Los Hongos Entomopatógenos Endófitos Mejoran

Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica y de Montes
Departamento de Ciencias y Recursos Agrícolas y Forestales
TESIS DOCTORAL
Los hongos entomopatógenos endófitos mejoran

la nutrición férrica y el crecimiento vegetal
Doctoranda: Dª Silvia Raya Díaz
Directores:
Prof. Dr. D. Enrique Quesada Moraga
Dr. D. Antonio Rafael Sánchez Rodríguez
Córdoba, 2017
TITULO: Los hongos entomopatógenos endófitos mejoran la nutrición férrica y el
crecimiento vegetal
AUTOR: Silvia Raya Díaz
© Edita: UCOPress. 2018

Campus de Rabanales
Ctra. Nacional IV, Km. 396 A
14071 Córdoba
www.uco.es/publicaciones
publicaciones@uco.es
Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica y de Montes
Departamento de Ciencias y Recursos Agrícolas y Forestales
Los hongos entomopatógenos endófitos mejoran

la nutrición férrica y el crecimiento vegetal
Tesis Presentada por Dª Silvia Raya Díaz para optar al grado de

Doctora por la Universidad de Córdoba
Córdoba,
rdoba, noviembre
nov
oviembre 2017
ov 201
Fdo.: Silvia Raya Díaz
V°B° del Director B° del Codirector

V°B°
o.:
Fdo.:
Fdo.:
Prof. Dr. D. Enrique Quesada Moraga Dr. D. Antonio R. Sánchez Rodríguez

Catedrático de Universidad PhD Research Officer
E.T.S.I.A.M. D.p.t.o. C.R.A.F. School of Environment, Natural
Universidad de Córdoba Resources and Geography,
Environment Centre Wales
Bangor University
D. Enrique Quesada Moraga, Doctor Ingeniero Agrónomo, Profesor
Catedrático de Producción Vegetal de la Universidad de Córdoba en el
Departamento de Ciencias y Recursos Agrícolas y Forestales de la
E.T.S.I.A.M, y Responsable del Grupo PAIDI AGR 163 “Entomología
Agrícola” y el Doctor Ingeniero Agrónomo Antonio Rafael Sánchez
Rodríguez, PhD Research Officer in the School of Environmental, Natural
Resources and Geography, Environment Centre Wales, Bangor University
INFORMAN: que el trabajo “Los hongos entomopatógenos endófitos

mejoran la nutrición férrica y el crecimiento vegetal” realizado bajo
nuestra dirección por la licenciada en Ciencias Ambientales Dª Silvia Raya
Díaz, lo consideramos ya finalizado y puede ser presentado para su
exposición y defensa como Tesis Doctoral en el Departamento de Ciencias
y Recursos Agrícolas y Forestales de la Universidad de Córdoba.
Córdoba, noviembre de 2017
Doctoranda:
da: Dª. Silvia Raya Díaz
Dí
Fdo.:
V°B° del Director V°B° del Codirector

Fdo.: Fdo.:
Prof. Dr. D. Enrique Quesada Moraga Dr. D. Antonio R. Sánchez Rodríguez

Catedrático de Universidad PhD Research Officer
E.T.S.I.A.M. D.p.t.o. C.R.A.F. School of Environment, Natural
Universidad de Córdoba Resources and Geography,
Environment Centre Wales
Bangor University
TÍTULO DE LA TESIS:
Los hongos entomopatógenos endófitos mejoran la nutrición férrica y el

crecimiento vegetal.
DOCTORANDO/A:
Silvia Raya Díaz
INFORME RAZONADO DEL/DE LOS DIRECTOR/ES DE LA TESIS

(se hará mención a la evolución y desarrollo de la tesis, así como a trabajos y publicaciones derivados de la misma).
La Doctoranda, Dª. Silvia Raya Díaz, se incorporó al Grupo de Investigación

AGR 163-Entomología Agrícola contratada con fecha 1 de junio de 2014
dentro del Proyecto de Excelencia de la Junta de Andalucía P11-AGR-7681
titulado “Estrategias sostenibles de control de plagas basadas en el
establecimiento endofítico y en la rizosfera de Hongos Entomopatógenos”
con fecha de finalización 30 de marzo de 2018. Esta Tesis Doctoral ha sido
presentada dentro del plazo de 3 años de duración del presente Proyecto.
Esta Tesis Doctoral cumple el requisito establecido por la Universidad de
Córdoba para su presentación como compendio de artículos.
Los distintos objetivos planteados en esta Tesis Doctoral se abordan en

capítulos como trabajos independientes con formato artículo, ya que todos
ellos han sido publicados como “full lenght papers”, como se indica a
continuación:
Sánchez-Rodríguez AR, Raya-Díaz S, Zamarreño AM, García-Mina JM, del

Campillo MC, Quesada-Moraga E. 2017. An endophytic Beauveria bassiana
strain increases spike production in bread and durum wheat plants and
effectively controls cotton leafworm (Spodoptera littoralis) larvae.
Biological Control, pp: 1049-9644. doi:10.1016/j.biocontrol.2017.01.012
Raya-Díaz S, Quesada-Moraga E, Barrón V, del Campillo MC, Sánchez-

Rodríguez AR. 2017. Redefining the dose of the entomopathogenic fungus
Metarhizium brunneum (Ascomycota: Hypocreales) to increase Fe
bioavailability and promote plant growth in calcareous and sandy soils.
Plant and Soil. 418: 387-404, doi:10.1007/s11104-017-3303-0.
Raya-Díaz S, Sánchez-Rodríguez AR, Segura-Fernández JM, del Campillo

MC, Quesada-Moraga E. 2017. Entomopathogenic fungi-based mechanisms
for improved Fe nutrition in sorghum plants grown on calcareous
substrates. PLoS ONE 12:(e0185903), doi: 10.1371/journal.pone.0185903
Por tanto, se han publicado tres trabajos en revistas de mayor impacto Q1

del Journal of Citation Reports (JCR). El primer artículo en la revista
Biological Control Factor de Impacto JCR: 2.3, Q1 (11/93), se trata de una
de las revistas de mayor índice de impacto donde se puede publicar un
trabajo de control de plagas en el área de Entomología, pues las que la
preceden se refieren a aspectos de investigación básica en fisiología de
insectos. Además, se ha publicado un segundo trabajo en la revista Plant
and Soil, situada en Q1 en el área de Agronomía Factor de Impacto JCR:
3.1, Q1 (11/83). Finalmente se ha publicado un trabajo en la revista PLoS
ONE del primer cuartil Q1 con Factor de Impacto JCR: 2.8, Q1 (15/64) en
ciencias multidisciplinarias.
Por todo ello, se autoriza la presentación de la tesis doctoral.
Córdoba, 20 de Noviembre de 2017
Firma del/de los director/es
Fdo.: Enrique Quesada Moraga Fdo.: Antonio R. Sánchez Rodríguez

Los trabajos incluidos en esta Tesis Doctoral han sido financiados
por el Proyecto de Investigación de Excelencia de la Consejería de
Economía, Innovación, Ciencia y Empleo de la Junta de Andalucía
convocatoria 2011, con referencia AGR-P11-7681, titulado “Estrategias
sostenibles de control de plagas basadas en el establecimiento endofítico y
en la rizosfera de Hongos Entomopatógenos”. La doctoranda ha contado
con la ayuda de una beca de Personal Investigador en Formación (PIF) de la
Consejería de Economía, Innovación, Ciencia y Empleo de la Junta de
Andalucía para la realización de la presente Tesis Doctoral.
A Pepe y a mis padres
por cuidar de él,
Agradecimientos
Así como no existen personas pequeñas ni vidas sin importancia,
tampoco existe trabajo insignificante. Educar a una persona no es hacerle
aprender algo que no sabía sino hacer de él alguien que no existía, por
esto, quiero agradecer a mi director Prof. Dr. D. Enrique Quesada Moraga
su esfuerzo por enseñarme el apasionante mundo de la entomología,
espero con más alegrías que tristezas.
Las grandes obras no son llevadas a cabo por la fuerza sino por la
perseverancia, es por esto que no puedo dejar de agradecer al Dr. D.
Antonio R. Sánchez Rodríguez su ayuda incondicional y su paciencia que sin
duda producían un efecto mágico ante el cual las dificultades y los
obstáculos desaparecían.
Hay personas que brillan con luz propia y hacen más bello el
camino estando a su lado. Para alcanzar la meta no he viajado sola sino
que me han acompañado mis amigos y compañeros (Adri, Álex, Carmen,
Dani, Gloria, José Manuel, María, Meelad, Natalia, Pedro, Sandra y
MªVictoria). Hoy estoy aquí para celebrar mi éxito, que no hubiese sido
posible sin vuestra ayuda.
Un líder es alguien que conoce el camino, anda el camino y

muestra el camino. Gracias Inma y gracias Campi por guiarme en este
recorrido.
La amistad, si se alimenta solo de gratitud, equivale a una

fotografía que con el tiempo se borra. José María y Mª Ángeles vosotros
siempre tendréis un lugar en mi corazón.
Muchas gracias a todos y todas.

Resumen
Los ascomicetos mitospóricos entomopatógenos (AME) son un

componente importante de la microbiota de los ecosistemas naturales,
agrícolas y forestales, donde regulan las poblaciones de insectos y ácaros
fitófagos, pero además, pueden ser utilizados de forma deliberada para el
control de plagas de acuerdo con distintas estrategias, incluso de forma
inundativa, como micoinsecticidas. Más allá, trabajos llevados a cabo
principalmente en la última década resaltan que la función ecológica de los
AME sobrepasa su condición de entomopatógenos, pues sus
sorprendentes relaciones con las plantas, como endófitos, en el filoplano o
en la rizosfera, abren nuevos horizontes en la protección y producción
vegetal. Los resultados de esta tesis doctoral ponen de manifiesto los
beneficios asociados al carácter endófito y competente en la rizosfera de
cepas de AME, principalmente de los géneros Beauveria y Metarhizium,
sobre distintas plantas cultivadas, no sólo por su impacto en el control de
plagas, sino también sobre su crecimiento y nutrición férrica en suelos
calcáreos.
En el capítulo II se ha evaluado el efecto de la colonización

endofítica de plantas de trigo blando y trigo duro por la cepa EABb 04/01-
Tip de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. (Ascomycota; Hypocreales)
mediante distintas estrategia de aplicación, tratamiento de semilla (SE),
aplicación al suelo (SU), o pulverización foliar (PU), sobre el crecimiento,
rendimiento, niveles de fitohormonas y absorción de nutrientes, y en
paralelo, el efecto de este comportamiento endofítico sobre la mortalidad
de larvas de Spodoptera littoralis Boisduval (Lepidoptera; Noctuidae) que
consumen tejido foliar colonizado. La cepa EABb 04/01-Tip colonizó con
éxito las plantas de trigo blando y duro, e incluso el hongo fue re-aislado
del grano de las plantas inoculadas en los tratamientos SE y SU. El
tratamiento SE incrementó un 40% el rendimiento del grano y la longitud
de la raíz en trigo blando en comparación con las plantas control. La
mortalidad de larvas del noctuido alimentadas con hojas de las plantas
inoculadas varió desde el 30% al 57%, en los tratamientos SE y PU
respectivamente.
En el capítulo III se determinó la dosis mínima de la cepa EAMa

01/58-Su de Metarhizium brunneum Petch. (Ascomycota; Hypocreales) que
aplicada al suelo, produce efectos sobre el crecimiento vegetal y la
biodisponibilidad de Fe en plantas que crecen sobre suelos calcáreos y no
calcáreos, con el objetivo de optimizar su utilización. Para ello se diseñó un
ensayo in vitro con el objetivo de evaluar la capacidad de las cepas EABb
04/01-Tip, EAMa 01/58-Su y EAIf 10/04-Msp de Isaria farinosa (Holmsk.)
Fr. para movilizar Fe a partir de nueve óxidos de Fe incluyendo ferrihidrita,
hematites, goethita y magnetita, que difieren en composición, tamaño de
partícula y cristalinidad. Además, se realizó un ensayo en maceta, para
explorar la capacidad de los hongos de mejorar la nutrición de Fe y
promover el crecimiento de plantas de sorgo y girasol, en el que se
aplicaron al suelo cinco dosis fúngicas (0, 5×102, 5×104, 5×106 y 5×108
conidios ml-1) de una suspensión de conidios de la cepa EAMa 01/58-Su. El
suelo calcáreo, debido a su baja disponibilidad de Fe, indujo clorosis en las
plantas de sorgo, a diferencia del suelo no calcáreo utilizado como control.
Los resultados del ensayo in vitro mostraron que las tres especies fúngicas
aumentaron la disponibilidad de Fe de forma diferente en función del
tamaño de partícula y cristalinidad de las fuente de Fe utilizadas. Las cepas
EABb 04/01-Tip y EAIf 10/04-Msp aumentaron el pH del medio de cultivo,
mientras que la cepa EAMa 01/58-Su no produjo efecto. Los resultados del
cultivo en maceta mostraron que las dosis más altas (5×106 y 5×108
conidios ml-1) de la cepa EAMa 01/58-Su aliviaron los síntomas de clorosis
Fe de las plantas de sorgo crecido en el suelo calcáreo, y aumentaron la
altura de la planta y la producción de inflorescencias de girasol cultivado
en ambos suelos.
En el capítulo IV se determinó in vitro la capacidad de las cepas

EAMa 01/58-Su, EABb 04/01-Tip y EAIf 10/01-Msp para aumentar la
biodisponibilidad de Fe en medios calcáreos o no calcáreos que contienen
diversas fuentes de Fe (ferrihidrita, hematites y goethita), y se evaluó en
maceta la influencia del método de inoculación SE, SU y PU con las cepas
EAMa 01/58-Su y EABb 04/01-Tip, sobre la extensión de la colonización
endofítica y la mejora en la nutrición de Fe en plantas de sorgo cultivadas
en un sustrato calcáreo. Los resultados mostraron que las tres cepas
aumentaron la disponibilidad de Fe en el ensayo in vitro. La cepa más
eficiente fue EAMa 01/58-Su, que disminuyó el pH del medio calcáreo, lo
que sugiere que utilizó una estrategia diferente (probablemente, mayor
producción de ácidos orgánicos), que los otros dos hongos, que elevaron el
pH del medio no calcáreo. Los resultados del ensayo en maceta mostraron
que los tres métodos de inoculación utilizados, condujeron a diferencias en
el aislamiento de los tejidos vegetales, incrementaron la altura, el
contenido de clorofila foliar, el Fe de la biomasa aérea, la longitud total de
la raíz y la densidad de raíces finas. Sin embargo, el tratamiento SU fue el
más eficaz, por su mayor efecto y persistencia sobre el contenido de
clorofila foliar cuando los síntomas de clorosis férrica eran más evidentes
en las plantas control, y tuvo un mayor efecto sobre la longitud total de la
raíz y densidad de las raíces finas.
Los resultados de esta tesis doctoral nos revelan importantes
beneficios asociados al empleo de AME en el control biológico. Más allá del
control de plagas, hemos informado de la mejora del crecimiento de varias
especies mono y dicotiledóneas, así como de la nutrición férrica en suelos
calcáreos. Si bien el método de aplicación tuvo una influencia en estos
efectos, los tres métodos utilizados, SE, SU y PU, podrían ser utilizados en
función del tipo de cultivo, tipo de fitófago, y condicionantes económicos.
Esta tesis abre nuevos horizontes científicos y de aplicación práctica, pues
es necesario profundizar en las bases fisiológicas y moleculares de la
relación endófito-planta, e incluso endófito-planta-fitófago, para potenciar
los efectos de mejora de la nutrición y crecimiento del cultivo, sin olvidar el
impacto de la estrategia sobre otros estreses abióticos.
Palabras clave: Endófito, rizosfera, clorosis férrica, método de

inoculación, longitud raíz, Metarhizium brunneum, Beauveria bassiana,
Isaria farinosa, Spodoptera littoralis, Sorgo, Girasol, Trigo.
Abstract
The entomopathogenic mitosporic ascomycetes (EMA) are an important

component of the microbiota of natural, agricultural and forest
ecosystems, where they regulate insect populations and phytophagous
mites, but can also be used deliberately for the control of pests in
accordance with different strategies, including inundative release as
mycoinsecticides. Furthermore, works carried out mainly in the last decade
highlight that the ecological role of EMAs exceeds their status as
entomopathogens, because of their surprising associations with plants, as
endophytes, in the phylloplane or in the rhizosphere, open new horizons in
Plant protection and Production. The results of this Doctoral Thesis show
the benefits associated with the endophytic and rhizosphere competent
behavior of strains of EMA, mainly of the genera Beauveria and
Metarhizium, on different cultivated plants, not only for their impact on
the control of pests, but also about its growth and ferric nutrition in
calcareous soils.
In chapter II, the effect of the endophytic colonization of bread

wheat and durum wheat plants by the strain EABb 04/01-Tip of Beauveria
bassiana (Bals.) Vuill. (Ascomycota; Hypocreales) has been evaluated
through different application strategies, seed dressing (SD), soil application
(SA), or leaf spraying (LS), on growth, yield, phytohormone levels and
nutrient uptake, and in parallel, the effect of this endophytic behavior on
mortality of larvae of Spodoptera littoralis Boisduval (Lepidoptera;
Noctuidae) that consumed colonized leaf tissue. The EABb 04/01-Tip strain
successfully colonized bread and durum wheat plants, and even the fungus
was re-isolated from the grain of inoculated plants in the SD and SA
treatments. The SD treatment increased grain yield up to a 40% and root
length in bread wheat in comparison to control plants. The mortality of
larvae of the noctuid fed with leaves of the inoculated plants varied from
30% to 57%, for SD and LS, respectively.
In chapter III, it was investigated the minimum dose of EAMa

01/58-Su Metarhizium brunneum Petch (Ascomycota; Hypocreales) that
applied to soil produces a positive effect on plant growth and Fe nutrition
in plants grown on calcareous and non-calcareous soils, with the aim of
optimizing their use. To this end, a preliminary in vitro assay was designed
to evaluate the capacity of several EMA strains (EABb 04/01-Tip, EAMa
01/58-Su and EAIf 10/04-Msp of Isaria farinosa (Holmsk.) Fr.) to mobilize
Fe from nine Fe sources (Fe oxides including ferrihydrite, hematite,
goethite and magnetite), which differ in composition, particle size and
crystallinity. In addition, a pot trial was conducted to explore the ability of
the M. brunneum EAMa 01/58-Su strain to improve Fe nutrition and
promote the growth of sorghum and sunflower plants. In this experiment,
five fungal doses (0, 5×102, 5×104, 5×106 y 5×108 conidia ml-1) of a
suspension of conidia were applied to the surface of soil. The calcareous
soil, due to its low availability of Fe, induced Fe chlorosis in sorghum
plants, unlike the non-calcareous soil used as a control. The results of the
in vitro test showed that the three fungal species increased Fe availability
differently depending on the particle size and crystallinity of the Fe
sources. The strains EABb 04/01-Tip and EAIf 10/04-Msp increased the pH
of the culture medium, while the strain EAMa 01/58-Su produced no
effect. The results of the pot culture showed that the highest doses (5×106
and 5×108 conidia ml-1) of the strain EAMa 01/58-Su alleviated the Fe
chlorosis symptoms in sorghum plants grown in the calcareous soil, and
increased the plant height of and the production of inflorescences of
sunflower grown in both soils.
In chapter IV, the potential of strains EAMa 01/58-Su, EABb 04/01-

Tip and EAIf 10/01-Msp to increase the bioavailability of Fe in calcareous or
non-calcareous media containing several sources of Fe (ferrihydrite,
hematite and goethite) was determined in vitro. In a second experiment,
the influence of the inoculation methods SD, SA and LS was assessed using
the strains EAMa 01/58-Su and EABb 04/01-Tip, on the extent of
endophytic colonization and the improvement in Fe nutrition in sorghum
plants grown on a calcareous substrate. The results showed that all the
three strains increased Fe availability. The most efficient strain was EAMa
01/58-Su, which decreased the pH of the calcareous medium, suggesting
that it used a different strategy (probably, greater production of organic
acids), than the other two fungi, which raised the pH of the medium not
calcareous. The results of the pot trial showed that the three inoculation
methods led to differences in the isolation of plant tissues, increased plant
height, leaf chlorophyll content, Fe of aboveground biomass, total length
of root and the density of fine roots. However, the SA treatment was the
most effective, due to its greater effect and persistence on the foliar
chlorophyll content (SPAD values) when the symptoms of Fe chlorosis were
more evident in the control plants, and had a greater effect on the total
length of the root and density of fine roots.
The results of this Doctoral Thesis reveal important benefits

associated with the use of EMA in biological control. Beyond the control of
pests, we have reported the improvement of the growth of several mono
and dicotyledonous species, as well as ferric nutrition in calcareous soils.
Although the method of application had an influence on these effects, the
three methods used, SD, SA and LS, could be used depending on the type
of crop, type of phytophagous, and economic conditions. This thesis opens
new scientific horizons and of practical application, since it is necessary to
deepen in the physiological and molecular bases of the relation
endophyte-plant, and even endophyte-plant-phytophagous, to enhance
the effects of improvement of nutrition and crop growth, and even the
impact of the strategy on other abiotic stresses.
Keywords: Endophyte, rhizosphere, iron chlorosis, inoculation
method, root length, Metarhizium brunneum, Beauveria bassiana, Isaria

farinosa, Spodoptera littoralis, Sorghum, Sunflower, Wheat.
Índice general
CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN 1
I. El Control Biológico, piedra angular del Control Integrado de Plagas 3
II. Los hongos entomopatógenos: más allá del control de plagas 7
II.1. Clasificación y diversidad 7
II.2. Modo de acción de los ascomicetos mitospóricos

Entomopatógenos 8
II.3. Estrategias de uso de los ascomicetos mitospóricos

entomopatógenos 11
II.4. Presencia natural de ascomicetos mitospóricos

Entomopatógenos 13
II.4.1. En los artrópodos 13
II.4.2. En el suelo 15
II.4.3. Asociaciones con las plantas: como endófitos y en el filoplano 18
III. Nuevas funciones ecológicas de los ascomicetos mitospóricos

entomopatógenos y sus aplicaciones 23
III.1. Protección de la planta frente a factores bióticos 25
III.1.1. Plagas de insectos 25
III.1.2. Enfermedades de las plantas 26
III.1.2.1. Supresión directa de patógeneops de plantas 26
III.2. Protección de la planta frente a factores abióticos 30
I
III.3. Microorganismos que mejoran la nutrición y crecimiento de las
plantas 31
III.3.1. Bacterias promotoras del crecimiento vegetal 32
III.3.1.1. Bacterias intracelulares 32
III.3.1.2. Bacterias extracelulares 34
III.3.2. Hongos 35
III.3.2.1. Hongos asociados a las raíces 35
III.3.2.2. Hongos formadores de microrrizas 37
III.3.3. Los hongos entomopatógenos en la nutrición y crecimiento

de las plantas 39
IV. Objetivos de la presente Tesis Doctoral 41
V. Referencias 43
CAPÍTULO II. An endophytic Beauveria bassiana strain

increases spike production in bread and durum wheat
plants and effectively controls cotton leafworm
(Spodoptera littoralis) larvae 61
1. Introduction 65
2. Material and methods 68
2.1. Experimental design 68
2.2. Plant material, soil properties and cropping 71
2.3. Fungus cultures and inoculation methods 72
2.4. Soil and plant assessments 74
2.5. Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidoptera; Noctuidae)

Culturing and feeding on inoculated plant leaves. Larval mortality 76
II
2.6. Statistical analysis 77
3. Results 78
3.1. Experiment 1: effect of B. bassiana on bread wheat growth 78
3.2. Experiment 2: effect of B. bassiana on bread and durum wheat

yield 83
3.3. Experiment 3: effect of B. bassiana on bread wheat yield and root

length 94
3.4. Experiment 4: survival of S. littoralis larvae fed with endophytically

colonized bread wheat 98
4. Discussion 99
5. Conclusions 105
6. Acknowledgments 106
7. Supplementary data 106
8. References 107
CAPÍTULO III. Redefining the dose of the

entomopathogenic fungus Metarhizium brunneum
(Ascomycota; Hypocreales) to increase Fe
bioavailability and promote plant growth in calcareous
and sandy soils 115
1. Introduction 117
2. Materials and methods 119
2.1 In vitro assay 119
2.1.1. Synthetic iron oxides 119
III
2.1.2. Fungal strains, experimental design and analysis 120
2.2. In vivo assay 124
2.2.1. Soil properties 124
2.2.2. Plant material, fungal treatment and experimental design 124
2.2.3. Soil and plant analyses 127
2.3. Statistical analyses 128
3. Results 129
3.1. In vitro assay 129
3.2. In vivo assay 136
3.2.1. Colony Forming Units (CFU) 136
3.2.2. SPAD chlorophyll measurements 137
3.2.3. Plant growth 138
3.2.4. Total mineral nutrient contents in above–ground plant

biomass 141
3.2.5. Total mineral nutrient content in rizhospheric soil 145
4. Discussion 145
5. Conclusions 151
6. Acknowledgements 151
8. References 154
IV
CAPÍTULO IV. Entomopathogenic fungi based
mechanisms for improved Fe nutrition in sorghum
plants grown on calcareous substrates 161
1. Introduction 163
2. Materials and methods 167
2.1. In vitro assay 167
2.1.1. Synthetic iron oxides 167
2.1.2. Fungal strains, experimental design, FeDTPA and pH analyses 169
2.2. Pot experiment 171
2.2.1. Artificial substrate 171
2.2.2. Plants and culture 172
2.2.3. Inoculation methods (treatments) and experimental design 173
2.2.4. Substrate analyses: Colony-forming units (CFU) and FeDTPA 174
2.2.5. Fungal re-isolation from plant tissues 176
2.2.6. Plant and root parameters 177
2.2.7. Statistical analysis 179
3. Results 180
3.1. In vitro experiment 180
3.2.1. Colony-Forming Units (CFU) 183
3.2.2. Fungal re-isolation 184
V
3.2.3. Plant growth and LCC 188
3.2.4. Root parameters 191
3.2.5. Nutrient contents of above-ground biomass 193
4. Discussion 195
4.1. In vitro experiment 195
5. Conclusions 204
6. Acknowledgments 205
8. References 210
CAPITULO V. DISCUSIÓN GENERAL 219
Referencias 232
CAPÍTULO VI. CONCLUSIONES 235
CAPÍTULO VII. ANEXOS 240
1. Producción científica derivada de la Tesis Doctoral 241
1.1. Contribución a revistas internacionales de carácter científico

(SCI) 241
1.2. Aportaciones científicas en congresos 242
VI
Índice de Tablas
CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN
Tabla 1. Comparación de los aspectos relacionados con el desarrollo

y aplicación del control químico y el biológico 3
Tabla 2. Especies de plantas colonizadas de manera natural y artificial

por hongos entomopatógenos endófitos 19
Tabla 3. Funciones más importantes de las micorrizas arbusculares en

los sistemas agrarios 38
CAPÍTULO II. An endophytic Beauveria bassiana strain increases spike

production in bread and durum wheat plants and effectively controls
cotton leafworm (Spodoptera littoralis) larvae
Table 1. Description of the experiments 69
Table 2. Mean ± standard error of total plant dry weight (aerial

biomass) and nutrient concentration in aerial biomass of bread
wheat as affected by B. bassiana inoculation method 31 days after
sowing (DAS) in Experiment 1 82
Table 3. Mean ± standard error for dry weight of leaf + stem, spike,
total plant (leaf + stem + spike), total weight of grains, number of
grains per plant and individual weight per grain (upper part), and
mineral nutrient concentration in grain of bread wheat and durum
wheat (bottom part) as affected by the B. bassiana inoculation
method at the termination of Experiment 2 (120 days after sowing
(DAS) for bread wheat, and 100 DAS for durum wheat) 91
VII
Table 4. Mean ± standard error for concentration of phytohormones
over time in the aerial biomass of bread wheat and durum wheat as
affected by B. bassiana inoculation method in Experiment 2. Three
replicates per treatment and sampling occasion. Values followed by
the same letter are not significantly different using Bonferroni’s
multiple comparison test, P < 0.05 93
Table 5. Mean ± standard error for dry weight of leaf + stem, spike,
total plant (leaf + stem + spike), total weight of grains, number of
grains per plant, and individual weight per grain (upper part), and
mineral nutrient concentration in grain (lower part) of bread wheat
as affected by B. bassiana inoculation method at the termination of
Experiment 3 (140 days after sowing) 97
Table 6. Mean ± standard error of mortality (%) and average survival

time (AST) of second instar S. littoralis larvae after 5 days of feeding
with leaf discs from inoculated plants (three inoculation methods
used) and uninoculated (‘control’) bread wheat plants. Thirty larvae
(replicates) were used per treatment and ‘control’ 99
CAPÍTULO III. Redefining the dose of the entomopathogenic fungus

Metarhizium brunneum (Ascomycota, Hypocreales) to increase Fe
bioavailability and promote plant growth in calcareous and sandy
soils
Table 1 In vivo assay. Selected properties of the soils 126
Table 2 In vitro assay. Factorial ANOVA of the slope of the growth

(mm day-1) for each fungus as a function of the Fe oxide and Fe dose
(mean ± standard error, n = 4 Petri dishes per combination of fungal
strain, Fe oxide and Fe dose) 130
Table 3 In vitro assay. Factorial ANOVA of FeDTPA and pH (mean ±

standard error, n = 4 Petri dishes per combination of fungal strain, Fe
oxide and Fe dose) in the medium after culturing the three different
strains for 11 (M. brunneum), 15 (B. bassiana) and 42 (I. farinosa)
days (when each fungal strain fully covered the surface of the Petri
dishes) at 25 °C, as a function of the Fe oxide and Fe dose 134
VIII
Table 4 In vivo assay. Factorial ANOVA for SPAD at the beginning and
at the end of the experiment (mean ± standard error; calcareous
soil: n = 5, non-calcareous soil: n = 6) 137
Table 5 In vivo assay. Factorial ANOVA for plant height (at the
beginning and at the end of the experiment) and above-ground plant
dry weight (without inflorescence for sunflower; mean ± standard
error; calcareous soil: n = 5, non-calcareous soil: n = 6) 140
Table 6 In vivo assay. Factorial ANOVA for total nutrient content in

the above-ground plant biomass of sorghum and sunflower plants,
and in sunflower´s inflorescence, grown on the two different soils
(mean ± standard error with n = 5 for the calcareous soil and n = 6
for the non-calcareous soil). 143
Table S1 In vivo assay. Factorial ANOVA for diameter and dry weight
of sunflower inflorescence (mean ± standard error; calcareous soil:
n= 5, non-calcareous soil: n = 6) 152
Table S2 In vivo assay. Factorial ANOVA for nutrient concentrations

in rhizospheric soil at the end of the experiment (mean ± standard
error with n = 5 for the calcareous soil and n = 6 for the non-
calcareous soil) 153
CAPÍTULO IV. Entomopathogenic fungi based mechanisms for

improved Fe nutrition in sorghum plants grown on calcareous
substrates
Table 1. Factorial ANOVA for the FeDTPA and pH (mean and standard
error, n = 4) of the Czapek-Dox medium after culturing the three
strains at 25 °C for 35 days with each combination of fungus, Fe
oxide (0 or 250 mg L-1) and the presence or absence of CaCO3 181
Table 2. Analysis of variance for above-ground plant dry weights and

micronutrient contents in the biomass of the sorghum plants (mean
± standard error, n = 4) at the end of the experiment (93 DAS) with
each fungus and inoculation method 194
IX
S1 Table. FeDTPA and pH (mean ± standard error, n = 4) 0f the culture
medium after 35 days of fungal growth in the presence of different
sources of Fe (0 or 250 mg L-1) and the presence or absence of CaCO3
(0 or 300 mg L-1) 206
S2 Table. Chlorophyll total concentration (CTC). Chlorophyll total

concentration (CTC) extracted from the two youngest leaves of each
plant (mean ± standard error, n = 4) according to the combination of
fungus and inoculation method at the end of the experiment (93
DAS) 207
S3 Table. Total macronutrient contents of plant biomass and root

parameters. Analysis of variance of macronutrient contents in the
above-ground biomass, root dry weight and root length of sorghum
(mean ± standard error, n = 4) as a function of the fungus and
inoculation method at the end of the experiment (93 DAS) 207
CAPITULO V. DISCUSIÓN GENERAL
Tabla 1. Resumen de los resultados obtenidos 228
X
Índice de figuras
CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN
Fig. 1. Los bioinsecticidas: más allá del control de plagas 5
Fig. 2. Funciones ecológicas inusuales de los hongos entomopatógenos 6
Fig. 3. Clasificación sistemática de los hongos entomopatógenos 9
Fig. 4. Modo de acción general de un ascomiceto mitospórico

entomopatógeno 10
CAPÍTULO II. An endophytic Beauveria bassiana strain increases

spike production in bread and durum wheat plants and effectively
controls cotton leafworm (Spodoptera littoralis) larvae
Fig. 1. Experiment 1: Mean ± standard error of B. bassiana re-

isolation (%) rates from bread wheat leaves and roots as influenced
by inoculation method at different times after sowing (DAS) 79
Fig. 2. Experiment 1: Mean ± standard error of plant height (mean

value ± standard) for bread wheat as influenced by inoculation
method at different times after sowing (DAS) 81
Fig. 3. Experiment 2: The number of Colony Forming Units (CFU,

mean ± standard error) over time in soil treated with B. bassiana and
used to grow bread wheat and durum wheat 83
Fig. 4. Experiment 2: Mean ± standard error of B bassiana re-

isolation (%) from bread wheat and durum wheat leaves, roots,
stems and grains at different phenological stages as influenced by
inoculation method 86
XI
Fig. 5. Experiment 2: Plant height (mean value ± standard) of bread
wheat and durum wheat at different times (DAS) as influenced by
inoculation method 88
Fig. 6. Experiment 3: Plant height (mean value ± standard) of bread

wheat at different phenological stages as influenced by inoculation
method 95
S1 Fig. Experiment 3: Mean ± standard error of B. bassiana re-

isolation (%) from bread wheat leaves, roots, stems and grains at
different phenological stages following inoculation with B. bassiana
using the ‘seed dressing’ method 106
CAPÍTULO III. Redefining the dose of the entomopathogenic fungus

Metarhizium brunneum (Ascomycota, Hypocreales) to increase Fe
bioavailability and promote plant growth in calcareous and sandy
soils
Fig. 1. In vitro assay. Electron micrographs showing the average

particle size, the X–ray diffraction patterns and the characteristic
peaks for each Fe oxide. Fh= Ferrihydrite, Hm= Hematite, Mag=
Magnetite, Gt= Goethite. The number in each Fe oxide means the
specific surface area (m2 g–1) 122
Fig. 2. In vitro assay. Diameter growth (slope in mm day–1) as a

function of the Fe source (A), Fe dose (B) for each fungal strain and
Fe source × Fe dose (C) for the three fungal strains 131
Fig. 3. In vitro assay. FeDTPA and pH for each fungal strain as a

function of the Fe source and Fe dose. Fh= Ferrihydrite, Hm=
Hematite, Mag= Magnetite, Gt= Goethite. The number in each Fe
oxide means the specific surface area (m2 g–1) 135
Fig. 4. In vivo assay. Colony Forming Units (CFU) of M. brunneum in

the soil as a function of the plant species (sorghum and sunflower),
kind of soil (calcareous soil and non–calcareous soil), days after
sowing (DAS) and fungal dose applied to the surface of each pot at
the beginning of the experiment 136
XII
Fig. 5. In vivo assay. SPAD chlorophyll measurements (SPAD value) in
sorghum and sunflower plants as a function of the kind of soil
(calcareous soil and non–calcareous soil), days after sowing (DAS)
and fungal dose applied to the surface of each pot at the beginning
of the experiment 138
Fig. 6. In vivo assay. Flower diameter and dry weight in sunflower as

a function of the kind of soil (calcareous soil and non–calcareous
soil), days after sowing (DAS) and fungal dose applied to the surface
of each pot at the beginning of the experiment. Mean ± standard
error for n = 5 (calcareous soil) and n = 6 (non–calcareous soil) 141
CAPÍTULO IV. Entomopathogenic fungi based mechanisms for

improved Fe nutrition in sorghum plants grown on calcareous
substrates
Fig. 1. Electron micrographs. Micrographs and characteristic XRD

peaks for the Fe oxides 168
Fig. 2. Mean FeDTPA and pH. The FeDTPA (A) and pH (B) in the Czapek-
Dox medium (mean ± standard error, n = 4) at the end of the in vitro
assay 182
Fig. 3. Colony-forming units (CFU). The number of conidia g-1 in the

calcareous substrate (mean ± standard error, n = 4) for each fungal
strain as a function of the inoculation method (seed dressing, soil
treatment and leaf spraying) at 7, 30, 68 and 93 days after sowing
(DAS) 185
Fig. 4. Re-isolation. The time course for the colonization (mean ±

standard error, n = 4) of the leaves, stems and roots by B. bassiana
(A, C, E) and M. brunneum (B, D, F) as a function of the inoculation
method 186
XIII
Fig. 5. Plant height, LCC and LCC × Plant height in sorghum. A time
course of the sorghum plant height, LCC (leaf chlorophyll
concentration) and LCC × plant height (mean ± standard error, n = 4)
for B. bassiana (A, C, E) and M. brunneum (B, D, F) as a function of
the inoculation method 190
Fig. 6. Root parameters. Specific root length (SRL), specific root area
(SRA) and root length according to the root diameter (mean ±
standard error, n = 4) for sorghum plants inoculated with B. bassiana
(A, C, E) or M. brunneum (B, D, F) by using different inoculation
methods 193
S1Fig. Number of leaves. Number of plant leaves for each treatment

(mean ± standard error, n = 4) applied to B. bassiana (A) and
M.brunneum (B) 208
S2 Fig. Images of the roots of plants that were inoculated with the
fungi by using different inoculation methods 209
XIV
CAPÍTULO I: Introducción
CAPÍTULO I
I. El Control Biológico, piedra angular del

Control Integrado de Plagas
El concepto de Manejo Integrado o Control Integrado de Plagas (Smith,
1978), surgió en los años cincuenta (Barlett, 1956; Stern et al., 1959) y se
consolidó a finales de los setenta (Zalom y Fry, 1992), en respuesta a los
problemas causados por el uso comercial de insecticidas químicos en los
sistemas agrícolas que caracterizaron a la denominada “revolución verde”,
con énfasis en el impacto sobre la salud humana y el medio ambiente. Al
principio, este enfoque promulgaba principios ecológicos en la utilización
de métodos biológicos y químicos de control contra plagas de insectos
(Smith y Reynolds, 1966) pero posteriormente, se amplió para incluir todos
los métodos de control (Smith et al., 1976).
Aún así, el control biológico, o estudio y empleo de entomófagos

(depredadores y parasitoides) y entomopatógenos (virus, bacterias,
protozoos, nematodos y hongos) para la regulación de las poblaciones de
insectos fitófagos (DeBach, 1964), constituye la piedra angular del Control
Integrado de Plagas. Más allá, en la actualidad el biocontrol es fomentado
por varios factores, donde destacan la prohibición de materias activas
químicas (p.ej. revisión en la UE previa al Reglamento (CE) nº 1107/2009 de
comercialización de productos fitosanitarios), la importancia creciente del
fenómeno de la resistencia de insectos a insecticidas, la concienciación
cada vez mayor de los consumidores por productos sanos, libres de
residuos y obtenidos mediante técnicas de cultivo sostenibles, así como a
la importancia clave de la seguridad alimentaria (Hampton, 2014). Estos
aspectos han presidido las políticas agrícolas en el siglo XXI (p.ej. Directiva
3
CAPÍTULO I
128/2009/CE del Parlamento Europeo y del Consejo de 21 de octubre de

2009, por el que se establece un marco de actuación comunitaria para
conseguir un uso sostenible de los plaguicidas).
Se ha discutido mucho sobre el potencial del control biológico

como alternativa a los insecticidas químicos de síntesis, pero los principales
obstáculos para la implantación de un bioinsecticida en el mercado son la
necesidad de una formación más especializada para su aplicación efectiva,
su mayor coste, así como el requisito de tiempos más largos para suprimir
la población del fitófago (Ehlers, 2011). Sin embargo, existen importantes
ventajas de los productos biológicos respecto a los químicos, tanto en su
desarrollo y rentabilidad, como en sus menores efectos secundarios, a lo
que se debe añadir un menor riesgo de aparición de resistencia (Tabla 1).
Tabla 1. Comparación de los aspectos relacionados con el desarrollo y aplicación del control
químico y el biológico (Actualizado a 2004; adaptado de (van Lenteren, 1997a; van
Lenteren, 1997b; Lacey et al., 2001).
Control químico Control biológico
Número de productos evaluados >3.5 millones 3000
Ratio de éxito 1 : 200 000 1 : 20
Coste de desarrollo 180 millones US$ 2 millones US$
Tiempo de desarrollo 10 años 10 años
Beneficio por unidad monetaria 2.5–5 30
invertida
Riesgo de resistencia Alto Pequeño o nulo
Especificidad Baja Alta
Efectos secundarios negativos Muchos Pocos o ningunos
Además, existe una diferencia entre ambos grupos que adquiere gran
relevancia en la actualidad, mientras que los insecticidas químicos son
diseñados exclusivamente para el control de plagas, el desarrollo de un
insecticida biológico, que también persigue el control directo del fitófago,
puede llevar asociados otros efectos positivos para la planta, mejorando
su respuesta frente a otros estreses de tipo biótico, como enfermedades,
e incluso, abiótico, p.ej. hídricos, térmicos o nutricionales (Fig. 1) (Olson,
2015).
4
CAPÍTULO I
Fig. 1. Los bioinsecticidas: más allá del control de plagas. Aunque tradicionalmente el
control biológico se centraba en la protección de cultivos frente a plagas y enfermedades de
insectos, se están observando nuevos roles relacionados con la mejora de la respuesta de
las plantas frente a estreses de tipo abiótico.
Este es el caso de los hongos entomopatógenos (HE), agentes

microbianos de control biológico, un conjunto diverso de especies con
diferencias en sus requisitos nutricionales, modo de acción, persistencia y
dispersión, pero que comparten su capacidad de infectar a los artrópodos
por vía tegumentaria y causarles la muerte (Goettel et al., 2005; Lacey,
2017), cuyo empleo para el control de plagas se considera hoy día un
método eficaz y respetuoso con el medioambiente. Pero además, en los
últimos años se han descrito nuevas funciones de los HE en la naturaleza
más allá de la regulación de poblaciones de artrópodos, en particular las
relacionadas con sus sorprendentes asociaciones con las plantas, de las
que emanan nuevas estrategias no sólo para la protección de cultivos,
5
CAPÍTULO I
sino incluso para la producción vegetal (Fig. 2), a las que se dirigen los
objetivos de esta tesis.
Fig. 2. Descripción general de las funciones ecológicas inusuales de los hongos endófitos
entomopatógenos. La protección directa frente a plagas y enfermedades se representa en
rojo, mientras que las actividades de promoción del crecimiento y su efecto indirecto sobre
la producción del cultivo se representa en verde. Fuente: modificado de Quesada–Moraga
(2013).
6
CAPÍTULO I
II. Los hongos entomopatógenos: más allá

del control de plagas
Para profundizar en las nuevas funciones ecológicas de los HE y de las

sorprendentes aplicaciones en protección de cultivos, pero más
importante, en producción vegetal, es necesaria una aproximación a este
fascinante grupo, a su diversidad, ecología, modo de acción y propiedades.
II.1. Clasificación y diversidad

Dentro del reino Mycota, se estima que existen alrededor de 700–750
especies de patógenos de artrópodos. La mayoría pertenecen a dos
divisiones, Entomophthoromycota y Ascomycota, y en menor número a las
divisiones Blastocladiomycota y Basidiomycota. Dentro de las divisiones
Entomophthoromycota y Ascomycota se sitúan respectivamente los
órdenes con más representantes, Entomophtorales e Hypocreales (Hibbett
et al., 2007; Gryganskyi et al., 2013; Humber, 2012) (Fig. 3). Los
Entomophtorales se caracterizan por ser biotrofos obligados, pues
dependen de los insectos a los que parasitan para completar su ciclo de
vida, lo que les hace difíciles de multiplicar en medio artificial y limita su
desarrollo comercial (Keller, 2007; Pell et al., 2010). Por el contrario, los
ascomicetos mitospóricos entomopatógenos, con más de 600 especies
que infectan insectos y ácaros, poseen ciclos de vida más complejos que
incluyen etapas fuera del insecto hospedante que les permiten persistir
durante prolongados periodos de tiempo en el suelo o asociados con las
plantas a la espera de infectar al insecto (Sung et al., 2008; Chandler,
2017). Estas especies fúngicas son de fácil manejo, lo que facilita su
7
CAPÍTULO I
producción en masa, y su aplicación comercial como micoinsecticidas, en

especial las familias Clavicipitaceae, Cordycipitaceae y
Ophiocordycipitaceae, del orden Hypocreales, y Trichocomaceae, del
orden Eurotiales (Lacey et al., 2015; Lacey, 2017).
II.2. Modo de acción de los ascomicetos

mitospóricos entomopatógenos
Las especies de HE más distribuidas y de mayor relevancia pertenecen a los
ascomicetos mitospóricos entomopatógenos (AME) clasificados en el
orden Hypocreales del Filo Ascomycota. La mayoría de los AME tienen
ciclos vitales que sincronizan con los de sus hospedantes, así como con las
condiciones ambientales del entorno (Quesada–Moraga y Santiago–
Álvarez, 2008). Su modo de acción, por contacto por vía tegumentaria, los
hace singulares dentro de los agentes de control microbiano de plagas
(Quesada–Moraga y Santiago–Álvarez, 2008; Jaronski, 2010; Quesada–
Moraga et al., 2014b).
El ciclo de vida de los AME comprende dos fases, una patógenica y

la otra saprofítica (Fig. 4). La fase patogénica involucra cuatro pasos
principales: adhesión, germinación, diferenciación y penetración. La
colonización se inicia con la adhesión de los conidios del hongo a la cutícula
del insecto hospedante, donde se adhieren fuertemente debido a
mecanismos mediados por fuerzas hidrofóbicas de su pared celular (Ortiz–
Urquiza y Keyhani, 2013), a lo que sigue la formación de un tubo
germinativo y en ocasiones de estructuras de anclaje tipo apresorio, a lo
que sigue la penetración de la cutícula gracias a una combinación de
acciones mecánicas y bioquímicas que facilitan la invasión del hemocele
8
División Clase Orden Familia Género
Batkoa, Entomophaga,
Entomophthoromycetes Entomophthorales Entomophthoracea Entomophthora, Erynia,

Eryniopsis, Furia, Massospora,
Orthomyces, Pandora, Strong–
e wellsea, Zoophthora
Ancylistes, Conidiobulus,
Ancylistaceae Macrobiotophthora
Entomophthoromycota
Completoriaceae Completoria
Meristacraceae Meristacrum, Tabanomyces
Basidiobolomycetes Basidiobulus Basidiobolaceae Basidiobolus
Apterivorax, Neozygites,
Neozygitomycetes Neozygitales Neozygitaceae Thaxterosporium
Hypocrella, Metacordyceps,
Regiocrella, Archersonia,
Metarhizium, Tipo–
Clavicipitaceae Paecilomyces, Pochonia
Normurea, Tipo–Verticillium
Cordyceps,Torrubiella, Isaria,
Beauveria, Engyodontium,
Sordariomycetes Hypocreales Cordycipitaceae Lecanicillium, Simplicillium,
Microhilum,Tipo–Mariannaea
Elaphocordyceps, Hirsutella,
Syngliocardium, Paraisaria
Ophiocordiceps, Sorosporella,
Acomycota Topypocladium, Hymenostibe
Ophicordycipitaceae Culicinomyces, Metarhiziopsis,
Tipo–paecilomyces,
Tipo–verticillum
Eurotiomycetes Eurotiales Trichocomaceae Paecilomyces
Fig. 3. Clasificación sistemática de los hongos entomopatógenos. Adaptada de (Hibbett et al., 2007; Humber, 2012; Gryganskyi et al., 2013).
CAPÍTULO I
donde el hongo crece en forma de cuerpos hifales, una vez que vence la
respuesta defensiva del hospedante, tanto celular (fagocitosis y
encapsulación) (Han et al., 2013; Tseng et al., 2014), como humoral
(producción de fenoloxidasa, lectinas u otras proteínas y péptidos
defensivos) (Vey et al., 2001; Volkoff et al., 2003).
Fig. 4. Modo de acción general de un ascomiceto mitospórico entomopatógeno. 1)

Adhesión: contacto entre el conidio y la cutícula del insecto; (2) Germinación y formación
del apresorio; (3) Penetración de la cutícula hasta alcanzar el hemocele; (4) Reacción
defensiva celular (hemocitos del insecto en el lugar de penetración fúngica); (5) Fagocitosis
de cuerpos hifales por hemocitos del insecto; (6) Evasión del sistema inmune; (7) Cuerpos
hifales propagándose en el hemocele; (8) Esporulación tras atravesar la cutícula del insecto.
La muerte del hospedante ocurre por la invasión de tejidos y

órganos, por la utilización de parte de sus nutrientes, y/o por el efecto de
los metabolitos tóxicos producidos por el mismo (Ríos–Moreno et al.,
2016). La muerte del insecto marca el fin de la fase patogénica, y da lugar a
10
CAPÍTULO I
la saprofítica, pues en condiciones favorables, las hifas emergen del
cadáver, donde producen conidióforos y conidios, que se dispersarán a
través del viento, la lluvia o los propios insectos, y se iniciará un nuevo ciclo
de infección (Goettel et al., 2005; Charnley y Collins, 2007; Ortiz–Urquiza y
Keyhani, 2016).
II.3. Estrategias de uso de los ascomicetos

Las estrategias para el empleo de AME en el control de insectos son cuatro:
(1) conservación, (2) control biológico clásico, (3) inoculación e (4)
inundación (Eilenberg, 2002). La estrategia de conservación implica la
modificación de algunas prácticas agronómicas que propicien las
condiciones necesarias para aumentar su actividad epizoótica sobre la
población del insecto que se quiere controlar (Quesada–Moraga y
Santiago–Álvarez, 2008), tales como la reducción del uso de fitosanitarios,
la provisión de lugares de hibernación para hospedantes alternativos, o
proporcionar una humedad por irrigación apropiada, entre otras. El control
biológico clásico promulga la introducción deliberada del HE en un hábitat
nuevo para el control de una especie invasiva. La eficacia de la estrategia
se favorece en hábitats con un cierto grado de permanencia, como por
ejemplo praderas, bosques y cultivos leñosos. Además, esta estrategia
requiere un alto nivel de especificidad por parte del enemigo natural y, que
su respuesta a la población del hospedante se acomode al modelo de
densidad dependiente. La estrategia de inoculación mediante la aplicación
puntual de cantidades bajas o medias de inóculo para iniciar ciclos de
enfermedad, establecer el hongo en la población del insecto y mantener el
control a largo plazo. Finalmente, la de inundación con la aplicación del
11
CAPÍTULO I
insecticida microbiano generalmente en grandes cantidades, para iniciar
una epizootia conducente al declive de la población en un tiempo
relativamente corto. En este caso el hongo se usa de manera similar a los
insecticidas químicos y se emplea el término micoinsecticida. Existen
numerosos ejemplos de AME utilizados por inundación para el control de
plagas, tanto en ambientes epigeos, como en hipogeos, mediante la
pulverización de micoinsecticidas a los árboles y partes aéreas de plantas,
o mediante la estrategia de atracción e infección, que se fundamenta en
la aplicación utilizando trampas atrayentes impregnadas con el hongo, que
permiten la autodiseminación del inóculo por el propio insecto (Ekesi et al.,
2007, Quesada–Moraga y Santiago–Álvarez, 2008). En los ambientes
hipogeos también se han obtenido buenos resultados, no en vano, el suelo
es el hábitat natural de los AME, donde se encuentran protegidos de
cualquier factor adverso, y es donde ejercen su máximo potencial de
biocontrol, por lo que constituyen la mejor alternativa, junto con los
nematodos entomopatógenos, para el control microbiano de plagas de
insectos del suelo (St. Leger, 2008; Scheepmaker y Butt, 2010).
Los AME también pueden ser aplicados mediante los tratamientos

de semilla, técnica que se ha utilizado tradicionalmente para proteger de
plagas y enfermedades de suelo a semillas y plántulas en desarrollo,
mediante el recubrimiento de éstas con fungicidas e insecticidas de amplio
espectro, facilitado por la aparición de nuevos biopolímeros en la industria
de la formulación de insecticidas.
En la actualidad, en el mercado mundial hay disponibles más de 30

formulados comerciales de AME que están basadas en un número
restringido de especies pertenecientes a los géneros Beauveria,
Metarhizium, Isaria y Lecanicillium, para el control de insectos picadores–
12
CAPÍTULO I
chupadores, insectos de suelo, lepidópteros y coleópteros, así como
langostas y saltamontes y varios grupos de fitófagos para los que no se
conocen enfermedades de naturaleza vírica o bacteriana, sin olvidar los
insectos sinantrópicos (Lacey et al., 2015; Lacey, 2017).
II.4. Presencia natural de ascomicetos

Los AME se encuentran de forma natural en el suelo y en los insectos cuyas
poblaciones regulan (Goettel et al., 2005; Quesada–Moraga et al., 2007;
Quesada–Moraga y Santiago–Álvarez, 2008). En la última década, varias
investigaciones han puesto de manifiesto la existencia de sorprendentes
asociaciones de los AME con las plantas, tanto en el filoplano (Meyling y
Eilenberg, 2006, 2007; Keyser et al., 2015), como endófitos (Vega et al.,
2009, 2012; Ownley et al., 2010; Quesada–Moraga et al., 2014b), o incluso
como microorganismos competentes en la rizosfera (Hu y St. Leger, 2002).
II.4.1. En los artrópodos

Los AME están adaptados a vivir a expensas de sus hospedantes ya que
han coevolucionado de manera intrínseca con los insectos a los que
parasitan, de los que obtienen la energía necesaria para su desarrollo (Roy
et al., 2006). En función de la asociación trófica de los HE con sus
hospedantes, se pueden distinguir tres grupos: (1) hongos biotrofos que se
alimentan únicamente de células vivas, proceso que cesa con la muerte de
las mismas, (2) necrotrofos que matan al hospedante y después crecen a
expensas de los tejidos muertos, y (3) hemibiotrofos que son inicialmente
biotrofos y una vez que el hospedante muere se vuelven necrotrofos
(Quesada–Moraga y Santiago–Álvarez, 2008; Vega et al., 2009).
13
CAPÍTULO I
Fruto de esta coevolución, diversos análisis filogenéticos muestran
que muchas especies de AME tienen características similares a un ancestro
común (Freckleton, 2000), como es el caso de los géneros monofiléticos
Beauveria o Metarhizium (Sung et al., 2007) de amplia distribución
geográfica que infectan a más de 700 especies de hospedantes (Rehner et
al., 2006; Meyling y Eilenberg, 2007; Meyling et al., 2009). Análisis
moleculares han diferenciado doce especies para Beauveria (B. amorpha, B
bassiana, B. brongniartii, B. caledonica, B. malawiensis, B. vermicornia, B.
asiatica, B. australis, B. kipukae, B. pseudobassiana, B. sungii y B. varroae
(Rehner et al., 2011), y nueve especies diferentes para Metarhizium (M.
majus, M. guizhouense, M. brunneum, M. pingshaense, M. robertsii, M.
anisopliae, M. lepidiotae, M. acridum y M. globosum) (Bischoff et al., 2009;
Schneider et al., 2011). Conocer el origen y diversidad de los AME resulta
primordial para entender el comportamiento e interacción con el hábitat y
el ecosistema (Beebee y Rowe, 2008), siendo clave para promover el
desarrollo de epizootias como consecuencia de su acción sobre los
insectos, para lo que también es importante la adquisición de un profundo
conocimiento de su ambiente, distribución y abundancia en el medio
(Fisher et al., 2011).
Algunas especies del orden Entomophtorales originan llamativas y

espectaculares epizootias. Infectan preferentemente estados inmaduros
de insectos (ninfas, larvas, pupas), aunque en ocasiones es el adulto el
estado más comúnmente infectado, como en los dípteros (Eilenberg,
2002). En general, las especies de HE presentan patogeneicidad para una
especie o grupo de especies relacionadas filogenéticamente aunque
algunas, muy pocas, tienen un amplio rango de hospedantes. El desarrollo
natural de la enfermedad e incluso su posible dispersión espacial y
14
CAPÍTULO I
temporal están sujetas a características de las poblaciones del insecto
hospedante (p.ej. susceptibilidad, densidad, movimiento y distribución
espacial) y del HE (p.ej. virulencia, poder de dispersión, densidad de
inóculo y distribución espacial), así como a factores ambientales (p.ej.
temperatura, humedad y radiación UV) y al impacto de la actividad del
hombre en los ecosistemas naturales y agroforestales (Quesada–Moraga et
al., 2007). Cuando existe escasez de insectos hospedantes, o las
condiciones ambientales no son favorables, la mayoría de especies de
Entomophthorales producen esporas de reposo, clamidosporas, zigosporas
o azigosporas para persistir en el suelo durante largos períodos de tiempo,
mientras que a tal efecto, los AME pueden formar otras estructuras como
esclerocios, clamidosporas, etc. (Quesada–Moraga et al., 2007).
II.4.2. En el suelo
La presencia, diversidad y dinámica poblacional de los AME en el suelo está
estrechamente relacionada con el grado de manejo de los ecosistemas
(Keller et al., 2003; Meyling y Eilenberg, 2006; Quesada–Moraga et al.,
2007). La mayoría de los AME se encuentran en los primeros 10 cm del
suelo, y su número disminuye a medida que aumenta la profundidad
(Jaronski, 2007). Mediante el análisis con marcadores moleculares se
puede constatar la presencia a lo largo del tiempo del aislado con el que se
ha realizado un tratamiento (Enkerli et al., 2002), que puede variar entre
pocas semanas e incluso años (Kabaluk et al., 2007).
En el hábitat epigeo es donde habitualmente ocurren las epizootias

ya que la infección se dispersa rápidamente a través de los conidios de la
superficie del sustrato vegetal, del viento, o a través de la transmisión
horizontal con insectos enfermos (Goettel et al., 2005). La superficie del
15
CAPÍTULO I
suelo se considera un entorno favorable para los AME ya que proporciona
refugio a los propágulos fúngicos contra las condiciones ambientales
(Jaronski, 2007). No obstante, el suelo es un medio extremadamente
complejo, y un gran número de factores del mismo (textura, pH, materia
orgánica, capacidad de intercambio catiónico, etc.) (Jaronski, 2010), así
como ambientales (temperatura, humedad), y relacionados con el
comportamiento de los insectos (microflora) que habitan en el suelo,
hacen que la distribución y persistencia de conidios a lo largo del perfil del
suelo sea extremadamente heterogénea (Jaronski, 2010). La interacción
con otros microorganismos del suelo puede afectar a la viabilidad y
persistencia de los HE por fungistasis (Groden y Lockwood, 1991; Jaronski,
2010). Algunos invertebrados geobiontes o geófilos, en especial
colémbolos, ácaros o lombrices, desempeñan un papel importante en la
dispersión en el suelo de los conidios tras ser ingeridos por ellos. Además,
la prevalencia de los HE en el suelo está estrechamente relacionada con la
presencia de insectos susceptibles a la infección (Meyling y Eilenberg,
2007; Lacey et al., 2015).
En las zonas cercanas a la rizosfera se desarrollan complejas

interacciones hongo ̶ ﬁtófago ̶ planta. Así, se he demostrado que M.
anisopliae expresa genes diferentes cuando crece en los exudados de las
raíces de plantas que cuando lo hace sobre la cutícula o hemolinfa de un
insecto, lo que revela el desarrollo por parte de los AME de diferentes
mecanismos de adaptación para su supervivencia en el medio ambiente, ya
sea como patógenos de artrópodos, como endófitos o incluso por su
competencia en la rizosfera (Hu y St. Leger, 2002; Wang et al., 2005; Bais et
al., 2006). También se conoce que M. anisopliae produce las proteínas
MAD1 y MAD2 que se combinan de manera diferente según la adhesión
16
CAPÍTULO I
del conidio se produzca en la cutícula del insecto o en la superficie de la
planta (Wang y St Leger, 2007). Esto ha llevado a algunos autores a
proponer que muchos de estos hongos nunca han abandonado su papel
como simbiontes vegetales y plantean la hipótesis de que la
patogeneicidad del insecto es una adaptación que permite a ciertas
especies de hongos endófitos acceder a una fuente especializada de
nitrógeno y otros nutrientes derivados de los insectos, y que son capaces
de intercambiar efectivamente estos nutrientes derivados de insectos por
el acceso a los carbohidratos vegetales (Elliot et al., 2000; Behie et al.,
2017).
La humedad y textura del suelo son dos factores que se encuentran

muy relacionados e influyen directamente en la viabilidad y la actividad de
los propágulos fúngicos, mientras que la lluvia juega un papel muy
importante en el movimiento vertical de los HE, ya que la humedad
favorece la viabilidad (Keller, 1989), pero también la excesiva precipitación
puede afectar a la eficacia del patógeno, debido al lavado de los
propágulos cuando no se da una buena adhesión del conidio a la cutícula
del insecto (Inglis et al., 2000). Algunos estudios han revelado que el
movimiento de los conidios de algunos hongos, entre ellos B. bassiana y M.
brunneum, difiere y depende del tipo de suelo (Garrido–Jurado et al.,
2011).
Además, estudios recientes para evaluar la disponibilidad y el

movimiento de conidios de B. bassiana y M. brunneum en función de las
propiedades !sico ̶ químicas del suelo, ponen de manifiesto diferencias
claras entre los dos hongos en su interacción con el mismo. La adsorción y
arrastre de conidios en experimentos de columnas empaquetadas con
diferentes suelos indica que los conidios de B. bassiana son retenidos en la
17
CAPÍTULO I
capa superficial por las partículas de arcilla, mientras que la retención es
menor en suelos arenosos con macroporos más grandes que los primeros
(Salazar et al., 2007; Garrido–Jurado et al., 2011). Por el contrario, la
retención de M. brunneum fue mayor en arena, como consecuencia del
mayor tamaño y la naturaleza hidrófoba de sus conidios (Jeffs et al., 1999).
Los experimentos de adsorción y de arrastre revelan la existencia

de una interacción entre los conidios de B. bassiana y los minerales de la
arcilla del suelo (Garrido–Jurado et al., 2011). La pared celular exterior de
los conidios de B. bassiana se compone de una gran diversidad de hidratos
de carbono que contribuyen a la formación de enlaces de hidrógeno entre
los conidios y las superficies hidrófobas e hidrófilas (Holder y Keyhani,
2005; Wanchoo et al., 2009), que pueden estar implicados en la interacción
de conidios con las superficies de arcilla para el intercambio de iones (Lavie
y Stotzky, 1986). Además, se ha demostrado que el hierro (Fe) extraíble
con ditionito (FeD), que es una medida de los óxidos de Fe asociados con
las arcillas de silicato del suelo, está relacionado con la retención de
conidios de B. bassiana en el suelo (Garrido–Jurado et al., 2011).
II.4.3. Asociaciones con las plantas: como endófitos y en

el filoplano
A pesar de que el término 'endófito' se emplee para todos los organismos
que habitan las plantas, los micólogos han llegado a utilizar el término
'endófito fúngico' para los hongos que colonizan las plantas sin causar
síntomas de enfermedad visibles (Schulz y Boyle, 2005; Hyde y Soytong,
2008; Quesada–Moraga et al., 2014a). Aunque el suelo se considera el
reservorio natural de los AME, también han sido aislados en hábitats muy
diversos como el filoplano. Se han citado una gran variedad de plantas,
18
CAPÍTULO I
incluidas especies herbáceas, arbustivas y leñosas, colonizadas de forma
natural por AME endófitos (Vega et al., 2008; Roy et al., 2010; Meyling et
al., 2011; Sasan y Bidochka, 2012; Garrido–Jurado et al., 2015; Jaber y
Enkerli, 2017), así como producto de la introducción artificial como
endófitos en una gran variedad de cultivos (Gurulingappa et al., 2010;
Quesada–Moraga et al., 2014a) (Tabla 2).
Tabla 2. Especies de plantas colonizadas de manera natural y artificial por hongos

entomopatógenos endófitos. Modificada de Resquín–Romero (2016b) y
actualizada. Continúa 1/3
Especie fúngica Inoculación Plantas hospedantes Referencias (*)
Metarhizium Natural Schizachne
brunneum purpurascens
Artificial Helianthus annuus, Jaber y Enkerli, 2016,
Sorghum bicolor, Zea Garrido–Jurado et al.,
mays, Cucumis melo. 2017; Ramanujam, et
Vicia faba al., 2017, Raya–Díaz, et
al., 2017
Metarhizium Natural Solidago altissima
guizhouense
Nematoctonus Artificial Hordeum vulgare
robustus
Paecilomyces sp. Natural Carpinus caroliniana,
Dactylis glomerata,
Holcus lanatus, Musa
acuminata, Oryza sativa
Plectosphaerella Natural Phaseolus vulgaris,
cucumerina Cynodon dactylon,
Ammophila arenaria,
Elymus farctus
Pleurotus djamor Artificial Hordeum vulgare
Pochonia Artificial Hordeum vulgare,
chlamydosporia Solanum lycopersicum,
Schizachne
purpurascens
Purpureocillium Artificial Gossypium hirsutum
lilacinum
Tolypocladium Natural Festuca rubra, Holcus
cylindrosporum lanatus
Arthrobotrys Hordeum vulgare,
Artificial
oligospora Solanum lycopersicum
Arthrobotrys Hordeum vulgare
Artificial
dactyloides
19
CAPÍTULO I
entomopatógenos endófitos. Modificada de Resquín–Romero (2016b) y
actualizada. Continuación 2/3
Especie fúngica Inoculación Plantas hospedantes Referencias (*)
Abies beshanzuensis,
Ammophila arenaria,
Carpinus carolinana,
Caffea arabica, Dactylis
glomerata, Datura
stramonium, Elymus
farctus, Espeletia spp.,
Eucalyptus globulus,
Natural
Gossypium hirsutum,
Papaver somniferum,
Pinus montícola, Pinus
radiata, Pinus sylvestris,
Quercus ilex,
Theobroma gileri, Zea
mays, Schizachne
purpurascens.
Coffea arabica, Greenfield et al., 2016;
Corchorus olitorius, Jaber y Enkerli, 2016;
Musa sp., Papaver Culebro–Ricaldi, et al.,
somniferum, Phoenix 2017; Gan et al., 2017;
Beauveria bassiana
dactylifera, Pinus Garrido–Jurado et al.,
radiata, Sorghum 2017; Herbst, et al.,
bicolor, Theobroma 2017; Raya–Díaz, et al.,
cacao, Zea mays, 2017; Rondot y
Lycopersicon Reineke, 2017
esculentum, Triricum
aestivum, Gossypium
hirsutum, Cynara
Artificial
scolymus, Vitis vinifera,
Phaseolus vulgaris,
Nicotiana tabacum,
Triticum sativus, Glycine
max, Brassica napus,
Oryza sativa, Solanum
Lycopersicum, Brassica
oleracea, Festuca
arundinacea, Cucumis
melo, Manihot
esculenta, Vitis vinífera,
Vicia faba
Bionectria ochroleuca Artificial Cynara scolymus
Cladiosporium velox Natural Tinospora cordifolia Singh et al., 2016
Clonostachys rosea Natural Coffea arabica, Quercus
myrsinifolia
20
CAPÍTULO I

entomopatógenos endófitos. Modificada de Resquín–Romero et al., 2016b y
actualizada. Continuación 3/3
Especie fúngica Inoculación Plantas hospedantes Referencias
Cordyceps sinensis Natural Holcus lanatus,
Theobroma giler
Cordyceps memorabilis Natural Eucaliptus globulus
Lecanicillium Phoenix dactylifera
dimorphum,
Lecanicillium cf.
psalliotae
Lecanicillium lecanii Natural Ammophila arenaria,
Carpinus caroliniana,
Dactylis glomerata,
Elymus farctus,
Gossypium hirsutum
Hirsutella aphidis Natural Lolium perenne
Hypocrea lixii Artificial Allium cepa
Isaria farinosa Natural Pinus sylvestris
Isaria fumosorosea Artificial Sorghum bicolor, Gan et al., 2017
Festuca arundinacea
Natural Cynodon dactylon
Metarhizium
Artificial Solanum lycopersicum, Greenfield et al., 2016
anisopliae
Manihot esculenta
Natural Aster vimineus,
Hieracium pratense,
Solidago altissima
Metarhizium robertsii
Artificial Panicum virgatum,
Phaseolus vulgaris,
Sorghum bicolor
(*) Se indican solo referencias recientes, posteriores a Resquín–Romero et al., 2016b
Para realizar la inoculación artificial de plantas con AME endófitos

pueden utilizarse diversas técnicas como son la pulverización foliar,
inyecciones al tronco, inoculación al suelo o tratamiento de semillas, con
resultados variables que pueden determinar el éxito y extensión de la
colonización sistémica del tratamiento fúngico (Tefera y Vidal, 2009). La
colonización puede ser intercelular o intracelular, localizada o sistémica
(Stone et al., 2000; Arnold y Lutzoni, 2007) y pueden colonizar cualquier
tejido de la planta, pudiendo dar lugar a la transmisión vertical a través de
21
CAPÍTULO I
las semillas (Bacon y White, 2000; Quesada–Moraga et al., 2014b). La
penetración de los AME en los tejidos de las plantas se realiza a través de
los estomas o por medio de la penetración directa mediante la actuación
de la enzima MAD2 que permite la adhesión a la planta (Wang y St Leger,
2007). Posteriormente, el movimiento se produce en los espacios
intercelulares siguiendo la vía del apoplasto (Landa et al., 2013).
El uso de los AME como endófitos tiene la ventaja de que son

necesarias menores cantidades de inóculo que con los insecticidas
convencionales, debido a que el inóculo fúngico queda confinado en el
interior de la planta. La planta proporciona protección al inóculo frente a
factores abióticos y bióticos que limitarían su uso en condiciones de campo
(Akello et al., 2008; Backman y Sikora, 2008). Las interacciones de los AME
endofíticos con las plantas a las que colonizan son heterogéneas, con
requerimientos ecológicos y adaptaciones distintas entre los diferentes
grupos de endófitos. Muchos intentos para establecer asociaciones
endofíticas entre cepas de AME y varias especies vegetales han fracasado
(Akutse et al., 2013; Vidal y Jaber, 2015; Mutune et al., 2016). Esto podría
deberse a las características innatas del aislamiento fúngico (Posada et al.,
2007) o a la genética de la planta hospedante (Arnold y Lewis, 2005), lo
que indica una elevada diversidad en la especificidad de la misma, que va
desde muy estrecha para los entomopatógenos obligados, hasta muy
amplia para los entomopatógenos facultativos (Wraight et al., 2007). Dado
que la colonización endofítica es principalmente intercelular, los endófitos
dependen de los nutrientes del apoplasto para el crecimiento. Sólo unos
pocos estudios tratan sobre la translocación y la fisiología específica, sobre
el intercambio de nutrientes o la acumulación in vivo (Pan y Clay, 2004). Sin
embargo, puede haber una reacción inducida de defensa de la planta.
22
CAPÍTULO I
Algunas plantas pueden producir algunos exudados que inhiben el
crecimiento de algunos hongos, como se ha observado en Quercus ilex (L.)
(Magnoliophyta; Fagaceae), que produce fenoles que pueden inhibir el
crecimiento de los hongos nematófagos y entomopatógenos: Verticillium
suchlaporium (Ascomycota: Glomerellales), B. bassiana (Ascomycota:
Hypocreales), Isaria farinosa (Holmsk.) (Acomycota; Hypocreales),
Hirsutella rhossiliensis Minter y BL Brady (Ascomycota: Hypocreales)
(López–Lorca y Olivares–Bernabéu, 1997).
Por otra parte, en el suelo son los exudados de las raíces los que
pueden favorecer la presencia y competencia del hongo en la rizosfera, en
especial para el género Metarhizium; cuando los AME se encuentran en el
filoplano, pueden verse afectados por la química de la superficie de las
plantas y la emisión de compuestos volátiles (Cory y Ericsson, 2010). La
gran exposición de esta zona a las condiciones ambientales, en especial la
radiación solar, podría limitar la posible presencia epífita de AME (Meyling
y Eilenberg, 2006). De hecho, algunos autores como Jaronski (2010) han
observado que el envés de las hojas, con menor exposición a la radiación
solar y el lavado de lluvia, parece ser más rico en AME.
III. Nuevas funciones ecológicas de los

ascomicetos mitospóricos entomopatógenos
y sus aplicaciones
Hasta finales del siglo XX los retos científicos en el estudio de los AME se
dirigían principalmente a su presencia natural, ecología, modo de acción y
23
CAPÍTULO I
empleo práctico para el control de insectos y ácaros, pero en el siglo XXI se
han descrito nuevas funciones ecológicas de los AME relacionadas con su
carácter endófito y su competencia en la rizosfera, de enorme significación
para la protección de cultivos y la producción vegetal (Quesada–Moraga et
al., 2014a). Cada día son más numerosos los estudios que demuestran que
los AME no son únicamente eficaces contra plagas de insectos, sino que
también mejoran la respuesta de la planta a otros estreses bióticos. Así, se
ha demostrado que los AME pueden inducir resistencia sistémica contra
patógenos de plantas gracias a su capacidad para secretar compuestos con
múltiples actividades biocidas como insecticidas, antifúngicos, herbicidas y
antivirales (Goettel et al., 2008; Ownley et al., 2008; 2010; Sasan y
Bidochka, 2013; Quesada–Moraga et al., 2014a). También se ha
demostrado que aportan beneficios como colonizadores de la rizosfera (Hu
y St. Leger, 2002; St. Leger, 2008; Pava–Ripoll et al., 2011), promueven el
crecimiento vegetal (Kabaluk y Ericsson, 2007; García et al., 2011; Lopez y
Sword, 2015; Jaber y Enkerli, 2016; 2017; Sánchez–Rodríguez et al., 2015),
mejoran la nutrición de las plantas (Behie et al., 2012; Behie y Bidochka,
2014), incrementan el desarrollo de las raíces (Wyrebek et al., 2011; Sasan
y Bidochka, 2012; Liao et al., 2014), y alivian estreses abióticos, como
salinidad (Waller et al., 2005) o deficiencia de Fe (Sánchez–Rodríguez et al.,
2015; 2016).
Estos beneficios adicionales sugieren que los HE tienen un gran potencial

para ser desarrollados con múltiples propósitos en estrategias de
Producción Integrada de Cultivos (Goettel et al., 2008; Vega et al., 2009;
Ownley et al., 2010), más respetuosas con el medio ambiente, incluso
podrían ayudar a reducir la necesidad de fertilizantes convencionales
bajo determinadas condiciones (Sánchez–Rodríguez et al., 2016).
24
CAPÍTULO I
III.1. Protección de la planta frente a factores

bióticos
III.1.1. Plagas de insectos

Las propiedades tan sobresalientes que presentan los AME para el control
de plagas de insectos han permitido que sean desarrollados como
bioinsecticidas y que hayan sido incorporados al Registro de Productos
Fitosanitarios. Las primeras aplicaciones de AME endófitos en control de
plagas se produjeron con la llegada del siglo XXI, en su mayor parte con
insectos barrenadores, con énfasis en maíz, adormidera, platanera y cafeto
(Quesada–Moraga et al., 2014a), donde los insectos que colonizan los
tejidos de la planta de forma endofítica, entran en contacto con el inóculo
fúngico dentro de la planta, con inicio de ciclos de infección como los ya
descritos. Sin embargo, estudios recientes ponen de manifiesto que la
colonización endofítica transitoria del tejido vegetal por AME puede
originar también mortalidad en insectos masticadores y chupadores que se
alimentan de la planta de forma ectófita (Resquín–Romero et al., 2016).
Aunque aún se desconocen con precisión los mecanismos implicados en
este efecto, la presencia de compuestos insecticidas dentro de la planta
aparece como uno de los principales (Schulz et al., 2002; Sree y Padmaja,
2008; Rohlfs y Churchill, 2011; Ríos–Moreno et al., 2016). Este origen viene
apoyado por la ausencia de esporulación fúngica (micosis) en insectos que
han muerto al alimentarse en plantas endofíticamente colonizadas por
AME. A pesar de ello, sólo algunos estudios han identificado los
metabolitos secundarios de hongos producidos en tejidos vegetales
colonizados por AME. Es el caso de la destruxina A implicada en la
patogénesis de insectos, en fragmentos de hojas, tallo, tubérculo y raíz de
25
CAPÍTULO I
plantas de patata (Ríos–Moreno et al., 2016) y en hojas de melón
colonizadas con M. brunneum (Garrido–Jurado et al., 2017). Sin embargo la
cantidad de destruxina A producida por M. brunneum detectada dentro de
los tejidos vegetales fue muy pequeña comparada con el grado de
colonización de la planta por el hongo, lo que indica que la persistencia de
destruxina A es efímera, haciéndola inocua para otros grupos de animales
como los parasitoides (Ríos–Moreno et al., 2017).
III.1.2. Enfermedades de las plantas

Resulta crucial, como se ha indicado en la sección I, la aparición de otras
ventajas adicionales para la planta asociadas a su colonización endofítica
por parte de AME, tales como la inducción de resistencia, mediante la
activación de las defensas de la planta que reducen o alivian la
enfermedad, así como una extensión de la hipótesis defensiva del
mutualismo (Bultman y Murphy, 2000; Ownley et al., 2010). En muchos
casos, los mecanismos de control biológico no son mutuamente
excluyentes, sino que una combinación de múltiples mecanismos puede
estar operando contra un patógeno vegetal, por ejemplo, la competencia,
la antibiosis, el micoparasitismo, la resistencia sistémica de las plantas y
producción de metabolitos secundarios vegetales (Vega et al., 2009).
III.1.2.1. Supresión directa de patógenos de plantas

Los AME endófitos pueden suprimir directamente a los patógenos
vegetales a través de competencia por nichos ecológicos y nutrición, por
producción de metabolitos secundarios y micoparasitismo. Los hongos
endófitos compiten activamente contra los patógenos de plantas por el
nicho o sitio de infección, carbono (C), nitrógeno (N) y diversos
microelementos que les son necesarios para su nutrición. El sitio de
26
CAPÍTULO I
competición es a menudo la rizosfera, el filoplano o el apoplasto. La
competencia exitosa suele ser una cuestión de oportunidad, ya que es
probable que los recursos lleguen al colonizador inicial, que ocupa en
primer lugar su espacio y depende de los nutrientes proporcionados por la
planta hospedante, que de esta forma no están a disposición de un posible
patógeno que aborde la infección en segunda instancia. El cambio en el
orden de la colonización de las plantas, por ejemplo cuando el patógeno
coloniza la planta antes que el endófito, puede desplazar la interacción
endófito–patógeno de la supresión de la enfermedad a la promoción de la
misma (Adame–Álvarez et al., 2014). En la literatura existen numerosos
ejemplos de competencia como es el caso de la resistencia que ofrecen
diversos aislados de B. bassiana aplicado a las semillas de plantas de
tomate (Ownley et al., 2004; Clark et al., 2006) y algodón (Griffin, 2007;
Ownley et al., 2008) contra Rhizoctonia solani Kühn (Basidiomycota;
Cantharellales) y Pythium myriotylum Drechsler (Oomycota; Pythiales).
La antibiosis por la producción de metabolitos secundarios es otro

de los mecanismos de resistencia contra patógenos de plantas (Ownley et
al., 2010). Los AME son una rica fuente de metabolitos secundarios con
actividades antimicrobianas, insecticidas y citotóxicas (Gibson et al., 2014).
Por ejemplo, B. bassiana produce numerosos metabolitos secundarios
incluyendo beauvericina, bassianina, beauverolidas, bassianolidas,
oosporeina, y bassianolona, entre otros (Ownley et al., 2010). De estos
compuestos, la beauvericina, secretada por los géneros Beauveria e Isaria,
es particularmente interesante por su propiedades antimicrobianas (Wang
y Xu, 2012).
El micoparasitismo es el parasitismo de un hongo por otro

(Barnett, 1963; Jeffries, 1995). Existen varios grados de especificidad pues
27
CAPÍTULO I
dentro de una especie fúngica, algunos aislados pueden infectar a un gran
número de hongos taxonómicamente diversos, mientras que otros
demuestran un alto nivel de especificidad (Askary et al., 1998). Un ejemplo
es Phialemonium inflatum (Burnside) (Ascomycota: Sordariales) aplicado a
la semilla de algodón contra Meloidogyne incognita Kofoid y White
(Tylenchida; Heteroderidae) (Zhou et al., 2016). También ha sido descrito
el micoparasitismo in vitro de Metarhizium y Beauveria, como es el caso de
M. brunneum y B. bassiana contra Verticillium dahliae Kleb. (Ascomycota:
Glomerellales) y Phytophthora megasperma Drechler (Oomycota;
Peronosporales) hongos patógenos que afectan gravemente al olivar
(Lozano–Tovar et al., 2013, Lozano–Tovar et al., 2017).
La inducción de la resistencia sistémica de las plantas es un

mecanismo importante por el cual la planta presenta una mejor respuesta
defensiva frente a posibles patógenos (Pieterse et al., 2014). La
colonización de plantas por hongos endófitos puede estimular a la planta a
producir metabolitos secundarios bioactivos (Hartley et al., 2015), entre
los que se encuentran las fitoalexinas con propiedades antifúngicas,
antibacterianas y antivirales, que ayudan a proteger las plantas contra
patógenos. La cantidad de fitoalexinas isoflavonoides aumentó
significativamente en las plantas de soja inoculadas con M. anisopliae en
comparación con las plantas testigo (Khan et al., 2012). La colonización
endofitica también induce a las plantas a producir lignina y otros depósitos
de la pared celular como una respuesta de defensa mecánica, lo que puede
prevenir o limitar la infección por patógenos de plantas que causan
enfermedades (Schulz y Boyle, 2005). La resistencia ofrecida incluye la
reducción de los síntomas de la enfermedad en partes de plantas distantes
del sitio donde el agente inductor está activo. Esto se ha demostrado con
28
CAPÍTULO I
B. bassiana aplicado a la raíz de plántulas de algodón contra bacterias
como Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (Smith)(Bacteria;
Xanthomonadaceae) 13 días después de la infección (Griffin et al., 2006;
Ownley et al., 2008), lo que produjo una reducción significativa de la
gravedad de la enfermedad en comparación con las plantas control no
tratadas. Ya existen en el mercado productos como Naturalis®, formulado
con una cepa de B. bassiana, que reducen significativamente la incidencia
y la gravedad de los síntomas de enfermedad causados por el virus del
mosaico amarillo Zucchini (ZYMV, género Potyvirus, familia Potyviridae) en
calabaza (Jaber y Salem, 2014). Además, también se ha demostrado que la
aplicación foliar de B. bassiana proporciona resistencia sistémica a plantas
contra otros hongos como Plasmopara viticola (Berk. y MA Curtis) Berl. y
De Toni (Oomycota; Peronosporales) que atacan a la vid (Jaber, 2015).
Otros hongos como Lecanicillium spp. producen resistencia contra Pythium
ultimum Trow (Oomycota; Pythiales) (Benhamou y Brodeur, 2001) y el
oídio Sphaerotheca fuliginea (Schlecht.: Fr.) Pollacci (Leotiomycetes;
Erysiphales) (Hirano et al., 2008), y M. robertsii, que confieren protección
contra la pudrición de la raíz del frijol causada por Fusarium solani (Mart.)
Sacc. F. sp. Phaseoli (Burkholder) W.C. Snyder y N.H. Hans (Ascomycota;
Hypocreales) (Sasan y Bidochka, 2013). Asimismo, se ha observado la
protección frente a Fusarium spp de distintas plantas cultivadas con sus
raíces colonizadas por Acremonium Link (Ascomycota; Hypocreales) (Raps y
Vidal, 1996; 1998; Dugassa et al., 1998; Kuldau, 2000), así como el
incremento de la tasa de supervivencia de plantas de tabaco al damping–
off tras la colonización por inoculaciones con Piriformospora indica Sav.
Verma, Aj. Varma, Rexer, G. Kost y P. Franken (Basidiomycota; Sebacinales)
(Sahay y Varma, 1999)
29
CAPÍTULO I
Finalmente se ha estudiado el empleo conjunto de
microorganismos endofíticos para el manejo simultáneo de plagas y
enfermedades. Así, el uso de una cepa de B. bassiana y otra de
Pseudomona fluorescens Migula (Bacteria; Pseudomonadaceae) redujo
significativamente el daño causado por la minadora de hojas Aproaerema
modicella Deventer (Lepidóptera; Gelechiidae) y la pudrición del tizón del
sur Athelia rolfsii (Curzi) CC Tu y Kimbr. (Basidiomycota; Atheliales) en
cacahuete (Arachis hypogaea L.) (Fabales; Fabaceae) (Senthilraja et al.,
2010). Una combinación similar fue el uso de B. bassiana y un hongo
micorrízico arbuscular, Rhizophagus intraradices NC Schenck y GS Sm.
(Mucoromycota; Glomerales), que permitió mejorar la respuesta defensiva
de la planta de tomate contra Spodoptera exigua Hilbner (Lepidoptera;
Noctuidae) (Shrivastava et al., 2015) con expresión en la producción de
terpenoides beneficiosos para la planta.
III.2. Protección de la planta frente a factores

abióticos
Además de proteger a las plantas frente a estreses bióticos (plagas y

enfermedades), algunas especies de hongos endófitos pueden mejorar su
adaptabilidad ecológica con mejora de la tolerancia a estreses ambientales
(Schulz et al., 1999; Tan y Zou, 2001), tales como sequía (Bacon y Hill,
1996), salinidad (Waller et al., 2005), temperatura (Redman et al., 2002),
radiación ultravioleta (Inglis et al., 1997), y estrés nutricional (Sánchez–
Rodríguez et al., 2015; 2016). La mejora del crecimiento depende de la
especie vegetal y de su estado metabólico (Schulz et al., 2002). Así, los
AME B. bassiana, I. fumosorosea Wize. Bull y M. brunneum promueven el
crecimiento, mejorando la salud y vigor de plantas de col bajo estrés
30
CAPÍTULO I
hídrico (Dara, 2016), mientras que B. bassiana también promueve el
crecimiento de plantas de fresa (Dara, 2013), M. anisopliae reduce el
estrés salino en soja (Khan et al., 2012), y M. robertsii mejora el
crecimiento de raíces y la absorción de nutrientes en pastizales y
habichuelas (Sasan y Bidochka, 2012). Las plantas cuyas raíces están
colonizadas por endófitos a menudo crecen más rápido que las no
colonizadas, lo que se asocia a la síntesis de fitohormonas y otras
sustancias promotoras del crecimiento por los hongos (Petrini, 1991;
Tudzynski y Sharon, 2002). El posible impacto de la colonización
endofítica por AME o la presencia de los mismos en la rizosfera sobre la
respuesta de la planta a estrés nutricional es el principal objetivo de la
presente tesis doctoral. Pero antes, conviene profundizar en el
conocimiento actual de microorganismos que mejoran la nutrición y
crecimiento de plantas.
III.3. Microorganismos que mejoran la nutrición y

crecimiento de las plantas
Los microorganismos, con su participación en innumerables reacciones
metabólicas, son componente clave del ciclo de los nutrientes, base de
toda productividad, lo que confiere un papel fundamental en la fertilidad
de los suelos (Johansson et al., 2004). Más allá, se han desarrollado
estrategias para incrementar la microbiota del suelo y acelerar todos los
procesos microbianos, como la utilización de bio–inoculantes, que
consisten en cepas individuales o conjunto de microorganismos que
añadidos directamente al suelo, o como un recubrimiento de semillas,
aportan beneficios para el crecimiento de las plantas (Roesti et al., 2006;
Ahmad et al., 2013; Owen et al., 2014). Estos productos pueden estimular
31
CAPÍTULO I
el crecimiento vegetal a través de mecanismos tales como control de
fitopatógenos en la rizósfera, producción de hormonas vegetales,
liberación de nutrientes del suelo o de la materia orgánica, y mejora en la
absorción y translocación de nutrientes (Aguado–Santacruz, 2012). Los
bioinoculantes pueden clasificarse en dos grupos principales: (1) bacterias
promotoras del crecimiento vegetal, inter Y extracelulares (Gray y Smith,
2005), (2) hongos asociados a la raíz y hongos formadores de micorrizas
(Gray y Smith, 2005).
III.3.1. Bacterias promotoras del crecimiento vegetal

Estas bacterias intervienen en el ciclo de algunos elementos minerales
como P, N, C, Fe, etc., favoreciendo la nutrición de las plantas. A cambio
utilizan los exudados de las raíces en forma de ácidos orgánicos,
aminoácidos o azúcares. Las bacterias se pueden dividir en dos grupos con
respecto al mecanismo de asociación de la planta: bacterias intracelulares
que son las que residen dentro de las células vegetales, produciendo
nódulos localizados dentro de estructuras especializadas (principalmente
rizobios que fijan N); y las bacterias extracelulares, que son aquellas que
residen fuera de la célula vegetal y no producen nódulos, pero pueden
residir en los espacios apoplásticos como endófitos, en el rizoplano
(Compant et al., 2010), o incluso en la filosfera (Compant et al., 2008).
III.3.1.1. Bacterias intracelulares

Las bacterias intracelulares intervienen en la fijación del N en plantas
vasculares a través de los nódulos como las bacterias del género Rhizobium
(Bacteria; Rhizobiales) que están asociadas simbióticamente en plantas de
leguminosas. También las cianobacterias que colonizan la superficie de las
raíces de una gran diversidad de plantas, son capaces de fijar N sin formar
32
CAPÍTULO I
nódulos destacando principalmente los géneros Nostoc (Bacteria;
Nostocales) y Anabaena (Bacteria; Nostocales) (Frenche et al., 2009). Un
ejemplo es Azospirillum (Bacteria; Rhodospirillales) que es capaz de realizar
la fijación biológica del N, es decir, transforman el N molecular del suelo o
la atmósfera, en nitrato o amonio. Esta bacteria también solubiliza el P del
suelo haciéndolo más fácilmente asimilable por la planta (Okon y
Labandera–Gonzalez, 1994; Dobbelaere et al., 1999).
Las bacterias fijadoras de N se encuentran en el suelo bajo dos

formas, estado libre o en simbiosis. En general, la importancia agrícola de
las bacterias fijadoras libres es relativa ya que las cantidades de N fijadas,
del orden de 10 a 20 kg N ha–1 año–1, son insuficientes para permitir el
desarrollo de la agricultura, mientras que la fijación simbiótica es mucho
más eficaz (p.ej. con judías: 80 kg N ha–1 año–1; con alfalfa: 400 kg N ha–1
año–1)(Herridge y Bergensen, 1988; Lampkin, 1998). La más común es la
simbiosis con plantas leguminosas, esta fijación se hace mediante bacterias
del género Rhizobium que viven en los nódulos radiculares de las
leguminosas. La asociación Rhizobium ̶ leguminosa suele ser bastante
específica, de manera que cada especie bacteriana se asocia con una sola
especie de leguminosa (p.ej. Bradyrhizobium japonicum Kichner ̶ Soja,
Rhizobium phaseoli Dangeard ̶ Judías, Rhizobium leguminosarum Frank ̶
guisantes, lentejas y habas). La nodulación se ve drásticamente reducida
cuando el suelo contiene N soluble, por lo que el abonado de síntesis
impide la simbiosis entre la bacteria y la leguminosa (Johansson et al.,
2004).
33
CAPÍTULO I
III.3.1.2. Bacterias extracelulares
Las bacterias extracelulares promueven el crecimiento de las plantas por
mecanismos tales como síntesis de fitohormonas (fundamentalmente el
ácido indolacético) y enzimas (Gray y Smith, 2005), promoción del
crecimiento de la raíz y la proliferación de los pelos radiculares, producción
de vitaminas, síntesis de compuestos químicos inhibitorios como
antibióticos que inhiben el crecimiento de microorganismos patógenos
(Gamalero y Glick, 2011; Owen et al., 2014) y enzimas líticas
detoxificadoras que inducen resistencia en la planta, producción de
sustancias quelantes de Fe (sideróforos) que facilitan su absorción por
parte de las plantas (Franco–Correa et al., 2010), mejora de la
solubilización de P (Frossard et al., 2000; Khan et al., 2007; Tao et al.,
2008), y aumento de la porosidad y capacidad de retención de agua y
nutrientes del suelo.
Uno de los principales mecanismos utilizados por las bacterias para

solubilizar nutrientes y hacerlos más disponibles para las plantas es a
través de la síntesis de ácidos orgánicos como el oxálico, cítrico, butírico,
malónico, láctico, succínico, málico, glucónico, acético, glicónico, fumárico,
adípico, indolacético y 2–cetoglucónico, los cuales acidifican la rizosfera
(Rodríguez y Fraga, 1999; Paredes–Mendoza y Espinosa–Victoria, 2010).
Algunos de los géneros bacterianos más conocidos que producen ácidos
orgánicos son Pseudomonas (Bacteria; Pseudomonadales), Bacillus
(Bacteria; Bacillales), Enterobacter (Bacteria; Enterobacteriales),
Streptomyces (Bacteria; Actinomycetales), Burkholderia (Bacteria;
Burkholderiales), Achromobacter (Bacteria; Burkholderiales),
Agrobacterium (Bacteria; Rhizobiales), Aereobacter (Bacteria;
Enterobacteriales), Flavobacterium (Bacteria; Flavobacteriaceae),
34
CAPÍTULO I
Streptosporangium (Bacteria; Actinomicetales) y Erwinia (Bacteria;
Enterobacteriales) (Rodríguez et al., 2004; Tao et al., 2008; Gamalero y
Glick, 2011; Hungria et al., 2016).
III.3.2. Hongos
Las raíces de los vegetales, que pueden llegar a suponer un total de 5 a 6
Tm por hectárea en un campo cultivado, producen exudados radiculares
que contienen, según las especies vegetales, entre el 10 y el 50 % de la
energía fijada por la fotosíntesis. Los exudados radiculares son ricos en
compuestos carbonatados que sirven de alimento a los microorganismos
de la rizosfera, entre ellos los hongos, que a cambio, proporcionan los
minerales que necesita la planta. Las raíces están colonizadas por un gran
número de especies de hongos, tanto en superficie como en su interior.
Hay más de 6.000 hongos diferentes que pueden establecer distintas
relaciones con las raíces de las plantas (Owen et al., 2014).
III.3.2.1. Hongos asociados a las raíces

Al igual que las bacterias, los hongos asociados a las raíces pueden residir
dentro de la rizosfera, en el rizoplano, y en muchos casos, colonizan la
corteza de la raíz, donde se desarrolla un micelio externo que ayuda a la
planta a adquirir nutrientes minerales y agua, a modo de sistema radicular
complementario (Bowen y Rovira, 1991). Los hongos asociados a las raíces
confieren efectos beneficiosos a las plantas a través de varios mecanismos,
por ejemplo, mediante la inducción de resistencia a las enfermedades y la
tolerancia a los estreses abióticos (Waller et al., 2005; Rawat y Tewari,
2011), como por ejemplo, Trichoderma spp. (Ascomycota; Hypocreales),
que sintetiza auxinas que estimulan el desarrollo lateral de las raíces de las
plantas (Benitez et al., 2004) o modifican la síntesis del óxido nítrico de la
35
CAPÍTULO I
planta hospedante en condiciones de ataque del patógeno (Gupta et al.,
2000). Otras funciones han sido categorizadas como de biocontrol y
bioremediación (Rodríguez et al., 2009).
Los hongos asociados a las raíces también son capaces tanto de

solubilizar P inorgánico como de mineralizar P orgánico, por ejemplo los
ascomicetos Aspergillus y Penicillium spp., que habitan la rizosfera y
pueden secretar ácidos orgánicos que movilizan P inorgánico a partir de
fosfato de roca, así como enzimas fosfatasas, permitiendo la hidrólisis del P
orgánico (Bolan, 1991), (Barrow y Osuna, 2002). Piriformospora indica
Sav.Verma, Aj.Varma, Rexer, G.Kost y P.Franken (Basidiomycota;
Sebacinales), Cryptosporiopsis sp. Gené y Guarro (Ascomycota; Helotiales)
(Varma, et al., 2000), Fusarium spp. Link ex Grey (Ascomycota;
Hypocreales) y Cladorrhinum foecundissimum Sacc. y Marchal
(Ascomycota; Sordariales) (Gasoni y Stegman De Gurfinkel, 1997; Kuldau,
2000; Sieber, 2002) son colonizadores de raíz no micorrízicos que han
demostrado mejorar el crecimiento de sus plantas hospedantes. En
particular, C. foecundissimum puede incrementar la absorción de P, así
como la de otros nutrientes como el Fe y N (O'Brien, 2008; de Santiago et
al., 2009; Behie et al., 2012).
Existen varias investigaciones que apuntan a que los efectos de

promoción del crecimiento asociados a varios hongos endófitos pueden
estar asociados a la síntesis de hormonas de crecimiento de las plantas por
éstos o a la puesta a disposición de la planta de nutrientes. Así, la
colonización endofítica de las raíces de cebada Hordeum vulgare L.
(Magnoliophyta; Poaceae) por Chaetomium spp. Kunze (Ascomycota;
Sordariales) causó un aumento del peso fresco de la raíz (Vilich et al.,
1998), la de Vulpia ciliata subsp. ambigua Dumort (Le Gall) Stacey Auquier
36
CAPÍTULO I
(Poaceae) por Phoma fimeti Brunaud (Ascomycota; Pleosporales) mejoró la
biomasa de sus raíces y los brotes, la longitud de la raíz y el número de
tallos (Newsham, 1994), y un sordariomiceto endófito no identificado de
Mentha piperita L. (Magnoliophyta; Lamiaceae) promovió la expansión del
sistema radicular de la planta y aumentó tanto la biomasa como la altura
(Mucciarelli et al., 2002; 2003).
La colonización de las raíces vegetales por los endofitos puede

tener otras ventajas para ambos organismos, los segundos mejoran sus
fuentes nutritivas, los primeros no sólo su crecimiento, sino su respuesta a
estreses bióticos y abióticos (Schoenbeck y Dehne, 1979; Bargmann y
Schoenbeck, 1992; Hallmann y Sikora, 1994; Redman et al., 2001; Sieber,
2002). Así, se ha observado mejora de la nutrición férrica en plantas de
trigo (Triticum aestivum L) (Magnoliophyta; Poaceae) cultivadas en medio
calcáreo, tras su inoculación con Trichoderma asperellum Samuels, Lieckf.
Nirenberg (Ascomycota; Hypocreales) (de Santiago et al., 2009; 2011), y el
incremento de la tolerancia de Dichanthelium lanuginosum (Ell.) Gould
(Poaceae) a temperaturas de hasta 65°C gracias al endófito Curvularia sp.
Boedjin (Ascomycota; Pleosporales) (Redman et al., 2002).
III.3.2.2. Hongos formadores de micorrizas

Las micorrizas son asociaciones de un hongo con la raíz de una planta que
resultan en una extensa red de hifas que actúan como una extensión de
sus raíces (Malloch et al., 1980). La asociación simbiótica se establece entre
las raíces de plantas y las hifas de los filos Glomeromycota, Basidiomycota
y Ascomycota. Al inicio de la colonización el hongo forma un manto
constituido por hifas que rodean el ápice de la raíz, posteriormente otras
hifas penetran el espacio intercelular entre las células radiculares,
37
CAPÍTULO I
formando lo que se conoce como la red de Harting (Malloch et al., 1980),
dónde se producirá el intercambio de nutrientes (sacarosa al hongo y N/P,
minerales y agua a la planta). Las raíces sólo pueden formar micorrizas a
partir del momento en que el vegetal es capaz de realizar la fotosíntesis,
después del desarrollo y apertura de las primeras hojas.
Las micorrizas se clasifican en siete grupos principales según las

hifas de los hongos permanezcan en el exterior de la raíz (ectomicorrizas) o
penetren en el interior (endomicorrizas) (Smith y Read, 2008; Martínez y
Pugnaire, 2009), pero los tipos más extendidos comercialmente y
ecológicamente más importantes son los formadores de micorrizas
arbusculares y las ectomizorrizas (Tabla 3).
Tabla 3. Funciones más importantes de las micorrizas arbusculares en los sistemas

agrarios. Fuente: Gianinazzi et al., (2010).
Función de las micorrizas arbusculares Servicio ecosistémico que realizan
Modificación de la morfología de las raíces y Aumenta la adherencia planta/suelo y la
creación de una red de micelio en el suelo. estabilidad del suelo (mejora de la
estructura del suelo.
Aumento del agua y los minerales Incremento de la absorción de P que
disponibles para la planta. favorece el crecimiento de las plantas.
Disminución del uso de fertilizantes.
Amortiguación del efecto del estrés abiótico. Aumenta la resistencia de las plantas a la
sequía, salinidad, contaminación por
metales pesados y niveles bajos de
nutrientes minerales.
Secreción de glomalina en el suelo. Aumento de la estabilidad del suelo y la
retención de agua.
Protección de las plantas contra patógenos Aumenta la resistencia de las plantas al
de las raíces y a enfermedades producidas estrés biótico y reduce el uso de
por hongos y microorganismos del suelo. insecticidas.
Control de malas hierbas.
Modificación del metabolismo y fisiología de Bioregulación del desarrollo de la planta.
las plantas. Aumento del contenido nutricional de las
plantas y de la calidad de la planta para la
salud humana.
38
CAPÍTULO I
El interés natural y económico de las micorrizas es enorme, algunas
especies de plantas no pueden germinar o emitir nuevos brotes en
ausencia de su hongo simbionte, el crecimiento está claramente
estimulado y presentan mayor resistencia al parasitismo. El caso más
remarcable es el de las orquídeas con tubérculos (Orchis, Ophrys), que son
totalmente dependientes de la formación de la endomicorriza con el
hongo Rhizoctonia para poder germinar (Ordoñez et al., 2016). En las
comunidades vegetales naturales es común que los hongos conecten a
nivel de sus raíces diferentes vegetales, de la misma o distinta especie,
creando un puente para la transferencia de sustancias nutritivas de una
planta a otra. Las micorrizas arbusculares tienen un papel clave en los
sistemas agrarios garantizando la productividad y la calidad, así como una
producción más sostenible. En el mercado es fácil encontrar
biofertilizantes que aporten micorrizas al suelo, o semillas micorrizadas,
por ejemplo hongos arbusculares pertenecientes al filo Glomeromycota,
especialmente Rhizophagus intraradices (NC Schenck y GS Sm.) C. Walker y
A. Schübler (anteriormente Glomus intraradices) (Mucoromycota;
Glomerales) y Funneliformis mosseae (TH Nicolson y Gerd.) C. Walker y A.
Schübler (Mucoromycota; Glomerales) (anteriormente Glomus mosseae)
(Krüger et al., 2012), para los que se ha demostrado que aumentan la
captación de P en diversas plantas de cultivo (Barea et al., 1983; Douds et
al., 2007; Antunes et al., 2009; Cozzolino et al., 2013).
III.3.3. Los hongos entomopatógenos en la nutrición y

crecimiento de las plantas
Al igual que las micorrizas, algunos AME endófitos establecen interacciones

mutualistas que no sólo son beneficiosas para la planta, sino que
39
CAPÍTULO I
proporcionan suficientes nutrientes para que los endófitos colonicen
extensamente las raíces y favorezcan su crecimiento en la rizosfera (Sieber,
2002; Schulz et al., 2002). La mejora del crecimiento de las plantas puede
deberse a una mejor absorción de P, o en un sistema cerrado, a la mayor
disponibilidad de carbohidratos y/o CO2, ambos resultantes del
metabolismo fúngico (Jumpponen, 1999).
En este sentido, los primeros trabajos realizados a este respecto

indican que B. bassiana y Metarhizum spp. son capaces de transferir
directamente a la planta el N obtenido de un insecto hospedante
infectado, a cambio de este nitrógeno derivado del insecto, la planta
proporcionaba carbono derivado de la fotosíntesis al hongo (Behie et al.,
2012). Estos hallazgos evidencian una interacción tripartita y simbiótica
entre el insecto–hongo–planta (Behie et al., 2017). Más allá, trabajos
pioneros realizados en el seno del Grupo de Investigación PAIDI AGR 163
“Entomología Agrícola” de la Universidad de Córdoba en colaboración
con el Grupo AGR 165 “Unidad de Edafología” de la misma universidad,
han aportado luz sobre el efecto de los hongos entomopatógenos
endófitos sobre el crecimiento de la planta y sobre su nutrición férrica, lo
que se ha demostrado en plantas de tomate y de trigo cuya semilla fue
inoculada con B. bassiana antes de su cultivo en sustrato calcáreo
deficitario en Fe, bajo ciertas circunstancias (Sánchez–Rodríguez et al.,
2015), o en plantas de sorgo, trigo y girasol en suelos calcáreos
inoculados con M. brunneum (Sánchez–Rodríguez et al., 2016). Esta
mejora puede explicarse por la capacidad de los HE de producir sideróforos
(transportadores de Fe) para acumular y transportar el Fe del medio
ambiente a las células (Lavie y Stotzky, 1986), también pueden promover
fenómenos de adsorción de hidróxidos de Fe (Cornejo et al., 2004), y
40
CAPÍTULO I
producir ácidos orgánicos que incrementan la solubilidad de Fe (Joseph et
al. 2012). Es importante destacar que la capacidad de varias especies de
hongos entomopatógenos para promover el crecimiento de las plantas
después de su colonización endofítica, con énfasis en B. bassiana, B.
brongniartii y M. brunneum, depende del método usado para la
inoculación de las plantas, de la dosis y del tiempo de duración de la
inoculación (Jaber y Enkerli, 2016; 2017), ya que determinan el tipo de
establecimiento de los mismos como endófitos.
Sin embargo, aún son numerosas las incógnitas sobre esta

sorprendente nueva función de los hongos entomopatógenos en la
promoción de la nutrición vegetal, más allá del control de plagas, y en la
presente tesis doctoral se ha pretendido dar luz sobre algunas de ellas, con
especial atención a la mejora de la nutrición férrica en suelos calcáreos.
IV. Objetivos de la presente Tesis Doctoral
Los objetivos de la presente Tesis Doctoral, que se enumeran a

continuación, se dirigen a investigar el comportamiento endofítico de
cepas de AME sobre distintas plantas cultivadas, su implicación en el
control de plagas, y la posible existencia paralela de efectos sobre su
crecimiento y nutrición férrica:
1. Evaluar el efecto de la colonización endofítica de plantas de trigo blando

y trigo duro por la cepa EABb 04/01–Tip de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill.
(Ascomycota; Hypocreales) sobre el crecimiento, rendimiento, niveles de
fitohormonas y absorción de nutrientes, así como paralelamente, su efecto
sobre la mortalidad de larvas de Spodoptera littoralis Boisduval
41
CAPÍTULO I
(Lepidoptera; Noctuidae) alimentadas con hojas de trigo colonizadas
endofíticamente.
2. Evaluar in vitro la capacidad de las cepas EABb 04/01–Tip de B. bassiana,

EAMa 01/58–Su de Metarhizium brunneum Petch, y EAIf 10/01–Msp de
Isaria farinosa (Holmsk.) Fr. (Ascomycota, Hypocreales), para incrementar
la disponibilidad de Fe de distintos óxidos de Fe con diferentes
propiedades (cristalinidad, superficie específica y tamaño de partícula), en
condiciones ácidas, neutras y calcáreas.
3. Determinar la dosis mínima a la que la cepa EAMa 01/58–Su aplicada al

suelo produce efectos sobre el crecimiento vegetal y la biodisponibilidad
de Fe en plantas monocotiledóneas como el sorgo y dicotiledóneas como
el girasol que crecen sobre suelos calcáreos y no calcáreos con el objetivo
de optimizar la dosis.
4. Evaluar el efecto de diferentes métodos de inoculación (tratamiento de

semilla (SE), aplicación al suelo (SU) y pulverización foliar (PU))con las
cepas EABb 04/01–Tip y EAMa 01/58–Su, seleccionadas por su potencial de
crecimiento endofítico y su competencia en la rizosfera, sobre el
crecimiento, nutrición y producción de plantas de sorgo cultivadas en
sustrato calcáreo.
El capítulo II recoge los resultados relativos al primer objetivo, incluidos en

el manuscrito “An endophytic Beauveria bassiana strain increases spike
production in bread and durum wheat plants and effectively controls
cotton leafworm (Spodoptera littoralis) larvae”, publicado en la revista
Biological Control. (2017) pp: 1049–9644 doi:
42
CAPÍTULO I
10.1016/j.biocontrol.2017.01.012. [Factor de Impacto JCR: 2.3, Q1 (11/93)
en “Entomology”].
El capítulo III recoge los resultados relativos a los objetivos segundo y

tercero, que comprende el manuscrito “Redefining the dose of the
entomopathogenic fungus Metarhizium brunneum (Ascomycota,
Hypocreales) to increase Fe bioavailability and promote plant growth in
calcareous and sandy soils’’, publicado en la revista Plant and Soil. (2017)
418: 387–404. doi: 10.1007/s11104–017–3303–0. [Factor de Impacto JCR:
3.1, Q1 (11/83) en “Agronomy”].
El capítulo IV recoge los resultados relativos a los objetivos tercero y

cuarto, incluidos en el manuscrito “Entomopathogenic fungi–based
mechanisms to improve Fe nutrition of sorghum plants grown in
calcareous substrates” publicado en la revista PLoS ONE. (2017) 12:
(e0185903). doi: 10.1371/journal.pone.0185903. [Factor de Impacto JCR:
2.8, Q1 (15/64) en “Multidisciplinary sciences”].
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60
CAPÍTULO II
Este capítulo es una versión adaptada del artículo:
http://dx.doi.org/10.1016/j.biocontrol.2017.01.012
CAPÍTULO II
An endophytic Beauveria bassiana strain

increases spike production in bread and
durum wheat plants and effectively controls
cotton leafworm (Spodoptera littoralis)
larvae
Authors: Antonio R Sánchez–Rodríguez1,*, Silvia Raya–Díaz1, Ángel María

Zamarreño2, José María García–Mina2, María Carmen del Campillo3,
Enrique Quesada–Moraga1
Address:
1
Departamento de Ciencias y Recursos Agrícolas y Forestales, Universidad
de Córdoba, Edificio C4, Campus de Rabanales, 14071 Córdoba, Spain
2
CIPAV TimacAGRO International–Roullier Group, Polígono Arazuri–
Orkoien, c/C no. 32, 31160 Orkoien, Navarra, Spain
3
Departamento de Agronomía, Universidad de Córdoba, Edificio C4,
Campus de Rabanales, 14071 Córdoba, Spain
*Corresponding author E–mail address: l02saroa@uco.es (Antonio R

Sánchez–Rodríguez).
63
CAPÍTULO III
https://doi.org/10.1007/s11104–017–3303–0
CAPÍTULO III
Redefining the dose of the

entomopathogenic fungus Metarhizium
brunneum (Ascomycota; Hypocreales) to
increase Fe bioavailability and promote
plant growth in calcareous and sandy soils
Authors: Silvia Raya–Díaz1, Enrique Quesada–Moraga1, Vidal Barrón2,

María Carmen del Campillo2, Antonio R. Sánchez–Rodríguez3,*
Address:
1
de Córdoba, Edificio C4, Campus de Rabanales, Córdoba, España
2
Campus de Rabanales, Córdoba, España
3
School of Environment, Natural Resources and Geography, Environment
Centre Wales, Bangor, United Kingdom

115
CAPÍTULO IV
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0185903
CAPÍTULO IV
Entomopathogenic fungi based mechanisms

for improved Fe nutrition in sorghum plants
grown on calcareous substrates
Authors: Silvia Raya–Díaz1, Antonio R. Sánchez–Rodríguez2,*, José Manuel

Segura–Fernández1, María Carmen del Campillo3, Enrique Quesada–
Moraga1
Address:
1
de Córdoba, Edificio C4, Campus de Rabanales, Córdoba, España
2
School of Environment, Natural Resources and Geography, Environment
Centre Wales, Bangor, United Kingdom
3
Campus de Rabanales, Córdoba, España

Abstract
Although entomopathogenic fungi (EPF) are best known for their ability to
protect crops against insect pests, they may have other beneficial effects
on their host plants. These effects, which include promoting plant growth
161
CAPÍTULO IV
and conferring resistance against abiotic stresses, have been examined in

recent years to acquire a better understanding of them. The primary
purposes of the present study were (i) to ascertain in vitro whether three
different strains of EPF (viz., Metarhizium, Beauveria and Isaria) would
increase the Fe bioavailability in calcareous or non–calcareous media
containing various Fe sources (ferrihydrite, hematite and goethite) and (ii)
to assess the influence of the EPF inoculation method (seed dressing, soil
treatment or leaf spraying) on the extent of the endophytic colonization of
sorghum and the improvement in the Fe nutrition of pot–grown sorghum
plants on an artificial calcareous substrate. All the EPFs studied were found
to increase the Fe availability during the in vitro assay. The most efficient
EPF was M. brunneum EAMa 01/58–Su, which lowered the pH of the
calcareous medium, suggesting that it used a different strategy (organic
acid release) than the other two fungi that raised the pH of the non–
calcareous medium. The three methods used to inoculate sorghum plants
with B. bassiana and M. brunneum in the pot experiment led to differences
in re–isolation from plant tissues and in the plant height. These three
inoculation methods increased the leaf chlorophyll content of young leaves
when the Fe deficiency symptoms were most apparent in the control
plants (without fungal inoculation) as well as the Fe content of the above–
ground biomass in the plants at the end of the experiment. The total root
lengths and fine roots were also increased in response to fungal
applications with the three inoculation methods. However, the soil
treatment was the most efficient method; thus, its effect on the leaf
chlorophyll content was the most persistent, and the effects on the total
root length and fine roots were the most apparent. In conclusion, EPF
162
CAPÍTULO IV
improved the Fe nutrition of the sorghum plants, but their effects

depended on the inoculation method.
1. Introduction
Entomopathogenic fungi (EPF) such as Beauveria, Metarhizium and Isaria

(Ascomycota; Hypocreales) are commonly found in both agricultural and
non–agricultural soils (Quesada–Moraga et al., 2007). These fungi are an
essential element of most agroecosystems because of their usefulness for
agricultural production and pest control in temperate regions (Vega et al.,
2012). Using EPF for pest control minimizes environmental damage and
complies with the stringent laws enacted in recent years (e.g., Regulation
(EU) 1107/2009) concerning the placement of plant protection products on
the market, in addition, it provides a natural, efficient pest management
strategy that is consistent with the concept of sustainable agriculture and
the principles of the European Union’s Common Agricultural Policy (CAP).
Entomopathogenic fungi are best known for their microbial control

potential; however, they have recently been assigned new roles, especially
in relation to their ability to establish themselves as endophytes in the
different parts of plants, and to compete with the rest of the rhizosphere
microorganisms for root exudates as well as for physical locations near the
radicular system (Vega et al., 2009; Sasan and Bidochka, 2012; Quesada–
Moraga et al., 2014). In addition, EPFs induce systemic resistance in plants
against other biotic stresses such as pathogens and phytoparasitic
nematodes (Bayat et al., 2009), promote plant growth (Kabaluk and
Ericsson, 2007), increase yields (Sánchez–Rodríguez et al., 2017), improve
163
CAPÍTULO IV
plant nutrition (Behie et al., 2012; Behie and Bidochka, 2014), boost root
development (Sasan and Bidochka, 2012; Wyrebek et al., 2011; Liao et al.,
2014) and alleviate abiotic stresses such as salinity (Waller et al., 2005) or
iron (Fe) chlorosis (Sánchez–Rodríguez et al., 2015, 2016). These new
ecological functions provide potential additional benefits to plant health
while reducing the need for conventional fertilizers, uncovering new
horizons (Sánchez–Rodríguez et al., 2016).
One of these abiotic stresses is Fe chlorosis or Fe deficiency, a

nutritional disorder that affects sensitive plants (fruit trees, olive trees,
citrus, cereals and berries) grown in calcareous soils (del Campillo y
Torrent, 1992). Iron is an essential microelement for plants; thus, it is a
component of many enzymatic systems and participates in major
processes such as photosynthesis (by catalyzing chlorophyll synthesis) and
respiration. The primary symptom of Fe chlorosis is the interveinal
yellowing of young leaves due to the inhibition of chlorophyll synthesis and
the limited ability by the plants to redistribute Fe in their phloem (Korkak,
1987), which may ultimately reduce plant growth and yield (Gruber and
Kosegarten, 2002; Rombolà and Tagliavini, 2006). Iron is poorly soluble at
neutral and alkaline pH values, and it is present as crystalline and
amorphous oxides in soil (Chen and Barak, 1982). Crystalline Fe oxides such
as goethite and hematite, which prevail in calcareous soils, are less soluble
than the more amorphous Fe oxides such as ferrihydrite (Torrent and
Barrón, 2003). As a result, Fe availability in calcareous soils, the pH of
which typically ranges from 7.5 to 8.5, is rather low and causes Fe chlorosis
in especially sensitive plants (del Campillo and Torrent, 1992). This is a
widespread nutritional disorder because calcareous soils account for
164
CAPÍTULO IV
almost 30% of the world’s arable land area (Marschner, 1995; Imsande,
1998).
In response to low Fe availability, most fungi develop specific

mechanisms to obtain Fe for their own survival (Behie and Bidochka,
2014). In addition, fungi possess highly efficient Fe acquisition systems
such as siderophores. Siderophores are biomolecules with low molecular
weights (0.5 to 1.5 kDa) with a high affinity for the Fe3+ ion (Lesuisse et al.,
2001; Stenico et al., 2005; Philpott and Protchenko, 2008; Kaplan and
Kaplan, 2009; Sanvisens and Puig, 2011) that mediates Fe uptake;
additionally, they possess Fe reduction mechanisms (ferroxidation and
permeation) for the extracellular reduction, and hence the solubilization,
of inorganic Fe3+ to Fe2+ by cell surface metalloreductases (Sanvisens and
Puig, 2011; Georgatsou and Alexandraki, 1994; Grusak et al., 1999; Felice
et al., 2005). Some fungal siderophores act as virulence factors and provide
resistance to oxidative stress, thereby facilitating sexual or asexual
development, Fe storage and protection from Fe–induced toxicity
(Sanvisens and Puig, 2011).
Previous studies have revealed that EPF increases the

bioavailability of certain nutrients such as Cd, Cu, Pb and Zn (Maniania et
al., 2003; Fomina et al., 2005; Behl et al., 2007). Thus, applying Beauveria
bassiana strain EA04/01–Tip to tomato seeds and wheat grown on artificial
calcareous substrates was found to improve Fe nutrition under certain
conditions (Sánchez–Rodríguez et al., 2015), and applying Metarhizium
brunneum strain EAMa 01/58–Su to the calcareous soils used to pot–grow
sorghum, wheat and sunflower improved the Fe bioavailability and/or
plant growth (Sánchez–Rodríguez et al., 2016). In addition, the inoculation
165
CAPÍTULO IV
method was found to influence plant growth decisively in bread and

durum wheats that were inoculated with B. bassiana EABb 04/01–Tip
when they were grown on a sandy soil (Sánchez–Rodríguez et al., 2017).
The degree of endophytic establishment and the rhizosphere competence
of the EPF have been shown to depend on the particular inoculation
method in use (e.g., leaf spraying, seed dressing, and soil treatment) (Liao
et al., 2014; Bing and Lewis, 1991; Wraight et al., 2001; Posada and Vega,
2005; Tefera and Vidal, 2009; Akutse et al., 2013; Parsa et al., 2013);
however, there is still a question as to which is the best plant inoculation
method for exploiting EPF's potential to increase the Fe bioavailability. The
primary purposes of this study were: (1) to ascertain whether applying
endophytic strains of Metarhizium, Beauveria and Isaria would modify Fe
bioavailability in calcareous and non–calcareous media in an in vitro assay
with three Fe oxides that differed in their composition, particle size and
crystallinity (viz., ferrihydrite, hematite and goethite) and (2) to assess
persistence and endophytic colonization by B. bassiana and M. brunneum,
as previously examined in the in vitro assay, and their effects on the
growth and Fe nutrition in a sensitive plant such as sorghum grown on an
artificial calcareous substrate (a sand mixture) after inoculation with three
different methods (seed dressing, soil treatment or leaf spraying).
166
CAPÍTULO IV
2. Materials and methods
2.1. In vitro assay
2.1.1. Synthetic iron oxides

Ferrihydrite, hematite and goethite were prepared according to
Schwertmann and Cornell, (2000), Colombo et al. (1994) and Torrent et al.
(1990), respectively, and purified by vigorous stirring, then centrifuged,
washed with de–ionized water and dialyzed to a conductivity below 10 µS
cm–1 to remove the salts. Their specific surface area was determined by
using the BET method (Brunauer et al., 1938), which is based on N2
adsorption measurements and found to be 350 m2 g–1 for ferrihydrite, 119
m2 g–1 for hematite and 115 m2 g–1 for goethite.
A sample of each Fe oxide was lyophilized and ground in a mortar

for analysis on a Siemens D5000 X–ray diffractometer using Co Ka
radiation and a JEOL JEM 2010 transmission electron microscope. Fig. 1
shows selected electron micrographs of the oxides including their average
particle size as well as the characteristic peaks for each oxide in the XRD
patterns. The particle size of the oxides was inversely related to their
surface area (< 4 nm for ferrihydrite, 100–400 nm for hematite and 100–
500 nm for goethite).
167
CAPÍTULO IV
Fig. 1. Electron micrographs. Micrographs and

characteristic XRD peaks for the Fe oxides. The average
particle size of each oxide is shown.
168
CAPÍTULO IV
2.1.2. Fungal strains, experimental design, FeDTPA and

pH analyses
Three different EPF strains that were deposited in the Entomopathogenic
Fungi Collection (CRAF) at the University of Córdoba, Spain were used as
follows:
(1) Beauveria bassiana EABb 04/01–Tip isolated from an Iraella

luteipes larva collected from a field in the town of Carmona
(Sevilla, Spain). This strain had previously been found to
exhibit endophytic behavior on opium–inoculated plants
(Quesada–Moraga, et al., 2006) and it is deposited with
accession No. CECT 20744 in the Spanish Collection of Culture
Types (CECT) at the University of Valencia (Spain).
(2) Metarhizium brunneum EAMa 01/58–Su isolated from soil
from the town of Hinojosa del Duque (Córdoba, Spain). The
specimens were deposited under accession No. CECT 20764 in
the Spanish Collection of Culture Types (CECT) at the
University of Valencia (Spain).
(3) Isaria farinosa EAIf 10/01–Msp was isolated from a
Monochamus (Coleoptera: Cerambycidae) specimen of an
unknown species.
The three strains were grown in Petri dishes containing Sabouraud

Dextrose Agar (SDA; Oxoid Ltd., Basingstoke, UK) at 25 °C in the dark for 15
days, which facilitated optimal growth for fungal sporulation. The mycelia
were then carefully removed by scraping the surface of the dishes and
placed in sterile beakers containing 50 ml of sterile de–ionized water with
169
CAPÍTULO IV
Tween 80 (0.1% v/v). The three suspensions (one per fungal strain) were
stirred, sonicated for 2 min, filtered to remove the mycelia and adjusted to
a concentration of 5 × 108 conidia ml–1 by using a hemocytometer (a
Malassez chamber). The conidial viability was checked before preparing
the suspensions, using germination tests in liquid Czapek–Dox broth
containing 1% (w/v) yeast extract. The germination rates exceeded 90% in
all the tests.
Then, 0.1 ml aliquots of each fungal suspension were

homogeneously distributed over the surface of Petri dishes containing 20
ml of Czapek–Dox solid medium (3 g NaNO3, 1 g KH2PO4, 0.5 g KCl, 0.5 g
MgSO4·7 H2O, 30 g glucose and 15 g of agar per liter) supplemented with
three different Fe oxides (250 mg Fe L–1 plus a control containing 0 mg Fe
L–1) and calcium carbonate (0 or 300 mg CaCO3 L–1). The control medium
was prepared similarly, using 0.1 ml of a fungus–free solution of Tween 80
(0.1% v/v) per Petri dish. A 20 ml volume of Czapek–Dox medium ensured
optimal fungal growth and nutrient use during the cultivation period.
After 35 days of cultivation, the fungal mycelium was carefully

removed by surface scraping, and fungus–free medium was cut into small
pieces (1–2 mm) with sterilized scissors. The pH was measured in a 1 M KCl
solution (1:2.5 w/v) and the Fe content was determined on an AAnalyst
200 atomic absorption spectrophotometer from Perkin Elmer (Perkin
Elmer AAS) after extraction with 0.005 M diethylenetriaminepentaacetic
acid (DTPA, 1:2 w/v), with stirring at 120 rpm for 2 h and centrifugation at
4053 g. The FeDTPA was used as a measure of the labile Fe (Lindsay and
Norvell, 1978).
170
CAPÍTULO IV
In summary, four fungal treatments (with M. brunneum, B.

bassiana, I. farinosa and a control without fungus), three different Fe
oxides (250 mg of Fe L–1 ferrihydrite, hematite, or goethite, and 0 mg of Fe
L–1 as a control), and the presence or absence of CaCO3 (0 or 300 mg CaCO3
L–1) were used to develop a completely randomized design with four
replicates per combination of the three factors (i.e., 32 treatment
combinations, with one Petri dish as the experimental unit and 128 Petri
dishes in total).
2.2. Pot experiment
2.2.1. Artificial substrate

A mixture containing 71% silica sand as inert medium, 4% silica sand
coated with ferrihydrite (Fe oxide–coated sand, FOCS) and 25% calcareous
sand to mimic calcareous conditions was used as the substrate. The silica
sand was sieved (0.2–0.5 mm), washed several times with Na2CO3–
enriched water (pH 9.5) to disperse clay and impurities, repeatedly washed
with de–ionized water and finally dried in an oven with forced aeration at
40 °C. The specific surface area of the sand as measured by N2 adsorption
(BET method) was 0.14 m2 g–1; its content of citrate/bicarbonate/
dithionite–extractable Fe (Fed), which is a measure of total Fe oxides
(Mehra and Jackson, 1958), was 40 mg kg–1; and its content of available
phosphorus as determined by Olsen method (Olsen et al., 1954) was 0.3
mg kg–1. Part of the silica sand was coated with ferrihydrite according to
Rahmatullah and Torrent (Rahmatullah and Torrent, 2000). For the FOCS,
the Fed was 380 mg kg–1, citrate/ascorbate–extractable Fe (Feca) (Reyes and
Torrent, 1996) at 250 mg kg–1 and oxalate–extractable Fe (Feox)
(Schwertmann, 1964) at 210 mg kg–1. The Feca and Feox are acceptably
171
CAPÍTULO IV
accurate proxies for poorly crystalline Fe oxides, which act as sources of

readily available Fe for plants.
The calcareous sand was sieved (0.2–0.5 mm), washed six times
with water and once with de–ionized water to remove impurities, and
dried at 40 °C. It had a surface area of 0.27 m2 g–1, Fed = 120 mg kg–1, Feca =
105 mg kg–1 and Olsen P = 1.0 mg kg–1.
2.2.2. Plants and culture

Cylindrical PVC pots that were 12 cm high and 5 cm in diameter were
covered with aluminum foil, and the drainage holes at the bottom were
filled with 250 g of the above–described mixture of sands after autoclaving
them at 121 °C for 20 min twice. Seeds of uniform size from Sorghum
bicolor L. cv 03CS780/779 were disinfected with 5% sodium hypochlorite
for 2 min and then washed several times with sterile de–ionized water.
After that, 10 seeds were placed on Petri dishes containing Malt Agar from
Biolife Italiana (Milan, Italy) to check the efficacy of the disinfection
method. As expected, no fungi or bacteria were re–isolated from the
disinfected seeds. Four seeds per pot were then sown before (leaf
spraying) or after the fungal applications (seed dressing and soil
treatment). All the plants except one in each pot were harvested and
removed 20 days after sowing (DAS).
The sorghum crop was held in a growth chamber under

photosynthetically active radiation at 350 µmol m2 s–1, with a photoperiod
of 16 h day/8 h night, a day/night temperature of 24/20 °C and a relative
humidity of 75% for 93 days. The plants were irrigated with 10 ml of
modified Hoagland solution per pot on a weekly basis. The solution
contained 5 mM Ca(NO3)2·4H2O, 1 mM KH2PO4, 5 mM KNO3, 2 mM MgSO4,
172
CAPÍTULO IV
0.05 µM KCl, 25 µM H3BO3, 2 µM MnSO4·H2O, 2 µM ZnSO4·7H2O, 0.5 µM

CuSO4·5H2O and 3 µM Na2MoO4·H2O. The KH2PO4 concentration was
increased to 10 mM after 2 weeks because some plants exhibited signs of P
deficiency, with purple spots on some leaves. The plants were weighed and
irrigated to 85% field capacity with de–ionized water on a daily basis, and
with nutrient solution once a week.
2.2.3. Inoculation methods (treatments) and

experimental design
Suspensions containing 5 × 108 conidia ml–1 of either B. bassiana or M.
brunneum were prepared by following the above–described procedure,
and they were used separately with the different inoculation methods.
These fungal strains were selected in response to the results of the initial
assay. The treatments involved applying the fungal solutions in three
different ways, and a control treatment without fungus was also used, as
follows:
(1) Seed dressing. This method was used before the seeds were
transferred to the pots. A total of 40 seeds were immersed in an
aseptic vessel containing 40 ml of fungal suspension, stirred at 120
rpm for 4 h and dried for less than 15 min in a flow chamber
before sowing. The seeds used in the other treatments were
stirred for 4 h in aseptic vessels containing 40 ml of sterile de–
ionized water with Tween 80 (0.1% v/v, no fungus).
(2) Soil treatment. A 5 ml volume of fungal solution was applied to the
top of the artificial substrate in each pot after sowing. All the other
pots were supplied with 5 ml of de–ionized water containing
Tween 80 (0.1% v/v, no fungus).
173
CAPÍTULO IV
(3) Leaf spraying. This treatment involved spraying 1 ml of fungal

suspension onto the first two leaves by using a manual hand
sprayer A model 27085 piston compressor from Artesania Latina,
(Cantabria, Spain) (23 L min–1, 103–345 kPa, 0.3 mm nozzle
diameter) was used 26 days after sowing (DAS) and prior to
spraying, and the surface of the pots was covered with aluminum
foil to prevent the conidia from reaching the substrate.
Immediately after the application, the plants were covered with a
transparent plastic bag for 24 h to facilitate moisture retention and
leaf penetration by the desired fungi. All the other plants were
sprayed with 1 ml of de–ionized water containing Tween 80 (0.1%
v/v, no fungus) and covered individually with plastic bags for 24 h.
(4) Control method. In this method, the seeds, substrate and first two
leaves were handled similarly to the previous one except that they
received a fungus–free solution (Tween 80, 0.1% v/v).
A total of 70 pots were used [(10 pots per combination of

inoculation method (soil treatment, seed dressing or leaf spraying) × 2
fungi (B. bassiana or M. brunneum), and 10 pots for the control treatment
without fungus]. A completely randomized design with four factors (three
inoculation methods and a control method) and 10 replicates (pots) per
factor was developed for each fungus. The experimental unit was a pot
bearing a plant.
2.2.4. Substrate analyses: Colony–forming units (CFU) and

FeDTPA
A 1 g quantity of substrate was collected from the top 0–2 cm of soil from
three randomly selected pots per sampling and inoculation method at 7,
174
CAPÍTULO IV
30, 68 and 93 DAS, and also from the control pots. Then, 10 ml of sterile
de–ionized water was added to the soil samples and the mixtures were
shaken on a Model 3000445 Orbit rotator stirrer from J.P. Selecta
(Barcelona, Spain) at 12 rpm for 90 min. Aliquots (0.1 ml) of four different
dilutions (1:10, 1:100, 1:1000 and 1:10000) were placed on four Petri
dishes containing SDAC (Biolife, Italy). The plates were placed in a culture
oven at 25 °C for 3–4 days and their numbers of colony–forming units
(CFU) were determined by counting.
The fungal growth was visually identified; B. bassiana colonies

exhibited dense white mycelia, whereas M. brunneum colonies exhibited
circular growth, were largely white and contained varying shades of green
in the central mycelia (Humber, 1997). In the event of contamination or
potential confusion with other fungal taxa, the mycelia and conidia were
removed with a sterile needle and mounted in a drop of fuchsine on a
microscope slide. The mounted slide was examined under a Motic BA400
light microscope for typical features of B. bassiana (viz., globose conidia
and zig–zag–shaped conidiophores) and M. brunneum (conidiophores
heavily branched in a candelabrum–like manner but very densely
intertwined and forming nearly wax–like fertile areas; short, blocky
conidiogenous cells lacking apical necks; and long conidial chains usually
laterally adherent in prismatic columns or continuous plates) (Humber,
1997).
Finally, substrate from four pots per inoculation method and

fungus was used to determine the FeDTPA at the end of the experiment. For
this purpose, 10 g of soil per pot was shaken with 20 ml of 0.005 M
diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA, 1:2 w/v) at 120 rpm for 2 h
175
CAPÍTULO IV
before centrifugation at 4053 g. The FeDTPA was determined on the Perkin

Elmer AAS as described in the in vitro assay section.
2.2.5. Fungal re–isolation from plant tissues

The endophytic colonization by B. bassiana and M. brunneum was assessed
in four determinations at 20, 28, 70, and 93 DAS. Three plants per
inoculation method (plus one from the control method) and sampling time
were randomly selected and harvested. During the first sampling (20 DAS),
the plants were randomly selected from those that were sown at the
beginning of the experiment and harvested to leave a single plant per pot
(experimental unit). For the second and third samplings (at 28 and 70 DAS,
respectively), the total number of pots per treatment and fungal strain was
reduced to 7 and 4, respectively. In the last sampling (93 DAS), three of the
last four plants per treatment and fungal strain were used to re–isolate the
endophytes and all four were used for additional analyses (see next
section).
For each sampling, the plants were harvested, and their leaves,
stems and roots were separated. A sample of the different plant parts was
disinfected in 2% NaClO (5% for roots) for 2 min before washing with
sterile de–ionized water twice for 2 min. The effectiveness of the surface
sterilization method was tested by plating 100 μL aliquots of 10 –1 to 10–3
dilutions from the water used to wash the plant material in Malt Agar from
Biolife Italiana (Milan, Italy) and incubated at 25 °C for 2 weeks to
determine the CFU. As expected, no fungi or bacteria were re–isolated
from the water that was used to wash the plant material. The surface of
the plant material was properly sterilized since no fungi or bacteria were
re–isolated from the water that was used to wash the plant material.
176
CAPÍTULO IV
The two youngest leaves in each sampling were split into 6

fragments of 1 cm2 each, and the stems and roots were split into 6
fragments that were 0.5 cm long. The resulting fragments were separately
placed on Petri dishes (one dish per plant for leaves, another for stems and
a third for roots) containing selective medium for B. bassiana and M.
brunneum. The B. bassiana selective medium consisted of 500 ml of de–
ionized water containing 10 g of oatmeal infusion, 10 g of agar, 225 mg of
dodine (N–dodecylguanidine monoacetate), 2.5 mg of chlortetracycline as
an antibacterial and 5 ml of a 10 mg L–1 solution of Crystal Violet. The M.
brunneum selective medium contained the following components, which
were suspended in 500 ml of de–ionized water: 5 g of glucose, 5 g of
bacteriological peptone, 7.5 g of ox gall, 17.5 g of agar, 5 mg of dodine (N–
dodecylguanidine monoacetate), 125 mg of cycloheximide and 250 mg of
chloramphenicol as an antibacterial. The Petri dishes containing the
different plant tissues were placed in a culture oven at 25 °C for
approximately 15–20 days, during which the proportion of fragments
exhibiting fungal outgrowth was recorded.
2.2.6. Plant and root parameters

The plant height, number of leaves and leaf chlorophyll concentration
(LCC) in the two youngest leaves from each pot were determined at 20, 29,
34, 42, 49, 56, 72, 79, 87 and 93 DAS. These variables were measured in 10
plants at the beginning of the experiment, but the number was reduced to
4 when they had to be harvested to assess the endophytic colonization in
the different samplings (destructive samplings). The LCC was determined
with an SPAD 502 portable chlorophyll meter from Minolta Camera Co.
(Osaka, Japan). The measurements were validated at the end of the
experiment against the chlorophyll total concentration (CTC) extracted
177
CAPÍTULO IV
from the two youngest leaves with a 99.5 wt% solution of methanol (r =
0.75, p < 0.001) according to (Wintermans and de Mots, 1965). The SPAD
proved a reliable proxy for estimating the CTC in the pot experiment.
The last four sorghum plants for each inoculation method, control
method included, and the fungal strain remaining at the end of the
experiment (93 DAS) were harvested and split according to the plant tissue
(roots, stems and leaves). A portion of each type of tissue was used to
assess the fungal re–isolation as described in the previous section. The
remaining roots were washed with de–ionized water for scanning on an
Epson Perfection V700 scanner, and the captured images were analyzed
with WinRhizo® software (Régent Instrument, Inc., Québec, Canada,
regent.qc.ca). As recommended by (Bouma et al., 2000), we used the
automatic thresholding in the imaging software to optimize the threshold
that divided the gray levels into two distinct groups (roots and background)
and to determine the root length, specific root length (SRL, equation 1)
(Klepper, 1991; Fitter, 2002), specific root area (SRA, equation 2)
(Cornelissen et al., 2003; Jiménez and Arias, 2004) and root length as a
function of the root diameter (L ≤ 0.2, 0.2 < L ≤ 1.0, L > 1.0 mm).
•••• •••!•"
••• (•⁄•) =
#$% &•'!"•
(1)
•••• 2$•2
()* (,- ⁄./) = #$% &•'!"• (2)
The leaves and stems (in combination) and roots (after scanning)
were dried in an oven at 70 °C for at least 73 h to determine the dry weight
per plant. The dried leaves were ground and digested with a mixture of
nitric and perchloric acids (Zasoski and Burau, 1977). The Ca, Mg, Fe, Mn,
Zn and Cu were determined on the Perkin Elmer AAS, K on a Jenway PFP7
178
CAPÍTULO IV
flame emission spectrometer and P by Molybdenum Blue method (Murphy

et al., 1962) on a Perkin Elmer Lambda 35 UV/VIS spectrophotometer. The
C and N were quantified by direct combustion on an EA3000 Analyzer from
Eurovector SpA (Milan, Italy).
2.2.7. Statistical analysis

Statistical analyses were performed with STATISTIX 10 software from
Analytical Software (Tallahassee, FL, USA). Previously, the data were
checked for normal distribution and homoscedasticity by using the
Kolmogorov–Smirnov test and Levene’s test, respectively. An analysis of
variance (ANOVA) was performed to identify the effects of the studied
factors (fungal strain, Fe oxide and CaCO3) on the pH and FeDTPA in the in
vitro assay and on the dry weight of the above–ground biomass and roots;
nutrient contents of above–ground biomass; CTC; root length; SRL, SRA
and root length as a function of root diameter in the sorghum plants; CFU
in soil and re–isolation of each fungal strain from plant tissues in the pot
experiment. An additional factorial ANOVA for the FeDTPA and pH was
performed for each combination of fungal strain, Fe oxide and the absence
or presence of CaCO3 in the in vitro assay. Logarithmic transformations
were applied whenever the requirements for parametric analyses were not
met. Additional correlation analyses between the pH and FeDTPA at the end
of the experiment (35 days) were performed. In addition, a split–plot
ANOVA was performed on each fungal strain with a provision for the factor
time and the interaction time × inoculation method for the plant height,
number of leaves, LCC and LCC × plant height for each fungal strain. When
the differences were significant (p < 0.05), a post hoc LSD test was used to
separate the means. The control group was excluded from the statistical
179
CAPÍTULO IV
analyses for CFU in soil and the colonization of plant tissues in the pot
experiment because it almost invariably had zero values.
3. Results
3.1. In vitro experiment

Table 1 shows the results of the factorial analysis for the FeDTPA and pH in
the Czapek–Dox medium at the end of the in vitro assay (after 35 days).
Regarding Table 1, M. brunneum could be said to produce the highest
FeDTPA concentrations (in mg Fe L–1), at 27.2 ± 5.6 and was followed in this
respect by I. farinosa (12.3 ± 1.8), B. bassiana (9.7 ± 1.9) and the control
without fungus (1.2 ± 0.3). Table 1 indicates that ferrihydrite was the
individual Fe oxide leading to the highest FeDTPA contents in the medium at
30.1 ± 5.2, followed by hematite (10.8 ± 1.9) and goethite (9.2 ± 1.9).
However, the addition of CaCO3 decreased the FeDTPA. Beauveria bassiana
and I. farinosa raised the pH of the medium (to 8.1 ± 0.1 and 8.2 ± 0.1,
respectively); by contrast, M. brunneum did not alter the pH relative to the
control without fungus (6.5 ± 0.1 vs 6.7 ± 0.3). Finally, all three Fe oxides
increased the pH in relation to the control without Fe (7.4–7.5 vs 7.0 ± 0.3),
and so did the presence of CaCO3 (7.9 ± 0.1–6.8 ± 0.2).
In any case, there were multiple interactions between the different

factors for the FeDTPA and pH except for Fe oxide × CaCO3 in FeDTPA (p =
0.096) and Fungus × Fe oxide × CaCO3 and pH (p = 0.449) (see Table 1).
These interactions are illustrated in Fig. 2 and the S1 Table. The S1 Table
indicates that the presence of CaCO3 decreased the FeDTPA and increased
the pH in most determinations. In all the factor combinations, the EPF
180
CAPÍTULO IV
activity led to increased FeDTPA values in relation to the control without

fungus. Although M. brunneum invariably produced the highest FeDTPA
concentrations, the differences from the other two fungi with goethite as
the Fe source in the presence of CaCO3 were not significant, nor were
those between M. brunneum and I. farinosa with the same Fe source in the
absence of CaCO3 (Fig. 2A).
.
Table 1. Factorial ANOVA for the FeDTPA and pH (mean and standard error, n =
4) of the Czapek–Dox medium after culturing the three strains at 25 °C for 35
–1
days with each combination of fungus, Fe oxide (0 or 250 mg L ) and the
presence or absence of CaCO3
FeDTPA pHKCl
–1
(mg L )
Fungus
No fungus 1.2 ± 0.3 6.7 ± 0.3
B. bassiana 9.7 ± 1.9 8.1 ± 0.1
I. farinosa 12.3 ± 1.8 8.2 ± 0.1
M. brunneum 27.2 ± 5.6 6.5 ± 0.1
p value < 0.001 < 0.001
Fe oxide
(a)
Control 0.0 ± 0.0 7.0 ± 0.3
Ferrihydrite 30.1 ± 5.2 7.5 ± 0.2
Hematite 10.8 ± 1.9 7.5 ± 0.2
Goethite 9.2 ± 1.9 7.4 ± 0.2
p value < 0.001 < 0.001
CaCO3
–1
0 mg L 17.0 ± 3.1 6.8 ± 0.2
–1
300 mg L 8.1 ± 1.3 7.9 ± 0.1
p value < 0.001 < 0.001
Interactions
Fungus × Fe oxide <0.001 <0.001
Fungus × CaCO3 0.045 <0.001
Fe oxide × CaCO3 0.096 <0.001
Fungus × Fe oxide × CaCO3 <0.001 0.449
(a) –1
Control (0 mg Fe L )
181
CAPÍTULO IV
In addition, I. farinosa significantly increased the FeDTPA in relation

to B. bassiana with hematite as the Fe source, whether or not CaCO3 was
present, and with goethite in the absence of CaCO3. However, this trend
was not found with the other combinations of factors (Fig. 2A).
Fig. 2. Mean FeDTPA and pH. The FeDTPA (A) and pH (B) in the
Czapek–Dox medium (mean ± standard error, n = 4) at the
end of the in vitro assay. Different letters indicate significant
differences between the different levels of each factor
according to an LSD post hoc test at p < 0.05.
182
CAPÍTULO IV
The fungus–free treatment led to the lowest pH values in the

absence of CaCO3 except when no Fe source was used; however, it
exhibited the opposite trend with ferrihydrite as the Fe source in the
presence of CaCO3 (Fig. 2B). Overall, I. farinosa and B. bassiana increased
the pH compared to M. brunneum in all the combinations of factors. In
addition, M. brunneum resulted in the lowest pH in the presence of CaCO3,
except with ferrihydrite, as shown in S1 Table and Fig. 2B.
The FeDTPA and pH were negatively correlated in the control

without Fe in the absence of CaCO3 (r = –0.47, p < 0.001). Conversely, these
two variables were positively correlated for B. bassiana, I. farinosa and M.
brunneum (r = 0.72, r = 0.36, and r = 0.80, respectively; p < 0.001). In the
presence of CaCO3, the pH and FeDTPA were negatively correlated in the
dishes without fungus (r = –0.94, p < 0.001), but positively correlated in
those containing B. bassiana, I. farinosa or M. brunneum (r = 0.74, r = 0.35,
r = 0.63, respectively; p < 0.001).
3.2. Pot experiment
3.2.1. Colony–Forming Units (CFU)

Fig. 3 shows the time course of CFU in the substrate. As expected, no B.
bassiana or M. brunneum CFU were detected in the substrate samples
from the control pots. The highest CFU concentrations in the first sampling
(7 DAS) were those in the substrates from the soil treatment (4.3 × 106 ±
3.3 × 104 conidia g–1 for B. bassiana and 1.6 × 107 ± 3.4 × 105 conidia g–1 for
M. brunneum), followed by seed dressing (9.7 × 104 ± 3.3 × 103 conidia g–1
for B. bassiana and 8.3 × 105 ± 8.8 × 104 conidia g–1 for M. brunneum) and
leaf spraying (no CFU detected, p < 0.001). In the second sampling, which
183
CAPÍTULO IV
was performed four days after leaf spraying (i.e., 30 DAS), the soil
treatment led to significantly (p < 0.001) higher CFU concentrations (9.3 ×
105 ± 6.7 × 104 conidia g–1 for B. bassiana and 1.3 × 107 ± 1.1 × 106 conidia
g–1 for M. brunneum) than the seed dressing and leaf spraying (ca. 2 × 104
conidia g–1 for both treatments and fungi). A decrease in the CFU was
observed with both fungi that was especially sharp with seed dressing and
leaf spraying in B. bassiana (Fig. 3A), and with leaf spraying in M.
brunneum (Fig. 3B), during the third sampling (68 DAS). Note that seed
dressing resulted in a constant CFU concentration with M. brunneum
throughout the experiment and that leaf spraying only resulted in CFU
production at 30 DAS with both fungal strains.
3.2.2. Fungal re–isolation

Neither B. bassiana nor M. brunneum were detected in any plant tissue
from the control plants. In addition, neither fungus was re–isolated from
the leaves, stems or roots of the leaf–sprayed plants in the first sampling
(20 DAS) because this treatment was applied 6 days after sampling (26
DAS). The fungal re–isolation from the different plant tissues progressively
decreased after the second sampling until the end of the culture (93 DAS),
independent of the inoculation method (Fig. 4).
184
CAPÍTULO IV
–1
Fig. 3. Colony–forming units (CFU). The number of conidia g in
the calcareous substrate (mean ± standard error, n = 4) for each
fungal strain as a function of the inoculation method (seed
dressing, soil treatment and leaf spraying) at 7, 30, 68 and 93
days after sowing (DAS). The dashed line indicates the time of
application of the leaf treatment. No B. bassiana or M. brunneum
CFUs were detected in the substrate samples from the control
pots. Different letters indicate significant differences between
inoculation methods in each sampling according to the LSD post
hoc test at p < 0.05
185
CAPÍTULO IV
Fig. 4. Re–isolation. The time course for the colonization (mean ± standard error, n = 4) of
the leaves, stems and roots by B. bassiana (A, C, E) and M. brunneum (B, D, F) as a function
of the inoculation method. The dashed line indicates the time of the leaf spraying (26 DAS)
application. Different letters indicate significant differences between inoculation methods
according to the LSD post hoc test at p < 0.05.
The re–isolation of both fungi from leaves peaked in the second

sampling (28 DAS) and amounted to 69 ± 10% with leaf spraying, 39 ± 7%
with soil treatment and 11 ± 3% with seed dressing in B. bassiana (Fig. 4A),
90% with leaf spraying and soil treatment with no difference between the
186
CAPÍTULO IV
two and 56 ± 12% with seed dressing in M. brunneum (Fig. 4B). A decrease
in re–isolation was observed in the third and fourth samplings (70 and 93
DAS, respectively) with leaf spraying (39 ± 3% and 19 ± 3%) and soil
treatment (28 ± 3% and 17 ± 5%). However, the re–isolation of B. bassiana
as applied by seed dressing remained constant at 8 ± 5% (Fig. 4A). A
decrease in the M. brunneum re–isolation was also observed in the third
and fourth samplings with the leaf spraying (53 ± 6% and 19 ± 7%), soil
treatment (58 ± 8% and 28 ± 7%) and seed dressing (36 ± 7% and 14 ± 7%)
(Fig. 4B). However, the differences among treatments at the end of the
experiment were not significant (Fig. 4A and 4B).
During the first sampling (20 DAS), soil treatment resulted in the
highest re–isolation (63 ± 7%), followed by seed dressing (46 ± 4%) in B.
bassiana (Fig. 4C). During the second and third samplings (28 and 70 DAS,
respectively), a decrease in re–isolation was observed with leaf spraying
(31 ± 3% and 19 ± 7%) and soil treatment (28 ± 3% and 19 ± 3%); this was
not the case with seed dressing (19 ± 7% and 17 ± 5%), which resulted in
insubstantial differences among the treatments (Fig. 4C). The previous
values are lower than those obtained with seed dressing and soil
treatment in the first sampling. After the fourth sampling (93 DAS), the soil
treatment resulted in greater re–isolation (19 ± 3%) than leaf spraying and
seed dressing (ca. 8 with both) (Fig. 4C). The re–isolation of M. brunneum
at 20 DAS (Fig. 4D) exhibited 63 ± 7% with soil treatment and 50 ± 7% with
seed dressing, with no significant differences between the two. In the
second and subsequent samplings, the differences among treatments were
not significant. The re–isolation decreased in the following sequence from
28 to 93 DAS: soil treatment (64 ± 12% to 14 ± 3%) > leaf spraying (58 ± 5%
to 8 ± 5%) > seed dressing (42 ± 5% to 8 ± 0%) (see Fig. 4D).
187
CAPÍTULO IV
Significant differences in root colonization among treatments were
observed in the first, second and third samplings (Fig. 4E and 4F). The seed
dressing and soil treatment showed no significant differences between the
two and resulted in the greater re–isolation of both fungi from 20 to 70
DAS than did leaf spraying. The re–isolation declined gradually in the
following sequence with B. bassiana: soil treatment (72 ± 6% to 22 ± 6%) >
seed dressing (67 ± 17% to 22 ± 3%), with no significant differences
between the two (Fig. 4E). The situation was similar for M. brunneum, with
no significant differences between the soil treatment (a decrease from 89
± 6% to 33 ± 5%) and seed dressing (78 ± 6% to 31 ± 3%) (Fig. 4F). The re–
isolation with leaf spraying never exceeded 6 ± 3% for B. bassiana or 19 ±
6% for M. brunneum in any sampling.
3.2.3. Plant growth and LCC

As observed in Fig. 5A and 5B, the fungal inoculation method used here
influenced the sorghum plant height. Thus, from 72 DAS to 93 DAS, the B.
bassiana plants inoculated by seed dressing were significantly taller than
the ones that were inoculated by leaf spraying (Fig. 5A). The seed–dressed
plants were also significantly higher than those in the soil treatment and
control groups at 79 DAS, and higher than the control plants at 93 DAS. In
most cases, the leaf–sprayed plants were the shortest, but the differences
from the control plants were never significant. The tallest M. brunneum
plants from 72 DAS to the end of the experiment were in the soil
treatment and seed dressing groups (p < 0.001 for each determination; Fig.
5B). Leaf spraying produced the shortest plants in relation to the other
treatments (control plants included). Although a similar effect was
observed at 56 DAS, no significant differences in this respect were found
between the seed dressing and control plants (Fig. 5B).
188
CAPÍTULO IV
Fig. 5C and 5D show the time course of the LCC. As observed, there
were three distinct stages. The LCC peaked in the first stage (20 to 34 DAS),
at 33.6 ± 0.6 in the control plants, 33.1 ± 0.9 in B. bassiana–inoculated
plants and 31.5 ± 0.8 in M. brunneum–inoculated plants, with no significant
differences between the inoculation methods and the control treatment in
either fungus. During the second stage (42 to 79 DAS), the LCC dropped
and the Fe chlorosis symptoms (viz., interveinal yellowing) became
apparent. There were significant differences among the treatments in
inoculated plants at the end of this stage. Thus, the inoculated B. bassiana
plants exhibited significantly higher LCC values than their control
counterparts at 72 DAS (p = 0.021 for the three inoculation methods) and
79 DAS (p = 0.048, but they were significant only in the soil treatment
group) (Fig. 5C). Inoculated M. brunneum plants also differed significantly
from the control plants at 72 DAS (p < 0.001 for the three inoculation
methods) and 79 DAS (p = 0.013, but significant only with leaf spraying and
soil treatment) (Fig. 5D). In the last two measurements, the LCC increased
slightly and became more similar among treatments, with no significant
differences through the end of the experiment (third stage, 87 to 93 DAS).
Fig. 5E and 5F show the LCC × Plant height interaction as a measure

of the overall plant status regarding Fe chlorosis, interveinal yellowing and
growth. All the fungal treatments led to higher values in B. bassiana than
did the control treatment at 72 DAS (p = 0.007) and 79 DAS (p = 0.013);
however, on the latter date, the differences from the control group were
only significant with soil treatment and leaf spraying (Fig. 5E).
189
CAPÍTULO IV
Fig. 5. Plant height, LCC and LCC × Plant height in sorghum. A time course of the sorghum
plant height, LCC (leaf chlorophyll concentration) and LCC × plant height (mean ± standard
error, n = 4) for B. bassiana (A, C, E) and M. brunneum (B, D, F) as a function of the
inoculation method. Different letters indicate significant differences between inoculation
methods according to the LSD post hoc test at p < 0.05.
In M. brunneum (Fig. 5F), the three fungal treatments led to

significantly higher LCC × Plant height values than the control treatment at
72 DAS (p < 0.001) and 79 DAS (p = 0.005). Subsequently, the only
significant differences were those resulting from soil treatment, which led
190
CAPÍTULO IV
to the highest values, at 87 DAS (p = 0.055 for B. bassiana and p < 0.001 for
M. brunneum).
There were no significant differences in the number of leaves

between the plants inoculated with B. bassiana and those in the control
group (Fig. S1A). By contrast, the plants inoculated with M. brunneum (Fig.
S1B) differed significantly among the groups (p < 0.001) in all the samplings
except at 49 DAS). The smallest numbers of leaves were those in the soil
treatment plants at 20, 29, 34, 42 and 72 DAS and those in the plants of
the soil treatment, seed dressing and control groups at 56, 79, 87 and 93
DAS. By contrast, leaf spraying produced the largest number of leaves at
the end of the cropping period (56 to 93 DAS, Fig. S1B).
The CTC values (in µg cm–2) of plants inoculated with B. bassiana at

the end of the experiment (93 DAS) decreased in the following sequence
(S2 Table: soil treatment > seed dressing > control treatment > leaf
spraying (p = 0.029). The sequence for plants inoculated with M. brunneum
was as follows: leaf spraying > soil treatment > seed dressing > control
treatment (p = 0.011).
3.2.4. Root parameters

The root dry weights (S3 Table) were unaffected by the fungal strain and
inoculation method. However, the total root length (m) for both fungal
strains was significantly influenced by the inoculation method. Thus, the
total root length in the plants inoculated with B. bassiana was 21.2 ± 2.4
with seed dressing, 21.6 ± 1.4 with soil treatment and 22.5 ± 2.8 with leaf
spraying, with all three values being significantly greater (p = 0.031) than
that for the control plants (12.2 ± 1.3) but not significantly different from
one another. With M. brunneum (p < 0.004), the total root length was
191
CAPÍTULO IV
greatest with soil treatment (26.5 ± 0.8), followed by leaf spraying (21.3 ±
2.3), seed dressing (18.2 ± 2.7) and the control treatment (12.2 ± 1.3) (Fig.
S2).
The specific root length (SRL) in the plants inoculated with B.

bassiana (Fig. 6A) was greater with seed dressing and soil treatment than
with the control treatment (p = 0.024); however, there were no significant
differences with leaf spraying. A similar trend was observed with M.
brunneum (Fig. 6B), but the differences were only significant with the soil
treatment (p = 0.008). The specific root area (SRA) in the plants inoculated
with B. bassiana exceeded that in the control plants; the differences were
significant for all treatments except leaf spraying (p = 0.014, Fig. 6C). The
plants inoculated with M. brunneum behaved similarly with regards to the
SRA, with the differences being significant for all treatments except seed
dressing (p = 0.005, Fig. 6D).
The fine roots (less than 0.2 mm in diameter) were less abundant
in the control plants than in those inoculated with B. bassiana (p = 0.039,
Fig. 6E) or M. brunneum (p = 0.001, Fig. 6F, seed–dressing plants excepted).
The results for roots 0.2–1.0 mm in diameter were similar (p = 0.029 with
B. bassiana and p = 0.006 with M. brunneum). No differences between
inoculation methods and the control treatment were found in roots thicker
than 1.0 mm (p = 0.154 with B. bassiana and p = 0.091 with M. brunneum;
Fig. 6E and 6F).
192
CAPÍTULO IV
Fig. 6. Root parameters. Specific root length (SRL), specific root area (SRA) and root length
according to the root diameter (mean ± standard error, n = 4) for sorghum plants inoculated
with B. bassiana (A, C, E) or M. brunneum (B, D, F) by using different inoculation methods.
Different letters indicate significant differences between inoculation methods according to
an LSD post hoc test at p < 0.05.
3.2.5. Nutrient contents of above–ground biomass

Table 2 and S3 Table show the dry weight and nutrient contents of the
above–ground biomass from the sorghum plants at the end of the cropping
193
CAPÍTULO IV
period (93 DAS). Although the sorghum plants exhibited Fe deficiency
symptoms (internerval yellowing throughout the trial) and purple leaf
coloration due to P deficiency (in this case, only during the first two
weeks), all the plants exhibited vigorous growth.
Table 2. Analysis of variance for above–ground plant dry weights and micronutrient
contents in the biomass of the sorghum plants (mean ± standard error, n = 4) at the
end of the experiment (93 DAS) with each fungus and inoculation method.
Dry weight Fe Mn Zn Cu
–1 –1 –1 –1
(g) (mg kg ) (mg kg ) (mg kg ) (mg kg )
B. bassiana
Seed dressing 1.59±0.12 31.3±2.5ab 10.2±0.2a 7.4±0.5 6.0±0.3a
Soil treatment 1.63±0.03 33.2±1.5a 9.3±0.6ab 8.4±0.3 6.2±0.1a
Leaf spraying 1.82±0.09 25.6±1.4b 8.2±0.3bc 8.7±1.2 5.4±0.1b
Control 1.62±0.19 18.2±1.9c 7.8±0.2c 9.7±0.5 4.9±0.2b
p value 0.531 <0.001 0.002 0.206 0.002
M. brunneum
Seed dressing 1.60±0.12 29.8±1.3a 13.2±1.3a 8.4±0.4b 6.4±0.1a
Soil treatment 1.79±0.11 27.7±2.0a 12.2±0.7a 7.9±0.2b 5.6±0.1b
Leaf spraying 1.52±0.05 27.4±1.6a 11.0±0.7a 7.9±0.4b 5.4±0.5b
Control 1.62±0.19 18.2±1.9b 7.8±0.2b 9.7±0.5a 4.9±0.2b
p value 0.491 0.002 0.004 0.023 0.010
Different letters indicate significant differences between the levels of each factor according to
the LSD post hoc test at p <0.05
There were no significant differences in dry weight, or in the K, P,

Ca or Mg contents, of the above–ground plant biomass between the
inoculation methods and the control treatment with either fungal strain
(S3 Table). Overall, the nutrient contents fell within their normal ranges
(Benton et al., 1991). Inoculation with B. bassiana significantly altered the
Fe, Mn and Cu contents (p < 0.001, p = 0.002 and p = 0.002, respectively) in
relation to the control plants (Table 2). The mean Fe, Mn and Cu contents
with soil treatment and seed dressing were higher than those for the leaf
spraying and control groups. Inoculation with M. brunneum also altered
the Fe, Mn, Cu and Zn contents to a significant extent (p = 0.002, p = 0.004,
194
CAPÍTULO IV
p = 0.023 and p = 0.010, respectively) (Table 2). Thus, the Fe and Mn
contents of the inoculated plants were significantly higher than the
contents of the control plants. However, the differences in Cu contents
were only significant with seed dressing, which led to the highest levels
relative to the control treatment. By contrast, the Zn content was slightly
lower in all the inoculated plants than in the control plants.
Finally, the FeDTPA at the end of crop, which is a measure of Fe

bioavailability, was not significantly affected by inoculation with either
fungus. The mean FeDTPA contents (mg Fe kg–1) with B. bassiana (p = 0.056)
were 1.16 ± 0.03 with soil treatment, 1.29 ± 0.03 with seed dressing and
1.28 ± 0.03 with leaf spraying, whereas those obtained with M. brunneum
(p = 0.208) were 1.16 ± 0.02 with soil treatment, 1.20 ± 0.05 with seed
dressing and 1.24 ± 0.03 with leaf spraying. The FeDTPA for the control group
was 1.28 ± 0.04.
4. Discussion
4.1. In vitro experiment

The soil pH is one of the primary factors influencing the EPF growth and
persistence in the soil (Quesada–Moraga et al., 2007). The optimum pH for
fungal growth is 5–10 for B. bassiana (Padmavathi et al., 2003; Otgonjargal
et al., 2015), approximately 7 for some Metarhizium species (Issaly et al.,
2005; Soundarapandian and Chandra, 2007), and approximately 5.8 for
some Isaria species (Hussein et al., 2014). These differences in pH values
may explain why the three EPF strains performed differently depending on
the particular combination of Fe sources and on the presence or absence
195
CAPÍTULO IV
of CaCO3. In fact, the pH of the culture medium ranged from 5.6 without
CaCO3 to 8.4 with CaCO3 when using hematite or goethite as the Fe
sources, and from 5.2 without CaCO3 to 6.8 with CaCO3 when ferrihydrite
was the Fe source. In the last case, the amorphous nature of ferrihydrite
caused it to release protons continuously while crystallizing (Schwertmann
and Cornell, 2000). This release might be the reason why ferrihydrite led to
a pH of 6.8 and the other Fe sources led to a pH of 8 in the presence of
CaCO3.
Fungi (EPF included) are known to alter their environment by

releasing organic acids (Liaud, et al., 2014), and the concentrations of
nutrients such as Fe, Cu, and Ag (Joseph et al., 2012), Zn (Sazanova et al.,
2015) or P (Li et al., 2016) increase as a result. The released organic acids
lower the pH of the medium and increase the solubility of Fe oxides. In our
experiment, B. bassiana and I. farinosa basically raised the pH of the
medium (Table 1) in relation to the control treatment without fungus in
the absence of CaCO3. This increase in pH can be ascribed to the presence
of Fe(NO3)3 and NaNO3 in the Czapek–Dox culture medium, providing NO3–
anions as a source of N and forcing the fungi to release OH– ions, which
had to be absorbed to ensure homeostatic regulation, thereby alkalizing
the medium (Villegas et al., 1996).
Metarhizium brunneum reduced the pH of the medium under

calcareous conditions (i.e., in the presence of CaCO3). However, it is clear
(Fig. 2B) that this reduction did not occur in the absence of CaCO3,
probably because the solubility of Fe was not reduced by the low prevailing
pH, or with ferrihydrite as an Fe source in the presence of CaCO3,
conditions under which Fe was more readily available, more reactive and
soluble, because of the higher surface area of ferrihydrite (Chen and Barak,
196
CAPÍTULO IV
1982; Vempati and Loeppert, 1986). In this situation, the fungi were
required to produce smaller amounts of organic acids than under
calcareous conditions or when the Fe source was a crystalline Fe oxide, and
iron was thus less readily available.
In addition, fungi produce and release substances with low

molecular weights called siderophores. These substances have a high
affinity for Fe, and also for other nutrients such as Mn, Zn and Cu, which
facilitates its chelation and makes it more readily available (Kaplan and
Kaplan, 2009, Sanvisen and Puig, 2011; Hider and Kong, 2010; Krasnoff et
al., 2014; Jirakkakul et al., 2015). This Fe acquisition mechanism, which
requires no direct alteration of the pH, may have compounded with the
release of organic acids to increase the Fe availability in the culture
medium.
As expected, the presence of CaCO3 reduced the Fe availability and

raised the pH (Tagliviani and Rombolà, 2001). The three EPF strains
increased the Fe availability in a different way; thus, M. brunneum
probably released organic acids in more under calcareous conditions, and
probably all three fungi produced siderophores. Based on the results for
the three EPF strains and the wider pH range for the optimal growth of B.
bassiana, we chose to use this species together with M. brunneum in the
pot experiment under calcareous conditions.
4.2. Pot experiment

Our calcareous artificial substrate mimicked the conditions of low
Fe availability in calcareous soils and was useful for reducing the number of
variables, potentially modulating the effect of EPF on the plant growth and
Fe nutrition in these soils. Although the number of fungal propagules (CFU)
197
CAPÍTULO IV
of B. bassiana and M. brunneum decreased gradually throughout the pot
experiment, it remained above the natural background level for the
substrates in which the fungi were applied to soil at ≤ 104 conidia g–1
(Scheepmaker and Butt, 2010). The CFU in the substrate with soil
treatment was higher for M. brunneum than it was for B. bassiana. This
result is consistent with those of previous experiments (Salazar et al., 2007;
Garrido–Jurado et al., 2011) in which the increased size of the M.
brunneum conidia resulted in easier retention in sandy substrates, whereas
the smaller size of the B. bassiana conidia facilitated their vertical dragging
by water through macropores in sand particles. Both M. brunneum and B.
bassiana are rhizosphere–competent fungi (St. Leger et al., 2008) and can
persist in the soil for a long time (Bidochka et al., 2001). The CFU in the
substrate with seed dressing may have resulted from fungal growth from
the surface and inside of seeds and plants having been more marked with
M. brunneum (CFU > 104 conidia g–1 in the four samplings). Although the
substrates were covered with aluminum foil to prevent contamination, leaf
spraying led to CFU being detected in the substrate during the sampling
following the application of the fungi. Nevertheless, the sterilization of the
substrate implies that the microbial diversity in our sterile artificial
substrate was not the same as it was in non–sterile substrates or under
natural conditions, and this environment should have facilitated the
growth of the EPF (Katznelson, 1940; Warcup, 1950; Trevors, 1996; Bennet
et al., 2003). Consequently, the results obtained using a sterile substrate
might not be comparable to those using the same substrate when it is
non–sterile. The primary reason is the antagonistic effect of soil
sterilization on substrate microbial diversity, which minimizes biological
competence for EPF. However, similar trends in CFU in soil have been
found in experiments that were developed by our research group using
198
CAPÍTULO IV
non–sterilized calcareous soils and M. brunneum applied to the surface
(Sánchez–Rodríguez et al., 2016).
Although B. bassiana is seemingly a more efficient endophyte than

M. brunneum (Landa et al., 2013), our results do not support this
assumption. In fact, M. brunneum was re–isolated to a greater extent from
most plant tissues and in most samplings. The differences in persistence
between M. brunneum and B. bassiana after inoculation may have resulted
from the inoculation method, fungal strain, host plant genotype and sandy
substrate in use. In fact, the re–isolation of B. bassiana from the sorghum
plants inoculated by seed dressing, soil treatment and leaf spraying was
previously found to be strongly influenced by the particular substrate (viz.,
sterile soil, non–sterile soil or vermiculite) (Tefera and Vidal, 2009).
Consequently, these factors influenced the success of the plant–endophyte
associations (i.e., the re–isolation percentage) (Quesada–Moraga et al.,
2014).
Our re–isolation results are consistent with those of previous

studies in which B. bassiana and M. brunneum successfully colonized
various plant tissues as endophytes, both in wheat inoculated with the two
fungal strains (Sánchez–Rodríguez et al., 2017) and in cassava roots
inoculated with B. bassiana and M. anisopliae (Greenfield et al., 2016). As
suggested by Tefera y Vidal (2009) for pot–grown sorghum, a successful
colonization may have relied on the hyphal motion and growth in the
internal structures of the plants. Additionally, as suggested by Quesada–
Moraga et al. (2006) for Papaver somniferum, and by Landa et al. (2013),
García et al. (2011) and Resquín–Romero et al. (2016) for tomato, melon
and alfalfa plants, the re–isolation of the fungus at a fairly long distance
from the inoculation point indicates that the circulation of the endophyte
199
CAPÍTULO IV
in a plant is due to a passive movement within the xylem and to the
development of hyphae in vascular elements.
The plant inoculation method was also critical in the pot

experiment because it governed the colonization of the plant tissues
during the cropping period and had a differential effect on the plant
growth (plant height and root) and LCC. Consistent with previous results
(Tefera and Vidal, 2009), the three inoculation methods (viz., seed
dressing, soil treatment and leaf spraying) enabled the colonization of the
leaves, stems and roots of the sorghum plants. The re–isolation results
were similar to those obtained previously in similar assays (Schwertmann
and Cornell, 2000), in which they found leaf spraying and soil treatment to
lead to endophytic colonization by 80% in bean plants (Phaseolus vulgaris
cv. Calima) that were inoculated with B. bassiana. However, the extent of
colonization was dependent on the particular plant tissue. In previous
studies, the leaves and stems responded better to leaf spraying treatments
in which the fungi were applied to the above–ground plant biomass,
whereas the roots were more responsive to soil treatments in which the
fungi were applied to the soil (Parsa et al., 2013).
The two fungal strains and three inoculation methods used here
had no effect on the dry weight of the above–ground plant biomass or
plant roots; in addition, as in other trials (Akello et al., 2009; Gurulingappa
et al., 2010), the fungal application did not impair the plant growth.
However, the effect on the plant height was dependent on the particular
inoculation method and especially marked at the end of the experiment in
the plants inoculated by seed dressing with B. bassiana and those
inoculated by soil treatment or seed dressing with M. brunneum. By
contrast, leaf spraying with B. bassiana decreased the final plant height
200
CAPÍTULO IV
while increasing the number of leaves compared to the other three
treatments with M. brunneum. The increase in plant growth was not
reflected in the above–ground plant biomass, probably because the pots
were filled with only 250 g of substrate. Our results are consistent with
those of (Vega et al., 2009), who found that some species in the
Metarhizium and Beauveria genera commonly colonized the rhizosphere to
promote plant growth; with those of (Kabaluk and Ericsson, 2007), who
reported an increase in leaf density in field corn inoculated with M.
anisopliae via seed dressing; and with those of Sasan and Bidochka (Sasan
and Bidochka, 2012), who found M. robertsii to promote root growth in
switch grass inoculated using the same method.
The significant positive effect of inoculation on LCC at 72 DAS (with

both fungi and the three inoculation methods) and 79 DAS (soil treatment
with both fungi, and soil treatment and leaf spraying with M. brunneum),
that is, when the Fe chlorosis symptoms in the control plants peaked and
the LCC was lowest, reflects a clear–cut beneficial effect. The interaction of
the LCC × plant height (an indicator of plant health status with respect to
the Fe chlorosis) behaved similarly and led to more marked differences
between the inoculated plants and the control group. The positive effect
on the sorghum plants was more persistent with M. brunneum (from 72 to
87 DAS but only 72 and 79 DAS with the three inoculation methods) than it
was with B. bassiana (from 72 to 79 DAS but only 72 DAS with all three
inoculation methods). The inoculation method was also the key variable in
the persistence of the effect on the LCC; thus, soil treatment and leaf
spraying had a similar effect at 72 and 79 DAS, whereas seed dressing with
B. bassiana was significantly influential at only 72 DAS. With M. brunneum,
the three inoculation methods had a similar positive effect at 72 and 79
201
CAPÍTULO IV
DAS, but only the soil treatment extended the effect to 87 DAS. Therefore,
inoculation with B. bassiana or M. brunneum increased the LCC in young
leaves and increased the Fe content, irrespective of the inoculation
method, in the above–ground biomass of sorghum plants grown under
calcareous conditions at the end of the pot experiment. In summary,
inoculation had a positive effect on the Fe nutrition. These results are
consistent with those of the in vitro assay, in which the EPF increased the
bioavailability of Fe from ferrihydrite in the calcareous medium. In
addition, they are consistent with those of Sánchez–Rodríguez et al.
(2015), who found that applying B. bassiana to wheat and tomato seeds
grown in an artificial calcareous substrate to increase the LCC to an extent
that was dependent on the ferrihydrite content of the substrate; and with
those of Sánchez–Rodríguez et al. (2016), who found that applying M.
brunneum to calcareous soils to alleviate the Fe chlorosis symptoms in
sorghum and wheat plants.
Overall, the three inoculation methods were effective at promoting

root growth in relation to the control group, with the soil treatment being
the most effective method in terms of the SRL, SRA and fine roots with
both fungi. The fine roots (less than 0.2 mm in diameter), SRA and total
root length were related to the ability of the plants to explore the soil and
obtain water and nutrients from it (Garnier and Growth, 1992; Ryser and
Lambers, 1995; Wahl and Ryser, 2000; Hummel et al., 2007). These findings
are highly significant for the uptake of nutrients such as Fe, Mn and Cu by
plants, especially when they are scant. Our results are consistent with
those of Jaber and Erkerly (Jaber and Enkerli, 2016), who found that
applying M. brunneum and B. bassiana via seed dressing would
systematically colonize different parts of bean plants (Vicia faba), and they
202
CAPÍTULO IV
increased the root lengths 7 days after inoculation, thereby resulting in
improved plant growth (plant height, number of leaves, fresh root weight
and shoot weight) at 14 and 28 days after inoculation.
Soil treatment was the inoculation method that produced the

largest amounts of CFU with both fungi, but particularly M. brunneum, in
our experiment. This result may have influenced the re–isolation of the
fungi, which was similar to that observed with seed dressing and greater
with M. brunneum than with B. bassiana in the roots. Liao et al. (2014)
used corn (Zea mays), and Parsa et al. (2016) used common bean
(Phaseolus vulgaris), and they both found a beneficial effect of
Metarhizium spp. on the plant growth and root promotion to rely on the
success of the fungus–plant association. Their results suggest that physical
root colonization is a prerequisite for many of the beneficial effects of
these fungi, which could partly explain our results. Additionally, Liao et al.
(2014) found that the Metarhizium strains used in their study could
promote plant growth and auxin production. Some evidence also likely
exists that may explain why soil treatment was the most efficient
inoculation method. Thus, as reported by Mukherjee et al. (2013) and
Harman and Shoresh (2007) for the Trichoderma species, we believe that
the mechanisms by which Metarhizium stimulates plant growth are
probably multifactorial and include the promotion of plant growth through
antibiotic, antiparasitic and host resistance–inducing effects. In any case,
our insect–free pot experiment revealed that the EPFs studied here had
direct positive effects on their plant hosts.
In general, the mineral element concentrations fell within the

normal ranges (Benton et al., 1991). An overall increase in the Fe, Mn and
Cu mean contents of the above–ground plant biomass in the inoculated
203
CAPÍTULO IV
plants relative to the control plants was observed (especially with seed
dressing and soil treatment). By contrast, inoculation with the fungi slightly
decreased the Zn contents. This detrimental effect on Zn may have
resulted from the potential adsorption of the metal onto Fe oxides,
diminishing its uptake by plants (Montilla et al., 2003). We hypothesize
that the alterations in root parameters (total root length and increased
SRL, SRA and fine roots) in inoculated plants facilitated the exploration of
the substrate, thereby resulting in increased contents of micronutrients
(primarily Fe) and had positive effects on the LCC and plant growth (in the
form of plant height) in our Fe–limiting calcareous substrate.
5. Conclusions
The three EPF strains used in the in vitro assay increased the Fe availability
under different conditions with respect to the Fe source (three Fe oxides of
different crystallinities and solubilities) and growing substrate (calcareous
or non–calcareous). Metarhizium brunneum was the most effective fungus,
seemingly as a result of its increase of the Fe availability by releasing
organic acids to lower the pH of the calcareous media. Both B. bassiana
and M. brunneum alleviated the Fe chlorosis symptoms in inoculated
sorghum plants grown on an artificial calcareous substrate. Although the
three inoculation methods used in this experiment had positive effects on
the plants, the soil treatment was the most effective method. Thus, it
resulted in the increased persistence of the fungus in the substrate (CFU),
re–isolation from different plant tissues to an extent comparable to that of
seed dressing, a more persistent effect on the chlorophyll concentration of
young leaves and plant growth relative to the other two inoculation
204
CAPÍTULO IV
methods, and a similar ability to increase the Fe uptake by sorghum plants.
As revealed by the root parameter values, the soil treatment also resulted
in a better exploration of the substrate. Therefore, the inoculation method
is a key factor to consider in designing sustainable agricultural strategies
based on EPF. The results of this work expand on the existing knowledge of
plant–EPF–soil relations, and they underscore the importance of the
inoculation method and the use of EPF to improve plant Fe nutrition in
calcareous substrates beyond their role as biocontrol agents.
6. Acknowledgments
We thank the Research Support Service (SCAI) of the University of Córdoba

for technical assistance in using its X–ray diffractometer and transmission
electron microscope.
205
CAPÍTULO IV
7. Supplementary data
S1 Table. FeDTPA and pH (mean ± standard error, n = 4) 0f the culture medium

after 35 days of fungal growth in the presence of different sources of Fe (0 or
–1 –1
250 mg L ) and the presence or absence of CaCO3 (0 or 300 mg L ).
With CaCO3 Without CaCO3
FeDTPA pHKCl FeDTPA pHKCl
–1 –1
(mg L ) (mg L )
No Fungus
(a)
Control 0.0 ± 0.0c 8.4 ± 0.1a 0.0 ± 0.0b 5.2 ± 0.1b
Ferrihydrite 2.0 ± 0.2a 6.8 ± 0.0b 5.1 ± 0.4a 5.2 ± 0.0b
Hematite 0.3 ± 0.0bc 8.4 ± 0.0a 0.4 ± 0.1b 5.7 ± 0.1a
Goethite 0.5 ± 0.1b 8.4 ± 0.1a 0.4 ± 0.0b 5.4 ± 0.0ab
p value <0.001 <0.001 <0.001 0.008
B. bassiana
(a)
Control 0.0 ± 0.0b 7.9 ± 0.0c 0.0 ± 0.0c 7.5 ± 0.3b
Ferrihydrite 20.2 ± 2.7a 8.5 ± 0.0a 32.3 ± 1.2a 8.5 ± 0.0a
Hematite 3.7 ± 0.1b 8.3 ± 0.1b 9.7 ± 1.0b 7.9 ± 0.1b
Goethite 3.7 ± 0.1b 8.0 ± 0.1c 7.4 ± 0.7b 8.0 ± 0.2ab
p value <0.001 <0.001 <0.001 0.014
I. farinosa
(a)
Control 0.0 ± 0.0c 8.4 ± 0.1ab 0.0 ± 0.0c 7.3 ± 1.0
Ferrihydrite 24.2 ± 1.5a 8.5 ± 0.1a 29.7 ± 1.4a 8.3 ± 0.1
Hematite 8.0 ± 0.6b 8.3 ± 0.1bc 14.5 ± 1.2b 8.3 ± 0.0
Goethite 7.6 ± 0.4b 8.3 ± 0.0c 13.6 ± 0.7b 8.0 ± 0.1
p value <0.001 0.023 <0.001 0.491
M. brunneum
(a)
Control 0.0 ± 0.0c 6.5 ± 0.4b 0.0 ± 0.0c 4.8 ± 0.1d
Ferrihydrite 32.5 ± 3.3a 7.3 ± 0.3a 94.6 ± 17.5a 6.8 ± 0.1a
Hematite 14.6 ± 2.4b 7.1 ± 0.1ab 34.8 ± 1.6b 6.4 ± 0.0b
Goethite 11.6 ± 6.3bc 6.8 ± 0.3ab 28.7 ± 7.3bc 6.0 ± 0.0c
p value <0.001 0.203 <0.001 <0.001
(a) –1
Control (0 mgFe L )
Different letters indicate significant differences between the levels of each factor
according to the LSD post hoc test at p <0.05
206
CAPÍTULO IV
S2 Table. Chlorophyll total concentration (CTC). Chlorophyll total concentration (CTC)

extracted from the two youngest leaves of each plant (mean ± standard error, n = 4)
according to the combination of fungus and inoculation method at the end of the
experiment (93 DAS).
B. bassiana M. brunneum
–2 –2
CTC (µg cm ) CTC (µg cm )
Seed dressing 19.4±2.0ab 16.6±1.1bc
Soil treatment 21.8±2.5a 19.0±1.5ab
Leaf spraying 14.3±1.4b 21.5±1.3a
Control 14.6±0.9b 14.6±0.9c
p value 0.029 0.011
Different letters indicate significant differences between the levels of each factor according to the
LSD post hoc test at p <0.05
S3 Table. Total macronutrient contents of plant biomass and root parameters. Analysis of
variance of macronutrient contents in the above–ground biomass, root dry weight and
root length of sorghum (mean ± standard error, n = 4) as a function of the fungus and
inoculation method at the end of the experiment (93 DAS).
Above–ground plant biomass Root
B. Root dry
K P Ca Mg Root length
bassiana weight
–1 –1 –1 –1
(g kg ) (g kg ) (g kg ) (g kg ) (g) (m)
Seed
40.1±3.1 2.93±0.35 3.9±0.4 4.0±0.3 0.65±0.08 21.15±2.39a
dressing
Soil
36.5±2.5 2.92±0.42 4.1±0.0 4.1±0.2 0.82±0.11 21.59±1.37a
treatment
Leaf
32.2±3.2 2.10±0.05 4.3±0.3 3.2±0.1 1.00±0.09 22.53±2.75a
spraying
Control 39.9±1.7 2.95±0.26 4.0±0.3 3.7±0.3 0.83±0.07 12.16±1.26b
p value 0.188 0.187 0.775 0.137 0.106 0.031
M.
brunneum
Seed
37.5±2.1 2.69±0.29 4.0±0.3 3.5±0.3 0.90±0.08 18.21±2.67bc
dressing
Soil
36.0±1.7 2.33±0.22 3.6±0.3 3.0±0.0 0.80±0.11 26.54±0.81a
treatment
Leaf
34.7±2.0 2.48±0.12 3.8±0.2 3.1±0.1 0.92±0.06 21.34±2.27ab
spraying
Control 39.9±1.7 2.95±0.26 4.0±0.3 3.7±0.3 0.83±0.07 12.16±1.26c
p value 0.278 0.560 0.647 0.136 0.728 0.004
Different letters indicate significant differences between the levels of each factor according to the
LSD post hoc test at p <0.05
207
CAPÍTULO IV
S1 Fig.. Number of leaves. Number of plant leaves for each treatment (mean ± standard
error, n = 4) applied to B. bassiana (A) and M. brunneum (B). Different letters indicate
significant differences between different levels of each factor according to an LSD post hoc
test at p <0.05.
208
CAPÍTULO IV
S2 Fig.. Images of the roots of plants that were inoculated with the fungi by using different
inoculation methods.
209
CAPÍTULO IV
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217
CAPÍTULO V:
Discusión general
CAPÍTULO V
Desde la llegada del siglo XXI son numerosos los trabajos que revelan el
gran potencial de los ascomicetos mitospóricos entomopatógenos (AME)
para el control de plagas y para su desarrollo como micoinsecticidas. Su
modo de acción por contacto los hace muy efectivos contra fitófagos
masticadores, con aparato picador chupador, contra plagas de insectos del
suelo, e incluso frente a insectos sinantrópicos (Quesada–Moraga et al.,
2006a; Ortiz–Urquiza et al., 2009; Garrido–Jurado et al., 2011). El carácter
endofítico de estos hongos extiende sus posibilidades, pues pueden ser
utilizados para la protección sistémica de la planta frente a insectos
barrenadores e incluso frente a insectos picadores y masticadores que se
alimentan de los tejidos colonizados de la planta (Schulz et al., 2002;
Quesada–Moraga et al., 2006a; Sree y Padmaja, 2008; Rohlfs y Churchill,
2011; Ríos–Moreno et al., 2016). Las cepas seleccionadas para la presente
tesis doctoral, EAMa 01/58–Su de M. brunneum y EABb 04/01–Tip de B.
bassiana han mostrado alta virulencia para distintas plagas de insectos, en
tratamientos aéreos y de suelo, así como capacidad de colonizar a la planta
de forma endofítica, y de protegerla frente al ataque de insectos
barrenadores e insectos ectófitos masticadores y picadores–chupadores
(Quesada–Moraga et al., 2006a; Resquín–Romero et al., 2016). Los
resultados de esta tesis doctoral enfatizan los beneficios del
comportamiento endofítico de cepas de AME sobre distintas plantas
cultivadas, no sólo por su ya demostrado impacto en el control de plagas,
sino también sobre su crecimiento y nutrición férrica (Tabla 1).
El capítulo II pone de manifiesto el doble beneficio que aportan los

AME, por un lado, como herramienta eficaz para el control de insectos y
ácaros, pero además, sobre la producción del cultivo, lo que les aporta un
gran potencial para ser desarrollados en programas de Control Integrado
221
CAPÍTULO V
de Plagas y Producción Integrada de Cultivos. Trabajos realizados dentro
de nuestro grupo de investigación ya habían informado de que la
colonización endofítica transitoria asociada a la aplicación por
pulverización foliar de la cepa EABb 04/01–Tip de B. bassiana a plantas de
alfalfa, tomate y melón, origina porcentajes significativos de mortalidad del
10 al 50% en larvas de S. littoralis alimentadas con las hojas colonizadas de
estos cultivos (Resquín–Romero et al., 2016). Nuestros resultados con
plantas de trigo blando, extienden este efecto a esta gramínea, con
mortalidades larvarias de S. littoralis del 56.7% cuando las larvas se
alimentaron con hojas colonizadas endofíticamente con la cepa EABb
04/01–Tip, tanto vía pulverización, como mediante la aplicación al suelo o
a la semilla, con porcentajes de mortalidad del 53.3% y del 30.0%
respectivamente, valores de mortalidad adicionales a los que produciría el
hongo aplicado de forma directa sobre las larvas del fitófago, que se
aproxima al 80% (Ríos–Moreno et al., 2017a). Llama la atención que nunca
se observó crecimiento fúngico a partir de los cadáveres de las larvas
infectadas, lo que sugiere que la mortalidad causada por estos hongos en
insectos masticadores, cuando los ciclos de infección se inician por la vía
digestiva, al ingerir tejido vegetal colonizado endofíticamente, podría estar
asociada a la producción de metabolitos insecticidas (Ríos–Moreno et al.,
2016; 2017a; 2017b).
En este capítulo se demostró también que B. bassiana fue capaz de

establecerse endofíticamente en raíces, tallos y hojas mediante diferentes
métodos de inoculación, e incluso su transmisión en trigo blando y trigo
duro, descrita por primera vez en adormidera (Quesada–Moraga et al.,
2006b), con porcentajes de colonización de alrededor del 13.5%. Las
aplicaciones al suelo y a la semilla incrementaron la producción de espigas,
222
CAPÍTULO V
obteniéndose rendimientos un 40% más altos que en las plantas control,
especialmente en la primera cosecha con el tratamiento a la semilla.
En los últimos años, el interés por la agricultura sostenible ha dado

lugar al creciente desarrollo y uso de bioinoculantes comerciales (bacterias
y/o hongos) para aumentar la movilización de nutrientes y aumentar su
disponibilidad para el cultivo de plantas (Owen et al., 2014). En condiciones
de deficiencia de Fe, las mejoras en el crecimiento de las plantas y las
concentraciones de nutrientes (Fe, Mn y Cu) que hemos observado en esta
tesis están directamente relacionadas con un efecto beneficioso general
debido a la inoculación con las cepas de AME utilizadas (Sánchez–
Rodríguez et al., 2015).
En este sentido, en los capítulos III y IV se profundiza mediante

ensayos in vitro en los mecanismos o estrategias que utilizan los AME para
solubilizar nutrientes y aumentar su biodisponibilidad, destacando la
importancia del Fe. Para ello, se han utilizado como sustratos de análisis
diferentes óxidos de Fe de diferente naturaleza, cristalinos como la
goethita o hematites, de solubilidad muy baja, o amorfos o poco cristalinos
como la ferrihidrita, que son fuentes de Fe más solubles (Vempati y
Loeppert, 1988). En respuesta a la baja disponibilidad de Fe, la mayoría de
los hongos desarrollan mecanismos específicos para obtener Fe para su
propia supervivencia (Behie y Bidochka, 2014). Los hongos poseen sistemas
de adquisición de Fe muy eficientes, tales como la producción de
sideróforos con una alta afinidad por el ion Fe3+ que median la absorción
de Fe (Lesuisse et al., 2001; Philpott y Protchenko, 2008; Kaplan y Kaplan,
2009; Sanvisens y Puig, 2011). Además, los hongos también tienen
mecanismos de reducción de Fe (ferroxidación y permeación) para la
reducción extracelular de Fe3+ inorgánico a Fe2+ mediante la producción de
223
CAPÍTULO V
metaloreductasas que incrementan su solubilidad (Georgatsou y
Alexandraki, 1994; Felice et al., 2005; Sanvisens y Puig, 2011). Finalmente,
también tienen la capacidad de producir ácidos orgánicos (p.ej. ácido
cítrico, ácido tartárico, ácido oxálico, ácido succínico, etc.) que favorecen la
solubilidad del Fe (Bidochka y Khachatourians, 1991; Fomina et al., 2005).
Nuestros resultados ponen de manifiesto que las cepas EABb 04/01–Tip,
EAMa 01/58–Su y EAIf 10/04–Msp son capaces de adaptar sus estrategias
de asimilación a las condiciones ambientes. La predominancia de una u
otra estrategia se evidencia con el hecho de que M. brunneum fue capaz
de reducir el pH del medio de cultivo en condiciones calcáreas (en
presencia de CaCO3), pero no fue así en ausencia de CaCO3, probablemente
porque la solubilidad del Fe no se vio afectada por el pH alcalino del
sustrato calizo, ni tampoco en presencia de ferrihidrita como fuente de Fe,
condiciones bajo las cuales el Fe estaba más disponible (por ser un óxido
de Fe con mayor superficie específica en comparación con los otros
utilizados). En estas situaciones, el hongo no necesita producir ácidos
orgánicos, y puede escoger como estrategia dominante la producción de
sideróforos.
La combinación de factores tales como la dosis y método de

aplicación es muy importante a la hora de seleccionar la cepa fúngica, ya
que determinará no sólo el porcentaje de colonización en la planta, sino la
capacidad de persistir en el ambiente durante un período de tiempo
deseable, sin que produzca un efecto perjudicial para la salud o el medio
ambiente, como indica la normativa reguladora (ej. Reglamento (CE) Nº
1107/2009 del Parlamento Europeo y del Consejo de 21 de octubre de
2009). Las dosis habituales que se suelen utilizar en los tratamientos de
campo están alrededor de 106–108 conidios g–1 de suelo, además estas
224
CAPÍTULO V
dosis son las más recomendadas para el control biológico en los ensayos de
laboratorio (Scheepmaker y Butt, 2010), sin embargo, se sabe que el efecto
de la dosis de hongo depende del cultivo en particular (Gurulingappa et al.,
2010).
De esta forma, los capítulos III y IV profundizan en la importancia

de la dosis y método de aplicación en diferentes especies de plantas
(monocotiledóneas y dicotiledóneas) en condiciones de cultivo variable
(suelos arcillosos o arenosos, y sustratos calizos), y sobre el efecto de la
colonización endofítica en la nutrición férrica de la planta. Aunque M.
brunneum sea un hongo competente en la rizosfera (Bidochka et al., 2001)
y B. bassiana sea un componente importante de la microbiota edáfica
(Quesada–Moraga et al., 2007), se ha constatado que sus propágulos en el
suelo están sometidos a los normales procesos de lixiviación y
translocación, con una reducción en el tiempo en el número de UFC
después de un tratamiento por inundación (Garrido–Jurado et al., 2011;
Yousef et al., 2013). Nuestros resultados muestran que las dosis de 5×10 6 y
5×108 conidios ml–1 son las más adecuadas para aplicar al suelo y producir
efectos positivos significativos sobre el crecimiento y la nutrición de las
plantas. En el capítulo III fue muy evidente la mejora del estatus nutricional
del sorgo, muy sensible a la clorosis en suelo calizo. Además, pudimos
apreciar claramente el efecto de promoción del crecimiento en las plantas
de girasol, con una mayor altura de la planta y una aceleración de la
floración que se reflejó en un incremento del diámetro y el peso seco de
las inflorescencias lo que se traduce en una mayor producción.
En el capítulo IV se observaron los mismos resultados positivos en

la promoción del crecimiento y la mejora de la nutrición que veníamos
obteniendo a lo largo de los diferentes ensayos. Pero en este caso, el
225
CAPÍTULO V
método de inoculación fue el factor decisivo; los tres métodos de
inoculación (tratamiento de semilla, aplicación al suelo y pulverización
foliar) fueron eficaces para promover el crecimiento de las raíces en
relación con el grupo control, pero el tratamiento del suelo resultó más
eficaz ya que se alcanzó una mayor longitud radicular y también del
número de raíces finas. Las raíces finas (<0.2 mm de diámetro) se han
relacionado con la capacidad de las plantas para explorar el suelo y
obtener agua y nutrientes de ella (Garnier, 1992; Ryser y Lambers, 1995;
Wahl y Ryser, 2000; Hummel et al., 2007). Estos hallazgos son altamente
significativos para la absorción de nutrientes como Fe, Mn y Cu por las
plantas, especialmente cuando son escasos.
Aunque los tres métodos de inoculación utilizados tuvieron efectos

positivos sobre el crecimiento y estatus nutricional de las plantas, el
tratamiento del suelo resultó ser el método más efectivo, relacionado
posiblemente a la mayor persistencia del hongo en el sustrato, lo que
puede explicar también los mayores porcentajes de re–aislamiento del
hongo en los diferentes tejidos vegetales. Los efectos positivos en el cultivo
fueron diversos, por un lado se observó un incremento en la concentración
de clorofila (SPAD) de hojas jóvenes y por tanto, disminución de los
síntomas de clorosis férrica; una mayor altura de las plantas de sorgo y
girasol, mayor floración en girasol, y mayor número de espigas en trigo, lo
que se traduce finalmente en un mayor rendimiento del cultivo. Como
pusieron de manifiesto los parámetros relacionados con la raíz, el
tratamiento del suelo además resultó en una mejor exploración del
sustrato. Por lo tanto, el método de inoculación es un factor clave a
considerar en el diseño de estrategias agrícolas sostenibles basadas en la
aplicación de AME.
226
CAPÍTULO V
Los resultados de este trabajo amplían el conocimiento existente sobre la
relación planta–AME–suelo y subrayan la importancia del método de
inoculación y el uso de AME para mejorar la nutrición del Fe en sustratos
calcáreos más allá de su papel como agentes de biocontrol. Esta Tesis
doctoral ha aportado un conocimiento más amplio sobre los beneficios del
uso de los AME para la Producción Integrada de Cultivos, no sólo por ser
una herramienta eficaz para el control biológico, sino también para
explotar nuevos roles relacionados con el alivio o mejora frente a síntomas
producidos por estreses abióticos que afectan a los cultivos. La capacidad
de los AME para promover el crecimiento de las plantas y aumentar los
rendimientos, mejorando su nutrición férrica, al mismo tiempo que las
protege de insectos dañinos, dibuja un horizonte nuevo en la producción y
protección integrada de cultivos, pero además, lanza fantásticos retos
científicos para revelar la naturaleza de la relación planta–endófito–
fitófago.
227
CAPÍTULO V
Tabla 1. Resumen de los resultados obtenidos. Continua 1/4
Tejido Efectos sobre
Capítulo Hongo Sustrato Planta Inoculación
colonizado estrés ABIÓTICO
Incrementó
número de
espigas
Incrementó un
Hoja, tallo, 40% el
Semilla
raíz, grano rendimiento del
Trigo grano
blando (*) Incrementó
longitud de la
EABb raíz
Suelo Incrementó
CAP. II 04/01– Hoja, tallo,
arenoso Suelo número de
Tip raíz, grano
espigas
Foliar Hoja, tallo
Hoja, tallo,
Semilla
raíz, grano
Incrementó
Hoja, tallo,
Trigo duro Suelo número de
raíz, grano
espigas
Hoja, tallo,
Foliar
raíz
(*) En este ensayo con trigo blando se realizó un control de larvas del fitófago Spodoptera
littoralis, obteniendo unos porcentajes de mortalidad del 30% con el tratamiento de semilla,
53.3% con el tratamiento al suelo y 56.7 % con la pulverización foliar. Obteniendo un tiempo de
supervivencia medio de 3 días.
228
CAPÍTULO V
Tabla 1. Resumen de los resultados obtenidos. Continúa 2/4
Tejido Efectos sobre
colonizado estrés ABIÓTICO
Czapek– Incrementó pH
EABb
dox + Aumentó
04/01– in vitro
óxidos de disponibilidad de
Tip
Fe Fe
Czapek– Sin efecto en pH
EAMa dox + Aumentó
in vitro
01/58–Su óxidos de disponibilidad de
Fe Fe
EAIf
dox + Aumentó
10/01– in vitro
óxidos de disponibilidad de
Msp
Fe Fe
No
Sorgo Suelo Incrementó SPAD
evaluado
No hubo
diferencias en
SPAD
Incrementó
altura de la
Suelo calizo
No planta
CAP. III Girasol Suelo
evaluado Aumentó
diámetro y peso
fresco de las
inflorescencias
Aceleró periodo
de floración
EAMa
No hubo
01/58–Su No
Sorgo Suelo diferencias en
evaluado
SPAD
No hubo
diferencias en
SPAD
Incrementó
Suelo
altura de la
arenoso
No planta
Girasol Suelo
evaluado Aumentó
diámetro y peso
fresco de las
inflorescencias
Aceleró periodo
de floración
229
CAPÍTULO V
Tejido Efectos sobre estrés
colonizado ABIÓTICO
EABb
dox +
04/01– in vitro Aumentó
óxidos de
Tip disponibilidad de Fe
Fe + CaCO3
Czapek– Disminuyó pH
EAMa dox +
in vitro Aumentó
01/58–Su óxidos de
disponibilidad de Fe
Fe + CaCO3
EAIf
dox +
óxidos de
Msp disponibilidad de Fe
Fe + CaCO3
EABb
dox +
óxidos de
Tip disponibilidad de Fe
Fe
Czapek– Sin efecto en pH
EAMa dox +
in vitro Aumentó
01/58–Su óxidos de
disponibilidad de Fe
Fe
CAP. IV Czapek– Incrementó pH
EAIf
dox +
óxidos de
Msp disponibilidad de Fe
Fe
Incrementó SPAD
Incrementó altura
Hoja, tallo, Incrementó SRL
Semilla
raíz raíces
Incrementó Fe, Mn y
Cu
Incrementó SPAD
EABb Incrementó altura
Sustrato
04/01– Sorgo Hoja, tallo, Incrementó SRL
calizo Suelo
Tip raíz raíces
Cu
Incrementó SPAD
Redujo altura
Hoja, tallo,
Foliar Incrementó SRL
raíz
raíces
Incrementó Fe, Cu
230
CAPÍTULO V

Tejido Efectos sobre estrés
colonizado ABIÓTICO
Incrementó SPAD
Incrementó altura
Semilla
raíz raíces
Incrementó Fe y Mn,
disminuyó Zn
Incrementó SPAD
Incrementó altura
EAMa Sustrato Hoja, tallo, Incrementó SRL
CAP. IV Sorgo Suelo
01/58–Su calizo raíz raíces
Cu, disminuyó Zn
Incrementó SPAD
Redujo altura
Foliar
raíz raíces
Incrementó Fe, Mn,
disminuyó Zn
231
CAPÍTULO V
Referencias
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CAPÍTULO V
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234
CAPÍTULO VI:
Conclusiones
108 106 104 102 C

CAPÍTULO VI
Conclusiones
A continuación se enumeran las conclusiones de los diferentes capítulos de

esta Tesis Doctoral. Las conclusiones 1 y 2 pertenecen al capítulo II de la
tesis, manuscrito “Sánchez–Rodríguez AR, Raya–Díaz S, Zamarreño AM,
García–Mina JM, del Campillo MC, Quesada–Moraga E. 2017. An
endophytic Beauveria bassiana strain increases spike production in bread
and durum wheat plants and effectively controls cotton leafworm
(Spodoptera littoralis) larvae. Biological Control, pp: 1049–9644.
doi:10.1016/j.biocontrol.2017.01.012 [Factor de Impacto JCR: 2.3, Q1
(11/93) en “Entomology”]”. Las conclusiones 1, 3, 4 y 5 corresponden al
capítulo III que comprende el manuscrito “Raya–Díaz S, Quesada–Moraga
E, Barrón V, del Campillo MC, Sánchez–Rodríguez AR. 2017. Redefining the
dose of the entomopathogenic fungus Metarhizium brunneum
(Ascomycota, Hypocreales) to increase Fe bioavailability and promote plant
growth in calcareous and sandy soils. Plant and Soil. 418: 387–404. doi:
10.1007/s11104–017–3303–0. [Factor de Impacto JCR: 3.1, Q1 (11/83) en
“Agronomy”]. Finalmente, las conclusiones 1, 3, 4 y 6 emanan del capítulo
IV, y por tanto, del manuscrito “Raya–Díaz S, Sánchez–Rodríguez AR,
Segura–Fernández JM, del Campillo MC, Quesada–Moraga E. 2017.
Entomopathogenic fungi–based mechanisms for improved Fe nutrition in
sorghum plants grown on calcareous substrates. PLoS ONE 12: (e0185903).
doi: 10.1371/journal.pone.0185903 [Factor de Impacto JCR: 2.8, Q1
(15/64) en “Multidisciplinary sciences”].
1. Las cepas EABb 04/01–Tip de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. y EAMa

01/58–Su de Metarhizium brunneum Petch fueron capaces de colonizar los
237
CAPÍTULO VI
diferentes tejidos vegetales y la rizosfera de plantas herbáceas
monocotiledóneas, sorgo, trigo blando, trigo duro, así como
dicotiledóneas, girasol.
2. La cepa EABb 04/01–Tip aplicada mediante tratamiento a la semilla, al

suelo o pulverización foliar, además de controlar eficientemente la
población de larvas de Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidoptera;
Noctuidae) en plantas de trigo, aumenta el peso seco y la producción de
espigas de este cereal.
3. Las cepas EAMa 01/58–Su, Bb 04/01–Tip y EAIf 10/01–Msp de Isaria

farinosa (Holmsk.) Fr. (Ascomycota, Hypocreales), aumentan la
disponibilidad de Fe bajo diferentes condiciones de fuente de Fe (óxidos de
Fe de diferente cristalinidad y solubilidad); substrato de cultivo
(calcáreo/no calcáreo, arcilloso/arenoso); y tipo de planta
(monocotiledónea/dicotiledónea).
4. Las cepas EAMa 01/58–Su, Bb 04/01–Tip y EAIf 10/01–Msp son capaces

de solubilizar Fe por múltiples mecanismos que implican quelación,
reducción extracelular de Fe3+ a Fe2+ y acidificación, adaptando su
estrategia en función de las condiciones ambientales. La cepa EAMa
01/58–Su de M. brunneum fue la más efectiva a este respecto,
posiblemente como resultado de la acidificación de los medios calcáreos.
5. Las dosis 5×106 y 5×108 conidios ml–1 de la cepa EAMa 01/58–Su son
óptimas para obtener efectos significativos en la promoción del
crecimiento y observar mejoras en el estatus nutricional de las diferentes
especies vegetales. Estas dosis permiten reducir la clorosis férrica en
plantas de sorgo cultivadas en suelos calizos y permiten obtener mayores
238
CAPÍTULO VI
rendimientos en plantas de girasol, con mayor altura y peso seco de las
inflorescencias.
6. Los tres métodos de inoculación (semilla, suelo o foliar) de las cepas

EABb 04/01–Tip y EAMa 01/58–Su, son eficaces para conseguir la
colonización endofítica en raíz, tallo y hojas de plantas de sorgo, aunque el
tratamiento de suelo permite una mayor persistencia en el mismo de los
conidios. Aunque todos los métodos de inoculación fueron eficaces para
promover el crecimiento de las raíces en relación con el grupo control, el
tratamiento del suelo destacó tanto en términos de Longitud Específica
Relativa (“SRL”) como de Área Específica Relativa (“SRA”) y densidad de
raíces finas.
239
CAPÍTULO VII: Anexos
CAPÍTULO VII
1. Producción científica derivada de la Tesis

Doctoral
1.1. Contribución a revistas internacionales de

carácter científico (SCI)
· Sánchez–Rodríguez AR, Raya–Díaz S, Zamarreño AM, García–Mina
JM, del Campillo MC, Quesada–Moraga E. 2017. An endophytic
Beauveria bassiana strain increases spike production in bread and
durum wheat plants and effectively controls cotton leafworm
(Spodoptera littoralis) larvae. Biological Control, pp: 1049–9644.
doi:10.1016/j.biocontrol.2017.01.012 [Factor de Impacto JCR: 2.3,
Q1 (11/93) en “Entomology”]”.
· Raya–Díaz S, Quesada–Moraga E, Barrón V, del Campillo MC,

Sánchez–Rodríguez AR. 2017. Redefining the dose of the
entomopathogenic fungus Metarhizium brunneum (Ascomycota,
Hypocreales) to increase Fe bioavailability and promote plant
growth in calcareous and sandy soils. Plant and Soil. 418: 387–404.
doi: 10.1007/s11104–017–3303–0. [Factor de Impacto JCR: 3.1, Q1
(11/83) en “Agronomy”].
· Raya–Díaz S, Sánchez–Rodríguez AR, Segura–Fernández JM, del

Campillo MC, Quesada–Moraga E. 2017. Entomopathogenic fungi–
based mechanisms for improved Fe nutrition in sorghum plants
grown on calcareous substrates. PLoS ONE 12: (e0185903). doi:
241
CAPÍTULO VII
10.1371/journal.pone.0185903 [Factor de Impacto JCR: 2.8, Q1
(15/64) en “Multidisciplinary sciences”].
1.2. Aportaciones científicas en congresos:

· Autores: Raya–Díaz, Silvia; Sánchez–Rodríguez, AR; Quesada–
Moraga, E. Título: The entomopathogenic fungi Metarhizium
brunneum, Beauveria bassiana and Isaria farinosa (Ascomycota,
Hypocreales) increase the availability of iron. Tipo de participación:
Poster. Congreso: 15th Meeting of the IOBC–WPRS. Institución
Organizadora: Working Group Microbial and Nematode Control of
Invertebrate Pests. Lugar: Riga, Latvia. Fecha: 07/06/2015 –
11/06/2015.

Moraga, E. Título: Los hongos entomopatógenos Metarhizium
brunneum, Beauveria bassiana e Isaria farinosa (Ascomycota;
Hypocreales) aumentan la movilización de hierro en el suelo,
mejoran la nutrición y el crecimiento de la planta. Tipo de
participación: Comunicación. Congreso: IX Congreso nacional de
entomología aplicada. XV Jornadas científicas de la SEEA.
Institución Organizadora: Sociedad Española de Entomología
Aplicada (SEEA). Lugar: Valencia, Valencia. Fecha: 19/10/2015 –
23/10/2015.
· Autores: del Campillo, M.C., Sánchez–Rodríguez, A.R., Raya–Díaz,

S., Barrón, V., Torrent, J., Recena, R., Delgado, A. Título: High level
of Phosphate in soil decreases the content of zinc in wheat grain.
Tipo de participación: Poster. Congreso: 8th International
242
CAPÍTULO VII
Phosphorus Workshop (IPW8). Institución Organizadora: Leibniz–
Institute for Baltic Sea Research Warnemuende (IOW). Lugar:
Rostock, Germany. Fecha: 16/09/2016.

Moraga, E. Título: Los hongos entomopatógenos aplicados para el
control de plagas pueden aliviar la clorosis férrica y promover el
crecimiento vegetal. Tipo de participación: Comunicación.
Congreso: X Congreso Nacional de Entomología Aplicada y XVI
Jornadas Científicas de la SEEA. Institución Organizadora: Sociedad
Española de Entomología Aplicada (SEEA). Lugar: Logroño, España.
Fecha: 16/10/2017 – 20/10/2017.

Moraga, E. Título: La disponibilidad de conidios del hongo
entomopatógeno Metarhizium brunneum Pech (Ascomycota;
Hypocreales) depende del caudal de agua y de las propiedades del
suelo. Tipo de participación: Póster. Congreso: X Congreso
Nacional de Entomología Aplicada y XVI Jornadas Científicas de la
SEEA. Institución Organizadora: Sociedad Española de Entomología
Aplicada (SEEA). Lugar: Logroño, España. Fecha: 16/10/2017 –
20/10/2017.
243

Los Hongos Entomopatógenos Endófitos Mejoran

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Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica y de Montes

Departamento de Ciencias y Recursos Agrícolas y Forestales

Los hongos entomopatógenos endófitos mejoran

Doctoranda: Dª Silvia Raya Díaz

AUTOR: Silvia Raya Díaz

© Edita: UCOPress. 2018

Los hongos entomopatógenos endófitos mejoran

Tesis Presentada por Dª Silvia Raya Díaz para optar al grado de

Fdo.: Silvia Raya Díaz

V°B° del Director B° del Codirector

Prof. Dr. D. Enrique Quesada Moraga Dr. D. Antonio R. Sánchez Rodríguez

INFORMAN: que el trabajo “Los hongos entomopatógenos endófitos

Córdoba, noviembre de 2017

V°B° del Director V°B° del Codirector

Prof. Dr. D. Enrique Quesada Moraga Dr. D. Antonio R. Sánchez Rodríguez

Los hongos entomopatógenos endófitos mejoran la nutrición férrica y el

INFORME RAZONADO DEL/DE LOS DIRECTOR/ES DE LA TESIS

La Doctoranda, Dª. Silvia Raya Díaz, se incorporó al Grupo de Investigación

Los distintos objetivos planteados en esta Tesis Doctoral se abordan en

Sánchez-Rodríguez AR, Raya-Díaz S, Zamarreño AM, García-Mina JM, del

Raya-Díaz S, Quesada-Moraga E, Barrón V, del Campillo MC, Sánchez-

Raya-Díaz S, Sánchez-Rodríguez AR, Segura-Fernández JM, del Campillo

Por tanto, se han publicado tres trabajos en revistas de mayor impacto Q1

Por todo ello, se autoriza la presentación de la tesis doctoral.

Córdoba, 20 de Noviembre de 2017

Firma del/de los director/es

Fdo.: Enrique Quesada Moraga Fdo.: Antonio R. Sánchez Rodríguez

Un líder es alguien que conoce el camino, anda el camino y

La amistad, si se alimenta solo de gratitud, equivale a una

Muchas gracias a todos y todas.

Los ascomicetos mitospóricos entomopatógenos (AME) son un

En el capítulo II se ha evaluado el efecto de la colonización

En el capítulo III se determinó la dosis mínima de la cepa EAMa

En el capítulo IV se determinó in vitro la capacidad de las cepas

Palabras clave: Endófito, rizosfera, clorosis férrica, método de

The entomopathogenic mitosporic ascomycetes (EMA) are an important

In chapter II, the effect of the endophytic colonization of bread

In chapter III, it was investigated the minimum dose of EAMa

In chapter IV, the potential of strains EAMa 01/58-Su, EABb 04/01-

The results of this Doctoral Thesis reveal important benefits

Keywords: Endophyte, rhizosphere, iron chlorosis, inoculation

method, root length, Metarhizium brunneum, Beauveria bassiana, Isaria

I. El Control Biológico, piedra angular del Control Integrado de Plagas 3

II. Los hongos entomopatógenos: más allá del control de plagas 7

II.1. Clasificación y diversidad 7

II.2. Modo de acción de los ascomicetos mitospóricos

II.3. Estrategias de uso de los ascomicetos mitospóricos

II.4. Presencia natural de ascomicetos mitospóricos

II.4.1. En los artrópodos 13

II.4.3. Asociaciones con las plantas: como endófitos y en el filoplano 18

III. Nuevas funciones ecológicas de los ascomicetos mitospóricos

III.1. Protección de la planta frente a factores bióticos 25

III.1.1. Plagas de insectos 25

III.1.2. Enfermedades de las plantas 26

III.1.2.1. Supresión directa de patógeneops de plantas 26

III.2. Protección de la planta frente a factores abióticos 30

III.3.1. Bacterias promotoras del crecimiento vegetal 32

III.3.1.1. Bacterias intracelulares 32

III.3.1.2. Bacterias extracelulares 34