:4 for rhamnolipid production.
the cells is one of the major limiting factors for their These results indicated as well that concentrations of MgSO4
biodegradation. In this sense, bioavailability can be enhanced and FeSO4 were the most significant factors affecting rham-
by an increase in temperature, a condition favourable for the nolipid production in scaling-up production of rhamnolipid in
growth of thermophilic microorganisms, during hydrocarbon a well-controlled 5 L jar fermentator. Nevertheless changing
degradation (Margesin and Schinner, 2001). Feitkenhauer et al. the media and culture conditions is not the only factor to
(2003) summarized several advantages by using thermophilic modify in order to increase the production yield. In this sense,
microorganisms for bioremediation of hydrocarbons over the development and use of overproducing mutant or
mesophilic organisms. Briefly, elevated temperature can recombinant strains for enhancing biosurfactant yield have
increase the solubility of hydrophobic pollutants, decrease been reported (Al-Gelawi and Al-Makadci, 2007). Also, differ-
their viscosity, enhance their diffusion, and transfer long- ent backgrounds have been proposed to overcome the
chain n-alkanes from solid phase to liquid phase. Combined complex environmental regulation with respect to rhamnoli-
effect of thermophilic strains and production of emulsifying pid biosynthesis, and to replace the opportunistic pathogen
agents by Bacillus strain NG80-2 has been recently described by P. aeruginosa with a safe industrial strain. To achieve
Wang et al. (2006) with great effect for long-chain n-alkanes rhamnolipid production in a heterologous host, Pseudomonas
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putida was used. To this end rhlAB rhamnosyltransferase products. As above indicated, few mutant and recombinant
genes with the rhlRI quorum sensing system, were inserted strains with enhanced bioemulsifiers production have been
into P. putida. In this way a functional rhamnosyltransferase reported (Mukherjee et al., 2006). Thus, future research aiming
catalyzed the formation of rhamnosyl-6-hydroxydecanoyl-6- for high-level production of bioemulsifiers must be focused
hydroxydecanoate (mono-rhamnolipid) in P. putida (Cha et al., towards the development of novel recombinant hyperprodu-
2008). However, the industrial application of recombinant cer strains.
hyperproducing strains, has still not been properly tested, The potential use of these hyperproducer strains in
despite of the fact that the hyperproducers have been reported addition to novel cost-effective bioprocesses throws the real
to increase yields several folds. This area of bioemulsifiers challenges and offers tremendous opportunities for making
research is still in its infancy. industrial production of bioemulsifiers a success story.
With reference to the lipopeptides and in order to increase In conclusion, for an optimal production of biosurfactant
surface activity, we have to mention that most lipopeptide several elements, media components, precursors, conformation
biosurfactants have been shown to have a structure similar to and genetic background have to be considered. All these factors
that of surfactin, the biosurfactant produced by B. subtilis are of paramount importance and affect the process of
(Peypoux et al., 1999). biosurfactant production as well as the final quantity and
Recombinants of B. subtilis have been developed by expres- quality of the biosurfactant. Consequently more research needs
sing foreign gene related to surfactin production, resulting in to be done in this regard in order to increase yield production in
high production of bioemulsifier (Ohno et al., 1995). Moreover, combination with the search for new types of bioemulsifiers for
recombinant strains often give rise to better product char- its application on hydrocarbon bioremediation processes.
acteristics. Thus, surfactin, the lipopeptide bioemulsifier
produced by a large multimodular peptide synthetase suffers
from the disadvantage of lysing erythrocytes because of it Acknowledgments
membrane-active property. However, the production of a
novel lipohexapeptide after engineering of B. subtilis surfactin This research has been supported by a grant of Ministerio de
synthetase reduced toxicity towards erythrocytes and Medio Ambiente (MMA.A4872007/20-01.1). M. Manzanera was
enhanced lyses of Bacillus licheniformis cells, making it more granted by Programa Ramón y Cajal (MEC, Spain and EDRF,
suitable to the bioemulsifiers in therapeutic formulations. European Union).
For emulsan optimal production, a series of studies has
focused on growth conditions, including the effect of ethanol
and phosphate on emulsan production by A. calcoaceticus RAG-1
REFERENCES
using batch-fed fermentators (Choi et al., 1996). Similar studies
can be performed for alasan, since this bioemulsifier of Acine-
tobacter radioresistant KA53 consists on a high-mass complex of Aislabie J, Saul DJ, Foght JM. Bioremediation of
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3640 S CI EN CE OF T H E T OTAL EN V I RO N M EN T 4 0 7 ( 2 0 09 ) 36 3 4– 3 64 0

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DOI 10.1007/s10295-008-0451-5

ORIGINAL PAPER

EYciency of the EPS emulsiWer produced by Ochrobactrum

anthropi in diVerent hydrocarbon bioremediation assays
C. Calvo · G. A. Silva-Castro · I. Uad ·
C. García Fandiño · J. Laguna · J. González-López

Received: 1 April 2008 / Accepted: 30 July 2008 / Published online: 11 September 2008
© Society for Industrial Microbiology 2008

Abstract Ochrobactrum anthropi strain AD2 was isolated way EPS emulsiWer stimulated the bioremediation eVect of
from the waste water treatment plant of an oil reWnery and S200 C product, increasing the number of bacteria and
was identiWed by analysis of the sequence of the gene decreasing the amount of hydrocarbon remained. Finally,
encoding 16S rDNA. This bacterium produced exopolysac- similar eVects were obtained in biopile assays amended
charides in glucose nutrient broth media supplemented with with EPS emulsiWer plus activated sludge. Our results
various hydrocarbons (n-octane, mineral light and heavy suggest that the bioemulsiWer EPS emulsiWer has interest-
oils and crude oils). The exopolysaccharide AD2 (EPS ing properties for its application in environment polluted
emulsiWer) synthesized showed a wide range of emulsify- with oil hydrocarbon compounds and may be useful for
ing activity but none of them had surfactant activity. Yield bioremediation purposes.
production varied from 0.47 to 0.94 g of EPS l¡1 depending
on the hydrocarbon added. In the same way, chemical Keywords Ochrobactrum anthropi · BioemulsiWer ·
composition and emulsiWcation activity of EPS emulsiWer Biodegradation · Hydrocarbon
varied with the culture conditions. EYciency of the EPS
emulsiWer as biostimulating agent was assayed in soil
microcosms and experimental biopiles. The AD2 biopoly- Introduction
mer was added alone or combined with commercial prod-
ucts frequently used in oil bioremediation such as inorganic Microbial biosurfactants and bioemulsiWers are produced
NPK fertilizer and oleophilic fertilizer (S200 C). Also, its by a wide variety of diverse microorganisms and they have
eYciency was tested in mixture with activated sludge from diVerent chemical structures and properties [6, 28]. In gen-
an oil reWnery. In soil microcosms supplemented with S200 eral, bacteria make low molecular weight molecules that
C + EPS emulsiWer as combined treatment, indigenous eYciently reduce surface and interfacial tensions such as
microbial populations as well as hydrocarbon degradation glycolipids [18, 35] and lipopeptide [22]; [32], and high
was enhanced when compared with microcosms treated molecular weight polymers that are eYcient emulsiWers
with NPK fertilizer or EPS emulsiWer alone. In the same such as emulsan [45], alasan [30] or biodispersan [36].
Within the Wrst group, it is worth mentioning the rhamnoli-
C. Calvo (&) · G. A. Silva-Castro · I. Uad · J. González-López
pids produced by Pseudomonas species, composed of two
Environmental Microbiological Research Group, molecules of rhamnose and two molecules of 3 hydroxy-
Department of Microbiology, Institute of Water Research, acids. Also remarkable are the trehalolipids produced by
University of Granada, C/Ramón y Cajal no. 4, several species of Rhodococcus, Arthrobacter and Myco-
18071 Granada, Spain
e-mail: ccalvo@ugr.es
bacterium composed of trehalose, nonhydroxylated fatty
acid and mycolic acids and the sophorolipids produced by
C. García Fandiño Candida and Torulopsis, in which sophorose is combined
CTR Repsol YPF, Madrid, Spain with long chain hydroxyacid [11, 37]. The high molecular
J. Laguna
weight biopolymers containing polysaccharides, polysac-
AG Ambiental, Madrid, Spain charides attached to lipids; or polysaccharides attached to

123
1494 J Ind Microbiol Biotechnol (2008) 35:1493–1501

proteins have been described as eYcient emulsifying Materials and methods

agents of numerous hydrocarbon compounds [4, 10, 20,
28, 33, 40]. Microorganism
Regardless of the diVerent chemical composition and
applications that bioemulsiWers show, the main Weld of Strain AD2 was isolated from an activated sludge plant
research nowadays is focused on the mass production of (wastewater treatment plant of a Repsol YPF oil reWnery
these compounds on an industrial scale [17]. Many research located in Puertollano, Spain). Sludge samples (10 g) from
[25, 42] papers have been published showing improved the aerobic biological reactor were placed in 500-ml Erlen-
methods for rhamnolipids production. Recently, the rela- meyer Xask mixed with 100 ml of BH liquid medium and
tionships between several exploratory variables and one or 1 ml of Kirkuk crude oil and incubated at 28 °C for a week.
more response variable [Response Surface methodology Samples for bacterial isolation (0.1 ml) were plated on BH
(RSM)] have been used to identify optimal C and N source agar medium [15] with the addition of 0.1% w/v naphtha-
in order to optimize rhamnolipid production from a P. lene, phenanthrene or pyrene. For that purpose, the poly-
aeruginosa S2 strain [13] and bioemulsiWer production by cyclic aromatic hydrocarbon (PAH) was dissolved in ether
Candida lipolytica [2]. and the solution was then spread onto the surface of the
The diversity of these compounds results in a broad medium. Strain AD2 was selected for further studies due to
spectrum of potential applications, being valuables in its ability to grow and produce a clear halo on the surface of
industries as diverse as agriculture, food industry, leather, the BH medium supplemented with 0.1% of PAHs. The
textile or paper industries, cosmetic and pharmaceutical strain was long-term maintained in the laboratory by lyo-
industries, etc. However, the largest possible market for philisation. For this study, stock cultures were grown on
biosurfactants and bioemulsiWers could be the oil industry, TSA (Difco) slants.
both for petroleum production and for bioremediation of oil
contaminated sites [21, 34]. Culture media
Biodegradation is one of the primary mechanisms for
elimination of petroleum and other hydrocarbon pollutants BH medium used for isolation of hydrocarbon degrading
from the environment [26]. It is considered an environmen- microorganisms is a minimal medium with the following com-
tally acceptable way of eliminating oils and fuel because position (g/l): MgSO4·7H2O, 0.2; K2HPO4, 1; CaCl2·2H2O,
the majority of hydrocarbons in crude oils and reWned 0.02; NH4NO3·6H2O, 1; FeCl3, 0.05 and agar, 20.
products are biodegradable, and hydrocarbons degrading Growth studies of strain AD2 was determined in nutrient
microbes are ubiquitous [23]. broth (NB medium) with the following composition (g/1):
Petroleum hydrocarbon compounds bind to soil compo- glucose, 10; yeast extract, 5; proteose-peptone, 5; and
nents and are diYcult to remove and degrade. BioemulsiW- NaCl, 5. Bacteria were cultivated at 32 °C for 5 days under
ers can emulsify hydrocarbons enhancing their water aerobic conditions in a rotatory shaker (150 rpm).
solubility and increasing the displacement of oily sub- The eVect of diVerent hydrocarbons on growth and EPS
stances from soil particles and thus making them more emulsiWer production by strain AD2 was evaluated by addi-
available to microorganisms [6]. It has been demonstrated tion of octane, toluene, xylene, mineral light oil, mineral
that emulsifying agents enhance the degradation process heavy oil or crude oil to glucose NB media at concentration
due to better solubilization of hydrocarbon prior to micro- of 1% v/v.
bial degradation [15]. Addition of compounds able to emul- PAHs, octane, toluene xylene, mineral light oil, mineral
sify hydrocarbons into microscopic droplets increases the heavy oil supplied by Sigma Co, were standard for HPLC
surface area exposed to bacteria, this produces a readily and gas chromatography (¸99.7% of purity). Crude oil
available food source that bacteria can assimilate quickly used was Kirkuk crude oil from the reWnery of Repsol YPF
[28, 34]. For these reasons, inclusion of bioemulsiWers in a (Puertollano, Spain).
bioremediation treatment of a hydrocarbon polluted envi-
ronment could be really advantageous. In this sense, it has Taxonomical characterization of strain AD2
been reported [8, 19, 34] that biosurfactant and other natu-
ral emulsifying agents are important tools for biotreatment Strain AD2 was identiWed by the analysis of the sequence
of hydrocarbon polluted environment. of the gene encoding 16S RNA (16S rDNA). Primers fD1
In the present study, we describe the properties, charac- and rD1 [43] were synthesized by Sigma-Genosis (Haver-
terization and eYciency of EPS emulsiWer produced by hill, UK) and used to amplify almost the full length of 16S
O. anthropi as biostimulating agent to oil hydrocarbon bio- rRNA gene. Freshly cultured colonies of strain AD2 were
degradation under experimental conditions such as soil lysed by the addition of 20
l of a mixture of NaOH
microcosms and biopiles. (0.05 M)–SDS (0.25%, w/v) and then boiled for 15 min.

123
J Ind Microbiol Biotechnol (2008) 35:1493–1501 1495

The lysates were adjusted to 200
l with sterile bidistilled 24 h. Emulsifying activity was expressed as the percentage
water and centrifuged at 2,500g for 5 min. of the total height occupied by the emulsion. Surfactant
The cleared lysates (4-
l aliquots) were used as template activity was determined by measurement of surface tension
for identiWcation. PCR was performed adding to the lysates with a Krüs K11 digital tensiometer, using a plate method
1£PCR buVer (ABI; Perkin Elmer, Norwalk, CT), 1.5 mM [7]. This property was searched in the bacterial culture and
MgCl2 (ABI), 200
M dNTPs (Roche Molecular Biochemi- in bioemulsiWer distilled water solution.
cals, Mannheim, Germany), 20 pmol of each primer, and
1 U of Taq polymerase (ABI). The Wnal volume in the reac- Microcosm assays
tion tubes was adjusted to 50
l. Reactions were run in a
Perkin Elmer GeneAmp PCR system 2400 (Perkin Elmer, Soil microcosms were constructed with oil polluted soil
Norwalk, CT). The temperature proWle was the one previ- samples (Table 1) incubated at room temperature in steady
ously described by Vinuesa et al. [41] except for the initial conditions for 21 days and weekly tested. The soil samples
denaturation step, which was extended to 7 min. PCR prod- were obtained from a real contaminated soil; they were sup-
ucts were run on 1% agarose gels and bands were puriWed plied by the Company AG Ambiental (Madrid, Spain) in
using a Quiaex II kit (Quiagen, Hilden, Germany). The order to perform assays of biotreatability. This soil was
nucleotide sequence of the puriWed bands was determined by franc-clay soil (36% clay, 33% sand and 10% slime); it was
the deoxy chain terminator method, using the ABI-PRISM polluted by a mixture of diesel and fuel oil at Wnal total
Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit, hydrocarbon concentration near 10,000 mg/Kg (See Table 1
(Perkin Elmer) and automated sequencer Applied Biosys- for values of initial pollution).
tems ABI capillary system (Perkin Elmer). Sequence data Six microcosms (three replicate for each treatment) were
were analyzed using gene Runner 3.05 software, and constructed in order to evaluate the eVect of the EPS emul-
compared to sequences in the EMBL databank using the free siWer on hydrocarbon biodegradation. Each microcosm
he BLASTn [3] online software provide by the European received a speciWc treatment: (A) NPK fertilizer (0.3 g/Kg
Bioinformatics Institute (http://www.ebi.ac.uk.) of soil), (B) oleophilic compound S200 C (1 ml/Kg of soil),
(C) EPS emulsiWer (1.5 g/Kg of soil), (D) NPK fertilizer
Production and characterization of EPS emulsiWer (0.3 g/Kg of soil) + EPS emulsiWer (1.5 g/Kg of soil), (E)
S200 C (1 ml/Kg of soil) + EPS emulsiWer (1.5 g/Kg of
Production of EPS emulsiWer was determined in NB soil) and (F) control microcosm without any addition.
medium. Erlenmeyer Xasks (500 ml) containing 100 ml of The NPK fertilizer (Agroblem S.L) is a inorganic com-
NB medium were inoculated with 1 ml of an overnight cul- plex fertilizer composed of 18% total nitrogen (nitrate,
ture, grown in the same medium. After incubation at 32 °C 1.2%; ammonium, 3.1% and urea 13.7%), 8% of P2O5, 2%
for 5 days under aerobic conditions in a rotatory shaker of MgO, 19% of K2SO3 and 0.5% of Fe. S200 C is an oleo-
(150 rpm), the cultures were centrifuged at 36,000g in a philic fertilizer (IEP Europe) which stimulates the indige-
Sorval RC-JB refrigerated centrifuge at 4 °C for 60 min. nous hydrocarbon microorganisms.
Supernatant obtained were precipitated with cold ethanol.
The biopolymer precipitated from the supernatants was dis- Biopile systems
solved in distilled water, dialysed against distilled water
during 24 h lyophilised, and weighed [10]. The EPS The composting process was determined in biopile systems
obtained were subjected to colorimetric analysis of proteins of 1 m height/1.25 m3 total volumes. The biopiles were
[9] and total carbohydrates [16].
Table 1 Concentration of hydrocarbons (mg of hydrocarbon/kg of
EmulsiWcation assays and surfactant activity test soil) in oil polluted soil utilized in microcosms and biopiles assays
Hydrocarbon Polluted soil Polluted soil
Emulsifying activity of biopolymer synthesized by strain compound of microcosms of biopiles
AD2 grown in glucose NB liquid media amended or un-
TPH 8,530 § 1438 11,000 § 1458
amended with hydrocarbon compounds was detected by a
Alkanes 5,726 § 572 7,863 § 171
modiWed version of the method previously described by
Prystane 547 § 81 219 § 84
Cooper and Goldenberg [12]. Test tubes (105 £ 15 mm)
Phytane 468 § 89 212 § 56
were amended with 3.0 ml of exopolymer diluted in
Alkenes and alkynes ND 997 § 285
distilled water (0.1%, w/v) and 3 ml of a hydrophobic
Naphthalenes 263 § 45 1,663 § 64
substrate (n-octane, xylene, toluene, mineral light oil, mineral
Pregnans ND 45 § 25
heavy oil or crude oil). Then the tubes were shaken vigor-
ously to homogeneity using a vortex, and left to stand for ND Not detected

123
1496 J Ind Microbiol Biotechnol (2008) 35:1493–1501

constructed with 1,245 Kg of soil, contaminated with rDNA versus the EMBL data base demonstrated the aYlia-
13.05 Kg (14.5 l of Kirkuk crude oil) of hydrocarbons and tion of this strain to the species Ochrobactrum anthropi
300 Kg of straw added as bulking agent. Homogenization (over 100% ungapped sequence identity). Thus, our results
of contaminant was carried out by turning over. Four diVer- showed that strain AD2 isolated from activated sludge of
ent biopiles (in duplicate) were tested in order to under- the wastewater treatment plant of the oil reWnery of Repsol
stand the eVects of activated sludge and EPS emulsiWer on YPF should be classiWed as O. anthropi.
hydrocarbon biodegradation. The treatments assayed were
as follows: (A) control biopile, (B) biopile amended with Production and characterization of bioemulsiWer AD2
325 Kg of activated sludge, (C) biopile amended with
325 Kg of activated sludge + 150 g of EPS emulsiWer, (D) In the present study, assays were carried out to know the
biopile amended with 150 g of EPS emulsiWer. The total capacity of O anthropi strain AD2 to produce extracellu-
amount of EPS emulsiWer was added in four doses: 60 g of lar biopolymers with biosurfactant or bioemulsiWers
EPS emulsiWer at the beginning of experiment and 30 g activities. Our data showed that strain AD2 was able to
after 15, 30 and 45 days of treatment. EPS emulsiWer addi- produce exopolysaccharide growing on glucose NB liquid
tion was done by irrigation with 1% EPS solution in dis- media and the capacity of this bacterium to grow and pro-
tilled water. Table 1 shows values of initial pollution. duce the EPS emulsiWer in the presence of hydrocarbon
compounds. Table 2, shows yield production and chemi-
Enumeration of culturable bacteria in soil cal composition, in terms of carbohydrates and proteins,
of the EPS emulsiWer synthesized by O anthropi strain
Three replicate samples from each microcosm were with- AD2 in glucose NB medium and in glucose NB medium
drawn every week for enumeration of aerobic heterotrophic added with n-octane, xylene, toluene, mineral light and
bacteria. 0.1 ml of serially diluted soil samples were plated heavy oils and crude oil. Addition of n-octane, mineral
in 1/10 diluted Trypticase Soy Agar (TSA, Difco) accord- light oil and mineral heavy oil enhanced the amount of
ing to Avidano et al. [5]. Triplicate plates were incubated at EPS synthesized. In contrast, strain AD2 was unable to
28 °C for 48 h before the colonies were counted. grow in presence of xylene and toluene, thus both hydro-
carbons seem to be toxic for it. When a preliminary char-
TPH, n-alkanes and PAH determinations acterization of the exopolymers was performed, it was
found that these water soluble substances contain high
Total petroleum hydrocarbons were extracted from the soil amounts of proteins and carbohydrates. However, the
samples with a mixture of hexane: acetone 1:1 (v/v) and addition of hydrocarbons (n-octane, mineral light oil,
determined by gravimetric analysis according to.Aguilera- mineral heavy oil or crude oil) aVected the protein and
Vázquez et al. [1]. Analysis of n-alkanes and polycyclic carbohydrate composition. Thus, O anthropi strain AD2
aromatics hydrocarbons (PAHs) in the soil samples were produced in glucose-crude oil medium extracellular poly-
determined from the extracted fractions above mentioned mers with higher content of protein (32.57%) than poly-
using a Hewlett–Packard 6890 GC system equipped with a mers synthesized in glucose-mineral light oil (10.77%). In
HP-5-MS-capillary column (30 £ 0.32 mm I.D.). Helium this context, our results show that O anthropi strain AD2
(1.6 ml/min) was utilized as carrier gas. The determinations can produce signiWcant amounts of extracellular polymers
were performed using the following temperature program: in the presence of diVerent hydrocarbons although these
40 °C held 1 min isothermal, heating rate 4 °C/min up to compounds can aVect the chemical composition of the
310 °C, Wnal temperature held for 1.5 min. Injector and extracellular polymers.
detector temperatures were 250C and 300 °C, respectively. The extracellular biopolymers synthesized in glucose
n-alkanes and PAH were detected using a mass detector NB medium showed a wide emulsifying activity, crude oil
5872 (Hewlett–Packard) and the library utilized was Wiley being the substrate most eVectively emulsiWed followed by
275. mineral light oil (Table 3). Thus, we found that all extracel-
lular biopolymers had a noticeable activity on crude oil;
however, the speciWcity of biopolymers was modiWed by
Results the conditions used for culture of the strain AD2. For exam-
ple, extracellular biopolymers extracted from media with
Taxonomical characterization of strain AD2 mineral light oil were most active on toluene. However,
mineral light oil and mineral heavy oil were not emulsiWed
The initial characterization of strain AD2 revealed that they by the polymers produced on crude oil. Finally, none of the
are Gram negative rods. Percentages similarity values isolated biopolymers produced by O. anthropi showed bio-
obtained after pair-wise alignment of the sequence of 16S surfactant activity.

123
J Ind Microbiol Biotechnol (2008) 35:1493–1501 1497

Table 2 Yield production (g/l of culture medium) and chemical media amended with n-octane, xylene, toluene, mineral light oil,
composition (percentage of carbohydrates and proteins) of EPS mineral heavy oil, and crude oil media
synthesized by Ochrobactrum anthropi strain AD2 in glucose NB
Carbon source of EPS culture media production Yield production (g/l) Chemical composition

Carbohydrates (%) Proteins (%)

Glucose 0.5 § 0.1 72.79 § 3.91 18.3 § 1.56

Glucose + n-octane 0.71 § 0.1 60.82 § 2.39 26.99 § 1.72
Glucose + xylene ND ND ND
Glucose + toluene ND ND ND
Glucose + mineral light oil 0.65 § 0.1 78.97 § 4.38 10.77 § 0.48
Glucose + mineral heavy oil 0.94 § 0.1 66.14 § 2.35 14.35 § 1.91
Glucose + crude oil 0.47 § 0.1 64.35 § 1.26 32.57 § 3.55
Values are mean § standard error of three replicates
ND Growth and extracellular polymers production was not detected

Table 3 Emulsifying activity of EPS emulsiWer produced by O anthropi strain AD2 in glucose media amended or un-amended (control) using
n-octane, toluene, xylene, mineral light oil, mineral heavy oil and crude oil
Growth medium for Emulsifying activity using following substrate (%)
EPS emulsiWer production
Octane Toluene Xylene Light oila Heavy oila Crude

NBa 37.5 § 2.7 28.8 § 1.3 22.5 § 4.6 51.2 § 2.4 28.8 § 3 88.7 § 4.2
NB-octane 38.1 § 0.6 25 § 1.3 23.2 § 2 56.1 § 1.2 31.1 § 0.4 95.1 § 3.3
NB- light oilb 8.16 § 0.2 58.33 § 3.9 10.42 § 3.1 14.58 § 0.7 12.5 § 0.5 85.41 § 5.1
NB- heavy oilb 0 53.19 § 2.8 27.66 § 0.6 32 § 0.9 0 81.25 § 7.2
NB- crude EPS 0 31.25 § 0.3 14.58 § 0.7 0 0 72.92 § 1.4
a
Nutrient broth
b
Mineral oil

Microcosm assays were found among the assays tested, except for the micro-
cosm treated with S200 C + EPS emulsiWer. This treatment
In this study, it has been evaluated the eVectiveness of the remarkably enhanced indigenous microbial population
biopolymer EPS emulsiWer as biostimulating agent and its (Fig. 1) throughout the incubation period (21 days). On the
application in bioremediation processes using microcosm other hand, GC/SM analyses showed that inoculation of
and biopile systems. In soil microcosms, EPS emulsiWer EPS emulsiWer enhanced hydrocarbon removal eYciency
was applied alone or amended with an inorganic NPK fer- when compared to un-amended control soils (Fig. 2). More-
tilizer or the S200 C biostimulating agent. Figure 1 shows over, a signiWcant increase in the elimination of TPH and
the response of indigenous microbial population in treated n-alkanes was detected in the soil microcosm soil treated
and nontreated soil microcosms. In general, no diVerences with NPK + EPS emulsiWer compared to microcosms
treated with inorganic NPK fertilizer alone. In the same
9,0 way, addition of the EPS emulsiWer bioemulsiWer also stim-
log UCF/ g of soil

8,5
ulated the hydrocarbon biodegradation rate in microcosms
8,0
7,5
containing S200 C. As it can be seen in Fig. 2, the percent-
7,0 age of hydrocarbon removed in microcosms treated with
6,5 S200 C + EPS emulsiWer was notably higher than in micro-
6,0
0 3 6 9 12 15 18 21
cosms containing S200 C alone.
Time of treatment [days]
Control NPK EPS emulsifier Biopile systems
NPK+ EPS emulsifier S200 C S200 C + EPS emulsifier

Fig. 1 Total heterotrophic bacteria in soil microcosms amended with Composting processes have been usefully applied in bio-
NPK fertilizer, EPS emulsiWer, S200 C product and un-amended remediation of soil polluted with hydrocarbon. In this con-
microcosm (control) text, the composting processes are able to increase the

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1498 J Ind Microbiol Biotechnol (2008) 35:1493–1501

100

% of hydrocarbon removed
TPH Alkanes
80

60

40

20

0
Control NPK EPS emulsifier NPK + EPS S200 C S200 C + EPS
emulsifier emulsifier
Treatment
Fig. 2 EYciency of TPH and n-alkanes removing in un-amended soil microcosms (control) or amended soil microcosms with NPK fertilizer, EPS
emulsiWer and S200 C, after 21 days of treatment

microbial biodegradation activities and consequently Discussion

enhance the biotransformation of diVerent nutrients such as
hydrocarbons. Under this point of view we have studied the O. anthropi is a Gram negative bacterium belonging to

eVect of the biopolymer EPS emulsiWer in the biodegrada- Proteobacteria with capacity for bioremediation due to its
tion of hydrocarbon using composting technology (biopile capability of degrading a high number of pollutants such as
systems). organophosphorus pesticides, phenol compounds, and
We have investigated the eVects of the addition of bio- petroleum wastes [31]. Its ability of removing heavy metals
surfactant EPS emulsiWer and activated sludge on biopile by producing high amount of exopolysaccharide has also
systems for composting of soil contaminated with petro- been described [31]. Studies of the microbial biodiversity
leum hydrocarbons. Both microbial populations and total during long-term storages of crude oil at diVerent layers of
hydrocarbon biodegradation (Figs. 3, 4) were enhanced in the tank storage, have demonstrated that Ochrobactrum
biopile amended with activated sludge plus biosurfactant spp. were isolated from all the samples collected at each
compared to biopiles amended with activated sludge, AD2 sampling time, suggesting the presence of these microor-
or un-amended control. Thus, our data showed that the ganisms in a viable state [44]. Similarly, Katsivela et al.
addition of both activated sludge and EPS emulsiWer to bio- [24] have reported that in a 14 months land farming treat-
pile systems clearly increases the petroleum hydrocarbon ment, although microbial diversity was decreased with
biodegradation. increased degradation of petroleum hydrocarbons, the gen-
era Enterobacter and Ochrobactrum were always detected
in the land farming treated soil [24].
9,5 O. anthropi strain AD2 was isolated in our laboratory
from activated sludge of the wastewater treatment plant of
log CFU/g of soil

9,0
an oil reWnery and it could be considered as an indigenous
8,5
crude oil microorganism grown in the reWnery oil com-
8,0 pounds. This strain was selected among other isolates
7,5 because it was able to grow in the hydrocarbon culture
7,0 media and due to its property of producing high amount of
exopolymers with emulsifying activity against diVerent
6,5
0 10 20 30 40 50 60 hydrocarbon compounds. Thus, O. anthropi strain AD2
Time of treatment [days] produces polymers under diVerent culture conditions and in
A B C D the presence of hydrophobic substances. However, culture
medium modiWes chemical composition and emulsifying
Fig. 3 Evolution of total heterotrophic bacteria in control (un-amend- activity of strain AD2 extracellular biopolymers (EPS
ed) composting biopiles and composting biopiles amended with
activated sludge and EPS emulsiWer bioemulsiWer, after 60 days
emulsiWer). Most polymers studied here have shown high
of treatment A control, B sludge, C sludge + EPS emulsiWer, D EPS emulsifying activities. This suggests that O. anthropi could
emulsiWer produce the emulsiWer polymer after being inoculated into

123
J Ind Microbiol Biotechnol (2008) 35:1493–1501 1499

Fig. 4 EYciency of hydrocar- 120

% hydrocarbon degradation
bons removing in control
(un-amended) biopile systems, 100
and biopiles systems amended
with activated sludge and EPS 80
emulsiWer, after 60 days of
60
treatment. A control, B sludge,
C sludge + EPS emulsiWer,
40
D EPS emulsiWer, Naphthalene
20

0
A B C D

Treatment
Alkanes Prystane Phytane Pregnans Naphthalenes TPH

polluted environmental sites, thus, be useful for in situ bio- and the S200 C oleophilic commercial product. The pri-
remediation treatment. The ability of all the polymers stud- mary limiting factors in the microbial degradation of petro-
ied to emulsify crude oil is also noteworthy, as they are its leum are nitrogen and phosphorous concentrations. These
emulsifying activity comparing to chemical surfactants. nutrients are important to cellular production and their sup-
Thus, the emulsifying capacity of EPS emulsiWer was plementation increases the hydrocarbon degradation eVec-
always higher than that compared to Tween 20, Tween 80 tiveness [38]. The results obtained have shown that the
and Triton X100 chemical surfactants [27]. application of NPK fertilizer stimulated microbial popula-
The persistence of hydrocarbons within the ecosystem tion at the beginning of the soil treatment (until 7 days of
is due to the low aqueous solubility that limits their incubation). However, at the end of the soil treatment
availability to hydrocarbon degrading microorganisms; (21 days) microbial count decreased below un-amended
bioemulsiWers can emulsify hydrophobic compounds, form controls. In contrast, combined treatment of NPK and EPS
stable emulsion, increase hydrocarbon solubility and conse- emulsiWer enhanced steadily bacterial growth but it was
quently enhance the bioavailability in the environment [34]. able to maintain higher number of microorganisms at the
Thus, they can stimulate the growth of hydrocarbon degrad- end of experiments (21 days). This result suggests that EPS
ing bacteria, improving their capacity to utilize these com- emulsiWer could be considered as a useful emulsiWer that
pounds [39]. increases the bioavailability of hydrocarbons to bacteria,
There is a useful diversity of biosurfactants and bioemul- favoring the use of hydrocarbon as carbon and energy
siWers due to the wide variety of producer microorganisms source. This agrees with the highest percentage of hydro-
[6]. The EPS emulsiWer is an exopolysaccharide which is carbons eliminated in microcosms added with inorganic
produced during the stationary phase of growth (after fertilizer and EPS emulsiWer.
7 days of incubation). This biopolymer can be included in According to commercial indications, S200 C product
the high molecular weight exopolymer group [35] and it is selectively stimulates hydrocarbon degrader microorgan-
able to eYciently emulsify petroleum hydrocarbons, but isms and not other type of bacteria, consequently the spe-
unable to reduce surface tension. ciWc natural selection of indigenous hydrocarbon degraders
It has been described that chemical composition and promotes a quicker degradation of contaminants. Our
functional properties of exopolymers could be inXuenced experiments have revealed that the addition of S200 C to
by the nutritional composition of culture media where the soil microcosm systems enhanced the percentage of
bacteria are growing [37]. Thus, yield production, chemical TPH removed compared to un-amended control 52.2%
composition and emulsifying activity of the exopolymers (4,452 ppm eliminated) and 26.3% (2,243 ppm), respec-
depend not only on the producer strain but also on the cul- tively. However, signiWcant diVerences in the number of
ture conditions [14, 29]. These chemical modiWcations total heterotrophic bacteria were not observed. Finally,
could be responsible of the diVerent emulsifying activity when the bioemulsiWer EPS emulsiWer was added in combi-
detected in the EPS emulsiWer according to the growth nation with S200 C, stimulation in microbial growth and oil
media where the strain AD2 was cultured. hydrocarbon biodegradation was detected. Thus, under
The eVectiveness of EPS emulsiWer as a biostimulating these experimental conditions, the amount of TPH removed
agent in oil bioremediation processes was evaluated in the at the end of the treatment (21 days) was near 6,500 ppm
present study using oil contaminated soil microcosms. The (76.3%).
EPS emulsiWer was applied alone or amended with other Bioremediation is not a new strategy for oil hydrocarbon
biostimulating products such as an inorganic NPK fertilizer removal but in many cases in situ remediation shows a

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1500 J Ind Microbiol Biotechnol (2008) 35:1493–1501

small rate of degradation. This could be associated with the 5. Avidano L, Gamalero E, Cossa GP, Carraro E (2005) Character-
microorganism’s availability to degrade, to low solubility ization of soil health in an Italian polluted site by using microor-
ganisms as bioindicators. Appl Soil Ecol 30:21–33
of the contaminant and to speciWc nutrient limitation. The 6. Banat RS, MakkarRS, Cameotra SS (2000) Potential commercial
results obtained suggest that EPS emulsiWer usefully applications of microbial; surfactants. Appl Microbiol Biotechnol
enhances the solubility and consequently the bioavailability 53:495–508
of hydrocarbon compounds to speciWc oil degrader micro- 7. Barathi S, Vasudevan N (2001) Utilization of petroleum hydro-
carbons by Pseudomonas Xuorescens isolated from a petroleum-
organisms previously stimulating by the S200 C product. contaminated soil. Environ Int 26:413–416
Thus, the use of this combined treatment may be useful for 8. Barkay T, Nayon-Venezia S, Ron EZ, Rosenberg E (1999)
the study of oil hydrocarbon degradation and for bioreme- Enhancement of solubilization and biodegradation of polyaro-
diation purposes. matic hydrocarbons by the bioemulsiWer alasan. Appl Environ
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Biopiles are used to reduce the concentration of petro- 9. Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quanti-
leum constituents in excavated soils through the use of bio- Wcation of microgram quantities of protein utilising the principle
degradation. This technology can be performed onsite and of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248–254
involves keeping contaminated soils into piles and stimulat- 10. Calvo C, Martínez-Checa F, Toledo FL, Porcel J, Quesada E
(2002) Characteristics of bioemulsiWers synthesized in crude oil
ing aerobic microbial activity within the soils through the media by Halomonas eurihalina and their eVectiveness in the iso-
addition of oxygen, minerals, nutrients, and moisture. The lation of bacteria able to grow in the presence of hydrocarbons.
enhanced microbial activity results in the breakdown of Appl Microbiol Biotechnol 60:347–351
the petroleum constituents in the soil. 11. Calvo C, Toledo FL, Pozo C, Martínez-Toledo MV, González-
López J (2004) Biotechnology of bioemulsiWers produced by
Activated sludges can be considered as an useful source microorganisms. J Food Agric Environ 2:238–243
of microorganisms with a wide range of metabolic activi- 12. Cooper DJ, Goldenberg BG (1987) Surface active agents from two
ties. Our results demostrated that the addition to biopiles of Bacillus species. Appl Environ Microbiol 54:224–229
activated sludge enhanced the bioremediation process; 13. Chen SY, Lu WB, Wei YH, Chen WM, Chang JS (2007) Im-
proved production of biosurfactant with newly isolated Pseudomo-
however, this positive eVect can be increased by the addi- nas aeruginosa S2. Biotech Progr 23:661–666
tion of activated sludge plus biosurfactant EPS emulsiWer, 14. Desai JD, Banat M (1997) Microbial production of surfactant and
suggesting that the application of the composting technol- their commercial potential. Microbiol Mol Biol Rev 61:47–61
ogy for the bioremediation of oil contaminated soil could 15. Déziel E, Paquette G, Villemur R, Lépine F, Bisaillon JG (1996)
Biosurfactant production by a soil Pseudomonas strain growing on
be improved with the addition of both products. In conclu- polycylic aromatic hydrocarbons. Appl Environ Microbiol
sion, our results suggest that a combined treatment includ- 62:1908–1912
ing bioemulsiWers such as EPS emulsiWer could be an 16. Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F (1956)
eYcient tool to improve the yield of hydrocarbons degrada- Colorimetric method for determination of sugars and related sub-
stances. Anal Chem 28:350–356
tion in bioremediation processes. 17. Fietcher A (1992) Biosurfactants: moving towards industrial
application. Trends Biotechnol 10:208–217
Acknowledgments This research has been supported by several 18. Guerra-Santos LH, Kappeli O, Flechter A (1986) Dependence of
projects of Ministerio de Educacion y Ciencia (CICYT: REN 200- Pseudomonas aeruginosa continuous culture biosurfactant pro-
0384-P4-02) and Ministerio de Medio Ambiente (MMA. A4872007/ duction on nutritional and environmental factors. Appl Microbiol
20-01.1). I Uad was granted by Agencia Española de Cooperación Biotechnol 24:443–448
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