Analisis Microbiologico de Los Alimentos

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
DE LOS ALIMENTOS
METODOLOGÍA ANALÍTICA OFICIAL
MICROORGANISMOS PATÓGENOS
VOLUMEN 1
Versión 1: diciembre 2011

INDICE
1. Salmonella spp. en alimentos………………………………………………. pág. 1
2. Detección, aislamiento e identificación de Salmonella spp. en

muestras de alimentos (procedimiento según International Standard
ISO 6579:2002)………………………………………………………………. pág. 5
3. Detección, aislamiento e identificación de Salmonella spp. en

muestras de alimentos (procedimiento según Bacteriological Analytical
Manual – FDA: 2007)………………………………………………………... pág. 23
4. Escherichia coli O157:H7/NM en alimentos………………………………. pág. 55
5. Detección, aislamiento e identificación de Escherichia coli

O157:H7/NM en productos cárnicos (procedimiento según
USDA/FSIS: 2010)…………………………………………………………… pág. 58
6. Detección de Escherichia coli O157:H7/NM en alimentos

(procedimiento según Bacteriological Analytical Manual – FDA: 2011).. pág. 73
7. Detección de Escherichia coli O157:H7/NM en alimentos.

(procedimiento según International Standard ISO 16654: 2001)………. pág. 87
8. Listeria monocytogenes en alimentos……………………………………... pág. 101
9. Detección de Listeria monocytogenes en productos cárnicos.

(procedimiento según USDA/FSIS: 2009)………………………………… pág. 105
10. Detección de Listeria monocytogenes en muestras de alimentos.

(procedimiento según Bacteriological Analytical Manual – FDA: 2011).. pág. 118
11. Detección de Listeria monocytogenes en muestras de alimentos.

(procedimiento según International Standard ISO 11290-1: 2004)……. pág. 140
12. Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) en fórmulas infantiles en

polvo…………………………………………………………………………… pág. 158
13. Detección, aislamiento e identificación de Enterobacter sakazakii

(Cronobacter spp.) en fórmulas infantiles en polvo.
(procedimiento según Technical Specification ISO/TS 22964: 2006). pág. 163
Salmonella spp. en alimentos
1. Generalidades
El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Son bacilos

gram negativos, de 0,7-1,5 x 2-5 µm, anaerobios facultativos, no formadores de
esporas, generalmente móviles por flagelos perítricos (excepto S. gallinarum).
Fermentan glucosa, maltosa y manitol, pero no fermentan lactosa ni sacarosa.
Son generalmente catalasa positiva, oxidasa negativa y reducen nitratos a
nitritos.
Son viables en diferentes condiciones ambientales, sobreviven a la
refrigeración y congelación y mueren por calentamiento (mayor a los 70 °C).
El serotipo de Salmonella está determinado por los siguientes tres tipos de
antígenos: el antígeno somático (O), el antígeno flagelar (H) y el antígeno de
virulencia (Vi). Los antígenos somáticos son lipopolisacáridos componentes de
la pared celular y se han identificado 60 antígenos diferentes. Los antígenos
flagelares son proteínas localizadas en el flagelo móvil. El antígeno de
virulencia es un polisacárido termolábil localizado en la cápsula.
Antes del 1° de Julio de 1963 se utilizaban 3 espe cies de Salmonella: S. typhi,
S. choleraesuis y S. enteritidis y la mayoría de los serotipos pertenecían a esta
última especie. En la actualidad, todas las especies y subgrupos anteriores de
Salmonella y Arizona se consideran de la misma especie, pero pueden
separarse en 6 subgrupos. La única excepción la constituye S. bongori que por
estudios de hibridación de ADN se constató que es una especie distinta.
Por lo tanto, existen 2 especies y 6 subespecies de S. entérica en el esquema
actual utilizado por el Centers for Disease Control and Prevention (CDC).
a. Salmonella entérica:
S. entérica subespecie entérica (I): comprende la mayoría de los serotipos

S. entérica subespecie salamae (II)
S. entérica subespecie arizonae (IIIa)
S. entérica subespecie diarizonae (IIIb)
S. entérica subespecie houtenae (IV)
S. entérica subespecie indica (VI)
b. Salmonella bongori (antes subespecie V)
La mayoría de las serovariedades aisladas del hombre y de los animales de

sangre caliente pertencen a la subespecie I (entérica) y llevan un nombre
relacionado con el lugar geográfico donde fueron aisladas.
Como las serovariedades no tienen nivel taxonómico de especie, escapan al
“Código Internacional de Nomenclatura Bacteriana” y por ello deben escribirse
en letra tipo romano, no itálica, por ejemplo: Salmonella entérica subespecie
entérica serovariedad Typhimurium.
Las serovariedades de las subespecies restantes y S. bongori se designan con
el nombre de la subespecie seguido de la fórmula antigénica, por ejemplo:
Salmonella subespecie IV 50: b:- (S. entérica subespecie houtenae 50: b:-).
1
La serotipificación es útil para definir, monitorear y controlar brotes y epidemias.
Un segundo método de clasificación que se utiliza con frecuencia es el
esquema de Kaufmann-White. En este esquema, varios serotipos de
Salmonella se clasifican dentro de once serogrupos. Los mismos están
basados en un antígeno mayor y uno o varios antígenos somáticos menores.
Recientemente se ha desarrollado un tercer esquema de clasificación basado
en las técnicas de hibridación del ADN. (1) (4) (5)
2. Características de la enfermedad
La salmonelosis es considerada una zoonosis de distribución mundial y de

origen alimentario. La vía de transmisión es fecal-oral a través de alimentos y
agua contaminada con heces humanas o animales, materiales y utensilios de
cocina contaminados o por contacto directo de persona a persona.
Desde el punto de vista epidemiológico, puede manifestarse como casos
esporádicos o brotes con un número variable de afectados. La susceptibilidad
es universal.
La salmonelosis se puede presentar como una enfermedad no sistémica o
gastroenteritis que se caracteriza por un período de incubación de 12 a 72
horas. Puede manifestarse en forma aguda con fiebre ligera (resuelve en 2 - 3
días), naúseas, vómitos, dolor abdominal y diarrea durante unos días o una
semana. La gravedad de los síntomas puede variar desde ligero malestar a
deshidratación grave y en algunos casos pueden quedar secuelas crónicas
(síntomas de artritis que pueden aparecer 3 a 4 semanas después de los
síntomas agudos).
Otra manifestación clínica de la enfermedad es la sistémica, también conocida
como fiebre entérica o fiebres tifoidea y paratifoidea, con una incubación de
entre 3 y 56 días y síntomas de fiebre, dolor de cabeza, sensibilidad abdominal,
constipación, manchas en la superficie del cuerpo de color rojo, infección del
flujo biliar, hemorragias provocadas por úlceras y perforación del intestino
causando peritonitis. (1) (2)
3. Epidemiología
En el período 1995-1999, Salmonella fue el segundo agente causal más

importante (35,3%) de brotes de enfermedad transmitida por alimentos (ETA)
en América Latina y el Caribe.
Durante el período 1993-2002 ocurrieron en Argentina 60 brotes de
salmonelosis que produjeron 889 enfermos y 4 muertos. El 6,7 % de los brotes
fue causado por Salmonella serovariedad Enteritidis, el 1,7% por S. arizonae y
en el 90% de los casos no se pudo identificar la serovariedad correspondiente.
Con relación a los alimentos involucrados en dichos brotes el 25%
correspondió a derivados de huevo, mayonesa y carne de aves.
Según el Ministerio de Salud de la Nación el porcentaje acumulado a la
semana 47 del año 2010 para las gastroenteritis por fiebre tifoidea y
paratifoidea es de 22 % contra 38 % correspondiente a la misma semana del
año 2009, siendo la región más afectada la del Noroeste Argentino (NOA) para
ambos años. (2) (3)
2
4. Reservorio y fuentes de infección
Los principales reservorios de Salmonella son las aves de corral, el ganado

bovino y el porcino. Por lo tanto, son fuentes de infección las carnes de estos
animales y los huevos. El hombre también es reservorio de esta bacteria lo que
revela la importancia de considerar a los manipuladores de alimentos
portadores como fuente de infección. También se han identificado como
fuentes de infección los vegetales frescos consumidos crudos en ensaladas.
Alimentos asociados: carnes crudas, pollo, huevos, leche y derivados lácteos,
vegetales frescos, pescados, salsas y aderezos para ensaladas, mezclas para
pasteles, postres a base de crema, gelatina en polvo, cacao y chocolate. (3) (4)
5. Prevención
Las principales causas de infección son los alimentos crudos o que hayan
sufrido cocción insuficiente, además de la contaminación cruzada que ocurre
cuando los productos cocidos entran en contacto con alimentos crudos o con
superficies o materiales contaminados (como las tablas para cortar).
Por lo tanto, la cocción adecuada y la higiene durante la manipulación de los
alimentos pueden prevenir en gran medida las infecciones causadas por
Salmonella. No olvidar estos consejos a la hora de manipular alimentos:
LIMPIAR: Lávese las manos y lave las superficies frecuentemente

SEPARAR: No propague la contaminación
COCINAR: Cocine hasta una temperatura adecuada
ENFRIAR: Refrigere prontamente (2) (3)
3
Referencias:
1. Elmer W. Koneman (et al.) - “Diagnóstico microbiológico-texto y atlas en

color”, Ed. Medica Panamericana, 6° edición, 2008
2. Ministerio de Salud Nacional, www.msal.gov.ar
3. Organización Mundial de la Salud
4. Romero Cabello, Raúl - “Microbiología y Parasitología Humana: bases
etiológicas de las enfermedades infecciosas y parasitarias”, Ed. Médica
Panamericana, 3° edición, 2007
5. Caffer, M. I.; Teragno, R. - ”Manual de Procedimientos para la
caracterización de Salmonella”, ANLIS “Dr. Carlos G. Malbran”, 2000
4
Detección, aislamiento e identificación
de Salmonella spp. en muestras de
alimentos
(Procedimiento según International Standard ISO 6579: 2002)
1. OBJETIVO
El presente procedimiento tiene como objetivo describir la metodología llevada

a cabo por el Laboratorio de Microbiología para realizar la detección,
aislamiento e identificación de Salmonella spp. en muestras de alimentos.
2. ALCANCE
Este procedimiento se aplica para realizar la detección, aislamiento e

identificación de Salmonella spp. en muestras de alimentos.
La confirmación de Salmonella spp. se realiza por propiedades bioquímicas y
serológicas.
NOTA: las cepas aisladas deben ser enviadas al Centro de Referencia Instituto
Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S “Dr. Carlos G. Malbrán”, para
una mayor tipificación.
3. DESARROLLO
3.1. Medios de cultivo, reactivos, materiales y equipos

3.1.1. Agua peptona bufferada (BPW)
3.1.2. Caldo Rappaport – Vassiliadis con soja (caldo RVS)
3.1.3. Caldo Müller – Kauffmann tetrationato + novobiocina (MKTTn)
3.1.4. Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)
3.1.5. Segundo medio sólido selectivo: a elección del laboratorio. Se deben
seguir las instrucciones del laboratorio para su preparación
3.1.6. Agar nutritivo (AN)
3.1.7. Agar triple sugar iron (TSI)
3.1.8. Agar urea (según Christensen)
3.1.9. Caldo lisina decarboxilasa
3.1.10. Reactivo para la detección de β-galactosidasa (o discos siguiendo las
instrucciones del fabricante)
3.1.11. Reactivos para la reacción de Voges-Proskauer (VP)
3.1.12. Reactivos para la reacción de Indol
3.1.13. Agar nutritivo semisólido
3.1.14. Solución salina fisiológica
5
3.1.15. Kit de pruebas bioquímicas capaz de identificar Salmonella spp.
(ej.Galería API 20 E, bioMerieux)
3.1.16. Sueros: En el comercio hay disponible distintos tipos de sueros que
contienen anticuerpos para uno o varios antígenos O. Ej.: antisueros
que contienen uno o más grupos O (sueros monovalentes o
polivalentes anti O), sueros anti Vi y antisueros que contienen
anticuerpos para uno o varios factores H. En las pruebas de serología
deben utilizarse los sueros adecuados para la detección de todos los
tipos de Salmonella. Los sueros deben ser provistos por un proveedor
reconocido y competente.
3.1.17. Estufa de esterilización
3.1.18. Autoclave
3.1.19. Horno o cabina de secado, ventilada por convección, capaz de operar
entre 37ºC y 55ºC
3.1.20. Estufa de incubación a 37°C ± 1°C
3.1.21. Baño de agua o estufa de incubación a 41.5°C ± 1°C
3.1.22. Baño de agua capaz de operar entre 44ºC a 47ºC
3.1.23. Baño de agua a 37ºC ± 1°C
3.1.24. Ansa de platino o níquel de aprox. 3 mm de diámetro o 10 µl.
3.1.25. Peachímetro calibrado con exactitud de 0.1 unidad de pH a
20°C a 25ºC.
3.1.26. Pipetas graduadas o automáticas de 10 ml y 1 ml de capacidad
nominal, graduadas en 0.5 ml y 0.1 ml respectivamente.
3.1.27. Tubos o frascos de capacidad apropiada.
3.1.28. Placa de Petri de vidrio o plástico de 90 a 100 mm de diámetro y de
140mm de diámetro.
3.2. Principio
El método está basado en las siguientes etapas:
3.2.1. Pre-enriquecimiento en medio líquido no selectivo: La muestra se

siembra en agua peptona bufferada (BPW) a temperatura ambiente y luego se
incuba a 37ºC ± 1ºC durante 18 h ± 2 h. Para ciertos tipos de alimentos se
utilizan enriquecimientos específicos. (3.3.1.)
3.2.2. Enriquecimiento en medio líquido selectivo: La muestra obtenida en la
etapa 3.2.1. se inocula en los siguientes medios líquidos:
- Caldo Rappaport - Vassiliadis con Soja (RVS): se incuba a 41.5ºC ± 1ºC

durante 24 h ± 3 h.
- Caldo Muller - Kauffmann tetrationato/ novobiocina (MKTTn): se incuba a
37ºC ± 1ºC durante 24 h ± 3 h.
3.2.3. Aislamiento en medio selectivo y diferencial: Del cultivo obtenido en la
etapa 3.2.2 se inoculan dos medios sólidos selectivos
- Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)

- Otro medio sólido selectivo, complementario al XLD, apropiado para el
aislamiento de Salmonella lactosa positiva y cepas de Salmonella Typhi
y Paratyphi. El laboratorio debe elegir el medio a utilizar.
6
El agar XLD se incuba a 37ºC ± 1ºC durante 24h ± 3h. El segundo medio
selectivo es incubado de acuerdo a las recomendaciones del fabricante.
Nota: Como segundo medio selectivo se puede utilizar el agar verde brillante o
agar bismuto sulfito.
3.2.4. Confirmación de colonias presuntivas aisladas: Las colonias

sospechosas de Salmonella son reaisladas y su confirmación se realiza por
propiedades bioquímicas y serología.
3.3. Procedimiento
3.3.1. Preenriquecimiento
Para la preparación de la suspensión inicial se utiliza en general como

diluyente Agua Peptona Bufferada (BPW).
Si la cantidad de la porción a analizar es mayor de 25 g utilizar la cantidad
necesaria del diluyente de preenriquecimiento para llevar a una dilución 1/10.
NOTA: Preparación de muestras compuestas (pool)

Cuando se necesita analizar más de una porción de 25 g de un lote específico
o un alimento y cuando existe evidencia disponible que la formación de pools
no afecta los resultados de una muestra en particular, se pueden analizar
muestras compuestas. Por ejemplo, en caso de analizar 10 muestras de 25 g,
combinar las 10 muestras para formar una muestra de 250 g y agregar 2,25 l
del caldo de preenriquecimiento. Alternativamente 0.1ml (en 10 ml de caldo
RVS) y 1 ml (en 10 ml de MKTTn) del caldo de preenriquecimiento
provenientes de 10 muestras separadas pueden ser combinadas para un
enriquecimiento en 100 ml del caldo para enriquecimiento selectivo.
Enriquecimiento para chocolate y alimentos que contienen chocolate (ej.

más de un 20%): agregar al BPW 50 g/l de caseína (evitar el uso de caseína
ácida) o 100 g/l de leche en polvo descremada estéril. Después de 2 horas de
incubación agregar 0.018 g/l de verde brillante si el alimento es sospechoso de
tener una alta contaminación con flora Gram positiva.
Enriquecimiento para alimentos ácidos: asegurarse que el pH no caiga por

debajo de 4.5 durante el preenriquecimiento. En este caso el pH es más
estable si se utiliza agua peptona bufferada (BPW) doble concentración.
Incubar el preenriquecimiento a 37ºC ± 1ºC durante 18 h ± 2 h.
3.3.2. Enriquecimiento selectivo
Transferir 0.1 ml del cultivo obtenido en 3.3.1. a un tubo con 10 ml de caldo

RVS e incubar a 41.5 Cº ± 1ºC durante 24 h ± 3 h.
Transferir 1 ml del cultivo obtenido en 3.3.1. a un tubo con 10 ml de caldo
MKTTn e incubar 37ºC ± 1ºC durante 24 h ± 3 h.
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Nota: Se recomienda utilizar baño de agua o estufa de incubación con aire
forzado para asegurar que la temperatura máxima no exceda los 42.5°C.
3.3.3. Aislamiento e identificación
Tomar un ansada de los cultivos obtenidos en 3.3.2. (caldo RVS y MKTTn) y

estriar en una placa de agar XLD. Utilizar las placas de Petri grandes ó 2 del
menor tamaño usando el mismo ansa. Proceder de la misma manera con el
segundo agar selectivo.
Incubar las placas de XLD a 37ºC ± 1ºC durante 24 h ± 3 h y el segundo agar
selectivo de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Examinar las placas después de la incubación para la determinación de la
presencia de colonias típicas de Salmonella y colonias atípicas que podrían ser
Salmonella (ver nota).
Las colonias típicas de Salmonella en el agar XLD son transparentes, del
mismo color del medio con centro negro.
Nota: las colonias de Salmonella H2S negativo (ej. S. Paratyphi A) en el XLD
son rosadas con un centro rosa oscuro y las de Salmonella lactosa positivas
son de color amarillo con o sin centro negro.
3.3.4. Confirmación bioquímica
Para la confirmación por propiedades bioquímicas pueden utilizarse kits

comerciales para los cuales deben seguirse las instrucciones del fabricante.
Para la confirmación tomar de cada placa de Petri (2 placas del menor tamaño
o una del mayor tamaño) de cada medio selectivo (ver 3.3.3.) al menos una
colonia típica o sospechosa de Salmonella y 4 colonias más si la primera es
negativa.
En el caso de estudios epidemiológicos se recomienda tomar al menos 5
colonias para la confirmación. Si en algunas de las placas hay menos de 5
colonias sospechosas confirmar todas las colonias sospechosas.
Seleccionar las colonias sospechosas y estriar por agotamiento en superficie
en placas de agar nutritivo para obtención de colonias aisladas. Incubar las
placas a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 3 h.
Para la confirmación bioquímica y serológica utilizar cultivos puros.
Agar TSI: con una aguja de inoculación hacer una punción en el fondo y estriar
el pico de flauta. Incubar a 37ºC ± 1ºC durante 24 h ± 3 h.
Interpretación:
Fondo:
- amarillo: glucosa positivo
- rojo o sin cambio: glucosa negativo
- negro: formación de H2S
- burbujas o ruptura de agar: formación de gas a partir de la glucosa
Pico de flauta:
- amarillo: lactosa y/o sucrosa positivo
- rojo o sin cambio: lactosa y sucrosa negativo.
- Las cepas típicas de Salmonella dan reacción alcalina (color rojo) en el
pico de flauta y ácida (color amarillo) en el fondo, con formación de gas y
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(en aproximadamente en el 90% de los casos) formación de H2S
(ennegrecimiento del agar).
En presencia de una Salmonella lactosa positiva el pico de flauta del TSI es de
color amarillo. Por esto la confirmación preliminar de Salmonella no debe
basarse solamente en los resultados del TSI.
Agar urea: Con un aguja de inoculación estriar el pico de flauta.Incubar a 37ºC

± 1ºC durante 24 h ± 3 h y examinar en intervalos.
Reacción positiva: por hidrólisis de la urea se libera amonio que vira el color del
indicador rojo de fenol a rosa y luego a color cereza. La reacción generalmente
aparece después de 2 h a 4 h.
Caldo L-Lisina decarboxilasa: a partir del cultivo puro inocular con una aguja
de inoculación por debajo de la superficie del caldo. Incubar a 30°C ± 1°C
Reacción positiva: coloración violeta
Reacción negativa: coloración amarilla
β- Galactosidasa: Utilizar discos siguiendo las instrucciones del fabricante.
Medio para Voges- Proskauer (VP): Resuspender un ansada de la colonia

sospechosa en un tubo estéril con 3 ml de caldo VP, Incubar a 37ºC ± 1ºC
durante 24 h ± 3 h después de la incubación agregar 2 gotas de la solución de
creatina, 3 gotas de la solución alcohólica de 1-naftol y 2 gotas de la solución
de KOH; agitar después del agregado de cada reactivo.
Medio para reacción de indol: Resuspender una ansada de la colonia

sospechosa en un tubo estéril con 5 ml de caldo triptona – triptofano. Incubar a
37ºC ± 1ºC durante 24 h ± 3 h. Después de la incubación agregar 1 ml de
reactivo de Kovacs.
Reacción positiva: formación de un anillo rojo
Reacción negativa: formación de un anillo amarillo – marrón.
9
Interpretación de las pruebas bioquímicas.
Test Salmonella
S. Typhi S.Paratyphi A S.Paratyphi B S. Paratyphi C Otras
especies
reacción %(b) reacción %(b) reacción %(c) reacción %(c) reacción %(b)
TSI: ácido de + 100 + 100 + + + 100
glucosa
TSI: gas de - (d) 0 + 100 + + + 92
glucosa
TSI: ácido de - 2 - 100 - - - 1
lactosa
TSI: ácido de - 0 - 0 - - - 1
sucrosa
TSI: + 97 - 10 + + + 92
producción
de H2S
Urea - 0 - 0 - - - 1
Lysina + 98 - 0 + + + 95
decarboxilasa
β- - 0 - 0 - - - 2(e)
galactosidasa
VP - 0 - 0 - - - 0
Indole - 0 - 0 - - - 1
(b) estos porcentajes indican que no todos los aislamientos de serotipos de
Salmonella presentan las reacciones + o – marcadas.
(c) el porcentaje no está disponible en la literatura.
(d) Salmonella Typhi es anaerogénica (no produce gas)
(e) Salmonella entérica subespecie arizonae puede ser lactosa positiva o negativa
pero siempre da positiva la reacción de la β -galactosidasa. Para el estudio de estas
cepas es útil realizar pruebas bioquímicas complementarias.
3.3.5. Confirmación serológica y serotipificación
3.3.5.1. General: La detección de la presencia de los antígenos O, Vi Y H de

Salmonella se realiza por aglutinación en placa con los sueros apropiados a
partir de colonias puras y después de eliminar las cepas autoaglutinables.
3.3.5.2. Eliminación de cepas autoaglutinables: colocar una gota de solución
salina en una placa de vidrio, con un ansa dispersar parte de la colonia para
obtener una suspensión turbia y homogénea. Mover la placa de vidrio en
círculos por 30 a 60 segundos. Observar el resultado contra un fondo oscuro
preferiblemente con ayuda de una lupa.
Si la cepa aglutina es considerada autoaglutinable y no debería someterse a la
determinación serológica ya que los resultados no son confiables.
3.3.5.3. Determinación del antígeno O: colocar una gota del suero anti O en
una placa de vidrio, con un ansa dispersar parte de la colonia para obtener una
suspensión turbia y homogénea. Mover la placa de vidrio en círculos por 30 a
60 segundos. Observar el resultado contra un fondo oscuro preferiblemente
con ayuda de una lupa. Si se observa aglutinación la reacción es considerada
positiva.
3.3.5.4. Determinación del antígeno Vi: colocar una gota del suero anti Vi en
una placa de vidrio, con un ansa dispersar parte de la colonia para obtener una
10
suspensión turbia y homogénea. Mover la placa de vidrio en círculos por 30 a
60 segundos. Observar el resultado contra un fondo oscuro preferiblemente
con ayuda de una lupa. Si se observa aglutinación la reacción es considerada
positiva.
3.3.5.5. Determinación del antígeno H: Inocular un agar nutritivo semisólido con
el cultivo puro, incubar a 37ºC ± 1ºC durante 24 h ± 3 h. Utilizar este cultivo
para determinación del antígeno H.
Colocar una gota del suero anti H en una placa de vidrio, con un ansa dispersar
parte de la colonia para obtener una suspensión turbia y homogénea. Mover la
placa de vidrio en círculos por 30 a 60 segundos. Observar el resultado contra
un fondo oscuro preferiblemente con ayuda de una lupa. Si se observa
aglutinación la reacción es considerada positiva.
3.3.6. Interpretación de reacciones bioquímicas y serológicas
Reacciones Auto-aglutinación Reacciones serológicas Interpretación

bioquímicas
Típica No O,Vi o H positivo Considerada Salmonella
Típica No Todas las reacciones
negativas Puede ser Salmonella
Típica Si No testeado
No típica No/Si O,Vi o H positivo
No típica No/Si Todas las reacciones No es considerada
negativas Salmonella
3.3.7. Tipificación
Una vez identificado el microorganismo como Salmonella spp. por propiedades

bioquímicas y serológicas, la cepa debe ser enviada al Centro de Referencia
Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S “Dr. Carlos G.
Malbrán”, para una mayor tipificación.
3.3.8. Expresión de los resultados
De acuerdo a los resultados de la interpretación (3.3.6) indicar presencia o

ausencia de Salmonella en la cantidad de muestra analizada (por gramos o
mililitros para muestras líquidas)
3.3.9. Control positivo
Junto con la muestra realizar un control positivo con un inóculo de una cepa de
Salmonella spp. de referencia y proceder de la misma manera que la muestra
para demostrar que el cultivo positivo es recuperado.
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4. ANEXOS
ANEXO 1: Diagrama de flujo del procedimiento para la detección de Salmonella

spp.
Preenriquecimiento: X g de muestra + 9 X ml de BPW (dil. 1/10). Incubar a

37°C ± 1°C, 18 h ± 2 h
Enriquecimiento selectivo:
- transferir 0.1 ml de BPW en 10 ml de caldo RVS. Incubar a 41.5°C
± 1°C, 24 h ± 3 h.
- transferir 1 ml de BPW en 10 ml de caldo MKTT. Incubar a 37ºC ±
1ºC, 24 h ± 3 h
Aislamiento: a partir de RVS y MKTT sembrar una ansada por agotamiento

en superficie en agar XLD y en el segundo agar elegido. Incubar a 37°C ±
1°C , 24 h ± 3 h.
Seleccionar colonias típicas y estriar en agar nutritivo. Incubar a 37°C ± 1°C,

24 h ± 3 h.
Confirmación por propiedades bioquímicas y serología
Interpretación de resultados
12
ANEXO 2: Medios de cultivos y reactivos
1. Agua peptona bufferada ( BPW)
Peptona (enzimática) de caseina 10.0 g

Cloruro de sodio (NaCl) 5.0 g
Disodio hidrógeno fosfato dodecahidratado (Na2HPO4.12H2O) 9.0 g
Potasio dihidrógeno fosfato (KH2PO4) 1.5 g
Agua destilada 1000 ml
Disolver los componentes en agua, si es necesario calentar. Ajustar el pH a 7.0 ±

0.2 a 25°C. Distribuir en frascos o tubos de acuerd o a las necesidades analíticas.
Esterilizar a 121°C durante15 minutos.
2. Caldo Rappaport – Vassiliadis con soja (caldo RVS)
2.1 Solución A
Digestivo enzimático de soja 5.0 g
Dipotasio hidrógeno fosfato (K2HPO4) 0.2 g
Disolver los componentes en agua, si es necesario calentando aproximadamente

a 70ºC. La preparación debe ser realizada el mismo día de utilización del medio
RVS completo.
2.2 Solución B
Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl.6H2O) 400.0 g
Disolver el MgCl.6H2O en agua destilada.

La solución debe ser mantenida en frasco de vidrio oscuro a temperatura
ambiente hasta 2 años.
2.3 Solución C
Oxalato de verde de malaquita 0.4 mg
Disolver el oxalato de verde de malaquita en agua destilada.

La solución debe ser mantenida en frasco de vidrio oscuro a temperatura
ambiente hasta 8 meses.
2.4 Medio completo

Solución A 1000 ml
Solución B 100 ml
Solución C 10 ml
13
Agregar a 1000 ml de la solución A, 100 ml de la solución B y 10 ml de la
solución C. Ajustar el pH si es necesario para obtener un valor de 5.2 ± 0.2
después de la esterilización a 25°C. Dispensar en t ubos en alícuotas de 10 ml.
Esterilizar en autoclave a 115ºC durante 15 minutos. Guardar a 3ºC ± 2ºC.
Utilizar el medio el día de la preparación.
Nota: La composición final del medio es: digestivo enzimático de soja 4.5 g/l,
cloruro de sodio 7.2 g/l, potasio dihidrógeno fosfato (KH2PO4 + K2HPO4) 1.44 g/l,
cloruro de magnesio hexahidratado 28.6 g/l o cloruro de magnesio anhidro 13.4
g/l, oxalato de verde de malaquita 0.036 g/l.
3. Caldo Müller – Kauffmann tetrationato + novobiocina (MKTTn)
3.1. Medio base

Extracto de carne 4.3 g
Digestivo enzimático de caseína 8.6 g
Carbonato de calcio ( CaCO3) 38.7 g
Tiosulfato de sodio pentahidratado (Na2S2O3. 5H2O) 47.8 g
Ox bilis para uso bacteriológico 4.78 g
Verde brillante 9.6 mg
Disolver los componentes en agua destilada llevando a ebullición por 5

minutos. Ajustar el pH si es necesario para obtener un valor de 8.2 ± 0.2 a 25°C
después de la esterilización.
Puede guardarse por 4 semanas a 3ºC ± 2ºC
3.2. Solución yodo-ioduro

Yodo (KI) 20.0 g
Ioduro de potasio 25.0 g
Disolver completamente el ioduro de potasio en 10 ml de agua, luego agregar

el yodo y llevar a 100 ml con agua destilada estéril. No calentar
Guardar la solución en la oscuridad y a temperatura ambiente en un envase
cerrado.
3.3 Solución de novobiocina

Sal sódica de novobiocina 0.04 g
Agua destilada 5 ml
Disolver la novobiocina en agua destilada, mezclar y esterilizar por filtración.

Conservar a 3ºC ± 2ºC hasta 4 semanas.
14
3.4 Medio completo
Medio base 1000 ml
Solución de yodo – ioduro 20 ml
Solución de novobiocina 5 ml
Agregar asépticamente 5 ml de de solución de novobiocina a 1000 ml de medio

base. Mezclar y agregar 20 ml de solución de yodo – ioduro. Mezclar bien.
Dispensar asépticamente en tubos en alícuotas de 10 ml. Utilizar el medio el día
de la preparación.
4. Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)
Extracto de levadura 3.0 g

Xilosa 3.75 g
Lactosa 7.5 g
Sucrosa 7.5 g
L-Lisina clorhidrato 5.0 g
Tiosulfato de sodio 6.8 g
Citrato férrico amónico 0.8 g
Rojo Fenol 0.08 g
Desoxicolato de sodio 1.0 g
Agar 9 g a 18 g*
*dependiendo de la fuerza gel del agar
Disolver los componentes en agua destilada por calentamiento con frecuente

agitación hasta ebullición. Evitar sobrecalentamiento.
Ajustar el pH si es necesario para obtener un valor de 7.4 ± 0.2 a 25°C.
Pasar el medio a tubos o frascos de capacidad adecuada. Calentar con
frecuente agitación hasta que el agar se disuelva y llegue a ebullición. No
sobrecalentar.
Preparación de las placas: enfriar en baño de agua a 44ºC - 47ºC, agitar y
volcar en placas de Petri. Dejar solidificar.
Inmediatamente antes de usar secar cuidadosamente las placas (sin tapa y con
la superficie del agar hacia abajo) en estufa entre 37ºC y 55ºC hasta que la
superficie del agar quede seca.
Almacenar hasta 5 días a 3ºC ± 2ºC.
5. Agar Nutritivo

Peptona 5.0 g
Agar 9 g a 18 g*
Agua 1000 ml
15
Disolver los componentes en agua destilada calentando si es necesario. Ajustar
el pH si es necesario para obtener un valor después de la esterilización de 7.0
± 0.2 a 25°C. Esterilizar a 121°C durante 15 minuto s.
6. Medio triple sugar iron (TSI)

Peptona 20.0 g
Lactosa 10.0 g
Sacarosa 10.0 g
Glucosa 1.0 g
Citrato de hierro (III) 0.3 g
Rojo fenol 0.024 g
Agar 8.0 g a 18.0 g *
Disolver los componentes en agua destilada llevando a ebullición. Ajustar el pH

si es necesario para obtener un valor después de la esterilización de 7.4 ± 0.2
a 25°C. Fraccionar 10 ml del medio en tubos de 18 m m x 160 mm. Esterilizar
en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Dejar los tubos tendidos para obtener agar en pico de flauta con un fondo de
2.5 cm a 5 cm de profundidad.
7. Medio Urea agar (según Christensen)
7.1 Medio base

Peptona 1.0 g
Glucosa 1.0 g
Rojo fenol 0.012 g
Agar 9.0 g a 18.0 g *

el pH si es necesario para obtener un valor de 6.8 ± 0.2 a 25°C después de la
esterilización. Esterilizar en autoclave a 121°C du rante 15 minutos.
7.2 Solución de urea

Urea 400 g
Agua destilada Hasta vol. final de 1000 ml
Disolver la urea en agua. Esterilizar por filtración.
16
7.3 Medio completo
Solución de Urea (7.2) 50 ml
Medio base (7.1) 950 ml
En condiciones asépticas agregar la solución de urea al medio base

previamente fundido y enfriado a 44°C a 47°C. Fracc ionar en tubos estériles 10
ml. Dejar solidificar en inclinación para obtener agar en pico de flauta.
8. Medio para L-Lisina decarboxilasa
L-Lisina monoclorhidrato (C6H14N2O2.HCl) 5.0 g

Glucosa (C6H12O6) 1.0 g
Púrpura de bromocresol 0.015 g
Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario. Ajustar el pH si

es necesario para obtener un valor de 6.8 ± 0.2 a 25°C después de la
esterilización. Fraccionar 5 ml del medio en tubos de 18 mm x 160 mm.
Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
9. β – Galactosidasa
9.1 Solución Buffer

Sodio dihidrógeno fosfato (NaH2PO4) 6.9 g
Hidroxido de Na, solución 10 mol/l solución 3.0 ml
Agua destilada para volumen final de 50 ml
Disolver el sodio dihidrógeno fosfato en aproximadamente 45 ml de agua en

frasco volumétrico. Ajustar el pH a 7.0 ± 0.2 a 25°C con solución de hidróxido
de sodio. Agregar agua para llevar a volumen final de 50 ml.
9.2 Solución de ONPG

O - Nitrofenil β -D-galactopiranósido (ONPG) 0.08 g
Agua detilada 15 ml
Disolver el ONPG en agua a 50ºC aproximadamente. Enfriar la solución.
9.3 Reactivo completo

Solución buffer 5 ml
Solución de ONPG (NaCl) 15 ml
Agregar la solución buffer a la solución de ONPG.
17
10. Reactivos para la reacción de Voges-Proskauer (VP)
10.1 Medio base

Peptona 7.0 g
Glucosa 5.0 g

esterilización. Fraccionar 3 ml del medio en tubos. Esterilizar a 121°C durante
15 minutos.
10.2 Solución alcohólica de 1- naftol

1-Naftol 6.0 g
Etanol 96% 100ml
Disolver el 1-Naftol en alcohol.
10.3 Solución de creatina (N-amidinosarcosine)

Creatina monohidrato 0.5 g
Agua destilada 100ml
Disolver la creatina monohidrato en agua
10.4 Solución de hidróxido de potasio

Hidróxido de potasio 40.0 g
Agua destilada 100ml
Disolver el hidróxido de potasio en agua.
11. Reactivos para la reacción de Indol
11.1 Caldo triptona - triptofano

Triptona 10.0 g
DL-Triptofano 1.0 mg
Disolver los componentes en agua hirviendo. Ajustar el pH si es necesario para

obtener un valor de 7.5 ± 0.2 a 25°C después de la esterilización. Fraccionar 5
ml del medio en tubos. Esterilizar a 121°C durante1 5 minutos.
11.2 Reactivo de Kovacs

Alcohol amílico o isoamílico 150 ml
p-dimetilamino-benzaldehído 10.0 g
Acido clorhídrico concentrado (HCl) 50 ml
18
Disolver el aldehído en el alcohol. Agregar lentamente el ácido a la mezcla
aldehído-alcohol.
Proteger de la luz en un frasco de vidrio de color marrón y guardar en
refrigeración a 3°C ± 2°C.
El reactivo debe mantener un color de amarillo a marrón claro libre de
precipitado.
12. Agar nutritivo semisólido

Peptona 5.0 g
Agar 4.0 g a 9.0 g*

esterilización. Esterilizar a 121°C durante15 minut os.
13. Solución salina fisiológica

Disolver el NaCl en agua destilada llevando a ebullición. Ajustar el pH si es

necesario para obtener un valor después de la esterilización de 7.0 ± 0.2 a
25°C. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 m inutos.
19
ANEXO 3: FOTOS
1. Agar Xilosa Lisina Desoxicolato
Salmonella spp.: colonias típicas transparentes, del mismo color del medio con
centro negro.
Salmonella Choleraesuis: colonias típicas transparentes, del mismo color del

medio, sulfhídrico negativo.
3. Agar Bismuto Sulfito
Salmonella Thypi: colonias negras con brillo metálico, rodeadas por un halo
negro.
20
Salmonella Choleraesuis: colonias verdosas.
5. Agar TSI
Salmonella Enteritidis: TSI
21
5. REFERENCIAS
International Standard. ISO 6579. Microbiology of food and animal feeding

stuffs – horizontal method for the detection of Salmonella spp. Fourth edition
2002-07-15.
22
de Salmonella spp. en muestras de
alimentos
(Procedimiento según Bacteriological Analytical Manual – FDA: 2007)
1. OBJETIVO

aislamiento e identificación de Salmonella spp. en muestras de alimentos.
2. ALCANCE

identificación de Salmonella spp. en muestras de alimentos.
La confirmación de Salmonella spp. se realiza por propiedades bioquímicas y
serológicas.
NOTA: las cepas aisladas deben ser enviadas al Centro de Referencia Instituto
una mayor tipificación.
3. DESARROLLO

3.1.1. Caldo lactosa (CL)
3.1.2. Leche descremada en polvo (reconstituida)
3.1.3. Caldo tetrationato (TT)
3.1.4. Caldo Rappaport – Vassiliadis (RV) debe ser preparado desde sus
ingredientes individuales, no son aceptables las formulaciones
comerciales
3.1.5. Caldo selenito cistina (SC)
3.1.6. Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)
3.1.7. Agar Hektoen Entérico (HE)
3.1.8. Agar bismuto sulfito (BS)
3.1.10. Caldo triptona (triptofano) al 1%
3.1.11. Caldo tripticasa soja
3.1.12. Caldo tripticasa soja con sulfato ferroso
3.1.13. Caldo tripticasa soja-triptosa
3.1.14. Caldo rojo de metilo – Voges Proskauer (MR-VP)
3.1.15. Agar triple sugar iron (TSI)
3.1.16. Agar citrato de Simmons
23
3.1.17. Caldo urea
3.1.18. Caldo malonato
3.1.20. Agar lisina hierro.
3.1.21. Medio para test movilidad (agar semisólido)
3.1.22. Caldo cianuro de potasio (KCN)
3.1.23. Caldo rojo fenol para carbohidratos
3.1.24. Caldo púrpura de bromo cresol para carbohidratos
3.1.25. Agar MacConkey
3.1.26. Caldo nutritivo
3.1.27. Caldo cerebro corazón infusión (BHI)
3.1.28. Agar base triptosa sangre
3.1.29. Caldo de preenriquecimiento Universal
3.1.30. Caldo de preenriquecimiento Universal (sin citrato férrico amoniacal)
3.1.32. Sulfato de potasio anhidro
3.1.33. Solución clorinada 200 ppm conteniendo sulfato dodecil de sodio al
0.1%
3.1.34. Etanol 70%
3.1.35. Solución de verde brillante al 1%
3.1.36. Solución de púrpura de bromo cresol al 0.2 %
3.1.37. Indicador rojo de metilo
3.1.38. Tergitol aniónico 7
3.1.39. Triton X-100
3.1.40. Solución salina 0.85%
3.1.41. Solución salina fisiológica formolada
3.1.42. Reactivos para la reacción de Voges-Proskauer (VP)
3.1.43. Reactivos para la reacción de indol
3.1.44. Agar nutritivo semisólido
3.1.45. Sueros para Salmonella: antisuero somático polivalente (O), antisuero
flagelar polivalente (H), antisueros somáticos (O) grupo: A, B, C1, C2,
C3, D1, D2, E1, E2, E3, E4, F, G, H, I, Vi y otros grupos cuando sea
apropiado
3.1.46. Autoclave
entre 37ºC y 55ºC
3.1.49. Baño de agua con circulación y termostáticamente controlado a 43°C
0.2°C
3.1.50. Baño de agua con circulación y termostáticamente controlado a 42°C ±
0.2°C
3.1.51. Baño de agua a 49ºC ± 1°C
3.1.52. Balanza con capacidad de 2000 g y sensibilidad de 0.1 g
3.1.53. Balanza con capacidad de 120 g y sensibilidad de 5 mg
3.1.54. Agitador tipo vortex
3.1.55. Lámpara para observar reacciones serológicas
3.1.56. Aguja de inoculación y ansa de platino o níquel de aprox. 3 mm de
diámetro o 10 µl.
3.1.57. Espátula de Drigalsky
24
3.1.58. Peachímetro calibrado con exactitud de 0.1 unidad de pH a 20°C a
25ºC.
3.1.59. Pipetas graduadas o automáticas: de 1 ml con graduación de 0.01 ml,
de 5 ml y 10 ml con graduación de 0.1 ml.
3.1.60. Tubos y frascos de capacidad apropiada.
3.1.61. Placas de Petri de vidrio o plástico de 15 x 100 mm
3.2. Principio
3.2.1. Pre-enriquecimiento en medio líquido no selectivo

3.2.2. Enriquecimiento en medio líquido selectivo
3.2.3. Aislamiento en medio selectivo y diferencial
3.2.4. Confirmación de colonias presuntivas aisladas: Las colonias
sospechosas de Salmonella son reaisladas y su confirmación se realiza
por propiedades bioquímicas y serología.
3.3. Procedimiento
Preparación de la muestra
El siguiente método está basado en el análisis de unidades análiticas de 25 g

en una dilución de 1:9, el volumen del diluyente depende del tamaño de la
muestra compuesta (pool). Mantener la dilución 1:9 a menos que se de otra
especificación.
1. Procedimiento para huevos enteros, yema de huevo y clara de

huevo desecados, leche líquida (entera, descremada, con 2% de
grasas y suero), mezclas de polvo para preparaciones de (tortas,
galletas, bizcochos, pan, etc.), fórmulas infantiles y de alimentación
oral y parenteral que contengan huevo.
Si el alimento es congelado, descongelar una porción conveniente tan

rápidamente como sea posible para minimizar el crecimiento de
microorganismos de la flora acompañante. Descongelar a 45°C durante 15
minutos con agitación continua en baño de agua termostáticamente controlado
o descongelar durante 18 h entre 2°C y 5°C.
Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un recipiente estéril de boca ancha
o en otro recipiente apropiado y agregar 225 ml de caldo lactosa (CL). Agitar
suavemente hasta disolución sin grumos.
Dejar 60 minutos ± 5 minutos a temperatura ambiente, mezclar bien por
agitación y determinar el pH con papel indicador. Si es necesario ajustar el pH
a 6.8 ± 0.2 con NaOH 1N ó HCl 1N. Incubar 24 h ± 2 h a 35°C.
25
2. Leche en polvo entera y descremada

o en otro recipiente apropiado y agregar 225 ml de solución de agua con verde
brillante. Alternativamente unidades analíticas de 25 g pueden ser compuestas
para formar un pool, en ese caso agregar la cantidad necesaria de solución de
agua con verde brillante para llevar a dilución 1: 9.
NOTA: Preparar la solución de agua con verde brillante agregando 2 ml de una

solución de Verde Brillante al 1 % a 1000 ml de agua destilada estéril.
Dejar 60 minutos ± 5 minutos a temperatura ambiente e Incubar 24 h ± 2 h a
35°C.
NOTA: Para leche entera no realizar muestras compuestas.
3. Caseína
Caseína láctica: Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un recipiente

estéril de boca ancha o en otro recipiente apropiado y agregar 225 ml de caldo
de preenriquecimiento Universal. Unidades analíticas de 25 g pueden ser
compuestas. Dejar 60 ± 5 minutos a temperatura ambiente e incubar 24 h ± 2 h
a 35°C.
Caseína de cuajo: Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un recipiente
lactosa. Unidades analíticas de 25 g pueden ser compuestas. Dejar 60 minutos
± 5 minutos a temperatura ambiente e incubar 24 h ± 2 h a 35°C.
Caseinato de sodio: Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un recipiente
lactosa. Mezclar bien. Unidades analíticas de 25 g pueden ser compuestas
a 6.8 ± 0.2 con NaOH 1N ó HCl 1N. Incubar 24 h ± 2 h a 35°C.
4. Harina de soja
Examinar como caseinato de sodio, excepto que unidades analíticas de 25 g no

pueden ser compuestas
5. Productos con huevo (fideos en general), queso, ensaladas

preparadas (jamón, huevo, atún, pavo), pescado, frutas secas o
congeladas, vegetales, crustáceos (langostino, cangrejo,
camarones, langosta) y pescados
Preferiblemente no descongelar las muestras antes del análisis. Si se debe

descongelar realizarlo a 45°C durante menos de 15 m inutos con agitación
continua en baño de agua termostáticamente controlado o descongelar durante
18 h entre 2°C y 5°C.
o en otro recipiente apropiado y agregar 225 ml de Caldo Lactosado.
26
a 6.8 ± 0.2 Incubar 24 h ± 2 h a 35°C.
6. Caramelos y recubrimiento de caramelo (incluyendo chocolate)

o en otro recipiente apropiado y agregar 225 ml de leche descremada en polvo
reconstituida y mezclar por 2 minutos
a 6.8 ± 0.2 Agregar 0.45 ml de solución acuosa de Verde Brillante al 1%.
Incubar 24 h ± 2 h a 35°C.
7. Carnes, sustitutos de carne, sustancias de origen animal,

productos glandulares y harinas (de pescado, carne, hueso)

o en otro recipiente apropiado y agregar 225 ml de caldo lactosa y mezclar 2
minutos.
a 6.8 ± 0.2 Agregar como máximo 2.25 ml de Tergitol Aniónico 7 calentado a
baño maría (15 minutos) y mezclar bien. Alternativamente utilizar Tritón X-100
precalentado en baño maría (15 minutos). Usar la mínima cantidad para formar
espuma. La cantidad dependerá de la composición del alimento. Incubar 24 h ±
2 h a 35°C.
8. Jugo de naranja (pasteurizado y sin pasteurizar), sidra de manzana

(pasteurizada y sin pasteurizar) y jugo de manzana pasteurizado
Agregar 25 ml de la muestra en un recipiente estéril de boca ancha o en otro

recipiente apropiado y agregar 225 ml de caldo de preenriquecimiento
Universal. Mezclar suavemente. Dejar 60 minutos ± 5 minutos a temperatura
ambiente. No ajustar el pH. Incubar 24 h ± 2 h a 35°C.
9. Tomates
Para tomates cortados pesar asépticamente 25 g de la muestra en un

recipiente estéril de boca ancha o en otro recipiente apropiado y agregar 225
ml de agua peptona bufferada (BPW) y mezclar por 2 minutos.
a 6.8 ± 0.2 Incubar 24 h ± 2 h a 35°C.
Para tomates enteros, no enjuagar si hay suciedad visible, examinar los
tomates “tal cual”. Colocar el tomate en una bolsa plástica estéril y agregar la
cantidad necesaria de Caldo de preenriquecimiento Universal para que el
tomate flote, generalmente el volumen es 1 peso del tomate (por ejemplo si el
tomate pesa 300 g se necesitan aproximadamente 300 ml del caldo de
27
preenriquecimiento para que el tomate flote). Dejar 60 minutos ± 5 minutos a
temperatura ambiente, no ajustar el pH. Incubar 24 h ± 2 h a 35°C.
10. Melón
Preferiblemente no descongelar las muestras antes del análisis. Si se debe

descongelar realizarlo a 45°C durante menos de 15 m inutos con agitación
continua en baño de agua termostaticamente controlado o descongelar durante
18 h entre 2°C y 5°C.
Para melón cortado pesar asépticamente 25 g de la muestra en un recipiente
de preenriquecimiento Universal y mezclar por 2 minutos.
Dejar 60 minutos ± 5 minutos a temperatura ambiente, no ajustar el pH,
mezclar bien por agitación, dejar la tapa del frasco floja e incubar 24 h ± 2 h a
35°C.
Para melones enteros, no enjuagar si hay suciedad visible, examinar los
melones “tal cual”.Colocar el melón en una bolsa plástica estéril y agregar la
cantidad necesaria de caldo de preenriquecimiento Universal para que el melón
flote, generalmente el volumen es 1.5 peso del melón (por ejemplo si el melón
pesa 1500 g se necesitan aproximadamente 2250 ml del caldo de
preenriquecimiento para que el melón flote). Dejar 60 minutos ± 5 minutos a
temperatura ambiente, no ajustar el pH. Incubar la bolsa sin cerrar totalmente,
24 h ± 2 h a 35°C.
NOTA: Para otros alimentos como huevos, levadura deshidratada,

especias, coco, gelatina, ancas de rana, carcasas de conejo, goma guar,
mango, alfalfa referir a la técnica Salmonella FDA-BAM: 2007, capítulo 5
(http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/Bacteriolo
gicalAnalyticalManualBAM/default.htm)
3.3.2.1. Mezclar bien las muestras incubadas.

- Para goma guar y alimentos sospechosos de contaminación con S.
Typhi: transferir 1 ml del caldo de enriquecimiento a 10 ml de caldo
selenito cistina (SC) y 1 ml del caldo de enriquecimiento a 10 ml de
caldo tetrationato. Mezclar en vórtex.
- Para otros alimentos transferir 0.1 ml del caldo de enriquecimiento a 10
ml de caldo Rappaport-Vassiliadis (RV) y 1 ml del caldo de
enriquecimiento a 10 ml de caldo tetrationato (TT). Mezclar en vórtex.
3.3.2.2. Incubar los caldos de enriquecimiento selectivo de la siguiente manera:
- Para alimentos con alta carga microbiana: incubar el caldo RV 24 h ± 2 h
a 42°C ± 0.2°C (en baño de agua con circulación y t ermostáticamente
controlado).Incubar el caldo TT 24 h ± 2 h a 43°C ± 0.2°C (en baño de
agua con circulación y termostáticamente controlado)
28
- Para alimentos con baja carga microbiana: incubar el caldo RV 24 h ± 2
h a 42°C ± 0.2°C (en baño de agua con circulación y termostáticamente
controlado). Incubar el caldo TT 24 h ± 2 h a 35°C ± 2°C
- Para goma guar y alimentos sospechosos de contaminación con S.
Typhi: incubar el caldo SC y el caldo TT 24 h ± 2 h a 35°C ± 2°C
3.3.3. Aislamiento en medios selectivos
Mezclar los tubos en vórtex y a partir de los caldos TT y RV estriar un ansa

llena (10 ul) en agar Bismuto sulfito (BS), en agar Xilosa Lisina Desoxicolato
(XLD) y en agar Hektoen Entérico (HE).
Para goma guar y alimentos sospechosos de contaminación con S. Typhi
realizar lo mismo a partir del caldo (CS).
NOTA: preparar el agar BS el día antes de utilizarlo y almacenarlo en la
oscuridad a temperatura ambiente.
Incubar las placas a 24 h ± 2 h a 35°C.

presencia de colonias típicas de Salmonella.
Picar 2 o más colonias sospechosas de cada uno de los agares selectivos.
Las colonias sospechosas se ven de la siguiente manera:
Morfología de colonias típicas:

- Agar Hektoen Entérico (HE): colonia azul verdosa a azul con o sin centro
negro. Muchas cepas de Salmonella pueden dar colonias con centros
negros grandes y brillantes o pueden dar colonias completamente
negras.
- Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD): colonia rosas con o sin centro
negro. Muchas cepas de Salmonella pueden dar colonias con centros
negros grandes y brillantes o pueden dar colonias completamente
negras.
- Agar bismuto sulfito (BS): colonia marron gris o negra, algunas veces
pueden tener brillo metálico. Alrededor de las colonias aparece una
coloración marrón al principio que puede pasar a negra con mayor
tiempo de incubación.
Si hay crecimiento de colonias típicas en el agar BS a las 24 h de incubación
picar 2 colonias. Independientemente si hay o no colonias reincubar el agar BS
24 h más. Después de 48 h de incubación picar 2 o más colonias típicas. Sólo
si las colonias picadas del agar BS a las 24 h dan una reacción atípica en el
TSI y LIA se puede descartar el cultivo por no ser Salmonella.
Morfología de colonias atípicas:

En ausencia de colonias típicas de Salmonella investigar las colonias atípicas
de la siguiente manera:
- Agar HE y Agar XLD: algunas cepas atípicas de Salmonella pueden
producir colonias amarillas con o sin centros negros. Picar 2 o más
colonias atípicas.
- Agar BS: algunas cepas atípicas producen colonias verdes con un poco
o sin oscurecimiento alrededor del medio. Si no hay colonias típicas en
29
el agar BS después de 24 h ± 2 h de incubación, no picar colonias y
reincubar el medio 24 h más. Si no hay colonias típicas después de las
48 h ± 2 h de incubación, entonces picar 2 o más colonias atípicas.
Controles de cultivos recomendados
Además de un cultivo de control positivo (Salmonella típica), se recomiendan

utilizar tres cultivos adicionales para ayudar a la identificación de colonias de
Salmonella atípica en los medios selectivos. Estos cultivos son: S. diarizonae
(ATCC 12325) lactosa positiva y H2S positivo, S. abortus equi (ATCC 9842)
lactosa negativa y H2S negativo o S.diarizonae (ATCC 29934) lactosa positiva y
H2S negativo. Estos cultivos pueden obtenerse en la American Type Culture
Collection (ATCC).
3.3.4 Identificación Bioquímica
3.3.4.1. TSI y LIA: Picar suavemente el centro de la colonia con aguja de

inoculación e inocular el TSI por punción en el fondo y estriar el pico de flauta.
Sin flamear inocular el LIA por punción en el fondo 2 veces y estriar el pico de
flauta. Como la reacción de la lisina decarboxilasa es estrictamente anaeróbica,
el LIA debe tener un fondo profundo (4 cm). Guardar las placas a 5°C - 8°C.
Incubar TSI y LIA a 35°C durante 24 h ± 2 h. Tapar los tubos sin apretar para
mantener condiciones de aerobiosis y prevenir la excesiva producción de H2S.
Interpretación:
Las cepas de Salmonella típica producen:
En TSI: pico de flauta alcalino (rojo) y fondo ácido (amarillo) con o sin
producción de H2S (ennegrecimiento del agar)
En LIA: fondo alcalino (violeta). Considerar sólo amarillo definido en el fondo
del tubo como ácido (reacción negativa).No descartar los cultivos que producen
decoloración en el fondo del tubo basándose solo en esta reacción. La mayoría
de los cultivos de Salmonella producen H2S en LIA. Algunos cultivos que no
son Salmonella producen un color rojo ladrillo en LIA.
Deben ser retenidos para confirmación bioquímica y serológica los cultivos que
dan:
- Fondo alcalino (violeta) en LIA sin importar la reacción en TSI
- Fondo ácido (amarillo) en LIA y pico de flauta alcalino (rojo) y fondo
ácido (amarillo) en TSI.
Descartar como no Salmonella los cultivos que dan fondo ácido en LIA y pico
de flauta y fondo ácidos en TSI.
Realizar las pruebas de identificación bioquímica y serológica a:

Tres TSI presuntivos provenientes de placas sembradas a partir del caldo RV
(o del caldo SC para goma guar) y tres TSI presuntivos provenientes de placas
sembradas a partir del caldo TT.
3.3.4.2. Urea: Sembrar a partir del TSI presuntivo en tubos con caldo urea.
Incubar 24 h ± 2 h a 35°C.
30
3.3.4.3. Urea rápida opcional: Transferir 2 ansadas llenas a partir del TSI
presuntivo a tubos con caldo urea rápido. Incubar 2 h a 37°C ± 0.5°C en baño
de agua. Descartar todos los cultivos que den reacción positiva.
3.3.4.4. Caldo lisina decarboxilasa: Se realiza en el caso de tener un

resultado dudoso en LIA. Si el cultivo dio una reacción satisfactoria en LIA no
es necesario realizar esta prueba.
Sembrar el caldo con una pequeña cantidad de cultivo a partir del TSI
sospechoso, ajustar bien la tapa e incubar 48 h ± 2 h a 35°C y examinar a
intervalos de 24 h. Salmonella da una reacción alcalina indicada por una
coloración violeta. Una reacción negativa es indicada por coloración amarilla en
el medio. Si el medio aparece descolorido (ni violeta ni amarillo) agregar unas
gotas de púrpura de bromo cresol al 0.2%.
3.3.4.5. Caldo dulcitol: Sembrar el caldo con una pequeña cantidad de cultivo
a partir del TSI sospechoso, cerrar la tapa sin apretar e incubar 48 h ± 2 h a
35°C y examinar a intervalos de 24 h. La mayoría de las especies de
Salmonella dan una reacción positiva indicada por producción de gas en la
campanita y producción de ácido (coloración amarilla). Una reacción negativa
está indicada por ausencia de gas en la campanita de fermentación y
coloración roja (con indicador rojo fenol) o violeta (con indicador púrpura de
bromo cresol).
3.3.4.6. Caldo triptona o triptofano: Inocular el caldo con una pequeña

cantidad de cultivo a partir del TSI sospechoso. Incubar 24 h ± 2 h a 35°C y
proceder de la siguiente manera:
- Caldo cianuro de potasio (KCN): transferir una ansada llena a partir

del cultivo de 24 h en caldo triptófano al caldo KCN, tapar con tapón de
corcho y sellar con parafina. Incubar 48 h ± 2 h a 35°C y examinar a
intervalos de 24 h. Interpretar presencia de crecimiento (indicado por
turbidez) como positivo. La mayoría de las especies de Salmonella no
crecen en este medio, indicado por ausencia de turbidez.
- Caldo malonato: transferir una ansada llena a partir del cultivo de 24 h

en caldo triptona al caldo malonato. Incubar 48 h ± 2 h a 35°C y
examinar a intervalos de 24 h. La mayoría de las especies de
Salmonella dan una reacción negativa (sin cambio de color o coloración
verde). Una reacción positiva está indicada por coloración azul.
- Indol: transferir 5 ml a partir del cultivo de 24 h en caldo triptófano a un

tubo vacío. Agregar 0.2 – 0.3 ml de reactivo de Kovacs. La mayoría de
las especies de Salmonella dan una reacción negativa. Una reacción
positiva está indicada por formación de color rojo fuerte en la superficie.
Registrar coloración naranja o rosa como +/-.
3.3.4.7 Pruebas bioquímicas adicionales: Realizar las siguientes pruebas

para los cultivos que no dan una reacción típica para Salmonella con las
pruebas bioquímicas descriptas en los puntos 3.3.4.1 a 3.3.4.6.
31
Caldo lactosa rojo fenol o caldo lactosa púrpura: Inocular el caldo con una
pequeña cantidad de cultivo a partir del TSI sin clasificar. Incubar 48 h ± 2 h a
35°C pero examinar a intervalos de 24 h.
La mayoría de las especies de Salmonella dan una reacción negativa indicada
por ausencia de gas en la campanita de fermentación y coloración roja (con
indicador rojo fenol) o violeta (con indicador púrpura de bromo cresol).
Una reacción positiva está indicada por producción de gas en la campanita y
producción de ácido (coloración amarilla).
Descartar como no Salmonella los cultivos que dan una reacción positiva para
el test de lactosa, excepto los cultivos que dan reacción ácida en el pico de
flauta del TSI y reacción positiva en LIA o cultivos que dan reacción positiva
para malonato. Realizar más pruebas bioquímicas para determinar si se trata
de Salmonella arizonae.
Caldo sucrosa rojo fenol o caldo sucrosa púrpura de bromocresol:

Inocular el caldo con una pequeña cantidad de cultivo a partir del TSI sin
clasificar. Incubar 48 h ± 2 h a 35°C pero examinar a intervalos de 24 h.
Descartar como no Salmonella los cultivos que dan una reacción positiva para
el test de sucrosa, excepto los cultivos que dan reacción ácida en el pico de
flauta del TSI y reacción positiva en LIA.
Caldo MR-VP: Inocular el caldo con una pequeña cantidad de cultivo a partir
del TSI sin clasificar. Incubar 48 h ± 2 h a 35°C p ero examinar a intervalos de
24 h.
Voges Proskauer (VP): Transferir 1 ml del cultivo de 24 h a un tubo test e

incubar el sobrante del caldo MR-VP 48 h más a 35°C . Agregar 0.6 ml de α-
naftol y mezclar bien. Agregar 0.2 ml de solución de KOH al 40% y mezclar.
Para acelerar e intensificar la reacción agregar unos cristales de creatina. Leer
la reacción después de 4 h: una reacción positiva está indicada por coloración
rosa a rojo rubí. La mayoría de las especies de Salmonella dan una reacción
negativa indicada por ausencia de desarrollo de color.
Rojo de metilo (MR): a 5 ml del caldo MR-VP de 96 h agregar 5 a 6 gotas de

indicador rojo de metilo. Leer inmediatamente. La mayoría de las especies de
Salmonella dan una reacción positiva indicada por desarrollo de color rojo.
Descartar como no Salmonella los cultivos que dan reacción positiva para KCN
y VP y reacción negativa para rojo de metilo.
Agar citrato de Simmons: Inocular con cultivo a partir del TSI sin clasificar.
Estriar con aguja el pico de flauta. Incubar 96 h ± 2 h a 35°C.
Una reacción positiva está indicada por presencia de crecimiento, usualmente
acompañado por cambio de color del verde al azul. La mayoría de las especies
de Salmonella son citrato positivo.
Una reacción negativa está indicada por ausencia o muy poco crecimiento y sin
cambio de color.
NOTA: Como alternativa de las pruebas bioquímicas convencionales en tubo

se pueden utilizar kits comerciales (ej.: API 20E bioMerieux, Enterotube II,
Enterobacteriaceae II, MICRO-ID, Vitek GNI).
32
3.3.5. Confirmación serológica y serotipificación
General: La detección de la presencia de los antígenos O, Vi Y H de

Salmonella se realiza por aglutinación en placa con los sueros apropiados a
partir de colonias puras y después de eliminar las cepas autoaglutinables.
3.3.5.1. Eliminación de cepas autoaglutinables: colocar una gota de solución

salina en una placa de vidrio. Con un ansa dispersar parte de la colonia para
obtener una suspensión turbia y homogénea. Mover la placa de vidrio en
círculos por 30 a 60 segundos. Observar el resultado contra un fondo oscuro
preferiblemente con ayuda de una lupa.
Si la cepa aglutina es considerada autoaglutinable y no debe someterse a la
determinación serológica, ya que los resultados no son confiables.
3.3.5.2. Determinación del antígeno somático O:

Antisuero polivalente (O): emulsionar una ansada de cultivo de 24 h - 48 h
tomado a partir del pico de flauta del TSI o preferiblemente del triptosa agar
sangre base (sin sangre) con 2 ml de solución salina 0.85% y colocar una gota
sobre la placa de vidrio. Agregar una gota del antisuero polivalente O y mezclar
con un aguja o ansa limpia y estéril. Inclinar con movimientos una y otra vez
durante un minuto. Observar el resultado contra un fondo oscuro y con buena
luz. Considerar cualquier grado de aglutinación como positivo.
Antisuero (O) de grupo: utilizar antisueros de grupo, incluyendo el Vi y realizar
el mismo procedimiento que para el antisuero polivante (O)
3.3.5.3. Determinación del antígenos flagelar (H):

A partir del pico de flauta del TSI inocular un caldo BHI e incubar 4h - 6 h a
35°C hasta crecimiento visible (para realizar el te st el mismo día) o caldo
tripticasa soja-triptona e incubar 24 h ± 2 h a 35 °C (para realizar el test al día
siguiente). Agregar 2.5 ml de solución salina fisiológica formolada a 5 ml de
cualquiera de los caldos arriba mencionados.
Colocar 0.5 ml de una dilución apropiada del antisuero polivalente flagelar (H)
en un tubo para serología y agregar 0.5 ml del antígeno.
Realizar un control de autoaglutinación mezclando 0.5 ml de solución salina
fisiológica formolada con 0.5 ml del antígeno. Incubar la mezcla en baño de
agua 48°C - 50°C. Observar a intervalos de 15 minut os y leer el resultado final
en 1 h.
Tratamiento de cultivos que dan antígeno flagelar negativo:

En el caso de cepas con antígeno flagelar negativo pero que presentan un
perfil bioquímico de Salmonella puede tratarse de cepas no móviles o que el
antígeno flagelar está poco desarrollado. En este caso proceder de la siguiente
manera:
Inocular una pequeña cantidad de crecimiento a partir del pico de flauta del TSI
en una placa de Petri con agar semisólido. Inocular por punción a 10 mm de los
bordes de la placa y a 2 - 3 mm de profundidad (no tocar el fondo de la placa).
Incubar 24 h a 35°C. Si el microorganismo presenta una movilidad de 40 mm o
más, realizar el ensayo de la siguiente manera:
Transferir una ansada de crecimiento tomada de los bordes del crecimiento
(zona de mayor movilidad) a caldo tripticasa soja-triptona, repetir la prueba de
33
aglutinación con el antisuero polivalente flagelar (H) como en 3.3.5.3. Si el
cultivo no presenta movilidad después de 24 h de incubación a 35°C, incubar
hasta 5 días a 25°C. Si después de 5 días de incuba ción no muestra movilidad
clasificar el cultivo como no móvil.
3.3.6. Interpretación de las pruebas bioquímicas y serológicas
Reacciones bioquímicas y serológicas de Salmonella.

Resultado Resultado para
Prueba positivo negativo Salmonella spp
(a)
Glucosa (TSI) fondo amarillo fondo rojo (+)

Lisina
decarboxilasa fondo violeta fondo amarillo (+)
(LIA)
sin
H2S (TSI y LIA) ennegrecimiento (+)
ennegrecimiento
sin cambio de
Ureasa rojo- violeta (-)
color
Caldo lisina
violeta amarillo (+)
decarboxilasa
Caldo dulcitol rojo sin gas y sin
amarillo y/o gas (+)(b)
fenol cambio de color
Caldo KCN crecimiento sin crecimiento (-)
sin cambio de
Caldo malonato azul (-)(c)
color
color rojo fuerte color amarillo en
Indol (-)
en la superficie la superficie
Antisuero
polivalente aglutinación sin aglutinación (+)
flagelar
Antisuero
polivalente aglutinación sin aglutinación (+)
somático
Caldo lactosa rojo sin gas y sin
amarillo y/o gas (-)(c)
fenol cambio de color
Caldo sucrosa sin gas y sin
amarillo y/o gas (-)
rojo fenol cambio de color
sin cambio de
Voges Proskauer rosa a rojo (-)
color
Rojo de metilo rojo amarillo (+)
sin crecimiento,
Citrato de
crecimiento, azul sin cambio de V
Simmons
color
(a) (+): 90% o más positivo en 1 o 2 días, (-): 90% o más negativo en 1 o 2
días, V: variable
(b) La mayoría de las S. arizonae son negativas
(c) La mayoría de las S. arizonae son positivas
34
Criterio para descartar cultivos Salmonella negativos
Prueba Resultado
Ureasa (+)
Indol y (+)
antisuero polivalente flagelar (H) (-)
Lisina decarboxilasa y (-)
caldo KCN (+)
Caldo lactosa rojo fenol (+)(a), (b)
Caldo sucrosa rojo fenol (+)(b)
Caldo KCN, (+)
Voges-Proskauer y (+)
Rojo de metilo (-)
(a) Realizar pruebas adicionales a los caldos malonato positivo para

determinar si se trata de Salmonella arizonae
(b) No descartar cultivos positivos si presentan un LIA típico de Salmonella,
realizar pruebas adicionales para determinar si se trata de Salmonella
spp.
3.3.7. Tipificación
Una vez identificado el microorganismo como Salmonella spp. por propiedades

bioquímicas y serológicas, las cepas aisladas deben ser enviadas al Centro de
Referencia Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S “Dr.
Carlos G. Malbrán”, para una mayor tipificación.
De acuerdo a los resultados de la interpretación (3.3.6) indicar presencia o

ausencia de Salmonella spp. en la cantidad de muestra analizada (por gramos
o mililitros para muestras líquidas).
35
4. ANEXOS
1. Caldo lactosa

Peptona 5.0 g
Lactosa 5.0 g

Esterilizar a 121°C durante15 minutos.
2. Leche descremada en polvo (reconstitución)
Leche en polvo descremada 100 g

Disolver los componentes en agua. Distribuir en frascos o tubos de acuerdo a las

necesidades analíticas. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
3. Caldo selenito cistina (SC)

Medio 1 (modificación de Leifson)
Triptona o polipeptona 5.0 g
Lactosa 4.0 g
Selenito sódico (NaHSeO3) 4.0 g
Sodio dihidrógeno fosfato (NaHPO4) 10.0g
L - cistina 0.01g
Calentar agitando hasta disolver. Ajustar el pH a 7.0 ± 0.2 a 25°C. Distribuir 10

ml en tubos estériles. NO AUTOCLAVAR.
Medio 2 (modificación de North-Bartram)

Polipeptona 5.0 g
Lactosa 4.0 g
Selenito sódico (NaHSeO3) 4.0 g
Sodio dihidrógeno fosfato (NaH2PO4) 5.5 g
L - cistina 0.01 g
Calentar agitando hasta disolver. Ajustar el pH a 7.0 ± 0.2 a 25°C. Distribuir 10

ml en tubos estériles. NO AUTOCLAVAR. Usar el mismo día de la preparación.
36
4. Medio tetrationato (TT)
4.1. Medio tetrationato base

Polipeptona 5.0 g
Sales biliares 1.0 g
Carbonato de calcio 10.0 g
Tiosulfato de sodio pentahidratado (Na2S2O3. 5H2O) 30.0 g
Calentar agitando hasta disolver. NO AUTOCLAVAR (el precipitado no se

disolverá completamente). Enfriar lentamente hasta los 45°C. Mantener entre
5°C - 8°C. Ajustar el pH final a 8.4 ± 0.2.
4.2. Solución yodo-ioduro de potasio (I2-KI)

Ioduro de potasio 5.0 g
Yodo resublimado 6.0 g
Disolver completamente el ioduro de potasio en 5 ml de agua, luego agregar el

yodo y llevar a 20 ml con agua destilada estéril.
4.3. Solución verde brillante

Colorante verde brillante estéril 0.1 g
4.4. Medio tetrationato completo

El día de uso agregar 20 ml de la solución I2-KI y 10 ml de la solución de verde
brillante a 1 litro de medio base. Resuspender el precipitado agitando la
solución y colocar asépticamente 10 ml en tubos estériles. No calentar la
solución luego del agregado del I2-KI y del colorante.
5. Medio Rappaport-Vassiliadis (RV)
5.1. Caldo base

Triptona 5.0 g
Cloruro de Sodio 8.0 g
5.2. Solución de cloruro de magnesio

Cloruro de Magnesio hexahidratado (MgCl2·6H2O) 400 g
5.3. Solución de oxalato de verde de malaquita

Oxalato de verde de malaquita 0.4 g
Para preparar el medio completo, combinar 1000 ml de la solución de caldo

base, 100 ml de la solución de cloruro de magnesio y 10 ml de la solución de
37
oxalato de verde de malaquita (llegando a un volumen final del medio completo
de 1110 ml). Debe ser preparada en el mismo día de uso. Dispensar 10 ml del
medio completo en tubos y autoclavar a 115°C durant e 15 minutos, pH 5.5 final ±
0.2. Guardar en refrigeración y usar hasta dentro de 1 mes del día de su
preparación.
Este medio debe ser preparado usando los componentes por separado. No se
recomienda el uso de fórmulas completas deshidratadas.
NOTA: La solución de cloruro de magnesio puede ser guardada en un frasco de
color caramelo al abrigo de la luz por un año. Para preparar la solución utilizar
MgCl2·6H2O de un envase nuevo, ya que esta sal es muy higroscópica.
La solución de verde de malaquita puede ser guardada en una botella oscura por
el lapso de 6 meses. Para la preparación de la solución 5.3 se recomienda el uso
de oxalato de verde de malaquita de Merck porque con otras marcas no se
obtuvieron resultados efectivos.
6. Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)

Xilosa 3.75 g
Lactosa 7.5 g
Sucrosa 7.5 g
Rojo Fenol 0.08 g
Desoxicolato de sodio 1.0 g
Agar 9 g a 18 g*
Disolver los componentes en agua destilada por calentamiento con frecuente

agitación hasta ebullición. Evitar sobrecalentamiento.
Ajustar el pH si es necesario para obtener un valor de 7.4 ± 0.2 a 25°C.
Preparación de las placas: enfriar en baño de agua a 44ºC - 47ºC, agitar y
volcar en placas de Petri. Dejar solidificar.
Inmediatamente antes de usar secar cuidadosamente las placas (sin tapa y con
la superficie del agar hacia abajo) en estufa entre 37ºC y 55ºC hasta que la
superficie del agar quede seca.
Almacenar hasta 30 días a 4°C ± 2ºC.
38
7. Agar Hektoen Entérico (HE)
Peptona 12.0 g
Sales biliares N°3 9.0 g
Lactosa 12.0 g
Sucrosa 12.0 g
Salicina 2.0 g
Azul de bromotimol 0.065 g
Fucsina acida 0.1 g
Agar 14.0 g
Calentar agitando con frecuencia hasta disolver. No calentar más de un minuto.

No sobrecalentar. Enfriar antes de pasar a placa. Secar 2 h con las tapas
abiertas. Ajustar el pH final a 7.5 ± 0.2. Almacenar hasta 30 días a 4ºC ± 2ºC.
8. Agar sulfito de bismuto (Wilson and Blair)
Polipeptona (o peptona) 10.0 g

Dextrosa 5.0 g
Disodio hidrógeno fosfato anhidro (NaH2PO4) 4.0 g
Sulfato de hierro (II) anhidro 0.3 g
Sulfito de Bismuto (indicador) 8.0 g
Verde brillante 0.025 g
Agar 20 g
Mezclar completamente y calentar con agitación. Calentar durante un minuto

hasta obtener una suspensión uniforme (el precipitado no se disuelve). Enfriar
a 45ºC-50°C. Resuspender el precipitado con suave a gitación y volcar en
placas de Petri. Secar 2 h con las tapas abiertas. Ajustar el pH final a 7.7 ± 0.2.
NO AUTOCLAVAR. Preparar las placas un día antes de su uso y guardarlas en
la oscuridad. Tener en cuenta que su selectividad disminuye a las 48 h.
39
9. Medio TSI (triple sugar iron)
MEDIO 1 MEDIO 2
Polipeptona 20 g Extracto de carne 3.0 g
Cloruro de sodio 5.0 g Extracto de levadura 3.0 g
Lactosa 10.0 g Peptona 15.0 g
Sacarosa 10.0 g Proteosa peptona 5.0 g
Glucosa 1.0 g Lactosa 10.0 g
Citrato de hierro (III) 0.2 g Sacarosa 10.0 g
Tiosulfato de sodio 0.2 g Glucosa 1.0 g
Rojo de fenol 0.025 g Sulfato de hierro (II) 0.2 g
Agar 13 g Cloruro de sodio 5.0 g
Agua destilada 1000 ml Tiosulfato de sodio 0.03 g
Rojo de fenol 0.024 g
Agar 12.0 g
Suspender los componentes del medio 1 en agua destilada y calentar agitando

suavemente. Continuar hasta la disolución de sus ingredientes.
Llenar 1/3 de los tubos de ensayo y tapar manteniendo un medio aeróbico.
Autoclavar el medio 1 a 118 ºC durante15 minutos.
Preparar el medio 2 de la misma manera que el medio 1, teniendo en cuenta
la diferencia en el autoclavado a 121ºC durante 15 minutos. Antes de solidificar
inclinar los tubos para obtener un pico de flauta de 4-5 cm y un fondo de 2-3
mm. Ajustar el pH final a 7.3 ± 0.2 para el medio 1 y a 7.4 ± 0.2 para el medio
2.
10. Caldo triptona (triptofano) al 1 %
Triptona o tripticasa 10.0 g

Disolver y fraccionar 5 ml del medio en tubos. Esterilizar a 121°C durante 15

minutos. Ajustar el pH final a 6.9 ± 0.2.
11. Caldo tripticasa soja
Tripticasa 17.0 g
Peptona 3.0 g
Glucosa 2.5 g
Calentar con suave agitación hasta disolver. Fraccionar 225 ml en frascos de

Erlenmeyer. Autoclavar a 121 ºC durante 15 minutos. Ajustar el pH final a 7.3 ±
0.2.
40
Para el caldo tripticasa soja sin glucosa, preparar el mismo medio sin los 2.5 g
de glucosa.
12. Caldo tripticasa soja con sultafo ferroso
Tripticasa 17.0 g
Peptona 3.0 g
Glucosa 2.5 g
Sulfato ferroso 35 mg
Calentar con suave agitación hasta disolver. Fraccionar 225 ml en frascos de

Erlenmeyer. Autoclavar a 121 ºC durante 15 minutos. Ajustar el pH final a 7.3 ±
0.2.
13. Caldo tripticasa soja-triptona
Medio Tripticasa soja (medio comercial deshidratado) 17.0 g

Caldo Triptosa (medio comercial deshidratado) 13.5 g
Disolver en 1 litro de agua destilada. Calentar suavemente hasta disolver.

Fraccionar 5 ml en tubos de ensayo. Autoclavar a 121 ºC durante 15 minutos.
Ajustar el pH final a 7.2 ± 0.2.
14. Caldo MR-VP
Medio 1
Peptona bufferada 7.0 g
Glucosa 5.0 g
Medio 2
Digesto pancreático de caseína 3.5 g
Digesto péptico de tejido animal 3.5 g
Dextrosa 5.0 g
Fosfato de potasio 5.0 g

41
esterilización. Fraccionar 10 ml del medio en tubos. Esterilizar a 118-121°C
durante 15 minutos.
Medio 3
Peptona 5.0 g
Glucosa 5.0 g
Fosfato bufferado 5.0 g
Disolver los componentes en agua. Fraccionar 10 ml en tubos de ensayo y

esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos. Ajustar el pH final a 7.5 ± 0.2.
Para Salmonella: fraccionar 10 ml en tubos de ensayo y esterilizar a 121ºC
durante 12-15 minutos.
15. Agar citrato de Simmons
Citrato de sodio 2.0 g

Cloruro de sodio 5.0 g
Fosfato de amonio (NH4H2PO4) 1.0 g
Sulfato de magnesio (MgSO4) 0.2 g
Agar 15 g
Calentar con suave agitación hasta disolver. Fraccionar 10 ml en tubos de

ensayo cubriendo 1/3 y esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos. Antes de
solidificar inclinar los tubos para obtener un pico de flauta de 4 - 5 cm y un
fondo de 2 - 3 mm. Ajustar el pH final a 6.8 ± 0.2.
16. Caldo urea
Urea 20.0 g
Disodio hidrógeno fosfato (Na2HPO4) 9.5 g
Rojo fenol 0.01 g
Disolver los componentes en agua destilada. NO CALENTAR. Esterilizar por

filtración con membrana de 0.45 µm. Fraccionar 1.5 - 3.0 ml en tubos estériles.
42
17. Caldo urea (rápida)
Urea 20.0 g
Rojo fenol 0.01 g
Preparar como el medio anterior 16 (Caldo Urea)
18. Caldo malonato

Sulfato de amonio (NH4)2SO4 2.0 g
Malonato de sodio 3.0 g
Glucosa 0.25 g
Disolver calentando, si es necesario. Fraccionar 3 ml en tubos de ensayo y

esterilizar 121°C durante 15 minutos. Ajustar el p H final a 6.7 ± 0.2.
19. Lisina hierro agar (LIA) (Edwards y Fife)
Peptona 5.0 g
Citrato amoniacal férrico 0.5 g
Tiosulfato de sodio (anhidro) 0.04 g
Agar 15 g
Disolver los componentes calentando. Fraccionar 4 ml del medio en tubos de

13 mm x 100 mm. Esterilizar a 121°C durante 12 minu tos. Antes de solidificar
inclinar los tubos para obtener un pico de flauta de 4 - 5 cm y un fondo de 2 - 3
mm. Ajustar el pH final a 6.7 ± 0.2.
43
20. Caldo lisina decarboxilasa (Falkow) (para Salmonella)
Peptona 5.0 g
L-lisina 5.0 g
Disolver los componentes calentando. Fraccionar 5 ml del medio en tubos de

16 mm x 125 mm. Esterilizar con la tapa a medio abrir a 121°C durante 12
minutos. Cerrar bien la tapa para su almacenamiento y posterior inoculación.
21. Medio para test movilidad (agar semisólido)

Peptona 10.0 g
Agar 4.0 g
Calentar con suave agitación hasta que se disuelva el agar. Fraccionar 20 ml

en tubos de ensayo de 20 x 150 mm. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
Luego enfriar a 45°C y almacenar en refrigeración.
Ajustar el pH si es necesario para obtener un valor de 7.4 ± 0.2 después de la
esterilización. Al momento de usar, fundir el medio y luego enfriarlo a 45°C.
Volcar asépticamente el contenido en placas de Petri estériles. Cerrar y dejar
solidificar. Deben ser usadas el mismo día que fueron preparadas.
22. Caldo cianuro de potasio
Cianuro de potasio (KCN) solución 0.5 % 15.0 ml

Polipeptona 3.0 g
Disolver todos los componentes excepto el cianuro de potasio y esterilizar

121°C durante 15 minutos. Enfriar y guardar en refr igeración a 5 - 8°C. Ajustar
el pH final a 7.6 ± 0.2.
Para preparar la solución de cianuro de potasio, agregar 0.5 g de KCN en 100

ml de agua destilada estéril fría a 5 - 8°C. USANDO PIPETA, adicionar 15 ml
de la solución de KCN a 1 litro del caldo base.
NO PIPETAR CON LA BOCA Y USAR GUANTES!
44
Mezclar y fraccionar asépticamente 1.0 - 1.5 ml en tubos estériles. Cerrar los
tubos con tapón de parafina. Almacenar los mismos en refrigeración a 5 - 8°C
no más de 2 semanas.
23. Caldo rojo de fenol para carbohidratos
Tripticasa o proteosa peptona N°3 10.0 g

Extracto de carne (opcional) 1.0 g
Rojo de fenol (7.2 ml de una solución de rojo de fenol al 0.25%) 0.018 g
Carbohidrato *
*Disolver 5 g de dulcitol, 10 g de lactosa o 10 g de sacarosa (según se

especifique en el test de Salmonella) en el medio de base. Fraccionar 2.5 ml en
tubos que contengan campanita para fermentación. Esterilizar a 118°C durante
15 minutos y enfriar. Alternativamente disolver los ingredientes (omitiendo los
carbohidratos) en 800 ml de agua destilada calentando y agitando suavemente.
Dispensar 2.0 ml en tubos de 13 x 100 mm conteniendo 1 campanita de
fermentación invertida (campana de Durhan). Autoclavar a 118°C durante 15
minutos y dejar enfriar. Disolver cada carbohidrato en 200 ml de agua destilada
y esterilizar por filtración. Adicionar 0.5 ml de la solución filtrada en cada tubo
con caldo base, después de enfriarlo a 45°C. Agitar suavemente para mezclar.
24. Caldo púrpura de bromo cresol para carbohidratos
Proteosa peptona N°3 10.0 g

Preparar el caldo según las instrucciones del medio rojo de fenol. Ajustar el pH
final a 6.8 ± 0.2.
45
25. Agar Mac Conkey
Proteosa peptona o polipeptona 3.0 g

Peptona 17.0 g
Lactosa 10.0 g
Rojo neutro 0.03 g
Cristal violeta 0.001 g
Agar 13.5 g
pH final a 25°C 7.1 ± 0.2
Suspender los componentes y calentar con suave agitación hasta disolver.

Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos . Enfriar entre 45 - 50ºC y
fraccionar 20 ml en placas de Petri estériles.
26. Caldo nutritivo

Peptona 5.0 g
Disolver los componentes en agua. Ajustar el pH si es necesario para obtener

un valor después de la esterilización de 6.8 ± 0.2 a 25°C. Esterilizar a 121°C
durante 15 minutos.
27. Caldo BHI
Medio 1
Infusión de cerebro 200 g
Infusión de corazón 250 g
Proteasa peptona o polipeptona 10.0 g
Dextrosa 2.0 g
Disolver los componentes en agua destilada con suave calentamiento. Ajustar

esterilización. Fraccionar en tubos y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15
minutos.
46
Medio 2
Infusión de corazón cerebro 6.0 g
Digestivo péptico de tejido animal 6.0 g
Dextrosa 3.0 g
Digestivo pancreático de gelatina 14.5 g
Disolver los componentes en agua destilada, calentar llevando a ebullición

durante 1 minuto hasta completa disolución. Ajustar el pH si es necesario para
obtener un valor de 7.4 ± 0.2 a 25°C después de la esterilización. Fraccionar en
tubos y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
NOTA: se aceptan caldos BHI disponibles en el comercio.
28. Agar base triptosa sangre
Triptosa 10.0 g
NaCl 5.0 g
Agar 15.0 g
Disolver los componentes en agua, calentar agitando suavemente hasta llevar

a ebullición durante 1 minuto. Llenar 1/3 de tubos de ensayo de 16 x 150 mm,
tapar y esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Ant es de solidificar inclinar los
tubos para obtener un pico de flauta de 4 - 5 cm y un fondo de 2 - 3 mm.
29. Caldo de preenriquecimiento Universal
Triptona 5.0 g
Proteasa Peptona 5.0 g
Dextrosa 0.5 g
Citrato Férrico amoniacal 0.1 g
Piruvato de sodio 0.2 g
Calentar con suave agitación hasta disolver los componentes, esterilizar a 121°C
durante 15 minutos. Ajustar el pH final a 6.3 ± 0.2 a 25°C.
47
30. Caldo de preenriquecimiento Universal sin citrato férrico
amoniacal
Triptona 5.0 g
Dextrosa 0.5 g
Calentar con suave agitación hasta disolver los componentes, esterilizar a 121°C
31. Agua peptona bufferada (BPW)
Peptona 10.0 g
Disolver los componentes en agua, si es necesario calentar. Esterilizar a 121°C

32. Solución de verde brillante al 1%
Colorante verde brillante 1.0 g

Agua destilada estéril 100 ml
Disolver 1 g del colorante en agua destilada estéril. Diluir a 100 ml, antes del
uso realizar prueba de toxicidad con controles conocidos de microorganismos
positivos y negativos
33. Solución de púrpura de bromo cresol al 0.2 %
Colorante púrpura de bromo cresol 0.2 g

Disolver 0.2 g del colorante en agua destilada estéril. Diluir a 100 ml
48
34. Indicador rojo de metilo
Colorante rojo de metilo 0.10 g

Etanol 95% 300 ml
Agua destilada estéril (cantidad necesaria para llevar a 500ml)
Disolver 0.10 g del colorante en 300 ml de etanol y llevar con agua destilada
estéril a volumen final de 500 ml
35. Tergitol aniónico 7
Este reactivo es un sulfato de soldio derivado del 3,9-dietil tridecanol-6. Es un

agente emulsificador aniónico.
36. Tritón X-100
Es un agente surfactante no iónico. Este reactivo es una marca registrada para

el octil fenol etoxilado. Se utiliza como agente emulsificador.
37. Solución salina 0.85%

Disolver el NaCl en agua destilada, esterilizar a 121°C, durante 15 minutos.
38. Solución salina fisiológica formolada
Solución de formaldehido (63-38%) 6.0 ml

Disolver el NaCl en agua destilada, esterilizar a 121°C durante 15 minutos.

Enfriar a temperatura ambiente, agregar 6 ml de la solución de formaldehído. No
autoclavar después de agregar el formaldehído.
39. Reactivos para la reacción de Voges-Proskauer (VP)
Solución 1: Solución alcohólica de α- naftol

α-Naftol 5.0 g
Etanol 96% 100 ml
Disolver el α-Naftol en alcohol.
49
Solución 2: Solución de hidróxido de potasio
Hidróxido de potasio 40.0 g
Disolver el hidróxido de potasio en agua.
40. Reactivo de Kovacs (para reaación de indol)
Alcohol amílico o isoamílico 75.0 ml

Acido clorhídrico concentrado (HCl) 25.0 ml
Disolver el aldehído en el alcohol. Agregar lentamente el ácido a la mezcla

aldehído-alcohol. Proteger de la luz en un frasco de vidrio de color marrón y
guardar en refrigeración a 3°C ± 2°C. El reactivo d ebe mantener un color
amarillo a marrón claro, libre de precipitado.
50
ANEXO 2: FOTOS
Salmonella spp: colonias típicas transparentes, del mismo color del medio con
centro negro.
Salmonella Choleraesuis: colonias típicas transparentes, del mismo color del

medio sulfhídrico negativo.
Salmonella Thypi: colonias negras con brillo metálico, rodeadas por un halo
negro.
51
Salmonella Choleraesuis: colonias verdosas.
5. Agar Hektoen Entérico
Salmonella Thypimurium: colonias verde oscuro con centro negro
52
6. Agar TSI
Salmonella Enteritidis: TSI
53
5. REFERENCIAS:
Bacteriological Analytical Manual. Chaper 5, Salmonella. December 2007
Edition. FDA U.S. Food and Drug Administration
54
Escherichia coli O157:H7/NM
en alimentos
1. Generalidades
Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC), incluido el serotipo

O157:H7, es un patógeno emergente asociado a casos de diarrea, colitis
hemorrágica, síndrome urémico hemolítico (SUH) y trastornos de coagulación
(púrpura trombocitopénica trombótica) en seres humanos.
Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH) se identificó por primera vez como
patógeno humano en 1982, cuando se detectaron en dos brotes de colitis
hemorrágica en los Estados Unidos cepas de un serotipo antes poco frecuente,
el O157:H7. A partir de entonces se han registrado y se siguen registrando
brotes de infección por ECEH O157:H7 en muchas regiones del mundo. [1]
El período de incubación promedio de la infección por STEC es de 3 días (con
un rango de 1 - 8 días) y el cuadro clínico incluye un período de 1 a 2 días de
vómitos, fiebre baja o ausente, dolores abdominales severos y diarrea sin
sangre, como síntomas iniciales, seguidos por diarrea sanguinolenta o colitis
hemorrágica durante 4 a 6 días. Aunque en la mayoría de los casos la diarrea
por STEC es autolimitada, aproximadamente el 5 a 10% de los niños infectados
evolucionan a SUH. [2]
La complicación de la enfermedad afecta particularmente a niños, ancianos y
aquellos que, por padecer otras enfermedades, tengan su sistema
inmunológico deprimido.
2. Reservorio y fuente de infección
Los rumiantes en general y el ganado vacuno en particular, han sido señalados

como los principales reservorios de STEC.
La contaminación de la canal durante el sacrificio es la ruta primaria que
últimamente lleva a la contaminación de la carne picada de vacuno. El
escenario más normal que conduce a que se presente la enfermedad es una
cocción insuficiente, la supervivencia del patógeno y la subsecuente infección.
[3]
La principal vía de transmisión son los alimentos contaminados como carne
molida, productos cárnicos crudos o insuficientemente cocidos, embutidos
fermentados, leche y jugos no pasteurizados, vegetales que se consumen
crudos, etc.
Otras formas de transmisión incluyen la contaminación cruzada durante la
preparación de alimentos, el contacto directo del hombre con los animales,
bañarse en aguas recreacionales contaminadas y de persona a persona por la
ruta fecal-oral.
55
3. Factores de virulencia
Las cepas STEC de origen humano, animal o de alimentos pueden producir

dos tipos de toxinas Shiga,Stx1 y Stx2, que poseen efectos citotóxicos en
células Vero y portan marcadores de virulencia accesorios como el gen eae y
el gen hlyA. El gen eae codifica una proteína, denominada intimina, la cual
induce una unión íntima de la bacteria al enterocito y la desorganización de las
microvellosidades, con producción de la lesión AE (“attaching and effacing”); y
el gen hlyA codifica una enterohemolisina. [1]
E. coli O157 posee la mayoría de las características bioquímicas de la especie,

con las siguientes diferencias:
No fermenta el sorbitol o lo hace lentamente
No posee actividad de β - glucuronidasa
Temperatura óptima de crecimiento: 30°C - 42ºC
Desarrolla pobremente a 44°C - 45ºC
No desarrolla a temperaturas superiores a 45ºC
No desarrolla a temperaturas de –10ºC, pero sobrevive en
productos congelados (–20ºC), sin cambio en el número total de
microorganismos por períodos prolongados
Es resistente a los cambios de pH
4. Incidencia
La notificación de las infecciones por E. coli O157:H7 experimentaron un

aumento exponencial a partir de su primera aparición en 1982.
Los numerosos brotes y casos esporádicos detectados en distintas partes del
mundo, así como también la cantidad de vehículos de transmisión identificados
llevaron a promover estrategias de prevención y control.
En Canadá, la incidencia de las infecciones por E. coli O157:H7 es de
5,3/100.000 habitantes.
En Asia hay pocos reportes de infecciones por STEC, salvo en Japón donde
hubo un brote masivo con más de 10.000 afectados en el año 1996.
En EE.UU. E. coli productor de toxina Shiga es el causante de diarrea en
72.000 habitantes por año, de los cuales el 5%, evolucionan a SUH. En dicho
país, en el año 2002 el número de casos fue de 1,7/100.000 habitantes,
registrándose que más del 50% de los brotes de origen alimentario fue debido
a carne picada. [4]
En Argentina el SUH es endémico; es el país con mayor incidencia de SUH a
nivel mundial (13,9/100000 niños menores de 5 años).
La enfermedad está distribuida en todo el país, pero la frecuencia es mayor en
las provincias del centro y sur.
En el año 2006, en Argentina hubo 464 casos notificados, de los cuales el 60 %
eran menores de 2 años. La letalidad en la fase aguda fue del 3,2 %.
En niños, es la primera causa de insuficiencia renal aguda, y la segunda de
insuficiencia renal crónica. Causa el 20 % de los transplantes renales en niños
y adolescentes. [1]
56
Referencias:
1. Evaluación del riesgo de Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH) en

la carne y los productos cárnicos.
http://www.fao.org/ag/agn/agns/jemra_riskassessment_ecoli_es.asp
2. ICMSF Microbiología de los alimentos 7. Editorial ACRIBIA. Capítulo 17.
3. Manual de procedimientos: Detección de Escherichia coli productor de
toxina Shiga O157 y no-O157 en alimentos. Servicio de Fisiopatogenia.
Departamento de Bacteriología INEI- ANLIS “Carlos G. Malbrán”, 2009.
4. Responsible use of antibiotics in aquaculture.
ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/009/a0282e/a0282e00.pdf
57
de Escherichia coli O157:H7/NM en
productos cárnicos
(Procedimiento según USDA/FSIS: 2010)
1. OBJETIVO

aislamiento e identificación de E.coli O157:H7/NM en productos cárnicos.
2. ALCANCE

identificación de E.coli O157:H7 en productos cárnicos.
Una vez identificado y confirmado el microorganismo como E.coli O157:H7/NM
por propiedades bioquímicas y serología, determinar la producción de toxinas
Stx1 y Stx2 o la presencia de los genes que codifican para las mismas.
NOTA: Las cepas aisladas deben ser enviadas al Centro de Referencia

Malbrán”, para una mayor caracterización y determinación de los factores de
virulencia.
3. DESARROLLO
3.1. Medios de cultivo, materiales, reactivos y equipos
3.1.1. Suplemento cefixima telurito bioMérieux (Ref 42606) o equivalente
3.1.2. Solución salina bufferada con 0.05% de Tween 20 (PBS-Tween 20)
3.1.3. Solución fisiológica (SF)
3.1.4. Solución de novobiocina 4mg/ml
3.1.5. Partículas inmunomagnéticas anti E.coli O157 (ej. Dynabeads anti-E.coli
O157)
3.1.6. Kit de identificación bioquímica. Ejemplo Test Api 20E (bioMérieux), GNI
- VITEX o equivalente.
3.1.7. Kit para prueba de tamizaje (screening test): Kit de ensayo para
detección de E.coli O157:H7/NM que cumpla con las siguientes
especificaciones:
• Sensibilidad: ≥ 98%
• Especificidad: ≥90%
• Falsos negativos :≤ 2%
• Falsos positivos: ≤ 10%
58
Ejemplo: Transia Card E coli O157:H7 (Diffchamb), RapidChek Pathogen
Screening Test Kit (Strategic Diagnostics) o equivalente, BAX System PCR
Assay for Screening E.coli O157:H7 MP kit o equivalente.
3.1.8. Antisuero anti-O157 (Instituto Malbrán) o kit de látex anti-O157 disponible
en el comercio. Ejemplo RIM E.coli O157:H7 (REMEL) o equivalente
3.1.9. Antisuero anti-H7 (Instituto Malbrán) o kit de látex anti-O157 disponible
en el comercio. Ejemplo RIM E.coli O157:H7 (REMEL) o equivalente
3.1.10. Kit para detección de toxina Shiga disponible en el comercio. Ejemplo
Meridian Premier EHEC kit (Meridian Diagnostics) o equivalente
3.1.11. Caldo triptona soja modificado con novobiocina (TSBm+n)
3.1.12. Agar MacConkey sorbitol con cefixima-telurito (SMAC-CT)
3.1.13. Medio Cromogénico: CHROMAgar o equivalente
3.1.14. Agar tripticasa de soja (TSA)
3.1.15. Triple sugar iron (TSI)
3.1.16. Agar citrato de Simmons
3.1.17. Medio sulfhídrico, indol, movilidad (SIM)
3.1.18. Caldo Voges Proskauer - rojo de metilo.(VP-RM)
3.1.19. Caldo sorbitol al 1 % en medio base con indicador
3.1.20. Medio urea de Christensen
3.1.21. Medio para lisina decarboxilasa
3.1.22. Medio para ornitina decarboxilasa
3.1.23. Balanza, sensibilidad 0.1g
3.1.24. Homogeneizador tipo Stomacher
3.1.25. Equipo para concentración inmunomagnética (ej. Dynal MPC-S)
3.1.26. Bolsas para Stomacher
3.1.27. Estufa de incubación a 35ºC ± 1ºC
3.1.28. Micropipeta de 1000 ul
3.1.29. Micropipeta de 20 µl
3.1.30. Micropipeta de 50 µl
3.1.31. Tips
3.1.32. Ansa de inoculación
3.1.34. Tubos Eppendorf
3.1.35. Placas de vidrio para reacción de aglutinación
3.2. Principio
El método está basado en 5 etapas:

3.2.1. Enriquecimiento en medio selectivo
3.2.2. Tamizaje rápido (Screening test)
3.2.3. Concentración Inmunomagnética
3.2.4. Aislamiento en medios selectivos y diferenciales
3.2.5. Identificación y caracterización de los aislamientos.
59
3.3. Procedimiento
3.3.1. Enriquecimiento
Pesar 65 g ± 2 g de la muestra, colocar en una bolsa de Stomacher, agregar

585 ml ± 11.7 ml de caldo TSBm+n y homogeneizar durante 2 minutos en
Stomacher.
Incubar a 42 °C ± 1ºC durante 15 h a 22 h.
Incluir un control positivo, otro negativo y un medio sin inocular como controles
para cada grupo de muestras analizadas.
Nota: En el caso de carne de vaca cruda molida, y carne de vaca cruda molida
mezclada con pollo o cerdo, pasteles o empanadas rellenos con carne cocidos,
y recortes de carne, se pueden combinar 5 muestras de 65 g para obtener una
muestra compuesta (pool) de 325 g ± 32.5 g. Llevar a dilución 1:4 con 975 ml ±
19.5 ml de caldo TSBm+n y homogeneizar durante 2 minutos en Stomacher.
3.3.2. Prueba de tamizaje (test de Screening)
Del caldo de enriquecimiento realizar el test de screening siguiendo las

instrucciones del fabricante.
Las muestras que dan un resultado negativo en el test de screening se
consideran NEGATIVAS para E.coli O157:H7/NM.
Las muestras que dan un resultado positivo en el test de screening se
consideran PRESUNTIVAMENTE POSITIVAS para E.coli O157:H7/NM y se
continúa con la concentración inmunomagnética.
3.3.3. Concentración inmunomagnética: Procedimiento para Kit marca

Dynabeads anti-E.coli O157 y equipo Dynal MPC-S
NOTA: en caso de utilizar otro kit comercial seguir las especificaciones del
fabricante.
3.3.3.1. Colocar el número de tubos Eppendorf que sean necesarios en el

Dynal MPC-S (concentrador magnético de partículas), sin el plato
magnético.
3.3.3.2. Resuspender Dynabeads anti E.coli O157 hasta que desaparezca el
pellet. Tomar con la pipeta 20 µl y colocar en los tubos.
3.3.3.3. Agregar con pipeta 1 ml del preenriquecimiento. Cerrar la tapa.
3.3.3.4. Agitar en vórtex 15 segundos y luego invertir el Dyna MPC-S unas
cuantas veces (aprox. 20 veces). Incubar a temperatura ambiente por
10 minutos con suave agitación para evitar depósitos.
3.3.3.5. Insertar el plato magnético, invertir varias veces, hasta observar un
botón en la pared que contacta el imán. Dejar en reposo 3 minutos.
3.3.3.6. Abrir los tubos utilizando el abridor, aspirar el sobrenadante con
precaución de no desprender las perlas de la pared que contacta con
el imán.
3.3.3.7. Remover el plato magnético.
60
3.3.3.8. Agregar 1 ml del Buffer PBS-Tween, cerrar la tapa, invertir el Dynal
MPC-S unas cuantas veces para resuspender las perlas hasta
homogeneizar la solución.
3.3.3.9. Repetir los pasos del 3.3.3.5 al 3.3.3.8
3.3.3.11. Resuspender las partículas en 100 µl de PBS-Tween usando el vórtex
3.3.4. Siembra en medios específicos
3.3.4.1. Dispensar 50 µl de las partículas concentradas 3.3.3.11. en una placa

de CT-SMAC y sembrar en forma aislada con un ansa o espátula de
Drigalsky. Incubar las placas a 35°C ± 1°C durante 18 h a 24 h.
3.3.4.2. Dispensar 50 µl de las partículas concentradas 3.3.3.11. en una placa
de medio cromogénico para E. coli O157 y sembrar en forma aislada
con un ansa o espátula de Drigalsky. Incubar las placas a 35°C ± 1°C
durante 18 h a 24 h.
NOTA: Dependiendo del tipo de alimento y su flora microbiológica la incubación

del caldo de enriquecimiento por 20 h a 24 h puede aumentar el crecimiento de
otras bacterias en los agares selectivos, dificultando el aislamiento de E.coli
O157.
La inoculación de los medios selectivos con diluciones de las partículas
concentradas, o con la siembra de un volumen menor a 50 µl, puede aumentar
la posibilidad de obtener colonias aisladas de E.coli O157, aunque esto puede
aumentar también el límite de detección de la técnica.
3.3.5. Selección de colonias típicas de E.coli O157
Las colonias típicas de E.coli O157 en el agar SMAC-CT son incoloras o grises,
de 1 a 2 mm de diámetro. Las bacterias que fermentan el sorbitol, como la
mayoría de las E. coli, producen colonias rosas.
Las características de las colonias típicas de E. coli O157 en el agar
cromogénico dependen de la marca utilizada (seguir las instrucciones del
fabricante).
3.3.6. Prueba de aglutinación con látex anti O157
A partir de los medios específicos de aislamiento (3.3.4) realizar la prueba de

aglutinación con el reactivo látex Anti O157 picando una porción de cada una
de las colonias sospechosas aisladas.
3.3.7. Aislamiento en agar TSA
Picar todas las colonias típicas que dieron una reacción positiva para la
prueba de aglutinación con látex anti O157 (3.3.6) (hasta un total de 5 colonias
por cada muestra) y estriar en agar TSA. Incubar a 35°C ± 1°C durante 16 h a
24 h.
61
A partir de las colonias aisladas en TSA (3.3.7), realizar la confirmación

bioquímica mediante el kit de identificación bioquímica (ej. Test Api 20E
bioMérieux, GNI - VITEX o equivalente) siguiendo las instrucciones del
fabricante) o pruebas bioquímicas en tubo.
Pruebas bioquímicas:
Pruebas bioquímicas E.coli E.coli O157:H7 E.hermanii

Fermentación de glucosa + + +
Fermentación de lactosa + + +
Fermentación de sacarosa + + +
Formación de ácido - - -
sulfhídrico
Producción de gas + + +
Utilización de citrato - - -
Producción de indol + + +
Movilidad móvil/no móvil Móvil móvil
Fermentación de sorbitol + - -
Actividad β-glucuronidasa + - -
Producción de ureasa -/+ -/+ -
Actividad lisina decarboxilasa + (90%) + (100%) - (6%)
Opcionales:
Actividad ornitina + (95%) + (100%) + (100%)
decarboxilasa
Fermentación de celobiosa - (2%) - (2%) + (97%)
Utilización de malonato - - -
3.3.9. Confirmación serológica
Se pueden utilizar reactivos de látex anti-O157 y anti H7 comerciales o sueros

provistos por el Centro de Referencia Instituto Nacional de Enfermedades
Infecciosas A.N.L.I.S “Dr. Carlos G. Malbrán”.
3.3.9.1. Detección del antígeno somático O
3.3.9.1.1. Látex anti-O157: kit de ensayo comercial MicroScreen E. coli O157 o

equivalente. Seguir instrucciones dadas por el fabricante.
3.3.9.1.2. Antisuero anti-O157

- Colocar separadamente dos gotas de 20 µl de solución fisiológica (SF)
en una placa de vidrio
- Mezclar una ansada del cultivo en TSA con SF
- Observar las dos suspensiones iluminando la placa con luz de una
lámpara.
62
Nota 1: Si la muestra aglutina por sí misma no se debe continuar con el
ensayo.
Una muestra autoaglutinada corresponde a una cepa rugosa, la cual puede
revertir al estado liso realizando sucesivos pasajes en agar sangre o en agar
Mueller Hinton.
- Agregar 15 µl del suero anti-O157 a una de las dos suspensiones y

mezclar.
- Mover la placa mediante rotación suave durante un minuto.
- Observar la apariencia de las suspensiones con luz de una lámpara.
Nota 2: La suspensión sin el agregado de antisuero se utiliza como control

negativo.
Nota 3: En cada ensayo se deben realizar control de los reactivos utilizando
cepas patrones positivas y negativas.
Interpretación de resultados:
Suspensión + antisuero Aglutinación Positivo
Suspensión + SF No presenta aglutinación O157
Suspensión + antisuero No presenta aglutinación

Negativo
Suspensión + SF No presenta aglutinación
3.3.9.2. Detección del antígeno flagelar H7
- Colocar separadamente dos gotas de 20 µl de solución fisiológica (SF)

en una placa de vidrio
- Mezclar una ansada del cultivo en TSA con SF
- Observar las dos suspensiones iluminando la placa con luz de una
lámpara.
- Comentario: Si la muestra aglutina por sí misma no se debe continuar
con el ensayo.
- Agregar 15 µl del suero anti-H7 a una de las dos suspensiones y mezclar
(la suspensión sin el agregado de antisuero se utiliza como control
negativo).
- Mover la placa mediante rotación suave durante un minuto.
- Observar la apariencia de las suspensiones con luz de una lámpara.
Nota: En cada ensayo se debe realizar el control de los reactivos utilizando

cepas patrones positivas y negativas.
Interpretación de resultados:
Suspensión + antisuero Aglutinación Positivo
Suspensión + SF No presenta aglutinación H7
Suspensión + antisuero No presenta aglutinación

Negativo
Suspensión + SF No presenta aglutinación
63
3.3.10. Detección de las toxinas Stx1 y Stx2 y/o de la presencia de los
genes que codifican las mismas
Para la detección de las toxinas Stx1 y Stx2 utilizar kits disponibles en el

comercio (seguir las especificaciones indicadas por el fabricante), o determinar
los genes que codifican las mismas por PCR.
3.4. Interpretación de resultados
3.4.1. Si la cepa aislada es confirmada como E. coli O157: H7, se debe

informar como: E. coli O157:H7: presencia en 65 g.
3.4.2. Si la cepa aislada es confirmada como E. coli O157: NM, se debe
informar como: E. coli O157:NM: presencia en 65 g.
3.4.3. Si la cepa aislada NO es confirmada como E. coli O157: H7 o E. coli
O157: NM, se debe informar como: E. coli O157:H7/NM: ausencia en
65 g.

virulencia.
64
4. ANEXOS
ANEXO 1: Diagrama de Flujo del procedimiento para la detección,

aislamiento e identificación de E. coli O157: H7/NM en productos
cárnicos.
65 g de muestra + 585 ml TSBm+n

Homogeneizar en Stomacher 2 min
Incubar durante 15 a 22 h a 42ºC ± 1ºC.
E.coli O157:H7/NM
Tamizaje (test de screening) Negativo: AUSENCIA
Positivo
Concentración inmunomagnética
Siembra 50 µl de concentrado en SMAC-CT

y en agar cromogénico. Incubar las placas a 35°C ± 1°C durante 18 a 24 hs.
Reaislamiento de colonias sospechosas en TSA
Identificación bioquímica y confirmación serológica
Detección de toxinas Stx1 y Stx2 o de la presencia de los genes que codifican

para las mismas
Informe de Resultados
65
Para la preparación de reactivos y medios de cultivos se siguen las

instrucciones dadas por el fabricante.
1. Caldo triptosa soja modificado con novobiocina (TSBm+n)
1.1. Caldo triptosa soja modificado
Caldo Triptona Soja modificado (marca Oxoid CM0989B u otra marca 33.0 g
de fórmula equivalente)
Casaminoácidos (hidrolizado ácido de caseína) 10.0 g
pH final a 25°C 7.4 ± 0.2
Esterilizar en autoclave a 121°C, durante 20 minuto s.

Después de autoclavado y enfriado a aproximadamente 50ºC, agregar en
esterilidad Novobiocina para obtener una concentración final de 20 µg/ml de
medio (5 ml de la solución stock de concentración 4 mg/ml en un litro de medio)
1.2. Solución stock de novobiocina 4mg/ml
Disolver la cantidad necesaria de sodium Novobiocin en agua destilada para

llegar a una solución de concentración 4mg/ml (ajustar de acuerdo a la
potencia). Esterilizar por filtración y conservar a 4°C durante 30 días en frasco
oscuro, al resguardo de la luz.
2. Agar MacConkey sorbitol con cefixima-telurito (SMAC-CT)
Peptona 20.0 g
Sorbitol 10.0 g
Rojo neutro 0.03 g
Agar 15.0 g
pH final a 25°C 7.1 ± 0.2
Esterilizar en autoclave a 121°C, durante 15 minuto s. Enfriar entre 45°C - 50ºC

y agregar 4 ml del suplemento cefixima-telurito por 200 ml de medio
(concentración final: cefixima: 0.005mg/l, telurito potásico: 2.5 mg/l). Ver
reactivos.
66
3. Medio Cromogénico CHROMAgar O157
Peptona y extracto de levadura 13.0 g

Mezcla cromogénica 12.0 g
Agar 1.5 g
pH: 7.0 ± 0.2
Añadir al medio deshidratado el volumen correspondiente de agua destilada,

mezclar suavemente, calentar a ebullición hasta completa disolución. En caso
de utilizar microondas después de un primer hervor, sacar del horno y agitar
despacio, volver a poner en el horno por cortos períodos repetidos de
calentamiento hasta la fusión completa del agar.
4. Solución salina bufferada con 0.05% de Tween 20 (PBS-Tween 20)

Cloruro de potasio 0.2 g
Fosfato ácido disódico anhidro 1.15 g
Fosfato diácido monopotásico 0.2 g
Tween 20 0.5 ml
pH final a 25ºC 7.3 ± 0.2
Esterilizar en autoclave a 121°C, durante 15 minuto s
5. Agar tripticasa de soja (TSA)
Triptona 15.0 g
Oxítona 5.0 g
Agar 15.0 g
Esterilizar en autoclave a 121°C, durante 15 minut os.

Agua 1000 ml
67
Esterilizar a 121°C, durante15 minutos.
7. Medio para L – Ornitina decarboxilasa
L-Ornitina monoclorhidrato (C6H12N2O2.HCl) 5.0 g

Agua 1000 ml

Esterilizar a 121°C, durante15 minutos.
8. Medio para fermentación de hidratos de carbono
8.1. Medio base

Peptona de caseína 10.0 g
Cloruro de sodio ( NaCl) 5.0 g
Rojo Fenol 0.02 g
Agua 1000 ml
Disolver los componentes en agua agitando si es necesario. Ajustar el pH si es

necesario para obtener un valor de 6.8 ± 0.2 a 25°C después de la
esterilización. Fraccionar el medio en tubos y esterilizar a 121°C, durante 15
minutos.
8.2. Solución de carbohidratos al 10%

(glucosa, lactosa, sacarosa, celobiosa, D-sorbitol)
Carbohidrato 10 g
Agua 100 ml
Para cada solución disolver el respectivo carbohidrato en agua y esterilizar por

filtración.
8.3. Medio completo para fermentación de hidratos de carbono
Medio Base ( 9.1) 900 ml

Solución de carbohidrato (9.2) 100 ml
Para cada carbohidrato agregar asépticamente la respectiva solución en el

medio base. Fraccionar 10 ml del medio completo en tubos de 18 mm x 160
mm.
68
9. Medio citrato de Simmons
Citrato de sodio (Na3C6H5O7) 2.0 g

Amonio dihidrógeno fosfato (NH4H2PO4) 1.0 g
Agar 8.0 g a 18.0 g *

si es necesario para obtener un valor de 6.8 ± 0.2 a 25°C después de la
2.5 cm de profundidad.
10. Medio TSI (triple sugar iron)
Peptona 20.0 g
Lactosa 10.0 g
Sacarosa 10.0 g
Glucosa 1.0 g
Citrato de hierro (III) 0.3 g
Rojo fenol 0.024 g
Agar 8.0 g a 18.0 g *

2.5 a 5 cm de profundidad.
69
11. Medio urea agar (según Christensen)
11.1 Medio base

Peptona 1.0 g
Glucosa 1.0 g
Rojo fenol 0.012 g
Agar 9.0 g a 18.0 g *

esterilización. Esterilizar en autoclave a 121°C, d urante 15 minutos.
11.2. Solución de urea

Urea 400 g
Agua destilada hasta vol. final de 1000 ml
Disolver la urea en agua. Esterilizar por filtración.
11.3. Medio completo

Solución de urea (12.2) 50 ml
En condiciones asépticas, agregar la solución de urea al medio base

previamente fundido y enfriado a 44°C a 47°C. Fracc ionar en tubos estériles 10
ml. Dejar solidificar en inclinación para obtener agar en pico de flauta.
12. Medio SIM (sulfhídrico, indol, movilidad)
Tripteína 20.0 g
Peptona 6.1 g
Sulfato de hierro y amonio 0.2 g
Tiosulfato sódico 0.2 g
Agar 3.5 g

Esterilizar en autoclave a 121°C, durante 15 minuto s. Dejar solidificar en
posición vertical.
13. Reactivo para detección de β-Glucuronidasa

Disco impregnado con un glucurónido. Seguir indicaciones del fabricante.
70
ANEXO 3: Fotos
1. Agar Mac Conkey sorbitol con cefixima telurito (SMAC-CT)
E.coli O157:H7: colonias típicas transparentes a incoloras de 1 mm de

diámetro.
2. Agar Medio cromogénico (“Chromagar”)
E.coli O157:H7: colonias típicas de color malva
3. Equipo para concentración inmunomagnética
71
5. REFERENCIAS
5.1. USDA/FSIS. Detection, Isolation and Identification of Escherichia coli

O157:H7/NM from Meat Products. Revisión MLG 5.05, 10/01/2010.
5.2. Manual de Procedimientos para la detección de Escherichia coli productor
de toxina Shiga O157 en alimentos. WHO Global Salm. Surv. Buenos Aires,
Argentina. 15 al 24 de Mayo del 2006.
5.3. Mac Faddin. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de
importancia clínica. 3° Edición.
72
Detección de Escherichia coli
O157:H7/NM en alimentos
(Procedimiento según Bacteriological Analytical Manual – FDA: 2011)
1. OBJETIVO

aislamiento e identificación de E.coli O157:H7 en alimentos.
2. ALCANCE

identificación de E.coli O157: H7 en alimentos.
Una vez identificado y confirmado el microorganismo como E.coli O157:H7 o
E.coli O157/NM por propiedades bioquímicas y serología, determinar la
producción de toxinas Stx1 y Stx2 o la presencia de los genes que codifican
para las mismas.

virulencia.
3. DESARROLLO
3.1 Medios de cultivo, materiales, reactivos y equipos
3.1.1. Agua peptona bufferada modificada con piruvato (mBPWp) y

suplemento acriflavina – cefsulodine – vancomicina (ACV).
3.1.3. Agar cromogénico selectivo para el aislamiento de E.coli O157. Ejemplo
Rainbow agar O157 o equivalente. Para muestras con un alto contenido
de flora acompañante, agregar 10 mg / l de novobiocina más 0.8 mg / l
de telurito de potasio.
3.1.4. Agar tripticasa soja con extracto de levadura (TSAYE)
3.1.5. Buffer fosfato de Butterfield´s
3.1.6. Solución fisiológica salina (0.85 % de NaCl)
3.1.7. Reactivo de Kovacs para indol
3.1.8. ColiComplete Discs - Biocontrol (contiene sustrato fluorogénico MUG
para Glucuronidasa y X-gal para Galactopiranosidasa)
3.1.9. Reactivo látex Anti O157 y anti H7. (Remel, Lenexa, KS, o equivalente)
73
3.1.10. Sistema para separación inmonumagnética: partículas
inmunomagnéticas anti E.coli O157, separador magnético para
concentración de partículas inmunomagnéticas, apto para usar con
tubos de plástico tipo Eppendorf. (ejemplo Dynabeads o equivalente)
3.1.11. Buffer de lavado: buffer fosfato modificado, 0.01 mol/l de pH 7.2
3.1.12. Sistema de pruebas bioquímicas (API 20, VITEX GNI o equivalente)
3.1.13. Balanza de 1 g - 500 g, sensibilidad 0.1 g
3.1.14. Homogeneizador automático tipo Stomacher
3.1.15. Bolsas para Stomacher con filtro de capacidad adecuada.
3.1.17. Estufa de incubación a 42°C ± 1ºC
3.1.18. Peachímetro: capaz de medir 0.01 unidad de pH, calibrado con
exactitud de 0.1 unidad de pH a 25ºC.
3.1.19. Tubos y frascos de capacidad adecuada para esterilización y
almacenamiento de medios de cultivo e incubación de medios líquidos.
3.1.21. Ansa de platino o níquel.
3.1.22. Micropipetas: de 0.5 µl – 20 µl, 20 µl – 200 µl, 200 µl – 1000 µl
3.1.23. Tips para micropipetas de capacidad adecuada
3.1.24. Tubos para microcentrífuga de 2.0 ml de capacidad (tipo Eppendorf).
3.1.25. Mezclador rotativo capaz de rotar a 15 a 20 r/min.
3.1.26. Placas de Petri de 150 mm
3.1.27. Vórtex
3.1.29. Papel de filtro
3.2 Principio
3.2.1. Enriquecimiento de la muestra en caldo mBPWp

3.2.2. Separación y concentración por medio de partículas inmunomagnéticas
revestidas con anticuerpos anti E. coli O157. (OPCIONAL)
3.2.3. Tamizaje (screening por PCR Real-time) (OPCIONAL)
3.2.4. Siembra de diluciones del caldo mBPWp en agar SMAC-CT y agar
cromogénico
3.2.5. Confirmación de colonias sospechosas por propiedades bioquímicas y
serología
3.3. Procedimiento
Vegetales de hoja: Agregar igual cantidad de Buffer fosfato de Butterfield´s a

200 g de muestra (como mínimo) en una bolsa o recipiente estéril, agitar con la
mano por 5 minutos. Pesar 125 g del líquido de enjuague y agregar 125 ml del
caldo mBPWp doble concentración.
74
Jugos, leche y otras bebidas turbias: centrifugar asépticamente 200 ml de la
muestra a 10000 x g durante 10 minutos. Descartar el sobrenadante y
resuspender el pellet en 225 ml de mBPWp.
Agua embotellada y otras bebidas no turbias: pesar 125 ml de la muestra

en 125 ml de caldo mBPWp doble concentración. Utilizar este procedimiento
para los líquidos en los cuales no queda precipitado después de la
centrifugación.
Otros Alimentos: Pesar 25 g de la muestra en 225 ml de mBPWp y agitar o

llevar a Stomacher.
Incubar las muestras a 37°C ± 1°C durante 5 horas, luego agregar 1 ml del
suplemento ACV e incubar a 42°C ± 1°C toda la noche (18 h a 24 h).
3.3.2. Separación Inmunomagnética (SIM) OPCIONAL
Cuando se sospecha que la muestra tiene un alto número de microflora

acompañante, como en el caso de brotes o carne cruda, el uso de la SIM antes
del método de tamizaje (screening) puede mejorar la recuperación de E.coli
O157.
Realizar la SIM con el caldo de enriquecimiento después de 5 h de incubación
o después de 18 h – 24 h, dependiendo del kit comercial utilizado.
3.3.3. Procedimiento para Kit marca Dynabeads anti-E.coli O157 y equipo

Dynal MPC-S
El procedimiento de SIM debe realizarse a una temperatura ambiente de 15ºC

a 25ºC y todos los reactivos deben estar a esa temperatura antes de su uso.

magnético.
3.3.3.2. Resuspender el vial de Dynabeads anti E.coli O157 hasta que
desaparezca el pellet. Tomar con pipeta 20 µl y colocar en los tubos.
3.3.3.4. Agitar en vórtex 15 segundos y luego invertir el Dynal MPC-S unas
cuantas veces (aprox. 20 veces). Incubar a temperatura ambiente por
10 minutos con suave y continua agitación para evitar depósitos.
(Utilizar el mezclador rotativo)
3.3.3.5. Insertar el plato magnético, invertir varias veces hasta observar un
botón en la pared que contacta el imán. Dejar en reposo 3 minutos.
el imán.
75
3.3.3.11. Resuspender las partículas en 100 µl de PBS-Tween usando el
vórtex.
3.3.4. Tamizaje (screening por PCR Real-Time) OPCIONAL
En la técnica FDA-BAM se describe, como un paso opcional, la metodología

para un tamizaje por PCR Real Time que se realiza a partir del caldo de
enriquecimiento mBPWp incubado toda la noche, o del concentrado obtenido
después de realizar la SIM (punto 3.3.2).
En este procedimiento no se incluye dicha metodología.
Para mayor información referirse a FDA - Bacteriological Analytical Manual,
Capítulo 4A. Diarrheagenic Escherichia coli.
(http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/Bacteriological
AnalyticalManualBAM/default.htm)
3.3.5. Siembra en agares selectivos
Sembrar las muestras (que dan un resultado positivo para la prueba de

tamizaje, así como de las muestras que no fueron sometidas a un tamizaje) en
los medios selectivos para el aislamiento de colonias. La siembra se realiza a
partir del caldo de enriquecimiento mBPWp incubado toda la noche, o del
concentrado obtenido en la SIM (punto 3.3.2)
3.3.5.1. A partir del caldo de enriquecimiento mBPWp incubado toda la noche

(3.3.1) realizar diluciones decimales con buffer fosfato de Butterfield´s, sembrar
50 µl en los agares selectivos y esparcir con espátula de Drigalsky.
Generalmente, sembrando 50 µl de las diluciones 10-2 y 10-4 se obtiene un
recuento de 100 a 300 colonias.
Sembrar por duplicado en agar SMAC-CT y en agar cromogénico para E.coli
O157 .
NOTA: en forma opcional se pueden agregar placas sembradas por estriado

con ansa.
3.3.5.2. Incubar las placas a 37°C ± 1°C, durante 1 8 h – 24 h.
3.3.5.3. Observar las placas para seleccionar colonias sospechosas.
Las colonias típicas en el agar SMAC-CT son incoloras o grises, de 1 a 2 mm

de diámetro. Las bacterias que fermentan el sorbitol, como la mayoría de las E.
coli, producen colonias rosas.
Examinar el medio cromogénico para seleccionar las colonias típicas de
acuerdo a las instrucciones del fabricante.
76
3.3.7. Prueba de aglutinación con látex anti O157
A partir de los agares de aislamiento (3.3.5.1) realizar la prueba de aglutinación

con el reactivo látex Anti O157 picando una porción de cada una de las
colonias sospechosas aisladas.
3.3.8. Aislamiento en agar TSAYE
Picar todas las colonias típicas que dieron una reacción positiva para la prueba
de aglutinación con látex anti O157 (3.3.7) (hasta 10 colonias si hay más de 10
colonias presentes) y estriar en agar TSAYE para chequear la pureza.
3.3.9. Prueba para Glucuronidasa y Galactopiranosidasa
Colocar un disco de ColiComplete (CC) en la zona de mayor crecimiento en el

agar TSAYE. Incubar las placas a 37°C ± 1°C, de 18 h a 37 h.
El kit CC tiene un ensayo cromogénico para Glucuronidasa (MUG) y
Galactopiranosidasa (X-gal) en el mismo disco.
Preparar un TSAYE similar con una cepa de E.coli MUG positiva como control
positivo.
Una reacción positiva se evidencia por color azul sobre el disco y alrededor del
disco (indicativo de coliformes, X-gal +), y fluorescencia azul alrededor del
disco observado bajo luz UV (365 nm) (indicativo de E.coli, MUG +).
Las cepas de E.coli O157 son X- gal (+) y MUG (-).
3.3.10. Prueba de la mancha de indol
A partir de las colonias aisladas en el agar TSAYE (3.3.8.) tomar una porción
de crecimiento y depositarla sobre un papel de filtro humedecido con reactivo
de Kovac. E coli O 157 da una reacción positiva.
3.3.11. Pruebas de confirmación
Para las colonias típicas que dieron X-gal (+), MUG (-) y la prueba de indol (+)
realizar las siguientes pruebas de confirmación a partir de los aislamientos
obtenidos en agar TSAYE:
Prueba de aglutinación con látex anti O157 y anti H7.

Confirmar la presencia de los antígenos O157 y H7 con el antisuero comercial
siguiendo las instrucciones del fabricante.
- si el aislamiento da una reacción positiva para O157 y H7, es evidencia
que el aislamiento presenta el serotipo O157:H7.
- si el aislamiento da O157 (+) y H7 (-), podría tratarse de una variante no
móvil (O157: NM).
NOTA: en caso de dar serología negativa para H7, el aislamiento puede ser
cultivado en agar sangre para inducir la movilidad y realizar nuevamente la
prueba con el suero anti H7.
77
NOTA: Realizar los controles de autoaglutinación para descartar la posibilidad
de cepas autoaglutinantes.
Pruebas bioquímicas:
Realizar identificación bioquímica de las cepas que dieron O157 y H7 positivo.
Utilizar los kits de identificación bioquímica siguiendo las instrucciones del
fabricante.
3.3.12. Identificación positiva
- Los aislamientos que dan sorbitol (-), indol (+), MUG (-), serología para O157
(+) y H7 (+) y son confirmadas como E.coli por propiedades bioquímicas se
informan como: presencia de E.coli O157:H7 en la cantidad de muestra
analizada.
- Los aislamientos que dan sorbitol (-), indol (+), MUG (-), serología para O157
(+) y H7 (-) y son confirmadas como E.coli por propiedades bioquímicas, se
informan como: presencia de E.coli O157: NM en la cantidad de muestra
analizada.
3.3.13. Detección de los factores de virulencia
Para las cepas identificadas como E.coli O157:H7 y E.coli O157: NM se debe
determinar la presencia de los genes que codifican las toxinas Stx1 y Stx2 por
PCR.

virulencia.
78
4. ANEXOS
ANEXO 1: Diagrama de flujo del procedimiento para la detección,

aislamiento e identificación de E.coli O157:H7 en alimentos.
Muestra x g ó x ml + 9 x ml de mBPWp
Homogeneizar
Incubar durante 5 h a 37°C ± 1°C y agregar el suple mento ACV
Incubar toda la noche a 42°C ± 1°C
Separación inmunomagnética (OPCIONAL)
Tamizaje (screening) por PCR (OPCIONAL)
Sembrar 50 µl del caldo en SMAC-CT

y en el agar cromogénico
Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h a 24 h.
Reaislamiento de colonias sospechosas en agar TSAYE
Serología con látex y pruebas bioquímicas
Detección de los genes que codifican para las toxinas Stx1 y Stx2 y otros
factores de virulencia
79

1. Agua peptona bufferada modificada con piruvato (mBPW) y

suplemento acriflavina – cefsulodine – vancomicina (ACV)
1.1 medio base

Peptona 10.0 g
Casaminoácidos 5.0 g
Lactosa 10.0 g
NOTA: Para la preparación del caldo doble concentración utilizar 500 ml de

agua destilada en lugar de 1000 ml.
Se pueden sustituir los 4 primeros ingredientes por la fórmula comercial.
Disolver los componentes en agua destilada, calentando si es necesario.
Ajustar el pH si es necesario para obtener un valor de 7.2 ± 0.2 a 25°C,
Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos .
1.2 Suplemento acriflavina – cefsulodine – vancomicina (ACV)

Acriflavina 10.0 mg
Cefsulodina 10.0 mg
Vancomicina 8.0 mg
Caldo base (1.1) 1000 ml
Para acriflavina y cefsulodine preparar una solución stock de 1.125 g en 500 ml

de agua destilada, y para vancomicina 0.9 g en 500 ml de agua destilada.
Esterilizar por filtración y agregar 1 ml de cada solución a 225 ml del medio
base (1.1).
80
2. Agar MacConkey sorbitol con cefixima-telurito (SMAC-CT)
2.1 Medio base
Peptona 17.0 g
Proteasa peptona n°3 o polipeptona 3.0 g
Sorbitol 10.0 g
Rojo neutro 0.03 g
Agar 13.5 g
Disolver los componentes en agua destilada calentando hasta ebullición.

Ajustar el pH si es necesario para obtener un valor de 7.1 ± 0.2 a 25°C después
de la esterilización. Esterilizar en autoclave a 121°C durante15 minutos.
2.2 Solución de telurito de potasio

Telurito de potasio de uso bacteriológico 0.25 g
Disolver el telurito de potasio en agua y esterilizar por filtración

Esta solución se puede guardar a temperatura ambiente hasta 1 mes, sin
embargo se debe descartar si se observa formación de precipitado blanco.
2.3 Solución de cefixima

Cefixima 5.0 g
Disolver la cefixima en agua y esterilizar por filtración.

Nota: puede ser necesario disolver la cefixima en etanol.
Esta solución se puede guardar a 3ºC ± 2ºC durante una semana.
2.4 Medio completo

Solución de telurito de potasio (3.2) 1.0 ml
Solución de cefixima (3.3) 1.0 ml
Enfriar el medio base entre 44ºC a 47ºC. Agregar 1 ml de la solución de telurito

de potasio y 1 ml de la solución de cefixima a 1000 ml del medio base. Mezclar,
y verter 15 ml en una placa de Petri, dejar solidificar.
La concentración final de telurito de potasio es de 2.5 mg/l y la de cefixima es
de 0.05 mg/l
Si se preparan con anticipación, las placas sin secar se pueden guardar en la
oscuridad en bolsa de plástico u otro contenedor que conserve la humedad en
refrigeración a 3ºC ± 2ºC, durante 2 semanas.
81
3. Agar cromogénico selectivo para el aislamiento de E. coli O157:
(Ej. Rainbow agar O157 o equivalente)
Seguir especificaciones del fabricante
4. Agar tripticasa soja con extracto de levadura (TSAYE) al 0.6 %
4.1 Agar tripticasa soja (TSA)

Tripticasa peptona 15.0 g
Fitopeptona 5.0 g
NaCl 5.0 g
agar 15.0 g
4.2 Agar tripticasa soja con extracto de levadura (TSAYE) al 0.6 %

Agar Tripticasa soja (TSA) 40.0 g
Agua 1000 ml

Ajustar el pH, si es necesario, para obtener un valor de 7.3 ± 0.2 a 25°C,
después de la esterilización. Esterilizar a 121°C d urante 15 minutos.
Enfriar el medio entre 44ºC a 47ºC y verter 15 ml en una placa de Petri, dejar
solidificar.
5. Buffer fosfato de Butterfield´s

Disolver los componentes en agua destilada, ajustar el pH a 7.2 ± 0.2 con

NaOH 1N. Llevar a volumen final de 1000 ml con agua destilada. Esterilizar a
121°C durante 15 minutos. Conservar en heladera
6. Reactivo de Kovacs para la reacción de indol

HCl ( concentrado) 50 ml
Disolver el aldehído en el alcohol. Agregar lentamente el ácido a la muestra

aldehído-alcohol.
Proteger de la luz en un frasco de vidrio de color marrón y guardar en
refrigeración a 3°C ± 2°C. El reactivo debe mantene r un color de amarillo a
marrón claro, libre de precipitado.
82
7. Partículas inmunomagnéticas anti E.coli O157
Son partículas recubiertas con anticuerpos específicos anti E. coli O157 para
concentración y separación de este microorganismo.
En el comercio hay disponibles diferentes kits. Seguir las instrucciones dadas
por el fabricante en cada caso.
8. Buffer de lavado: buffer fosfato modificado, 0.01 mol/l, pH 7.2
Cloruro de sódio 8.0 g

Tween 20 0.2 ml
Disolver los componentes en agua destilada, ajustar si es necesario el pH a 7.2

± 0.2 a 25°C. Fraccionar en frasco de volumen aprop iado y esterilizar a 121°C
durante 15 minutos.

Disolver el NaCl en agua destilada llevando a ebullición. Ajustar el pH si es

necesario, para obtener un valor de 7.0 ± 0.2 a 25°C, después de la
83
ANEXO 3: Fotos

diámetro.
84
4. Resultados de discos ColiComplete (CC) para
E. coli O157:H7 y E. coli
E. coli O157:H7 y E. coli son galactopiranosidasa

(X-gal) positivas y producen coloración azul que
rodea al disco CC.
E. coli es glucuronidasa (MUG) positiva y

muestra fluorescencia alrededor del disco CC a
365 nm.
E. coli O157:H7 es glucuronidasa (MUG)

negativa y no muestra fluorescencia alrededor
del disco CC.
85
5. REFERENCIAS
FDA – Bacteriolocical Analytical Manual. Chapter 4a. Diarrheagenic Escherichia

coli. February 2011.
86
Detección de Escherichia coli
O157:H7/NM en alimentos
(Procedimiento según International Standard ISO 16654:2001)
1. OBJETIVO

aislamiento e identificación de E.coli O157 en alimentos.
2. ALCANCE

identificación de E.coli O157 en alimentos.
Una vez identificado y confirmado el microorganismo como E.coli O157 por
propiedades bioquímicas y serología, determinar la producción de toxinas Stx1
y Stx2 o la presencia de los genes que codifican para las mismas.

virulencia.
3. DESARROLLO
3.1 Medios de cultivo, materiales, reactivos y equipos

3.1.1. Caldo triptona soja modificado con novobiocina (TSBm+n)
3.1.3. Segundo medio de aislamiento selectivo: a elección del laboratorio,
complementario al SMAC-CT y adecuado para el aislamiento de E.coli
O157
3.1.5. Medio de triptona / triptofano
3.1.6. Reactivo de Kovacs para indol
3.1.7. Partículas inmunomagnéticas anti E.coli O157
3.1.8. Buffer de lavado: buffer fosfato modificado, 0.01 mol/l de pH 7.2
3.1.9. Solución salina
3.1.10. Antisuero E. coli O157 disponible en el comercio como separado
somático “O” 157
3.1.11. Suero anti H7 (si está disponible en el comercio)
3.1.12. Kit para la detección de toxinas Shiga disponibles en el comercio
(seguir las indicaciones establecidas por el fabricante)
87
3.1.13. Balanza, sensibilidad 0.1 g
3.1.14. Homogeneizador automático tipo Stomacher
3.1.15. Bolsas para Stomacher con filtro
3.1.17. Autoclave
entre 25ºC y 50ºC
3.1.20. Estufa de incubación a 41.5°C ± 1ºC
3.1.21. Baño de agua: capaz de mantener la temperatura entre 44ºC y 47ºC.
3.1.22. Peachímetro: capaz de medir 0.01 unidad de pH, calibrado con
exactitud de ± 0.1 unidad de pH a 25ºC.
3.1.23. Tubos y frascos de capacidad adecuada para esterilización y
almacenamiento de medios de cultivo e incubación de medios líquidos.
3.1.25. Ansa y ansa aguja de platino o níquel.
3.1.26. Pipetas automáticas de 20 µl a 200 µl, con divisiones de 10 µl o similar.
3.1.27. Separador magnético para concentración de partículas
inmunomagnéticas, apto para usar con tubos de plásticos tipo
Eppendorf.
3.1.28. Tubos de plástico tipo Eppendorf, estériles, descartables de 1.5 ml de
capacidad.
3.1.29. Mezclador rotativo capaz de rotar a 15 a 20 r/min.
3.1.30. Placas de Petri de 90 mm y 140 mm
3.1.31. Vórtex
3.2 Principio
El método está basado en 4 etapas:

3.2.1. Enriquecimiento de la porción de la muestra en caldo triptona soja
modificado con novobiocina (TSBm+n) con incubación a 41.5ºC ± 1ºC durante
6 h y posteriormente 12 h a 18 h más.
3.2.2. Separación y concentración del microorganismos por medio de partículas
inmunomagnéticas revestidas con anticuerpos anti E. coli O157.
3.2.3. Aislamiento por subcultivo de las partículas inmunomagnéticas con la
bacteria adherida en agar MacConkey Sorbitol con cefixima telurito (SMAC-CT)
y en el segundo agar selectivo de aislamiento a elección del laboratorio.
3.2.4. Confirmación de las colonias sorbitol negativas del SMAC-CT y de las
colonias típicas del segundo agar de aislamiento por producción de indol y por
aglutinación con el antisuero E.coli O157.
88
3.3. Procedimiento
Pesar x g o x ml de la muestra, colocar en una bolsa de Stomacher, agregar 9 x

ml (para obtener una dilución 1/10) de caldo TSBm+n precalentado en estufa a
41.5ºC ±1 ºC, y homogeneizar durante 2 minutos en Stomacher. Incubar a
41.5ºC ± 1ºC durante 6 h y posteriormente 12 a 18 h más (tiempo total de
incubación de 18h a 24 h.)
NOTA: una incubación de 6 h seguida de separación inmunomagnética y

siembra en los agares selectivos, puede dar un resultado positivo presuntivo,
que puede resultar negativo a las 18 h de incubación.
3.3.2. Separación Inmunomagnética (SIM)
La SIM debe ser realizada después de las 6 h de incubación, y luego si el

resultado es negativo, después de las 12 h a 18 h de incubación.
Seguir las instrucciones del fabricante para el kit de SIM y aparato utilizado.
3.3.3. Procedimiento para Kit marca Dynabeads anti-E.coli O157 y equipo

Dynal MPC-S
El procedimiento de SIM debe realizarse a una temperatura ambiente de 15ºC

a 25ºC y todos los reactivos deben estar a esa temperatura antes de su uso.

magnético.
3.3.3.2. Resuspender el vial de Dynabeads anti E.coli O157 hasta que
desaparezca el pellet. Tomar con pipeta 20 µl y colocar en los tubos.
3.3.3.4. Agitar en vórtex 15 segundos y luego invertir el Dynal MPC-S unas
cuantas veces (aproximadamente 20 veces). Incubar a temperatura
ambiente por 10 minutos con suave y continua agitación para evitar
depósitos (utilizar el mezclador rotativo).
3.3.3.5. Insertar el plato magnético, invertir varias veces hasta observar un
botón
en la pared que contacta el imán. Dejar en reposo 3 minutos.
el imán.
3.3.3.11. Resuspender las partículas en 100 µl de PBS-Tween usando el
vórtex.
89
3.3.4. Siembra en agares selectivos
Dispensar con pipeta automática 50 µl de las partículas concentradas 3.3.3.11.

en una placa de CT-SMAC y 50 µl de las partículas concentradas en una placa
del segundo medio de aislamiento. Estriar con un ansa para obtener colonias
bien aisladas. Incubar las placas de CT-SMAC a 37ºC durante 18 h a 24 h y
las placas del segundo medio de aislamiento de acuerdo a las instrucciones del
fabricante.
NOTA: Dependiendo del tipo de alimento y su flora microbiológica la incubación

del caldo de enriquecimiento por 20 h a 24 h puede aumentar el crecimento de
otras bacterias en los agares selectivos dificultando el aislamiento de E.coli
O157.
La inoculación de los medios selectivos con diluciones de las partículas
concentradas o con la siembra de un volumen menor a 50 µl puede aumentar
la posibilidad de obtener colonias aisladas de E.coli O157, aunque esto puede
aumentar también el límite de detección de la técnica.
Las colonias típicas en el agar SMAC-CT son transparentes a incoloras de 1

mm de diámetro. Examinar el segundo medio de aislamiento para seleccionar
las colonias típicas de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
3.3.6. Confirmación
Seleccionar 5 colonias típicas (si hay menos de 5 colonias, seleccionar todas)

en cada placa, y estriar cada una en una placa de agar nutritivo para obtener
colonias aisladas. Incubar de 18 h a 24 h a 37ºC.
Inocular una colonia aislada de cada agar nutritivo en un tubo con caldo
triptona /triptofano e incubar a 37ºC por 24 h. Agregar 1 ml de reactivo de
Kovacs y dejar a temperatura ambiente 10 minutos.
Reacción positiva: formación de color rojo
Reacción negativa: color amarillo/marrón.
3.3.8. Confirmación serológica
Realizar la confirmación serológica sólo de las colonias indol positivas.
3.3.8.1. Eliminación de cepas autoaglutinantes
- Colocar una gota de solución salina en una placa de vidrio

- Con un ansa colocar una colonia aislada obtenida en el agar nutritivo y
homogeneizar hasta obtener una suspensión homogénea.
- Rotar la placa suavemente entre 30 a 60 segundos.
- Observar el resultado contra un fondo negro y si es necesario, con una
lupa.
90
Si se produce aglutinación, la cepa es considerada autoaglutinante y no es
posible realizar la reacción con el antisuero específico.
3.3.8.2. Reacción con el antisuero E. coli O157
- Colocar una gota de solución salina en una placa de vidrio

- Con un ansa colocar una colonia aislada obtenida en el agar nutritivo y
agregar un pequeña gota del antisuero E. coli O157
- Rotar la placa suavemente entre 30 a 60 segundos.
- Observar el resultado contra un fondo negro y si es necesario, con una
lupa.
- Si se produce aglutinación dentro del minuto se considera una reacción
positiva
3.3.9. Identificación positiva
Se considera aislamiento positivo el que da la reacción del indol positiva y la

reacción con el antisuero E. coli O157 o con el antisuero O157 y H7 (si está
disponible) positiva
3.3.10. Detección de las toxinas Stx1 y Stx2 y/o de la presencia de los

genes que codifican las mismas
Para la detección de las toxinas Stx1 y Stx2 utilizar kits disponibles en el

comercio (seguir las especificaciones indicadas por el fabricante), o determinar
los genes que codifican para las mismas por PCR.
3.3.11. Mayor caracterización
Las cepas aisladas deben ser enviadas al Centro de Referencia Instituto

una mayor caracterización y determinación de los factores de virulencia.
3.3.12. Control de Calidad
3.3.12.1. Cepa Control
Cepas de E. coli O 157 sin factores de virulencia que atribuyen su

patogenicidad están disponibles en Colecciones de Cultivos nacionales o
internacionales. Se recomienda la utilización de este tipo de cepas para el
control de calidad de los medios de cultivos y antisueros.
91
3.3.12.2. Método de cultivo
Para chequear la capacidad del laboratorio y de los medios de cultivos para

detectar un bajo número de E.coli O157 en la muestra de alimento analizada,
analizar en forma paralela una muestra contaminada con un bajo inóculo de E.
coli O157 no patogénica y un alto inóculo de otra cepa de E. coli.
De acuerdo a la interpretación de los resultados, informar como ausencia o

presencia de E. coli O157 en la porción de muestra analizada, expresada en
gramos o mililitros.
92
4. ANEXOS
ANEXO 1: Diagrama de Flujo del procedimiento para la detección,

aislamiento e identificación de E.coli O157 en alimentos
Muestra x g ó x ml + 9 x ml TSBm+n precalentado a 41.5°C

Homogeneizar en Stomacher 2 min
Incubar durante 6 h y luego 12 h a 18 h más, a 41.5°C
Concentración inmunomagnética
Sembrar 50 µl del concentrado en SMAC-CT

y 50 µl en el segundo agar selectivo.
Incubar las placas a 37°C ± 1°C durante 18 h a 24 h .
Reaislamiento en AN de 5 colonias típicas de cada medio
Identificación bioquímica, confirmación serológica
Detección de toxinas Stx1 y Stx2 o de la presencia de los genes que codifican

para las mismas
93

1. Caldo Triptosa Soja modificado con novobiocina (TSBm+n)
Digestivo enzimático de caseina 17.0 g

D(+) glucosa 2.5 g
Sales biliares Nº3 1.5 g
pH final a 25°C 7.4 ± 0.2

Ajustar el pH, si es necesario, para obtener un valor de 7.4 ± 0.2 a 25°C
Fraccionar en frascos en cantidades adecuadas.
Después de autoclavado y enfriado a aproximadamente 50ºC, agregar en
condiciones de esterilidad la novobiocina, para obtener una concentración final
de 20 mg/l de medio (5 ml de la solución stock, de concentración 4 mg/ml en un
litro de medio).
1.1 . Solución Stock de Novobiocina (4 mg/ml)
Disolver la cantidad necesaria de novobiocina sódica en agua destilada para

llegar a una solución de concentración de 4 mg/ml (ajustar de acuerdo a la
potencia). Esterilizar por filtración, y conservar a 4°C durante 30 días en frasco
oscuro, al resguardo de la luz.
94
2. Agar MacConkey Sorbitol con Cefixima-Telurito
2.1 Medio base

Digestivo enzimático de tejido animal 3.0 g
Sorbitol 10.0 g
Rojo neutro 0.03 g
Agar de 9 a 18* g
pH final a 25°C 7.1 ± 0.2
*Dependiendo de la fuerza gelificante del agar
Disolver los componentes en agua destilada calentando hasta ebullición.

2.2 Solución de telurito de potasio

Telurito de potasio de uso bacteriológico 0.25 g
Disolver el telurito de potasio en agua y esterilizar por filtración

Esta solución se puede guardar a temperatura ambiente hasta 1 mes, sin
embargo se debe descartar si hay formación de precipitado blanco.
2.3 Solución de cefixima

Cefixima 5.0 g
Disolver la cefixima en agua y esterilizar por filtración

Nota: puede ser necesario disolver la cefixima en etanol
Esta solución se puede guardar a 3ºC ± 2ºC durante una semana.
2.4 Medio completo

Solución de telurito de potasio (2.2) 1.0 ml
Solución de cefixima (2.3) 1.0 ml
Enfriar el medio base entre 44ºC a 47ºC. Agregar 1 ml de la solución de telurito

potasio y 1 ml de la solución de cefixima a 1000 ml del medio base. Mezclar y
verter 15 ml en una placa de Petri. Dejar solidificar.
La concentración final de telurito de potasio es de 2.5 mg/l y la de cefixima es
de 0.05 mg/l.
95
Inmediatamente antes del uso, secar las placas preferiblemente sin tapa, y con
la superficie del agar hacia abajo, en estufa entre 25ºC y 50ºC hasta que
desaparezcan las gotas de agua de la superficie del medio. No secar por más
tiempo. Las placas también se pueden secar en cabina de flujo laminar por 30
minutos con la mitad de la tapa abierta, o durante toda la noche a temperatura
ambiente, con la tapa cerrada.
Si se preparan con anticipación, las placas sin secar se pueden guardar en la
oscuridad, en bolsa de plástico u otro contenedor que conserve la humedad, en
refrigeración a 3ºC ± 2ºC durante 2 semanas.
3. Segundo medio selectivo de aislamiento para E. coli O157
Utilizar otro agar selectivo de aislamiento a elección del laboratorio que sea
complementario al SMAC-CT, y especialmente apropiado para el aislamiento
de E. coli O157. (ej. un agar cromogénico específico para E.coli O157).
Inmediatamente antes del uso secar las placas preferiblemente sin tapa, y con
la superficie del agar hacia abajo, en estufa entre 25ºC a 50ºC, hasta que
minutos, con la mitad de la tapa abierta, o durante toda la noche a temperatura
ambiente con la tapa cerrada.
Si se prepara con anticipación, las placas sin secar se pueden guardar en la
oscuridad en bolsa de plástico u otro contenedor que conserve la humedad, en
4. Agar nutritivo

Peptona 5.0 g
Agar 9 g a 18 g*
Agua 1000 ml

el pH, si es necesario, para obtener un valor de 7.0 ± 0.2 a 25°C después de la
esterilización. Esterilizar a 121°C durante 15 minu tos.
Enfriar el medio entre 44ºC a 47ºC y verter 15 ml en una placa de Petri. Dejar
solidificar.
Inmediatamente antes del uso secar las placas preferiblemente sin tapa, y con
la superficie del agar hacia abajo en estufa entre 25ºC a 50ºC hasta que
minutos con la mitad de la tapa abierta, o durante toda la noche a temperatura
ambiente con la tapa cerrada.
Si se preparan con anticipación, las placas sin secar, se pueden guardar en la
oscuridad en bolsa de plástico u otro contenedor, que conserve la humedad en
96
5. Solución de Triptona / Triptofano
Triptona 10.0 g
DL triptofano 1.0 g
Disolver los componentes en agua destilada llevando a ebullición, si es

necesario. Ajustar el pH, si es necesario, para obtener un valor de 7.5 ± 0.2 a
25°C después de la esterilización.
Fraccionar 5 ml en tubos y esterilizar a 121°C dura nte 15 minutos.
6. Reactivo de Kovacs para la reacción de indol

HCl ( concentrado) 50 ml
Disolver el aldehído en el alcohol. Agregar lentamente el ácido a la muestra

aldehído-alcohol.
Proteger de la luz en un frasco de vidrio de color marrón, y guardar en
refrigeración a 3°C ± 2°C. El reactivo debe mantene r un color de amarillo a
marrón claro, libre de precipitado.
7. Partículas inmunomagnéticas anti E.coli O157
Son partículas recubiertas con anticuerpos específicos anti E. coli O157 para
concentración y separación de éste microorganismo.
En el comercio hay disponibles diferentes kits. Seguir las instrucciones dadas
por el fabricante en cada caso.
8. Buffer de lavado: buffer fosfato modificado, 0.01 mol/l, pH 7.2
Cloruro de sódio 8.0 g

Tween 20 0.2 ml
Disolver los componentes en agua destilada, ajustar si es necesario el pH a 7.2

± 0.2 a 25°C. Fraccionar en frasco de volumen aprop iado, y esterilizar a 121°C
durante 15 minutos.
97

Disolver el NaCl en agua destilada llevando a ebullición. Ajustar el pH, si es

necesario, para obtener un valor de 7.0 ± 0.2 a 25°C después de la
10. Antisuero específico para E. coli O157
Disponible en laboratorios específicos o en el comercio como antígeno

somático “O” 157. El antisuero debe ser chequeado con controles.
98
ANEXO 3: Fotos

diámetro.
99
4. REFERENCIAS
International Standard. ISO 16654. Microbiology of food and animal feeding

stuffs - Horizontal method for the detection of Escherichia coli O157. First
edition. 2001.05.01.
100
Listeria monocytogenes en alimentos
1. Generalidades
Listeria monocytogenes es una bacteria Gram positiva y catalasa positiva,

anaerobia facultativa, no esporógena, con forma de bacilos cortos, a veces
cocoides. Su tamaño consiste entre 0,5 a 2 micras de largo por 0,5 micras de
ancho. Este microorganismo presenta como particularidad una motilidad tipo
“tumbling” a los 20 - 25ºC pero es inmóvil a los 35ºC. Cuando se observan las
colonias a la luz oblicua (iluminación de Henry) poseen apariencia azulada-gris
a verde. Es un microorganismo psicótrofo y su rango de crecimiento oscila
entre 0ºC a 45ºC siendo las condiciones óptimas entre 30ºC y 37ºC. Puede
crecer a niveles de pH entre 4,4 y 9,4 y con una actividad de agua (aw) ≥ 0,90.
Tolera concentraciones de NaCl de hasta 20%. Se conocen 6 especies del
género Listeria de las cuales L. innocua y L. grayi se consideran no patógenas,
mientras L. seeligeri, L. ivanovii y L. welshimeri raramente causan infección en
humanos. De esta manera L. monocytogenes permanece como la especie más
importante, destacándose además su capacidad de producir β-hemólisis en
agar sangre.
Listeria monocytogenes es una bacteria oportunista. Puede multiplicarse fuera

del huesped aún con bajas exigencias en cuanto a nutrientes. Comparada con
otras bacterias patógenas que no producen esporas y que son transmitidas por
los alimentos, Listeria monocytogenes presenta la particularidad de resistir
distintas condiciones de estrés como congelación, secado, acidez y frío,
pudiéndose adaptar a éstas mediante la produción de biofilms. [1] [5]
Se denomina listeriosis a la enfermedad producida por este microorganismo, y

ocurre usualmente vía intestinal. La enfermedad puede manifestarse de
manera no invasiva, también conocida como gastroenteritis febril leve, con
aparición de los siguientes síntomas: diarrea, náuseas, fiebre, dolor de cabeza,
fatiga y mialgia dentro de las 9 a 32 hs.
También puede ocurrir como enfermedad invasiva en adultos y embarazadas
produciendo meningitis, septicemia y abortos, como algunas de las
características más importantes. En la forma invasiva los síntomas aparecen
entre las 2 y 6 semanas y se asocia con la población inmunocomprometida,
recién nacidos, fetos, mujeres embarazadas, ancianos y enfermos terminales.
Existen 13 serovariedades, pero solamente 3 de ellas (4b, ½a y ½b) están
relacionadas con la listeriosis humana. De todos modos, Listeria
monocytogenes se detecta en las heces de aproximadamente un 5% de la
población sana. [1] [5]
101
3. Epidemiología
Los datos epidemiológicos disponibles muestran que se dan tanto casos

esporádicos como brotes de listeriosis invasiva, siendo los esporádicos la
causa de la mayoría de los casos.
La listeriosis invasiva es una enfermedad relativamente poco común pero
habitualmente grave, con una frecuencia típica de 3 a 8 casos por cada
1.000.000 de personas, y tasas de mortalidad del 20% al 30% de los pacientes
hospitalizados. Durante los últimos años, la frecuencia de la listeriosis se ha
mantenido constante en la mayoría de los países; varios países han informado
una reducción en la frecuencia de los casos.
La incidencia anual de casos por listeriosis es muy baja. Por ejemplo en Europa
los casos varían entre 0,3 y 7,5 por millón de personas (6,2 casos por millón de
habitantes en Alemania en 2005), y 3 casos por millón en Australia. Según
datos del CDC en el año 2008 la incidencia fue de 0.29 casos por 100.000
habitantes en Estados Unidos de América. La listeriosis presenta un cuadro
severo, lo que hace que las personas afectadas busquen atención médica. De
esta manera, y como en Estados Unidos, la listeriosis es una enfermedad de
notificación obligatoria. El Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
estima que se identifican aproximadamente la mitad de todos los casos de
listeriosis de ese país. [3] [4] [6]
4. Reservorio y fuentes de infección
Listeria monocytogenes se encuentra ampliamente distribuída en el medio

ambiente y ha sido aislada de varios tipos de fuentes como por ejemplo suelos,
vegetación, ensilados, materia fecal animal y humana, agua, desperdicios,
aguas cloacales. También los alimentos relacionados con la listeriosis han sido,
en su gran mayoría, productos listos para el consumo que generalmente se
conservan durante largos períodos a temperaturas de refrigeración. Algunos
ejemplos de alimentos capaces de provocar una enfermedad transmitida por
alimentos (ETA) causada por Listeria monocytogenes son: quesos, helados,
vegetales crudos, alimentos cárnicos y de origen marino, tanto crudos como
cocidos y, como ya se mencionó, alimentos listos para el consumo. Es común
la presencia de éste microorganismo en plantas de elaboración de alimentos,
en donde puede permanecer en ambientes y superficies húmedas. Como se
trata de un microorganismo capaz de desarrollarse a bajas temperaturas puede
persistir por largos períodos de tiempo en alimentos, utensilios y equipos, como
por ejemplo heladeras y cámaras de frío. También es capaz de sobrevivir en
condiciones de congelamiento a -18°C durante varias semanas, en distintas
matrices alimentarias. [1] [5]
102
4. Prevención
Las recomendaciones para la prevención de alimentos contaminados por

Listeria monocytogenes están vinculadas a la naturaleza de la bacteria, su
medio y su resistencia a varias condiciones medioambientales. Por lo tanto
deberá prestarse especial atención a la cocción de los alimentos crudos de
origen animal, el lavado cuidadoso de las hortalizas y hierbas aromáticas
crudas, la remoción de la capa dura de los quesos y a los productos listos para
el consumo los cuales no han sido sometidos a un tratamiento listericida como
ser un tratamiento térmico.
Asimismo, deberán cocinarse bien las carnes molidas y adoptar medidas que
permitan la reducción del riesgo de la contaminación cruzada, tales como el
almacenamiento de los alimentos crudos (carne, hortalizas, etc.) separados de
los alimentos cocidos o listos para el consumo, y el lavado de las manos y
utensilios de la cocina después de manipular los alimentos crudos.
Finalmente, otras recomendaciones más generales son: lavar y desinfectar la
heladera con regularidad usando agua con cloro, controlar el funcionamiento de
la misma a 4°C, observar la fecha de vencimiento de los alimentos y evitar las
“ventas especiales” ofrecidas cerca del final del tiempo de conservación. [1] [6]
103
Referencias:
1. Microorganisms in Food, Microbiological Specifications of Food

Pathogens. Chapter 8, Listeria monocytogenes, p. 141, ICMSF, 1996.
2. Evaluación de riesgos de Listeria monocytogenes en alimentos listos

para el consumo: Resumen Interpretativo. Serie de Evaluación de
Riesgos Microbiológicos Nº 4 - FAO/OMS (2004).
3. Summary of Notifiable Diseases in the United States, 2008, Morbidity

and Mortality Weekly Report. Centers for Disease Control and
Prevention.
http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5754a1.htm?s_cid=mm
5754a1_w
4. Koch J, Stark K. Significant Increase of Listeriosis in Germany -

Epidemiological patterns 2001-2005. p. 631, Euro Surveill, 2006; 11(6).
5. E.T. Ryser, C.W. Donnelly. Compendium of Methods for the

Microbiological Examinations of Foods, Chapter 36, Listeria, p. 343-353,
1996.
6. Directrices sobre la Aplicación de Principios Generales de Higiene de los

Alimentos para el Control de Listeria monocytogenes en los Alimentos.
CAC/GL 61 – 2007.
104
Detección de Listeria monocytogenes
en productos cárnicos
(Procedimiento según USDA/FSIS: 2009)
1. OBJETIVO
El presente procedimiento tiene como objeto describir la metodología llevada a

cabo por el Laboratorio de Microbiología para realizar la detección, aislamiento
e identificación de Listeria monocytogenes en productos cárnicos.
2. ALCANCE

identificación de Listeria monocytogenes en productos cárnicos.
NOTA: Una vez identificado el microorganismo como Listeria monocytogenes

por propiedades bioquímicas la cepa debe ser enviada al Centro de Referencia
Malbrán”, para una mayor caracterización.
3. DESARROLLO
3.1.1. Caldo University of Vermont modificado (UVM)

3.1.2. Caldo Fraser (FB)
3.1.3. Agar Oxford modificado (MOX)
3.1.4. Agar sangre de caballo con una sobrecapa de agar (HL o HBO)
3.1.5. Agar tripticasa soja con 5% de sangre de oveja (TS-SBA)
3.1.6. Agar tripticasa soja - extracto de levadura (TSA-YE)
3.1.7. Caldo cerebro, corazón infusión (BHI)
3.1.8. Kit de pruebas bioquímicas capaz de identificar Listeria monocytogenes
(ej. Galería API Listeria, bioMerieux, MICRO-ID, VITEK 2 Compact o
equivalente)
3.1.9. Test de identificación genética: Kits de hibridación de DNA para Listeria
monocytogenes (Gene Trak, GenProbe o equivalente)
3.1.11. Autoclave
3.1.12. Balanza electrónica capaz de pesar 25 g ± 0.1 g
3.1.15. Estufa de incubación a 20°C ó 25ºC ± 2°C
3.1.16. Vórtex
3.1.17. Stomacher
105
3.1.18. Bolsas para stomacher con o sin filtro de capacidad adecuada.
3.1.19. Ansa de platino o níquel de aproximadamente 3 mm de diámetro ó 10
µl.
3.1.20. Aguja de inoculación
3.1.21. Peachímetro calibrado con exactitud de 0.1 unidad de pH de 20°C a
25ºC.
3.1.22. Pipetas graduadas o automáticas de 1 ml y de 100 µl de capacidad
nominal
3.1.23. Tubos o frascos de capacidad apropiada
3.1.24. Placas de Petri de vidrio o plástico.
3.2. Cultivos
3.2.1. Cepa de Listeria monocytogenes como control positivo: pueden ser

ATCC 19111, NCTC 7973 u otro cultivo de Listeria monocytogenes validado
3.2.2. Cepa de Listeria innocua como control negativo: puede ser ATCC 33090
u otro cultivo de Listeria innocua validado
3.2.3. Otras cepas de Listeria spp. como L. seeligeri, L. grayi y L. ivanovii se
pueden requerir como controles para pruebas confirmatorias adicionales.
3.2.4. Cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923 ó ATCC 4944 y
Rhodococcus equi ATCC 6939 para realizar el test de CAMP tradicional.
3.3. Procedimiento
3.3.1. Preparación de la muestra
Los envases intactos de las muestras deben ser desinfectados en el sitio de la

incisión inmediatamente antes de realizar la misma para la toma de muestra.
Para la desinfección se puede utilizar: peróxido de hidrógeno al 3 %, etanol al
70 %, o isopropanol al 70 %. Si el envase no parece estar limpio lavar antes de
la desinfección con agua y jabón y luego enjuagar.
3.3.2. Primer enriquecimiento en caldo UVM
Pesar 25 g de la muestra en una bolsa de stomacher, agregar 225 ml de caldo

UVM y homogeneizar durante 2 minutos ± 0.2 minutos en Stomacher.
Incubar durante 22 h ± 2 h a 30ºC ± 2ºC.
Incluir un control positivo (ver 3.3.10) y un medio sin inocular como controles,
por cada grupo de muestras analizadas.
3.3.3. Segundo enriquecimiento en caldo Fraser y siembra en placa

directamente del caldo UVM
3.3.3.1. Transferir 0.1 ml ± 0.02 ml del caldo UVM obtenido en 3.3.2. a 10 ml ±

0.5 ml de caldo Fraser (FB) e incubar a 35 Cº ± 2ºC durante 26 h ± 2 h.
3.3.3.2. Sembrar una ansada o una gota de aproximadamente 0.1 ml del caldo
UVM obtenido en 3.3.2. sobre la superficie del agar MOX. Alternativamente con
un hisopo estéril estriar el 25% - 50% de la superficie del agar MOX y con un
106
ansa estriar desde la zona hisopada el resto del agar para obtener colonias
aisladas. Incubar a 35 Cº ± 2ºC durante 26 h ± 2 h.
3.3.4. Observación de las placas de agar MOX sembradas directamente

con caldo UVM y siembra del caldo Fraser en placas de agar MOX
3.3.4.1. Examinar las placas del punto 3.3.3.2. después de la incubación para
la determinación de la presencia de colonias típicas de Listeria spp. Las
colonias típicas son pequeñas (aproximadamente 1mm) y rodeadas por un halo
de oscurecimiento debido a la hidrólisis de la esculina.
3.3.4.2. Seleccionar las colonias sospechosas y sembrarlas en agar HL, como
se describe en el punto 3.3.6.1.
3.3.4.3. Si no se evidencian colonias sospechosas, reincubar las placas de
agar MOX por 26 h± 2 h más.
3.3.4.4 Examinar después de la incubación los tubos con caldo Fraser para la
visualización de un oscurecimiento del caldo debido a la hidrólisis de la
esculina.
3.3.4.5. Si se evidencia oscurecimiento, sembrar asépticamente 0.1 ± 0.02 ml
de caldo Fraser en agar MOX. Estriar o hisopar el 25% - 40% de la superficie
del agar y luego con un ansa estriar desde la zona hisopada el resto del agar
para obtener colonias aisladas. Incubar a 35 Cº ± 2ºC durante 26 h ± 2 h.
3.3.4.6. Si no se evidencia oscurecimiento, reincubar los tubos con caldo
Fraser a 35º C ± 2ºC durante 26 h ± 2 h más.
3.3.5. Observación de las placas de agar MOX y siembra del caldo Fraser
de 48 h en placas de agar MOX
3.3.5.1. Examinar y seleccionar colonias sospechosas de cualquiera de las

placas de agar MOX del análisis (ejemplo las placas de MOX estriadas desde
el Caldo Fraser de 26h ± 2h y/o UMV)
3.3.5.2. Re-examinar el caldo Fraser para evidenciar la presencia de
oscurecimiento después de 48 h ± 2 h de incubación.
3.3.5.3. Si se evidencia oscurecimiento, hisopar, estriar e incubar en placas de
agar MOX.
3.3.5.4. Si no se evidencia oscurecimiento y no se observan colonias
sospechosas en las placas de agar MOX o HL, la muestra se considera
negativa para Listeria monocytogenes.
3.3.6. Aislamiento y purificación
3.3.6.1. Seleccionar las colonias sospechosas en las placas de agar MOX y

con un ansa tocar como mínimo 20 colonias (si hay disponibles), y estriar por
agotamiento en superficie en placas de agar HL para obtención de colonias
aisladas. Incubar las placas a 35°C ± 2°C durante 2 2 h ± 4 h.
3.3.6.2. Después de la incubación examinar las placas de agar HL a contra luz
para observar colonias translúcidas rodeadas por un pequeño halo de β -
hemólisis.
3.3.6.3. Si al menos una colonia sospechosa está claramente aislada, proceder
con el test de confirmación (Conservar las placas a temperatura ambiente o en
heladera hasta completar el test de confirmación).
107
3.3.6.4. Si hay colonias sospechosas con β - hemólisis pero no están aisladas,
reaislar las colonias en un nuevo agar HL.
3.3.6.5. Si no se evidencian colonias sospechosas en ninguna de las placas de
agar HL, la muestra se considera negativa para Listeria monocytogenes.
3.3.7. Confirmación y otros procedimientos de identificación
La identificación y confirmación de Listeria monocytogenes consiste en pruebas

de confirmación preliminar, pruebas bioquímicas, test de CAMP y en algunas
situaciones se requiere de tests genéticos.
3.3.7.1. Test de confirmación preliminar: a partir de una colonia aislada en agar

HL inocular caldo BHI y, opcionalmente, inocular una placa fresca de agar HL
para confirmar la pureza de la colonia. A partir de esa misma colonia inocular
los medios para realizar las pruebas bioquímicas (agar HL, TSA-YE ó TS-SBA
o equivalentes). Como mínimo una colonia debe ser confirmada.
Si la colonia sospechosa seleccionada en el agar HL no es confirmada como L.
monocytogenes, se debe realizar la confirmación a otras colonias, si hay
disponibles, hasta que al menos 3 colonias sospechosas den la confirmación
negativa.
3.3.7.2. Prueba de la movilidad (opcional): inocular el caldo BHI, incubar de 16

h a 18 h a 18°C - 25ºC. Si no se evidencia crecimie nto, reincubar hasta que se
observe crecimiento o hasta un máximo de 48 h. Luego de la incubación,
depositar una gota del cultivo entre porta y cubre objeto bien limpio, y examinar
en el microscopio. Listeria spp. aparece como bacilos cortos, delgados y con
movimientos característicos de “tumbos” (tumbling).
3.3.7.3. Coloración de Gram: realizar la coloración de Gram. Listeria spp. se

presenta como bacilos Gram positivos cortos y delgados.
3.3.7.4. Prueba de la catalasa: tomar una colonia aislada y suspender en una

gota de solución de peróxido de hidrógeno en un portaobjeto. Listeria spp. da
una reacción positiva que se evidencia por la formación inmediata de burbujas
de gas.
NOTA: Si la morfología y la movilidad no es característica de Listeria spp. y el

cultivo es puro, informar Listeria monocytogenes negativo
Si la morfología y la movilidad es característica de Listeria spp. y el cultivo es
puro, continuar con las pruebas bioquímicas para la confirmación de Listeria
monocytogenes.
3.3.7.5. Pruebas bioquímicas: a partir de colonias aisladas en agar HL, TSA-YE

o TS-SBA o equivalentes, realizar la confirmación bioquímica mediante la
galería de API Listeria – bioMérieux, MICRO-ID, VITEK 2 Compact o
equivalente (siguiendo las instrucciones del fabricante) o mediante pruebas
bioquímicas en tubo (ver Bacteriological Analytical Manual).
108
3.3.7.6. Prueba de CAMP (figura A)
3.3.7.6.1. En una placa de agar TS-SBA estriar en forma paralela una línea
simple de S. aureus ATCC 25923 ó ATCC 4944 y otra línea simple de
Rhodococcus equi ATCC 6939, separadas entre si 3-4 cm. Utilizar un ansa o
aguja de inoculación.
3.3.7.6.2. Estriar los cultivos test en una línea simple y perpendicular, entre las
dos líneas de cultivos de referencia. Las líneas de cultivo test deben estar
separadas de las de referencia 2-4 mm. Durante el estriado, las líneas test y
referencia no se deben tocar para evitar contaminación cruzada.
3.3.7.6.3. Simultáneamente estriar cultivos controles de L.monocytogenes, L.
innocua y L. ivanovii
3.3.7.6.4. Incubar 24 h ± 2 h a 35ºC
3.3.7.6.5. Se considera reacción positiva una zona acrecentada de β-hemólisis
en la intersección de los cultivos test y los cultivos de S.aureus y R.equi.
3.3.7.6.6. Una reacción positiva para R. equi se ve como una amplia zona (5 a
10 mm) en forma de “cabeza de flecha” de hemólisis. La reacción es negativa
si se presenta como una pequeña zona (alrededor de 1 mm) de hemólisis débil
en la intersección del cultivo test con la zona de difusión de R.equi.
3.3.7.6.7. Una reacción positiva para S.aureus se ve como una pequeña zona
de hemólisis acrecentada, que se extiende alrededor de 3 a 4 mm del cultivo
test y dentro de la zona de hemólisis débil debida al crecimiento del cultivo de
S.aureus. No ocurre una zona grande de β - hemólisis en la proximidad de las
áreas entre S.aureus y L. monocytogenes.
Figura A: Prueba de Camp
109
3.3.8. Interpretación bioquímica
Producción de ácido Test de CAMP

Especie Hemólisis
ramnosa xilosa S. aureus R. equi
L. monocytogenes + + - + -
L. innocua - V - - -
L. ivanovii + - + - +
L. seeligeri (+) - + (+) -
L. welshimeri - V + - -
L. grayi sub. grayi - - - - -
L. grayi sub.
- V - - -
murrayi
V: reacción variable
(+): reacción positiva débil
+: > del 90 % reacciones positivas
-: reacción negativa
Nota: existen algunas cepas raras de L. monocytogenes que no dan β-

hemólisis y dan reacción de CAMP negativa.
3.3.9. Test de identificación genética
Los tests de identificación genética pueden ser utilizados como tests

confirmatorios para todas las cepas de Listeria monocytogenes identificadas
por pruebas bioquímicas. Sin embargo, pueden ser requeridos para identificar
cepas atípicas sospechosas de ser L. monocytogenes. En algunos casos no se
pueden diferenciar las cepas de L. monocytogenes de las cepas de L. innocua
por pruebas fenotípicas, en particular para L. monocytogenes β - hemolíticas
rammnosa negativa y fosfolipasa C negativa. En otros casos, una L.
monocytogenes débilmente hemolítica puede ser confundida como L. innocua
(además existen las cepas de L. innocua β-hemolíticas).
De acuerdo a los resultados de 3.3.8. y 3.3.9 (en caso de realizarse) indicar

presencia o ausencia de Listeria monocytogenes en la cantidad de muestra
analizada (por gramos o mililitros para muestras líquidas).
Nota: Una vez identificado el microorganismo como Listeria monocytogenes por

propiedades bioquímicas, la cepa debe ser enviada al Centro de Referencia
110
Junto con la muestra realizar un control positivo con un inóculo de una cepa de
Listeria monocytogenes de referencia, y proceder de la misma manera que la
muestra para demostrar que el cultivo positivo es recuperado.
111
4. ANEXOS
ANEXO 1: Diagrama de flujo del procedimiento para la detección de Listeria

monocytogenes
Primer enriquecimiento: 25 g de muestra + 225 ml de UVM (dilución 1/10).

Stomacher 2 ± 0.2 minutos
Incubar a 30°C ± 2°C, 22 h ± 2 h
Segundo enriquecimiento: Estriado en placa:

transferir 0.1 ml ± 0.02 ml de UVM en 10 ml Estriar un ansada o 0.1 ml en agar MOX
± 0.5 ml de caldo FB. Incubar a 35°C ± 2°C, Incubar a 35°C ± 2°C, 26 h ± 2 h. (hasta 48 h)
26 ± 2 h. (hasta 48 h)
Estriado en placa:
- Si el FB presenta coloración negra:
Estriar un ansada ó 0.1 ml en agar MOX
Incubar a 35°C ± 2°C, 26 h ± 2h. (hasta 48 h)
- Si el FB no presenta coloración negra
incubar 24 hs más
Seleccionar colonias típicas y estriar en HL. Incubar a 35°C ± 2°C, 22 h ± 4h.
Seleccionar colonias sospechosas: colonias translúcidas con zona de β –hemólisis y

reaislar en agar HL, TSA-YE ó TS-SBA, incubar a 35°C ± 2°C, 22 h ± 4h.
Confirmación:
Test de confirmación preliminar
Pruebas bioquímicas
Test de CAMP
Test de identificación genética
112
1. Caldo University of Vermont modificado (UVM)

Triptona 5.0 g
Lamb Lemco powder (o extracto de carne) 5.0 g
Esculina 1.0 g
Acido nalidíxico (2 % en NaOH 0.1 M) 1.0 ml
Acriflavina 12.0 mg
Disolver los componentes en agua destilada. Ajustar el pH, si es necesario, para

obtener un valor de 7.2 ± 0.2 a 25ºC después de la esterilización. Esterilizar a
121°C durante 15 minutos. NO SOBRECALENTAR. Enfriar después de
esterilizar. Si el medio se oscurece o ennegrece, fue sometido a
sobrecalentamiento y debe ser descartado.
2. Caldo Fraser (FB)

Triptona 5.0 g
Lamb Lemco powder (o extracto de carne) 5.0g
Esculina 1.0 g
Acido nalidíxico (2 % en NaOH 0.1 M) 1.0 ml
Cloruro de litio 3.0 g
Disolver los componentes en agua destilada y fraccionar en tubos en porciones

de 10 ml. Ajustar el pH si es necesario para obtener un valor después de la
esterilización de 7.2 ± 0.2 a 25ºC. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. NO
SOBRECALENTAR. Enfriar después de esterilizar. Si el medio se oscurece o
ennegrece, fue sometido a sobrecalentamiento y debe ser descartado. Guardar
en refrigeración. Inmediatamente antes del uso agregar a los 10 ml de Caldo
Fraser 0.1 ml de la solución de acriflavina (2.5 mg/ml esterilizada por filtración) y
0.1 ml de la solución de citrato amoniacal férrico al 5 % esterilizada por filtración.
113
3. Agar Oxford Modificado (MOX)
3.1 Medio base
Polipeptona 20.0 g
Almidón 1.0 g
Cloruro de Sodio (NaCl) 5.0 g
Esculina 1.0 g
Citrato férrico amoniacal 0.5 g
Agar bacteriológico 13.0 g
Disolver los componentes en agua destilada llevando a ebullición con constante

agitación, hasta completa disolución. Ajustar el pH, si es necesario, para
obtener un valor de 7.0 ± 0.2 a 25°C después de la esterilización. Fraccionar
100 ml en frascos y esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar y mantener
el medio a 47ºC y, asépticamente, agregar a los 100 ml del medio base 1 ml
del suplemento selectivo Oxford (instrucciones para el suplemento selectivo
Oxford CCCFA de Biokar Diagnostics) siguiendo las indicaciones del
fabricante.
4. Agar sangre de caballo con una sobrecapa de agar (HL ó

HBO)
4.1 Capa de base
Agar base Columbia: preparar de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Volcar 10 ml en una placa de Petri de
100 mm, dejar solidificar y hacer la sobrecapa con el agar sangre descripto en
4.2.
4.2 Sobrecapa
Agregar un 4 % de sangre de caballo estéril al agar base Columbia fundido y

enfriado a 46ºC, mezclar bien y rápidamente agregar de 5 a 6 ml arriba de la
capa de agar base realizada en 4.1 y mover para distribuir bien la sobrecapa.
Almacenar en heladera hasta 2 semanas.
5. Agar Tripticasa soja con 5% de sangre de oveja (TS-SBA)
Tripticasa (Tryptic- digestivo pancreático de caseina) 15.0 g

Phytone (digesto papaínico de harina de poroto de soja) 5.0 g
Agar 15.0 g
Agua 1000 ml
114
Disolver los componentes en agua destilada calentando con constante
agitación hasta completa disolución. Ajustar el pH, si es necesario, para
obtener un valor de 7.3 ± 0,2 a 25°C después de la esterilización. Esterilizar a
121°C durante 15 minutos. Enfriar a 50ºC aproximada mente, agregar un 5 %
de sangre de oveja desfibrinada y mezclar bien. Evitar formación de burbujas.
Volcar 15 ml en placas de Petri de 100 mm y dejar solidificar.
6. Agar Tripticasa soja- extracto de levadura (TSA-YE)
Tripticasa (Tryptic) 15.0 g

Phytone (digesto papaínico de harina de poroto de soja) 5.0 g
Agar 15.0 g
Agua 1000 ml
Disolver los componentes en agua destilada, calentando con constante

obtener un valor de 7.3 ± 0,2 a 25°C después de la esterilización. Esterilizar a
121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45ºC - 50ºC y v olcar en placas de Petri.
7. Caldo cerebro, corazón infusión (BHI)
Digestivo pancreático de gelatina 14.5 g

Sólidos de cerebro, corazón 6.0 g
Digestivo peptico de tejido animal 6.0 g
Glucosa 3.0 g
Disolver los componentes en agua destilada. Ajustar el pH, si es necesario,

para obtener un valor de 7.4 ± 0.2 a 25°C después d e la esterilización.
Fraccionar en tubos y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
8. Agar movilidad
Digesto enzimático de caseína 20.0 g

Digesto enzimático de tejido animal 6.1 g
Agar 3.5 g
Disolver los componentes en agua destilada, calentando a ebullición hasta

completa disolución. Ajustar el pH, si es necesario, para obtener un valor de 7.3
± 0.2 a 25°C después de la esterilización. Fraccion ar en tubos en cantidad de 5
ml aproximadamente. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
115
ANEXO 3: Fotos
1. Caldo Fraser
Izquierda: control negativo

Derecha: control positivo
2. Agar Oxford Modificado
Listeria monocytogenes: colonias típicas pequeñas (aproximadamente 1mm) y

rodeadas por un halo de oscurecimiento.
3. Test de movilidad
Listeria monocytogenes: crecimiento en forma de paraguas (foto derecha)
116
5. REFERENCIAS
5.1. USDA. MLG 8.07. Isolation and identification of Listeria monocytogenes

from Red Meat, Poultry, Egg and Enviromental Samples. Effective Date:
8/3/03.
117
en muestras de alimentos
(Procedimiento según FDA-BAM: 2011)
1. OBJETIVO
El presente procedimiento tiene como objeto describir la metodología llevada a

cabo por el Laboratorio de Microbiología para realizar la detección, aislamiento
e identificación de Listeria monocytogenes en alimentos.
2. ALCANCE

identificación de Listeria monocytogenes en alimentos.

por propiedades bioquímicas la cepa debe ser enviada al Centro de Referencia
3. DESARROLLO
3.1.1. Acido acético 5 N

3.1.2. Clorhidrato de acriflavina
3.1.3. Agar
3.1.4. N-(1- naftil) etilen diamina
3.1.5. Agar base sangre
3.1.6. Cicloheximida
3.1.7. Natamicina
3.1.8. Sangre de oveja desfibrinada
3.1.9. Etanol absoluto
3.1.10. Kit para coloración de Gram
3.1.11. Solución de peróxido de hidrogeno al 3 % (para la prueba de catalasa)
3.1.12. Agar cloruro de litio-feniletanol-moxalactam (LPM) con agregado de
hierro y esculina.
3.1.13. Sal sódica de ácido nalidíxico
3.1.14. Medio y reactivos para la prueba de reducción de nitrato
3.1.15. Caldo nutritivo
3.1.16. Solución salina fisiológica al 0.85 %
3.1.17. Caldo base púrpura de bromocresol para fermentación de carbohidratos
con 0.5% de soluciones de dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa,
manitol y xilosa.
118
3.1.18. Agar SIM o medio para la prueba de movilidad (MTM)
3.1.19. Agar tripticasa soja con 0.6 % de extracto de levadura (TSA-YE)
3.1.20. Caldo tripticasa soja con 0.6 % de extracto de levadura (TSB-YE)
3.1.21. Agar Oxford (OXA)
3.1.22. Caldo de enriquecimiento buffer Listeria (BLEB)
3.1.23. Agar PALCAM
3.1.24. Agar BCM
3.1.25. Agar Oxford Modificado (MOX)
3.1.26. Agar ALOA
3.1.27. Agar Cromogénico para Listeria
3.1.28. CHROMagar Listeria
3.1.30. Autoclave
3.1.31. Balanza electrónica capaz de pesar 25 ± 0.1 g
3.1.34. Vórtex
3.1.35. Stomacher
3.1.36. Bolsas para stomacher con o sin filtro de capacidad adecuada.
3.1.37. Ansa de platino o níquel de aproximadamente 3 mm de diámetro ó 10
µl.
3.1.38. Aguja de inoculación
3.1.39. Peachímetro calibrado con exactitud de 0.1 unidad de pH de 20°C a
25ºC.
3.1.40. Pipetas graduadas o automáticas de 25 ml, 10 ml y 1 ml de capacidad
nominal
3.1.41. Tubos o frascos de capacidad apropiada
3.1.42. Placa de Petri de vidrio o plástico.
3.1.43. Kit de pruebas bioquímicas capaz de identificar Listeria monocytogenes
(ej. Galería API Listeria, bioMerieux, MICRO-ID, VITEK 2 Compact o
equivalente)
3.1.44. Test de tamizaje (screening) para determinación de Listeria spp.
(ejemplo GENE-TRAK, TECRA, VIDAS o equivalente)
3.1.45. Sueros para tipificación de Listeria
3.2. Cultivos

ATCC 19111, NCTC 7973 u otro cultivo de Listeria monocytogenes validado
u otro cultivo de Listeria innocua validado
3.2.3. Otras cepas de Listeria spp. como L. seeligeri, L. grayi y L. ivanovii se
pueden ser requerir como controles para pruebas confirmatorias adicionales.
3.2.4. Cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923 ó ATCC 4944 y
Rhodococcus equi ATCC 6939 para realizar el test de CAMP tradicional.
119
3.3. Procedimiento

70 %, o isopropanol al 70 %. Si el envase no parece estar limpio, lavar antes de
3.3.2. Preenriquecimiento y enriquecimiento
Pesar 25 g de la muestra en una bolsa de Stomacher, agregar 225 ml de BLEB

y homogeneizar. Incubar durante 4 h a 30ºC. Agregar los agentes selectivos y
continuar la incubación por 24 h- 48 h.
NOTA: La cicloheximida puede ser reemplazada por natamicina (25 mg/l).

En el caso de matrices con bajos recuentos de mohos (como ser leche y crema
pasteurizada, yogurt, etc.) no agregar los agentes antifúngicos.
3.3.3. Test de screening (OPCIONAL)
Del caldo de enriquecimiento, realizar el test de screening siguiendo las

3.3.4. Aislamiento
3.3.4.1. A partir del caldo de enriquecimiento BLEB de 24 h y 48 h de

incubación, estriar en uno de los siguientes agares selectivos para aislamiento:
OXA, PALCAM, MOX, LPM. Incubar las placas de OXA, MOX, PALCAM a
35°C durante 24 h – 48 h, y las placas de LPM a 30° C durante 24 h – 48 h.
3.3.4.2. A partir del caldo de enriquecimiento de 48 h (y del caldo de 24 h en
forma opcional) estriar en uno de los siguientes medios selectivos diferenciales:
BCM, ALOA o CHROMagar.
NOTA: el paso 3.3.4.2 es recomendado para reducir el problema de confundir

L. monocytogenes con L.innocua.
3.3.5. Selección de colonias sospechosas
3.3.5.1. Examinar las placas del punto 3.3.4.1 después de la incubación, para
la determinación de la presencia de colonias típicas de Listeria spp.. Las
colonias típicas son pequeñas (aproximadamente 1mm) y rodeadas por un halo
de oscurecimiento debido a la hidrólisis de la esculina.
Seleccionar 5 ó más colonias típicas y sembrar por estriado en agar TSA-YE
para aislamiento de las colonias sospechosas. Incubar a 30°C durante 24 h –
48 h.
3.3.5.2. Examinar las placas del punto 3.3.4.2 después de la incubación para la
determinación de la presencia de colonias típicas de Listeria monocytogenes,
que se evidencian de la siguiente manera:
120
- Agar BCM: colonias azules
- Agar ALOA: las colonias de L.monocytogenes y L. ivanovii son azules
con una zona de lipólisis.
Seleccionar 5 ó más colonias típicas y sembrar por estriado en agar TSA-YE,
para aislamiento de las colonias sospechosas. Incubar a 30°C durante 24 h –
48 h.
NOTA: El TSA-YE se puede incubar a 35°C si las colo nias no se someterán al

test de movilidad (3.3.6.2).
3.3.6. Identificación
3.3.6.1. Observación de colonias típicas con el sistema óptico de Henry

(opcional)
Examinar las placas de TSA-YE para ver las colonias típicas. En forma
opcional se pueden examinar las colonias con el sistema óptico de Henry (fig.
1), el cual consta de un rayo de luz blanca, transmitido en forma oblicua y lo
suficientemente intenso como para iluminar bien la placa en un ángulo de 45°.
Las colonias se observan con una coloración azul grisácea a azul. Se
recomienda el uso de controles positivos y negativos. La placa se puede
observar a simple vista, pero se recomienda utilizar un microscopio de baja
resolución o un microscopio de disección (con espejo incorporado).
Figura 1: Sistema óptico de Henry
3.3.6.2. Prueba de la movilidad
A partir de una colonia típica de una placa incubada a una temperatura de 30°C
o menor, preparar una suspensión densa en solución fisiológica al 0.85 %.
Depositar una gota de la suspensión entre porta y cubreobjeto bien limpios y
examinar en el microscopio. Listeria spp. se presenta como bacilos cortos,
delgados y con movimientos característicos en tumbos (tumbling).
121
3.3.6.3. Prueba de la catalasa
Tomar una colonia aislada y suspender en una gota de solución de peróxido de

hidrógeno al 3 % en un portaobjeto. Una reacción positiva se ve por la
formación inmediata de burbujas de gas.
3.3.6.4. Coloración de Gram
Realizar la coloración de Gram. Listeria spp. se presenta como bacilos Gram

positivos cortos y delgados.
3.3.6.5. Inoculación en caldo TSB-YE
Inocular las colonias típicas en un tubo con caldo TSB-YE. Incubar a 35°C
durante 24 h. Este cultivo puede ser conservado a 4°C durante varios días para
repetidas inoculaciones. A partir de este tubo se realizarán las pruebas de
fermentación de hidratos de carbono y otras pruebas bioquímicas.
3.3.6.6. Prueba de hemólisis
A partir del agar TSA-YE inocular el agar sangre de oveja al 5 %, para realizar
el test de hemólisis.
Secar bien la superficie del agar sangre de oveja antes de usar, delinear una
grilla de 20 - 25 espacios en la base de la placa y, a partir de una colonia
aislada, sembrar con aguja. Utilizar un espacio para cada cultivo.
Simultáneamente sembrar controles positivos (L. monocytogenes, L.ivanovii) y
un control negativo (L. innocua).
Incubar a 35ºC durante 24 h – 48 h.
Después de la incubación, examinar las cepas bajo luz brillante:
- L. monocytogenes: produce una delgada y clara zona de β-hemólisis
- L. innocua: no produce zona de hemólisis
- L. seeligeri: produce una zona de hemólisis débil
- L. ivanovii: generalmente produce una amplia y clara zona de β-
hemólisis
NOTA: No diferenciar especies en este punto, pero registrar la naturaleza de la

reacción de hemólisis. En caso de reacciones dudosas, resolver con el test de
CAMP.
La prueba de hemólisis se observa mejor cuando se utiliza una capa de agar
sangre más delgada de lo usual. También se puede utilizar una sobrecapa de
agar sangre de 1- 2 mm de grosor.
3.3.6.7. Reducción de nitrato (opcional)
Sólo Listeria grayi ssp. murrayi reduce nitratos. Este test permite distinguir L.
grayi ssp. murrayi de L. grayi ssp. grayi.
A partir del caldo TSB-YE (3.3.6.5) inocular el caldo nitrato. Incubar a 35°C
durante 5 días. Agregar 0.2 ml del reactivo A, seguido de 0.2 ml del reactivo B.
El desarrollo de una coloración rojo - violeta indica la presencia de nitritos
(reducción del nitrato). Si no hay desarrollo de color, agregar zinc en polvo y
122
esperar 1 h. El desarrollo de coloración rojo - violeta indica que no hubo
reducción de nitratos.
3.3.6.8. Inoculación en SIM o MTM
A partir del caldo TSB-YE inocular agar SIM ó MTM, incubar a temperatura
ambiente 7 días. Observar diariamente. Listeria spp. es móvil y da un
crecimiento típico en forma de paraguas (umbrella) en la cercanía de la
superficie del agar.
En el medio MTM se observa un crecimiento típico más definido.
3.3.6.9. Prueba de fermentación de carbohidratos
A partir del cultivo obtenido en TS-YEB inocular con un ansa cada uno de los
caldos para utilización de carbohidratos (caldo base púrpura de bromo cresol
para fermentación de carbohidratos con 0.5 % de soluciones de dextrosa,
esculina, maltosa, ramnosa, manitol y xilosa). El uso de campanita de Durham
es opcional.
Incubar a 35°C hasta 7 días. Una reacción positiva (formación de ácido) se
visualiza por una coloración amarilla, que generalmente sucede dentro de las
24 h ó 48 h.
Todas las especies de Listeria son positivas para dextrosa, esculina y maltosa
y negativas para manitol (excepto L. grayi).
Ver punto 3.3.7 para interpretación de resultados.
NOTA: si la reacción de esculina se evidencia bien en los medios OXA,

PALCAM, MOX, LPM se puede omitir esta prueba en tubo.
3.3.6.10. Pruebas bioquímicas por kits comerciales

Los cultivos puros pueden ser identificados por sistemas de identificación
bioquímica disponibles en el comercio (ej. API Listeria, Vitek, MICRO-ID-
bioMérieux)
- En una placa de agar sangre de oveja estriar en forma paralela una línea
simple de S. aureus ATCC 25923 ó ATCC 4944 y otra línea simple de
Rhodococcus equi ATCC 6939, separadas entre sí 3-4 cm. Utilizar un ansa o
- Estriar los cultivos test en una línea simple y perpendicular entre las dos
líneas de cultivos de referencia. Las líneas de cultivo test deben estar
separadas de las de referencia 2 - 4 mm. Durante el estriado las líneas test y
- Simultáneamente estriar cultivos controles de L.monocytogenes, L. innocua y
L. ivanovii
- Incubar 24 h a 48 h a 35ºC.
- Se considera reacción positiva una zona acrecentada de β-hemólisis en la
intersección de los cultivos test y los cultivos de S.aureus y R.equi.
- Una reacción positiva para R. equi se ve como una amplia zona (5 a 10 mm)
en forma de “cabeza de flecha” de hemólisis. La reacción es negativa si se
123
presenta como una pequeña zona (alrededor de 1 mm) de hemólisis débil en la
intersección del cultivo test con la zona de difusión de R.equi.
- Una reacción positiva para S.aureus se ve como una pequeña zona de
hemólisis acrecentada, que se extiende alrededor de 3 a 4 mm del cultivo test y
dentro de la zona de hemólisis débil debida al crecimiento del cultivo de
S.aureus. No ocurre una zona grande de β-hemólisis en la proximidad de las
3.3.7. Interpretación de propiedades morfológicas, fisiológicas y

reacciones bioquímicas
Todas las especies de Listeria spp. son bacilos cortos Gram positivos móviles,
catalasa positivos.
Listeria monocytogenes se distingue de las demás especies por las
propiedades presentadas en la siguiente tabla.

Especie Hemólisis manitol ramnosa xilosa S. R. equi
aureus
L. monocytogenes + - + - + -
L. innocua - - V - - -
L. ivanovii + - - + - +
L. seeligeri (+) - - + (+) -
L. welshimeri - - V + - -
L. grayi sub. grayi - + - - - -
L. grayi sub.
- + V - - -
murrayi
124
NOTA: existen algunas cepas raras de L. monocytogenes que no dan β –

3.3.8. Test de identificación genética
Los tests de identificación genética pueden ser utilizados como tests

confirmatorios para todas las cepas de Listeria monocytogenes identificadas
por pruebas bioquímicas. Sin embargo, pueden ser requeridos para identificar
cepas atípicas sospechosas de ser L. monocytogenes. En algunos casos no se
pueden diferenciar las cepas de L. monocytogenes de las cepas de L. innocua
por pruebas fenotípicas, en particular para L. monocytogenes β-hemolíticas
rammnosa negativa y fosfolipasa C negativa. En otros casos una L.
monocytogenes débilmente hemolítica puede ser confundida como L. innocua
(además existen las cepas de L. innocua β-hemolíticas).
3.3.9. Serotipificación
Para la serotipificación se pueden utilizar sueros comerciales para caracterizar

a los aislamientos como tipo 1, tipo 4 ó no tipo 1 ó 4 (tipo 3, 5, 6 etc.). Seguir
las instrucciones del fabricante.
Especies de Listeria serotipos

L. monocytogenes 1/2a, 1/2b, 1/2c,
3a, 3b, 3c,
4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e,
“7”
L. ivanovii 5
L. innocua 4ab, 6a, 6b, INa
L. welshimeri 6a,6b
L. seeligeri 1/2b, 4c, 4d, 6b,INa
a: IN: indefinido
La mayoría de los aislamientos de L monocytogenes obtenidos en pacientes y

en muestras ambientales corresponden a los serotipos 1 y 4. Más del 90 % de
los aislamientos de L. monocytogenes pueden ser serotipificados con sueros
disponibles en el comercio. Todas las especies no patogénicas excepto L.
welshimeri comparten uno o más antígenos somáticos con L. monocytogenes.
De acuerdo a la interpretación de resultados, indicar presencia o ausencia de

Listeria monocytogenes en la cantidad de muestra analizada (por gramos o
mililitros para muestras líquidas).
Nota: Una vez identificado el microorganismo como Listeria monocytogenes por

propiedades bioquímicas, la cepa debe ser enviada al Centro de Referencia
125
Junto con la muestra, realizar un control positivo con un inóculo de una cepa de
Listeria monocytogenes de referencia, y proceder de la misma manera que la
muestra para demostrar que el cultivo positivo es recuperado.
126
4. ANEXOS
ANEXO 1: Diagrama de flujo del procedimiento para la detección de Listeria

monocytogenes
Enriquecimiento: 25 g de muestra + 225 ml de BLEB (dilución 1/10).

Incubar a 30°C, 4h
Agregar agentes selectivos
Continuar incubación durante 24 h - 48 h
Test de screening (OPCIONAL)
A partir del caldo BLEB de 24 h y 48 h estriar A partir del caldo BLEB de 24 h (opcional) y 48
en uno de los siguientes medios: h estriar en uno de los siguientes medios:
- Agar OXA, Palcam, MOX: incubar a - BCM, ALOA o CHROMagar: incubar
35ºC, 24 h - 48 h siguiendo instrucciones del fabricante
- Agar LPM: incubar a 30ºC, 24 h - 48 h
Seleccionar 5 colonias típicas y estriar en agar TSA-YE

Incubar a 30ºC, 24 h – 48 h
Identificación por:
Sistema óptico de Henry
Catalasa
Movilidad
Hemólisis
Gram
Bioquímicas
CAMP
Interpretación y expresión de resultados
127
1. Caldo de enriquecimiento buffer Listeria (BELB)
Caldo TSB – YE suplementado con :
Potasio dihidrógeno fosfato anhidro (KH2PO4) 1.35 g / l

Disodio hidrógeno fosfato (Na2HPO4) 9.6 g / l
Clorhidrato de acriflavina HCl 10.0 mg / l
Acido nalidíxico (sal sódica) 40.0 mg / l
Cicloheximida 50.0 mg / l
Acido pirúvico (sal sódica, 10% P/V en solución acuosa) 11.1 ml / l
Esterilizar el medio base (caldo TSB-YE) sin el agregado de los 3 agentes

selectivos a 121°C durante 15 minutos.
Agregar 2.5 ml de una solución al 10 % (p/v) de piruvato de sodio (previamente
esterilizada por filtración)
Nota: el piruvato de sodio puede ser agregado antes del autoclavado.
Preparar la acriflavina y el ácido nalidíxico como una solución stock al 0.5 % (p/v)
en agua destilada,
Preparar el suplemento cicloheximida como una solución stock al 10 % (p/v) en
una solución al 40 % (v/v) de etanol en agua.
Esterilizar los 3 agentes selectivos por filtración.
Agregar asépticamente las siguientes cantidades de solución stock de los 3
agentes selectivos a 225 ml del caldo de enriquecimiento que contiene la
muestra después de 4 h de incubación a 30 ºC: 0.455 ml de acriflavina, 1.8 ml de
ácido nalidíxico y 1.15 ml de cicloheximida
2. Agar tripticasa soja con extracto de levadura (TSA-YE) al 0.6 %
2.1 Agar tripticasa soja (TSA)

Fitopeptona 5.0 g
Agar 15.0 g
2.2 Agar tripticasa soja con extracto de levadura (TSA-YE) al 0.6 %

Agar Tripticasa soja (TSA) 40.0 g
Agua 1000 ml

Ajustar el pH si es necesario para obtener un valor de 7.3 ± 0.2 a 25°C después
de la esterilización. Esterilizar a 121°C durante 1 5 minutos.
Enfriar el medio entre 44ºC a 47ºC, y verter 15 ml en una placa de Petri. Dejar
solidificar.
128
3. Caldo tripticasa soja con extracto de levadura al 0.6 % (TSB-YE)
3.1 Caldo tripticasa soja (TSB)

Fitopeptona 3.0 g
Potasio dihidrógeno fosfato anhidro (KH2PO4) 2.5 g
Glucosa 2.5 g
Caldo Tripticasa soja 30.0 g

Agua 1000 ml

después de la esterilización. Esterilizar a 121°C d urante 15 minutos.
4. Agar Oxford
Agar base Columbia sangre 39.0 g

Esculina 1.0 g
Cicloheximida 0.4 g
Sulfato de colistina 0.02 g
Acriflavina 0.005 g
Cefotetan 0.002 g
Fosfomicina 0.010 g
Disolver los primeros cuatro componentes (55.5 g) en 1 litro de agua destilada.

Mezclar suavemente, calentando hasta completa disolución. Esterilizar en
autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 50° C y agregar asépticamente
los suplementos. Mezclar, y volcar en placas de Petri.
Para preparar el suplemento disolver la cicloheximida, el sulfato de colistin, la
acriflavina, el cefotetan y la fosfomicina en 10 ml de una mezcla 1:1 de agua
destilada y etanol, y esterilizar por filtración.
129
5. Agar Oxford Modificado (MOX)
Agar base Columbia sangre 39.0 a 44.0 g

Agar 2.0 g
Esculina 1.0 g
Solución bufferada de sulfonato de metano colistina 1.0 ml
Disolver el medio basal en agua destilada, ajustar el pH, si es necesario, para

obtener un valor de 7.2 ± 0.2 a 25°C después de la esterilización. Esterilizar a
121°C durante 10 minutos. Mezclar, enfriar a 46°C y agregar 2 ml de una
solución bufferada de moxalactam al 1 % (p/v), esterilizada por filtración.
Mezclar bien y volcar 12 ml por cada placa de Petri.
5.1 Solución bufferada de colistina al 1 % (p/v)

Sulfonato de metano colistin (Sigma C1511 o equivalente) 1.0 g
Buffer fosfato de potasio, 0.1 M, pH 6.0 ± 0.1 100 ml
Fraccionar en alícuotas de 5 ml y conservar a - 20°C.
5.2 Solución bufferada de moxalactam al 1 % (p/v)

Moxalactam sodio (o amonio) (Sigma M1900 o equivalente) 1.0 g
Buffer fosfato de potasio, 0.1 M, pH 6.0 ± 0.1 100 ml
Disolver, esterilizar por filtración y fraccionar en alícuotas de 2 ml. Conservar a

- 20°C
6. Agar Palcam
6.1. Medio basal

Peptona 23.0 g
Almidón 1.0 g
Agar base Columbia 13.0 g
Manitol 10.0 g
Esculina 0.8 g
Glucosa 0.5 g
Rojo fenol 0.08 g
6.2 Agentes selectivos

Sulfato de polimixina B 10.0 mg
Acriflavina 5.0 mg
Ceftazidina 20.0 mg
Agua destilada 2.0 ml
130
Para preparar 500 ml de medio, pesar 34.4 g del medio basal (todos los
ingredientes excepto los 3 agentes selectivos) y disolver en 500 ml de agua
destilada. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Disolver la mezcla de agentes selectivos en agua destilada (17.5 g en 1 ml) y
esterilizar por filtración.
Agregar 1 ml de la mezcla de agentes selectivos a 500 ml del medio base
esterilizado y enfriado a 50°C. Mezclar y volcar en placas de Petri. Ajustar el pH
final a 7.2 ± 0.1.
7. Agar cloruro de litio-feniletanol-moxalactam (LPM) con agregado de

hierro y esculina
7.1 Medio base

Agar feniletanol (Difco) 35.5 g
Glicina anhidra 10.0 g
Solución stock de moxalactam (1% en buffer fosfato, pH 6.0) 2.0 ml
Esterilizar el medio sin el moxalactam en autoclave a 121ºC durante 15

minutos. Enfriar a 48ºC - 50ºC. Agregar 2 ml de la solución de moxalactam, la
esculina y el citrato férrico amoniacal.
Solución stock de moxalactam: disolver 1 g de sal de moxalactam (sal de

amonio o sodio) en 100 ml de buffer fosfato de potasio. Llevar a pH 6.
Esterilizar por filtración y fraccionar en alícuotas de 2 ml. Conservar en el
freezer.
7.2 Esculina y hierro férrico

Esculina 1.0 g
8. Agar BCM ( Biosynth Chromogenic Medium)
Este medio se encuentra disponible en el comercio. Se caracteriza por

contener un sustrato cromogénico para la fosfatidilinositol-fosfolipasa C
específica. Esta enzima permite la diferenciación de L. monocytogenes y L.
ivanovii de otras especies de Listeria. Seguir las instrucciones del fabricante
9. Agar ALOA (Agar Listeria de acuerdo a Ottaviani y Agosti)
(Es aceptable la utilización de otro medio disponible en el comercio de igual

fórmula)
131
9.1 Medio base
Glucosa 2.0 g
Gliscerofosfato de magnesio 1.0 g
Sulfato de magnesio (anhidro) 0.5 g
5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-glucopiranósido 0.05 g
Agar 12 g a 18 g a
Agua destilada 930 ml b
a
dependiendo del poder gelificante del agar
b
926 ml si se utiliza la solución de Anfotericina B
Disolver los componentes deshidratados o el medio base completo

deshidratado en agua destilada, llevando a ebullición con constante agitación,
hasta completa disolución. Ajustar el pH, si es necesario, para obtener un valor
de 7.2 ± 0.2 a 25°C después de la esterilización. E sterilizar a 121°C durante 15
minutos.
9.2 Solución de sal sódica de ácido nalidíxico

Sal sódica de ácido nalidíxico 0.02 g
Solución de hidróxido de sodio 0.05 mol/ l de solución 5.0 ml
Disolver la sal de ácido nalidíxico en el hidróxido de sodio y esterilizar por

filtración.
9.3 Solución de Ceftazidima

Ceftazidima 0.02 g
Disolver la ceftazidima en agua y esterilizar por filtración, con membrana de

0.45 µm.
9.4 Solución de Polimixina B

Polimixina B 76 700 IU
Disolver la polimixina B en agua y esterilizar por filtración, con membrana de

0.45 µm
9.5 Suplemento de antibiótico
9.5.1 Solución de cicloheximida

Cicloheximida 0.05 g
Metanol 2.5 ml
132
Disolver la cicloheximida en el metanol y luego agregar el agua. Esterilizar por
filtración, con membrana de 0.45 µm.
9.5.2 Solución de anfotericina B (como alternativa de la solución de

cicloheximida)
Anfotericina B 0.01 g
Ácido clorhídrico (1mol/l) 2.5 ml
Dimetilformamida (DMF) 7.5 ml
Disolver la anfotericina en la solución de HCl/DMF. Esterilizar por filtración, con

membrana de 0.45 µm
PRECAUCIÓN: La solución de HCl/DMF es tóxica, manipular con cuidado.
9.6 Suplemento
Disolver 2 g de L – α - fosfatidil inositol (Sigma P6636) ® en 50 ml de agua fría.
Mezclar alrededor de 30 minutos hasta obtener una suspensión homogénea.
Autoclavar a 121°C durante 15 minutos y enfriar a 4 8°C - 50°C.
NOTA: Sigma P6636 es una marca comercial. Se puede utilizar un producto

equivalente que demuestre tener el mismo resultado.
9.7 Medio completo

Medio base (3.1) 930 ml a
Solución de sal sódica de ácido nalidíxico (3.2) 5 ml
Solución de ceftazidima (3.3) 5 ml
Solución de polimixina B (3.4) 5 ml
Solución de cicloheximida (3.5.1) o 5 ml
Solución de anfotericina B (3.5.2) 10 ml
Suplemento (3.6) 50 ml
a
925 ml si se utiliza solución de Anfotericina B
Agregar las correspondientes soluciones al medio fundido y enfriado a

aproximadamente 50°C, mezclar suavemente entre cada adición. El pH del
medio completo debe ser de 7.2 ± 0.2 a 25°C. El med io es homogéneamente
opaco.
En cada placa de Petri agregar de 15 ml a 20 ml del medio recientemente
preparado y dejar solidificar.
10. Agar cromogénico para Listeria (Chromogenic Listeria Agar)
Este medio es comercializado por OXOID. Se caracteriza por contener el

sustrato Lecitina, que permite la diferenciación de L. monocytogenes y L.
ivanovii de otras especies de Listeria. Seguir las instrucciones del fabricante.
133
11. CHROMagar Listeria
Este medio se encuentra disponible en el comercio. Se caracteriza por

contener un sustrato cromogénico que permite la diferenciación de L.
monocytogenes y L. ivanovii de otras especies de Listeria. Seguir las
12. Agar sangre de oveja
12.1 Agar Base

Peptona de carne 15.0 g
Digestivo de hígado 2.5 g
Agar 9.0 a 18.0 g 1
Agua 1000 ml
1
Dependiendo del poder gelificante del agar

obtener un valor de 7.2 ± 0,2 a 25°C después de la esterilización. Fraccionar en
frascos de capacidad adecuada. Esterilizar a 121°C durante15 minutos.
12.2 Sangre desfibrinada de oveja
12.3 Medio completo

Base (12.1) 100 ml
Sangre desfibrinada de oveja (12.2) 5 ml a 7 ml
Agregar la sangre al medio base previamente fundido y enfriado a aprox. 47°C.

Mezclar bien. Dispensar en placas de Petri y dejar solidificar.
13. Caldo púrpura de bromocresol para carbohidratos (con dextrosa,

esculina, maltosa, ramnosa, manitol y xilosa)
Proteosa peptona N°3 10.0 g

Disolver los ingredientes (omitiendo los carbohidratos) en 800 ml de agua

destilada, calentando y agitando suavemente. Dispensar 2.0 ml en tubos de 13
x 100 mm que contegan una campanita de fermentación invertida (campana de
Durhan). Autoclavar a 118°C durante 15 minutos y de jar enfriar. Disolver 5 g
de cada carbohidrato en 200 ml de agua destilada, y esterilizar por filtración.
Adicionar 0.5 ml de la solución filtrada en cada tubo con caldo base, después
134
de enfriarlo a 45°C. Agitar suavemente para mezclar . Ajustar el pH final a 6.8 ±
0.2.
14. Caldo nutritivo

Peptona 5.0 g

agitación hasta completa disolución. Fraccionar en tubos. Esterilizar a 121°C
durante 15 minutos.
15. Caldo nitrato

Peptona 5.0 g
Nitrato de potasio (KNO3) 1.0 g
Disolver los componentes en agua destilada. Fraccionar 5 ml en tubos.

Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Ajustar el pH final a 7.0 ± 0.2.
16. Reactivos para la prueba de reducción de nitrato
16.1 Reactivo A: de ácido sulfanílico

Acido sulfanílico 1.0 g
Acido acético 5 N 125 ml
16.2 Reactivo B: Dihidroclorhidrato de N- (l-naftil) etilendiamina

Dihidroclorhidrato de N- (l-naftil) etilendiamina 0.25 g
Acido acético 5 N 200 ml
Conservar en frasco de vidrio oscuro con tapa
17. Medio SIM (para prueba de movilidad)

Sulfato ferroso de amonio 0.2 g
Agar 3.5 g
135
completa disolución. Ajustar el pH, si es necesario, para obtener un valor de 7.3
± 0,2 a 25°C después de la esterilización. Fraccion ar en tubos en cantidad de 6
ml aproximadamente. Esterilizar de acuerdo a indicaciones del fabricante.
NOTA: Este medio se encuentra disponible en BBL (no utilizar SIM de Difco)
18. Medio para test de movilidad (agar semisólido)

Peptona 10.0 g
Agar 4.0 g
Calentar con suave agitación hasta que se disuelva el agar. Fraccionar 8 ml en

tubos de ensayo de 16 x 150 mm con tapa a rosca. Esterilizar a 121°C durante
15 minutos. Luego, enfriar a 45°C y almacenar en re frigeración.
Ajustar el pH, si es necesario, para obtener un valor de 7.4 ± 0.2 después de la
esterilización.
136
ANEXO 3: Fotos
1. Agar Oxford Modificado
Listeria monocytogenes: colonias típicas pequeñas (aproximadamente 1mm) y

rodeadas por un halo de oscurecimiento.
2. Agar Listeria Ottaviani Agosti (ALOA)
Listeria monocytogenes: colonias típicas color verde - azulado rodeadas por un

halo opaco.
137
3. Agar PALCAM
Listeria monocytogenes: colonias típicas color verde-oliva rodeadas por un halo

negro.
4. Test de movilidad
Listeria monocytogenes: crecimiento en forma de paraguas (foto derecha).
138
5. REFERENCIAS
FDA U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual.

Chapter 10. Detection and Enumeration of Listeria monocytogenes in Foods.
April 2011 Edition.
139
en alimentos
(Procedimiento según International Standard ISO 11290-1: 2004)
1. OBJETIVO

aislamiento e identificación de Listeria monocytogenes en muestras de
alimentos.
2. ALCANCE

identificación de Listeria monocytogenes en muestras de alimentos.

por propiedades bioquímicas y morfológicas, la cepa debe ser enviada al
Centro de Referencia Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S
“Dr. Carlos G. Malbrán”, para una mayor caracterización.
3. DESARROLLO
3.1.1 Caldo Half Fraser (HFB)

3.1.2 Caldo Fraser (FB)
3.1.3 Agar Listeria de acuerdo a Ottaviani y Agosti (ALOA) u otro medio
disponible en el comercio de igual fórmula
3.1.4 Segundo medio de aislamiento selectivo a elección del laboratorio: como
por ejemplo Oxford o Palcam
3.1.5 Agar triptona soja extracto de levadura (TS-YEA)
3.1.6 Caldo triptona soja extracto de levadura (TS-YEB)
3.1.7 Agar sangre de oveja
3.1.8 Caldo para la utilización de carbohidratos (ramnosa y xilosa)
3.1.9 Agar movilidad (opcional)
3.1.10 Suspensión de glóbulos rojos de oveja (opcional)
3.1.11 Medio CAMP (Christie, Atkins, Munch - Petersen)
3.1.12 Solución de peróxido de hidrógeno (H2O2)
3.1.13 Para realizar la identificación bioquímica se pueden utilizar Kits de
pruebas bioquímicas capaz de identificar Listeria monocytogenes. (ej.
Galería API Listeria, bioMérieux) (opcional)
140
3.1.14 Estufa de esterilización
3.1.15 Autoclave
3.1.16 Balanza electrónica capaz de pesar 25 ± 0.1 g
3.1.17 Estufa de incubación a 30°C ± 1°C
3.1.18 Estufa de incubación a 35°C ± 1°C o 37ºC ± 1 ºC.
3.1.19 Estufa de incubación a 25ºC ± 1
3.1.20 Baño de agua a 47ºC ± 2°C
3.1.21 Vórtex
3.1.22 Stomacher
3.1.23 Bolsas para Stomacher con o sin filtro de capacidad adecuada.
3.1.24 Ansa de platino o níquel de aproximadamente 3 mm de diámetro ó 10 µl.
3.1.25 Aguja de inoculación
3.1.26 Espátula de Drigalsky
3.1.27 Tubos y frascos de vidrio de capacidad adecuada.
3.1.28 Peachímetro calibrado con exactitud de 0.1 unidad de pH a 20°C - 25ºC.
3.1.29 Pipetas graduadas o automáticas de 1 ml y de 100 µl de capacidad
nominal
3.1.30 Pipetas de 10 ml
3.1.31 Jarra para incubación en microaerofilia (opcional)
3.1.32 Mezcla de gases para incubación en microaerofilia: 5 % a 12 % de CO2,
5 % a 15 % de O2 y 75 % de N2 (opcional)
3.1.33 Equipo para el test de iluminación de Henry (opcional)
3.1.34 Microscopio preferiblemente con contraste de fase
3.1.35 Porta y cubreobjetos
3.1.36 Placas de Petri de 90 a 100 mm de diámetro.
3.2. Cepas

ATCC 19111, NCTC 7973 u otro cultivo de Listeria monocytogenes
validado.
u otro cultivo de Listeria innocua validado.
3.2.3. Otras cepas de Listeria spp. como L. seeligeri, L. grayi y L. ivanovii
pueden ser requeridas como controles para pruebas confirmatorias
adicionales.
3.2.4. Cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923 ó NCTC 1803 y
Rhodococcus equi NCTC 6121 ó ATCC 6939 para realizar el test de
CAMP tradicional.
3.3. Principio
3.3.1. Enriquecimiento primario
Siembra de la muestra en el medio de enriquecimiento líquido selectivo Caldo

Half Fraser que contiene una concentración reducida de agente selectivo (un
volumen de cloruro de litio y la mitad de volumen de acriflavina y ácido
nalidíxico). Incubación a 30ºC durante 24 h.
141
3.3.2. Enriquecimiento secundario:
Inoculación del medio de enriquecimiento líquido selectivo Caldo Fraser (que

contiene una concentración completa de agente selectivo) con el cultivo
obtenido en 3.3.1. Incubar a 35ºC ó 37ºC durante 48 h.
3.3.3. Estriado en placa e identificación
A partir de los cultivos obtenidos en 3.3.1 y 3.3.2. estriar en los dos medios
sólidos selectivos:
- Agar Listeria de acuerdo a Ottaviani y Agosti (ALOA)
- Segundo medio sólido selectivo a elección del laboratorio
complementario al ALOA, como por ejemplo Oxford o PALCAM.
Incubar el ALOA a 37ºC ± 1ºC y revisar después de 24 h ± 3 h y si es necesario
incubar por 24 h ± 3 h más para observar las colonias características de
Listeria monocytogenes.
Incubar el segundo agar selectivo de acuerdo a las indicaciones del fabricante.
NOTA: ALOA es un ejemplo de un medio apropiado disponible en el comercio.

La utilización de otro medio con la misma fórmula está permitida.
Aislamiento de las colonias sospechosas de L. monocytogenes obtenidas en

3.3.3. y confirmación por características morfológicas y propiedades
bioquímicas.
3.4. Procedimiento

70 %, o isopropanol al 70%. Si el envase no parece estar limpio lavar antes de
3.4.2. Primer enriquecimiento selectivo
Pesar x g de la muestra y agregar 9x ml de caldo Half Fraser (HFB), para llevar

a una dilución 1/10. Por ejemplo si se pesa 25 g de muestra agregar 225 ml de
HFB y homogeneizar durante 2 minutos ± 0.2 minutos en Stomacher.
Incubar durante 24 h ± 2 h a 30ºC ± 2ºC.
3.4.3. Segundo enriquecimiento en caldo Fraser
Transferir 0.1 ml ± 0.02 ml del caldo HFB obtenido en 3.4.2. en 10 ml ± 0.5 ml

de Caldo Fraser (FB) e incubar a 35°C ó 37ºC, 48 h ± 2 h.
142
3.4.4. Estriado en placas de agar selectivo
A partir de los medios de enriquecimientos obtenidos en 3.4.2. (HFB) y 3.4.3.

(FB) sembrar una ansada o una gota de aproximadamente 0.1 ml y distribuir
con espátula de Drigalsky sobre la superficie del Agar Listeria de acuerdo a
Ottaviani y Agosti (ALOA) y del segundo medio selectivo.
Incubar el ALOA a 37ºC ± 1ºC durante 24 h ± 3 h y si es necesario incubar 24 h
± 3 h más.
Incubar el segundo medio selectivo siguiendo las instrucciones del fabricante.
presencia de colonias características de Listeria monocytogenes:
ALOA: las colonias típicas de L. monocytogenes son verdes azuladas

rodeadas por un halo opaco. Si es crecimiento es débil o no se
observan colonias o no hay presencia de colonias típicas incubar 24
h ± 3 h más.
NOTA 1: algunas especies de L. monocytogenes presentan un halo muy débil o
pueden no presentar halo en caso de estrés en particular por estrés
ácido.
NOTA 2: algunas L. monocytogenes se caracterizan por tener una actividad
PIPLC (Fosfatidil inositol fosfolipasa C) lenta. Dichas bacterias se
detectan cuando el tiempo de incubación es mayor a 4 días. Algunas
de estas especies podrían ser patogénicas.
Segundo medio selectivo: Examinar la placas después del tiempo apropiado de
incubación para observar las presencia de colonias características de Listeria
spp o L. monocytogenes, dependiendo del medio.
3.4.5. Confirmación de Listeria spp
3.4.5.1. Para la confirmación seleccionar de cada placa obtenida en 3.4.4 cinco

colonias sospechosas de Listeria spp., si en algunas de las placas hay
menos de cinco colonias seleccionar todas.
3.4.5.2. Estriar las colonias seleccionadas en la superficie de una placa de agar
Triptona soja extracto de levadura (TS-YEA) para obtener colonias
aisladas. Incubar las placas a 35ºC ó 37ºC durante 18 h a 24 h hasta
obtener un crecimiento satisfactorio.
Las colonias típicas de Listeria spp en el agar TS-YEA son de 1mm a 2
mm de diámetro, convexas, incoloras y opacas con bordes definidos.
Si las colonias no están bien aisladas picar una colonia típica de
Listeria spp. y estriar en otra placa de TS-YEA.
3.4.5.3. Prueba de la catalasa: tomar una colonia aislada y suspender en una

gota de solución de peróxido de hidrógeno en un portaobjeto. Una
reacción positiva se ve por la formación inmediata de burbujas de
gas
3.4.5.4. Coloración de Gram: realizar la coloración de Gram. Listeria spp. se
presenta como bacilos Gram positivos cortos y delgados.
3.4.5.5. Prueba de la movilidad: a partir de una colonia aislada inocular el caldo
TS-YEB, incubar de 8 h a 24 h a 25ºC. Luego de la incubación
depositar una gota del cultivo entre porta y cubreobjeto bien limpio y
143
examinar en el microscopio. Listeria spp. aparece como bacilos
cortos, delgados y con movimientos característicos en tumbos
(tumbling).
Otra alternativa es sembrar, a partir de una colonia aislada en TS-
YEA, y con una aguja de inoculación, un agar movilidad. Incubar 48 h
a 25ºC. Examinar el crecimiento alrededor de la inoculación. Listeria
spp. da un crecimiento característico en forma de paraguas
(umbrella), inmediatamente por debajo de la superficie del agar. Si el
crecimiento no es suficiente incubar 5 días más y examinar el cultivo
durante ese tiempo.
3.4.6. Confirmación de Listeria monocytogenes
3.4.6.1. Test de hemólisis
Si las características morfológicas, fisiológicas y la prueba de la catalasa son

indicativas de Listeria spp., inocular el agar sangre de oveja para realizar el test
de hemólisis.
Secar bien la superficie del agar sangre de oveja antes de usar y, a partir de
una colonia aislada, sembrar con aguja, utilizando un espacio para cada cultivo.
Simultáneamente sembrar un control positivo (L. monocytogenes) y un control
negativo (L. innocua).
Incubar a 35ºC ó a 37ºC durante 24 h ± 2 h.
Después de la incubación examinar las cepas control:
- L. monocytogenes: produce una delgada y clara zona de β - hemólisis
- L. innocua: no produce zona de hemólisis
- L. seeligeri: produce una zona de hemólisis débil
- L. ivanovii: generalmente produce una amplia y clara zona de β -
hemólisis
Examinar las placas bajo luz brillante para comparar los cultivos con los
controles.
El test de hemólisis también puede realizarse utilizando glóbulos rojos de

sangre de oveja:
Dispersar la colonia aislada en 150 ul de caldo Triptona soja extracto de
levadura (TS-YEB), incubar a 37ºC durante 2 h. Agregar 150 ul de glóbulos
rojos de sangre de oveja. Incubar a 37ºC durante 15 a 60 minutos. Luego
refrigerar a 3ºC ± 2ºC durante aproximadamente 2 h. Examinar la actividad
hemolítica. Si la reacción no es definida, dejar a 3ºC ± 2ºC durante 24h ± 3h.
3.4.6.2. Utilización de carbohidratos (ramnosa y xilosa)
A partir del cultivo obtenido en TS-YEB, inocular con un ansa cada uno de los
caldos para utilización de carbohidratos. Incubar a 35°C ó a 37°C hasta 5 días.
Una reacción positiva (formación de ácido) se visualiza por una coloración
amarilla, que generalmente sucede dentro de las 24 h ó 48 h.
144
3.4.6.3.1. En una placa de agar sangre de oveja estriar una línea simple de S.
aureus ATCC 25923 ó ATCC 4944 y, en forma paralela, otra línea simple de
Rhodococcus equi ATCC 6939, separadas entre si 3 - 4 cm. Utilizar un ansa o
3.4.6.3.2. Estriar los cultivos test en una línea simple y perpendicular entre las
dos líneas de cultivos de referencia. Las líneas de cultivo test deben estar
separadas de las de referencia 2 - 4 mm. Durante el estriado las líneas test y
3.4.6.3.3. Simultáneamente estriar cultivos controles de L. monocytogenes, L.
innocua y L. ivanovii
3.4.6.3.4. Incubar 18 h a 24 h a 35º ó 37°C. Si se utiliza agar doble capa,
incubar a 37°C ó 35°C de 12 h a 18 h.
3.4.6.3.5. Se considera reacción positiva una zona acrecentada de β -hemólisis
en la intersección de los cultivos test y los cultivos de S.aureus y R.equi.
3.4.6.3.6. Una reacción positiva para R. equii se ve como una amplia zona (5 a
10 mm) en forma de “cabeza de flecha” de hemólisis. La reacción es negativa
si se presenta como una pequeña zona (alrededor de 1 mm) de hemólisis débil
en la intersección del cultivo test con la zona de difusión de R.equi.
3.4.6.3.7. Una reacción positiva para S.aureus se ve como una pequeña zona
de hemólisis acrecentada que se extiende alrededor de 3 a 4 mm del cultivo
test y dentro de la zona de hemólisis débil debida al crecimiento del cultivo de
S.aureus. No ocurre una zona grande de β-hemólisis en la proximidad de las
3.4.7. Interpretación de propiedades morfológicas, fisiológicas y

reacciones bioquímicas
Todas las especies de Listeria spp. son bacilos cortos Gram positivos móviles,
catalasa positivos.
Listeria monocytogenes se distingue de las demás especies por las
propiedades presentadas en la siguiente tabla.
145
Especie Hemólisis
ramnosa xilosa S. aureus R. equi
L. monocytogenes + + - + -
L. innocua - V - - -
L. ivanovii + - + - +
L. seeligeri (+) - + (+) -
L. welshimeri - V + - -
L. grayi sub. grayi - - - - -
L. grayi sub.
- V - - -
murrayi
NOTA: existen algunas cepas raras de L. monocytogenes que no dan β –

3.4.8. Control de cultivos
Para controlar la capacidad de los medios de enriquecimiento y los medios de

identificación de modo de lograr un crecimiento selectivo de L. monocytogenes,
sembrar en un frasco control con el primer medio de enriquecimiento selectivo
(HFB) una dilución de un cultivo recientemente aislado de L. monocytogenes y
de una cepa de control negativo (ej. Streptococcus).
Agregar de 10 a 100 células de L. monocytogenes y de la cepa de control
negativo por frasco.
Proceder con el frasco control de igual manera que la muestra, para demostrar
que la cepa de control positivo es recuperada.
3.4.9. Expresión de resultados
De acuerdo a la interpretación de los resultados indicar presencia o ausencia

de Listeria monocytogenes en la cantidad de muestra analizada (por gramos o
mililitros para muestras líquidas).

por propiedades bioquímicas, la cepa debe ser enviada al Centro de Referencia
146
4. ANEXOS
ANEXO 1: Diagrama de flujo del procedimiento para la detección de

Listeria monocytogenes
Primer enriquecimiento: x g de muestra + 9x ml de HFB (dilución 1/10).

Stomacher 2 ± 0.2 minutos
Incubar a 30°C, 24 h ± 3 h
Segundo enriquecimiento:
Transferir 0.1 ml ± 0.02 ml de FB en 10 ± Estriado en placa:
0.5 ml de caldo FB. Incubar a 35°C o 37°C, Estriar un ansada ó 0.1 ml en:
48 h ± 3h - agar ALOA , incubar a 37°C, 24 h ± 3 h (a 48 h)
- segundo medio selectivo, incubar de acuerdo a
especificaciones del fabricante
Estriado en placa:
Estriar un ansada ó 0.1 ml en:
- agar ALOA , incubar a 37°C, 24 h ± 3 h (a 48 h)
- segundo medio selectivo, incubar de acuerdo a
especificaciones del fabricante
Seleccionar colonias típicas y estriar en agar TS-YEA. Incubar de 35° a 37°C,

18 h a 24 h
Confirmación
147
ANEXO 2: Medios de cultivos, propiedades bioquímicas y reactivos
1. Caldo Half Fraser (HFB)
1.1 Caldo base
Peptona de carne (digestivo péptico de tejido animal) 5.0 g

Triptona (digestivo péptico de caseina) 5.0 g
Esculina 1.0 g
Disolver los componentes en agua destilada. Ajustar el pH, si es necesario, para

obtener un valor de 7.2 ± 0.2 a 25ºC después de la esterilización. Esterilizar a
121°C durante 15 minutos. NO SOBRECALENTAR, enfriar después de
esterilizar. Si el medio se oscurece o ennegrece, fue sometido a
sobrecalentamiento y debe ser descartado.
1.2 Solución de cloruro de litio

Agua 10 ml
Agregar el cloruro de litio al agua, y esterilizar por filtración.
ADVERTENCIA: tomar todas las precauciones necesarias cuando se disuelve el

cloruro de litio en agua, ya que la reacción es fuertemente exotérmica. La
solución irrita las membranas mucosas.

Solución de hidróxido de sodio 0.05 mol/ l de solución 10 ml
Disolver la sal de ácido nalidíxico en el hidróxido de sodio, y esterilizar por
filtración.
1.4 Solución de clorhidrato de acriflavina
Clorhidrato de acriflavina 0.25 g

Disolver el clorhidrato de acriflavina en agua, y esterilizar por filtración.
148
1.5 Solución de citrato amoniacal férrico
Citrato amoniacal férrico 5.0 g

Disolver el citrato amoniacal férrico en agua, y esterilizar por filtración.
1.6 Medio completo
Caldo Base (1.1) 100 ml

Solución de cloruro de litio (1.2) 1.0 ml
Solución de sal sódica de ácido nalidíxico (1.3) 0.1 ml
Solución clorhidrato de acriflavina (1.4) 0.5 ml
Solución de citrato amoniacal férrico (1.5) 1.0 ml
Inmediatamente antes del uso agregar las cuatro soluciones (de 1.2 a 1.5) a
100 ml del medio base (1.1)
2. Caldo Fraser (FB)
2.1 Caldo Base
Peptona de carne (digesto péptico de tejido animal) 5.0 g

Triptona (digesto péptico de caseína) 5.0 g
Esculina 1.0 g
Disolver los componentes en agua destilada y fraccionar en tubos, en porciones

de 10 ml. Ajustar el pH, si es necesario, para obtener un valor de 7.2 ± 0.2 a
25ºC después de la esterilización. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. NO
SOBRECALENTAR. Enfriar después de esterilizar. Si el medio se oscurece o
ennegrece, fue sometido a sobrecalentamiento y debe ser descartado. Guardar
en refrigeración.
2.2 Solución de clorhidrato de acriflavina

Ver 1.4
2.3 Solución de citrato amoniacal férrico

Ver 1.5
2.4 Medio completo

Inmediatamente antes del uso agregar a cada tubo con 10 ml de medio base
(2.1) 0.1 ml de solución de clorhidrato de acriflavina (2.2) y 0.1 ml de solución de
citrato amoniacal férrico (2.3). Mezclar suavemente
149
3. Agar Listeria de acuerdo a Ottaviani y Agosti (ALOA)
(Es aceptable la utilización de otro medio disponible en el comercio de igual
fórmula)
3.1 Medio base

Glucosa 2.0 g
Glicerofosfato de magnesio 1.0 g
Sulfato de magnesio (anhidro) 0.5 g
5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-glucopiranósido 0.05 g
Agar 12 g a 18 g a
Agua destilada 930 ml b
a
dependiendo del poder gelificante del agar
b
926 ml si se utiliza la solución de Anfotericina B

deshidratado en agua destilada llevando a ebullición, con constante agitación,
minutos

Solución de hidróxido de sodio 0.05 mol/ l de solución 5.0 ml
Disolver la sal de ácido nalidíxico en el hidróxido de sodio, y esterilizar por
filtración.
3.3 Solución de Ceftazidima
Ceftazidima 0.02 g
Disolver la ceftazidima en agua, y esterilizar por filtración con membrana de
0.45 µm
3.4 Solución de Polimixina B
Polimixina B 76 700 IU
Disolver la polimixina B en agua, y esterilizar por filtración con membrana de
0.45 µm
150
3.5 Suplemento de antibiótico
3.5.1 Solución de cicloheximida
Cicloheximida 0.05 g
Metanol 2.5 ml
Disolver la cicloheximida en el metanol y luego agregar el agua. Esterilizar por
filtración con membrana de 0.45 µm
3.5.2 Solución de anfotericina B (como alternativa de la solución de

cicloheximida)
Anfotericina B 0.01 g
HCl (1mol/l) 2.5 ml
Dimetilformamida (DMF) 7.5 ml
Disolver la anfotericina en la solución de HCl/DMF. Esterilizar por filtración con
membrana de 0.45 µm
PRECAUCION: La solución de HCl / DMF es tóxica, manipular con cuidado.
3.6 Suplemento
Disolver 2 g de L-α- fosfatidil inositol (Sigma P6636) ® en 50 ml de agua fría.

Mezclar alrededor de 30 minutos hasta obtener una suspensión homogénea.
Autoclavar a 121°C durante 15 minutos, y enfriar a 48°C - 50°C.
NOTA: Sigma P6636 es una marca comercial. Se puede utilizar un producto

equivalente que demuestre tener el mismo resultado.
3.7 Medio completo
Medio base (3.1) 930 ml a

Solución de sal sódica de ácido nalidíxico (3.2) 5 ml
Solución de ceftazidima (3.3) 5 ml
Solución de polimixina B (3.4) 5 ml
Solución de cicloheximida (3.5.1) o 5 ml
Solución de anfotericina B (3.5.2) 10 ml
Suplemento (3.6) 50 ml
a
925 ml si se utiliza solución de Anfotericina B
Agregar las correspondientes soluciones al medio fundido y enfriado a
aproximadamente a 50°C. Mezclar suavemente entre ca da adición. El pH del
medio completo debe ser de 7.2 ± 0.2 a 25°C. El med io es homogéneamente
opaco.
En cada placa de Petri agregar de 15 ml a 20 ml del medio recientemente
preparado y dejar solidificar.
151
4. Agar Triptona soja extracto de levadura (TS-YEA)
Caldo triptona soja 1 30.0 g

Agar 9.0 18.0 g 2
1
Triptona 17.0 g
Peptona de soja 3.0 g
Glucosa 2.5 g
2

deshidratado en agua destilada, llevando a ebullición con constante agitación,
minutos.
Fraccionar el medio en tubos de capacidad adecuada, esterilizar a 121°C
durante 15 minutos, y dejar solidificar en posición inclinada para obtener un
pico de flauta.
Para la preparación de las placas, en cada placa de Petri agregar de 15 ml a 20
ml del medio y dejar solidificar.
.
5. Caldo Triptona soja extracto de levadura (TS-YEB)
Caldo triptona soja 1 30.0 g

1
Triptona 17.0 g
Glucosa 2.5 g

deshidratado en agua destilada calentando, si es necesario. Ajustar el pH, si es
esterilización. Fraccionar el medio en tubos de capacidad adecuada. Esterilizar
a 121°C durante 15 minutos.
152
6.1 Agar Base

Digestivo de hígado 2.5 g
Agar 9.0 a 18.0 g 1
Agua 1000 ml
1
Disolver los componentes en agua destilada calentando con constante

agitación, hasta completa disolución. Ajustar el pH, si es necesario, para
obtener un valor de 7.2 ± 0,2 a 25°C después de la esterilización. Fraccionar
en frascos de capacidad adecuada. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
6.2 Sangre desfibrinada de oveja
6.3 Medio completo
Base (6.1) 100 ml

Sangre desfibrinada de oveja (6.2) 5 ml a 7 ml
Agregar la sangre al medio base previamente fundido y enfriado a aprox. 47°C
y mezclar bien. Dispensar en placas de Petri y dejar solidificar.
7. Suspensión de glóbulos rojos de oveja
Mantener los glóbulos rojos de oveja a 3°C ± 2°C an tes del uso. Antes de
utilizar, examinar la presencia de señales de hemólisis (enrojecimiento) en la
capa superior del suero. Si no hay signos de hemólisis, introducir 2 ml de la
capa inferior de los glóbulos rojos en 98 ml de buffer PBS.
Si hay signos de hemólisis, suspender aproximadamente 4 ml de la capa de
glóbulos rojos en 10 ml de buffer PBS, mezclar suavemente y luego centrifugar.
Si el líquido sobrenadante toma color rojo debido a una hemólisis significante,
descartar la suspensión. Si no toma color rojo, descartar el líquido
sobrenadante y agregar 2 ml de la suspensión de glóbulos rojos a 98 ml de
buffer PBS.
Mantener la suspensión hasta 5 días a 3°C ± 2°C. De scartar cuando ocurre
hemólisis.
153
8. Caldo para utilización de carbohidratos (ramnosa y xilosa)
8.1 Caldo base
Proteasa peptona 10.0 g

Disolver los componentes en agua destilada con calentamiento, si es

necesario. Ajustar el pH, si es necesario, para obtener un valor de 6.8 ± 0.2 a
25°C después de la esterilización. Fraccionar en tu bos de capacidad adecuada
y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minut os.
8.2 Solución de carbohidratos
Carbohidrato (L-ramnosa o D-xilosa) 5.0 g

Disolver separadamente cada carbohidrato en agua y esterilizar por filtración
8.3 Medio completo
Para cada carbohidrato, agregar asépticamente x ml de solución (8.2) a 9 x ml

de caldo base (8.1)
9. Agar movilidad

Agar 3.5 g

completa disolución. Ajustar el pH, si es necesario, para obtener un valor de
7.3 ± 0.2 a 25°C después de la esterilización. Frac cionar en tubos en cantidad
de 5 ml aproximadamente. Esterilizar a 121°C durant e 15 minutos.
10. Medios y cepas para la prueba de CAMP
Para este test se pueden utilizar las placas de agar sangre del punto 6.0, pero
es preferible utilizar agar doble capa con una delgada capa de agar sangre.
10.1 Agar Base

Ver 6.1
154
10.2. Agar sangre de oveja
Ver 6.3
10.3. Medio completo
Dispensar 10 ml del medio base (6.1) en una placa de Petri, y dejar solidificar.
Volcar una capa muy fina de agar sangre (6.3) utilizando una cantidad no
mayor de 3 ml por placa. Dejar solidificar
Si el agar sangre es agregado a placas de agar base preparadas con
anticipación, puede ser necesario calentar las placas por 20 min. en estufa a
37°C antes de volcar la capa de agar sangre.
10.4. Cepas para la prueba de CAMP
10.4.1. Cepas β-hemolíticas de S.aureus: ej. NCTC 1803 ó ATCC 25923

10.4.2. Cepas de R.equi: ej. NCTC 6121 ó ATCC 6939
10.4.3. Cepas de L. monocytogenes: ej. ATCC 19111, NCTC 7973 u otro
cultivo de L. monocytogenes validado.
10.4.4. Cepas de L innocua: ej. ATCC 33090 u otro cultivo de L. innocua
validado
10.4.5. Cepas de L. ivanovii
11. Solución de peróxido de hidrógeno
Utilizar al 3 % (m/m), ej. 10 volúmenes
12. Buffer fosfato salino (PBS)

Sodio dihidrógeno fosfato (KH2PO4) 2.71 g
Disolver los componentes en agua destilada. Ajustar el pH, si es necesario,
para obtener un valor de 7.2 ± 0.2 a 25°C después d e la esterilización.
155
ANEXO 3: Fotos
1. Agar Listeria Ottaviani Agosti (ALOA)
Listeria monocytogenes: colonias típicas color verde-azulado rodeadas por un

halo opaco.
2. Agar PALCAM
Listeria monocytogenes: colonias típicas color verde-oliva rodeadas por un halo

negro.
156
5. REFERENCIAS
INTERNATIONAL STANDARD. ISO 11290-1: Microbiology of Food and animal

feeding stuffs. Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria
monocytogenes. Part 1: Detection. First edition 1996-12-15. AMENDMENT1
2004-10-15: Modification of the isolation media and the haemolysis test, and
inclusion of precision data.
157
Enterobacter sakazakii
(Cronobacter spp.)
en fórmulas infantiles en polvo
1. Generalidades y nomenclatura
Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) es una bacteria Gram - negativa que

no forma esporas, perteneciente a la familia Enterobacteriaceae. Fue llamada
originalmente “Enterobacter cloacae de pigmentación amarilla” hasta 1980
cuando fue renombrada Enterobacter sakazakii. En el año 2008 CODEX
reconoce un cambio en la nomenclatura, ya que por estudios moleculares
independientes (incluyendo “f – AFLP”, “automated ribotyping, “full- length 16S
rRNA gene sequencing” e hibridación de DNA) demostraron que Enterobacter
sakazakii comprende por lo menos 6 especies, por lo que se resuelve la
creación del género Cronobacter constituido por 5 especies, 1 genomoespecie
y 3 subespecies.
- Cronobacter sakazakii (biogrupos 1-4, 7, 8, 11, 13)
- Cronobacter malonaticus (biogrupos 5, 9, 14)
- Cronobacter muytjensii (biogrupo 15)
- Cronobacter turicensis (biogrupo 16)
- Cronobacter dublinensis (biogrupos 6, 10, 12)
C. dublinensis subesp. dublinensis (biogrupo 12)
C. dublinensis subesp. lausannensis (biogrupo 10)
C. dublinensis subesp. lactaridi (biogrupo 6)
La creación de un nuevo género simplifica la inclusión de estos organismos

potencialmente patógenos en la legislación (el género propuesto Cronobacter
es sinónimo de Enterobacter sakazakii) y los esquemas de identificación
actuales desarrollados para Enterobacter sakazakii siguen siendo aplicables
para el género de Cronobacter. Es necesario ser conscientes de la existencia
de las especies múltiples dentro de este grupo del organismo, para interpretar
correctamente las pruebas de aislamiento e identificación, especialmente
cuando estas se basan en métodos moleculares. (1)(2)
2. Epidemiología
Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) ha surgido recientemente como

patógeno en los lactantes. En las reuniones de expertos de FAO/OMS se
determinó que el grupo de todos los lactantes (< de 12 meses de edad) era la
población expuesta a especial riesgo de infección por Enterobacter sakazakii
158
(Cronobacter spp.). En este grupo, los neonatos (< de 28 días) presentan el
mayor riesgo de infección, especialmente los prematuros, los lactantes con
bajo peso al nacer (< 2500 g) y los inmunodeficientes, al igual que los lactantes
menores de 2 meses. Los lactantes cuyas madres son seropositivas al VIH
también corren riesgo, porque es posible que requieran específicamente
preparados para lactantes y también que sean más vulnerables a las
infecciones.
Se han documentado casos por Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.)
tanto casos esporádicos como brotes, donde las manifestaciones clínicas de la
infección se presentan en forma de sepsis, meningitis, cerebritis y enterocolitis
necrotizante.
Si bien la incidencia de estas infecciones por Enterobacter sakazakii
(Cronobacter spp.) en los lactantes parece ser baja, sus consecuencias pueden
ser graves. Las principales manifestaciones por Enterobacter sakazakii
(Cronobacter spp.) en los lactantes, meningitis y bacteriemia, tienden a variar
según la edad. La meningitis causada por Enterobacter sakazakii (Cronobacter
spp.) tiende a presentarse en los lactantes durante el período neonatal,
mientras que la bacteriemia aparece, sobre todo, en los lactantes prematuros
fuera del período neonatal y en la mayoría de los casos antes de los 2 meses
de edad. Sin embargo, en los lactantes con inmunodeficiencia la bacteriemia se
ha presentado hasta los 10 meses de edad; y lactantes anteriormente sanos
también han presentado enfermedad invasiva fuera del período neonatal. Las
infecciones se han presentado tanto en hospitales como en entornos
ambulatorios.
Los índices de mortalidad notificados en los lactantes para las infecciones por
Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) varían considerablemente, con
índices tan altos como 50% de mortalidad en, al menos, un brote epidémico.
Además, un porcentaje de los lactantes sobrevivientes queda con
discapacidades permanentes, tales como retraso mental y otras enfermedades
neurológicas (3) (4).
3. Fuente de infección
Aunque en algunos de los casos se determinó que los preparados en polvo

eran la fuente de E. sakazakii (Cronobacter spp.), en muchos otros no se
indicaron como fuente de la infección, ni desde el punto de vista epidemiológico
ni microbiológico. No obstante, en esos casos tampoco se determinaron otras
fuentes desde ninguna de las dos perspectivas. Debido a la gran difusión de E.
sakazakii (Cronobacter spp.) es posible que los lactantes, los niños y los
adultos estén expuestos a dicho organismo en una variedad de fuentes.
Los brotes epidémicos de infección por E. sakazakii (Cronobacter spp.) han
llevado a establecer su vinculación con los preparados en polvo para lactantes,
especialmente en entornos de cuidado intensivo para neonatos. Se sabe que
E. sakazakii (Cronobacter spp.) está presente en bajas concentraciones en un
porcentaje de estos preparados. Aunque el microorganismo ha sido detectado
en otros tipos de alimentos y entornos ambientales, sólo los preparados para
lactantes se han vinculado con brotes epidémicos.
E. sakazakii (Cronobacter spp.) puede introducirse en los preparados en polvo
por cuatro vías:
159
1) a través de los ingredientes añadidos en las operaciones de mezclado en
seco, durante la fabricación del preparado;
2) por contaminación del preparado a partir del ambiente de elaboración,
durante las operaciones de secado o después de estas;
3) por contaminación del preparado tras la apertura del envase; y
4) durante la reconstitución del preparado que efectúa la persona que se ocupa
del lactante, previamente a su administración, o después de haberlo
reconstituido. (3)(4)
4. Prevención
En los lactantes expuestos a mayor riesgo, por ejemplo, en situaciones de

cuidado neonatal intensivo, deberían usarse preparados líquidos esterilizados
comercialmente siempre que estén disponibles, a menos que el médico que los
atiende recomiende algo distinto. Si se escoge una opción alimenticia sin
esterilidad comercial, debe usarse un procedimiento de descontaminación
eficaz en el lugar de uso.
Las iniciativas de prevención deben ser multifacéticas, dirigidas a los
fabricantes, a los proveedores de atención médica y a las guarderías, así como
a las personas encargadas del cuidado de lactantes en el hogar, y deben tomar
en consideración el riesgo que corren los lactantes tanto durante el período
neonatal como después de él.
El etiquetado del producto, los programas de educación del consumidor y la
capacitación del personal en los hospitales deberían actualizarse, según
corresponda, para brindar la información adecuada a las personas encargadas
del cuidado de los lactantes sobre el uso inocuo del producto, y para
proporcionar advertencias sobre los peligros para la salud, que se derivan de la
preparación y manipulación incorrectas de los preparados en polvo para
lactantes. (3)
5. Normativa Nacional
5.1 Criterios microbiológicos

En el Código Alimentario Argentino (C.A.A), por una modificación en el artículo
1340 que entró en vigencia en el año 2007, se actualizaron los criterios
microbiológicos para productos destinados a lactantes y niños de corta edad (
artículo 1340: incisos E-A1 y E-A2). Por dicha incorporación, se establece el
criterio microbiológico para E. sakazakii (Cronobacter spp.) en productos para
lactantes que han de consumirse después de añadir un líquido, para la
población de 0 a 6 meses. (5)
160
E) PRODUCTOS PARA LACTANTES Y NIÑOS DE CORTA EDAD:
E-A1: Productos para lactantes que han de consumirse después de añadir

un líquido para la población de 0 a 6 meses
Parámetro Criterio de aceptación Metodología

Recuento de aerobios mesófilos
n=5, c=2, m=103, M=104 ICMSF
(ufc/g) *
Recuento de Enterobacterias
n=10, c=2, m<3, M=10 ISO 21528-1:2004
(NMP/g)
Salmonella spp. / 25g n= 30, c=0, Ausencia ISO 6579: 2002
Detección de Enterobacter
n=30, c=0, Ausencia ISO 22964: 2006
sakazakii / 10 g
(*) No aplicable a los productos alimenticios en cuya elaboración intervienen
procesos de fermentación por bacterias lácticas
E-A2 Productos para niños de corta edad que han de consumirse después
de añadirse un líquido para la población de 6 a 12 meses
Parámetro Criterio de aceptación Metodología (1)

n=5, c=2, m=103, M=104 ICMSF
(ufc/g) *
Recuento de Enterobacterias
n=10, c=2, m<3, M=10 ISO 21528-1:2004
(NMP/g)
Salmonella spp. / 25g n= 30, c=0, Ausencia ISO 6579: 2002
(*) No aplicable a los productos alimenticios en cuya elaboración intervienen

procesos de fermentación por bacterias lácticas
a. Implementación de un Sistema de HACCP
En el artículo 1346 bis del C.A.A, incorporado en el año 2008, se establece la

obligatoriedad de la implementación de un Sistema de HACCP para los
establecimientos que elaboren/industrialicen y/o fraccionen alimentos en polvo
para lactantes y en el artículo 18 bis del C.A.A. se establecen las Directrices
para la aplicación de un Sistema de HACCP.
Artículo 1346 bis - (Res Conj. SPReI y SAGPyA N° 87 / 2008 y N° 340 / 2008).
“Todo establecimiento que elabore/industrialice y/o fraccione alimentos en
polvo para lactantes, incluidos en las Categorías a y b del Artículo 1353 del
C.A.A., que requieran ser reconstituidos para su consumo, deberá implementar
un Sistema de Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control (HACCP) de
161
acuerdo a las directrices que constan en el Artículo 18 bis del presente
Código.”(5)
Referencias:
1. CODEX. Alinorm 08/31/8. Mayo del 2008. Enmiendas a las normas y a

los textos afines del CODEX.
2. The taxonomy of Enterobacter sakazakii: proposal of a new genus
Cronobacter gen. nov. and descriptions of Cronobacter sakazakii comb.
nov. Cronobacter sakazakii subsp. sakazakii, comb. nov., Cronobacter
sakazakii subsp. malonaticus subsp. nov., Cronobacter turicensis sp.
nov., Cronobacter muytjensii sp. nov., Cronobacter dublinensis sp. nov.
and Cronobacter genomospecies 1: http://www.biomedcentral.com/1471-
2148/7/64
3. Código de prácticas de higiene para los preparados en polvo para

lactantes y niños pequeños. CAC/RCP 66-2008
4. Enterobacter sakazakii and other microorganisms in powdered infant

formula. Microbiological Risk Assessment Series. 6:
http://www.who.int/foodsafety/publications/micro/mra6/en/
5. Código Alimentario Argentino:

http://www.anmat.gov.ar/alimentos/normativas_alimentos_caa.asp
162
Detección, aislamiento e
identificación de Enterobacter
sakazakii (Cronobacter spp.) en
fórmulas infantiles en polvo y en
leche en polvo
(Procedimiento según Technical Specification ISO/TS 22964:2006)
1. OBJETIVO

aislamiento e identificación de Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) en
leche en polvo y fórmulas infantiles en polvo.
2. ALCANCE

identificación de Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) en fórmulas
infantiles en polvo y leche en polvo.
NOTA: Una vez identificado el microorganismo como Enterobacter sakazakii

(Cronobacter spp.) por propiedades bioquímicas, la cepa debe ser enviada al
Centro de Referencia Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S
“Dr. Carlos G. Malbrán” para una mayor caracterización.
3. DESARROLLO

3.1.2. Caldo lauril sulfato Triptosa modificado + vancomicina
(LSTm/vancomicina)
3.1.3. Agar cromogénico para aislamiento de Enterobacter sakazakii
3.1.4. Triptona soja agar (TSA)
3.1.5. Solución de vancomicina (10 mg en 10 ml)
3.1.6. Prueba de la oxidasa
3.1.8. Caldo ornitina decarboxilasa
3.1.9. Caldo L-arginina dehidrolasa
3.1.10. Medio para fermentación de carbohidratos (D-sorbitol, L-ramnosa, D-
sucrosa, D-melobiosa y amigdalina)
163
3.1.11. Citrato de Simmons
3.1.12. Galería API 20 E, bioMerieux
3.1.14. Autoclave
3.1.15. Estufa de incubación: 25°C ± 1°C, 30°C ± 1° C y 44°C ± 1°C
3.1.16. Baño de agua a 44°C ± 0.5°C
3.1.17. Peachímetro de exactitud 0.1 a 25°C ± 1°C.
3.1.18. Pipetas de 1 ml de capacidad (para medir 0.1 ml)
3.1.19. Ansa de platino o níquel de aproximadamente 3 mm de diámetro
3.1.20. Tubos de ensayo de 18 mm de diámetro y 160 mm de largo con tapa
3.1.21. Placa de Petri de vidrio o plástico de 90 a 100 mm de diámetro
3.2. Principio

3.2.1. Enriquecimiento en medio líquido no selectivo
3.2.2. Enriquecimiento en medio líquido selectivo
3.2.3. Aislamiento en medio selectivo y diferencial
3.2.4. Confirmación bioquímica de colonias sospechosas aisladas.
3.3. Procedimiento
Pesar x g de la muestra en 9x ml de BPW (dilución 1/10). Dejar que la muestra

se disuelva en el líquido, sin agitación. Si al cabo de 30 min la muestra no se
disuelve, mezclar suavemente. Incubar a 37°C ± 1°C, 18 h ± 2 h.
Transferir 0.1 ml del cultivo obtenido en 4.3.1. a 10 ml de LSTm/vancomicina.

Incubar a 44°C ± 0.5°C durante 24 h ± 2 h.
Nota: Se recomienda utilizar baño de agua o estufa de incubación con aire

forzado para asegurar que la temperatura máxima no exceda los 44.5°C.
3.3.3. Aislamiento presuntivo
Tomar un ansada del enriquecimiento 3.3.2. y estriar en una placa de agar

cromogénico para aislamiento de Enterobacter sakazakii. Incubar a 44°C ± 1°C
Después de la incubación examinar la presencia de colonias típicas de
Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.)
Nota: las colonias típicas de Enterobacter sakazakii son de un tamaño

mediano (1 a 3 mm), de color verde a verde azulado. Las colonias no típicas
son generalmente transparentes y de color violeta.
164
3.3.4.1. Producción de pigmento amarillo
Seleccionar 5 colonias presuntivas (si hay menos de 5 colonias seleccionar

todas) del medio obtenido en 3.3.3. y estriar por agotamiento en superficie en
placas de TSA para obtención de colonias aisladas. Incubar las placas a 25°C
± 1°C durante 44 h - 48 h.
Después de la incubación observar la presencia de colonias con pigmento
amarillo.
Nota: Existen algunas cepas raras de Enterobacter sakazakii (Cronobacter

spp.) que no producen pigmento amarillo en las condiciones especificadas en
la técnica, o que pierden el pigmento por subcultivos, por lo tanto para las
colonias sospechosas seleccionadas en el agar cromogénico y que no
producen pigmentación amarilla en TSA, igual se procederá con la
confirmación bioquímica.
3.3.4.2. Confirmación bioquímica
La confirmación bioquímica se realiza a partir de colonias aisladas en TSA. Se

pueden utilizar Kits de pruebas bioquímicas comercialmente disponible
capaces de identificar Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) o realizar
pruebas bioquímicas en tubos.
Oxidasa: en un tubo de hemólisis, preparar una suspensión densa del cultivo

puro en aproximadamente 0.2 ml de agua destilada y colocar un disco del
reactivo o humedecer el disco con agua destilada, y luego colocar sobre el
mismo una porción del cultivo puro con un ansa (no usar ansa de platino ni
níquel). La reacción ocurre en forma inmediata, dentro de los 10 segundos (una
reacción lenta se considera negativa)
Reacción negativa: no hay cambio de coloración.
L-Lisina decarboxilasa: a partir del cultivo puro, inocular con una aguja de
inoculación por debajo de la superficie del caldo. Incubar a 30°C ± 1°C durante
24 h ± 2 h.
Reacción negativa: coloración amarilla.
L-Ornitina decarboxilasa: a partir del cultivo puro, inocular con una aguja de
inoculación por debajo de la superficie del caldo. Incubar a 30°C± 1°C durante
24 h ± 2 h.
L-Arginina dehidrolasa: a partir del cultivo puro, inocular con una aguja de
inoculación por debajo de la superficie del caldo. Incubar a 30°C ± 1°C durante
24 h ± 2 h.
165
Fermentación de azúcares: a partir del cultivo puro, inocular con una aguja de
inoculación por debajo de la superficie del caldo. Incubar a 30°C ± 1°C por 24 h
± 2 h.
Reacción positiva: coloración amarilla
Reacción negativa: coloración violeta.
Utilización de Citrato: a partir del cultivo puro, inocular con una aguja de
inoculación por estría en la superficie inclinada del medio. Incubar a 30°C ± 1°C
Reacción positiva: cambio del color del medio del verde al azul.
3.3.5. Interpretación de los resultados de las pruebas bioquímicas
Porcentaje de cepas de Enterobacter

Test Resultado
sakazakii con el resultado indicado
Pigmentación amarilla en
+ >99
TSA
Oxidasa - >99
L-Lisina decarboxilasa - >99
L-Ornitina decarboxilasa + ± 90
L-Arginina dehidrolasa + >99
Utilización de citrato + >95
Fermentación de:
D-Sorbitol - ± 95
L-Ramnosa + >99
D-Sucrosa + >99
D-Melobiosa + >99
Amigdalina + >99
Junto con la muestra, sembrar un control positivo con un inóculo bajo de una
cepa de Enterobacter sakazakii de referencia y proceder de la misma manera
que la muestra para demostrar que el cultivo positivo es recuperado.
Se informa presencia o ausencia de Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.)

en la porción de muestra analizada (por gramos o mililitros para muestras
líquidas).
166
4. ANEXOS
ANEXO 1: Diagrama de flujo del procedimiento para la detección de E.

sakazakii (Cronobacter spp.)
Preenriquecimiento: x g de muestra + 9 x ml de BPW (dilución

1/10). Incubar a 37°C ± 1°C, 18 h ± 2 h
Enriquecimiento selectivo: transferir 0.1 ml de BPW en 10 ml

de LSTm+ V. Incubar a 44°C ± 0.5°C, 24 h ± 2 h
Aislamiento: a partir de LSTm+V sembrar un ansada por

agotamiento en superficie en agar cromogénico para E.
sakazakii. Incubar a 44°C ± 1°C, 24 h ± 2 h.
Seleccionar colonias típicas y estriar en agar TSA para

producción de pigmento amarillo. Incubar a 25°C ± 1°C, 48 h
± 4 h.
Confirmación bioquímica de colonias con pigmento amarillo de

TSA y colonias típicas del agar cromogénico para E. sakazakii.
167
ANEXO 2: Medios de cultivos, propiedades bioquímicas y reactivos
1. Agua peptona bufferada ( BPW)
Peptona (enzimática) de caseína 10.0 g


2. Caldo lauril sulfato triptosa modificado + vancomicina

(LSTm)
2.1 Caldo lauril sulfato triptosa modificado

Digesto enzimático de tejido animal y vegetal 20.0 g
Lactosa (C12H22O11) 5.0 g
Lauril sulfato de sodio (C12H25NaO5S) 0.1 g

0.2 a 25°C. Distribuir 10 ml de LSTm en tubos de 18 mm x 160mm. Esterilizar a
121°C durante 15 minutos.
2.2 Solución de vancomicina
Vancomicina 10 mg
Disolver la vancomicina en agua destilada, mezclar y esterilizar por filtración.

Conservar entre 0°C a 5°C hasta 15 días.
2.3 Caldo lauril sulfato triptosa modificado + vancomicina (LSTm)
Agregar 0.1 ml de la solución de vancomicina (2.2) a 10 ml del caldo LSTm (2.1)

para obtener una concentración final de vancomicina de 10 µg por ml de LSTm.
El medio completo de LSTm + vancomicina puede ser conservado entre 0°C a
5°C por un día.
168
3. Agar para aislamiento de Enterobacter sakazakii (ESIA)
Peptona (pancreática) de caseína 7.0 g

Desoxicolato de Sodio 0.6 g
5-Bromo-4-cloro-3-indol ά-D-glucopiranósido (C14H15BrClNO6) 0.15 g
Cristal Violeta 2 mg
Agar 12.0 a 18.0 g*

a 7.0 ± 0.2 a 25°C. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar entre 44°C y
47°C y agregar aproximadamente 15 ml de ESIA en pla cas de Petri. Dejar
enfriar.
El medio puede ser conservado entre 0°C y 5°C hasta 14 días.
4. Triptona soja agar

Agar 12.0 a 18.0 g*

a 7.3 ± 0.2 a 25°C. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar entre 44°C y
47°C y agregar aproximadamente 15 ml de TSA en plac as de Petri. Dejar
enfriar.
5. Reactivo para el test de la Oxidasa
N, N, N´, N´- t etrametil-p-fenilendiamina diclorohidrato (C10H16N2.2HCl) 1.0 mg

Disolver los componentes en agua inmediatamente antes del uso

Agua 1000 ml
169
Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario. Ajustar el pH, si
es necesario, para obtener un valor de 6.8 ± 0.2 a 25°C después de la
7. Medio para L – Ornitina decarboxilasa
L-Ornitina monoclorhidrato (C6H12N2O2.HCl) 5.0 g

Agua 1000 ml

Esterilizar a 121°C durante 15 durante minutos.
8. Medio para L-Arginina dehidrolasa
L-Arginina monoclorhidrato (C6H14N4O2.HCl) 5.0 g

Agua 1000 ml

9. Medio para fermentación de hidratos de carbono
9.1 Medio base

Rojo fenol 0.02 g
Agua 1000 ml
Disolver los componentes en agua agitando si es necesario. Ajustar el pH, si es

esterilización. Fraccionar el medio en tubos y esterilizar a 121°C durante 15
minutos.
170
9.2 Solución de carbohidratos
(D-sorbitol, L-ramnosa, D-sucrosa, D-melobiosa o amigdalina)
Carbohidrato 8g
Agua 100 ml
Para cada solución disolver el respectivo carbohidrato en agua y esterilizar por

filtración.
9.3 Medio completo para fermentación de hidratos de carbono
Medio base ( 9.1) 875 ml

Solución de carbohidrato (9.2) 125 ml
Para cada carbohidrato agregar asépticamente la respectiva solución en el

medio base. Fraccionar 10 ml del medio completo en tubos de 18 mm x 160
mm.
10. Medio citrato de Simmons
Citrato de sodio (Na3C6H5O7) 2.0 g

Amonio dihidrógeno fosfato (NH4H2PO4) 1.0 g
Agar 8.0 g a 18.0 g *
Disolver los componentes en agua destilada llevando a ebullición. Ajustar el
pH, si es necesario, para obtener un valor de 6.8 ± 0.2 a 25°C después de la
2.5 cm de profundidad.
171
ANEXO 3: FOTOS
1. Agar TSA
Enterobacter sakazakii: colonias con pigmento amarillo.
2. Agar cromogénico
Enterobacter sakazakii: colonias típicas de tamaño mediano (1 a 3 mm), de

color verde a verde azulado
172
5. REFERENCIAS
Technical Specification. ISO/TS 22964. IDF/RM 210. Milk and Milk Products -
Detection of Enterobacter sakazakii. First edition 2006-02-0.
173
Este Manual ha sido preparado por integrantes del
Grupo Técnico de Microbiología de la RENALOA
Redacción:
- Lic. María del Carmen Alcaide. Servicio de Microbiología, INAL -
ANMAT
- Bioq. María Josefina Cabrera. Servicio de Microbiología, INAL –
ANMAT
Revisión técnica
- Bioq. Mariela Darré. Dirección de Bromatología de la Provincia
de Chaco
- Bioq. María Susana Condorí. Dirección de Bromatología de la
Provincia de Tucumán
- Bioq. Marcela López. Laboratorio Regional de Salud Ambiental
Cinco Saltos
- Lic. Verónica Trevisán. Departamento Laboratorio
Microbiológico del Instituto Biológico
"Dr Tomás Perón" de La Plata
- Med. Vet. Cecilia Peirano Departamento Laboratorio
Microbiológico del Instituto Biológico "Dr Tomás Perón" de La
Plata
- Lic. Stella Maris Reffi. Departamento Laboratorio Microbiológico
del Instituto Biológico
"Dr Tomás Perón" de La Plata
- Diana Verónica Benegas. Laboratorio Bromatológico Dr. G.
Montes, Mercado de Abasto de Río Cuarto
- Lic. Nancy Passalacqua. CEPROCOR
- Med. Vet. María Noel Olivera. Servicio de Microbiología, INAL -
ANMAT
- Lic. María Soledad Sarniguet. Servicio de Microbiología, INAL -
ANMAT
- Lic. Fernando Trinks. Servicio de Microbiología, INAL - ANMAT
Revisión editorial y edición

- Lic. Martín Fernandez
- Lic. Juan Pablo Maseda
- Lic. Fernando Trinks
INDICE
Bacillus cereus en alimentos pág. 5
Recuento de Bacillus cereus en muestras de alimentos. pág. 11

Técnica de recuento en placa. Procedimiento según
International Standard Organization ISO 7932: 2006
Bacillus cereus. Detección y enumeración por la técnica pág. 30

de número más probable (NMP) en muestras de
alimentos. Procedimiento según International
Standard Organization ISO 21871:2006
Clostridium perfringens en alimentos pág. 55
Recuento de Clostridium perfringens en muestras de pág. 62

alimentos. Técnica de recuento en placa.
Procedimiento según International Standard
Organization ISO 7937: 2004
Stahylococcus aureus en alimentos pág. 85
Recuento de Estafilococos coagulasa positiva en pág. 91

muestras de alimentos. Técnica de recuento en placa.
Procedimiento según International Standard
Organization ISO 6888-1: 1999
Recuento de Estafilococos coagulasa positiva en pág. 109

muestras de alimentos. Técnica de recuento en placa.
Procedimiento según International Commission on
Microbiological Specifications for Foods (ICMSF)
Estafilococos coagulasa positiva. Detección y pág. 110

enumeración por la técnica de número más probable
(NMP) en muestras de alimentos. Procedimiento
según International Standard Organization ISO 6888-
3: 2003 (corrección 2004)
Estafilococos coagulasa positiva. Detección y pág. 134

enumeración por la técnica de número más probable
(NMP) en muestras de alimentos. Procedimiento
según International Commission on Microbiological
Specifications for Foods (ICMSF)
Bacillus cereus
Bacillus cereus
Bacillus cereus en alimentos
1. Generalidades
Bacillus cereus es un microorganismo Gram positivo, con forma de

bastón, anaerobio facultativo y esporoformador. Por tinción de Gram
se observan bacilos positivos grandes de extremos rectos, aislados,
en pares o cadenas, la mayoría móvil por flagelos perítricos.
Las condiciones óptimas para su crecimiento son de 30°C a 40ºC, con
un rango de crecimiento entre 4°C y 55ºC. Es mesófilo, pero existen
cepas psicrótrofas.
El pH óptimo para el desarrollo es entre 6.0 y 7.0, con un mínimo de
5.0 y un máximo de 8.8.
(1)
La actividad acuosa (aw) mínima para su desarrollo es 0.93 .
La capacidad de esporular es una característica importante, porque
estas estructuras confieren a la bacteria resistencia a condiciones
adversas, de esta manera pueden seguir viables a pesar de que las
células vegetativas hayan sido destruidas. Luego, si las condiciones
son las apropiadas, la espora germina y el microorganismo puede
crecer. La espora se desarrolla en forma central o subterminal sin
deformación del esporangio. Para la germinación de las esporas,
algunas cepas necesitan activación por calor (shock térmico), una
opción es por calentamiento a 80°C durante 10 minutos. Esta
propiedad es utilizada en algunas técnicas analíticas y es de
importancia a la hora de establecer el origen de algunos brotes de
ETA causados por este microorganismo.
Es resistente a la penicilina y más resistente que otros
microorganismos esporulados al tratamiento con ácido peracético, el
cual se usa como alternativa al peróxido de hidrógeno en el
tratamiento de los envases para envasado aséptico de alimentos (3).
2. Taxonomía
Debido a la gran diversidad del género, la clasificación es compleja.

Actualmente, la jerarquía taxonómica es: Reino: Bacteria; División:
Firmicutes (bajo contenido G+C); Clase: Bacilli; Orden: Bacillales;
Familia: Bacillaceae; Género: Bacillus; Subgrupo I: Grupo Bacillus
cereus sensu lato. A este subgrupo también pertenecen: B. anthracis,
B. mycoides, B. pseudomycoides, B. thuringiensis, B.
weihenstephanensis (1, 2).
5
Bacillus cereus
Es considerado un patógeno de riesgo moderado directo, de

diseminación limitada, categoría 8 de la clasificación de la I.C.M.S.F.
(4)
. La distribución del microorganismo es universal. Es una bacteria
ubicua, encontrándose en suelo, polvo, ambiente, de fácil
propagación a vegetales. También se ha encontrado en otros tipos de
alimentos debido a contaminación cruzada. No se transmite de
persona a persona, pero sí puede multiplicarse en el alimento. Se
sabe que gran parte de los alimentos e ingredientes están
contaminados con esta bacteria, pero no alcanzan la dosis infectiva,
la cual es de aproximadamente 105 UFC/g (5). Se considera que un
alimento que contenga más de 104 UFC/g de B. cereus podría no ser
seguro para su consumo (1).
La portación asintomática en el hombre tiene un rango del 13 al 43 %
según la Organización Panamericana de la Salud (6), aunque algunos
autores afirman que su presencia en heces refleja el consumo de
alimentos contaminados, ya que la bacteria no colonizaría el
intestino.
Bacillus cereus causa dos tipos de intoxicaciones, según la toxina
involucrada: síndrome emético y síndrome diarreico. Según la cepa,
producen una u otra toxina, pero hay algunas que tienen la capacidad
de sintetizar las dos. El tipo de enfermedad predominante varía por
regiones geográficas según la distribución de las cepas de Bacillus
cereus y la dieta típica de cada zona.
El síndrome emético es ocasionado por una toxina preformada en el
alimento (1, 7). La toxina involucrada es llamada cereulida o
vomitoxina, es un péptido altamente resistente a los extremos de pH
de 2 y 11, al calor (no se destruye por tratamiento a 121ºC por 90
minutos) y a la acción de enzimas proteolíticas (tripsina y pepsina).
Esta toxina es una molécula proteica pequeña, no antigénica, que se
produce en la fase estacionaria de crecimiento, antes de la
esporulación. Los síntomas se presentan entre una y cinco horas
después de realizada la ingesta, predominando náuseas y vómitos. El
malestar dura de 6 a 24 horas. Este cuadro puede confundirse con el
ocasionado por Staphylococcus aureus. La toxina interfiere en la
actividad mitocondrial y tiene acción inmunomodeladora. Esta toxina
es la más peligrosa de las producidas por Bacillus cereus, junto con la
citotoxina K.
El síndrome diarreico se debe a la germinación in vivo de las esporas
de la bacteria en el intestino con la consecuente producción de
enterotoxinas termolábiles. Suelen aparecer en alimentos mal
refrigerados. Los síntomas aparecen entre las 6 y 8 horas de
realizada la ingesta y duran entre 12 y 24 horas. La sintomatología
principal consiste en diarrea y dolor abdominal y, ocasionalmente,
náuseas y vómitos. Esta intoxicación suele confundirse con la
6
Bacillus cereus
ocasionada por Clostridium perfringens. Las toxinas involucradas son

moléculas proteicas que se elaboran en la fase exponencial de
crecimiento de la bacteria, la toxicidad se pierde después de esta
fase. Según Granum (1), las enterotoxinas involucradas en
intoxicaciones alimentarias son: citotoxina K1 y K2, enterotoxina no
hemolítica (NHE) y, probablemente, hemolisina HBL. Hay otras dos
enterotoxinas (T y FM) que se desconoce si son contaminantes de
alimentos. La presencia de estas toxinas puede determinarse en el
laboratorio por métodos moleculares (PCR) o por ensayos de
citotoxicidad contra líneas celulares que resultaron ser sensibles a las
enterotoxinas diarreicas, tales como Vero (células de riñón de mono)
y CHO (células de ovario de hamster chino).
4. Epidemiología
Ambas intoxicaciones gastrointestinales tienen corto período de

incubación (menos de 12 horas), son sintomáticas (principalmente
diarrea, dolor abdominal, náuseas y vómito) y son autolimitadas, se
resuelven en 12 a 24 horas sin necesidad de tratamiento con
antimicrobianos. En la mayoría de los casos para el tratamiento
alcanza con la hidratación adecuada del paciente durante el proceso.
Para confirmar un caso, es necesario identificar en el alimento
sospechoso Bacillus cereus con un recuento igual o superior a 105
UFC/g; no es suficiente con su identificación en las heces debido a la
posible portación asintomática. Además, hay que tener en cuenta en
el caso del síndrome diarreico que la presencia de los genes de la
toxina en cepas aisladas de Bacillus cereus no prueba la producción in
vivo de la misma.
En general, se admite que debido a la levedad del cuadro y a que la
detección de esta bacteria no se realiza rutinariamente en los
análisis, la incidencia real puede ser mayor que la estimada. Además
hay que tener en cuenta que el cuadro clínico puede confundirse con
el causado por Staphylococcus aureus o Clostridium perfrigens, según
la toxina implicada.
La resistencia térmica de las esporas dificulta su eliminación del
ambiente, relacionando su presencia con fallas en las condiciones
higiénico sanitarias. Muchos alimentos están contaminados con
Bacillus cereus debido a su amplia distribución en el ambiente, pero
su presencia en pequeñas cantidades no suele constituir un problema
ya que no causará enfermedad. Aquellos que son probable fuente de
infección o intoxicación, son los que se conservan a temperatura
ambiente luego de la cocción, lo cual puede permitir el desarrollo de
la bacteria y la producción de toxina preformada en el alimento antes
de su ingestión. Por lo tanto, si la cocción no fue suficiente para
inactivar las células, es la falta de refrigeración inmediata del
alimento lo que permitirá el desarrollo de dicha bacteria. Aunque
7
Bacillus cereus
luego los alimentos se recalienten previamente a su consumo, este

proceso no inactivará las esporas ni la toxina emética que pudo
haberse producido. Por lo cual, la prevención de la enfermedad
requiere del control de la germinación de las esporas y del
crecimiento de las células vegetativas en los alimentos listos para
consumir. Las condiciones que favorecen el desarrollo del
microorganismo incluyen procedimientos que activan las esporas
seguidos de un enfriamiento lento y el almacenamiento de los
alimentos a temperaturas entre 10°C y 50ºC. Para disminuir los
riesgos de intoxicación, los alimentos deben ser refrigerados o
consumidos en caliente, inmediatamente después de la cocción. La
germinación de esporas también puede controlarse por regulación del
pH y la aw.
Alimentos amiláceos como el arroz, papas, pastas y otros están
particularmente asociados a brotes por Bacillus cereus. También las
especias son un importante vehículo de transmisión ya que las
esporas son muy resistentes a la desecación. En productos cárnicos,
la incidencia suele ser mayor debido a que en muchos de ellos se
incorporan aditivos, como las especias, que incrementan el número
de Bacillus cereus. La contaminación de leche con esta bacteria está
muy relacionada a vacas enfermas con mastitis aguda. Alimentos que
poseen leche en polvo en su composición pueden estar altamente
contaminados con esporas, esto es especialmente importante en el
desarrollo de fórmulas para lactantes y niños. Otros alimentos de los
que fue aislada la bacteria son té, postres, legumbres, salsas, sopas,
entre otros.
5. Determinación
Existen ciertas diferencias entre las normas que se utilizan para la

determinación de Bacillus cereus en el laboratorio. Algunas normas
establecen marchas para su determinación muy largas, con una
extensa batería de pruebas bioquímicas. Por el contrario, hay otras
que sólo indican la realización de algunas pocas pruebas debido a la
dificultad de identificar a nivel especie las bacterias del género. Por
este último camino se llega a una determinación “presuntiva” de
Bacillus cereus. En estos casos, la determinación más importante se
considera que es la capacidad hemolítica de la bacteria, ya que se
relaciona esta propiedad con la patogenicidad de la misma (norma
ISO 7932:2004).
6. Legislación
Actualmente, el C.A.A. exige su búsqueda en polvos o mezclas para

preparar postres para helar (Art. 818 bis), en polvo para preparar
helados, preparado básico para helados y similares (Art. 1079 bis),
8
Bacillus cereus
en harinas de trigo (Art. 661 bis), en comidas preparadas listas para

el consumo (Art. 156 tris) y en viandas a domicilio (Art. 151) (8)
Por otro lado, la legislación de otros países pide su búsqueda en otros
alimentos. Por ejemplo en España, hay límites establecidos para
caldos, consomés, sopas y cremas; especias y condimentos; salsa de
mesa; té; preparados para lactantes y alimentos dietéticos para
menores de 6 meses.(9) En Perú, se exige su búsqueda en muchos
alimentos tales como: postres a base de helados, mezclas
deshidratadas para helados, sopas, cremas, salsas y purés
deshidratadas instantáneas y que requieren cocción; en mezclas en
seco de uso instantáneo (refrescos, gelatinas) y que requieren
cocción (flanes); en harinas, almidones y féculas, cereales
instantáneos, productos de panadería congelados listos para su
consumo y en productos deshidratados e instantáneos que requieren
reconstitución o cocción.(10) En Chile, se pide su búsqueda en
fórmulas lácteas, fórmulas para lactantes, mezclas deshidratadas de
uso instantáneo o que requieran cocción, y en comidas y platos listos
para el consumo que contengan arroz(11). La legislación brasileña
también reglamenta su análisis en una amplia variedad de alimentos.
(12)
9
Bacillus cereus
Referencias
(1) Granum, P. E. 2002 Bacillus cereus. En : Food Microbiology
Fundamentals and Frontiers. Doyle, M.P.; Bechaut, L. R.; Montville, T.
J. A&M Press. Washington D.C. USA. Pág: 327 a 336.
(2) Claus, D., Berkeley, R.C.W., 1986. Genus Bacillus. En: Bergey's
Manual of Systematic Bacteriology, vol. 2. The Williams and Wilkins
Co., Baltimore. Pág: 1105-1139.
(3) Blakistone, B. R. Chuyate, D. Kautter, jr., J. Charbonneau, and K.
Suit. 1999. Efficacy of Oxonia Active against selected spore formers.
J. Food Protect. 62: 262-7.
(4) Microorganismos de los Alimentos. Características de los
patógenos microbianos. ICMSF
(5) Adams, M. R.; Moss, M. O. 1995. Food Microbiology. The Royal
Society of Chemistry. Cambridge. USA. Pág. 160 a 164.
(6) Diagnóstico e Investigación Epidemiológica de las Enfermedades
Transmitidas por los Alimentos. Organización Panamericana de la
Salud. Curso virtual. http://www.ops.org.ar/publicaciones/
publicaciones20virtuales/libroETAs/index.html
(7) Rajkowski, K.T., Bennett, R.W., 2003. Bacillus cereus. En:
International Handbook of foodborne Pathogens. Miliotis, M.D., Bier,
J.W. Marcel Dekker, inc. New York, USA.
(8) Código Alimentario Argentino. http://www.anmat.gov.ar/
alimentos/normativas_alimentos_caa.asp
(9) Reglamento (CE) Nº 1441/2007. Diario Oficial de la Unión
Europea. http://cvu.rediris.es/pub/bscw.cgi/d311175/Normicro/
Recopila/normicro.htm
(10) Norma sanitaria Nº 071-MINSA/DIGESA-V.01, “Norma Sanitaria
que establece los Criterios Microbiológicos de Calidad Sanitaria e
Inocuidad para los Alimentos y Bebidas de Consumo Humano”.
Resolución ministerial Nº 591-2008/MINSA. Perú.
(11) Chile. Reglamento Sanitario de los Alimentos.
(12) Resolución 2/1/2001. Reglamento técnico sobre patrones
microbiológicos para alimentos. ANVISA, Ministerio de Salud, Brasil.
(13) Rhodehamel, E.J; Harmon, S.M 1998. Bacillus cereus. En:
Bacteriological Analytical Manual (BAM). Octava Edición, Revisión A.
(14) Fundamento pruebas bioquímicas: Manual de Prácticas de
Microbiología. Evangelina Olivas E. y Luis Roberto Alarcón.
Universidad Autónoma de Ciudad Juárez.
(15) Hobbs, B.C. and Gilbert, R. J. 1974. “Microbiological Counts in
relation to food poisoning”, Proceedings of the IV international
Congress of Food Science Technology 3:159.
10
Bacillus cereus
Recuento de Bacillus cereus en

muestras de alimentos
Técnica de recuento en placa
Procedimiento según
International Standard Organization ISO 7932:2004
1. OBJETIVO
El presente procedimiento tiene como objetivo describir la

metodología llevada a cabo por el Laboratorio de Microbiología para
realizar la enumeración de presunto Bacillus cereus viable por la
técnica de recuento de colonias en placa a 30°C, en muestras de
alimentos y muestras ambientales de las áreas de producción y
manipulación de alimentos.
2. ALCANCE
Este procedimiento se aplica para realizar la enumeración de

presunto Bacillus cereus por la técnica de recuento de colonias en
placa a 30°C en muestras de alimentos y muestras ambientales en el
área de producción y manipulación de alimentos.
Con el fin de tener un método de ensayo práctico, la fase de
confirmación ha sido restringida al aspecto típico de las colonias en
agar MYP y al test de hemólisis.
El término “presunto” se utiliza con el fin de reconocer el hecho que
la fase de confirmación no permite la distinción entre B.cereus y otras
especies de Bacillus estrechamente relacionadas pero aisladas con
menor frecuencia, tales como B. anthracis, B. thuringiensis, B.
weihenstephanensis, B. mycoides.
En caso que se sospeche la presencia de B. anthracis se puede
agregar un test de movilidad para ayudar a diferenciarlo de B.
cereus.
NOTA: las cepas aisladas deben ser enviadas al Centro de Referencia

Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S “Dr. Carlos
G. Malbrán”, para una mayor tipificación.
Normas de referencia: Para la aplicación del presente

procedimiento son indispensables las normas citadas en el punto 5.
“Referencias”
3. DESARROLLO
11
Bacillus cereus
3.1. Definiciones
Para el propósito de este documento, presunto Bacillus cereus es una

bacteria que forma colonias típicas en la superficie del medio de
cultivo selectivo y da una reacción positiva de confirmación bajo las
condiciones especificadas en este procedimiento.
Al parecer muchas, si no la mayoría, de las cepas de Bacillus cereus
germinan rápidamente en la superficie del medio de cultivo usado
para recuento. En la mayoría de los casos no parece ser necesario un
shock térmico para provocar la germinación. A veces un tratamiento
térmico es deseable, por ejemplo para el recuento de esporas o para
inhibir el crecimiento de células vegetativas. En tales casos se
recomienda un calentamiento por 10 minutos a 80°C.

3.2.2. Solución salina peptonada (SFP)
3.2.3. Agar manitol yema de huevo polimixina (MYP) para aislamiento
de Bacillus cereus
3.2.4. Solución de polimixina (106 U.I. en 100 ml)
3.2.5. Emulsión de yema de huevo
3.2.6. Agar base sangre
3.2.7. Sangre de oveja desfibrinada
3.2.9. Autoclave
3.2.10. Estufa de incubación: 30°C ± 1°C
3.2.11. Baño de agua o aparato similar capaz de mantener la
temperatura a 45°C ± 0.5°C y a 50°C ± 1°C,
3.2.13. Pipetas de 1 ml y 10 ml de capacidad, graduadas en
intervalos de 0.1 y 0.5 ml respectivamente
3.2.14. Ansas de platino/irídio o níquel/cromo de aproximadamente 3
mm de diámetro y de punción del mismo material, o equivalentes
estériles descartables.
3.2.15. Tubos de ensayo, botellas o frascos de capacidad apropiada,
en particular de 16 mm x 160 mm o bolsas de plásticos estériles de
capacidad apropiada.
3.2.16. Equipo para mezclado (tipo stomacher)
3.2.17. Agitador mecánico (tipo vortex)
3.2.18. Placas de Petri de vidrio o plástico de 90 a 100 mm de
diámetro o de 140 mm en caso que fuere necesario.
3.2.20. Equipo de filtración para esterilización de soluciones.
3.3. Principio (ver anexo 1)
12
Bacillus cereus
3.3.1. Preparación de la muestra, suspensión inicial y diluciones

decimales sucesivas.
3.3.2. Plaqueo en la superficie de un medio de cultivo selectivo de
una cantidad específica de la muestra problema si es líquida o de la
suspensión inicial si es sólida y de las diluciones decimales sucesivas.
Incubación en aerobiosis a 30°C por 18 h a 48 h.
3.3.3. Cálculo del número de presunto Bacillus cereus por gramo o
mililitro de muestra a partir del número de colonias obtenidas de las
placas que dan resultados significativos y de la confirmación de
acuerdo al test especificado.
3.4. Muestreo
El plan de muestreo a utilizar está fuera del alcance de esta

metodología.
3.5. Procedimiento
3.5.1. Preparación de la muestra, suspensión inicial y

diluciones (ISO 6887-1:1999)
NOTA: Para este punto referir a la norma ISO 6887 – 1 y las normas
específicas para el alimento en cuestión. (Ver punto 5 “Referencias”)
3.5.1.1. Suspensión inicial

En un frasco estéril o bolsa de plástico estéril pesar con una
incertidumbre de medición de ± 5 % una cantidad de masa x g o
medir con una incertidumbre de medición de ± 5 % un volumen x ml
(como mínimo 10 g ó 10 ml a menos que se indique otra cantidad).
Agregar una cantidad del diluyente igual a 9 x g ó 9 x ml (dilución
1/10) y homogeneizar de 1 a 3 minutos dependiendo del alimento.
Para evitar daños de los microorganismos por cambios bruscos de
temperatura, la temperatura del diluyente debería ser aproximada a
la temperatura ambiente.
En el caso de recuento de esporas realizar un tratamiento térmico a
la suspensión inicial, inmediatamente después de su preparación, por
ejemplo 10 minutos a 80°C seguido de un enfriamiento rápido.
NOTA: En algunos casos, particularmente para los productos muy
viscosos o muy espesos, podría ser necesario agregar mayor cantidad
de diluyente lo cual debe tenerse en cuenta en las operaciones
subsiguientes y / o en la expresión de resultados.
3.5.1.2. Diluciones decimales

Transferir con una pipeta 1ml (con una incertidumbre de medición de
± 5 %) de la suspensión inicial en un tubo con 9 ml del diluyente
estéril, para obtener la dilución 10-2.
13
Bacillus cereus
Para una óptima precisión no introducir la pipeta más de 1 cm en la

suspensión inicial y evitar el contacto entre la pipeta que contiene el
inóculo y el diluyente estéril.
Mezclar utilizando preferentemente un agitador mecánico entre 5 y
10 segundos Si es necesario repetir esta operación a partir de la
dilución 10-2 y diluciones sucesivas, utilizando en cada operación una
nueva pipeta estéril para obtener las siguientes diluciones (10-3, 10-4,
etc.). Se realizan las diluciones que sean necesarias para obtener un
número apropiado de microorganismos para realizar el recuento. (Ver
3.5.3.)
3.5.1.3. Duración del procedimiento

El tiempo transcurrido entre el final de la preparación de la
suspensión inicial y el instante en que el inóculo entra en contacto
con el medio de cultivo no debe superar los 45 minutos, mientras que
el lapso de tiempo límite entre la preparación de la suspensión inicial
y el comienzo de la preparación de las diluciones decimales sucesivas
es de 30 minutos.
NOTA: si la temperatura ambiente del laboratorio es muy alta estos
dos lapsos de tiempo deben ser reducidos.
3.5.2. Inoculación e incubación
3.5.2.1. Transferir por medio de una pipeta estéril, 0.1 ml de la

muestra si el producto es líquido ó 0.1 ml de la suspensión inicial
(dilución 1/10), por duplicado, a placas de agar MYP. Si es necesario
repetir el procedimiento para las sucesivas diluciones decimales.
3.5.2.2. Para algunos productos se puede aumentar el límite de
detección por un factor de diez, examinando 1 ml de la muestra
inicial si es líquida ó 1 ml de la suspensión inicial para otros
productos. Distribuir 1 ml del inóculo en la superficie de una placa de
Petri de 140 mm de diámetro con agar MYP o en tres de placas 90
mm de diámetro con agar MYP utilizando una espátula de Drigalsky.
En ambos casos preparar duplicados usando dos placas de 140 mm o
seis placas de 90 mm.
3.5.2.3. Distribuir el inóculo tan pronto como sea posible sobre la
superficie del medio sin tocar los bordes de las placas con una
espátula estéril. Utilizar una espátula para cada placa. Dejar las
placas con la tapa puesta por 15 minutos a temperatura ambiente
para permitir que el inóculo sea absorbido en el agar.
3.5.2.4. Invertir las placas e incubarlas a 30°C entre 18 y 24 horas.
Si no hay colonias claramente visibles, incubar las placas por 24
horas adicionales antes del conteo.
3.5.3. Recuento y selección de las colonias
Después de la incubación por el período especificado, seleccionar las

placas, preferiblemente en dos diluciones sucesivas, en las que el
14
Bacillus cereus
recuento sea menor a 150 colonias, contar en cada placa las colonias
con características de colonias presuntas de Bacillus cereus.
Las colonias presuntas son grandes, rosas (indicando que no ocurre
fermentación del manitol, ver NOTA 1) y generalmente rodeadas de
una zona de precipitación (producción de lecitinasa, ver NOTA 2).
Si hay menos de 15 colonias características en las placas inoculadas
con el producto líquido o con la menor dilución de los otros productos,
es posible realizar un recuento estimado como se indica en el punto
3.5.5.
NOTA 1. Si las placas contienen numerosos organismos
fermentadores de manitol que producen ácido, la característica de
color rosa de las colonias de Bacillus cereus puede reducirse o
desaparecer por completo.
NOTA 2. Algunas cepas de Bacillus cereus producen poco o nada de
lecitinasa. Las colonias deberían también ser sometidas al test de
confirmación.
Si el inóculo de 1 ml fue distribuido sobre tres placas de Petri de 90
mm (ver 3.5.2.2) tratar esas placas como una en el recuento y en el
procedimiento de confirmación.
3.5.4.1. Selección y purificación de las colonias para

confirmación
Elegir cinco colonias presuntas de cada placa seleccionada como en

3.5.3. Si hay menos de cinco colonias en la placa, tomar todas las
colonias presentes. Confirmar esas colonias como se especifica en
3.5.4.2 y 3.5.4.3
Si las placas están con sobrecrecimiento y no es posible seleccionar
colonias bien aisladas, estriar 5 colonias presuntivas en placas con el
medio selectivo (MYP). Incubar las placas a 30°C durante 18 h a 24
h.
Seleccionar de cada placa al menos una colonia bien aislada.
Confirmar como se especifica en 3.5.4.2 y 3.5.4.3.
3.5.4.2. Confirmación por el test de hemólisis en agar sangre

de oveja
Estriar, pinchar o sembrar como mancha las colonias seleccionadas
en 3.5.4.1 a partir de las placas de MYP en la superficie de agar
sangre de oveja de modo de obtener colonias aisladas que permitan
una buena interpretación de la reacción de hemólisis.
Incubar a 30°C durante 24 h y leer la reacción de hemólisis.
Cada colonia rodeada de una zona clara se considera hemólisis
positiva.
3.5.4.3. Interpretación bioquímica

Ver tabla 1
15
Bacillus cereus
Tabla 1
Test Resultado de los test

Formación de colonia rosa
Agar MYP rodeada de precipitado (ver NOTA
1 en 3.5.3.)
Hemólisis Reacción positiva (a)
(a) El ancho de la zona de hemólisis puede variar
3.5.5.1. Recuento de colonias de presunto Bacillus cereus

Informar el recuento de presunto Bacillus cereus en la porción de
muestra analizada (por gramos o mililitros para muestras líquidas).
Ver Anexo 3: Cálculo y expresión de resultados.
3.5.5.2. Placas sin colonias

Si las dos placas correspondientes a la muestra sembrada (productos
líquidos) o a la suspensión inicial (otros productos) no contienen
colonias de presunto Bacilus cereus informar el resultado como
sigue:
Si se sembró 1 ml repartido en 3 placas (ver 3.5.2.2)

- Menos de 1 microorganismo / ml (productos líquidos) ó
- Menos de 1/d microorganismo / g (otros productos) donde d es
el factor de dilución de la suspensión inicial.
Si se sembró 0.1 ml en cada placa

- Menos de 10 microorganismos / ml (productos líquidos) ó
- Menos de 10/d microorganismos / g (otros productos) donde d
es el factor de dilución de la suspensión inicial.
16
Bacillus cereus
4. ANEXOS
ANEXO 1: Diagrama de flujo del procedimiento para recuento

de Bacillus cereus
Preparación de la muestra: x g de muestra + 9 x ml de diluyente

(dilución 1/10)
Inoculación e incubación: transferir por duplicado 0.1 ml de las

diluciones preparadas en placas de Petri con agar MYP, Incubar a
30°C ± 0,5ºC, 18 h a 48 h
Recuento y selección de las colonias características: seleccionar

las placas con menos de 150 colonias características y contar como
presunto Bacillus cereus. Seleccionar 5 colonias características
Confirmación
Selección y purificación de las colonias para confirmación: en agar
MYP a 30°C, 18 h a 24 h
Test de hemólisis en agar sangre de oveja: a 30°C, 24 h ± 2 h
Expresión de resultados
17
Bacillus cereus

Disolver los componentes en agua, si es necesario calentar. Ajustar el

pH a 7.0 ± 0.2 a 25°C. Distribuir en frascos o tubos de acuerdo a las
necesidades analíticas. Esterilizar a 121°C durante15 minutos.
2. Solución salina peptonada (SFP)


3. Agar manitol yema de huevo polimixina (MYP)
3.1. Medio base

D- manitol 10.0 g
Rojo fenol 0.025 g
9 g a 18
Agar
g*
*dependiendo de la firmeza del agar
Disolver los componentes en agua, por calentamiento y agitación.

Ajustar el pH si es necesario para obtener un valor después de la
esterilización de 7.2 ± 0.2 a 25°C. Fraccionar 90 ml del medio en
recipientes de capacidad adecuada. Esterilizar a 121°C durante 15
minutos.
3.2. Solución de sulfato de polimixina B
18
Bacillus cereus
1.000.000 unidades (equivalente a

Sulfato de polimixina B
0.1g aproximadamente)
Disolver el sulfato de polimixina B en agua destilada. Esterilizar por

filtración.
3.3 Emulsión de yema de huevo.
Usar huevos de gallina frescos, limpios y con sus cáscaras intactas.

Lavar los huevos, usando un cepillo, en detergente líquido. Enjuagar
bajo agua corriente, sumergir por 30 segundos en alcohol 70% en
volumen y secar. Usando procedimientos asépticos, romper cada
huevo y separar la yema de la clara por repetidas transferencias de la
yema de una mitad de la cáscara del huevo a la otra. Poner las
yemas en un recipiente con graduación y agregar cuatro partes en
volumen de agua estéril. Transferir asépticamente a un recipiente
estéril y mezclar vigorosamente.
Calentar la mezcla durante 2 h en baño de agua a 44°C - 47°C.
Luego dejar durante 18 h a 24 h a 3°C ± 2°C para permitir que se
forme un precipitado.
Recoger el sobrenadante asépticamente.
La emulsión puede ser guardada a 3°C ± 2°C durante no más de 72
h.
NOTA: Se acordó incluir en este procedimiento la siguiente

modificación a la Norma ISO 7932:2006.
Con el objetivo de aumentar la practicidad de la técnica se incluyen

en este procedimiento dos opciones de Emulsión de yema de huevo
1. En caso de haber disponible se puede utilizar una preparación

comercial
2. Como opcional se puede utilizar el procedimiento del

Bacteriological Analytical Manual para la preparación de la
emulsión yema de huevo
Emulsión de yema de huevo al 50%: Bacteriological Analytical

Manual M51
(http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/
ucm064304.htm)
Lavar los huevos frescos con un cepillo duro y enjuagar bajo corriente
de agua, sumergir por 1 h en etanol al 70% y escurrir. Usando
procedimientos asépticos, romper cada huevo y separar la yema de la
clara por repetidas transferencias de la yema de una mitad de la
19
Bacillus cereus
cáscara del huevo a la otra. Retirar las yemas de huevo con una
jeringa estéril o una pipeta de boca ancha. Colocar las yemas en un
recipiente estéril y mezclar asépticamente con un volumen igual de
solución salina estéril 0,85%. Almacenar a 4°C hasta su uso. La yema
de huevo emulsión (50%) está disponible comercialmente.
3.4 Medio completo
Medio base (3.1) 90.0 ml

Solución de sulfato de polimixina (3.2) 1.0 ml
Emulsión yema de huevo (3.3) 10.0 ml
Fundir el agar base y enfriar en baño de agua a 44°C - 47°C.

Agregar los otros ingredientes agitando continuamente.
Mantener en baño de agua a 44°C - 47°C.
Preparación de las placas de Petri

Transferir 15 a 20 ml del medio completo en placas de Petri y dejar
solidificar. Las placas pueden guardarse a 3°C ± 2°C hasta 4 días.
Antes de ser usadas, secar las placas en estufa entre 25°C y 50°C,
preferentemente sin la tapa y con la superficie del agar hacia abajo
hasta que la misma esté seca.
4.1 Medio base sangre N° 2
Proteasa peptona o peptona equivalente 15.0 g

Hidrolizado de hígado 2.5 g
12g a
Agar
18g*
Disolver los componentes o el medio deshidratado en agua, por
ebullición. Ajustar el pH si es necesario para obtener un valor
después de la esterilización de 7.3 ± 0.2 a 25°C. Fraccionar en
minutos.
4.2 Sangre de oveja desfibrinada
20
Bacillus cereus
4.3 Medio completo

5 ml a 7
Sangre de oveja desfibrinada
ml
Fundir el agar base y enfriar en baño de agua a 47°C. Agregar la

sangre desfibrinada. Mezclar.
Verter aproximadamente al menos 12 ml del medio en placas de
Petri estériles y dejar solidificar.
21
Bacillus cereus
ANEXO 3: Cálculo y expresión de los resultados (ISO

7218:2007)
NOTA: Para el cálculo y expresión de resultados se seguirán los

requisitos generales establecidos en la Norma ISO 7218 salvo que la
norma ISO 7932 para recuento de Bacillus cereus en placa indique
otros requisitos específicos.
1. Método de cálculo
Para que un resultado sea válido, se suele considerar necesario que el
recuento de colonias se realice al menos en una placa que contenga
un mínimo de 15 colonias sospechosas (de acuerdo a la norma
específica ISO 7932 para recuento de Bacillus cereus en placa)
2. Método de cálculo después de la confirmación

2.1. En este método donde se requiere de una confirmación para el
recuento, se identifica un número de colonias sospechosas ( A) que se
someten a confirmación (ver 3.5.4.1). Tras la confirmación se calcula
el número de colonias de cada placa (a ) que cumplen con los criterios
de la confirmación, utilizando la ecuación (1):
𝑏𝑏
1. 𝑎𝑎 = × 𝐶𝐶
𝐴𝐴
Donde:
- b: es el número de colonias que cumplen con los criterios de

confirmación dentro de las colonias sospechosas A que se
someten a confirmación
- C: es el número total de colonias sospechosas contadas en cada

placa
2.2. El resultado calculado se aproxima al número entero más

próximo. Cuando se realiza esta operación, si la primera cifra decimal
es inferior a 5, no se modifica la cifra anterior; si la primera cifra
decimal es igual o superior a 5, la cifra anterior se incrementa en una
unidad
2.3. El número de microorganismos N presentes en la muestra de

análisis se calcula reemplazando ΣC por Σa en la ecuación general
∑ 𝐶𝐶 ∑ 𝑎𝑎
𝑁𝑁 = quedando 𝑁𝑁 =
𝑉𝑉×1,1×𝑑𝑑 𝑉𝑉×1,1×𝑑𝑑
22
Bacillus cereus
Donde:
V: es el volumen de inóculo utilizado en cada placa, en mililitros
- d: es la dilución correspondiente a la primera dilución elegida

(d = 1 cuando se utiliza el producto líquido sin diluir)
2.4. El resultado calculado se redondea a dos cifras significativas.

Cuando se realiza esta operación, si la tercera cifra es inferior a 5, no
se modifica la cifra anterior; si la tercera cifra es igual o superior a 5,
la cifra anterior se incrementa en una unidad.
Preferiblemente el resultado se expresa como un número entre 1.0 y
9.9 multiplicado por la potencia de 10 adecuada, o como un número
entero con dos cifras significativas.
El resultado se expresa como número de microorganismos N por
mililitro (para productos líquidos) o por gramo (para el resto de
productos)
EJEMPLO: El recuento ha proporcionado los siguientes resultados
- Para la primera dilución escogida (10-3): 66 colonias

- Para la segunda dilución escogida (10-4): 4 colonias
Realizando el análisis de las colonias escogidas:

- de las 66 colonias, se analizaron 8, de las que 6 cumplieron los
criterios, por consiguiente a = 50
- de las 4 colonias, las 4 cumplieron los criterios; por consiguiente a
=4
∑ 𝑎𝑎 50 + 4 54
𝑁𝑁 = = = = 49090
𝑉𝑉 × 1,1 × 𝑑𝑑 1 × 1,1 × 10−3 1,1 × 10−3
Redondeando el resultado como se indicó en 2.4., el número de

microorganismos es de 49000 o 4,9 x 104 por mililitro o por gramo de
producto.
NOTA: en caso de sembrar 0.1 ml V = 0.1 ml
3. Método de cálculo para recuento bajo
3.1. Si la placa contiene menos de 15 colonias (de acuerdo a la

norma específica ISO 7932 para recuento de Bacillus cereus en
placa), pero como mínimo 4, el resultado se calcula como lo indicado
en 2.3 y se expresa como número estimado de microorganismos x
por mililitro (productos líquidos) o por gramo (resto de productos)
23
Bacillus cereus
3.2. Si el resultado total oscila entre 1 y 3 colonias, la precisión del

análisis es demasiado baja y el resultado debe expresarse como:
“Hay microorganismos presentes, pero a un nivel inferior a (4 x d)

por gramo o ml”
NOTA: para recuentos de casos especiales ver la norma ISO

7218:2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs. General
requirements and guidance for microbiological examinations.
24
Bacillus cereus
ANEXO 4: FOTOS
Bacillus cereus ATCC 4778: colonias típicas rosa rodeada de

precipitado
Bacillus cereus: reacción positiva para el test de hemólisis
25
Bacillus cereus
5. REFERENCIAS
(1) International Standard. ISO 7932: 2004 (E). Microbiology of

food an animal feeding stuffs. Horizontal method for the enumeration
of presumptive Bacillus cereus. Colony - count technique at 30°C.
Third edition, 2004-06-15.
(2) International Standard. ISO 6887 – 1. Microbiology of food and

animal feeding stuffs. Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination - Part 1:
General rules for the preparation of the initial suspension and decimal
dilutions. First edition, 1999-02-15.
(3) International Standard. ISO 7218: 2007. Microbiology of food

and animal feeding stuffs. General requirements and guidance for
microbiological examinations. Third edition, 2007-08-15.
NOTA: Las siguientes normas de referencias son

indispensables para la aplicación del presente procedimiento.
Para cada norma de referencia debe aplicarse la edición
citada, en caso de no especificarse la misma, deberá aplicarse
la última edición (incluyendo cualquier modificación).
IS0 6887-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs -

Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions
for microbiological examination - Part 1: General rules for the
preparation of the initial suspension and decimal dilutions

for microbiological examination - Part 2: Specific rules for the
preparation of meat and meat products

preparation of fish and fishery products

preparation of products other than milk and milk products meat and
meat products, and fish and fishery products
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs - General

26
Bacillus cereus
ISO 6887-5, Microbiology of food and animal feeding stuffs --

preparation of milk and milk products
lSO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs -

Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1 :
General guidelines on quality assurance for the preparation of culture
media in the laboratory
lSO/TS 11133-2:2003, Microbiology of food and animal feeding

stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media -
Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media
27
Bacillus cereus
NOTAS PERSONALES
28
Bacillus cereus
29
Bacillus cereus
Bacillus cereus
Detección y enumeración por la técnica de
número más probable (NMP) en muestras de
alimentos
1. OBJETIVO

realizar la detección y la enumeración de presunto Bacillus cereus
viable, en bajo número, por la técnica de número más probable
(NMP) y método de detección en muestras de alimentos y muestras
ambientales de las áreas de producción y manipulación de alimentos.
2. ALCANCE
Este procedimiento se aplica para realizar la detección y la

enumeración de presuntos Bacillus cereus en bajo número por la
técnica de número más probable (NMP) y método de detección en
alimentos y muestras ambientales en el área de producción y


“Referencias”
3. DESARROLLO
3.1. Definiciones
Para el propósito de este documento, presunto Bacillus cereus es una

bacteria que forma colonias típicas o atípicas en la superficie del
medio de cultivo selectivo, y da reacciones positivas de confirmación
bajo las condiciones especificadas en este procedimiento.
30
Bacillus cereus
NOTA: La definición de presunto Bacillus cereus obedece al hecho de

que para propósitos prácticos este procedimiento no distingue entre
otras especies íntimamente relacionadas. En particular el test de
confirmación no es adecuado para distinguir entre Bacillus cereus y
otras especies de Bacillus como Bacillus weihenstephanensis, Bacillus
anthracis, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides and Bacillus
pseudomycoides
3.2.1. Método de enumeración

3.2.1.1. Inoculación de tres tubos con medio líquido de

enriquecimiento selectivo doble concentración, con una cantidad
específica de la primera dilución (suspensión inicial).
3.2.1.2. Inoculación de tres tubos con medio líquido de
enriquecimiento selectivo simple concentración, con una cantidad
específica de la primera dilución (suspensión inicial). Luego bajo las
mismas condiciones inoculación de tres tubos con medio líquido de
enriquecimiento selectivo simple concentración, con una cantidad
específica de las diluciones sucesivas realizadas a partir de la
suspensión inicial.
3.2.1.3. Incubación de los tubos con medio líquido de
enriquecimiento selectivo simple y doble concentración a 30°C
durante 48 h.
3.2.1.4. Inoculación en superficie del medio de cultivo sólido
selectivo a partir de los tubos con medio líquido de enriquecimiento
selectivo.
3.2.1.5 Incubación de las placas a 37ºC ó 30°C (de acuerdo al medio
sólido selectivo utilizado) durante 18 h a 48 h y selección de colonias
típicas de presuntos Bacillus cereus.
3.2.1.6. Confirmación de las colonias típicas por el test de hemólisis y
por observación microscópica.
3.2.7. Cálculo del NMP de presunto Bacillus cereus por gramo o por
mililitro de muestra, teniendo en cuenta los tubos confirmados y
utilizando la tabla de NMP.
3.2.2. Método de detección

3.2.2.1. Inoculación de un medio de enriquecimiento selectivo con

una cantidad específica de la muestra si el producto es líquido o con
una cantidad específica de la dilución inicial en caso de otros
productos.
3.2.2.2. Incubación del tubo a 30°C durante 48 h.
3.2.2.3. Inoculación por superficie del medio de cultivo sólido
selectivo a partir del medio líquido de enriquecimiento selectivo.
31
Bacillus cereus
3.2.2.4. Incubación de las placas a 37ºC ó 30°C durante 18 h a 48 h

y selección de colonias típicas de presunto Bacillus cereus
3.2.2.5. Confirmación de las colonias típicas por el test de hemólisis y
por observación microscópica
3.2.2.6. Expresión de resultados como “presencia” o “ausencia” de
presuntos Bacillus cereus en g o ml de producto.
3.3. Medios de cultivo, soluciones, reactivos para propiedades

bioquímicas y equipos (ver ANEXO 2)
3.3.1. Agua peptona bufferada (BPW).

3.3.2. Solución salina peptonada (SFP).
3.3.3. Medio selectivo líquido: caldo triptona soja polimixina (TSPB).
3.3.4. Medio selectivo sólido: agar polimixina piruvato emulsión de
yema de huevo manitol azul de bromotimol (PEMBA).
3.3.5. Solución de sulfato de polimixina B.
3.3.6. Emulsión de huevo.
3.3.7. Medio selectivo sólido: agar manitol yema de huevo polimixina
(MYP)
3.3.8. Solución de verde de malaquita.
3.3.9. Solución de Sudan black B.
3.3.10. Xileno.
3.3.11. Solución de safranina.
3.3.12. Agar base sangre.
3.3.13. Sangre de oveja desfibrinada.
3.3.15. Autoclave
3.3.16. Estufa de incubación: a 30°C ± 1°C o 37ºC ± 1°C
temperatura a 47°C ± 2°C y aproximadamente 80°C
3.3.19. Pipetas de 10 ml y 1 ml de capacidad, graduadas en
intervalos de 0.5 ml y 0.1 ml respectivamente.
3.3.20. Ansas de platino-iridio o níquel-cromo de aproximadamente 3
mm de diámetro y de punción del mismo material, o
equivalentes estériles descartables.
en particular de 16 mm x 160 mm y tubos de hemólisis.
3.3.22. Placas de Petri de vidrio o plástico de 90 mm a 100 mm de
diámetro.
3.3.23. Vortex
3.3.24. Mezclador tipo stomacher
3.3.25. Microscopio con objetivo de inmersión
3.3.26. Portaobjetos de aproximadamente 76 mm por 26 mm
3.3.27. Papel de filtro de poro fino, por ejemplo Whatman N° 41
3.4. Muestreo
32
Bacillus cereus

metodología.
3.5. Procedimiento

específicas para el alimento en cuestión. (Ver punto 5. Referencias)

1/10) y homogeneizar de 1 a 3 minutos dependiendo del alimento.

estéril.
Mezclar utilizando preferentemente un agitador mecánico de 5 a 10
segundos para obtener la dilución 10-2.
Si es necesario repetir esta operación a partir de la dilución 10-2 y
diluciones sucesivas, utilizando en cada operación una nueva pipeta
estéril para obtener las siguientes diluciones (10-3, 10-4, etc.). Se
realizan las diluciones que sean necesarias para obtener un número
apropiado de microorganismos para realizar el recuento. (Ver 3.5.3.)

33
Bacillus cereus

es de 30 minutos.
3.5.2.2. Método de enumeración
3.5.2.2.1. Porción de muestra para el ensayo y suspensión

inicial
Preparar la suspensión inicial y las diluciones decimales de acuerdo al
ítem 3.5.1.
3.5.2.2.2. Inoculación e incubación

Inocular 3 tubos que contengan caldo triptona soja polimixina (TSPB)
doble concentración, con 10 ml de la primera dilución (suspensión
inicial) y mezclar utilizando un agitador tipo vortex. Esta inoculación
equivale a 1 g de muestra por tubo.
Inocular 3 tubos que contengan caldo triptona soja polimixina (TSPB)
simple concentración, con 1 ml de la primera dilución (suspensión
inicial) (equivale a 0.1 g de la muestra por tubo) y mezclar utilizando
un agitador tipo vortex.
Para cada dilución decimal sucesiva transferir 1 ml a 3 tubos con
medio TSPB simple concentración.
Incubar los tubos inoculados a 30°C durante 48 h ± 4 h.
3.5.2.2.3. Subcultivo
Después de la incubación por el período especificado, agitar bien los
tubos y estriar con ansa de 3 mm a partir de cada uno de los tubos
en la superficie de placa de agar PEMBA o agar MYP.
Incubar las placas invertidas a 37°C (PEMBA) o a 30°C (MYP) durante
18 h a 24 h. Si las colonias no pueden verse bien incubar las placas
por otras 24 h adicionales. Si se usa placas de agar PEMBA, la
incubación posterior puede ser llevada a cabo a temperatura
ambiente.
3.5.2.2.4. Selección de las placas

Después de la incubación completa, examinar las placas para
determinar la presencia de colonias típicas y atípicas
- Colonias típicas: En agar PEMBA, las colonias típicas de presunto
Bacillus cereus son de alrededor de 2 mm a 5 mm, tienen un borde
irregular entre rugoso y radicular, con aspecto brilloso en la
superficie, de color turquesa a azul, posiblemente con centro blanco
grisáceo contra el fondo azul, y tienen un halo de precipitación
(reacción de la yema de huevo) de hasta 5 mm de ancho.
34
Bacillus cereus
En agar MYP, las colonias típicas son de 2 mm a 5mm de tamaño,

rugosas. Tienen una coloración rosa contra el fondo carmesí y un halo
de precipitación (reacción de la yema de huevo) de hasta 5 mm de
ancho.
- Colonias atípicas: Si las placas tienen un alto contenido de flora
acompañante que fermenta el manitol, la coloración de las colonias y
del fondo puede reducirse y no ser visible. Además, algunas cepas de
presunto Bacillus cereus tienen solamente una reacción leve con la
yema de huevo o ninguna. En tales casos y en otros casos dudosos,
esas colonias deberían ser también sometidas a la confirmación.
3.5.2.2.5. Confirmación
Las colonias típicas y las atípicas en agar PEMBA o MYP deben ser
confirmadas por medio del test de hemólisis en agar sangre de oveja.
Además, las colonias típicas y las atípicas en agar PEMBA (pero no en
agar MYP) pueden ser confirmadas por microscopía.
3.5.2.2.5.1. Selección y purificación de las colonias para

confirmación
Seleccionar tres colonias de cada placa, de acuerdo a lo indicado en
3.5.2.2.4. Si hay menos de tres colonias en la placa, tomar todas las
colonias presentes. Confirmar esas colonias como se especifica en
3.5.2.2.5.2. ó 3.5.2.2.5.3
Si las placas presentan sobrecrecimiento y no es posible seleccionar
colonias bien aisladas, tomar material de las colonias de tres puntos y
estriar en placas con el medio selectivo (PEMBA o MYP). Incubar las
placas a 37°C (agar PEMBA) o a 30°C (agar MYP) por 18 h a 24 h.
Seleccionar de cada placa al menos una colonia bien aislada.
Confirmar como se especifica en 3.5.2.2.5.2. ó 3.5.2.2.5.3
3.5.2.2.5.2 Confirmación por el test de hemólisis en agar

sangre de oveja (PEMBA o MYP)
Estriar las colonias seleccionadas en 3.5.2.2.1. en la superficie de
placas de agar sangre de oveja de modo de obtener colonias aisladas.
Incubar a 30°C durante 24 h y leer la reacción de hemólisis.
Cada colonia rodeada de una zona clara se considera hemólisis
positiva.
3.5.2.2.5.3. Confirmación microscópica (PEMBA)
- Coloración: transferir algo de material del centro de la colonia en el

caso de cultivos de 24 h, o de la periferia en caso de cultivos viejos,
usando un ansa de inoculación a un portaobjeto desgrasado y
suspender en una pequeña gota de agua. Dejar secar al aire y fijar
por calentamiento. Luego colorear las esporas sobre agua hirviente
con la solución de verde de malaquita. Después de 2 minutos,
enjuagar el exceso de colorante con agua, secar el portaobjeto y
cubrir con una capa de la solución Sudan black B para colorear la
35
Bacillus cereus
grasa intracelular. Dejar durante 15 minutos, luego lavar con xileno,

secar con papel de filtro y recolorear con la solución de safranina el
esporangio. Después de 20 segundos, volcar el exceso de colorante,
enjuagar con agua y secar al aire.
- Observación microscópica: examinar el portaobjeto al microscopio

usando aceite de inmersión. Como regla, las células con forma de
ladrillos de presunto Bacillus cereus están agrupadas en cadenas y
son de 4 μ a 5 μ de largo, 1 μ a 1,5 μ de ancho y contienen gran
cantidad de grasa intracelular que se colorea de negro. La coloración
verde de las esporas puede ser central o subterminal, pero nunca
deforma la coloración roja del esporangio.
3.5.2.3. Método de detección

inicial
Preparar la suspensión inicial de acuerdo al item 3.5.1.1

Agregar 1 ml de la suspensión inicial a un tubo con 9 ml del caldo
triptona soja polimixina (TSPB) simple concentración (es decir 0.1 g ó
0.1 ml de la muestra) ó 10 ml de la suspensión inicial a un tubo con
10 ml del caldo triptona soja polimixina (TSPB) doble concentración
(es decir 1 g ó 1 ml de la muestra). Para cantidades más grandes de
muestra de ensayo, preparar la suspensión inicial agregando x ml o x
g de la muestra a 9 x ml del diluyente (ver 3.5.1.1.). Luego agregar
toda la suspensión inicial a 90 x ml del caldo triptona soja polimixina
(TSPB) simple concentración (ejemplo agregar 5 ml ó 5 g de la
muestra a 45 ml del diluyente y agregar todo el volumen de
suspensión inicial a 450 ml del caldo TSPB simple concentración).
Incubar el tubo o frasco inoculado a 30°C durante 48 h ± 4 h
3.5.2.3.3. Subcultivo
Luego de mezclar, si es posible usando un Vortex, estriar con ansa a
partir del tubo o frasco, en la superficie de una placa de agar PEMBA
o agar MYP. Luego proceder como en 3.5.2.2.3, segundo párrafo.
3.5.2.3.4. Selección de las placas

Proceder como en 3.5.2.2.4.
3.5.2.3.5. Confirmación
Proceder como en 3.5.2.2.5.
3.5.3. Cálculo y expresión de resultados
3.5.3.1. Método de enumeración para la determinación del

número más probable (NMP)
36
Bacillus cereus
Para cada dilución del medio líquido selectivo de enriquecimiento

inoculado (3.5.2.2.2.) registrar el número de tubos en los que la
presencia de presunto Bacillus cereus ha sido confirmada. Designar
esos tubos como positivos.
3.5.3.1.1. Selección de resultados positivos para el cálculo de

NMP de (ISO 7218)
Hay combinaciones de tubos positivos con una probabilidad de
aparición mucho mayor que otras. Por ejemplo, es mucho menos
probable que aparezca una combinación de resultados positivos de 0,
0, 3 que una combinación de 3, 2, 1. Para cuantificar esta
probabilidad, se ha asignado un índice de 0 a 3 a todas las
combinaciones posibles de resultados positivos. La categoría 1
corresponde a los resultados de probabilidad más alta, mientras que
los resultados de la categoría 3 son raros y no son fáciles de
reproducir. Los peores casos son los resultados de la categoría 0, los
cuales deberían considerarse con un alto grado de desconfianza.
Asumiendo que los resultados del análisis son correctos, debería
esperarse que el 95% de las combinaciones correspondan a la
categoría 1, el 4 % a la categoría 2 y el 0.9% a la categoría 3 y
solamente el 0.1% a la categoría 0. En la tabla 2 del Anexo 3 se
explican con más detalles las categorías.
En el caso que se realicen más de tres diluciones, la selección de la

combinación “correcta” de tres diluciones consecutivas no siempre es
muy evidente. Sin embargo, se puede hacer fácilmente registrando
todas las combinaciones posibles de tubos positivos, determinando en
la tabla 1 a cual categoría corresponde.
Por consiguiente, se aplican las reglas siguientes:

• Se selecciona la combinación de tres diluciones consecutivas
con un perfil de categoría 1 para obtener el índice de NMP. Si se
obtiene más de una combinación con perfil de categoría 1, se
utiliza la que tenga un mayor número de tubos positivos.
• Si no se encuentra ninguna combinación de categoría 1, se
utiliza la que presente un perfil de categoría 2. Si se obtiene
más de una categoría con perfil de categoría 2, se utiliza la que
tenga un mayor número de tubos positivos.
En la tabla siguiente se muestran algunos ejemplos
37
Bacillus cereus
Ejemplo de selección de resultados positivos para el cálculo

de NMP
Fuente: ISO 7218
3.5.3.1.2. Expresión de resultados.

Seleccionar tres diluciones consecutivas de acuerdo al punto
3.5.3.1.1. y determinar el NMP entrando en la tabla 1 del Anexo3.
Utilizando el índice de NMP determinado en la tabla 1, se determina la
cantidad más probable de microorganismos en el volumen de
referencia.
El resultado se expresa cómo el número más probable de presuntos
Bacillus cereus por gramo o mililitro

De acuerdo a la interpretación de los resultados, reportar la presencia
o ausencia de presuntos Bacillus cereus en la porción testeada,
especificando en gramos o mililitros de muestra.
38
Bacillus cereus
4. ANEXOS
ANEXO 1: Diagrama de flujo del procedimiento para

enumeración de presuntos Bacillus cereus por la técnica de
número más probable (NMP)
Sembrar 10 ml de la suspensión inicial Sembrar 1 ml de la suspensión inicial y

en 3 tubos con medio TSPB doble de las diluciones sucesivas en 3 tubos
concentración con medio TSPB simple concentración
Incubar a 30°C durante 48 h +/- 4 h.
Aislar en
- Agar PEMBA a 37°C, 18 h a 24 h y 24 h adicionales si es necesario
o en
- Agar MYP a 30°C. 18 h a 24 h y 24 h adicionales si es necesario
Selección de colonias sospechosas
- Confirmación de colonias aisladas de agar PEMBA por: test de hemólisis y observación en

microscopio
- Confirmación de colonias aisladas de agar MYP por: test de hemólisis
Cálculo del NMP de acuerdo al número de tubos confirmados y expresión de resultados
39
Bacillus cereus

1000
Agua destilada
ml

2. Solución salina peptonada

1000
Agua destilada
ml

3. Caldo triptona soja polimixina (TSPB)
.1. Medio base

Digesto enzimático de soja 3.0 g
Glucosa 2.5 g
Fosfato ácido disódico (Na2HPO4) 1.0 g
1000
Agua destilada (a)
ml
(a) 500 ml para el caldo doble concentración.

Disolver los componentes en agua por calentamiento y agitación.
Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7.3 ± 0.2
a 25°C. Distribuir en tubos de 16 mm x 160 mm, 10 ml para el caldo
doble concentración y 9 ml para el caso simple concentración.
40
Bacillus cereus
.2. Solución de sulfato de polimixina B
500.000 unidades (equivalente a

Sulfato de polimixina B
0.05 g aproximadamente)
Disolver el sulfato de polimixina B en agua destilada. Esterilizar por

filtración.
3.3. Medio completo

Inmediatamente antes de usar, agregar 200 µl (caldo doble
concentración) y 100 µl (caldo simple concentración) de la solución
de sulfato de polimixina a cada uno de los tubos que contienen el
medio.
4. Agar polimixina piruvato yema de huevo manitol azul de

bromotimol (PEMBA)
4.1. Medio base

D-Manitol 10.0 g
Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O) 0.1 g
Fosfato ácido disódico (Na2HPO4) 2.5 g
Fosfato diácido monopotásico (KH2PO4) 0.25 g
9g a
Agar
18g*
* dependiendo de la firmeza del agar
Disolver los componentes en agua destilada por calentamiento y
agitación. Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de
7.2 ± 0.2 a 25°C. Dispensar en porciones de 8 ml en tubos.

Preparar como en 3.2.
4.3. Emulsión de yema de huevo al 20%

Usar huevos de gallina frescos, limpios y con sus cáscaras intactas.
Lavar los huevos, usando un cepillo, en detergente líquido. Enjuagar
bajo agua corriente, sumergir por 30 segundos en alcohol 70% en
41
Bacillus cereus
volumen y secar. Usando procedimientos asépticos, romper cada

huevo y separar la yema de la clara por repetidas transferencias de la
yema de una mitad de la cáscara del huevo a la otra. Poner las
yemas en un recipiente con graduación y agregar cuatro partes en
volumen de agua estéril. Transferir asépticamente a un recipiente
estéril y mezclar vigorosamente.
Calentar la mezcla durante 2 h en baño de agua a 47°C. Luego dejar
durante 18 h a 24 h a 3°C ± 2°C para permitir que se forme un
precipitado.
Recoger el sobrenadante asépticamente.
La emulsión puede ser guardada a 3°C ± 2°C por no más de 72 h.
Los dos medios selectivos descriptos en esta norma son
originalmente preparados con emulsión de huevo al 20 %. Hay
emulsiones disponibles comercialmente, en algunos casos con
diferentes concentraciones, las que pueden usarse teniendo en
cuenta las instrucciones del fabricante, especialmente en lo referente
a la vida útil y asegurándose que la concentración sea apropiada para
el medio de cultivo tal como se lo describe en los puntos 4 y 5.
4.4. Medio completo

Solución de sulfato de polimixina (3.2) 10 ml
Emulsión yema de huevo (3.3) 50 ml
Preparación:
Fundir el agar base y enfriar en baño de agua a 47°C.
Calentar los otros ingredientes a la misma temperatura y agregarlos
agitando continuamente.
- Preparación de las placas de Petri: Transferir 12.5 ml del medio
completo en placas de Petri y dejar solidificar. Las placas pueden
guardarse a 3°C ± 2°C hasta 4 días. Antes de ser usadas, secar las
placas en estufa a una temperatura entre 25°C y 50°C,
5.1. Medio base

D- manitol 10.0 g
Rojo fenol 0.025 g
42
Bacillus cereus
Agar 9g a 18g*
Disolver los componentes en agua, por calentamiento y agitación.
Ajustar el pH si es necesario para obtener un valor después de la
esterilización de 7.2 ± 0.2 a 25°C. Fraccionar cada 90 ml del medio
en recipientes de capacidad adecuada. Esterilizar a 121°C durante 15
minutos.

5.3. Emulsión de yema de huevo

5.4. Medio completo
Medio base (5.1) 90.0 ml

Solución de sulfato de polimixina (5.2) 1.0 ml
Fundir el agar base y enfriar en baño de agua a 47°C.

Calentar los otros ingredientes a la misma temperatura y agregarlos
agitando continuamente.
- Preparación de las placas de Petri: transferir de 15 a 20 ml del
medio completo en placas de Petri y dejar solidificar. Las placas
pueden guardarse a 3°C ± 2°C hasta 4 días. Antes de ser usadas,
secar las placas en estufa a una temperatura entre 25°C y 50°C,
6. Soluciones de coloración para identificación

microscópica
6.1. Solución de oxalato de verde de malaquita
Oxalato de verde de malaquita 5.0 g

Agua 100 ml
Disolver el oxalato de verde de malaquita en agua.
6.2. Solución de Sudan black B
Sudan Black B 0.3 g

Etanol 70% 100 ml
43
Bacillus cereus
Disolver el Sudan black B en alcohol.
6.3. Xileno
6.4. Solución de safranina
Safranina 0.5 g
Agua 100 ml
Disolver la safranina en agua.
7.1. Medio base

Digesto enzimático de soja 5.0 g
9g a
Agar
18g*
Disolver los componentes o el medio deshidratado en agua, por
ebullición. Ajustar el pH si es necesario para obtener un valor
después de la esterilización de 7.3 ± 0.2 a 25°C. Fraccionar en
minutos.
7.2. Sangre de oveja desfibrinada
7.3. Medio completo

5ml a
Sangre de oveja desfibrinada
7ml
Fundir el agar base y enfriar en baño de agua a 47°C. Agregar la

sangre desfibrinada. Mezclar.
Verter aproximadamente 15 ml del medio en placas de Petri estériles
y dejar solidificar.
44
Bacillus cereus
ANEXO 3:
Tabla 1: Índices de NMP y límites de intervalo de confianza

(95%) cuando se utilizan tres porciones analíticas de 1g (ml),
tres de 0.1g (ml) y tres de 0.01 g (ml)
b
: ver tabla 2
Fuente: ISO 7218
45
Bacillus cereus
Tabla 2:
Categoría Definición
Cuando el número de bacterias de la muestra es igual al valor de

NMP hallado, este resultado es de los que tienen mayor
1 probabilidad de obtenerse. Como mucho, hay un 5 % de
probabilidad de obtener un resultado que es menos probable que el
de menor probabilidad de esta categoría

NMP hallado, este resultado es de los que tienen una probabilidad
de obtenerse menor que incluso el resultado menos probable de la
2
categoría 1, pero hay en el mejor de los casos solamente un 1% de
probabilidad de obtener un resultado que es menos probable que el
de menor probabilidad de esta categoría.

3
categoría 2, pero hay en el mejor de los casos solamente un 0.1%
de probabilidad de obtener un resultado que es menos probable que
el de menor probabilidad de esta categoría.

0
categoría 3. Solamente hay un 0.1% de probabilidad de obtener un
resultado de esta categoría, incluso sin que se haya cometido
ninguna incorrección
a
Antes de comenzar los análisis, debería decidirse que categoría se va a aceptar,
es decir, solamente la categoría 1, la 1 y la 2 o incluso la 1, la 2 y la 3. Cuando se
vaya a tomar una decisión de gran importancia en base a los resultados,
solamente debería aceptarse la categoría 1, o en todo caso la 1 y la 2. Los
resultados de la categoría 0 deberían considerarse con un alto grado de
desconfianza.
46
Bacillus cereus
ANEXO 4: FOTOS
1. Caldo triptona soja polimixina (TSPB)
Método de NMP para recuento de presuntos Bacillus cereus en caldo

TSPB
Bacillus cereus: reacción positiva para el test de hemólisis
47
Bacillus cereus
Bacillus cereus ATCC 4778, en agar MYP, 24 h de incubación
4. Agar polimixina piruvato yema de huevo manitol azul de

bromotimol (PEMBA) y Agar manitol yema de huevo
polimixina (MYP)
Bacillus cereus ATCC 4778
5. Agar PEMBA
Bacillus cereus ATCC 4778
48
Bacillus cereus
5. REFERENCIAS
(1) International Standard. ISO 21871. Microbiology of food and

animal feeding stuffs - Horizontal method for the determination of
low numbers of presuntive Bacillus cereus. Most problable number
technique and detection method. First edition 2006-01-15








49
Bacillus cereus

lSO/TS 1 11 33-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs -

lSO/TS 11 133-2:2003, Microbiology of food and animal feeding

50
Bacillus cereus
NOTAS PERSONALES
51
Bacillus cereus
52
Clostridium perfringens
Clostridium perfringens en
alimentos
1. Generalidades
El género Clostridium está formado por más de cien especies con

limitada relación genética y propiedades bioquímicas diversas.
Comprende a bacilos Gram positivos, anaerobios, esporulados. Son
ubicuos pudiendo ser encontrados en el suelo y aguas residuales
como así también en la flora intestinal de hombres y animales.
En su mayoría son saprófitos, pero los patógenos pueden causar
enfermedades graves que pueden ser fatales, como gangrena
gaseosa, botulismo, tétanos, infecciones de piel y partes blandas,
colitis asociada a antibióticos e intoxicaciones alimentarias.
La capacidad para provocar enfermedad está vinculada a la
posibilidad de sobrevivir en condiciones ambientales adversas
mediante la formación de esporas, crecer rápidamente y producir
toxinas histolíticas, enterotoxinas y neurotoxinas.
Clostridium perfringens es la especie del género Clostridium más

frecuentemente aislada en materiales clínicos. Pertenece a la familia
de las Bacillaceae.
Es un bacilo Gram-positivo grande (1μ de ancho por 4 μ de largo, en

promedio) de bordes rectos y extremos romos, inmóvil, formador de
esporas que se encuentra en los intestinos de los seres humanos y de
varios animales, en el suelo, en el agua, en los alimentos (sobre todo
en las carnes que no están bien cocinadas), entre otros.
Anaeróbico significa que es incapaz de crecer en presencia de oxígeno
libre. Desarrolla rápidamente en anaerobiosis, produciendo colonias
grandes (1 a 3 mm de diámetro) que muestran doble halo de
hemólisis en las placas de agar sangre.
Clostridium perfringens teñidos con la tinción de Gram
55
Clostridium perfringens: colonias hemolíticas en agar sangre
Sus características morfológicas, la demostración de presencia de

esporas, el rápido desarrollo en anaerobiosis y algunas propiedades
bioquímicas (lecitinasa) conforman un perfil que facilita su rápida
detección en el laboratorio.
Las células vegetativas de C. perfringens en la fase exponencial de la

curva de crecimiento son muy sensibles a la refrigeración y a la
congelación. Así sucede que las pruebas en alimentos congelados o
refrigerados frecuentemente sólo revelan los esporos presentes de C.
perfringens (que sobreviven a la refrigeración y a la congelación) y no
las células vegetativas que se habrán inactivado.
C. perfringens es el agente etiológico de muchas enfermedades y es

la tercera causa de toxinfección alimentaria bacteriana después de
Salmonella spp y Staphylococcus aureus.
Produce toxinas que pueden causar otras enfermedades como la

enteritis necrótica o la gangrena gaseosa.
En la gangrena gaseosa, el Clostridium provoca destrucción en los

tejidos infectados si persiste. Esto es provocado por la liberación de
exoenzimas específicas que atacan a las moléculas constituyentes de
los tejidos animales: fosfolipasas, hemolisinas, colagenasas,
proteasas, que provocan la putrefacción del tejido acompañada de
una producción de gas, y de ahí su nombre ("gaseosa"). La solución,
llegado este nivel, es la amputación de la zona afectada; de no ser
así la infección suele acabar con la muerte del animal (cerdos, pollos,
caballos y humanos).
Es el tercer indicador de contaminación fecal de las aguas. Se

destruye con temperaturas superiores a 121°C.
2. Patogenia
56
Existen dentro de la especie cinco tipos llamados A, B, C, D y E.
C. perfringens A es el responsable de la mayoría de los procesos

infecciosos.
Produce una enterotoxina (polipéptido de 35.000 Daltons de peso
molecular) que se comporta como un superantígeno promoviendo la
liberación de mediadores de inflamación en forma masiva.
La enterotoxina es susceptible a pronasa pero no a tripsina ni

quimiotripsina.
En el intestino delgado, la enterotoxina se une a un receptor de

membrana del ribete en cepillo e induce una alteración de la
permeabilidad calcio dependiente resultando en una pérdida de iones
y metabolitos. Esta pérdida electrolítica altera la función metabólica
intracelular provocando daño morfológico y eventual lisis.
3. Epidemiología
La enfermedad se produce cuando el individuo ingiere alimento

contaminado con un elevado número de microorganismos
productores de enterotoxinas (>106 UFC) los cuales al llegar al
intestino delgado esporulan y liberan las enterotoxinas.
Los alimentos que pueden estar contaminados son carnes vacuna,

porcina, pollo, salsas cocinadas, guisos, sopas y no refrigerados.
Estos alimentos, cuando son almacenados a temperaturas

inadecuadas aumentan el riesgo de infección y enfermedad por
Clostridium perfringens, ya que las esporas presentes después de la
cocción pueden germinar y potencialmente crecer hasta un número
alto y peligroso. El mantenimiento del alimento en la zona de
temperaturas peligrosas por más de dos horas, es la causa principal
de ETA por Clostridium perfringens.
No son comunes los brotes familiares pero si los producidos a través

de alimentos preparados comercialmente y destinados a restaurantes
o instituciones.
Para confirmar la existencia de una enfermedad de este tipo es

necesario recuperar el agente de la muestra de alimento y del
paciente. Se deben recuperar al menos 105 UFC de C. perfringens por
gramo de alimento y 106 UFC de microorganismos por gramo de
heces en las primeras 24 horas.
Es posible detectar anticuerpos contra la enterotoxina pero ellos no
tienen valor protector.
57
4. Clínica
Entre 7 y 15 horas después de la ingesta, el paciente presenta

diarrea líquida espumosa y maloliente y dolores abdominales. La
enfermedad tiende a ser autolimitada en pacientes que no presenten
otras complicaciones.
5. Diagnóstico
El diagnóstico es sospechado por la presencia del agente en el

alimento y el paciente. También puede buscarse la presencia de la
enterotoxina en las heces utilizando ELISA o hemaglutinación pasiva
reversa; también se han desarrollado técnicas moleculares para la
detección de estos agentes.
6. Tratamiento y prevención
En general, no requiere tratamiento antimicrobiano, sólo medidas de

sostén. Como acción preventiva, debe ser mantenida una
refrigeración adecuada de los alimentos cocidos de no ser consumidos
de inmediato.
El control de C. perfringens se basa casi totalmente en los
procedimientos de cocción y de enfriamiento. La mayoría de los
brotes son el resultado de un enfriamiento lento de los alimentos
luego de su cocción, y un mantenimiento prolongado en las
temperaturas peligrosas de crecimiento (entre 10ºC y 60ºC). Por lo
tanto, las medidas principales para prevenir una toxiinfección por C.
perfringens son:
 Los alimentos deben ser cocinados completamente a una
temperatura interna entre 63°C a 74°C y luego mantenidos en
una temperatura mayor a 60°C hasta el servicio/ consumo.
 Si el alimento no va a ser consumido inmediatamente, se debe
enfriar rápida y adecuadamente siguiendo el Procedimiento de
Enfriado Rápido de Alimentos. Debe permanecer el menor
tiempo posible en el rango de temperaturas de 60°C a 10°C, y
luego ser mantenido a temperaturas inferiores a 5ºC.
 El recalentamiento de los alimentos debe realizarse a una
temperatura mayor a 74ºC en su interior inmediatamente antes
de su consumo.
Las Buenas Prácticas Agropecuarias contribuyen a reducir la
contaminación de los alimentos con tierra y materia fecal animal,
minimizando así la carga bacteriana general en la materia prima. La
elaboración con Buenas Prácticas de Manufactura, evitando la
contaminación cruzada entre alimentos cocidos y crudos o
contaminados, y las Buenas Prácticas de Higiene son esenciales para
la prevención de éste y otros microorganismos.
58
Referencias
(1) Bad Bug Book: Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural

Toxins.
(2) U.S. Food and Drug Administration, Center for Food Safety and
Applied Nutrition.
(3) Handbook http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=
Clostridiumperfringens&oldid=52349170.
(4) Manual of Clinical Microbiology, Patrick R. Murray, 1995.
(5) Principles and Practice of Infectious Diseases, Gerald L. Mandell,
1995.
(6) Diagnóstico Microbiológico, Elmer W. Koneman, 1999.
(7) Ohio State University Extension. Clostridium perfringens: Not the
24-hour flu, HYG-5568-98. http://ohioline.osu.edu/hyg-
fact/5000/5568.html (Last Accessed: 23 March 2010).
(8) Enfermedades Transmitidas por Alimentos: Ficha Técnica n°5:
Toxiinfección por Clostridium perfringens: RENAPRA
(9) US Food and Drug Administration. US FDA/CFSAN - Bad Bug Book
- Clostridium perfringens, April 2009.
http://www.fda.gov/Food/FoodSafety/ FoodborneIllness/
FoodborneIllnessFoodbornePathogensNaturalToxins/
BadBugBook/ucm070483.htm (Last Accessed: 23 March 2010).
(10) US Food and Drug Administration. FDA Food Code. July 2009.
http://www.cfsan.fda.gov/~dms/foodcode.html (Last Accessed: 04
September 2009).
(11) Schmidt, R.H., R.M. Goodrich, D.L. Archer, and K.R. Schneider.
FSHN033/FS099: General Overview of the Causative Agents of
Foodborne Illness. http://edis.ifas.ufl.edu/FS099 (Last Accessed: 04
September 2009
59
NOTAS PERSONALES
60
61
Recuento de Clostridium perfringens

1. OBJETIVO

realizar la enumeración y confirmación de Clostridium perfringens
viables por la técnica de recuento de colonias en placa, en muestras
de alimentos y muestras ambientales de las áreas de producción y
2. ALCANCE
Este procedimiento se aplica para realizar la enumeración y

confirmación de Clostridium perfringens viables por la técnica de
recuento de colonias en placa en muestras de alimentos y muestras
ambientales en el área de producción y manipulación de alimentos.


Referencias
3. DESARROLLO
3.1. Definiciones
Para el propósito de este documento, Clostridium perfringens es una
bacteria que forma colonias características (precipitado negro,
causado por la reducción de sulfito a sulfuro y por tanto colonias
negras) en el medio selectivo especificado, y da reacciones positivas
para cualquiera de las dos técnicas de confirmación especificadas en
este procedimiento.
3.2. Principio (ver ANEXO 1)

3.2.1. Preparación de la muestra y diluciones sucesivas
62
3.2.2. Aislamiento en medio selectivo y diferencial en doble capa del

mismo medio.
3.2.3. Recuento de colonias características
3.2.4. Confirmación bioquímica de colonias sospechosas aisladas.

3.3.3. Agar sulfito-cicloserina (SC) para aislamiento de Clostridium
perfringens
3.3.4. Solución de D-cicloserina (4 mg en 100 ml)
3.3.5. Medio de tioglicolato fluído
3.3.6. Medio lactosa-sulfito (LS)
3.3.7. Solución de disulfito de sodio (Na2S2O5 anhidro al 1.2 %)
3.3.8. Solución citrato férrico amónico (1%)
3.3.9. Medio para nitrato movilidad
3.3.10. Reactivo para detección de nitrito (solución de ácido sulfónico
5-amino-2-naftalen (5-2-ANSA) y ácido sulfanílico)
3.3.11. Zinc en polvo
3.3.12. Galería API 20 A bioMerieux (opcional)
3.3.14 Autoclave
3.3.15. Jarra para incubación en atmósfera anaeróbica o cualquier
otro aparato apropiado para incubación de cultivos en anaerobiosis.
3.3.16. Estufa de incubación: 37°C ± 1°C, 46°C ± 0.5°C
temperatura entre 44 ºC y 47ºC y a 46ºC ± 0,5ºC
46°C ± 0.5°C y a 44°C ± 1°C,
3.3.19. Pipetas de 1 y 10 ml de capacidad, graduadas en intervalos
de 0.1 y 0.5 ml respectivamente
3.3.20. Ansas de platino-iridio o níquel-cromo de aprox. 3 mm de
diámetro y de punción del mismo material, o equivalentes estériles
descartables.
en particular de 16 mm x 160 mm, con campanita de Durham.
3.3.22. Caja de Petri, de vidrio o plástico, de 90 a 100 mm de
diámetro.
3.3.23. Equipo de filtración para esterilización de soluciones.
3.3.24. Peras de goma para usar con las pipetas graduadas para
dispensar los reactivos para detección de nitritos (si fuera necesario)
3.4. Muestreo

metodología.
63
3.5. Procedimiento


1/10) y homogeinizar de 1 a 3 minutos dependiendo del alimento.
Para evitar el daño de los microorganismos por cambios bruscos de
3.5.1.2. Diluciones decimales (ISO 6887-1:1999)

estéril.
Mezclar utilizando preferentemente un agitador mecánico de 5 a 10
segundos para obtener la dilución 10-2.
3.5.1.3. Duración del procedimiento (ISO 6887-1)

es de 30 minutos.
64


Transferir 1 ml de la muestra si el producto es líquido ó 1 ml de la
suspensión inicial (dilución 1/10) y 1 ml de las diluciones sucesivas
preparadas según 3.5.1.2. por duplicado en el centro de placas de
Petri vacías. Verter entre 10 y 15 ml de agar SC, fundido y mantenido
a 44°C - 47ºC en baño de agua. Mezclar bien con el inóculo por
rotación suave. Cuando el medio haya solidificado, agregar una
sobrecapa de 10 ml del mismo agar SC. Incubar a 37°C ± 0.5°C
durante 20 h ± 2 h en condiciones anaeróbicas (jarra de atmósfera
modificada o contenedor semejante).
Una incubación más prolongada puede dar como resultado un
ennegrecimiento en exceso de las placas.
Seguir el mismo procedimiento para las diluciones decimales
preparadas en 3.5.1.2

Después de la incubación por el período especificado, seleccionar
todas las placas que contengan menos de 150 colonias, de éstas, si
es posible, seleccionar las placas que representen diluciones
sucesivas.
Contar en cada placa las colonias con características de presuntivos
Clostridium perfringens.
- Colonias características: Colonias negras (precipitado negro,
causado por la reducción de sulfito a sulfuro).
Seleccionar cinco colonias características y confirmar usando una de
las técnicas descriptas en 3.5.4.2 y 3.5.4.3.
3.5.4. Confirmación bioquímica (dos opciones)
3.5.4.1. General
Elegir una de las dos técnicas descriptas en 3.5.4.2 y 3.5.4.3
Hay disponibles galerías comerciales que pueden ser usadas si
responden a la norma ISO 7218.
3.5.4.2. Técnica de confirmación usando el medio lactosa-

sulfito (LS)
NOTA. La reacción obtenida en el medio de lactosa-sulfito cuando se
incuba a 46ºC es muy específica para Clostridium perfringens y
Clostridium absonum. Por lo tanto no es necesario asegurar la pureza
de las colonias antes de la inoculación en tioglicolato y
subsecuentemente en el medio de lactosa sulfito.
65
Inocular cada una de las colonias seleccionadas en medio de

tioglicolato fluido. Incubar bajo condiciones de anaerobiosis a 37ºC
durante 18 h a 24 h.
Después de la incubación, transferir sin demora 5 gotas del cultivo en
tioglicolato al medio LS por medio de una pipeta estéril. Incubar
aeróbicamente a 46ºC durante 18 h a 24 h en baño de agua.
3.5.4.2.2. Interpretación
Examinar los tubos del medio LS para la producción de gas y la
presencia de color negro (precipitado de sulfito de hierro). Las
campanitas de Durham con más de un cuarto llenas de gas y los
tubos con precipitado negro se consideran positivos.
En caso de duda, cuando la campanita de Durham presente menos de
un cuarto lleno de gas en un medio ennegrecido, transferir sin
demora, usando una pipeta estéril, 5 gotas del cultivo en medio LS a
otro tubo de medio LS. Incubar en baño a 46ºC durante 18h a 24h.
Examinar este tubo como se describe anteriormente.
Bacterias que forman colonias características en medio SC y las
cuales dan confirmación positiva con LS se consideran C. perfringens.
En todos los otros casos, los tubos deberían ser considerados como
negativos.
3.5.4.3. Técnica de confirmación usando los medios de nitrato-

movilidad y lactosa-gelatina.
3.5.4.3.1. General
Esta técnica de confirmación necesita de colonias características bien
aisladas. Si este no es el caso (por ejemplo si la superficie de las
placas está con sobrecrecimiento y no es posible seleccionar colonias
características bien aisladas) incubar cinco colonias características en
tubos pre-desaireados de medio de tioglicolato fluido.
Incubar bajo condiciones de anaerobiosis a 37ºC durante 18 h a 24 h.
Estriar las colonias en placas de SC agar base y agregar una capa de
10 ml de SC agar base.
Dejar solidificar e incubar anaerobicamente a 37ºC durante 18 h a 24
h. Seleccionar de cada placa al menos una colonia característica y
bien separada. Si fuera necesario, repetir el estriado e inoculación en
placas de SC agar base hasta obtener colonias características,
negras, bien aisladas.
Confirmar como se describe en 3.5.4.3.2. y 3.5.4.3.3.
3.5.4.3.2. Inoculación y lectura del medio de nitrato movilidad

Inocular por punción cada una de las colonias seleccionadas en medio
de nitrato movilidad recientemente desaireado.
Incubar bajo condiciones de anaerobiosis a 37ºC durante 24 h.
Examinar el tubo de nitrato movilidad para ver el tipo de crecimiento
a lo largo de la línea de inoculación. La movilidad se evidencia por un
crecimiento difuso en el medio fuera de la línea de inoculación.
66
Testear la presencia de nitrito por el agregado, con pipeta graduada y

pera de goma, de 0.2 ml a 0.5 ml del reactivo para detección de
nitritos a cada tubo de medio nitrato-movilidad.
ADVERTENCIA - Por razones de salud, llevar a cabo este test

bajo campana.
La formación de un color rojo confirma la reducción de nitrato a

nitrito. Si no se forma color rojo dentro de los 15 minutos, agregar
una pequeña porción de zinc en polvo y dejar por 10 minutos. Si se
forma un color rojo después de la adición del polvo de zinc, no ha
ocurrido reducción de nitrato.
3.5.4.3.3. Inoculación y lectura del medio de lactosa-gelatina

Inocular cada una de las colonias seleccionadas en medio de lactosa-
gelatina desaireado. Incubar bajo condiciones anaeróbicas a 37ºC
durante 24 h. Examinar los tubos del medio de lactosa-gelatina para
la presencia de gas y un color amarillo (debido a la producción de
ácido) indicando la fermentación de lactosa. Enfriar los tubos durante
1 h a 5ºC y chequear la licuación de gelatina. Si el medio ha
solidificado, reincubar durante 24 h adicionales y repetir nuevamente
para la licuación de la gelatina.
3.5.5. Interpretación
Bacterias que producen colonias negras en el medio de SC, son no-
móviles, usualmente reducen nitrato a nitrito, producen ácido y gas
de lactosa, y licuan gelatina en 48 h, se consideran C. perfringens.
Cultivos que muestran una reacción débil para nitritos (color rosa)
deberían ser descartados, ya que C. perfringens da una reacción
intensa e inmediata.

Se informa recuento de Clostridium perfringens en la porción de
muestra analizada (por gramos o mililitros para muestras líquidas).
Ver Anexo 3: Cálculo y expresión de resultados
67
4. ANEXOS

de Clostridium perfringens
Preparación de la muestra: X g de muestra + 9 x ml de diluyente (dilución 1/10)
Inoculación e incubación: transferir por duplicado 1 ml de las diluciones preparadas en placas de Petri
vacías, verter 10-15 ml de agar SC, mezclar suavemente. Cuando haya solidificado, agregar una doble
capa de 10 ml de agar SC. Incubar a 37°C ± 0.5ºC, 20 h ± 2 h en anaerobiosis
Recuento y selección de las colonias características: seleccionar las placas con menos de 150
colonias y contar como presunto Clostridium perfringens. Seleccionar 5 colonias características.
Inocular cada una de las colonias Opción 2. Confirmación bioquímica usando

seleccionadas en medio de tioglicolato fluído. lactosa-gelatina y nitrato- movilidad: Si la
Incubar a 37ºC durante 18h a 24h en reacción es positiva en el medio de lactosa-
anaerobiosis gelatina (producción de gas y color amarillo
debido a la formación de ácido con licuación de
la gelatina a las 48 h), y hay reducción de nitrato
a nitrito, con movilidad negativa se considera que
se trata de C. perfringens.
Opción 1. Confirmación bioquímica usando

el medio LS. Si la reacción es positiva
(producción de gas y precipitado negro) se
considera que se trata de C. perfringens
68
1. Diluyentes
1. 1. Agua Peptona Bufferada (BPW)
Digesto enzimático de tejidos animales 10.0 g

Fosfato disódico mono ácido dodecahidratado (Na2HPO4.12H2O) 9.0 g
Fosfato monopotásico diácido (KH2PO4) 1.5 g

1.2. Solución salina peptonada


necesidades analíticas. Esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos.
2. Agar sulfito-cicloserina (SC)
2.1. Agar sulfito-cicloserina base
Digestivo enzimático de proteína 15.0 g

Disulfito disódico (Na2S2O5), anhidro 1.0 g
Citrato férrico amónico (a) 1.0 g
Agar 9.0 a 18.0 g*
(a)
este reactivo debe contener al menos 15 % (fracción en peso)
de hierro
*dependiendo de la potencia gelificante del agar
Disolver los componentes en agua hasta ebullición. Ajustar el pH para
que después de la esterilización sea de 7.6 ± 0.2 a 25°C. Distribuir
en frascos o botellas de capacidad adecuada. Esterilizar a 121°C
durante 15 minutos.
69
Descartar a las 2 semanas de preparado.
2.2. Solución de D-cicloserina
D-cicloserina (a) 4.0 g

(a) usar solamente el polvo en estado cristalino blanco

Disolver la D-cicloserina en agua destilada, mezclar y esterilizar por
filtración. Conservar a 3ºC ± 2ºC, descartar a las 4 semanas
después de preparada.
2.3. Medio completo

Inmediatamente antes de usar, por cada 100 ml del medio base
fundido y enfriado a 44º - 47º C, añadir 1 ml de la solución de D-
cicloserina.
3. Medio de tioglicolato fluído
Digesto enzimático de caseina 15.0 g

D-glucosa 5.5 g
L-cisteína 0.5 g
Tioglicolato de sodio (mercaptoacetato) 0.5 g
Agar 0.5 a 2.0 g*
Resazurina 0.001 g 0.001 g
*dependiendo de la potencia gelificante del agar
Disolver los componentes en agua destilada llevando a ebullición.

Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7.1 ± 0.2 a
25°C. Dispensar en porciones de 10 ml en tubos. Esterilizar a 121°C
durante 15 minutos. Antes de usar el medio debe ser desaireado.
4. Medio de lactosa sulfito (LS) (opción 1)
4.1. Medio base

Lactosa 10.0 g
Clorhidrato de L-cisteína 0.3 g
70
Disolver los componentes en agua destilada llevando a ebullición si

fuese necesario. Ajustar el pH para que después de la esterilización
sea de 7.1 ± 0.2 a 25°C. Dispensar en porciones de 8 ml en tubos
con campanitas de Durham. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
Conservar a 3ºC ± 2ºC, descartar a las 4 semanas después de
preparado.
4.2. Solución de disulfito disódico
Disulfito disódico (Na2S2O5) anhidro 1.2 g

Agua 100 ml
Disolver el disulfito disódico en agua y esterilizar la solución por

filtración. Usar en el día.
4.3. Solución de citrato férrico amónico
Citrato de hierro (III) amónico 1.0 g

Agua 100 ml
Disolver el citrato férrico amónico en agua y esterilizar la solución por

filtración. Usar en el día.
4.4. Medio completo

Si el medio no se usa el día de la preparación, antes de usar
desairearlo completamente por calentamiento y enfriado rápido. Si el
medio está en tubos con tapa a rosca aflojarlas antes del
calentamiento y ajustarlas antes de enfriar. Entonces agregar 0.5 ml
de la solución de disulfito disódico (4.2) y 0.5 ml de la solución de
Citrato de hierro (III) amónico (4.3) por cada 8 ml del medio base.
Usar el medio completo en el día.
5. Medio para nitrato movilidad (opción 2)

Nitrato de potasio 1.0 g
Galactosa 5.0 g
Glicerol 5.0 g
Orto-fosfato ácido disódico (Na2HPO4) 2.5 g
Agar 1.0 a 5.0 g*
Disolver los componentes en agua, por ebullición. Ajustar el pH si es
necesario para obtener un valor después de la esterilización de 7.3 ±
0.2 a 25°C. Fraccionar 10 ml del medio en tubos. Esterilizar a 121°C
71
durante 15 minutos. Si no se usa el día de la preparación, mantener a

5ºC ± 3ºC. Justo antes de usar, calentar en baño hirviente durante
15 minutos y enfriar rápidamente a temperatura ambiente.
Descartar a las 4 semanas después de preparado.
6. Reactivos para la detección de nitrito
6.1. Solución de ácido sulfónico 5-amino-2-naftalen (5-2-

ANSA)
Disolver 0.1 g de 5-2-ANSA en 100 ml de solución ácido acético al 15
% (en volumen). Filtrar a través de papel de filtro. Almacenar en
botellas color caramelo (preferentemente con sistema de gotero) a
5ºC ± 3ºC.
6.2. Solución de ácido sulfanílico

Disolver 0.4 g de ácido sulfanílico en 100 ml de solución ácido acético
al 15 % (en volumen). Filtrar a través de papel de filtro. Almacenar
en botellas marrones (preferentemente con sistema de gotero) a 5ºC
± 3ºC.
6.3. Preparación del reactivo completo
Mezclar partes iguales de la soluciones 6.1. y 6.2. justo antes de

usar. Descartar inmediatamente el reactivo no usado.
6.4 Zinc en polvo
7. Medio de lactosa-gelatina

Lactosa 10.0 g
Gelatina 120.0 g
Rojo fenol 0.05 g
Agua 1000 ml
Disolver los componentes en agua, excepto la lactosa y el rojo fenol.

Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7.5 ± 0.2 a
25°C. Agregar la lactosa y el rojo fenol, dispensar en porciones de 10
ml en tubos y esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Si no se usa en
el día, mantener en heladera a 5ºC ± 3ºC.
Justo antes de usar, calentar en baño hirviente o con vapor por 15
minutos, entonces enfriar rápidamente a la temperatura de
incubación. Descartar a las 3 semanas de la preparación.
72

7218:2007)
1. Método de cálculo
Para que un resultado sea válido, se suele considerar necesario que el
un mínimo de 10 colonias sospechosas.
2. Método de cálculo después de la confirmación

2.1. En este método donde se requiere de una confirmación para el
recuento, se identifica un número de colonias sospechosas (A) que se
someten a confirmación (ver 3.5.4.1). Tras la confirmación se calcula
el número de colonias de cada placa (a) que cumplen con los criterios
de la confirmación, utilizando la ecuación (1):
𝑏𝑏
1. 𝑎𝑎 = × 𝐶𝐶
𝐴𝐴
Donde:
- b: es el número de colonias que cumplen con los criterios de

confirmación dentro de las colonias sospechosas A que se
someten a confirmación
- C: es el número total de colonias sospechosas contadas en cada

placa
2.2. El resultado calculado se aproxima al número entero más

próximo. Cuando se realiza esta operación, si la primera cifra decimal
es inferior a 5, no se modifica la cifra anterior; si la primera cifra
decimal es igual o superior a 5, la cifra anterior se incrementa en una
unidad
2.3. El número de microorganismos N presentes en la muestra de

análisis se calcula reemplazando ΣC por Σa en la ecuación general
∑ 𝐶𝐶 ∑ 𝑎𝑎
𝑁𝑁 = quedando 𝑁𝑁 =
𝑉𝑉×1,1×𝑑𝑑 𝑉𝑉×1,1×𝑑𝑑
Donde:
- V: es el volumen de inoculo utilizado en cada placa, en mililitros
- d: es la dilución correspondiente a la primera dilución elegida

(d = 1 cuando se utiliza el producto líquido sin diluir)
2.4. El resultado calculado se redondea a dos cifras significativas.

Cuando se realiza esta operación, si la tercera cifra es inferior a 5, no
73
se modifica la cifra anterior; si la tercera cifra es igual o superior a 5,

la cifra anterior se incrementa en una unidad.
productos)
EJEMPLO: El recuento ha proporcionado los siguientes resultados
- Para la primera dilución escogida (10-3): 66 colonias

- Para la segunda dilución escogida (10-4): 4 colonias
Realizando el análisis de las colonias escogidas:

- de las 66 colonias, se analizaron 8, de las que 6 cumplieron los
criterios, por consiguiente a = 50
- de las 4 colonias, las 4 cumplieron los criterios; por consiguiente
a=4
∑ 𝑎𝑎 50 + 4 54
𝑁𝑁 = = = = 49090
𝑉𝑉 × 1,1 × 𝑑𝑑 1 × 1,1 × 10−3 1,1 × 10−3
Redondeando el resultado como se indicó en 2.4, el número de

microorganismos es de 49000 o 4,9 x 104 por mililitro o por gramo de
producto.
3. Método de cálculo para recuento bajo
3.1. Si la placa contiene menos de 10 colonias, pero como mínimo 4,

el resultado se calcula como lo indicado en 2.3 y se expresa como
número estimado de microorganismos x por mililitro (productos
líquidos) o por gramo (resto de productos)
3.2. Si el resultado total oscila entre 1 y 3 colonias, la precisión del

análisis es demasiado baja y el resultado debe expresarse como:
“Hay microorganismos presentes, pero a un nivel inferior a (4 x d)

por gramo o ml”
4. Caso en el que la placa (muestra para análisis, suspensión

inicial o primera dilución) no contiene colonias
Si la placa que contiene la muestra para análisis (productos líquidos)

o la suspensión inicial (restos de productos), o la primera dilución
74
inoculada o escogida no contiene colonias, el resultado se expresa de

la siguiente manera:
1
“Menos de microorganismos por mililitro” (productos líquidos) o
d
1
“menos de microorganismos por gramo” (restos de producto)
d
NOTA: para recuento de casos especiales ver norma ISO 7218:2007.

Microbiology of food and animal feeding stuffs. General requirements
and guidance for microbiological examinations.
75
ANEXO 4: FOTOS
1. Agar sulfito-cicloserina
Clostridium perfringens: Siembra de diluciones decimales sucesivas.

Colonias características negras (precipitado negro, causado por la
reducción de sulfito a sulfuro)
2. Medio lactosa sulfito
Control negativo
Control negativo
Clostridium perfringen: producción de gas y precipitado negro en

medio lactosa sulfito
76
3. Caldo tioglicolato
Clostridium perfringens: en caldo tioglicolato
77
5. REFERENCIAS
(1) International Standard. ISO 7937: 2004 (E). Microbiology of

food and animal feeding stuffs. Horizontal method for the
enumeration of Clostridium perfringens - Colony-count technique.
Third edition, 2004-08-15








78



79
NOTAS PERSONALES
80
81
82
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus en
alimentos
1. Generalidades
Género Staphylococcus
El género Staphylococcus pertenece a la familia Micrococcaceae, los

miembros de éste género se caracterizan por ser cocos gram
positivos de 0.5 – 1.5 μm de diámetro, catalasa positiva, que se
encuentran aislados, en pares, tétradas o formando racimos
irregulares (término derivado del griego staphylé: racimo de uva).
Son inmóviles, anaerobios facultativos, no formadores de esporos,
generalmente no capsulados o con limitada formación de cápsula. 2
El género Staphylococcus incluye al menos 40 especies. De éstos,

nueve, tienen dos subespecies y uno, tiene tres subespecies (Harris
L.G, Foster S.J, Richards S. G. (2002). La mayoría son inofensivos y
pueden residir normalmente en la piel y las membranas mucosas de
los seres humanos y otros organismos (1).
De éstas especies, Staphylococcus aureus subespecie aureus o

normalmente llamado Staphylococcus aureus es el principal
responsable de la intoxicación alimentaria estafilocócica.
Staphylococcus aureus conocido como estafilococo aureus, o

comúnmente estafilococo dorado, es una bacteria anaerobia
facultativa, grampositiva, productora de coagulasa, catalasa positiva,
inmóvil y no esporulada, que se encuentra ampliamente distribuida
por todo el mundo, estimándose que una de cada tres personas se
hallan colonizadas, aunque no infectadas, por ella.
Puede producir una amplia gama de enfermedades, que van desde

infecciones cutáneas y de las mucosas relativamente benignas, tales
como foliculitis, forunculosis o conjuntivitis, hasta enfermedades de
riesgo vital, abscesos profundos, osteomielitis, meningitis, sepsias,
endocarditis o neumonía. Además, puede afectar al aparato
gastrointestinal por la ingestión de alimentos contaminados con la
enterotoxina estafilocócica secretada por la bacteria.
85
2. Reservorio y vías de transmisión
El hombre es el principal reservorio de S. aureus, se encuentra en la

piel y en las vías respiratorias superiores (nasofaringe).
La contaminación de los alimentos puede ocurrir desde los
operadores y por contaminación cruzada por el uso de utensilios
contaminados o materias primas contaminadas.
En el caso de contaminación directa desde el operador puede ocurrir
por contacto directo con lesiones en la piel o por microgotas salivales
generadas en estornudos o tos de los operadores.
Los animales también son una fuente importante de infección; se
destaca la mastitis en los bovinos y ovinos que puede determinar la
contaminación de la leche (2). La presencia de este microorganismo en
cuero, plumas y piel de animales es habitual, por lo tanto la
contaminación de las carcasas de los animales a veces es inevitable.
Muy diversos alimentos han sido la causa de la intoxicación
alimentaria estafilocócica. En lugar destacado en términos de
frecuencia han de citarse la carne de mamíferos y aves cocinadas,
leche y sus derivados como queso, crema, yogur y helados,
productos de pastelería rellenos de crema, ensaladas, alimentos
cortados en rebanadas, sándwiches y otros tipos de alimentos que
llevan manipulación por parte del operador. (3)
3. Patogenia de la intoxicación
S.aureus produce una gama especialmente amplia de sustancias

(agresinas y exotoxinas) asociadas con el grado de infección y con la
enfermedad. Varían desde componentes de la pared celular, por
ejemplo ácidos teicoicos, hasta una amplia gama de exoenzimas que
incluyen estafiloquinasa, hialuronidasas, fosfatasas, coagulasas,
catalasas, proteasas, nucleasas y lipasas, leucocidinas y hemolisinas
y, por último, pero de ningún modo menos importantes, las
enterotoxinas que causan la intoxicación alimentaria.
Los síntomas de la intoxicación por S. aureus se deben a diversos
polipéptidos antigénicamente distintos que actúan como toxinas
eméticas, las enterotoxinas estafilocócicas (SE). Estas toxinas son
liberadas al propio alimento por ciertas cepas de S.aureus (3).
Hasta hace unos años, se reconocían 5 tipos de enterotoxinas por la
técnica de inmunodifusión: SEA, SEB, SEC, SED y SEE.
Posteriormente se identificaron 13 nuevos tipos, reconociéndose en la
actualidad 20 tipos de SE (4).
Los estafilococos pueden multiplicarse exponencialmente a
temperaturas entre 6.7°C y 45.5°C. La enterotoxina es producida por
86
las células durante o inmediatamente después de la multiplicación.

Según Gilbert y colaboradores, se precisa la presencia actual o en un
momento anterior de la vida del alimento de un número elevado
(generalmente más de 106 ufc/g) para producir la cantidad suficiente
de toxina que origine síntomas en el consumidor del alimento. Con
todo, la cantidad de enterotoxina A necesaria para determinar
síntomas de intoxicación en el hombre es sólo de 0,1 – 1 µg / Kg. (3).
Las SE originan el reflejo emético por estimulación vagal de la
mucosa gástrica y los nervios simpáticos, produciendo la activación
del centro del vómito en el tronco encefálico. La diarrea inducida por
SE se debe a la disminución de la absorción del agua en el intestino y
al aumento simultáneo de la secreción de agua y sales minerales
desde las células intestinales en un mecanismo mediado por AMP –
cíclico (4).
Estabilidad y termoresistencia de las enterotoxinas

estafilocócicas
Las enterotoxinas de S.aureus poseen una elevada estabilidad, ya

que resisten la irradiación y la actividad de enzimas proteolíticas
como la pepsina y la tripsina. Las SE son termoestables, presentan
elevada resistencia a los tratamientos térmicos habituales, como por
ejemplo la pasteurización a 72°C durante 30 segundos y a 100°C
durante 30 minutos. Se inactivan a temperatura de esterilización a
115°C.
Los alimentos procesados o tratados en los que se ha destruido una
elevada población de estafilococos por calentamiento pueden, no
obstante, producir intoxicación alimentaria debido a la
termoresistencia de las SE. De este modo puede encontrarse en
alimentos tratados térmicamente toxina en presencia de un pequeño
número e incluso en ausencia de estafilococos viables.
Por ejemplo los alimentos fluidos, particularmente la leche, si se
mantiene algunas horas a temperaturas adecuadas para el
crecimiento de los estafilococos, puede permitir la producción de
cantidades significativas de SE. La subsiguiente pasteurización y un
proceso de desecado inactivarán todos o la mayoría de los
estafilococos, pero permanecerán sin afectarse las SE por su
termoresistencia. De hecho se han comprobado con absoluta
evidencia brotes de intoxicación estafilocócica producidos por leche
en polvo reconstituida (3).
4. Manifestaciones clínica
La intoxicación alimentaria estafilocócica es un síndrome
caracterizado por náuseas, vómitos, diarrea, malestar y debilidad
87
general. Los síntomas comienzan a manifestarse entre 1 a 6 horas (y

más generalmente de 2 a 4 horas) después de consumido el
alimento. Aunque la enfermedad es raramente mortal, los casos
graves pueden complicarse, presentándose a veces deshidratación y
shock. El enfermo suele reponerse en unas 24 horas, aunque en
algún caso la recuperación puede durar varios días (3).
5. Diagnóstico
Habitualmente el diagnóstico es clínico - epidemiológico
- Epidemiológico: (tipo de alimento, período de incubación, otros

casos).
- Clínico: (vómitos, diarrea líquida, dolor cólico abdominal).
- Por métodos auxiliares: rescate de S. aureus en cultivo de muestras

de heces obtenidas dentro de las 48 horas y del alimento (105
UFC/g).
6. Tratamiento
La intoxicación alimenticia por estafilococo se trata manejando

cualquier complicación hasta que desaparezca. La deshidratación
causada por la diarrea y el vómito es la complicación más común. El
tratamiento es sintomático y de sostén (aporte hidroelectrolítico
adecuado y dieta astringente).
7. Prevención
La intoxicación estafilocócica se puede evitar impidiendo el

crecimiento de S.aureus enterotoxigénicos en los alimentos. Para ello
es necesario respetar las Buenas Prácticas de Higiene a lo largo de la
cadena alimentaria, especialmente en el momento de preparación de
las comidas.
Se puede minimizar extraordinariamente la contaminación de los
alimentos por S. aureus de origen humano, apartando de la
manipulación y preparación de alimentos a personas infectadas o
enfermas.
La contaminación de los alimentos por S. aureus de origen animal se
reduce controlando las mastitis. Además, es necesario evitar en el
matadero las contaminaciones cruzadas entre piel y canales, así
como en el hogar y establecimientos de elaboración de comidas
(catering, comedores, etc.) entre alimentos crudos y cocidos
88
Los S. aureus del ambiente (aparatos, superficies, utensilios de

cocina, etc.) se eliminan con buenas prácticas de limpieza e higiene
Además de estas medidas preventivas es preciso:
- Destruir los S. aureus por el calor antes que se multipliquen
(pasteurización, cocción)
- Frenar su multiplicación llevando rápidamente los alimentos a
temperaturas inferior a 4°C para su conservación.
- Respetar la cadena de frío, es el punto clave para la prevención del
crecimiento de S. aureus
89
REFERENCIAS
(1) Harris L.G, Foster S.J, Richards S. G. (2002). "An introduction to

Staphylococcus aureus, and techniques for identifying and quantifying
S. aureus adhesins in relation to adhesion to biomaterials: review".
European cells and materials 4: 39–60. PMID 14562246.
(2) http://publicaciones.ops.org.ar/publicaciones/publicaciones
%20virtuales/libroETAs/modulo2/modulo2n.html
(3) ICMSF. Microorganismos de los Alimentos I. Editorial Acribia.
(4) Detección, recuento y caracterización fenotípica y genotípica de

Staphylococcus aureus enterotoxigénico a partir de alimentos.
Servicio de Fisiopatogenia, Depto. de Bacteriología. Instituto Nacional
de Enfermedades Infecciosas (INEI – ANLIS)
90
Recuento de Estafilococos coagulasa

positiva en muestras de alimentos
International Standard Organization ISO 6888-1: 1999
1. OBJETIVO
realizar el recuento y la confirmación de estafilococos coagulasa
positiva (Staphylococcus aureus y otras especies), por la técnica de
recuento de colonias en placa en muestras de alimentos.
2. ALCANCE
Este procedimiento se aplica para realizar el recuento y la
confirmación de estafilococos coagulasa positiva (Staphylococcus
aureus y otras especies) por técnica de recuento de colonias en placa
en muestras de alimentos.


Referencias
3. DESARROLLO
3.1. Definiciones y abreviaturas

Para el propósito de este documento
- Estafilococo coagulasa positiva: bacteria que forma colonia
característica y/o no característica en la superficie del medio
agar Baird Parker, y que presenta una reacción de coagulasa
positiva cuando la determinación es llevada a cabo por la
presente técnica.
- Recuento de estafilococo coagulasa positiva: determinación del
número de estafilococos coagulasa positiva por mililitro o gramo
de muestra cuando la determinación es llevada a cabo por la
presente técnica.
3.2. Principio (ver ANEXO 1)

91
3.2.1. Inoculación en la superficie de un medio de cultivo sólido

selectivo por duplicado, con una cantidad específica de la muestra si
el producto es líquido o con una cantidad específica de la dilución
inicial en caso de otros productos. 3.2.2. Inoculación bajo las mismas
condiciones de la dilución inicial o de las diluciones decimales
utilizando dos placas por cada dilución.
3.2.2. Incubación a 35ºC ó 37°C (la temperatura es acordada entre
las partes interesadas y es indicada en el informe de resultados)
y observación de las placas a las 24 h y 48 h.
3.2.3. Cálculo del número de estafilococos coagulasa positiva por
mililitro o por gramo de muestra a partir del número de colonias
típicas y/o atípicas obtenidas en una determinada dilución y
confirmadas por la prueba de la coagulasa.

3.3.3. Agar Baird Parker
3.3.4. Solución de telurito de potasio al 1 %
3.3.5. Solución de yema de huevo (aproximadamente al 20% o de
acuerdo a las instrucciones del fabricante)
3.3.6. Solución de sulfametazina (sulfametazina, sulfadimidina)
3.3.7. Caldo cerebro, corazón, infusión (caldo BHI)
3.3.8. Plasma de conejo
3.3.10. Autoclave
3.3.11. Estufa de incubación: 35ºC ± 1°C o 37°C ± 1°C
temperatura a 47°C ± 2°C.
3.3.14. Pipetas de 1 ml, 2 ml y 10 ml de capacidad, graduadas en
intervalos de 0.1, 0.1 y 0.5 ml respectivamente
diámetro y de punción del mismo material, o equivalentes estériles
descartables.
diámetro y de 140 mm de diámetro.
3.4. Muestreo
metodología.
3.5. Procedimiento
92


1/10) y homogeneizar entre 1 minuto a 3 minutos dependiendo del
alimento.
temperatura, procurar que la temperatura del diluyente y la
ambiental sean similares.

de diluyente, lo cual debe tenerse en cuenta en las operaciones

estéril.
Mezclar utilizando preferentemente un agitador mecánico, durante 5
a 10 segundos para obtener la dilución 10-2.
diluciones sucesivas, utilizar en cada operación una nueva pipeta

El tiempo transcurrido, entre el final de la preparación de la
con el medio de cultivo, no debe superar los 45 minutos. Mientras
que el lapso de tiempo límite entre la preparación de la suspensión
inicial y el comienzo de la preparación de las diluciones decimales
sucesivas es de 30 minutos.
93

3.5.2.1. Transferir 0.1 ml de la muestra si el producto es líquido ó 0.1
ml de la suspensión inicial (dilución 1/10) en caso de otros productos
y 0.1 ml de las diluciones sucesivas preparadas según 3.5.1.2. por
duplicado a placas con agar Baird Parker.
3.5.2.2. Si para ciertos productos es necesario realizar un recuento
de un número bajo de estafilococos coagulasa positiva, el límite de
detección puede ser elevado por un factor de 10 sembrando 1 ml de
la muestra si el producto es líquido ó 1 ml de la suspensión inicial
(dilución 1/10) en caso de otros productos, y 1 ml de las diluciones
sucesivas preparadas según 3.5.1.2. en una placa de Petri grande
(140 mm) con agar Baird Parker o en tres placas de Petri de 90 mm
con agar Baird Parker. En ambos casos, sembrar por duplicado
utilizando 2 placas grandes o 6 placas de Petri de 90 mm.
3.5.2.3. Cuidadosamente dispersar el inóculo sobre la superficie del
agar con una espátula de Drigalsky lo más rápido posible, tratando de
no tocar los bordes de la placa. Dejar secar las placas sin invertir,
con la tapa puesta durante 15 minutos a temperatura ambiente.
3.5.2.4. Invertir las placas sembradas e incubar a 35ºC ó 37°C (la
temperatura es acordada entre las partes interesadas y es indicada
en el informe de resultados) durante 24 h ± 2 h y luego 24 h ± 2 h
adicionales.

3.5.3.1. Después de la incubación de 24 h ± 2 h marcar en el fondo
de la placa la posición de cualquier colonia típica presente. (Ver NOTA
1)
3.5.3.2. Incubar todas las placas a 35ºC ó 37°C (la temperatura es
acordada entre las partes interesadas y es indicada en el informe de
resultados) durante 24 h ± 2 h adicionales y marcar todas las
colonias típicas nuevas. También marcar las colonias atípicas
presentes. (Ver NOTA 2).
Tener en cuenta para el recuento sólo las placas que contienen como
máximo 300 colonias totales con 150 colonias típicas y/o atípicas
hasta dos diluciones sucesivas. Una de las placas debe contener al
menos 15 colonias.
3.5.3.3. Seleccionar para la confirmación un número A de colonias (en
general 5 colonias típicas si sólo hay colonias típicas o 5 colonias
atípicas si sólo hay colonias atípicas o 5 colonias típicas y 5 colonias
atípicas si se encuentran presente ambos tipos en cada placa).
3.5.3.4. Si en la placa hay menos de 15 colonias típicas y/o atípicas
inocular con el producto líquido sin diluir o con la más baja dilución de
los otros productos. Es posible realizar un recuento estimado como se
describe en 3.5.5.2.
NOTA 1: Las colonias típicas son negras o grises, con brillo y

convexas (de 1 mm a 1.5 mm de diámetro después de una
incubación de 24 h y de 1.5 mm a 2.5 mm de diámetro después de
94
una incubación de 48 h) y rodeadas por una zona de clarificación que

puede ser parcialmente opaca. Después de una incubación de por lo
menos 24 h puede aparecer un anillo opalescente de precipitación
inmediatamente alrededor de la colonia.
Las colonias atípicas son del mismo tamaño que las típicas y pueden
presentar una de las siguientes morfologías:
- Colonias negras con brillo, con o sin un fino borde blanco, la
zona de clarificación está ausente o es vagamente visible y el
anillo opalescente ausente o poco visible.
- Colonias grises sin zona de clarificación
NOTA 2: las colonias atípicas son formadas principalmente por cepas

de estafilococos coagulasa positiva presentes por ejemplo en
productos lácteos, camarones y menudencias. Con menos frecuencia
son formadas por cepas de estafilococos coagulasa positiva presentes
en otros productos.
NOTA 3: algunas bacterias pertenecientes a otros géneros pueden

dar colonias de apariencia similar a las de estafilococos pero
realizando una observación microscópica con coloración de Gram
antes de la confirmación se puede realizar una separación de
géneros.
NOTA 4: Las colonias restantes que pueden estar presentes en la

placa y que no presentan apariencia de colonias típicas (NOTA 1) o
atípicas (NOTA 2) son consideradas como flora acompañante.
3.5.3.5. Si se realizó un inóculo de 1 ml en tres placas (ver 3.5.2.2.)

considerar esas placas como una en los subsiguientes procedimientos
de recuento y confirmación.
3.5.3.6. Para realizar un recuento estimativo de un bajo número de
estafilococos coagulasa positiva retener todas las placas que
contienen colonias típicas y atípicas, seleccionar todas las colonias
para la confirmación dentro de los límites establecidos arriba (ver
3.5.5.2.)
3.5.4. Confirmación: prueba de la coagulasa

3.5.4.1. De la superficie de cada colonia seleccionada remover un
inóculo con ansa aguja y transferir a un tubo con caldo cerebro
corazón infusión (caldo BHI), incubar a 35ºC ó 37°C durante 24 h ± 2
h.
3.5.4.2. Asépticamente agregar 0.1 ml de cada cultivo en 0.3 ml de
plasma de conejo (a menos que otra cantidad sea especificada por el
fabricante) en un tubo de hemólisis estéril. Incubar a 35ºC ó 37°C (la
temperatura es acordada entre las partes interesadas y es indicada
en el informe de resultados)
3.5.4.3. Inclinando el tubo observar la formación de coágulo después
de 4 h a 6 h de incubación. Si la prueba es negativa reexaminar
95
después de 24 h de incubación o examinar en el tiempo de incubación

especificado por el fabricante.
3.5.4.4. Considerar un resultado positivo si el volumen del coágulo
formado ocupa más de la mitad del volumen del líquido original.
3.5.4.5. Como control negativo para cada lote de plasma agregar 0.1
ml de caldo BHI estéril a 0.3 ml de plasma de conejo e incubar sin
inoculación. Para que la prueba sea válida el control negativo no debe
mostrar signos de coagulación.
3.5.5.1. Caso general

3.5.5.1.1. Cálculo del número a de estafilococos coagulasa positiva
identificados por cada placa seleccionada:
Calcular para cada una de las placas seleccionadas el número a de
estafilococos coagulasa positiva identificados de acuerdo a la
siguiente ecuación:
𝑏𝑏𝑐𝑐 𝑏𝑏𝑛𝑛𝑛𝑛
𝑎𝑎 = × 𝐶𝐶𝑐𝑐 + × 𝐶𝐶𝑛𝑛𝑛𝑛
𝐴𝐴𝑐𝑐 𝐴𝐴𝑛𝑛𝑛𝑛
Donde:
- Ac: es el número de colonias típicas sometidas a la prueba de la
coagulasa
- Anc: es el número de colonias atípicas sometidas a la prueba de
la coagulasa
- bc: es el número de colonias típicas que dieron positiva la
prueba de la coagulasa
- bnc: es el número de colonias atípicas que dieron positiva la
prueba de la coagulasa
- Cc: es el número de total de colonias típicas que se contaron en
la placa
- Cnc: es el número de total de colonias atípicas que se contaron
en la placa
Redondear a un número entero
3.5.5.1.2. Cálculo del número N de estafilococos coagulasa positiva

identificados presentes en la porción de muestra sembrada:
Para las placas que contienen un máximo de 300 colonias con 150
colonias típicas y/o atípicas en dos diluciones consecutivas calcular el
número de estafilococos coagulasa positiva para cada placa como se
especifica en 3.5.5.1.1 y calcular como un promedio de las dos
diluciones sucesivas, el número N de estafilococos coagulasa positiva
identificados, presentes en la porción de muestra sembrada,
utilizando la siguiente ecuación:
96
∑ 𝑎𝑎
𝑁𝑁 =
𝑉𝑉(𝑛𝑛1 + 0.1𝑛𝑛2 )𝑑𝑑
Donde:
- Σa: es el número de colonias de estafilococos coagulasa

positiva identificadas en todas las placas seleccionadas
- V: es el volumen de inóculo en cada placa en mililitros
- n1: es el número de placas seleccionadas de la primer dilución
- n2: es el número de placas seleccionadas de la segunda dilución
- d: es el factor de dilución correspondiente a la primer dilución
seleccionada (la suspensión inicial es una dilución)
Redondear el resultado calculado a 2 cifras significativas.
3.5.5.1.3. Informar el resultado como el número de estafilococos

coagulasa positiva por mililitro (productos líquidos) o por gramo
(otros productos), expresado como un número entre 1.0 y 9.9
inclusive multiplicado por 10x donde x es la potencia apropiada de 10.
Ejemplo:
El recuento después de la inoculación con 0.1 ml del producto dio los
siguientes resultados:
- Para la primera dilución seleccionada (10-2): 65 colonias típicas
y 85 colonias típicas, no hay colonias atípicas
- Para la segunda dilución seleccionada (10-3): 3 colonias típicas y 7
colonias típicas, no hay colonias atípicas
Se obtuvieron los siguientes datos:
- De las 65 colonias 5 colonias fueron sometidas a la prueba de la
coagulasa y todas dieron un resultado positivo, obteniendo
entonces un valor de a = 65
coagulasa y 3 colonias dieron un resultado positivo, obteniendo
- De las 3 colonias todas fueron sometidas a la prueba de la
coagulasa y 3 colonias dieron un resultado positivo, obteniendo
coagulasa y todas dieron un resultado positivo, obteniendo
65 + 51 + 3 + 7
𝑁𝑁 = = 57272
0.1(2 + 0.1 × 2)10−2
El resultado después de redondear se expresa como: 5.7 x 104
3.5.5.2. Estimación para un recuento bajo.
97
3.5.5.2.1 Si en dos placas correspondientes a la muestra (productos

líquidos) o a la suspensión inicial (otros productos), cada una tiene
menos de 15 colonias identificadas, informar el resultado de la
siguiente manera:
a) Para productos líquidos: estimación del número de estafilococos

coagulasa positiva por mililitro:
∑ 𝑎𝑎
𝑁𝑁𝑒𝑒 =
𝑉𝑉 × 2
Donde:
- Σa: es la sumatoria de las colonias de estafilococos coagulasa
positiva identificadas (3.5.5.1.1.)
- V: es el volumen sembrado en cada placa
b) Para otros productos: estimación del número de estafilococos

coagulasa positiva por gramo:
∑ 𝑎𝑎
𝑁𝑁𝑒𝑒 =
𝑉𝑉 × 2 × 𝑑𝑑
Donde:
- Σa: es la sumatoria de las colonias de estafilococos coagulasa
positiva identificadas (3.5.5.1.1.)
- V: es el volumen sembrado en cada placa
- d: es el factor de dilución de la suspensión
3.5.5.2.2. Si las dos placas correspondientes a la siembra de la

muestra (producto líquido) o de la suspensión inicial (otros
productos) no contienen colonias de estafilococos coagulasa positiva
y si la inoculación ha sido realizada con 0.1 ml de muestra informar el
resultado de la siguiente manera:
- Menos de 10 estafilococos coagulasa positiva por mililitro (para
productos líquidos)
- Menos de 10/d estafilococos coagulasa positiva por gramo
(para otros productos), donde d es el factor de dilución de la
Si la inoculación ha sido realizada con 1 ml de muestra informar el
resultado de la siguiente manera:
- Menos de 1 estafilococos coagulasa positiva por mililitro (para
productos líquidos)
- Menos de 1/d estafilococos coagulasa positiva por gramo (para
otros productos), donde d es el factor de dilución de la
98
4. ANEXOS

de estafilococos coagulasa positiva por la técnica de recuento
en placa.
Preparación de la muestra: X g de muestra + 9 x ml de diluyente (dilución 1/10)
Inoculación e incubación: transferir por duplicado 0.1 ml de las diluciones preparadas en

placas con agar Baird Parker Incubar a 35°C ó 37°C ±1ºC durante 24 h ± 2h. Luego incubar
24 h ± 2h adicionales.
Recuento y selección de las colonias características: seleccionar las placas con un

máximo de 300 colonias y hasta 2 diluciones sucesivas. Realizar el recuento y seleccionar 5
colonias características.
Confirmación bioquímica: a las 5 colonias

seleccionadas realizar la prueba de la coagulasa
Recuento y expresión de resultados
99
1. Diluyentes

Fosfato disódico mono ácido dodecahidratado
9.0 g
(Na2HPO4.12H2O)

pH para que luego de la esterilización su valor sea de 7.0 ± 0.2 a
25°C. Distribuir en frascos o tubos de acuerdo a las necesidades
analíticas. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
1.2. Solución salina peptonada


analíticas. Esterilizar a 121 º C durante 15 minutos.
2. Agar Baird Parker
2.1. Medio base

L – glicina 12.0 g
Agar 12.0 a 20.0 g*
que luego de la esterilización su valor sea de 7.0 ± 0.2 a 25°C.
100
Fraccionar en volumenes de 100 ml en frascos o botellas de

capacidad adecuada. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
2.2. Solución de telurito de potasio
Telurito de potasio (K2TeO3) 1.0 g

Disolver completamente el telurito de potasio en agua destilada con

mínimo calentamiento. Esterilizar por filtración utilizando membrana
con poros de 0.22 µm de tamaño. Conservar a 3ºC ± 2ºC por un
máximo de 3 meses. Descartar la solución si se forma un precipitado
blanco
2.3 Emulsión yema de huevo

(Concentración aproximada 20 % o de acuerdo a las indicaciones del
fabricante)
NOTA: En caso de haber disponible se debería utilizar una

preparación comercial.
Preparación:
Utilizar huevos frescos con la cáscara intacta. Lavar los huevos con
cepillo utilizando detergente líquido, enjuagar con agua y desinfectar
sumergiéndolos en etanol (solución 70%) durante 30 segundos y
dejar secar al aire o rociarlos con alcohol y esterilizar a la llama.
En condiciones asépticas romper cada huevo, separar la yema de la
clara pasando la yema varias veces de una mitad de la cáscara a la
otra.
Colocar las yemas en un frasco estéril y agregar 4 veces su volumen
de agua estéril y mezclar perfectamente. Calentar la preparación en
baño de agua a 47ºC durante 2 horas y dejar de 18 h a 24 h a 3ºC ±
2ºC hasta que se forme un precipitado. Asépticamente recolectar el
sobrenadante y conservar en un frasco estéril. La preparación se
debe conservar a 3ºC ± 2ºC, durante un máximo de 72 h.
2.4 Solución de sulfamezatina (sulfametazina, sulfadimidina)

Nota: esta solución se utiliza sólo si se sospecha que la muestra está
contaminada con Proteus
Sulfamezatina 0.2 g
Solución de Hidróxido de sodio (NaOH)=0.1 mol/l 10 ml
Disolver la sulfamezatina en la solución de Hidróxido de sodio y diluir

con agua destilada hasta llegar a un volumen de 100 ml. Esterilizar
101
por filtración utilizando membrana con poros de 0.22 µm de tamaño.

Conservar entre 3ºC ± 2ºC por un máximo de 1 mes.
2.5 Medio completo

Solución Telurito de potasio (2.2) 1.0 ml
Solución de sulfamezatina (2.4) (si es necesario) 2.5 ml
Fundir el medio base, enfriar aproximadamente a 47ºC y agregar en

condiciones de asepsia la solución de telurito de potasio (2.2) y la
emulsión yema de huevo (2.3) y la solución de sulfamezatina (2.4), si
se considera necesario porque se sospecha de la presencia de
Proteus. Cada solución debe ser previamente calentada a 47ºC en
baño de agua y mezclar bien después de cada adición.
2.6 Preparación de las placas
Colocar en las placas de Petri una cantidad adecuada del medio

completo para obtener una capa de 4 mm de espesor y dejar
solidificar.
Las placas pueden ser almacenadas antes del secado hasta 24 h a
3ºC ± 2ºC.
Antes de utilizar secar las placas preferentemente sin tapa y con la
superficie del agar hacia abajo en una estufa a una temperatura entre
25ºC y 50ºC, hasta que hayan desaparecido las gotas de agua de la
superficie del medio.
3. Caldo cerebro corazón infusión (caldo BHI)

Infusión de cerebro de ternero deshidratada 12.5 g
Infusión de carne corazón deshidratada 5.0 g
Glucosa 2.0 g
Disodio hidrógeno fosfato anhidro (Na2HPO4) 2.5 g

Ajustar el pH para que luego de la esterilización su valor sea de 7.4 ±
0.2 a 25°C. Dispensar en porciones de 10 ml o 5 ml en tubos.
102
4. Plasma de conejo
Utilizar plasma de conejo deshidratado disponible en el comercio y

rehidratar siguiendo las indicaciones del fabricante.
Si el plasma de conejo no está disponible en el comercio diluir un
volumen de plasma de conejo fresco estéril con tres volúmenes de
agua destilada estéril.
Si se ha utilizado citrato de sodio o citrato de potasio como
anticoagulante, agregar solución de EDTA (ácido
etilendiaminotetraacético) para llegar a una concentración de EDTA
del 0.1 % en el plasma diluído.
NOTA: el plasma con oxalato o heparina no requiere del agregado de

EDTA.
El plasma rehidratado o diluído debe ser utilizado inmediatamente al
menos que el fabricante de otras especificaciones.
Antes de utilizar cada lote de plasma realizar un control con una cepa
de estafilococo coagulasa positiva y una cepa de estafilococo
coagulasa negativa.
103
ANEXO 3: FOTOS
Staphylococcus aureus: colonias típicas negras o grises con brillo,

convexas, rodeadas por una zona de clarificación que puede ser
parcialmente opaca. Después de una incubación de por lo menos 24 h
puede aparecer un anillo opalescente de precipitación
1. Prueba de la coagulasa
Control negativo
Formación de coágulo:
prueba positiva
Staphylococcus aureus: Prueba de la coagulasa
104
5. REFERENCIAS

animal feeding stuffs. Horizontal method for the enumeration of
coagulase - positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other
species). Part 1: Technique using Baird Parker agar medium. First
edition 1999-02-15








105



106
NOTAS PERSONALES
107
108
Recuento de Estafilococos coagulasa

positiva en muestras de alimentos
International Commission on Microbiological Specifications for Foods
(ICMSF), Método 1
Nota: Este procedimiento es equivalente al procedimiento según la

ISO 6888-1
Con las siguientes salvedades:

1. En el punto 3.5.2.2. Inoculación e incubación: No especifica
que para un número bajo de estafilococos coagulasa positiva el
límite de detección puede ser elevado por un factor de 10
sembrando 1 ml de la muestra si el producto es líquido ó 1 ml de
la suspensión inicial (dilución 1/10) en caso de otros productos y
1 ml de las diluciones sucesivas como lo especifica en el
procedimiento según la ISO 6888-1
2. En el punto 3.5.3.2. Recuento y selección de las colonias:

Pasadas 30 horas de incubación elegir las placas que contengan
entre 20 y 200 colonias aisladas para realizar el recuento
109
Estafilococos coagulasa positiva.

Detección y enumeración por la técnica de
número más probable (NMP) en muestras de
alimentos
International Standard Organization ISO 6888-3: 2003(corrección
2004)
1. OBJETIVO
realizar la enumeración y la confirmación de estafilococos coagulasa
positiva (Staphylococcus aureus y otras especies), por la técnica de
número más probable (NMP), en muestras de alimentos y en
muestras ambientales de las áreas de producción y manipulación de
alimentos.
2. ALCANCE
Este procedimiento se aplica para realizar la enumeración y la
confirmación de estafilococos coagulasa positiva (Staphylococcus
aureus y otras especies) por técnica de NMP en muestras de
Este método es recomendado para productos donde los estafilococos
pueden estar estresados y en bajo número, por ejemplo en productos
secos.
Los estafilococos coagulasa positiva son en mayor medida
Staphylococcus aureus, pero Staphylococcus intermedius y algunas
especies de Staphylococcus hyicus pueden producir coagulasa


Referencias
3. DESARROLLO
3.1. Definiciones y abreviaturas

Para el propósito de este documento
110
- Estafilococo coagulasa positiva: bacteria que forma colonias

típicas o atípicas en la superficie de un medio de cultivo
selectivo y que da una reacción positiva para la prueba de la
coagulasa o una reacción específica del plasma de conejo en el
agar fibrinógeno plasma de conejo.
NOTA: En este procedimiento la confirmación de los estafilococos

coagulasa positiva está basada en una reacción fuertemente positiva
de la prueba de la coagulasa, pero es sabido que algunas cepas de
estafilococos coagulasa positiva dan una reacción débil pudiendo ser
confundidas con otras bacterias. En este caso, las cepas que dan una
reacción débil de coagulasa pueden distinguirse utilizando otras
pruebas adicionales como la producción de termonucleasa.
- Enumeración de estafilococo coagulasa positiva: determinación

del número de estafilococos coagulasa positiva por mililitro o
gramo de muestra.
3.2. Principio (ver Anexo 1)
3.2.1. Método de detección

3.2.1.1. Inoculación de un medio de cultivo selectivo con una
cantidad específica de la muestra si el producto es líquido o con una
cantidad específica de la dilución inicial en caso de otros productos.
3.2.1.2. Incubación de los tubos inoculados a 37°C en anaerobiosis
durante 24 h y 48 h. La presencia de presuntivos estafilococos
coagulada positiva es indicada por la reducción del telurito de
potasio.
NOTA: En este procedimiento se logra la anaerobiosis mediante la

formación de un tapón de agar o parafina en cada tubo o por la
incubación de los tubos en una estufa o jarra en condiciones de
anaerobiosis.
3.2.1.3. Inoculación por superficie del medio de cultivo agar Baird

Parker a partir de los tubos presuntamente positivos incubados
durante 24 h y el resto de los tubos de 48 h.
3.2.1.4 Incubación de las placas a 37ºC durante 24 h y 48 h. La
presencia de estafilococos coagulasa positiva presuntivos es indicada
por la reducción del telurito de potasio y la reacción de la yema de
huevo.
3.2.1.5. Confirmación de las colonias típicas y atípicas por la prueba
de la coagulasa
NOTA: Alternativamente se puede inocular la superficie de un medio

agar fibrinógeno plasma de conejo y luego de una incubación
111
apropiada, determinar la presencia de estafilococos coagulasa

positiva, indicada por las colonias que dan una reacción específica con
el fibrinógeno del plasma de conejo.
3.2.1.6. Expresión de resultados como “presencia” o “ausencia” de

estafilococos coagulasa positivos en x g ó x ml de producto.
3.2.2. Método de enumeración

3.2.2.1. Inoculación de un medio de cultivo líquido selectivo con
diluciones decimales sucesivas del producto.
3.2.2.2. Incubación de los tubos inoculados a 37°C en anaerobiosis
durante 24 h y 48 h. La presencia de estafilococos coagulasa positiva
presuntivos es indicada por la reducción del telurito de potasio.
NOTA: En este procedimiento se logra la anaerobiosis mediante la

formación de un tapón de agar o parafina en cada tubo o por la
incubación de los tubos en una estufa o jarra en condiciones de
anaerobiosis.
3.2.2.3. Inoculación por superficie del medio de cultivo agar Baird

Parker a partir de los tubos positivos presuntivos incubados durante
24 h y el resto de los tubos de 48 h.
3.2.2.4 Incubación de las placas a 37ºC durante 24 h y 48 h. La
presencia de estafilococos coagulasa positiva presuntivos es indicada
por la reducción del telurito de potasio y la reacción de la yema de
huevo.
3.2.2.5. Confirmación de las colonias típicas y atípicas por la prueba
de la coagulasa
NOTA: Alternativamente se puede inocular la superficie de un medio

agar fibrinógeno plasma de conejo y luego de una incubación
apropiada, determinar la presencia de estafilococos coagulasa
positiva, indicada por las colonias que dan una reacción específica con
el fibrinógeno del plasma de conejo.
3.2.2.6. El número más probable (NMP) de estafilococos coagulasa

positivos por mililitro o por gramo de muestra es calculado teniendo
en cuenta las diluciones confirmadas y utilizando la tabla de NMP.

3.3.3. Caldo Giolitti y Cantoni modificado
3.3.4. Solución agar
3.3.5. Agar Baird Parker
112
3.3.6. Agar fibrinógeno plasma de conejo

3.3.7. Solución de telurito de potasio al 1 %
3.3.8. Solución de yema de huevo (aproximadamente al 20% o de
acuerdo a las instrucciones del fabricante)
3.3.9. Caldo cerebro, corazón, infusión (caldo BHI)
3.3.10. Plasma de conejo
3.3.12. Autoclave
3.3.13. Estufa de incubación: 37ºC ± 1°C
temperatura a 44°C, 47°C y 37°C.
3.3.16. Pipetas de 1 ml de capacidad graduadas en intervalos de 0.1
ml.
diámetro y ansas de punción del mismo material, o equivalentes
estériles descartables.
diámetro.
3.3.20. Espátula para cortar el agar
3.3.21. Jarra de anaerobiosis
3.4. Muestreo
metodología.
3.5. Procedimiento


alimento.
temperatura, procurar que la temperatura del diluyente y la
ambiental sean similares.
113


estéril.
Mezclar utilizando preferentemente un agitador mecánico durante 5
segundos a 10 segundos para obtener la dilución 10-2.

es de 30 minutos.

inicial
Agregar 1 ml de la suspensión inicial a un tubo con 9 ml del caldo
Giolitti y Cantoni modificado simple concentración (es decir 0.1 g ó
0.1 ml de la muestra) ó 10 ml de la suspensión inicial a un tubo con
10 ml del caldo Giolitti y Cantoni modificado doble concentración (es
decir 1 g ó 1 ml de la muestra). Para cantidades más grandes de
muestra de ensayo, preparar la suspensión inicial agregando x ml o x
g de la muestra a 9 x ml del diluyente (ver 3.5.1.1.). Luego agregar
toda la suspensión inicial a 90 x ml del caldo Giolitti y Cantoni
modificado simple concentración previamente desaereado y con
telurito de potasio agregado, de este modo quedará un mínimo de
volumen de aire en el tubo o frasco (ejemplo agregar 5 ml ó 5 g de la
muestra a 45 ml del diluyente y agregar todo el volumen de
114
suspensión inicial a 450 ml del caldo Giolitti y Cantoni modificado

simple concentración. Cuidadosamente formar un tapón de agar o
parafina, enfriar entre 44°C y 47°C en la parte superior del medio y
dejar solidificar para sellar el tubo.
3.5.2.1.2. Enriquecimiento
Incubar la suspensión inicial durante 24 h ± 2 h a 37°C. Si se
observa formación de un precipitado negro sembrar como se indica
en 3.5.2.1.3, si no se observa formación de un precipitado negro
incubar durante 24 h más y sembrar como se indica en 3.5.2.1.3.
(haya o no formación de precipitado negro)
3.5.2.1.3. Siembra de los tubos

Retirar asépticamente el tapón de agar o parafina utilizando una
espátula estéril para cortar el agar en cuartos a lo largo. Si es
necesario introduzca la espátula alrededor del tapón para liberarlo de
las paredes del tubo. Agitar el tubo para que los pedacitos de tapón
se depositen en el fondo del tubo y para resuspender el cultivo.
Con un ansa estéril estriar cada uno de los caldos seleccionados en la
superficie de placas de agar Baird Parker o placas de agar
fibrinógeno plasma de conejo para obtener colonias aisladas.
3.5.2.1.4. Incubación
Invertir las placas sembradas e incubar a 37ºC durante 24 h ± 2 h y
48 h ± 2 h.
3.5.2.2. Método de enumeración

inicial
Preparar la suspensión inicial y las diluciones decimales de acuerdo al
ítem 3.5.1.
3.5.2.2.2. Inoculación
Tomar 3 tubos con medio doble concentración desaereado y con
telurito de potasio agregado. Transferir a cada uno de los tubos 10 ml
de la muestra inicial para productos líquidos ó 10 ml de la suspensión
inicial (es decir 1 g de la muestra) para otros productos.
Tomar 3 tubos con medio simple concentración desaereado y con
telurito de potasio agregado. Transferir a cada uno de los tubos 1 ml
de la muestra inicial para productos líquidos ó 1 ml de la suspensión
inicial (es decir 0.1 g de la muestra) para otros productos.
Para cada dilución decimal sucesiva (ej. 10-1, 10-2 y 10-3 para
productos líquidos, ó 10-2, 10-3 y 10-4 para otros productos) transferir
1 ml a 3 tubos con medio simple concentración desaereado y con
telurito de potasio agregado.
Preparar un número adecuado de diluciones para asegurar que la
dilución final es suficiente para obtener tres tubos negativos.
115
En cada caso mezclar cuidadosamente los tubos evitando la

introducción de aire.
Cuidadosamente formar un tapón de agar o parafina, enfriar entre
44°C y 47°C en la parte superior del medio y dejar solidificar para
sellar el tubo.
3.5.2.2.3. Incubación
Incubar los tubos inoculados (3.5.2.2.2) durante 24 h ± 2 h a 37°C.
Si se observa formación de un precipitado negro sembrar como se
indica en 3.5.2.2.4, si no se observa formación de un precipitado
negro incubar durante 24 h más y sembrar como se indica en
3.5.2.2.3.4 (haya o no formación de precipitado negro)
3.5.2.2.4. Siembra de los tubos

Ver 3.5.2.1.3.
3.5.2.2.5. Incubación de las placas

Invertir las placas sembradas e incubar a 37ºC durante 24 h ± 2 h y
48 h ± 2 h.
3.5.3 Selección e interpretación de las placas
3.5.3.1. Agar Baird Parker

3.5.3.1.1. Selección de colonias
Después de la incubación de 24 h ± 2 h marcar en el fondo de la
placa la posición de cualquier colonia típica presente. (Ver NOTA 1)
Incubar todas las placas a 37°C durante 24 h ± 2 h adicionales y
marcar todas las colonias típicas nuevas. También marcar las colonias
atípicas presentes. (Ver NOTA 2).
NOTA 1: Las colonias típicas son negras o grises con brillo y convexas
(de 1 mm a 1.5 mm de diámetro después de una incubación de 24 h
y de 1.5 mm a 2.5 mm de diámetro después de una incubación de 48
h) y rodeadas por una zona de clarificación que puede ser
NOTA 2: Las colonias atípicas son del mismo tamaño que las típicas
y pueden presentar una de las siguientes morfologías:
- Colonias negras con brillo, con o sin un fino borde blanco, la
zona de clarificación está ausente o es vagamente visible y el
anillo opalescente ausente o poco visible.
- Colonias grises sin zona de clarificación.
Las colonias atípicas son formadas principalmente por cepas de

estafilococos coagulasa positiva presentes por ejemplo en productos
lácteos, camarones y menudillos. Con menos frecuencia son formadas
116
por cepas de estafilococos coagulasa positiva presentes en otros

productos.
NOTA 3: Las colonias restantes que pueden estar presentes en la

placa y que no presentan apariencia de colonias típicas (NOTA 1) o
atípicas (NOTA 2) son consideradas como flora acompañante.
3.5.3.1.2. Confirmación: prueba de la coagulasa

De la superficie de cada colonia seleccionada remover un inóculo con
ansa aguja y transferir a un tubo con caldo cerebro, corazón infusión
(caldo BHI), incubar a 37ºC durante 24 h ± 2 h.
Asépticamente agregar 0.1 ml de cada cultivo en 0.3 ml de plasma de
conejo (al menos que otra cantidad sea especificada por el
fabricante) en un tubo de hemólisis estéril. Incubar a 37ºC ± 1ºC.
Inclinando el tubo observar la formación de coagulo después de 4 h a
6 h de incubación. Si la prueba es negativa reexaminar después de
24 h de incubación
Considerar un resultado positivo si el cultivo produce al menos una
reacción +3 de acuerdo al puntaje de la figura 1, las reacciones de
+1 a +2 son consideradas como intermedias.
Como control negativo para cada lote de plasma agregar 0.1 ml de
caldo BHI estéril a 0.3 ml de plasma de conejo e incubar sin
inoculación. Para que la prueba sea válida el control negativo no debe
mostrar signos de coagulación.
Registrar como positivo cada tubo desde el cual al menos una colonia
es confirmada con la prueba de coagulasa positiva.
Figura 1: Puntaje de la prueba de la coagulasa
Negativo (-): no hay evidencia de formación de coagulo

Positivo +1: coágulos pequeños y desorganizados
Positivo +2: un coágulo pequeño organizado
Positivo +3: un coágulo grande organizado
Positivo +4: La totalidad del contenido coagula y el coágulo no se desplaza
cuando el tubo es invertido.
117

De acuerdo a la interpretación de los resultados informar presencia o
ausencia de Estafilococos coagulasa positiva en la cantidad de
muestra analizada por gramos o mililitros para muestras líquidas.
3.5.4.2. Método de enumeración (ISO 7218)
3.5.4.2.1. Selección de las diluciones

Nota: La suspensión inicial y la muestra para el caso de productos
líquidos son consideradas como diluciones.
Para cada dilución inoculada en el medio líquido, registrar el número
de tubos positivos en los cuales se confirmó la presencia de
Estafilococos coagulasa positiva.
3.5.4.2.2. Selección de resultados positivos para el cálculo de

NMP
Hay combinaciones de tubos positivos con una probabilidad de
aparición mucho mayor que otras. Por ejemplo, es mucho menos
probable que aparezca una combinación de resultados positivos de 0,
0, 3 que una combinación de 3, 2, 1. Para cuantificar esta
probabilidad, se ha asignado un índice de 0 a 3 a todas las
combinaciones posibles de resultados positivos. La categoría 1
corresponde a los resultados de probabilidad más alta, mientras que
los resultados de la categoría 3 son raros y no son fáciles de
reproducir. Los peores casos son los resultados de la categoría 0,
deberían considerarse con un alto grado de desconfianza. Asumiendo
que los resultados del análisis son correctos, debería esperarse que el
95% de las combinaciones correspondan a la categoría 1, el 4 % a la
categoría 2 y el 0.9% a la categoría 3 y solamente el 0.1% a la
categoría 0. En la tabla 2 del Anexo 3 se explican con más detalles las
categorías.
En el caso que se realicen más de tres diluciones, la selección de la

combinación “correcta” de tres diluciones consecutivas no siempre es
muy evidente. Sin embargo, se puede hacer fácilmente registrando
todas las combinaciones posibles de tubos positivos, determinando en
la tabla 1 a cual categoría corresponde.
Por consiguiente, se aplican las reglas siguientes:

• Se selecciona la combinación de tres diluciones consecutivas
con un perfil de categoría 1 para obtener el índice de NMP. Si se
obtiene más de una combinación con perfil de categoría 1, se
utiliza la que tenga un mayor número de tubos positivos.
118

En la tabla siguiente se muestran algunos ejemplos
Ejemplo de selección de resultados positivos para el cálculo de

NMP
|: ISO 7218
3.5.4.2.3. Cálculo y expresión de resultados

Seleccionar tres diluciones consecutivas de acuerdo al punto
3.5.5.2.2. y determinar el NMP entrando en la tabla 1 del ANEXO 3.
Utilizando el índice de NMP determinado en la tabla 1, se determina la
cantidad más probable de microorganismos en el volumen de
referencia.
El resultado se expresa cómo el número más probable de
Estafilococos coagulasa positiva por gramo o mililitro.
119
4. ANEXOS

de estafilococos coagulasa positiva
X g de muestra + 9 x ml de diluyente (dilución 1/10)
Preparación de las diluciones decimales
Inoculación de los tubos con medio de cultivo (caldo Giolitti y Cantoni) con diluciones decimales
sucesivas del producto. Se inoculan series de 3 tubos por cada dilución
Incubación de los tubos a 37°C en anaerobiosis durante 24 h y 48 h.
La presencia de estafilococos coagulasa positiva presuntivos es indicada por la reducción del

telurito de potasio.
Inoculación por superficie del medio agar Baird Parker a partir de los tubos positivos presuntivos.
Incubación de las placas a 37ºC durante 24 h y 48 h.
Confirmación de las colonias típicas y atípicas por la prueba de la coagulasa
Cálculo del NMP de acuerdo al número de tubos confirmados y expresión de resultados
120
1. Diluyentes

Fosfato disódico mono ácido dodecahidratado
9.0 g
(Na2HPO4.12H2O)

1.2. Solución salina peptonada (SFP)


analíticas. Esterilizar a 121 º C durante 15 minutos.
2. Caldo Giolitti y Cantoni modificado
2.1. Medio base
Doble Simple
concentración concentración
Digesto enzimático de caseína 20.0 g 10.0 g
Extracto de carne 10.0 g 5.0 g
Extracto de levadura 10.0 g 5.0 g
Cloruro de litio 10.0 g 5.0 g
Manitol 40.0 g 20.0 g
Cloruro de sodio 10.0 g 5.0 g
Glicina 2.4 g 1.2 g
Piruvato de sodio 6.0 g 3.0 g
Polyoxyethylenesorbitan monooleato
2.0 g 1.0 g
(Tween 80)
121
Agua destilada 1000 ml 1000 ml
Disolver los componentes en agua, calentando y mezclando si es

necesario. Enfriar a temperatura ambiente y ajustar el pH para que
después de la esterilización sea de 6.9 ± 0.2 a 25°C. Fraccionar en
cantidades apropiadas en tubos de dimensiones adecuadas (ej. 16
mm x 160 mm en el caso del medio simple concentración y 20 mm x
200 mm en el caso del medio doble concentración). Esterilizar a
121°C durante 15 minutos.


máximo de 1 mes. Descartar la solución si se forma un precipitado
blanco.
2.3 Medio completo
Antes de usar calentar el medio base (2.1) a 100°C durante 15

minutos para eliminar el aire. Enfriar entre 44°C y 47°C y
asépticamente agregar la solución de telurito de potasio (2.2): 0.1 ml
para los tubos con medio simple concentración y 0.2 ml para los
tubos con medio doble concentración.
3. Solución de agar (20 g/l)
Agar 15 a 20 g
Disolver el agar en agua hasta ebullición y esterilizar a 121°C durante

15 minutos. Enfriar entre 44°C y 47°C antes de su uso.
4.1. Medio base

L –glicina 12.0 g
122

Agar 12.0 a 20.0 g*
que después de la esterilización sea de 7.2 ± 0.2 a 25°C. Fraccionar
en volúmenes de 100 ml en frascos o botellas de capacidad
adecuada. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.


máximo de 3 meses.
4.3 Emulsión yema de huevo (de concentración aproximada 20 %

o de acuerdo a las instrucciones del fabricante). En caso de haber
disponible se debería utilizar una preparación comercial.
Preparación:
Utilizar huevos frescos con la cáscara intacta. Lavar los huevos con
cepillo utilizando detergente líquido, enjuagar con agua y desinfectar
sumergiéndolos en etanol (solución 70%) durante 30 segundos y
dejar secar al aire o rociarlos con alcohol y esterilizar a la llama.
En condiciones asépticas romper cada huevo, separar la yema de la
clara pasando la yema varias veces de una mitad de la cáscara a la
otra.
Colocar las yemas en un frasco estéril y agregar 4 veces su volumen
de agua estéril y mezclar perfectamente. Calentar la preparación en
baño de agua a 47ºC por 2 horas y dejar de 18 a 24 h a 3ºC ± 2ºC
hasta que se forme un precipitado. Asépticamente recolectar el
sobrenadante y conservar en un frasco estéril. La preparación se
debe conservar a 3ºC ± 2ºC, durante un máximo de 72 h.
4.4 Solución de sulfamezatina (sulfametazina, sulfadimidina)

Nota: esta solución se utiliza sólo si se sospecha que la muestra está
contaminada con Proteus
Sulfamezatina 0.2 g
Solución de hidróxido de sodio (NaOH) = 0.1 mol/l 10 ml
123
Disolver la sulfamezatina en la solución de hidróxido de sodio y diluir

con agua destilada hasta llegar a un volumen de 100 ml. Esterilizar
por filtración utilizando membrana con poros de 0.22 µm de tamaño.
Conservar a 3ºC ± 2ºC por un máximo de 1 mes.
4.5 Medio completo

Solución de sulfamezatina (2.4) (si es necesario) 2.5 ml
Fundir el medio base, enfriar aproximadamente a 47ºC y agregar en

condiciones de asepsia la solución de telurito de potasio (2.2) y la
emulsión yema de huevo (2.3) y la solución de sulfamezatina (2.4), si
se considera necesario porque se sospecha de la presencia de
Proteus. Cada solución debe ser previamente calentada a 47ºC en
baño de agua y mezclar bien después de cada adición.

solidificar.
3ºC ± 2ºC.
5. Agar fibrinógeno plasma de conejo
NOTA: Se pueden utilizar los medios comercialmente disponibles que

estén de acuerdo con las especificaciones de este punto de la norma.
Sin embargo, teniendo en cuenta la variabilidad experimentada de los
lotes manufacturados del suplemento, se recomienda que cada lote
de solución de fibrinógeno bovino / plasma de conejo sea testeada
antes de su uso, mediante la ejecución de controles positivos y
negativos.
5.1. Medio base

124
L –glicina 12.0 g
Agar 12.0 a 20.0 g*
que después de la esterilización sea de 7.2 ± 0.2 a 25°C.
Fraccionar en volúmenes de 90 ml en frascos o botellas de capacidad
adecuada. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.


máximo de 3 meses.
5.3. Solución de fibrinógeno bovino
Fibrinógeno bovino 5.0 g a 7 g*

* Dependiendo de la pureza del fibrinógeno bovino
En condiciones asépticas disolver el fibrinógeno en agua antes de
utilizar.
5.4. Plasma de conejo y solución de inhibidor de tripsina
Plasma de conejo con EDTA para coagulasa 30 ml

Inhibidor de tripsina 30 g
En condiciones asépticas disolver los componentes en agua antes de

utilizar.
5.5. Medio completo

Solución de fibrinógeno bovino (5.3) 7.5 ml
Plasma de conejo y solución de inhibidor de tripsina (5.4) 2.5 ml
125
Fundir el medio base, enfriar a 48ºC ± 1°C en baño de agua y

agregar en condiciones de asepsia las 3 soluciones previamente
calentadas a 48ºC ± 1°C en baño de agua.
Mezclar bien, por rotación, después de cada adición para reducir al
mínimo la formación de espuma.
Utilice el medio completo inmediatamente después de su preparación,
con el fin de evitar cualquier precipitación del plasma.
ADVERTENCIA Si se usa una solución de fibrinógeno bovino / plasma

de conejo disponible en el mercado siga con sumo cuidado las
instrucciones del fabricante para la preparación de esta solución y del
medio completo (en particular, la temperatura del medio de base).
De lo contrario, el medio puede perder por completo su actividad.

solidificar.
3ºC ± 2ºC.
6. Caldo cerebro, corazón, infusión (caldo BHI)

Infusión de cerebro de ternero deshidratada 12.5 g
Infusión de carne corazón deshidratada 5.0 g
Glucosa 2.0 g
Disodio hidrógeno fosfato anhidro (Na2HPO4) 2.5 g

Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7.4 ± 0.2
a 25°C. Dispensar en porciones de 10 ml o 5 ml en tubos. Esterilizar
7. Plasma de conejo
Utilizar plasma de conejo deshidratado disponible en el comercio y

rehidratar siguiendo las indicaciones del fabricante.
126
Si el plasma de conejo no está disponible en el comercio diluir un

volumen de plasma de conejo fresco estéril con tres volúmenes de
agua destilada estéril.
Si se ha utilizado citrato de sodio o citrato de potasio como
anticoagulante, agregar solución de EDTA (ácido
etilendiaminotetraacético) para llegar a una concentración de EDTA
del 0.1 % en el plasma diluido.
NOTA: el plasma con oxalato o heparina no requiere del agregado de

EDTA.
El plasma rehidratado o diluido debe ser utilizado inmediatamente al
menos que el fabricante de otras especificaciones.
Antes de utilizar cada lote de plasma realizar un control con una cepa
de estafilococo coagulasa positiva y una cepa de estafilococo
coagulasa negativa.
127
ANEXO 3:
Tabla1: Índices de NMP y límites de intervalo de confianza

(95%) cuando se utilizan tres porciones analíticas de 1g (ml),
tres de 0.1g (ml) y tres de 0.01 g (ml)
b
: ver tabla 2
Fuente: ISO 7218
128
Tabla 2:
a
Categoría Definición
Cuando el número de bacterias de la muestra es igual al valor de NMP

hallado, este resultado es de los que tienen mayor probabilidad de
1 obtenerse. Como mucho, hay un 5 % de probabilidad de obtener un
resultado que es menos probable que el de menor probabilidad de esta
categoría
hallado, este resultado es de los que tienen una probabilidad de
obtenerse menor que incluso el resultado menos probable de la categoría
2
1, pero hay en el mejor de los casos solamente un 1% de probabilidad de
obtener un resultado que es menos probable que el de menor
probabilidad de esta categoría.
obtenerse menor que incluso el resultado menos probable de la categoría
3
2, pero hay en el mejor de los casos solamente un 0.1% de probabilidad
de obtener un resultado que es menos probable que el de menor
probabilidad de esta categoría.
0 obtenerse menor que incluso el resultado menos probable de la categoría
3. Solamente hay un 0.1% de probabilidad de obtener un resultado de
esta categoría, incluso sin que se haya cometido ninguna incorrección
a
Antes de comenzar los análisis, debería decidirse que categoría se va a aceptar, es
decir, solamente la categoría 1, la 1 y la 2 o incluso la 1, la 2 y la 3. Cuando se vaya a
tomar una decisión de gran importancia en base a los resultados, solamente debería
aceptarse la categoría 1, o en todo caso la 1 y la 2. Los resultados de la categoría 0
deberían considerarse con un alto grado de desconfianza.
Fuente: ISO 7218
129
ANEXO 4: FOTOS
1. Caldo Giolitti y Cantoni
Tubo presuntamente
positivo
Staphylococcus aureus: Caldo Giolitti Cantoni
Staphylococcus aureus: colonias típicas negras o grises con brillo y

convexas rodeadas por una zona de clarificación que puede ser
130
3. Prueba de la coagulasa
Control negativo
Formación de coagulo:
prueba positiva
Staphylococcus aureus: Prueba de la coagulasa
131
5. REFERENCIAS

animal feeding stuffs. Horizontal method for the enumeration of
coagulase - positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other
species). Part 3: Detection and MNP technique for low numbers. First
edition 2003-03-15. Corrected version 2004-01-15








132



133
Estafilococos coagulasa positiva

Detección y enumeración por la técnica de número
más probable (NMP) en muestras de alimentos
International Commission on Microbiological Specifications for Foods
(ICMSF), Método 5
Nota: Este procedimiento es equivalente al procedimiento según la

ISO 6888-3
Con las siguientes salvedades:

1. En el punto 3.5.2.2.2. Inoculación: pipetear volúmenes de 1
ml de cada una de las tres diluciones decimales (10-1, 10-2, 10-3)
en tubos de caldo Giolitti y Cantoni (3 tubos por dilución).
2. En el punto 3.5.2.2.3. Incubación: Incubar los tubos durante
24 h - 48 h a 35°C – 37°C. La presencia de S. aureus se pone de
manifiesto por la aparición de un precipitado negro o por el
ennegrecimiento del medio.
3. En el punto 3.5.2.2.4. Siembra de los tubos. Utilizando
pipetas Pasteur estériles, tomar algunas gotas del fondo de cada
tubo y extenderlas sobre la superficie de placas de Petri
independiente conteniendo agar Baird Parker.
4. En el punto 3.5.2.2.5. Incubación de las placas: incubar las
placas en posición invertida a 35°C – 37°C durante 24 h.
5. En el punto 3.5.5.2.3. Cálculo y expresión de resultados:
Calcular el NMP de S.aureus presentes en el alimento teniendo
en cuenta el número de placas de cada dilución que contienen
estafilococos positivos y utilizando la tabla 1.
Para la selección de tubos elegir la dilución más alta en la que sean

positivos los 3 tubos y las dos diluciones superiores más próximas.
Por ejemplo, si la dilución más alta en la que aparecen los tres tubos
positivos es la 1:100 y en la 1:1000 hay un tubo positivo y en la
1:10000 ninguno, el resultado se anotaría del siguiente modo:
dilución 1:100 = 3, dilución 1:1000 = 1 y dilución 1:10000 = 0. Estos
resultados corresponden a la tabla de NMP para series de 3 tubos a
un NMP de 400. Si no hubiera ninguna dilución que presentase los 3
tubos positivos, seleccionar las 3 diluciones más altas con algún tubo
positivo. Por ejemplo, si las cuatro últimas diluciones con algún tubo
positivo fueran 1:10, 1:100, 1:1000, y 1:10000 con 2, 2, 1 y 1 tubos
positivos, respectivamente, los resultados se anotan como 1:100 = 2,
134
1:1000 = 1 y 1:1000 = 1. Este resultado corresponde en la tabla de

NMP a 200.
Cuando no se hayan hecho diluciones más altas, de forma que la
última presente también los tres tubos positivos, seleccionar las
últimas 3 diluciones realizadas. Por ejemplo si las tres últimas
diluciones fueran 1:100, 1:1000 y 1:10000 y el número de tubos
positivos fuera 3, 3 y 3., respectivamente, los resultados se anotarían
como 1:100 = 3, 1:1000 = 3 y 1:10000 = 3. En este caso el NMP es
igual o mayor de 11000.
Tabla 1: Índices de NMP y límites de confianza (99% y 95%)

cuando se utilizan tres porciones analíticas de 0.1g (ml), tres
de 0.01g (ml) y tres de 0.001 g (ml)
Fuente: Microorganismos de los Alimentos 1. Técnicas de análisis

microbiológico.ICMSF. Segunda edición.
135
NOTAS PERSONALES
136
137
www.anmat.gov.ar
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
DE LOS ALIMENTOS
METODOLOGÍA ANALÍTICA OFICIAL
MICROORGANISMOS
INDICADORES
VOLUMEN 3
Versión: Noviembre 2014

Este manual ha sido preparado por integrantes del Grupo
Técnico de Microbiología de la RENALOA
COORDINACIÓN TÉCNICA:
- Nancy Passalacqua, CEPROCOR. Córdoba
- Josefina Cabrera, INAL - ANMAT
REDACCIÓN:
- María Angélica Díaz. Departamento Laboratorio, Dirección Provincial de
Salud Ambiental (DSA), Trelew - Chubut
- María del Pilar Barrio. Departamento Laboratorio, Dirección Provincial de
Salud Ambiental (DSA), Trelew – Chubut
- Mariela E. Darré, Dirección de Bromatología - Chaco
- Marcela López. Laboratorio Regional Salud Ambiental, Cinco Saltos - Río
Negro
- Mariela Cofre. Laboratorio Regional Salud Ambiental, Villa Regina - Río
Negro
- Marina Susana Condorí. Laboratorio de la Dirección de Bromatología,
SIPROSA, Tucumán
- Daniela Lazarte. Laboratorio de la Dirección de Bromatología, SIPROSA,
Tucumán
- Verónica Trevisán. Instituto Biológico Tomás Perón, La Plata
- Cecilia Peirano. Instituto Biológico Tomás Perón, La Plata
- Carolina Del Bó. CEPROCOR. Córdoba
- Armando Luis Cañete. INAL - Posadas
- María del Carmen Alcaide. INAL - ANMAT
REVISIÓN TÉCNICA:
- María Angélica Díaz. Departamento Laboratorio, Dirección Provincial de
- María del Pilar Barrio. Departamento Laboratorio, Dirección Provincial de
- Mariela E. Darré, Dirección de Bromatología - Chaco
- Marcela López. Laboratorio Regional Salud Ambiental Cinco Saltos - Río
Negro
- Mariela Cofre. Laboratorio Regional Salud Ambiental, Villa Regina - Río
Negro
- Armando Luis Cañete. INAL - Posadas
- Alina Rondini. Laboratorio de Alimentos Municipalidad de Córdoba. Córdoba
- Marina Susana Condorí. Laboratorio de la Dirección de Bromatología,
SIPROSA, Tucumán
- Cecilia Peirano. Instituto Biológico Tomás Perón, La Plata
- Florencia Soledad Mazzeo. Laboratorio de Aguas y Alimentos , Dirección
Provincial de Bromatología, Neuquén
- Carolina Del Bó. CEPROCOR. Córdoba
- Nancy Passalacqua. CEPROCOR. Córdoba
- Josefina Cabrera Durango. INAL - ANMAT
- María del Carmen Alcaide. INAL - ANMAT
REVISIÓN, EDITORIAL Y EDICIÓN:

- Fernando Trinks. INAL - ANMAT
INDICE
Microorganismos aerobios mesofilos. Generalidades. pág. 5
Método horizontal para el recuento de Microorganismos.

Parte I: Recuento de colonias a 30°C mediante la técnica de
siembra en profundidad. pág. 8
Procedimiento según International Standard Organization
ISO 4833-1:2013.
Método horizontal para el recuento de Microorganismos.

Parte II: Recuento de colonias a 30°C mediante la técnica
de siembra en superficie. pág. 22
ISO 4833-2:2013.
Recuento de aerobios mesófilos en muestras de alimentos.

Técnica de recuento en placa. pág. 43
Procedimiento según BAM, Capítulo 3, enero de 2001.
Recuento de microorganismos aerobios mesófilos en

muestras de alimentos.
pág. 60
Técnica de Recuento en placa.
Procedimiento según ICMSF – 2000.
Mohos y levaduras. Generalidades. pág. 75
Método horizontal para la enumeración de mohos y

levaduras.
Parte 2: Técnica de recuento en placa para productos con
pág. 78
actividad de agua menor o igual a 0.95 .
ISO 21527-2:2008.
Recuento de unidades formadoras de colonias de Mohos y

Levaduras en leche y productos de la leche.
Técnica de recuento en placa a 25ºC pág. 93
ISO 6611:2004.
Recuento de mohos y levaduras muestras de alimentos.

Técnica de recuento en placa. pág. 116
Procedimiento según APHA 2001. Capítulo 20.
Anaerobios Sulfito Reductores. Generalidades. pág. 131
Método Horizontal para el Recuento de bacterias sulfito

reductoras que crecen en anaerobiosis.
pág. 136
ISO 15213:2003.
Microorganismos Aerobios Mesófilos
nismo Microorganismos
aerobios mesófilos
Microorganismos aerobios
mesófilos
1. Generalidades
En este grupo se incluyen todos los microorganismos, capaces de

desarrollar en presencia de oxígeno a una temperatura comprendida
entre 20°C y 45°C con una óptima entre 30ºC y 40ºC.
El recuento de microorganismos aerobios mesófilos, en condiciones
establecidas, estima la microflora total sin especificar tipos de
microorganismos.
Refleja la calidad sanitaria de los productos analizados, indicando
además de las condiciones higiénicas de la materia prima, la forma
como fueron manipulados durante su elaboración.
Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la
ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un
recuento elevado no significa presencia de flora patógena. Ahora
bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación, no son
recomendables recuentos elevados.
Un recuento elevado puede significar:
- Excesiva contaminación de la materia prima.
- Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración.
- La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos.
- La inmediata alteración del producto.
En el uso o la interpretación del recuento de microorganismo aerobios

mesofilos hay ciertos factores que deben ser tenidos en cuenta:
Este recuento es sólo de microorganismos vivos.

- La utilidad del indicador depende de la historia del producto y el
momento de la toma de muestra. En alimentos perecederos
manipulados correctamente pueden desarrollar recuentos elevados
y perder calidad si son almacenados por un período de tiempo
prolongado. En este caso, el recuento no se encontraría elevado
por la condición de higiene del producto, sino por la vida útil del
mismo.
- Los procedimientos que sufre el alimento en su elaboración, por
ejemplo un proceso térmico, pueden enmascarar productos con
altos recuentos o condiciones deficientes de higiene. Además, el
almacenamiento prolongado en congelación o con pH bajo puede
producir una disminución del recuento.
- El recuento de mesófilos nos indica las condiciones higiénico
sanitarias de algunos alimentos pero no tiene significado sanitario
75
Microorganismos
aerobios mesófilos
- en otros productos que han sido madurados con bacterias (por

ejemplo quesos) o alimentos que dentro de su formulación tienen
conservadores.
2. Referencias
(1) María del Rosario Pascual Anderson, 1992. Editorial Díaz de

Santos, S.A., MADRID, España. Microbiología Alimentaria:
Metodología Analítica para Alimentos y Bebidas.
(2) ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis

microbiológico. Volumen I - SEGUNDA EDICION. EDITORIAL ACRIBIA
ZARAGOZA (España).
(3) Guía de Interpretación de Resultados Microbiológicos de

Alimentos. Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y
Tecnología Médica (ANMAT). Instituto Nacional de Alimentos (INAL).
6
nismo Microorganismos
aerobios mesófilos
NOTAS PERSONALES
7
Microorganismos
aerobios mesófilos
Método horizontal para el recuento

de Microorganismos
Parte I: Recuento de colonias a 30°C mediante
la técnica de siembra en profundidad
International Standard Organization ISO 4833-1:2013
1. OBJETIVO

realizar el recuento de microorganismos capaces de crecer y formar
colonias en un medio sólido tras la incubación a 30°C.
2. ALCANCE
Este procedimiento se aplica para realizar un método horizontal para

el recuento de microorganismos capaces de crecer y formar colonias
en un medio sólido tras la incubación a 30°C.
El método resulta aplicable para:
a) Productos destinados al consumo humano y la alimentación
animal;
b) Muestras ambientales de área de producción y manipulación de
alimentos para consumo humano y alimentación animal.
Esta parte de la Norma ISO 4833 resulta aplicable para:
1) productos que requieran un recuento fiable cuando se especifica

un límite de detección bajo (inferior a 102/g o 102/ml en el caso
de muestras líquidas o inferior a 103/g para muestras sólidas);
2) productos en los que se espera la presencia de colonias
invasivas, que ocultan a las colonias de otros organismos. Por
ejemplo es probable que la leche o los productos lácteos
contengan Bacillus spp. invasivas.
La aplicabilidad de esta parte de la norma ISO 4833 para el análisis

de ciertos alimentos fermentados para consumo humano y
alimentación animal es limitada y pueden resultar más adecuados
otros medios o condiciones de incubación diferentes. Sin embargo,
este método se puede aplicar a tales productos, aunque es posible
que los microorganismos predominantes en ellos no se detecten
efectivamente.
8
Microorganismos
aerobios mesófilos
En algunas matrices el método descripto en esta parte de la Norma

ISO 4833 puede proporcionar resultados diferentes de los obtenidos
con el método descripto en la Norma ISO 4833-2.

Referencias.
3. DESARROLLO
3.1. Definiciones
Para el propósito de este documento:

Microorganismos: entidad de tamaño microscópico, que incluye
bacterias, hongos, protozoos y virus.
Nota: para el propósito de esta parte de la norma, microorganismos

son bacterias, levaduras y mohos capaces de formar colonias en el
medio específico y en las condiciones de ensayo descriptas en el
siguiente procedimiento.

3.2.3. Agar Plate Count (PCA)
3.2.4 Agar para cubrir (AC), si es necesario ver 3.5.2.8.
3.2.6. Autoclave
3.2.8. Baño de agua o equipo similar capaz de mantener la
temperatura entre 44°C y 47°C
3.2.9. Equipo contador de colonias (opcional) , por ejemplo, se puede
utilizar un equipo compuesto por un sistema de iluminación sobre
fondo negro, con lentes de aumento, capaces de aumentar cerca de
1,5x y un contador mecánico o digital
3.2.10. Peachímetro de exactitud 0.1 a 25°C ± 1°C
diámetro
3.2.14. Pipetas de 1 ml de capacidad, graduadas con divisiones de
0.1 ml, clase A, o pipetas automáticas con tips estériles
3.2.15. Tubos de ensayo, frascos o botellas, de capacidad no mayor a
500 ml.
9
Microorganismos
aerobios mesófilos

3.3.2. Siembra en placas utilizando el medio de cultivo específico y la
cantidad de muestra apropiada, si el producto inicial es líquido o de
una suspensión inicial para el caso de otros productos.
Se preparan otras placas bajo las mismas condiciones, utilizando
diluciones decimales de la muestra o de la suspensión inicial.
3.3.3. Incubación aeróbica a 30°C por 72 h.
3.3.4. Cálculo del número de unidades formadoras de colonias (UFC)
por mililitro (ml) o por gramo (g) de la muestra, a partir del número
de colonias obtenidas en las placas que contienen menos de 300
colonias.
3.4. Muestreo

metodología.
3.5. Procedimiento

específicas para el alimento en cuestión (ver punto 5. Referencias).

alimento.
La temperatura del diluyente debería ser aproximada a la
temperatura ambiente, para evitar daños de los microorganismos por
cambios bruscos.

Transferir con una pipeta 1 ml (con una incertidumbre de medición de
estéril.
10
Microorganismos
aerobios mesófilos

hacen las diluciones que sean necesarias para obtener un número
apropiado de microorganismos para realizar el recuento (ver punto
3.5.3.).

es de 30 minutos.
3.5.2.1. Transferir por medio de una pipeta estéril 1 ml de la muestra

líquida, o 1 ml de la suspensión inicial en el caso de otros productos
(dilución 10-1), en dos (2) placas de Petri estériles.
Si se preparan placas de más diluciones, se puede reducir a una placa
por dilución.
3.5.2.2. Tomar otra placa de Petri estéril. Transferir utilizando otra
pipeta estéril, 1 ml de la dilución 10-1 (productos líquidos) o 1 ml de
la dilución 10-2 (otros productos).
3.5.2.3. Si es necesario, se repite el procedimiento con mayores
diluciones, utilizando una pipeta estéril nueva para cada dilución
decimal.
3.5.2.4. Si es apropiado y posible, se seleccionan solo las diluciones
críticas para el paso de incubación (al menos dos diluciones decimales
consecutivas), aquellas en las que se espera obtener recuentos entre
10 y 300 colonias por placa.
3.5.2.5. Se coloca entre 12 ml a 15 ml del agar PCA enfriado a 44°C -
47°C en cada placa de Petri, evitando verter directamente el medio
sobre el inóculo. El tiempo trascurrido entre que se terminó de
preparar la dilución inicial (o la dilución 10-1 si el producto es sólido) y
el momento en que se agrega el agar a las placas no debe exceder
los 45 min.
3.5.2.6. Se mezcla cuidadosamente el inóculo con el medio de cultivo
por rotación suave de la placa de Petri.
11
Microorganismos
aerobios mesófilos
3.5.2.7. Se colocan las tapas y se deja solidificar sobre una superficie

horizontal fría, a temperatura ambiente.
3.5.2.8. Después de la completa solidificación del medio y solo en los
casos en que se sospeche que la muestra contiene microorganismos
cuyas colonias invaden la superficie del medio, verter 4 ml del agar
para cubrir (AC) o agar PCA a 44°C - 47°C sobre la superficie del
medio inoculado. Dejar solidificar de acuerdo a 3.5.2.7.
3.5.2.9. Se invierten las placas y se incuban en la estufa a 30°C
±1°C por 72 h ± 3 h.
NOTA: No apilar más de seis (6) placas. Las placas deben estar
separadas unas de otras y de las paredes y techo de la estufa por lo
menos por una distancia de 25 mm.
3.5.3.1. Después de la incubación por el período especificado,

seleccionar las placas que, de ser posible, tengan menos de 300
colonias. Contar las colonias, si es necesario utilizando el equipo
contador de colonias. Examinar las placas bajo una luz tenue.
3.5.3.2. Es importante que las colonias diminutas sean incluidas en el
recuento sin confundirlas con partículas insolubles o precipitado del
alimento. Se examinan los objetos dudosos detenidamente, utilizando
lentes de aumento si es necesario, para poder distinguir las colonias
de otros materiales.
3.5.3.3. Las “colonias diseminadas” o dispuestas en rosario se
consideran como una colonia.
3.5.3.4. Si menos un cuarto (1/4) de la placa está cubierto por un
crecimiento difuso o diseminado, se cuentan las colonias en la parte
de la placa no afectada y se calcula el número correspondiente para
la placa de Petri entera, deduciéndolo por extrapolación del número
teórico que debería corresponder a la placa entera. Si hay
sobrecrecimiento en un área superior a un cuarto de la placa, se
rechaza este recuento.
3.5.5.1. De acuerdo a norma ISO 7218:2007. Ver anexo 3.
12
Microorganismos
aerobios mesófilos
4. ANEXOS

de Microorganismos aerobios mesófilos
Preparación de la muestra: x g de muestras + 9 x

ml del diluyente (dilución 1/10)
Inoculación e incubación: transferir por duplicado 1

ml de las diluciones preparadas en placas de Petri. Si
se siembra más de una dilución sembrar solo 1 placa
por dilución (sembrar al menos 2 diluciones decimales
consecutivas).
Verter 12 ml -15 ml del agar PCA.
Incubar a 30°C ± 1ºC, 72 h ± 3 h.
Recuento y selección de las colonias:

Seleccionar preferiblemente las placas que tienen
menos de 300 colonias.
Se cuentan las colonias que se observan en cada placa
y se calcula el número de unidades formadoras de
colonias presentes en 1 ml ó 1 g de muestra.
13
Microorganismos
aerobios mesófilos

Disodio hidrógeno fosfato dodecahidratado (Na 2HPO4.12H2O) 9.0 g



3. Agar Plate Count (PCA)

Glucosa anhidra (C6H12O6) 1.0 g
Agar, en polvo o granulado 9 - 18 g
Cuando se examinan productos lácteos, agregar 1.0 g de leche en

polvo descremada por litro de medio de cultivo. La leche en polvo
descremada debe estar libre de sustancias inhibidoras.
Disolver los componentes en agua, si es necesario calentar hasta la

disolución completa del agar. Ajustar el pH si es necesario para
obtener un valor después de la esterilización de 7.0 ± 0.2 a 25°C.
Se distribuye en tubos, botellas u otros recipientes, volúmenes de
medio de 12 ml a 15 ml. Para la conservación de volúmenes mayores
se utilizan recipientes de hasta 500 ml de capacidad. Se esteriliza en
autoclave a 121 ºC durante 15 minutos.
14
Microorganismos
aerobios mesófilos
Si el medio se utiliza inmediatamente, enfriar en un baño de agua a

44°C - 47ºC antes de su uso, si no, se deja solidificar y se mantiene a
5°C ± 3ºC no más de 3 meses, protegido de la luz, bajo condiciones en
las cuales no se produzcan modificaciones en la composición y
propiedades del medio.
Para su empleo, se funde el medio, se deja enfriar y se mantiene a
44°C - 47ºC en el baño de agua antes de su uso.
Usar el agar lo antes posible, este no debe ser retenido por más de 4 h
en el baño de agua.
Control de calidad del medio de cultivo:

El agar Plate Count (PCA) es un medio no selectivo, usado en esta
parte de la ISO 4833 para colocar en las placas. La productividad del
medio debe ser testeada de acuerdo a ISO 11133.
Productividad:
Incubación: (30 ± 1) °C por (72 ± 3) h
Escherichia coli WDCM 00013 o WDCM 00012

(World Data Centre for Microorganisms (WDCM))
Cepas control: Bacillus subtilis subsp. Spizizenii WDCM 0003
Staphylococcus aureus WDCM 00032 o WDCM

00034
Medio de
Agar Tripteína Soya
referencia:
Método de
Cuantitativo
control:
Criterio: Coeficiente de productividad: (PR)≥ 0,7
4. Agar para cubrir (AC)

Agregar el agar al agua y calentar hasta la disolución completa del

agar. Ajustar el pH si es necesario para obtener un valor después de la
esterilización de 7.0 ± 0.2 a 25°C.
Se distribuye en tubos, botellas u otros recipientes, volúmenes de 4 ml
de medio. Para la conservación de volúmenes mayores se utilizan
15
Microorganismos
aerobios mesófilos
recipientes de hasta 500 ml de capacidad. Se esteriliza en autoclave a

121ºC durante 15 minutos.
44°C - 47ºC antes de su uso, si no se deja solidificar y se mantiene a
5°C ± 3ºC no más de 3 meses, protegido de la luz, bajo condiciones en
las cuales no se produzcan modificaciones en la composición y
44°C - 47ºC en el baño de agua antes de su uso.
Control de calidad del medio de cultivo: De acuerdo a ISO/TS 11133.
16
Microorganismos
aerobios mesófilos

7218:2007)
1.1 Método de cálculo: caso general

Para que el recuento sea válido, se suele considerar necesario que el
un mínimo de 10 colonias.
El número de microorganismos N presentes en la muestra para

análisis se calcula como la media corregida de dos diluciones
consecutivas, utilizando la ecuación (1)
Donde:
∑C: es la suma de las colonias contadas en dos placas de las dos

diluciones consecutivas, de las cuales al menos una contiene un
mínimo de 10 colonias;
V: es el volumen de inóculo utilizado en cada placa, en mililitros;
d: es la dilución correspondiente a la primera dilución elegida (d = 1

cuando se utiliza el producto líquido sin diluir).
El resultado calculado se redondea a dos cifras significativas. Cuando

se realiza esta operación:
- si la tercera cifra es inferior a 5, no se modifica la cifra anterior;
- si la tercera cifra es igual o superior a 5, la cifra anterior se
incrementa en una unidad.


productos).
Ejemplo 1: El recuento ha proporcionado los siguientes resultados:
- Para la primera dilución escogida (10-2): 168 colonias;

- Para la segunda dilución (10-3): 14 colonias.
17
Microorganismos
aerobios mesófilos
= 168 + 14 = 182 = 16545

1 x 1,1 x 10-2 0,011
Redondeando el resultado como se indicó, el número de

microorganismos es de 17.000 o 1.7 x 104 por mililitro o por gramo
de producto.
1.2. Método de cálculo para recuento bajo: caso en el que una

placa (muestra para análisis o suspensión inicial o primera
dilución) contiene menos de 10 colonias
- Si la placa contiene menos de 10 colonias, pero como mínimo

4, el resultado se calcula siguiendo el caso general (1.1) y se
expresa como: “el número estimado de microorganismos x por
mililitro (productos líquidos) o por gramo (resto de productos)”.
- Si el resultado total oscila entre 1 y 3, la precisión del análisis
es demasiado baja y el resultado debe expresarse como: “hay
microorganismos presentes, pero a un nivel inferior a (4xd) por
gramo o ml”.
Ejemplo: Si la dilución inoculada es 10-1:

Hay microorganismos presentes, pero a un nivel inferior a 40
UFC/g ó ml
1.3. Método de cálculo para el caso en el que la placa (muestra

para análisis, suspensión inicial o primera dilución) no
contiene colonias
o la suspensión inicial (resto de productos), o la primera dilución
“Menos de 1/d microorganismos por mililitro” (productos líquidos) o

“menos de 1/d microorganismos por gramo” (resto de los productos).
Donde d es el factor de dilución de la suspensión inicial, o la primera

dilución inoculada o escogida (d = 100 = 1 cuando se inocula
directamente la muestra para análisis).
Ejemplo:
- Si la dilución más concentrada sembrada fue: 10-1
< 10 UFC /ml o g
18
Microorganismos
aerobios mesófilos
< 100 UFC /ml o g

para análisis, suspensión inicial o primera dilución) contiene
más de 300 colonias
Si el recuento de colonias en todas las placas de todas las diluciones
es incontable, mayor a 300, el resultado se expresa de la siguiente
manera:
“Más de 300/d microorganismos /g ó ml”
Donde d es la dilución correspondiente a la última dilución escogida.
Ejemplo:
- Si la última dilución (más diluida) sembrada fue: 10-3
> 300.000 microorganismos / ml o g
> 3x105 UFC/ml o g
19
Microorganismos
aerobios mesófilos
ANEXO 4: FOTOS
1. Más de 300 UFC/ml
2. Entre 30-300 UFC/ml
20
Microorganismos
aerobios mesófilos
ANEXO 5: REFERENCIAS
(1) International Standard Organization. ISO 4833-1: 2013.

Microbiology of food chain. Horizontal method for the enumeration of
microorganisms. Part 1: Colony count at 30°C by the pour plate
technique.







ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water -

Preparation, production, storage and performance testing of culture
media
21
Microorganismos
aerobios mesófilos
Método horizontal para el recuento

de Microorganismos
Parte II: Recuento de colonias a 30°C
mediante la técnica de siembra en superficie
International Standard Organization ISO 4833-2:2013
1. OBJETIVO

realizar el recuento de microorganismos capaces de crecer y formar
colonias en un medio sólido tras la incubación a 30°C.
2. ALCANCE
Este procedimiento se aplica para realizar un método horizontal para

el recuento de microorganismos capaces de crecer y formar colonias
en un medio sólido tras la incubación a 30°C.
El método resulta aplicable para:
a) Productos destinados al consumo humano y la alimentación
animal;
b) Muestras ambientales de área de producción y manipulación de
alimentos para consumo humano y alimentación animal.
Esta parte de la Norma ISO 4833 resulta aplicable para:

1) Productos que contengan organismos sensibles al calor que
puedan representar una proporción significativa de la flora total
(por ejemplo organismos psicrótrofos alimentos refrigerados y
congelados, alimentos desecados u otros alimentos que puedan
contener organismos sensibles al calor);
2) Productos que contengan bacterias aerobias estrictas que
puedan representar una proporción significativa de la flora total
(por ejemplo Pseudomonas spp.);
3) Productos que contengan partículas pequeñas que puedan
resultar difíciles de distinguir de las colonias en una placa
sembrada en profundidad;
4) Productos cuyo color intenso impida el reconocimiento de las
colonias en una placa en profundidad;
5) Productos en los que se requiera una distinción entre distintos
tipos de colonias como parte de la garantía de la calidad
alimentaria.
22
Microorganismos
aerobios mesófilos
Además de la técnica de siembra manual por extensión en placa, esta

parte de la Norma ISO 4833 también describe el uso de un
sembrador de placas en espiral, un método rápido para realizar el
recuento de colonias en superficie (anexo 5).
La aplicabilidad de esta parte de la norma ISO 4833 al examen de

ciertos alimentos fermentados para consumo humano y alimentación
animal es limitada y pueden resultar más adecuados otros medios o
condiciones de incubación diferentes. Sin embargo, este método se
puede aplicar a tales productos, aunque es posible que los
microorganismos predominantes en ellos no se detecten
efectivamente.
En algunas matrices el método descripto en esta parte de la Norma

ISO 4833 puede proporcionar resultados diferentes de los obtenidos
con el método descripto en la Norma ISO 4833-1.

Referencias
3. DESARROLLO
3.1. Definiciones
Para el propósito de este documento:
Microorganismos: entidad de tamaño microscópico, que incluye

bacterias, hongos, protozoos y virus.
Nota: para el propósito de esta parte de la norma, microorganismos

son bacterias, levaduras y mohos capaces de formar colonias en el
medio específico y en las condiciones de ensayo descriptas en el
siguiente procedimiento.
3.2.1. Agua peptona bufferada (BPW);

3.2.2. Solución salina peptonada (SFP);
3.2.3. Agar Plate Count (PCA);
3.2.4. Estufa de esterilización;
3.2.5. Autoclave;
3.2.6. Cabina de secado o incubación, con ventilación por convección,
para el secado de las placas, capaz de mantener la temperatura entre
37°C y 55°C, o cabina de flujo laminar;
3.2.7. Estufa de incubación: 30°C ± 1°C;
3.2.8. Baño de agua o equipo similar capaz de mantener la
temperatura entre 47°C y 50°C;
23
Microorganismos
aerobios mesófilos
3.2.9. Equipo contador de colonias (opcional), por ejemplo, se puede

utilizar un equipo compuesto por un sistema de iluminación sobre
fondo negro, con lentes de aumento, capaces de aumentar cerca de
1,5x y un contador mecánico o digital;
3.2.10. Peachímetro de exactitud 0.1 a 25°C ± 1°C;
3.2.11. Equipo para mezclado (tipo stomacher);
3.2.12. Agitador mecánico (tipo vortex);
diámetro, o 140 mm;
3.2.14. Pipetas de 0.1 ml y 1 ml de capacidad nominal, graduadas,
clase A, o pipetas automáticas con tips estériles (ISO 8655-2).
3.2.15. Tubos de ensayo, frascos o botellas, de capacidad no mayor a
500 ml.
3.2.16. Esparcidor/Espátula de vidrio, plástico o acero, estéril, para
extender el inóculo sobre la superficie del medio de cultivo.

3.3.2. Siembra de la cantidad de muestra apropiada si el producto
inicial es líquido o de una suspensión inicial para el caso de otros
productos en la superficie de placas, que contienen el medio de
cultivo específico.
Se preparan otras placas bajo las mismas condiciones, utilizando
diluciones decimales de la muestra o de la suspensión inicial.
3.3.3. Incubación aeróbica a 30°C por 72 h.
3.3.4. Cálculo del número de unidades formadoras de colonias (UFC)
por mililitro (ml) o por gramo (g) de la muestra, a partir del número
de colonias obtenidas en las placas que contienen menos de 300
colonias.
3.4. Muestreo

metodología.
3.5. Procedimiento

NOTA: Para este punto referir a la norma ISO 6887–1 y las normas
24
Microorganismos
aerobios mesófilos

alimento.
La temperatura del diluyente debería ser aproximada a la
temperatura ambiente, para evitar daños de los microorganismos por
cambios bruscos.


estéril.
Mezclar utilizando preferentemente un agitador mecánico durante 5 a
10 segundos para obtener la dilución 10-2.
Si es necesario repetir esta operación a partir de la dilución 10 -2 y
apropiado de microorganismos para realizar el recuento (ver punto
3.5.3.).

suspensión inicial y el instante en el que se realiza la siembra no debe
superar los 45 minutos, mientras que el lapso de tiempo límite entre
la preparación de la suspensión inicial y el comienzo de la preparación
de las diluciones decimales sucesivas es de 30 minutos.
3.5.2.1. Transferir por medio de una pipeta estéril 0.1 ml de la

muestra líquida, o 0.1 ml de la suspensión inicial en el caso de otros
productos (dilución 10-1), al centro de dos (2) placas de Petri estériles
preparadas de acuerdo al punto 3 del anexo 2.
25
Microorganismos
aerobios mesófilos
Si se preparan placas de más diluciones, se puede reducir a una placa

por dilución.
Para los productos en los que se espera obtener recuentos bajos, el

límite de detección puede aumentarse por un factor de 10, si se
siembra 1.0 ml de la muestra, si la muestra es líquida, o 1.0 ml de la
suspensión inicial para otros productos, en placas de mayor tamaño
(140 mm) o en la superficie de 3 (tres) placas de Petri pequeñas (90
mm). En ambos casos se preparan por duplicado, utilizando 2 (dos)
placas grandes o 6 (seis) pequeñas.
3.5.2.2. Tomar otra placa de Petri preparada con el medio de cultivo.

Transferir utilizando otra pipeta estéril, 0.1 ml de la dilución 10-1
(productos líquidos) o 0.1 ml de la dilución 10-2 (otros productos).
3.5.2.3. Si es necesario, se repite el procedimiento con mayores

diluciones, utilizando una pipeta estéril nueva para cada dilución
decimal.
3.5.2.4. Cuidadosamente extender el inóculo en forma uniforme y lo

más rápido posible, sobre la superficie del agar, sin tocar las paredes
de la placa de Petri con el esparcidor o espátula. Se puede utilizar el
mismo esparcidor/espátula para todas las diluciones de la misma
muestra, comenzando con la mayor dilución y progresando en orden
hacia la dilución con mayor cantidad de la muestra o menos diluida.
Se colocan las tapas y se dejan las placas a temperatura ambiente

por 15 min para que el inóculo sea absorbido por el agar.
3.5.2.5. Se invierten las placas preparadas y se incuban en la estufa

a 30°C ± 1°C por 72 h ± 3 h.
NOTA:
Para el uso del sembrador de placas en espiral ver anexo 5.
No apilar más de seis (6) placas. Las placas deben estar separadas
unas de otras y de las paredes y techo de la estufa por lo menos por
una distancia de 25 mm.
3.5.3.1. Después de la incubación por el período especificado,

seleccionar las placas que, de ser posible, tengan menos de 300
colonias. Contar las colonias, si es necesario utilizando el equipo
contador de colonias. Examinar las placas bajo una luz tenue.
3.5.3.2. Es importante que las colonias diminutas sean incluidas en

el recuento sin confundirlas con partículas insolubles o precipitado del
26
Microorganismos
aerobios mesófilos
alimento. Se examinan los objetos dudosos detenidamente, utilizando

lentes de aumento si es necesario, para poder distinguir las colonias
de otros materiales.
3.5.3.3. Las “colonias diseminadas” o dispuestas en rosario se

consideran como una colonia.
3.5.3.4. Si se espera el crecimiento de colonias invasivas, se

examinan las placas a las 24 h o 48 h y se marcan las colonias
visibles.
3.5.3.5. Si menos un cuarto (1/4) de la placa está cubierto por un

crecimiento difuso o diseminado, se cuentan las colonias en la parte
de la placa no afectada y se calcula el número correspondiente para
la placa de Petri entera, deduciéndolo por extrapolación del número
teórico que debería corresponder a la placa entera. Si hay
sobrecrecimiento en un área superior a un cuarto de la placa, se
rechaza este recuento.
3.5.5.1. De acuerdo a norma ISO 7218:2007. Ver anexo 3.
27
Microorganismos
aerobios mesófilos
4. ANEXOS

de Microorganismos aerobios mesófilos
Preparación de la muestra: x g de muestras + 9 x

ml del diluyente (dilución 1/10)
Inoculación e incubación:
1. Transferir por duplicado 0.1 ml de las diluciones
preparadas en placas de Petri con agar PCA, si se
siembra más de una dilución sembrar solo 1 placa
por dilución (sembrar al menos 2 diluciones
decimales consecutivas).
2. Para muestras con recuentos bajos sembrar 1.0
ml de la muestra o dilución en placas de mayor
tamaño (140 mm) o en la superficie de 3 (tres)
placas de Petri pequeñas (90mm) por duplicado.
3. Incubar a 30°C ± 1ºC, 72 h ± 3 h.
Recuento y selección de las colonias:

1. Seleccionar preferiblemente las placas que tienen
menos de 300 colonias.
2. Se cuentan las colonias que se observan en cada
placa y se calcula el número de unidades
formadoras de colonias presentes en 1 ml ó 1 g de
muestra
28
Microorganismos
aerobios mesófilos




3. Agar Plate Count (PCA)

Glucosa anhidra (C6H12O6) 1.0 g
Cuando se examinan productos lácteos, agregar 1.0 g de leche en

polvo descremada por litro de medio de cultivo. La leche en polvo
descremada debe estar libre de sustancias inhibidoras.
Disolver los componentes en agua, si es necesario calentar hasta la

disolución completa del agar. Ajustar el pH si es necesario para
obtener un valor después de la esterilización de 7.0 ± 0.2 a 25°C.
Se distribuye en tubos, botellas u otros recipientes, volúmenes de
medio de 12 ml a 15 ml. Para la conservación de volúmenes mayores
se utilizan recipientes de hasta 500 ml de capacidad. Se esteriliza en
autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
29
Microorganismos
aerobios mesófilos

47°C - 50ºC antes de su uso, si no se deja solidificar y se mantiene a
5°C ± 3ºC, no más de 3 meses, protegido de la luz, bajo condiciones
en las cuales no se produzcan modificaciones en la composición y
47°C – 50ºC en el baño de agua antes de su uso.
Preparación de las placas:

Colocar 15 ml - 20 ml del medio en placas de Petri estériles y se deja
solidificar.
Las placas preparadas se pueden conservar a 5°C ± 3°C hasta 4
semanas.
Inmediatamente antes de su uso, las placas se deben secar de acuerdo
a ISO 11133.
Control de calidad del medio de cultivo:

El agar Plate Count (PCA) es un medio no selectivo, usado en esta
parte de la ISO 4833 para colocar en las placas. La productividad del
medio debe ser testeada de acuerdo a ISO 11133.
Productividad:
Incubación: (30±1) °C por (72±3) h

Escherichia coli WDCM 00013 o WDCM 00012
(World Data Centre for Microorganisms (WDCM))
Bacillus subtilis subsp. Spizizenii WDCM 0003

Cepas control:
Staphylococcus aureus WDCM 00032 o WDCM
00034
Medio de
Agar Tripteína Soya
referencia:
Método de Control Cuantitativo
Criterio: Coeficiente de productividad: (PR)≥ 0,7
30
Microorganismos
aerobios mesófilos

7218:2007)
1.1. Método de cálculo: caso general


Donde:






productos).
Ejemplo1: El recuento ha proporcionado los siguientes resultados:

= 168 + 14 = 182 = 165454

0,1 x 1,1 x 10-2 0,0011
31
Microorganismos
aerobios mesófilos

microorganismos es de 170000 o 1.7 x 105 por mililitro o por gramo
de producto.
NOTA: en caso de sembrar 1 ml V = 1 ml

placa (muestra para análisis o suspensión inicial o primera
dilución) contiene menos de 10 colonias

gramo o ml”.
Ejemplo:
 Si la dilución inoculada es 10-1 y se sembró 1 ml: “Hay
microorganismos presentes, pero a un nivel inferior a 40
UFC/g ó ml”
 Si la dilución inoculada es 10-1 y se sembró 0.1 ml: “Hay
microorganismos presentes, pero a un nivel inferior a 400
UFC/g ó ml”

contiene colonias


Ejemplo:
- Si la dilución más concentrada sembrada fue 10-1 y se sembró
1 ml
< 10 UFC /ml o g
32
Microorganismos
aerobios mesófilos
- Si la dilución más concentrada sembrada fue 10-2 y se sembró

1 ml
< 100 UFC /ml o g

manera:
Ejemplo:
- Si la última dilución (más diluida) sembrada fue 10-3 y se
sembró 1ml
> 300.000 microorganismos /ml o g
> 3x105 UFC/ml o g
33
Microorganismos
aerobios mesófilos
ANEXO 4: FOTOS
1. Más de 300 UFC/ml
2. Entre 30-300 UFC/ml
34
Microorganismos
aerobios mesófilos
ANEXO 5: Recuento de colonias en superficie utilizando un

sembrador de placas en espiral
5.1. General
Este anexo especifica un método para el recuento de
microorganismos presentes en alimentos, alimentos para animales y
muestras ambientales utilizando un sembrador en espiral y el
recuento de colonias que crecen sobre el medio sólido después de la
incubación aeróbica (para una definición de microorganismo ver
punto 3.1.).
5.2. Principio
5.2.1. La muestra, si es líquida, o la suspensión inicial en el caso de
otros productos se deposita cuidadosamente sobre la superficie de
una placa de agar rotativa en forma de un espiral de Arquímedes.
5.2.2. El volumen depositado disminuye mientras el sistema
dispensador (aguja o microjeringas estériles descartables) se mueve
del centro al borde de la placa, por lo que se establece una relación
exponencial entre el volumen sembrado y el radio del espiral.
5.2.3. Durante la incubación, las colonias desarrollan a lo largo de
las líneas donde fue depositada la muestra sobre el agar. La
cuadrícula de recuento es calibrada para el volumen de muestra
sembrado sobre las diferentes áreas del agar.
5.2.4. Se cuenta en un área determinada el número de colonias y se
hacen los cálculos para obtener el recuento por gramo o mililitro de la
muestra. Alternativamente, se puede utilizar para el recuento un
sistema automático.
5.3. Medios de cultivo y diluyentes

Ver punto 3.2. y anexo 2.
Las soluciones que se detallan a continuación se utilizan para la

limpieza y descontaminación de las jeringas. Estas no son necesarias
si se utiliza microjeringas estériles descartables.
5.3.1. Agua estéril: Se puede agregar 1% de polisorbato 80 si la
muestra a sembrar contiene materia grasa.
5.3.2. Solución de hipoclorito de sodio: 5% de cloro libre
5.4. Equipos
Ver punto 3.2.
5.4.1. Sembrador de placas en espiral: Se ajusta para distribuir el

volumen total de la muestra a sembrar, por ejemplo: 0.05 ml, 0.1 ml,
0.2 ml o 0.4 ml por placa. Generalmente incluye una trampa de vacío
para el control de la carga, distribución de la muestra, disposición de
los residuos de la misma y la limpieza y desinfección del sistema. La
presión residual requerida es de 24 KPa a 35 KPa (160 mmHg a 260
mmHg).
35
Microorganismos
aerobios mesófilos
5.4.2. Equipo contador de colonias: con una cuadrícula calibrada,

relaciona el volumen de la muestra sembrada con áreas específicas
del agar. Alternativamente se pueden utilizar sistemas automáticos
de recuentos.
5.4.3. Vaso de precipitado de 5 ml, estéril, descartable: algunos
modelos nuevos utilizan diferentes tamaños de vasos,
particularmente para el lavado y desinfección.
5.4.4. Microjeringas estériles descartables: opcional
5.4.5. Placas de agar: preparadas de acuerdo al anexo 2. Es
importante que las placas contengan la cantidad suficiente,
profundidad uniforme y que la superficie del agar esté nivelada.
5.5. Muestreo

metodología.
5.6. Procedimiento

En general, cuando se utiliza el sembrador en espiral no se necesitan

diluciones de la muestra, o se necesitan pocas.
Transferir, utilizando una pipeta estéril, 3 ml o 5 ml del

homogenizado de la muestra a un vaso de precipitado de 5 ml
descartable estéril.
Si es necesario, se deja la muestra en reposo por unos minutos antes

de remover la porción de líquido del sobrenadante para el plaqueo en
espiral, debido a que la presencia de partículas puede obstruir los
tubos del sistema. Si es frecuente la obstrucción de los mismos, se
recomienda el uso de bolsas de plástico estériles con filtro para la
preparación de la suspensión inicial en muestras que no son líquidas.
5.6.2. Preparación del sembrador en espiral

Ver ISO 7218.
a) Programar el equipo de acuerdo a las instrucciones del

fabricante, si es necesario ajustar.
b) En particular se debe verificar:
 La altura a la cual se eleva el brazo, de manera que se dispense

el volumen correcto, para máquinas que operan
mecánicamente;
36
Microorganismos
aerobios mesófilos
 Que la placa etiquetada esté centrada en la plataforma

giratoria;
 Que la punta de la aguja o microjeringa forme el ángulo

correcto con la superficie del agar, de acuerdo a lo que
especifica el fabricante.
 Que la aguja comience a sembrar y luego seleccione los puntos

correctos. Para equipos electrónicos solo se debe verificar el
punto de inicio.
Se deben repetir los pasos de verificación, durante la operación del

equipo, si se produce el daño de la aguja o el desalineado de la
misma, lo que es indicado por la deposición irregular de la
muestra.
5.6.3. Inoculación
5.6.3.1. General
a) Los pasos que se describen a continuación se aplican a modelos
operados manualmente, los modelos semiautomáticos, deben
ser operados según las instrucciones del fabricante.
b) Llenar un vaso de precipitado estéril con la solución de

hipoclorito de sodio, un segundo vaso con agua estéril y el
tercer vaso con la muestra.
c) Limpiar la punta de la aguja, y desinfectarla entre el plaqueo de

cada muestra, lavándola por 1 segundo con la solución de
hipoclorito de sodio y luego por 1 segundo con agua estéril.
d) Después del lavado, bajar la aguja dentro de la muestra y abrir

la válvula de relleno. Extraer la muestra a través de la aguja
hasta que se forme una columna continua de líquido en el tubo
que se encuentra sobre la válvula de relleno. Cuando la punta
de la aguja se encuentre todavía debajo del nivel del líquido,
cerrar la válvula de vacío. Levantar la aguja y rotar el recipiente
de la muestra fuera del camino.
e) Colocar en la base la placa de agar preparada, marcar sobre un

lado, sobre la plataforma giratoria, y bajar la aguja hasta que el
tip descanse libremente sobre la superficie del agar. Encender
el motor y dejar que la plataforma rotatoria gire hasta que la
aguja se levante y el equipo se detenga automáticamente.
Colocar la tapa y remover la placa de la plataforma giratoria.
f) Después de cada muestra analizada, el equipo se lava con

hipoclorito de sodio y con agua estéril como se describió
37
Microorganismos
aerobios mesófilos
anteriormente. Cuando el equipo no se va a utilizar

nuevamente, se deja lleno con agua estéril.
g) Si se siembra más de una dilución por muestra, se comienza a

plaquear por la mayor dilución (más diluida).
h) Se dejan las placas con las tapas por 15 minutos a temperatura

ambiente hasta que el inóculo es absorbido por el agar.
5.6.3.2. Control de esterilidad:

a) Verificar la esterilidad del sembrador en espiral plaqueando
agua estéril antes y después de cada serie de muestras
examinadas.
5.6.4. Incubación
Ver punto 3.5.2.
5.6.5. Recuento de colonias

5.6.5.1. Cuadrícula de Recuento:
a) Se encuentran disponibles dos tipos de cuadrícula dependiendo
del tamaño de la placa de Petri utilizada.
b) Alternativamente, la cuadrícula de recuento transparente para
placas de 150 mm de diámetro puede utilizarse para el
recuento de placas de 90 mm de diámetro si se utiliza solo la
parte interna del círculo que tiene un diámetro de 90 mm.
c) Utilizar las cuadrículas provistas junto al equipo y de acuerdo a
las especificaciones del fabricante.
d) La cuadrícula se utiliza para relacionar el número de colonias
contadas en un área de la placa con el volumen de muestra
sembrado en dicha área.
e) Ver ejemplos en la Figura A1.
38
Microorganismos
aerobios mesófilos
+ -
concentrado concentrado
Figura A1
5.6.5.2. Calibración y Verificación

a) Los volúmenes sembrados sobre varios segmentos de la
cuadrícula están dados en el manual de operaciones que
acompaña el equipo sembrador en espiral.
b) Para calibraciones con mayor precisión, los volúmenes por área
de la cuadrícula deben ser verificados por un experto.
c) Para verificar los volúmenes depositados en cada segmento,
preparar 11 concentraciones bacterianas en el rango de 106
células/ml y 103 células/ml por diluciones seriadas (1+1) de
suspensiones de bacterias que no tengan crecimiento invasivo
sobre las placas de agar.
d) Sembrar todas las diluciones por duplicado de acuerdo a lo
especificado en 3.5.2. y con el sembrador en espiral, utilizando
el mismo medio y las mismas condiciones de incubación
(mismo incubador).
39
Microorganismos
aerobios mesófilos
e) Luego de la incubación contar las colonias. Calcular el volumen

depositado en cada área de la cuadrícula de recuento de la
siguiente manera:
V = CA
Cml
Donde
V: es el volumen del área de la cuadrícula (en ml);
CA: es el recuento por la técnica en espiral de esa área
Cml: es el recuento por la técnica estándar por ml.
f) Verificar el volumen total sembrado por el sembrador en espiral

pesando la cantidad sembrada en una balanza analítica con una
precisión de ± 2 mg.
5.6.5.3. Examen e informe de los recuentos de las placas en espiral

(método manual)
a) Centrar la placa incubada sobre la cuadrícula. Seleccionar un
segmento y contar las colonias desde el borde exterior hasta el
centro, hasta contar un total de 20 colonias.
b) Continuar el recuento de las restantes colonias en el área (ej.
segmento o subdivisiones del segmento) en el cuál la colonia
número 20 fue observada. Registrar este número junto con el
número del área que incluía la colonia número 20 (ej. 3c, 3b,
3a, 4c, 4a, en la figura A1).
c) Contar el mismo área en el lado opuesto de la placa y dividir el
recuento total de las dos áreas por el volumen, conocido,
depositado sobre las áreas sembradas. Esto da como resultado
el recuento por mililitro de muestra.
d) Si el número total de colonias es mayor que 75 y el recuento en
el área donde se contó la colonia número 20 está completo, el
recuento es generalmente bajo debido a un error asociado al
crecimiento masivo de las colonias. Es recomendable que el
recuento se realice contando los segmentos adyacentes
anulares alrededor de la circunferencia hasta contar al menos
50 colonias. Calcular el recuento dividiendo las colonias
contadas por el volumen del área donde se contaron las
colonias.
e) Si se cuentan menos de 20 colonias en toda la placa, el
intervalo de confianza para el recuento obtenido es amplio.
f) Si el recuento excede las 75 colonias en la primer área, ej. área
3c, registrar el resultado estimado como >300.000 colonias/ml.
5.6.5.4. Examen e informe de los recuentos de las placas en espiral

(utilizando un contador electrónico de colonias)
a) Seguir las instrucciones del fabricante, pero verificar
manualmente (5.6.5.3.) al menos cuando el equipo se utiliza
por primera vez o cuando se examina una nueva matriz.
40
Microorganismos
aerobios mesófilos
5.6.6. Cálculo y expresión de resultados

a) Calcular el recuento de colonias en la placa en espiral.
b) Informar los recuentos como el recuento en placa en espiral por
g o ml de muestra según corresponda.
41
Microorganismos
aerobios mesófilos
(1) International Standard. ISO 4833-2: 2013. Microbiology of food

chain. Horizontal method for the enumeration of microorganisms.
Part 2: Colony count at 30°C by the surface plating technique.







ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water -

Preparation, production, storage and performance testing of culture
media.
42
Microorganismos
aerobios mesófilos

Bacteriological Analytical Manual (BAM)
Capítulo 3, enero de 2001
1. OBJETIVO

realizar el recuento de microorganismos aerobios mesófilos por la
técnica de recuento convencional de colonias en placa a 35°C ± 1ºC
en muestras de alimentos.
2. ALCANCE
Este procedimiento se aplica para realizar la enumeración de

microorganismos aerobios mesófilos por la técnica de recuento de
colonias en placa a 35°C ± 1ºC en muestras de alimentos
congelados, refrigerados, precocidos o preparados.
El método de recuento en placa espiral automatizado para el examen

de productos alimenticios y cosméticos (5), que se ajusta a la AOAC
Official Methods of Analysis, sec. 977.27; no se detalla en este
documento.

procedimiento son indispensables las referencias citadas en el anexo
4.
3. DESARROLLO
3.2.1. Solución buffer fosfato de Butterfield (Solución stock) (ver

anexo 2)
3.2.2. Buffer para realizar diluciones (ver anexo 2)
3.2.3. Agar plate count (APC) (ver anexo 2)
3.2.5. Autoclave
3.2.6. Estufa de incubación: 35°C ± 1°C; leche, 32°C ± 1°C
3.2.7. Baño de agua circulante para mantener el templado del agar,
capaz de mantener la temperatura a 45°C ± 1 °C
43
Microorganismos
aerobios mesófilos

3.2.9. Pipetas 1 ml, 5 ml y 10 ml, graduada en 0.1 ml unidades; con
propipetas (no pipetear con la boca)
3.2.10. Placas de Petri estériles de vidrio, o descartables de plástico
(no menos de 15 mm x 90 mm)
3.2.11. Contenedores para pipetas y placas de Petri, con adecuada
protección
3.2.12. Botellas de dilución de 160 ml de capacidad de vidrio de
borosilicato resistente, con tapones de goma o tapa a rosca
3.2.13. Botellas para diluciones con 90 ml ± 1 ml de solución fosfato
buferado de Butterfield (3.2.2.); para muestras de leche, 99 ml ± 2
ml del mismo diluyente
3.2.14. Balanza; de 2000 g de capacidad; y sensibilidad 0.1 g
3.2.15. Recipientes estériles
3.2.16. Cuchillos, tenedores, espátulas, pinzas, tijeras, cucharas de
mango largo, etc, estériles para el manejo de la muestra
3.2.17. Agitador mecánico (tipo vórtex)
3.2.18. Equipo para homogeneizado (tipo stomacher)
3.2.19. Contador de colonias de campo oscuro, tipo Quebec, o
equivalente, con fuente de luz adecuada y con la base o plataforma
grillada
3.2.20. Refrigerador para enfriar y mantener las muestras que
necesitan conservarse entre 0°C - 5°C; leche, 0°C – 4.4°C
3.2.21. Freezer para conservar las muestras freezadas entre -15ºC a
-20°C.
3.2.22. Termómetros calibrados de rango apropiado
3.2.23. Área de trabajo: el área de trabajo debe poseer una mesada
nivelada con una superficie amplia, en una habitación limpia, bien
iluminada y ventilada, libre de polvo y corrientes de aire. La densidad
microbiana del aire en la zona de trabajo, medida por sedimentación
durante el procedimiento analítico, no debe exceder las 15
colonias/placa, correspondientes a 15 minutos de exposición
3.2.24. El espacio de almacenamiento, debe estar libre de polvo e
insectos y debe contar con protección adecuada para los equipos y
suministros
3.3. Principio

3.3.3. Recuento de las colonias
3.4. Muestreo
44
Microorganismos
aerobios mesófilos

metodología.
3.4.3. Recepción de la muestra
3.4.3.1. Condiciones del recipiente contenedor de las

muestras. Chequear en los recipientes defectos físicos groseros.
Detenidamente, inspeccionar pequeños derrames en bolsas y botellas
plásticas, agujeros o marcas de perforaciones. Si las muestras fueron
colectadas en botellas plásticas, chequear si éstas presentan
rajaduras o fisuras y/o tapas flojas. Si se usan bolsas plásticas en la
toma de muestras, tenga la precaución de que los alambres del cierre
no perforen otras bolsas cercanas.
3.4.3.2. Almacenamiento
Siempre que sea posible, analizar las muestras inmediatamente luego
de recibirlas. Sin embargo, si el análisis tuviera que ser diferido o
pospuesto, refrigerar las muestras perecederas no freezables entre
0°C - 4ºC por no más de 36 h. Los productos que requieran ser
freezados almacenarlos a -20ºC hasta su análisis. Almacenar los
productos enlatados (no perecederos), o alimentos de baja humedad,
a temperatura ambiente hasta el momento de ser realizado el
análisis.
3.5. Procedimiento

diluciones
NOTA: Para el punto de la preparación de la suspensión inicial nos

remitimos al Capítulo 1 del BAM, abril de 2003, que a
continuación se detalla.
3.5.1.1.1. Descongelado
Utilizar técnicas asépticas para el manejo del producto. Antes de
manipular, limpiar las áreas de análisis estrictas y sus alrededores.
Asimismo, humedecer la zona de análisis propiamente dicha con un
agente desinfectante comercial. Preferiblemente, no descongelar las
muestras freezadas previo al análisis. Si fuera necesario atemperar
una muestra congelada para obtener una porción analítica,
descongelarla en su envase original o en el recipiente en el cual se
recibió en el laboratorio. Siempre que sea posible, evitar transferir la
muestra a un envase secundario para su descongelado. Usualmente,
una muestra puede ser descongelada a 2°C - 5 ºC dentro de las 18 h.
Si se desea un descongelado rápido, descongelar la muestra a menos
de 45ºC, por no más de 15 min. Cuando se descongela una muestra
45
Microorganismos
aerobios mesófilos
a temperatura elevada, agitarla continuamente en un baño de agua

termostáticamente controlado.
3.5.1.1.2. Homogeneizado
En las muestras de alimentos es esperable encontrar, varios grados
de distribución no uniforme de microorganismos. Para asegurarnos
una distribución más homogénea, agitar enérgicamente las muestras
líquidas, y si resultara práctico, cuando se trate de muestras secas de
100 g o más, mezclar con cucharas estériles antes de retirar la
unidad analítica. Utilizar una unidad analítica de 50 g de
alimentos líquidos o sólidos para determinar el recuento en placa
de aerobios. Utilizar el tamaño de la unidad analítica y los
volúmenes de diluyente apropiados recomendados para ser utilizados
en los métodos del BAM. Si el contenido de un envase no es
homogéneo (por ej. una comida congelada), macerar completamente
el contenido del envase y retirar la unidad analítica, o
preferiblemente, analizar cada porción de alimento en forma
separada, dependiendo de los propósitos del ensayo.
3.5.1.1.3. Pesada
Pesar 50 g ± 0.1 g del alimento.
3.5.1.1.4. Mezclado y dilución de muestras que requieren

recuento de microorganismos.
a. Todos los alimentos/comidas excepto aquellas que

contengan harina de nuez, nueces en mitades o en fragmentos
mayores. Adicionar 450 ml del diluyente Butterfield (BDB, ver anexo
2), a un frasco que contiene 50 g de una unidad analítica y
homogeneizar por 2 minutos. Esta operación da como resultado la
dilución 10-1. Realizar las diluciones a partir del homogenato original
rápidamente, utilizando pipetas que suministren volúmenes en forma
precisa. No utilizar pipetas para suministrar volúmenes menores al
10% de su capacidad. Por ejemplo, no utilizar pipetas con capacidad
mayor a 10 ml para suministrar volúmenes de 1 ml; para suministrar
volúmenes del orden de 0.1 ml, no utilice pipetas con capacidad
mayor a 1 ml. Preparar todas las diluciones decimales con 90 ml de
BDB, más 10 ml de la dilución previa, excepto que se especifique algo
diferente. Agitar todas las diluciones vigorosamente 25 veces durante
7 segundos. No deberían transcurrir más de 15 minutos entre que se
realiza la preparación del homogenato y la serie completa de las
diluciones, y el momento en que el inóculo toma contacto con el
medio de cultivo.
b. Para nueces en mitades o fragmentos mayores.

Asépticamente pesar 50 g de la unidad analítica dentro de un frasco
con tapa a rosca. Adicionar 50 ml de diluyente (BDB, ver anexo 2) y
46
Microorganismos
aerobios mesófilos
agitar vigorosamente 50 veces, para obtener la dilución 10 0. Dejar

reposar 3 min - 5 min y agitar 5 veces para resuspender justo antes
de realizar las diluciones decimales e inoculaciones.
c. Harina de nuez. Asépticamente pesar 10 g de la unidad analítica

en un frasco con tapa a rosca. Adicionar 90 ml de diluyente BDB y
agitar vigorosamente 50 veces en para obtener la dilución 10-1. Dejar
reposar 3 min - 5 min y agitar 5 veces para resuspender justo antes
de realizar las diluciones decimales y las inoculaciones.
A partir del homogenato del alimento o primera dilución transferir 10

ml, a 90 ml de diluyente BDB. Si es necesario repetir esta operación a
partir de la dilución 10-2, utilizando pipetas estériles diferentes para
cada dilución, para preparar las diluciones decimales sucesivas
de 10-3, 10-4, y otras que sean necesarias para obtener un número
apropiado de microorganismos para realizar el recuento (ver 3.5.3.).
Evite la formación de espuma durante el proceso. Agite todas las
diluciones 25 veces durante 7 segundos.
NOTA: Para una óptima precisión no introducir la pipeta más de 1 cm

en la suspensión inicial y evitar el contacto entre la pipeta que
contiene el inóculo y el diluyente estéril.
El tiempo máximo transcurrido entre la preparación de la suspensión

inicial y el momento en que el inóculo toma contacto con el medio de
cultivo no debe superar los 15 minutos.
3.5.2.1. Inoculación
Pipetear 1 ml de cada dilución por separado y por duplicado, y verter

en placas de Petri correctamente rotuladas. Agitar nuevamente el
frasco de dilución 25 veces durante 7 segundos, si pasan más de 3
minutos antes de la siembra en las placas de Petri. Añadir en cada
placa, 12 ml - 15 ml de agar de recuento en placa (PCA, ver anexo 2)
enfriado a 45ºC ± 1°C. Evitar verter el medio sobre el inóculo.
Mezclar con suavidad y con un movimiento uniforme, por rotación
alternada hacia atrás y hacia adelante, sobre una superficie plana y
nivelada. Dejar solidificar. El tiempo de solidificación no debe exceder
los 10 minutos.
47
Microorganismos
aerobios mesófilos
3.5.2.2. Incubación. Invertir las placas de Petri solidificadas e

incubar durante 48 h ± 2 h a 35°C ± 1°C. No apilar las placas cuando
el agar no ha solidificado. Las placas deben estar separadas unas de
otras y de las paredes y techo de la estufa por lo menos a una
distancia de 25 mm.
NOTA: Para muestras de leche, realizar tres controles: un control

de agar PCA (ver Anexo 2), un control de diluyente (BDB, ver anexo
2), y pipetear el diluyente para un control de pipeta.
NOTA: Cuando la muestra contenga materiales higroscópicos,

como por ejemplo, harina o almidón, adicione inmediatamente el
agar para diluir.
Después de la incubación por el período especificado en 3.5.2.2,

contar las colonias bajo luz tenue sin confundir con precipitados del
alimento o partículas indisolubles. Examinar elementos dudosos bajo
lente de aumento. Las “colonias diseminadas” o dispuestas “en
rosario”, se consideran como una colonia. Seleccionar las placas que
se encuentren en un rango de lectura entre un mínimo 25 colonias
y un máximo de 250 colonias (para placas de 90 mm de
diámetro).
3.5.4. Calculo y expresión de resultados (Ver referencias 6, 8)
1. Para placas con un mínimo 25 colonias y un máximo de

250 colonias
Donde:
N: número de colonias por ml o g de producto
∑C: es la suma de todas las colonias en todas las placas

contadas/tenidas en cuenta*
n1: es el número de placas de la primera dilución contada*/
n2: es el número de placas de la segunda dilución contada*/
48
Microorganismos
aerobios mesófilos
d: es la primera dilución a partir de la cual se obtiene el recuento.
Ejemplo:
1:100 1:1000
232-244 33-28
N = 537/0.022
N = 24.409
N = 24.000
N = 2.4 x 104 UFC/g
NOTA: Cuando los recuentos de placas por duplicado caigan dentro y

fuera del rango de colonias 25-250, utilizar sólo aquellos
recuentos que caigan dentro del rango.
Para evitar crear falsas impresiones de precisión y exactitud cuando

calculamos el recuento de aerobios mesófilos, informar sólo los dos
primeros dígitos significativos. Redondear a dos cifras significativas
sólo al momento de expresar el resultado. En el caso de muestras de
leche, cuando ninguna placa de todas las diluciones realizadas
contenga colonias, informar el recuento de aerobios mesófilos como
menor a 25 colonias en recuento estimado. Redondear
incrementando el segundo dígito en una cifra el siguiente número,
cuando el tercer dígito sea 6, 7, 8 o 9 y usar ceros a la derecha para
los sucesivos dígitos. Redondear disminuyendo en una cifra el
segundo dígito, cuando el tercer dígito es 1, 2, 3 o 4. Cuando el
tercer dígito es 5, redondear hacia abajo cuando el segundo dígito es
par, y redondear hacia arriba cuando el segundo dígito es impar.
Ejemplos:
Recuento calculado PCA

12.700 13.000
12.400 12.000
15.500 16.000
14.500 14.000
49
Microorganismos
aerobios mesófilos
NOTA 5: Preferiblemente expresar el resultado como un número

entre 1.0 y 9.9 multiplicado por la potencia de 10 adecuada, o como
un número entero con dos cifras significativas.
NOTA 6: Expresar el resultado como número de colonias N por

mililitro (para los productos líquidos) o por gramo (para el resto de
los productos).
Ver anexo 3: Casos no comunes de recuentos de aerobios

mesófilos.
50
Microorganismos
aerobios mesófilos
4. ANEXOS

en placa de microorganismos aerobios mesófilos a 35ºC ± 1ºC
Preparación de la muestra:
50 g de muestra + 450 ml de diluyente (dilución 1/10)
Homogeneizar 2 minutos
Preparación de las diluciones decimales:

10 ml de la dilución inicial + 90 ml de diluyente
(10-2)
Mezclar (preferentemente con vórtex durante 7s).
Transferir, por duplicado, 1ml de las diluciones
preparadas en placas de Petri de 90 mm, agregar 12
ml a 15 ml de APC preenfriado a 45ºC ± 1ºC.
Incubar las placas invertidas a 35°C ± 1ºC, durante
48 h ± 2 h
Recuento de las colonias:

Seleccionar las placas con un mínimo de 25 colonias y
un máximo de 250 colonias
51
Microorganismos
aerobios mesófilos
1. Diluyente: Solución buffer fosfato de Butterfield

(Solución stock)
Potasio dihidrógeno fosfato (KH2PO4) 34 g

Ajustar el pH a 7.2 con NaOH 1N. Esterilizar a 121°C durante 15

minutos. Conservar en heladera.
2. Buffer para realizar diluciones de Butterfield (BDB)
Tomar 1,25 ml de la solución stock y llevar a volumen de 1000 ml con

agua destilada. Fraccionar en frascos o tubos de 90 ± 1 ml. Esterilizar
3. Agar plate count (PCA) o Agar placa levadura (APL)
Triptona 5g
Dextrosa 1g
Agar 15 g
Agua destilada 1 litro
Calentar los ingredientes para disolver. Fraccionar en tubos o frascos

de capacidad adecuada. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
52
Microorganismos
aerobios mesófilos
ANEXO 3: Guía para informar casos no comunes de recuentos

de aerobios mesófilos.
El Official Method of Analysis (3) no provee una guía para el cálculo y

expresión de recuento en placa, mientras que el Standard Methods
for the Examination of Dairy Products, 16 Ed. (2) presenta una guía
detallada; por consiguiente para unificar, remitirse a las guías APHA
según la modificación señalada en las referencias (6) y (8). Informar
todos los recuentos en placa (2) realizados a partir de placas por
duplicado. En el caso de muestras de leche, informar todos los
recuentos (2) en placa, contabilizando las placas y sus duplicados,
que contengan menos de 25 colonias, como así también menos de 25
colonias como recuento estimado. Informar todos los recuentos de
aerobios en placa (2) contabilizados a partir de placas duplicadas que
contengan más de 250 colonias, así como estimados (en más de 250
colonias). Los recuentos por fuera del rango normal 25-250 pueden
proporcionar indicadores erróneos de la composición microbiana real
de la muestra. Los factores de dilución pueden exagerar los recuentos
bajos (menores de 25) y en las placas “sobrecrecidas”/“incontables”,
(con más de 250 colonias) puede ser dificultoso contar o bien podría
ser inhibido el desarrollo de algunas bacterias, resultando en un
recuento bajo. Informar recuentos menores a 25 o mayores 250 UFC
como recuentos de aerobios e placa estimados (EAPC) siglas en
inglés. Use la siguiente guía:
1- Placas normales (25-250) Seleccionar la/s placa/s libres de

“colonias diseminadas”. Contar todas las UFC incluyendo
aquellas del tamaño preciso en las placa/s seleccionada/s.
Registrar las diluciones usadas y el número total de colonias
contadas.
2- Placas con más de 250 colonias. Cuando el número por

placa excede las 250 colonias, en todas las diluciones,
registrarlas como incontables (muy numerosas para ser
contadas, MNPC) para todas aquellas menos las que estén
cercanas a 250, en las que se contarán las UFC en las
porciones de la placa donde se observe una distribución
representativa de las colonias. Ver referencia 2 para una guía
detallada. Expresar el recuento de aerobios en placa APC como
recuento ESTIMADO de aerobios en placa (APCE), para resaltar
que fue estimado a partir de los recuentos que se alejan del
rango 25-250.
3- “Colonias diseminadas”. Las “colonias diseminadas” son

usualmente de tres tipos diferentes: 1) una cadena de
colonias, no muy distinguibles separadamente, que parecen
haberse producido por desintegración de un agregado
bacteriano; 2) aquellas que desarrollan un film entre el agar y
53
Microorganismos
aerobios mesófilos
el fondo de la placa; y 3) aquellas que forman un film en el

agua sobre los bordes o sobre la superficie del agar. Si las
placas preparadas a partir de una muestra, presentan o tienen
excesivo sobrecrecimiento, de manera tal que: a) el área
cubierta por sobrecrecimiento, incluyendo el área total de
crecimiento reprimido, excede el 50% del área total, o b) el
área de crecimiento reprimido excede el 25% del área total de
la placa, informar las placas como “sobrecrecidas”. Cuando sea
necesario contar las placas con sobrecrecimiento no
descartadas según a) o b) como se mencionó arriba, contar
cada uno de los tres tipos distintivos como si procedieran de
una única colonia. Para el primer caso, si se presenta una única
cadena, contarla como una colonia simple. Si aparece más de
una cadena con orígenes aparentes separados, contar cada una
como una colonia simple. No contar cada crecimiento individual
de una cadena como una colonia separada. Los tipos 2 y 3,
usualmente son el resultado de colonias diferentes y se
cuentan como tales. Combine el recuento de “colonias
diseminadas” y el recuento de colonias, para calcular el
recuento de aerobios en placa.
4- Placas sin UFC. Cuando las placas de todas las diluciones no

presentan colonias, informar el recuento de aerobios mesófilos
tan bajo como “uno por” aquel correspondiente a la dilución
más baja usada. Marcar el recuento de aerobios mesófilos con
un asterisco para denotar que fue estimado a partir de los
recuentos que cayeron fuera del rango de 25-250 por placa.
Cuando las placas de una muestra se presumen contaminadas o
con alguna otra característica no satisfactoria, informar el/los
resultado/s como “accidente de laboratorio” (AL).
Cálculo y Expresión de resultados NO COMUNES en el recuento

de aerobios mesófilos
1. Todas las placas con menos de 25 UFC. Cuando las placas de

ambas diluciones caen debajo de las 25 UFC, informar el recuento en
placa real, pero informarlo como menor a 25 x 1/d, donde d es el
factor de dilución a partir del cual se realizó el primer recuento
obtenido.
Ejemplo:
Colonias
1:100 1:1000 APCE / ml(g)
18 2 < 2.500
0 0 < 2.500
APCE: recuento de aerobios en placa ESTIMADO
54
Microorganismos
aerobios mesófilos
2. Todas las placas con más de 250 UFC. Cuando las placas de las
dos diluciones seleccionadas contienen más de 250 UFC cada una
(pero menos que 100/cm2), estimar el recuento de aerobios mesófilos
(APCE) de las placas cercanas a 250 y multiplicar por la dilución.
Ejemplo:
Colonias
1:100 1:1000 APCE / ml (g)
MNPC 640 640.000
MNPC: muy numerosas para ser contadas o incontables
APCE: recuento de aerobios en placa ESTIMADO
3. Todas las placas con “colonias diseminadas” y/o que hayan

sufrido accidentes de laboratorio (AL). Informarlas
respectivamente como “sobrecrecidas” (SC) o “accidente de
laboratorio” (AL).
4. Todas las placas con un promedio de más de 100 UFC x cm 2.

Estimar el recuento en placa de aerobios como mayor que 100 veces
la mayor dilución sembrada, sobre el área de la placa. Los ejemplos
siguientes tienen un recuento promedio de 110 x cm 2.
Ejemplo:
Colonias / Dilución
1:100 1:1000 APCE / ml (g)
MNPC 7,150 (a) > 6.500.000 EAPC (b)
MNPC 6.490 (c) > 5.900.000 EAPC
(a) Basado en un área de la placa igual a 65cm2.

(b) APCE, recuento en placa de aerobios estimado
(c) Basado en un área de placa igual a 59 cm2.
55
Microorganismos
aerobios mesófilos
ANEXO 4: FOTOS
1. Agar recuento en placa
Izquierda: Placa con crecimiento máximo de UFC.

Derecha: Placa con crecimiento mínimo de UFC.
Placa con crecimiento entre 25-250 UFC.
56
Microorganismos
aerobios mesófilos
Fuente del texto web: Bacteriological Analytical Manual, 8th

Edition, Revision A, 1998. Chapter 3. Última revisión de la página:
04/10/2013.
(1) American Public Health Association. 1984. Compendium of

Methods for the Microbiological Examination of Foods, 2nd ed. APHA,
Washington, DC
(2) American Public Health Association. 1993. Standard Methods for

the Examination of Dairy Products, 16th ed. APHA, Washington, DC
(3) Association of Official Analytical Chemists. 1990. Official Methods

of Analysis, 15th ed. AOAC, Arlington, VA
(4) Donnelly, C.B., J.E. Gilchrist, J.T. Peeler, and J.E. Campbell.
1976. Spiral plate count method for the examination of raw and
pasteurized milk. Appl. Environ. Microbiol. 32:21-27.
(5) Gilchrist, J.E., C.B. Donnelly, J.T. Peeler, and J.E. Campbell.
1977. Collaborative study comparing the spiral plate and aerobic
plate count methods. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 60:807-812.
(6) International Dairy Federation. 1987. Milk and Milk Products:

Enumeration of Microorganisms—Colony Count at 3°C. Provisional
IDF Standard 100A. IDF, Brussels, Belgium.
(7) Jarvis, B., V.H. Lach, and J.M. Wood. 1977. Evaluation of the
spiral plate maker for the enumeration of microorganisms in foods. J.
Appl. Bacteriol. 43:149-157.
(8) Niemela, S. 1983. Statistical evaluation of Results from

Quantitative Microbiological Examinations. Report No. 1, 2nd ed.
Nordic Committee in Food Analysis, Uppsala, Sweden.
(9) Tomasiewicz, D.M., D.K. Hotchkiss, G.W. Reinbold, R.B. Read,

Jr., and P.A. Hartman. 1980. The most suitable number of colonies on
plates for counting. J. Food Prot. 43:282-286.
(10) Zipkes, M.R., J.E. Gilchrist, and J.T. Peeler. 1981. Comparison of
yeast and mold counts by spiral, pour, and streak plate methods. J.
Assoc. Off. Anal. Chem. 64:1465-1469.
57
Microorganismos
aerobios mesófilos
Fuente del texto web: Bacteriological Analytical Manual, Edition 8,

Revision A, 1998. Chapter 1.
(1) American Public Health Association. 1985. Laboratory Procedures

for the Examination of Seawater and Shellfish, 5th ed. APHA,
Washington, DC.
(2) AOAC INTERNATIONAL. 1995. Official Methods of Analysis, 16th

ed. AOAC INTERNATIONAL, Arlington, VA.
(3) Food and Drug Administration. 1989. Laboratory Procedures

Manual. FDA, Rockville, MD.
(4) Food and Drug Administration. 1978. EDRO Data Codes Manual.
Product Codes: Human Foods. FDA, Rockville, MD.
(5) Food and Drug Administration. 1993. Investigations Operations

Manual. FDA, Rockville, MD.
(6) International Commission on Microbiological Specifications for

Foods. 1986. Microorganisms in Foods. 2. Sampling for
Microbiological Analysis: Principles and Specific Applications, 2nd ed.
University of Toronto Press, Toronto, Ontario, Canada.
(7) National Academy of Sciences. 1969. An Evaluation of

the Salmonella Problem. National Academy of Sciences, Washington,
DC.
58
Microorganismos
aerobios mesófilos
NOTAS PERSONALES
59
Microorganismos
aerobios mesófilos
Recuento de
microorganismos aerobios mesófilos
Técnica de Recuento en placa
Procedimiento según ICMSF - 2000
1. OBJETIVO
realizar el recuento de microorganismos aerobios mesófilos, por la
técnica de recuento en placa en muestras de alimentos.
2. ALCANCE
El presente procedimiento se aplica para realizar el Recuento de
microorganismos aerobios mesófilos en muestras de alimentos por el
método de Recuento en Placa por siembra en todo el medio (Método
1) y por Siembra en Extensión de Superficie (Método 2).
3. DESARROLLO
3.1. Definiciones
Microorganismos aerobios mesófilos son aquellos microorganismos

(bacterias, mohos y levaduras) que se desarrollan en presencia de
oxígeno libre y a una temperatura comprendida entre 20°C y 45°C,
con una zona óptima entre 30°C y 40°C.
3.2.1. Agua de peptona para diluciones

3.2.2. Agua de peptona salina para diluciones
3.2.3. Una cabina o estufa de desecación para secar la superficie del
medio sólido contenido en las placas. La temperatura más adecuada
es 50°C.
3.2.4. Tween 80 al 1%
3.2.5. Agar para recuento en placa
3.2.6. Estufa de incubación (29°C - 31°C)
3.2.8. Homogeneizador de una o dos velocidades, con control por
reostasto.
60
Microorganismos
aerobios mesófilos
3.2.9. Vasos o recipientes de vidrio o de metal, adecuados para el

homogeneizador, de 1 litro de capacidad, con tapa, resistentes a las
temperaturas de esterilización en autoclave. Debe utilizarse un
recipiente estéril (esterilizado en autoclave a 121°C durante 15
minutos) para cada muestra de alimento a analizar
3.2.11. Balanza de una capacidad no inferior a 2.500 g y de una
sensibilidad de 0.1 g
3.2.12. Instrumentos para preparar las muestras: cuchillos,
tenedores, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, todo ello previamente
esterilizado en autoclave o por aire caliente
3.2.13. Bolsas de polietileno de paredes delgadas aproximadamente
del calibre 200) de unos 18 x 30 cm y con el fondo soldado
3.2.14. Baño de agua o estufa de aire para templar y mantener el
medio fundido a 44°C - 46°C
3.2.15. Heladera a 2°C - 5°C
3.2.16. Peachimetro de exactitud 0.01 a 25°C ± 1°C
3.2.17..Pipetas bacteriológicas estériles de 1 ml, 5 ml y 10 ml de
idênticas características
3.2.18..Tubos de cultivo para el diluyente de 15 ml - 20 ml de
capacidad
3.2.19. Placas de petri de vidrio (100 x 15 mm) o plástico de (90 x 15
mm) de diámetro
3.2.20. Contador de colonias (se recomienda el modelo Quebec de
campo oscuro o equivalente)
3.2.21..Dispositivo de registro automático del número de colonias
contadas
3.2.22. Varillas de vidrio en forma de bastón de hockey para
distribuir el inóculo, dobladas en ángulo recto a 3 cm de un extremo.
3.3. Principio
Los métodos utilizados para el recuento de microorganismos

aerobios mesófilos están basados en las siguientes etapas:
3.3.1. Preparación y homogeneización de la muestra, suspensión

inicial y diluciones decimales sucesivas.
3.3.2. Plaqueo de acuerdo al método utilizado de un medio de cultivo
selectivo de una cantidad específica de la muestra problema, si es
líquida o de la suspensión inicial si es sólida y de las diluciones
sucesivas.
3.3.3. Incubación en aerobiosis a 29°C - 31°C durante el tiempo
establecido, según el método utilizado.
3.3.4. Cálculo del número de microorganismo aerobios mesófilos por
gramo o mililitro de muestra a partir del número de colonias
obtenidas de las placas que dan resultados significativos.
3.4. Muestreo
61
Microorganismos
aerobios mesófilos

metodología.
3.5. Procedimiento

diluciones
3.5.1.1. PROCEDIMIENTO 1
3.5.1.1.1. Una vez tomada la muestra debe iniciarse el análisis tan

pronto como sea posible. La muestra debe refrigerarse a 0°C - 5°C si
no puede ser estudiada inmediatamente después de su llegada al
laboratorio. Si la muestra está congelada, descongelarla en su envase
original (o en el recipiente en el que llegó al laboratorio) durante un
tiempo máximo de 18 horas en una heladera o frigorífico a 2°C -
5°C. Si la muestra congelada puede ser fácilmente triturada, no es
necesario descongelarla.
3.5.1.1.2. Tarar el vaso del homogeneizador estéril y vacío y pesar en

él 50 g ± 0.1 g representativo de la muestra del alimento. Si el
contenido del envase no es homogéneo (como sucede, por ejemplo,
en un plato precocinado congelado), deberá tomarse una muestra
de 50 g a partir de un macerado de todos los componentes o se
analizarán separadamente cada uno de ellos, según la finalidad del
examen.
3.5.1.1.3. Añadir al vaso del homogeneizador 450 ml de agua

peptona para diluciones o de agua peptona salina para diluciones. De
este modo se obtiene una dilución 10-1.
3.5.1.1.4..Homogeneizar el alimento y hacer las diluciones

inmediatamente.
3.5.1.1.5. Medir 1 ml de la dilución 10-1 del homogeneizado,

evitando la formación de espuma y pasarlo a uno de los blancos de
dilución conteniendo 9 ml de diluyente ó medir 10 ml de la dilución
10-1 y pasarlo a 90 ml de diluyente. Agitar esta dilución y las
subsiguientes enérgicamente 25 veces en un arco de 30 cm. Repetir
esta operación utilizando las diluciones progresivamente más
elevadas para preparar las diluciones 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 ó las
necesarias según indique la experiencia para el alimento que se va a
analizar.
62
Microorganismos
aerobios mesófilos
3.5.1.2. PROCEDIMIENTO 2
3.5.1.2.1. Comenzar a trabajar tan pronto como sea posible después

de la toma de muestra. Pesar en una bolsa de polietileno previamente
tarada, al menos 10 g representativos de la muestra total. Los
alimentos congelados no precisan ser previamente descongelados a
no ser que ello resulte necesario para pesar las unidades de muestra.
Tampoco es necesario picar, antes de homogeneizar, alimentos como
la carne. Si es preciso descongelar la muestra, ésta se mantendrá en
su envase original (o en el recipiente en el que llegó al laboratorio) en
una heladera o frigorífico a 2°C - 5°C y se iniciará el análisis tan
pronto como la descongelación permita tomar adecuadamente las
unidades de muestra (el tiempo máximo de descongelación no
superará las 18 horas).
3.5.1.2.2. Añadir un volumen de diluyente igual a 9 veces la muestra.

Así se obtiene una dilución 10-1.
3.5.1.2.3. Si se sabe o se sospecha que el alimento contiene

gérmenes patógenos, es conveniente colocar la bolsa conteniendo la
muestra y el diluyente dentro de otra bolsa como precaución frente a
la posibilidad de que se rompa la primera.
3.5.1.2.4. Para alimentos con un elevado contenido en grasa

(superior al 20%), como ocurre por ejemplo en ciertas carnes, en
necesario añadir un 1% de Tween 80 ó de otro tensioactivo no tóxico.
3.5.1.2.5. Colocar la bolsa en el “Stomacher” y hacer funcionar el

aparato durante 60 segundos.
3.5.1.2.6. Agitar enérgicamente la bolsa con las manos y pipetear 10

ml en un frasco conteniendo 90 ml de diluyente, o bien pasar 1 ml a
un tubo conteniendo 9 ml de diluyente. De este modo se obtiene la
dilución 10-2.
3.5.1.2.7. Agitar enérgicamente la suspensión de 100 ml 25 veces en

un arco de 30 cm, o aspirar 10 veces la suspensión de 10 ml con una
pipeta estéril. Pipetear 10 ml en un nuevo blanco de dilución de 90 ml
ó 1 ml en uno de 9 ml, obteniendo de esta forma la dilución 10 -3.
Repetir esta operación para preparar las diluciones 10-4 y 10-5, ó las
necesarias, según indique la experiencia, para el alimento que se va a
analizar.
3.5.2.1. MÉTODO 1: Recuento estándar en placa o recuento en

placa por siembra en todo el medio
63
Microorganismos
aerobios mesófilos
Preparar la suspensión inicial y diluciones por uno de los dos

procedimientos detallados en 3.5.1.1. y 3.5.1.2.
3.5.2.1.1. Pipetear por duplicado, en placas de Petri, alícuotas de 1

ml de las diluciones 10-1, 10-2,10-3,10-4, y 10-5 y una alícuota de 0,1
ml de la dilución 10-5, lo que supone la siembra por placa de 10 -1 a
10-6 g de alimento. Se aconseja esta serie de diluciones en aquellos
casos en que se desconoce en número aproximado de gérmenes
presentes en el alimento, pero el rango de diluciones preparadas y
sembradas puede modificarse en función de la cifra de
microorganismos esperada. De todos modos, siempre deben
sembrarse tres diluciones distintas.
3.5.2.1.2. Fundir el agar para recuento en placa utilizando vapor o

agua hirviendo y procurando que este tratamiento térmico no sea
excesivamente prolongado. Templar el medio a 44°C - 46°C y
controlar cuidadosamente su temperatura para que al mezclarlo con
la dilución del alimento no sean inactivados los gérmenes. Verter
inmediatamente en las placas de Petri 10 ml - 15 ml del medio
fundido y templado. El período de tiempo transcurrido entre la
realización de las diluciones y el vertido del medio no debe superar
los 20 minutos y es preferible que sea inferior a 10 minutos.
3.5.2.1.3. Acto seguido, mezclar el inóculo con el medio fundido,

inclinando y girando las placas. La forma adecuada de llevar a cabo
esta operación sería la siguiente: (a) imprimir a la placa movimientos
de vaivén 5 veces en una dirección, (b) hacerla girar 5 veces en
sentido de las agujas del reloj, (c) volver a imprimir movimientos de
vaivén en una dirección que forme ángulo recto con la primera y (d)
hacerla girar 5 veces en sentido contrario a las agujas del reloj.
3.5.2.1.4. Con el fin de controlar la esterilidad, preparar una o varias

placas conteniendo medio y diluyente sin inocular. Transcurrido el
período de incubación, el número de colonias presentes en estas
placas no debe modificar el recuento en más de una unidad en la
segunda cifra significativa.
3.5.2.1.5. Una vez solidificado el agar, invertir las placas e incubarlas

a 29°C - 31°C durante 48 ± 3 h.
3.5.2.2. MÉTODO 2: Recuento en placa por siembra en

extensión en superficie
Preparar la suspensión inicial y diluciones por uno de los dos
procedimientos detallados en 3.5.1.1. y 3.5.1.2.
3.5.2.2.1. Añadir a cada placa de Petri 15 ml de medio para recuento

en placa fundido y enfriado a 45°C - 60°C y dejar solidificar. Secar
las placas preferiblemente a 50°C durante 1.5 - 2 h. Si las placas se
64
Microorganismos
aerobios mesófilos
preparan con antelación, no deben guardarse más de 24 horas a

temperatura ambiente ó de 7 días en heladera o frigorífico a 2°C -
5°C.
3.5.2.2.2. Tomar dos alícuotas de 0.1 ml de la dilución más elevada y

depositarlas en la superficie del medio contenido en 2 placas de Petri
(2 placas por dilución, sembrando en cada una 0.1 ml). Repetir esta
operación con cada dilución hasta llegar a la más concentrada
utilizando siempre la misma pipeta que se vaciará y llenará tres veces
antes de transferir a cada placa los 0.1 ml. Deben sembrarse por lo
menos tres diluciones aún en el caso de que se conozca el número
aproximado de microorganismos presentes en la muestra de
alimento.
3.5.2.2.3. Extender las alícuotas de 0.1 ml sobre la superficie del

medio tan pronto como sea posible, utilizando las varillas de vidrio en
forma de bastón (emplear una varilla de vidrio para cada placa).
Dejar secar las superficies de las placas durante 15 minutos.
3.5.2.2.4. Incubar las placas invertidas durante 3 días a 29°C - 31°C.

Las indicaciones señaladas pueden ser utilizadas tanto en el Método 1
como en el Método 2:
3.5.3.1. Elegir las dos placas, correspondientes a una dilución, que

presenten entre 30 y 300 colonias. Contar todas las colonias de cada
placa utilizando el contador de colonias y el dispositivo de registro
automático. Hallar la media aritmética de los dos valores y
multiplicarla por el factor de dilución (la inversa de la dilución cuyas
placas han sido seleccionadas). Dar el valor obtenido como el
recuento estándar en placa.
3.5.3.2. Si una de las placas de la dilución elegida presenta algo

menos de 30 colonias o algo más de 300, deben de contarse también
todas las colonias de ambas y como en el caso anterior, hallar la
media aritmética y multiplicarla por el factor de dilución. El valor
obtenido se dará como el recuento estándar en placa.
3.5.3.3. Cuando las placas de dos diluciones consecutivas presentan

entre 30 y 300 colonias, deben hallarse los recuentos estándar en
placa de cada dilución tal como se ha señalado anteriormente y se
dará como resultado la media de los dos valores obtenidos, a no ser
que uno de ellos sea superior al doble del otro, en cuyo caso se dará
como recuento estándar en placa el valor más bajo.
65
Microorganismos
aerobios mesófilos
3.5.3.4. Cálculo del recuento estándar en placa estimado

(a) Si ninguna de las placas tiene entre 30 y 300 colonias, el valor
calculado se da como el recuento estándar en placa estimado y el
cálculo del número de microorganismos presentes en el alimento se
lleva a cabo en los distintos casos en la forma que se indica en los
apartado (b), (c) y (d), a continuación.
(b) Si todas las placas presentan más de 300 colonias, dividir las dos
placas, correspondientes a la dilución más elevada, en secciones
radiales (2,4 u 8) y contar todas las colonias obtenidas en cada caso
por el factor adecuado, con el fin de conseguir una estimación del
número total de colonias presentes en la placa. Hallar la media del
valor estimado por las dos placas y multiplicar por el factor de
dilución correspondiente. El valor obtenido se da como el recuento
estándar en placa estimado.
(c) Si en las placas inoculadas con la dilución menos concentrada se
encuentran más de 200 colonias en una sección correspondiente a la
octava parte de la placa, multiplicar 1.600 (procedente de 200 x 8)
por el factor de dilución y expresar el recuento estándar en placa
estimado como superior (>) al valor obtenido. En estos casos resulta
aconsejable señalar entre paréntesis la dilución utilizada.
(d) Cuando no se encuentran colonias en las placas correspondientes
a la dilución más concentrada, expresar el recuento estándar en placa
estimado como inferior a (<) 1 multiplicado por el factor de la
dilución más concentrada.
3.5.3.5 Presencia de colonias de crecimiento difusivo en

superficie
(a) Cuando en las placas elegidas aparezcan estas colonias y siempre
que el área ocupada por ellas no supere la mitad de la placa, contar
las colonias de otro tipo que se encuentran fuera de esta zona.
Corregir la cifra obtenida teniendo en cuenta el área en que no se han
podido contar las colonias.
(b) Siempre que la zona ocupada por este tipo de colonias supere la
cuarta parte de la superficie de la placa hay que anotar su presencia.
Si este problema lo presenta más de una placa de cada veinte hay
que tomar las medidas necesarias para evitar su aparición (como, por
ejemplo, reducir la humedad de la estufa de incubación o mezclar el
inóculo con el medio fundido y templado de forma más completa.
Cuando se dan los valores del recuento estándar en placa o del

recuento estándar en placa estimado, deben utilizarse únicamente
dos cifras significativas. Estas dos cifras corresponden a los dígitos
primero y segundo (empezando por la izquierda) de la media de las
colonias halladas o estimadas. Los dígitos restantes tienen que ser
substituidos por ceros. Por ejemplo, si el valor calculado fue 523.000,
éste ha de darse como 520.000 (52x104). Si el tercer dígito
66
Microorganismos
aerobios mesófilos
empezando por la izquierda es 5 o superior, se le añade una unidad

al segundo dígito (se redondea). Por ejemplo, si el valor calculado es
83.600, este debe hacerse como 84.000 (84x103).
Los resultados se expresan como UFC de microorganismos aerobios
mesófilos por gramos o por mililitro del alimento según corresponda.
67
Microorganismos
aerobios mesófilos
4. ANEXOS

de microorganismos aerobios mesófilos
MÉTODO 1
Preparación de la Preparación de la
suspensión inicial: suspensión inicial:
PROCEDIMIENTO 1 ó PROCEDIMIENTO 2
50 g de Muestra + 450 ml 10 ± 0.1 g de Muestra + 90 ml

de diluyente (dilución 10-1) de diluyente (dilución 10-1)
MÉTODO 1
Transferir por duplicado 1 ml de la suspensión inicial y 1 ml de las
diluciones en placas de Petri vacías.
Verter 10 ml – 15 ml de agar para recuento en placa e incubar a
29°C - 31°C, 48 ± 3 h
Recuento y selección de las

colonias características:
Seleccionar las placas con un mínimo de 30 colonias y un máximo
de 300 colonias y calcular el recuento
68
Microorganismos
aerobios mesófilos
MÉTODO 2:
Preparación de la Preparación de la
suspensión inicial: suspensión inicial:
PROCEDIMIENTO 1 ó PROCEDIMIENTO 2
50 g de Muestra + 450 ml 10 ± 0.1 g de Muestra + 90 ml

de diluyente (dilución 10-1) de diluyente (dilución 10-1)
MÉTODO 2
Transferir por duplicado 0.1 ml de la suspensión inicial y 0.1 ml de las
diluciones en placas de Petri con agar para recuento en placa.
Incubar a 29°C - 31°C, 3 días
Recuento y selección de las

colonias características:
Seleccionar las placas con un mínimo de 30 colonias y un máximo
de 300 colonias y calcular el recuento
69
Microorganismos
aerobios mesófilos
ANEXO 2: Medios de cultivo y reactivos
1. Agua de peptona para diluciones
Instrucciones: Disolver 1 gramo de peptona en 1 litro de agua

destilada y ajustar el pH a 7 ± 0.1. Distribuir en frascos para
diluciones o en tubos en volumenes predeterminados, de tal forma
que después del tratamiento en autoclave (121°C durante 15
minutos) el volumen sea de ±2% del deseado; ó, si los recipientes
tienen marcado el volumen, reajustar éste de modo aséptico con una
pipeta después de la esterilización.
2. Agua de peptona salina para diluciones
Peptona 1g
Instrucciones: Disolver los ingredientes en un litro de agua

destilada y ajustar el pH a 7 ± 0.1. Distribuir en frascos de dilución o
en tubos, en volumenes predeterminados, de tal forma que después
del tratamiento en autoclave (121°C durante 15 minutos) el volumen
sea el deseado ± 2%. Si los recipientes estuviesen graduados,
reajustar los volúmenes asépticamente con una pipeta después de la
esterilización.
3. Agar para recuento en placa
Triptona 5g
Glucosa 1.0 g
Agar 15 g
Instrucciones: Añadir los ingredientes a un litro de agua destilada,

calentar hasta la ebullición agitando para obtener la completa
disolución, enfriar a 45°C - 60°C y ajustar la reacción de forma que el
pH después de la esterilización sea de 7.0 ± 0.1. Distribuir en la
forma más conveniente y esterilizar en el autoclave a 121°C durante
15 minutos.
Este medio existe en el mercado en forma deshidratada;
reconstituirlo en la forma indicada en el envase.
70
Microorganismos
aerobios mesófilos
ANEXO 3: FOTOS
Hongos y Levaduras Bacterias
(1) Microorganismos de los Alimentos 1. Su significado y Método de

Enumeración 2da Ed. ICSMF - 2000.
71
Microorganismos
aerobios mesófilos
NOTAS PERSONALES
72
73
Mohos y Levaduras
74
Mohos y Levaduras
Mohos y levaduras
1. Generalidades
Los hongos son miembros del reino vegetal que no están

diferenciados en raíces, tallos y hojas; carecen del pigmento
fotosintético verde, la clorofila. Presenta múltiples formas, incluidos
setas, mohos y levaduras.
Comúnmente se da el nombre de moho a ciertos hongos
multicelulares filamentosos, dotados de un micelio verdadero,
microscópicos, y cuyo crecimiento en los alimentos se conoce
fácilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso.
Los hongos son microorganismos aerobios estrictos, eucarióticos,
característicamente miceliares, y heterótrofos con nutrición por
absorción, desarrollan en un rango de pH de 2 a 9, temperaturas
entre 10 a 35ºC y pueden crecer en condiciones de actividad de agua
(aw) relativamente bajas (<0.85), aunque las levaduras
generalmente requieren una mayor actividad de agua.
Asimismo las levaduras son hongos que crecen generalmente en
forma de agregados sueltos de células independientes, que pueden
ser globosas, ovoides, piriformes, alargadas o casi cilíndricas. En
algunos casos, forman cadenas de células alargadas, adheridas de
modo suelto, semejantes a un micelio, por lo que se las denomina
seudomicelio. Cuando crecen sobre medios sólidos, forman colonias
de aspecto característico que recuerdan a las colonias bacterianas. En
casi todas las especies de interés industrial, el modo habitual de
reproducción vegetativa es por gemación. Muchas de ellas presentan
reproducción sexual por medio de ascosporas y, a diferencia de los
mohos, las levaduras no pueden identificarse solamente por sus
caracteres morfológicos; se precisa la ayuda de pruebas bioquímicas
para la identificación específica.
La importancia de la presencia de mohos y levaduras en los alimentos
está determinada por la capacidad de producir diferentes grados de
deterioro y descomposición de los mismos. Además los hongos
producen metabolitos tóxicos conocidos como micotoxinas,
compuestos estables que no se destruyen durante el procesamiento
de alimentos, por lo que son responsables de intoxicación con
consecuencias graves (cáncer, mutagénesis) en los órganos
afectados. También están asociados a reacciones alérgicas e
infecciones sobretodo en la población inmunocomprometida, en
ancianos y niños.
75
Mohos y Levaduras
2. Referencias
(1) Pascual Anderson, M., Calderon y Pascual, V., 2º Edición 2000.

Microbiología alimentaria. Metodología analítica para alimentos y
bebidas. Editorial Díaz de Santos, S. A. Madrid España. Capitulo 16
Joaquín Berenguer Soler. Pág: 141-148.
(2) Hayes, P. R. Microbiología e higiene de lós alimentos. Editorial
Acribia S. A. España 1993. Capítulo 1. Pág: 1-22.
(3) International Food and Drug Administration “Bacteriological

Analytical Manual”, BAM Online, enero 2001, capítulo 18.
76
Mohos y Levaduras
NOTAS PERSONALES
77
Mohos y Levaduras
Método horizontal para la

enumeración de mohos y levaduras
Parte 2: Técnica de recuento en placa para productos con
actividad de agua menor o igual a 0.95

ISO 21527-2:2008
1. OBJETIVO

realizar la enumeración de mohos y levaduras presentes en productos
alimenticios con actividad de agua menor o igual a 0.95.
2. AlCANCE
Método horizontal para la enumeración de mohos xerófilos y

levaduras osmófilas viables, por la técnica de recuento de colonias en
placa a 25°C ± 1°C, en alimentos para el consumo humano y
alimentación animal que tengan una actividad de agua igual o menor
a 0.95 (frutas secas, mermeladas, carnes secas o saladas, granos,
cereales, harinas, especies, condimentos, etc.)
Esta parte de la norma no es aplicable a productos deshidratados con
una actividad de agua menor o igual a 0.60 (cereales deshidratados,
productos oleaginosos, especies, plantas leguminosas, semillas,
bebidas instantáneas
en polvo, productos secos para alimentación animal, etc.) y no
permite la enumeración de esporas de mohos.
No es indicada para la enumeración de hongos xerófilos halófilos tales
como se encuentran en pescado seco.
3. DESARROLLO
3.1. Definiciones
Levaduras osmófilas y mohos xerófilos: hongos capaces de crecer a

una actividad de agua menor o igual a 0.95
3.2. Medios de cultivo, equipos y materiales
3.2.1. Caldo agua peptona al 0.1%

3.2.2. Agar dicloran glicerol 18 % (DG18)
78
Mohos y Levaduras

3.2.4. Autoclave
3.2.5. Estufa de incubación capaz de funcionar a 25°C ± 1°C
3.2.8. Microscopio (campo claro, ampliación de 250 a 1000 veces)
3.2.9. Lupa (aumento de 6.5 a 50 veces)
3.2.10. Baño de agua, o aparato similar, capaz de funcionar a 44°C a
47°C
3.2.11. Pipetas de 1 ml, graduadas en intervalos de 0.1 ml
3.2.12 Erlenmeyer, frascos y tubos, para la preparación y el
almacenamiento de los medios de cultivo, y para la realización de las
diluciones
diámetro.
3.2.14. Ansas de platino/irídio o níquel/cromo de aproximadamente
3 mm de diámetro y de punción del mismo material, o equivalentes
estériles descartables
3.2.16. Porta y cubreobjetos
Opcionales:
3.2.17. Cloranfenicol
3.2.18. Clorhidrato de clorotetraciclina
3.2.19. Elementos traza (ver anexo 2.2)
3.2.20. Tergitol
3.2.21. Tween 80
3.3. Principio
Se siembra en la superficie de placas con medio de cultivo específico,

un volumen de la muestra (si el producto es líquido), o una alícuota
de la suspensión inicial (en el caso de otros productos). Si se
presume una alta contaminación del alimento se pueden sembrar
diluciones decimales del mismo o de la suspensión inicial.
Posteriormente las placas se incuban aeróbicamente a 25°C ± 1°C
durante 5 a 7 días.
Luego se cuentan las colonias de hongos desarrolladas. Si es
necesario diferenciar levaduras de bacterias, se realiza un examen
con una lupa binocular o un microscopio.
El número de levaduras y mohos por gramo o por mililitro de muestra
se calcula a partir del número de colonias obtenidas de las placas
elegidas en los niveles de dilución que desarrollaron colonias
contables. Los mohos y las levaduras se cuentan por separado, si es
necesario.
3.4. Muestreo
79
Mohos y Levaduras
El ensayo debe realizarse a una muestra representativa que no debe

haber sido dañada o cambiada durante el transporte al laboratorio o
su almacenamiento. La muestra no debe congelarse. El muestreo no
es parte del método especificado en esta parte de la ISO 21527. El
muestreo se llevará a cabo de conformidad con la norma
internacional específica, adecuada al producto en cuestión. Si no hay
una norma internacional específica, se recomienda que las partes
interesadas lleguen a un acuerdo sobre este tema.
3.5. Procedimiento


El diluyente recomendado es el Caldo agua peptona al 0.1% (ver
anexo 2), excepto para muestras que requieran una preparación
específica.
Se recomienda el uso de un diluyente con una cantidad suficiente de

soluto (ej. una solución al 20% a 35% de glicerol o D-glucosa) para
disminuir el shock osmótico de mohos xerófilos y levaduras osmófilas
cuando se realizan las diluciones decimales antes de la siembra.
Si la muestra es sólida o el producto lo requiera (ej: un líquido con

alta carga microbiana), realizar una suspensión inicial (1/10).
En un frasco estéril o bolsa de plástico estéril pesar x g ± 5% ó x ml

± 5% de la muestra (como mínimo 10 g ó 10 ml a menos que se
indique otra cantidad).

1/10) y homogenizar entre 1 a 3 min dependiendo del alimento.

temperatura la temperatura del diluyente debería ser aproximada a la
temperatura ambiente.

Transferir con una pipeta 1 ml ± 5% de la suspensión inicial en un
tubo con 9 ml del diluyente estéril. Se recomienda utilizar caldo de
agua de peptona al 0.1% como diluyente.

suspensión inicial y evitar el contacto entre la pipeta conteniendo el
80
Mohos y Levaduras
Mezclar preferentemente utilizando un agitador mecánico durante 5 s

a 10 s para obtener la dilución 10-2.
Si es necesario repetir esta operación utilizando la dilución 10 -2 y

estéril para obtener 10-3, 10-4, etc., diluciones, hasta que se obtenga
un número apropiado de microorganismos para realizar el recuento.
NOTA: Agitar la suspensión inicial y diluciones con el fin de evitar la

sedimentación de partículas que contienen microorganismos.
Debido a la rápida sedimentación de las esporas en la pipeta,

mantener la pipeta en una posición horizontal (no vertical), cuando se
llena con el volumen apropiado de la suspensión inicial y diluciones.

es de 30 minutos.
NOTA: si la temperatura ambiental del laboratorio es muy alta estos

3.5.2 Inoculación e incubación
3.5.2.1. Transferir por medio de una pipeta estéril 0.1 ml de la

muestra si el producto es líquido ó 0.1 ml de la suspensión inicial
(dilución 1/10) por duplicado en placas de agar dicloran glicerol
18% (DG18).
Repetir el procedimiento para las diluciones decimales si es necesario.
Para facilitar el recuento de bajas poblaciones de levaduras y mohos,
se puede inocular un volumen de hasta 0.3 ml de una dilución 10-1; o
directamente de la muestra si es líquida, en tres placas.
3.5.2.2. Distribuir el inóculo tan pronto como sea posible sobre la
superficie del agar con una espátula estéril, hasta que el líquido se
absorba completamente en el medio.
NOTA: Se puede utilizar para la siembra el método de placa vertida,

pero en este caso se validará la equivalencia de resultados
comparando con los de la inoculación en superficie. La discriminación
y la diferenciación de mohos y levaduras no son admisibles.El método
de siembra en superficie puede dar recuentos más altos. Este permite
una máxima exposición de las células al oxígeno atmosférico y evita
cualquier riesgo de inactivación térmica de los propágulos fúngicos.
Los resultados pueden depender del tipo de hongos.
81
Mohos y Levaduras
3.5.2.3 Incubar las placas aeróbicamente sin invertir (con la tapa

superior hacia arriba), a 25°C ± 1°C durante 5 a 7 días. Si es
necesario. Se recomienda incubar las placas en una bolsa de plástico
abierta con el fin de no contaminar la estufa en caso de dispersión de
los hongos.
3.5.3.1 Realizar el recuento entre el 2º y el 5º día de incubación. Si

se han desarrollado mohos de crecimiento rápido, contar el 2º día y
luego el 5º y el 7º.
Seleccionar las placas con menos de 150 (generalmente entre 10 y
150):
Si la microflora está compuesta principalmente de mohos se
seleccionan las placas dentro del intervalo de recuentos más bajos.
Si la microflora está compuesta principalmente de levaduras se
seleccionan las placas que contienen hasta el límite superior de
recuento.
Puede llevarse a cabo un examen con una lupa binocular o con un

microscopio con el fin de distinguir entre levaduras o mohos y
colonias bacterianas.
Contar las colonias de levaduras y las colonias / propágulos de mohos
por separado, si es necesario.
Si la identidad de las colonias es dudosa, se examinan preparaciones

húmedas o teñidas de células procedentes de un mínimo de 5
colonias por muestra para confirmar que no hay bacterias presentes
NOTA 1: El método de recuento de mohos y levaduras puede ser

impreciso ya que el cultivo desarrollado consiste en una mezcla de
micelio y esporas asexuales y sexuales. El número de unidades
formadoras de colonias dependen del grado de fragmentación del
micelio y la proporción de esporas capaces de crecer en el medio en
placa.
NOTA 2: La no linealidad de los recuentos de dilución en placas a

menudo se produce, es decir, diluciones 1:10 de muestras a menudo
no dan lugar a reducciones de 10 veces en los números de colonias
recuperadas en el medio.
Esto se ha atribuido a la fragmentación del micelio y la rotura de
grumos de esporas durante la dilución, además de la inhibición
competitiva cuando un gran número de colonias están presentes en
las placas.
PRECAUCIÓN - Las esporas de hongos se dispersan en el aire

con gran facilidad. Manipular las placas de Petri con cuidado
82
Mohos y Levaduras
para evitar el desarrollo de colonias satélites que darían lugar

a una sobreestimación de la población en la muestra.
Según ISO 7218:2007: Requisitos generales y guía para el examen

microbiológico.
3.5.4.1. Se informa recuento de mohos y levaduras en la porción

de muestra analizada (por mililitros para muestras líquidas, o por
gramo para el resto de los productos). Ver Anexo 3: Cálculo y
expresión de resultados.
3.5.4.2. Si las dos placas correspondientes a la muestra sembrada
(productos líquidos) o a la suspensión inicial (otros productos) no
contienen colonias de mohos y/o levaduras, informar el resultado
como sigue:
< 10 UFC/ ml (productos líquidos)

< 102 UFC/g (otros productos)
Volumen sembrado = 0.1 ml
83
Mohos y Levaduras
4. ANEXOS
ANEXO 1: Diagrama de flujo del procedimiento de enumeración

de mohos y levaduras
Preparación de la muestra: x g de muestra + 9 x ml

de diluyente (dilución 1/10) y homogeneización
(1 a 3 min)
Preparación de diluciones decimales: 1 ml de la

suspensión inicial + 9 ml del diluyente (dilución 10-2).
Proceder de igual manera para las siguientes
diluciones.
1 ml de la suspensión inicial + 9 ml del diluyente

(dilución 10-2)e incubación: Sembrar una placa por
Inoculación
dilución con 0.1 ml de muestra líquida ó suspensión
inicial y 0.1 ml de dilución decimal (10-2, 10-3,etc.), en
placas de Petri con Agar DG18.
Incubar a 25ºC ± 1ºC durante 5 a 7 días.
Recuento: Seleccionar las placas con menos de 150

colonias de mohos y/o levaduras (generalmente entre
10 y 150)
Realizar el recuento entre el 2° y 5° día: si hay mohos
de crecimiento rápido contar el 2° día y luego el 5° y
7º día.
84
Mohos y Levaduras
ANEXO 2: Medios de cultivo
1. Diluyentes: ver norma ISO 6887-1: 1999
1.1. Caldo agua peptona al 0.1%
Digesto enzimático de tejido animal o vegetal 1.0 g

pH: 7.0 ± 0.2
NOTA: Es posible agregar al diluyente un agente tensoactivo como el

Tween 80 en una concentración al 0.05 % para reducir el
aglutinamiento de esporos de mohos y conidias.
2. Agar Selectivo
2.1. Agar dicloran glicerol 18 % (DG18)

D-Glucosa (C6H12O6) 10.0 g
Sulfato de magnesio (MgSO4 . H2O) 0.5 g
Dicloran (2,6-dicloro-4-nitroanilina) 0.002 g
Glicerol anhidro 220 g
Agar 12 - 15 g
Cloranfenicol 0.1 g
pH: 5.6 ± 0.2
Preparar las placas con 15 ml de de agar, dejar solidificar, utilizar

inmediatamente o conservar en la oscuridad.
2.2 Agregados opcionales para el Agar dicloran glicerol

18 % (DG18)
Cloranfenicol (50 mg/l) y clorhidrato de clorotetraciclina (50 mg/l):

Cuando existe el problema de un sobrecrecimiento bacteriano como
por ejemplo en carne fresca.
Elementos traza: para que los mohos exhiban toda su morfología en

especial algunos pigmentos.
Agregar una solución de elementos traza de 1 ml por litro de medio,
antes del autoclavado de la siguiente solución:
85
Mohos y Levaduras
ZnSO4. 7H2O 1.0 g

CuSO4 . 5H2O 0.5 g
Tergitol (1ml/l): para impedir el sobrecrecimiento de Mucoraceae
86
Mohos y Levaduras
ANEXO 3: Cálculo y expresión de resultados (ISO 7218:2007)
Para placas con un mínimo de 10 colonias y un máximo de 150

colonias el número de microorganismos N presentes en la muestra
de análisis se calcula como, la media corregida de dos diluciones
consecutivas según la siguiente ecuación:
N
C
V1.1d
∑C: Suma de las colonias contadas en las dos placas escogidas de
las dos diluciones consecutivas, de las cuales al menos una contiene
V : Volumen del inóculo utilizado en cada placa en mililitros.
d : Es la dilución correspondiente a la primera dilución escogida
El resultado calculado se redondea a dos cifras significativas. Si la

tercera cifra es inferior a 5, no se modifica la cifra anterior. Si es igual
o superior a 5, la cifra anterior se incrementa en una unidad.
Preferiblemente el resultado se expresa como un número entre 1,0 y

El resultado se expresa como número de mohos y levaduras N por

mililitro (para los productos líquidos) o por gramo (para el resto de
productos).
87
Mohos y Levaduras
ANEXO 4: Fotos de hongos desarrollados en Agar Dicloran Glicerol

18 % (DG18)
Rhodotorula mucilaginosa Mucor racemosus
Saccharomyces cerevisiae
88
Mohos y Levaduras
ANEXO 5: Ejemplos de la actividad de agua de acuerdo a los

productos que se desean analizar
Actividad
Ejemplos de matrices de alimentos
de agua
Alimentos altamente perecederos (frutas frescas y en conserva,

> 0.95 verduras, carne, pescado), leche, embutidos cocidos, panes,
alimentos que contienen hasta 4% de sacarosa o 7% de NaCl (sal).
Quesos duros como el Cheddar, carne curada, concentrados de

> 0.91
zumos de frutas con adición de 55% de sacarosa y 12% de NaCl.
Salchicha fermentada, bizcochos, queso seco, margarina, alimentos

> 0.87
que contienen el 65% de sacarosa y 15% de NaCl (sal)
La mayoría de los concentrados de zumos de frutas, leche

> 0.80 condensada, sirope, harina, tortas de alto contenido de azúcar,
legumbres contienen de 15% a 17% de humedad.
> 0.75 Mermelada, frutas confitadas, mazapán, malvaviscos, pastel.
Copos de avena que contienen 10% de humedad, mermelada, miel,

> 0.65
frutos secos.
Frutas secas que contienen 15% a 20% de humedad, caramelos,

> 0.60 miel, barras de cereales, piensos para perros, alimentos granulados,
granos, cereales y productos de cereales.
Fideos que contienen 12% de humedad, especias que contienen 10%

> 0.50
de humedad.
> 0.40 Huevo en polvo entero con 5% de humedad, turrón.
Galletas, galletas saladas, masa de pan que contiene 3% a 5% de

> 0.30
humedad, salsa base deshidratada.
Leche entera en polvo que contiene 2% a 3% de humedad, sopas

> 0.03
deshidratadas, café instantáneo.
89
Mohos y Levaduras
Para las referencias con fecha sólo se aplica la edición citada. Para las
referencias sin fecha se aplica la última edición del documento de
referencia (incluyendo cualquier modificación).
ISO 6887 (todas las partes), Microbiología de los alimentos y

piensos - Preparación de muestras de ensayo, suspensión inicial y
diluciones decimales para examen microbiológico.
ISO 7218, Microbiología de los alimentos y los piensos Requisitos

generales y de orientación para el examen microbiológico.
ISO 8261, Leche y productos lácteos - Orientaciones generales para

la preparación de las muestras, suspensiones iniciales y diluciones
decimales para examen microbiológico.
ISO / TS 11133 (todas las partes), Microbiología de los alimentos y

piensos - Directrices sobre la preparación y producción de medios de
cultivo.
ISO 21527-1, Método horizontal para la enumeración de mohos y

levaduras. Parte 1: Técnica de recuento en placa para productos con
actividad de agua superior a 0.95 .
90
Mohos y Levaduras
NOTAS PERSONALES
91
Mohos y Levaduras
NOTAS PERSONALES
92
Mohos y Levaduras
Recuento de unidades formadoras de

colonias de Mohos y Levaduras en
leche y productos de la leche
Técnica de recuento en placa a 25ºC
International Standard ISO 6611:2004
1. OBJETIVO

realizar la detección y el recuento de unidades formadoras de
colonias (UFC) de mohos y/o levaduras viables por la técnica de
recuento de colonias en placa a 25°C en muestras de leche y
productos de la leche.
2. ALCANCE
Este procedimiento se aplica para realizar la detección y enumeración

de mohos y/o levaduras viables por la técnica de recuento de colonias
en placa a 25°C en muestras de:
- leche, productos líquidos de la leche,

- leche deshidratada, suero dulce deshidratado, suero de leche
deshidratado, lactosa,
- queso,
- caseína ácida, caseína láctica, caseína de cuajo (caseína
rennet),
- caseinato, suero ácido en polvo,
- manteca,
- productos lácteos congelados (incluido helados),
- flanes, postres, leche fermentada y crema.
Nota: Este método no es adecuado para un gran número de

levaduras termolábiles (en queso fresco). En tales casos se prefiere el
método de siembra en superficie.

procedimiento son indispensables las normas citadas en el anexo 4.
Referencias.
93
Mohos y Levaduras
3. DESARROLLO
3.1. Definiciones
Para el propósito de este documento, se define a mohos y levaduras

como microorganismos que forman colonias a 25ºC en medios
selectivos bajo las condiciones especificadas en este procedimiento.
3.2. Medios de cultivo, reactivos, materiales y equipos (ver

anexo 2)
3.2.1. Agua de peptona bufferada (APB)

3.2.2. Solución salina peptonada (SSP)
3.2.3. Solución de Ringer de potencia 1/4x
3.2.4. Solución de peptona
3.2.5. Solución tamponada de fosfato
3.2.6. Solución de citrato sódico
3.2.7. Solución de fosfato ácido dipotásico
3.2.8. Solución de fosfato ácido dipotásico con agente antiespumante
3.2.9. Solución de tripolifosfato sódico
3.2.10. Monooleato de sorbitán (polisorbato 80)
3.2.11. Diluyente de uso general con solución de alfa-amilasa
3.2.12. Agua de peptona tamponada con púrpura de bromocresol
3.2.13. Agar extracto de levadura-glucosa-oxitetraciclina (OGA)
3.2.14. Agar extracto de levadura-glucosa-cloranfenicol (YGC)
3.2.15. Estufa de esterilización (calor seco)
3.2.16. Autoclave (calor húmedo)
3.2.19. Baño de agua con capacidad para operar a 45ºC ± 1ºC
3.2.20. Contador de colonias, que consiste de una fuente de luz y un
fondo oscuro en la base, equipado con una lente de aumento para ser
utilizado con un aumento de 1,5 x, y un contador mecánico ó
electrónico digital
3.2.21. Pipetas de 1 ml de capacidad y de 10 ml graduadas en
intervalos de 0.1 y 0.5 ml respectivamente con filtro de algodón
3.2.22. Ansas de platino/iridio o níquel/cromo de aproximadamente 3
en particular de 16 mm x 160 mm o bolsas de plástico estériles de
capacidad apropiada.
diámetro o de 140 mm en caso que fuera necesario.
3.2.26. Vortex
3.2.27. Cuentas de vidrio
3.2.28. Varilla de vidrio
94
Mohos y Levaduras

3.3.2. Las placas se preparan colocando la cantidad establecida de
muestra si es líquida o de la suspensión inicial en el caso de otros
productos y agregando, por vertido, el medio de cultivo selectivo
especificado.
Otras placas se preparan, bajo las mismas condiciones, utilizando las
diluciones decimales de la muestra o las diluciones decimales de la
3.3.3. Las placas se incuban aeróbicamente a 25ºC durante 5 días.
3.3.4. El número de unidades formadoras de colonias (UFC) de
mohos y/o levaduras por gramo ó mililitro del producto se calcula a
partir del número de colonias obtenidas en las placas elegidas
basándonos en la dilución, a fin de obtener un resultado significativo.
3.4. Muestreo
La muestra representativa debe ser enviada al Laboratorio. No debe

sufrir daños ni cambios durante su transporte y/o almacenamiento.

metodología. El método de muestreo recomendado está desarrollado
en la ISO 707.
En quesos madurados utilizando levaduras o recubrimientos de

mohos es deseable excluir éste recubrimiento para realizar la toma
de muestra para el análisis. En esos casos, el recubrimiento puede
removerse utilizando un bisturí ó un cuchillo estériles antes de
comenzar el muestreo.
3.5. Procedimiento
específicas para el alimento en cuestión (ver anexo 4. Referencia 3).
3.5.1.1 Productos congelados

Los productos almacenados congelados deberían descongelarse hasta
alcanzar una consistencia que permita su procesamiento, por ejemplo
manteniéndolos a una temperatura de 18ºC a 23ºC (temperatura de
Laboratorio) durante un tiempo máximo de 3 h. o a una temperatura
de 3ºC ± 2ºC durante un tiempo máximo de 24 h. Las muestras
95
Mohos y Levaduras
deberían procesarse lo más rápido posible una vez descongeladas.

Véase la norma ISO 6887-1.
Si el producto se mantiene aún congelado mientras se procesa, puede

utilizarse el diluyente (ver anexo 2) a la temperatura del Laboratorio
para facilitar su descongelación.
3.5.1.2. Productos secos y duros

Para mezclar productos duros en el Stomacher (3.2.24), la muestra y
el diluyente se colocan en dos o más bolsas estériles para evitar que
se perforen las bolsas y que se pierda parte de la muestra.
Estos productos no se deben homogeneizar en el Stomacher durante
más de 2.5 minutos cada vez. En el caso de productos secos y duros
ó heterogéneos, puede ser necesario triturar la muestra (sin
diluyente). En éste caso, para evitar un aumento excesivo de la
temperatura, no se deben triturar durante más de 1 minuto.
3.5.1.3. Productos líquidos y no viscosos

La muestra para análisis se agita manualmente (ver procedimiento
específico para leche y productos lácteos líquidos) ó mecánicamente
para asegurar una distribución uniforme de los microorganismos en
toda la muestra antes del análisis.
3.5.1.4. Productos heterogéneos

En los productos heterogéneos (que contienen porciones de distintos
alimentos) debería recogerse alícuotas de cada componente,
representativas de sus proporciones en el producto original.
También se puede homogeneizar toda la muestra de laboratorio para
conseguir que la porción para análisis sea más homogénea.
Puede resultar necesario triturar la muestra. En este caso, para evitar

un aumento excesivo de temperatura, no se debe triturar durante
más de 1 minuto.
3.5.2. Suspensión inicial

incertidumbre de medición de ±5 % una cantidad de masa x g o
alimento.
96
Mohos y Levaduras

3.5.2.1. Procedimientos generales
3.5.2.1.1. Caso general para los productos ácidos

Cuando se utiliza una solución en suspensión de productos ácidos, se
verifica que el pH se revierta a un valor neutro. El uso de un
diluyente con indicador de pH añadido (3.2.12.) puede evitar la
necesidad de utilizar y esterilizar sondas de pH; se añade hidróxido
de sodio (NaOH) hasta que el indicador comience a cambiar de color.
En los diluyentes tamponados suele ser necesaria la adición del NaOH
para aumentar la capacidad tamponante del diluyente. La
concentración del NaOH añadido depende de la acidez del producto.
La concentración más adecuada (por ej. 0.1 mol/l ó 1 mol/l) es la
concentración que todavía mantiene una proporción cercana a 1 a 9
con el diluyente.
3.5.2.1.2. Alimentos de alto contenido en materia grasa

(contenido en materia grasa > 20%)
El uso de un diluyente con una cantidad añadida de monooleato de
sorbitán (polisorbato 80) (3.2.10.) entre 1 g/l y 10g/l, en relación
aproximada a los niveles de materia grasa (por ej. se añaden 4 g/l
para un contenido de materia grasa del 40%) puede mejorar la
emulsificación durante la suspensión.
3.5.2.2 Procedimientos específicos
3.5.2.2.1. Leche y productos lácteos líquidos

La muestra para análisis se mezcla exhaustivamente para que los
microorganismos se distribuyan lo más homogéneamente posible
invirtiendo el recipiente de la muestra 25 veces. Al invertirlo evitar la
formación de espuma o bien esperar a que desaparezca la espuma
formada.
El tiempo transcurrido entre la mezcla y la toma de la porción para
análisis no debe ser mayor a 3 minutos.
Se retira como mínimo 1 ml de la muestra para análisis con una
pipeta estéril y se añade un volumen 9 veces superior del diluyente
de uso general (ver anexo 2) Se agita esta solución inicial para
obtener una dilución del orden de 10 -1.
Se preparan diluciones sucesivas conforme al punto 3.5.3.
3.5.2.2.2. Leche en polvo, suero dulce deshidratado, suero de

leche deshidratado y lactosa
97
Mohos y Levaduras
Se mezcla exhaustivamente el contenido del recipiente cerrado por

agitación repetida e inversión.
Se pesan 10 g de la muestra para análisis y se introducen en la
botella que contiene el diluyente necesario.
Si la muestra para análisis se presenta en un recipiente original sin
abrir y éste está demasiado lleno como para permitir una agitación
suficiente, se transfiere a un recipiente de mayor tamaño y se
mezcla. Se abre el recipiente, se retira la porción para análisis
necesaria con una espátula y se procede según se indica a
continuación. El recipiente se vuelve a cerrar inmediatamente.
Se pesan 10 g de la muestra para análisis y se introducen en un
recipiente de vidrio estéril (por ejemplo un vaso de precipitados) y se
añade el material en polvo a la botella de dilución que contiene
diluyente de uso general (ver anexo 2). Para el suero de leche agrio
se utiliza solución de fosfato ácido dipotásico (3.2.7.) a un pH de 8.4
± 0.2 o, en caso necesario, para leche en polvo obtenida mediante
rodillos (Hatmaker), se utiliza solución de citrato sódico (3.2.6.) o
solución de fosfato ácido dipotásico (3.2.7.) a un pH de 7.5 ± 0.2.
NOTA: Para conseguir una mejor reconstitución, y en particular para

leche en polvo obtenida mediante rodillos (Hatmaker), pueden
resultar convenientes las cuentas de vidrio (3.2.27.). Si se utilizan,
deberían añadirse a la botella antes de su esterilización.
Para disolver la muestra para análisis, se remueve suavemente para

humedecer el producto en polvo y a continuación se agita la botella
durante unos 7 segundos. Puede utilizarse un Stomacher (3.2.24.)
como alternativa a la agitación.
Se deja en reposo durante 5 minutos, agitando ocasionalmente.
El diluyente puede precalentarse a 45ºC si no puede conseguirse una
suspensión homogénea incluso después de mezclar. Dicho
procedimiento adicional se menciona en el informe del análisis.
3.5.2.2.3. Queso y productos elaborados a base de queso

Se pesan 10 g de la muestra para análisis en un recipiente o bolsa
estéril y se procesa en un equipo de mezclado tipo Stomacher
(3.2.24.).
Otra alternativa es pesar 10 g de la muestra para análisis en un
recipiente estéril y añadir 90 ml del diluyente de uso general (Anexo
2 punto 1) ó como diluyente para el queso, 90 ml de solución de
citrato sódico (3.2.6.) ó de solución de fosfato ácido dipotásico
(3.2.7.) a un pH de 7.5 ± 0.2.
Se mezcla hasta que todo el queso quede bien homogeneizado. Se
deja en reposo hasta que desaparezca toda la espuma.
El diluyente puede precalentarse a 45ºC si no se puede obtener una
suspensión homogénea incluso después de mezclar.
98
Mohos y Levaduras
Dicho procedimiento adicional se menciona en el informe del análisis.
3.5.2.2.4. Caseína ácida, caseína láctica, caseína al cuajo

mediante hidrólisis enzimática (caseína rennet) y caseinatos
3.5.2.2.4.1. Caso general

agitación repetida e inversión.
Se pesan 10 g de la muestra para análisis y se introducen en la bolsa
de plástico estéril de un Stomacher (3.2.24.) Se añaden 90 ml del
diluyente adecuado a temperatura ambiente, de la siguiente manera:
a) para caseína ácida y láctica, se diluyen con solución de fosfato

ácido dipotásico con agente antiespumante (3.2.8.) a un pH de
8.4 ± 0.2 unidades;
b) para caseinato, se diluye con solución de citrato sódico (3.2.6)
o con solución de fosfato ácido dipotásico (3.2.7.) a un pH de
7.5 ± 0.2 o solución salina peptonada (3.2.2.);
c) para caseína al cuajo mediante hidrólisis enzimática (caseína
rennet), se diluye con solución de fosfato ácido dipotásico con
agente antiespumante (3.2.8.) a un pH de 7.5 ± 0.2 unidades.
Se mezcla bien manualmente y se deja en reposo a temperatura

ambiente durante 15 minutos. En caso necesario se mezcla durante 2
minutos en el Stomacher (3.2.24.) utilizando dos bolsas estériles
para los productos granulados. Se deja en reposo durante 5 minutos.
3.5.2.2.4.2. Caso especial: caseína al cuajo mediante hidrólisis

enzimática (caseína rennet)
La caseína al cuajo mediante hidrólisis enzimática (caseína rennet)
puede resultar difícil de disolver. Puede utilizarse un protocolo
opcional al descripto en el apartado 3.5.2.2.4.1.
El uso de solución de fosfato ácido dipotásico con agente
antiespumante (3.2.8.) como diluyente para las caseínas rennet
puede no ser eficaz en la disolución de los granos. Dichos granos de
caseína dificultan el recuento de microorganismos a 30ºC. Por
consiguiente, se recomienda el siguiente procedimiento opcional.
En caso necesario, se tritura la caseína seca antes de recoger la
porción para análisis. Se transfieren aproximadamente 20 g de la
porción para análisis a un recipiente adecuado. Se trituran utilizando
un aparato con cuchillas capaz de girar a una frecuencia de
aproximadamente 20.000 rpm, equipado con un sistema que
prevenga que la muestra se caliente durante la trituración.
99
Mohos y Levaduras
Se pesan 5 g de la muestra para análisis preparada de ésta forma en

una botella estéril de 250 ml. Se añaden cuentas de vidrio (3.2.27.)
para mezclar y 95 ml de la solución de tripolifosfato sódico (3.2.9.)
precalentada a 37ºC. Se mezcla dejando la botella en el sistema de
mezclado durante 15 min. A continuación se introduce en el baño de
agua (3.2.19.) calentado a 37ºC durante 15 min mezclando de vez en
cuando.
3.5.2.2.5. Manteca
Véase la norma ISO 707/IDF 50 si se considera necesario excluir de
la investigación la superficie de una muestra de manteca.
Se pesan 10 g de la muestra para análisis y se llevan al recipiente

para muestras. El recipiente se introduce en el baño de agua
(3.2.19.) calentado a 45ºC. Se mantiene dentro del baño de agua
hasta que toda la porción para análisis se funda. Se añaden 90 ml del
diluyente de uso general (anexo 2 punto 1) calentado a 45ºC y se
mezcla. Esta operación se realiza más fácilmente en un mezclador
tipo Stomacher (3.2.24.). Como opción puede utilizarse solamente la
fase acuosa para la dilución de la siguiente manera.
Se recoge una porción para análisis de 50 g que contenga una
proporción volumen: masa de agua del W%.
Se añaden [50 – (50 x W/100)] ml del diluyente de uso general
(anexo 2 punto 1) precalentado en el baño de agua (3.2.19.) a 45ºC.
En éstas condiciones, 1 ml de fase acuosa corresponde a 1g de
manteca.
Ejemplo: Para 50 g de manteca con una proporción volumen: masa

de agua de aproximadamente el 16%, la fase acuosa representa 8 ml
de líquido. Se añaden [50 – (50 x 16/100)] = 42 ml del diluyente de
uso general precalentado en el baño de agua a 45ºC.
El recipiente se introduce en el baño de agua calentado a 45ºC hasta

que se funda la manteca. Se retira del baño de agua, se agita bien y
se deja que las fases se separen durante un tiempo no superior a 15
min. En caso necesario, la fase de materia grasa se retira con una
espátula o una varilla de vidrio (3.2.28.).
En caso necesario para separar las fases, se transfiere la porción para

análisis fundida a un tubo de centrífuga estéril (o bien se funde la
porción para análisis directamente en el tubo) y se centrifuga a una
frecuencia de rotación que permita la separación de fases. Puede ser
necesario retirar asépticamente la fase de materia grasa (superior)
utilizando un tubo estéril conectado a una bomba de vacío. Se
pipetea de la fase inferior.
100
Mohos y Levaduras
3.5.2.2.6. Helados
erlenmeyer o en una bolsa de plástico estéril para Stomacher.
Se añaden 90 ml de diluyente de uso general (anexo 2 punto 1) a
temperatura ambiente y se mezcla. El producto se funde a la vez que
se mezcla.
3.5.2.2.7. Crema de leche y postres en base a leche (pH > 5)

recipiente de vidrio estéril adecuado con cuentas de vidrio estériles
(3.2.27.). Se añaden 90ml del diluyente de uso general (anexo 2
punto 1) a temperatura ambiente y se agita para disgregar. Como
opción puede utilizarse un Stomacher (3.2.24).
3.5.2.2.8. Leche fermentada y Crema ácida (pH < 5)

recipiente de vidrio estéril adecuado con cuentas de vidrio estériles
(3.2.27.). Se añaden como diluyente 90 ml de agua de peptona
bufferada (3.2.1) o de solución de fosfato ácido dipotásico (3.2.7.) a
un pH de 7.5 ± 0.2 a temperatura ambiente y se agita de forma
manual. Como alternativa puede utilizarse un Stomacher (3.2.24.).
3.5.2.2.9. Polvo para preparar alimentos infantiles a base de

leche
agitación repetida e inversión. Si la muestra para análisis se
encuentra en su recipiente original sin abrir y éste está demasiado
lleno como para permitir que se mezcle lo suficiente se transfiere a
un recipiente estéril de mayor tamaño y se mezcla. Se abre el
recipiente, se retira la porción para análisis necesaria con una
espátula y se continúa según se indica a continuación. El recipiente se
vuelve a cerrar inmediatamente.
recipiente de vidrio estéril adecuado. Se añade al material en polvo el
diluyente de uso general (anexo 2 punto 1) o, para muestras con un
alto contenido en almidón, un diluyente para casos especiales (anexo
2 punto 2).
Como opción se pesan 10 g de la muestra para análisis directamente
en el recipiente con el diluyente necesario.
101
Mohos y Levaduras
El diluyente puede precalentarse a 45ºC si no puede conseguirse una

suspensión homogénea incluso después de mezclarlo con la muestra.
Dicho procedimiento adicional se menciona en el informe.
Para conseguir una mejor reconstitución, podría resultar conveniente

el uso de cuentas de vidrio (3.2.27.). Si se utilizan, se añaden al
recipiente de vidrio adecuado antes de su esterilización.
Para disolver la muestra, se remueve suavemente para humedecer el
producto en polvo y a continuación se agita el recipiente de forma
manual durante unos 7 segundos o en forma opcional puede
utilizarse un Stomacher (3.2.24.). Se deja en reposo durante 5 min,
agitando de vez en cuando.
Las muestras con un alto contenido de almidón pueden ocasionar

problemas debidos a la elevada viscosidad de la solución base.
Se utiliza el diluyente de uso general con solución de alfa amilasa
(3.2.11.) para reducir la viscosidad de la solución inicial o bien se
utiliza una cantidad doble de diluyente. Esta dilución adicional se
toma en consideración en los exámenes posteriores.
3.5.3. Diluciones decimales sucesivas (ISO 6887-1:1999)

± 5%) de la suspensión inicial en un tubo con 9 ml del diluyente
estéril a la temperatura apropiada.
Cuando se transfieren volúmenes de una dilución inicial viscosa,

como las de la caseína ácida o de rennet (3.5.2.2.4.), la pipeta se
enjuaga con diluyente aspirando varias veces, utilizando el diluyente
del tubo empleado para preparar la dilución decimal.
IMPORTANTE: Si el proceso mencionado se realiza sin enjuagar la

pipeta cuando se transfiere una dilución inicial viscosa, se transfiere
un volumen incorrecto de dilución inicial.
102
Mohos y Levaduras
3.5.4. Duración del procedimiento

es de 30 minutos.
NOTA: si la temperatura ambiente del laboratorio es muy alta los dos

lapsos de tiempo deben ser reducidos.
3.5.5.1. Tomar dos placas de Petri estériles (3.2.25.). Transferir a

cada placa por medio de una pipeta estéril (3.2.21.), 1 ml de la
muestra, si es líquida, o 1 ml de la suspensión inicial si se trata de
otros productos.
3.5.5.2. Tomar otras dos placas de Petri estériles. Transferir a cada
placa utilizando otra pipeta estéril, 1 ml de la dilución 10-1 (en el caso
de muestras líquidas) o 1ml de la dilución 10-2 (en el caso de otros
productos.
3.5.5.3. Si es necesario, repetir la operación utilizando diluciones
decimales mayores.
3.5.5.4. Vierta aproximadamente 15 ml del medio que contiene
clorhidrato de Oxitetraciclina (3.2.13.) o del medio que contiene
Cloranfenicol (3.2.14.), previamente calentado y mantenido a 45ºC
en un baño de agua (3.2.19.), dentro de cada placa de Petri. Evitar
verter el medio directamente sobre el inóculo.
3.5.5.5. Cuidadosamente, mezclar el inóculo con el medio por
rotación de las placas de Petri y permitir que la mezcla se solidifique
dejando la placa de Petri reposar, hasta que se enfríe, sobre una
superficie horizontal fría.
3.5.5.6. El tiempo transcurrido entre la preparación de la primera
dilución y la mezcla del inóculo con el medio no debe exceder los 15
minutos.
3.5.5.7. Preparar un número suficiente de placas de control para
chequear la esterilidad.
3.5.5.8. Después de invertir las placas sembradas, colocarlas
(manteniéndola en una posición horizontal) en la estufa (3.2.17.) a
25ºC por 5 días.
Para prevenir la propagación debe tomarse algunas precauciones

- La adición de una sobrecapa de medio de cultivo luego de la
solidificación del agar sembrado o
- Agregar un papel de filtro con una gota de glicerol en la tapa de
la placa.
103
Mohos y Levaduras
3.5.5.9. No apilar más de seis placas de Petri. Separar las pilas de

placas unas de otras y de las paredes y el techo de la estufa.
3.5.6.1. Enumerar las colonias de cada placa. Evitar incluir en el

recuento las colonias bacterianas que pudieran haber crecido de
manera ocasional.
Si es necesario distinguir las colonias de mohos de las colonias de
levaduras, sobre la base de sus características morfológicas.
3.5.6.2. Seleccionar sólo las placas que contiene por lo menos 10 y
no más de 150 colonias. Si parte de las placas está cubierta por
mohos, o si es difícil el recuento de colonias aisladas, contar las
colonias de las placas de la siguiente dilución, aunque su número sea
menor que 10. En éste último caso proceda como en 3.5.8.2.
La identidad de las colonias dudosas ó muy pequeñas se investigará

por microscopia.
Si fuera necesario, confirmar por microscopia como mínimo √n,

siendo n el número de colonias contadas.
3.5.8. Expresión de los resultados (ISO 7218:2007- ver anexo 4

referencia 4)
3.5.8.1. Seleccionar las placas que contiene por lo menos 10 y no

más de 150 colonias.
Calcular el número de UFC de mohos y/o levaduras, N, por gr ó por

ml de producto, utilizando la siguiente fórmula:
donde:
∑c: es la sumatoria de las colonias contadas en las placas

seleccionadas;
n1: es el número de placas seleccionadas de la primera dilución que

tienen entre 10 y 150 colonias;
n2: es el número de placas seleccionadas de la segunda dilución que

tienen entre 10 y 150 colonias;
d: es el factor de dilución correspondiente a la primera dilución.
104
Mohos y Levaduras
En el caso de que haya más de dos diluciones cuyo recuento se

encuentre entre 10 y 150 colonias la fórmula deberá ser modificada
teniendo en cuenta la dilución adicional. Para tres diluciones la
fórmula será la siguiente:
donde:
n3: es el número de placas seleccionadas de la tercera dilución que

tienen entre 10 y 150 colonias.
El resultado calculado se redondea a dos cifras significativas.
Cuando se realiza la operación, si la tercera cifra es inferior a 5, no se

modifica la cifra anterior; si la tercera cifra es igual ó superior a 5, la
cifra anterior se incrementa en una unidad.
El resultado se expresa como UFC de mohos y/o levaduras por ml ó

por gr del producto, tomando como resultado un número entre 1.0 y
9.9 multiplicado por la potencia de 10 adecuada.
Ejemplo:
El recuento en UFC de mohos y levaduras ha proporcionado los
siguientes resultados (se incubaron dos placas de Petri por dilución):
- Para la primera dilución seleccionada (10-2), 83 y 97 colonias;

- Para la segunda dilución seleccionada (10-3), 33 y 28 colonias:
Redondeando el resultado como se especifica en 3.5.5.1.
En el ejemplo dado se expresa de la siguiente manera:

11.000 ó 1.1 x 104 UFC de mohos y/o levaduras por gr ó ml del
producto.
3.5.8.2. Si las dos placas correspondientes a la muestra analizada

(producto líquido) ó a la suspensión inicial (otros productos)
contienen menos de 10 colonias, se informa el resultado de la
siguiente manera:
105
Mohos y Levaduras
- menor a 10 UFC de mohos y/o levaduras por ml. (productos

líquidos);
- menor a 10 x 1/d UFC de mohos y/o levaduras por gr (otros
productos), siendo d el factor de dilución de la suspensión inicial.
3.5.8.3. Si sólo hay placas conteniendo más de 150 colonias se

realiza un recuento estimativo de las placas que contienen alrededor
de 150 colonias y se multiplica el número estimado por la recíproca
del valor que corresponde a la dilución más alta. Se expresa el
resultado como “número estimado de UFC de mohos y/o levaduras
por gr ó por ml del producto”.
106
Mohos y Levaduras
4. ANEXOS

de mohos y/o levaduras

de diluyente (dilución 1/10) y diluciones sucesivas.
Inoculación e incubación: transferir por duplicado 1

ml. de las diluciones preparadas en placas con OGA o
YGC. Incubar a 25°C ± 1ºC, durante 5 días.
Recuento y selección
de las colonias características:
seleccionar las placas con un máximo de 150 colonias
y hasta 2 diluciones sucesivas. Realizar el recuento.
107
Mohos y Levaduras
1. Diluyentes de uso general
1.1. Agua peptona bufferada (BPW)


1.2. Solución salina peptonada (SFP)


1.3. Solución de Ringer de potencia 1/4x

Cloruro de potasio (KCl) 0.105 g
Cloruro de calcio (CaCl2) anhidro 0.06 g(a)
Carbonato ácido de sodio (NaHCO3) 0.05 g
(a)Como alternativa, se utilizan 0.12g de CaCl 2.6H2O

1.4. Solución de peptona

108
Mohos y Levaduras
Disolver la peptona en agua, si es necesario calentar. Ajustar el pH si

es necesario para obtener un valor después de la esterilización de 7.0
± 0.2 a 25°C. Distribuir en frascos o tubos de acuerdo a las
1.5. Solución tamponada de fosfato

Disolver la sal en 500 ml de agua destilada. Luego diluir hasta 1000

ml con el resto del agua. La solución concentrada se almacena
refrigerada. Ajustar el pH si es necesario para obtener un valor
después de la esterilización de 7.0 ± 0.2 a 25°C Para utilizar como
diluyente se añade 1ml de la solución concentrada a 1000ml de agua.
Distribuir en frascos o tubos de acuerdo a las necesidades analíticas.
2. Diluyentes de uso especial
Estos diluyentes deben utilizarse solamente para la preparación de las

suspensiones iniciales
2.1. Solución de citrato sódico
Citrato trisódico dihidratado (Na3C6H5O7.2H2O) 20.0 g

Disolver la sal en el agua, calentando en caso necesario a una

temperatura de 45 a 50ºC. Ajustar el pH si es necesario para obtener
un valor después de la esterilización de 7.5 ± 0.2 a 25°C Esta
solución se utiliza para la leche en polvo obtenida mediante rodillos,
el queso y para algunos caseinatos.
2.2. Solución de fosfato ácido de potasio
Fosfato dipotásico monoácido (K2HPO4) 20.0 g


temperatura de 45 a 50ºC.
Para el suero agrio en polvo, se ajusta el pH de forma que para la
dilución inicial tras la esterilización, sea de 8.4 ± 0.2 a 25ºC.
Para el queso, la leche en polvo obtenida mediante rodillos, la leche
fermentada, los caseinatos y la crema agria, se ajusta el pH de forma
que tras la esterilización sea de 7.5 ± 0.2 a 25ºC.
109
Mohos y Levaduras
Esta solución se utiliza para el queso, la leche en polvo obtenida

mediante rodillos, la leche fermentada, algunos caseinatos, el suero
agrio en polvo y la crema agria.
2.3. Solución de fosfato ácido dipotásico con agente

antiespumante
2.3.1. Solución de fosfato dipotásico monoácido
Fosfato dipotásico monoácido (K2HPO4) 20.0 g


temperatura de 45 a 50ºC.
2.3.2. Solución concentrada de antiespumante
Polietilénglicol 2000 1g
Disolver el polietilénglicol en el agua y mezclar.
Añadir 1 ml de la solución concentrada del antiespumante (2.3.2.) a

1L de la solución de K2HPO4 (2.3.1.).
Ajustar el pH de forma que la dilución inicial tanto para la caseína
láctica como ácida, tras la esterilización, sea de 8.4 ± 0.2 a 25ºC, y
para la caseína al cuajo mediante hidrólisis enzimática (caseína
rennet), tras la esterilización, sea de 7.5 ± 0.2 a 25ºC.
Esta solución se utiliza para caseína ácida, caseína láctica y caseínas
al cuajo mediante hidrólisis enzimática (caseínas rennet).
2.4. Solución de tripolifosfato sódico
Tripolifosfato sódico (Na5O10P3) 20.0 g

Disolver la sal en el agua, calentando en caso necesario. Distribuir en

frascos o tubos de acuerdo a las necesidades analíticas. Esterilizar a
121°C durante 15 minutos. Almacenar a una temperatura de 5ºC ±
3ºC durante un máximo de un mes.
Esta solución se utiliza como diluyente alternativo para caseínas al
cuajo mediante hidrólisis enzimática (caseínas rennet) difíciles de
disolver.
2.5. Diluyente de uso general con solución de alfa amilasa
110
Mohos y Levaduras
Añadir 12.5 mg de alfa amilasa, de una actividad específica de

aproximadamente 400 unidades (1) por miligramo sobre 225 ml del
diluyente de uso general. Este diluyente se utiliza para una porción
de muestra para análisis de 25 g. Se utilizan cantidades
proporcionales para la preparación de porciones de ensayo diferentes
(por ejemplo, para una porción para análisis de 10 g se añaden 5 mg
de alfa amilasa sobre 90ml de diluyente de uso general).
Esta solución se utiliza para alimentos que contienen almidón.
(1) Esta unidad (frecuentemente denominada Unidad Internacional o

Unidad Estándar) se define como la cantidad de enzima que cataliza
la transformación de 1 µmol de sustrato por minuto en condiciones
normales.
2.6. Agua de peptona tamponada con púrpura de

bromocresol
Agua de peptona tamponada (1.1) 1000 ml

Púrpura de bromocresol (solución en alcohol al 4%, por ej.
0.1ml
solución etanólica)
Añadir la solución de púrpura de bromocresol al agua peptonada.

Esta solución se utiliza con ciertos productos ácidos de forma que el
ajuste de pH se pueda realizar sin el uso de una sonda de pH estéril
(3.5.2.1.1.).
El púrpura de bromocresol es amarillo a pH ácido, virando a púrpura
a un pH superior a 6.8 .
3. Medios de cultivo
3.1. Extracto de levadura glucosa oxytetraciclina (OGA)
3.1.1. Medio base
Extracto de levadura en polvo 5.0 g

Agar 10 - 15ga
a Dependiendo de la firmeza del agar

pH si es necesario para obtener un valor después de la esterilización
de 6.6 a 25°C. Distribuir en frascos o tubos de acuerdo a las
3.1.2. Solución de oxitetraciclina
111
Mohos y Levaduras
Clorhidrato de oxytetraciclina (C22H30O11.HCl) 50.0 mg

Disolver el clorhidrato de oxytetraciclina en agua. Preparar la solución

en el momento de su uso. Esterilizar la solución por filtración.
3.1.3. Medio completo
Solución de clorhidrato de oxytetraciclina 10ml

Medio base 90 ml
Calentar el medio base esterilizado a 45ºC. Llevar la solución de

oxitetraciclina a 45ºC y añadir asépticamente 10 ml de ésta solución
a 90 ml del medio base.
3.2. Extracto de levadura glucosa cloranfenicol (YGC)
Extracto de levadura en polvo 5.0 g

Cloranfenicol (C11H12Cl2N2O5) 0.1 ga
Agar 10 - 15gb
a Para obtener una concentración final de 100 µg/ml en el medio
b Dependiendo de la firmeza del agar

pH si es necesario para obtener un valor después de la esterilización de
6.6 a 25°C. Distribuir en frascos o tubos de acuerdo a las necesidades
112
Mohos y Levaduras
ANEXO 3 : FOTOS
Medio YGC
hongos provenientes de muestras de helado
113
Mohos y Levaduras
ANEXO 4 : REFERENCIAS
(1) International Standard. ISO 6611: 2012. Milk and milk

products. Enumeration of colony – forming units of yeasts and/or
molds – Colony – count technique at 25°C. 2004.


Specific rules for the preparation of milk and milk products. 2010.
Esta norma anula y sustituye a la Norma ISO 8261:2002.






114
Mohos y Levaduras
lSO/TS 11133-2:2003, Microbiology of food and animal feeding

Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media.
115
Mohos y Levaduras
Recuento de mohos y levaduras

muestras de alimentos
Procedimiento según APHA 2001. Capítulo 20.
1. OBJETIVO

realizar el recuento de mohos y levaduras por la técnica de recuento
de colonias en placa en muestras de alimentos.
2. ALCANCE
Este procedimiento se aplica para realizar el recuento de mohos y

levaduras por la técnica de recuento de colonias en placa en muestras
de alimentos.
3. DESARROLLO
3.1. Definiciones
Para el propósito de este documento, se define a mohos y levaduras

como microorganismos que forman colonias en medios selectivos
bajo las condiciones especificadas en este procedimiento.

3.2.2. Autoclave
3.2.3. Balanza
3.2.4. Contador de colonias
3.2.5. Frascos de 150 ml de capacidad
3.2.6. Estufa de incubación
3.2.7. Agitador mecánico o vortex
3.2.8. Placas de Petri de 100 x 15 mm
3.2.9. Pipetas
3.2.10. Tips para pipetas
3.2.11. Heladera
3.2.12. Termómetros
3.2.13. Baño de agua
3.2.14. Espátulas de vidrio
3.2.15. Buffer fosfato de Butterfield
116
Mohos y Levaduras
3.2.16. Agua peptona al 0.1 %.

3.2.17. Agar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC) para
alimentos con actividad de agua < 0,95
3.2.18. Agar Dicloran 18 % Glicerol (DG 18) para alimentos con
actividad de agua ≤ 0.95
3.2.19. Agar plate count (PCA)
i. Preparación del homogenato, suspensión inicial y diluciones

decimales sucesivas
ii. Inoculación e incubación
3.3.1. Recuento y selección
3.4. Muestreo

metodología.
3.5. Procedimiento
3.5.1. Preparación de la muestra, suspención inicial y

diluciones
3.5.1.1. Preparación de la muestra

Las muestras líquidas o semilíquidas en recipientes que tienen un
espacio de aire pueden ser mezcladas invirtiendo rápidamente el
envase de la muestra 25 veces. Los envases de las muestras que
están 2/3 a 3/4 llenos deberán ser agitados 25 veces en 7 segundos
en un radio de 30 cm. El intervalo entre el agitado y la remoción de la
porción para el ensayo no deberá exceder los 3 minutos. Para
asegurarse una muestra homogénea cuando no hay espacio de aire
presente, abrir asépticamente el envase y verter el producto del
envase lleno a otro estéril ida y vuelta tres veces.
Las muestras en polvo deben ser asépticamente revueltas con una
cuchara estéril o espátula u otro utensilio para asegurar una muestra
homogénea.
3.5.1.2. Suspención inicial

3.5.1.2.1. Muestras líquidas: para productos líquidos no viscosos (por
ejemplo de viscocidad no mayor a la de la leche) transferir con una
pipeta estéril 11 ml de la muestra a un frasco con 99 ml del
117
Mohos y Levaduras
diluyente. Si la pipeta se contamina antes de completar la

transferencia, reemplazarla por otra estéril. No introducir la pipeta
más de 2.5 cm debajo de la superficie de la muestra. La pipeta
deberá ser vaciada en el diluyente permitiendo que la columna
escurra desde la marca de la graduación al punto inferior de la pipeta
dentro de los 2 a 4 segundos, entonces tocar el borde inferior de la
pipeta contra el cuello del recipiente del diluyente. No soplar la última
gota o enjuagar la pipeta en el líquido de la dilución.
Para productos con una viscosidad similar a la de la leche, la última
gota deberá caer de la pipeta.
Para productos líquidos viscosos pesar 11 g de la muestra en 99 g del
diluyente. Esto corresponde a una dilución 1:10.
3.5.1.2.2. Muestras sólidas: Pesar 11 g de la muestra en un
recipiente estéril y agregar 99 ml del diluyente.
Se puede sembrar una cantidad mayor de la muestra y agregar una
cantidad necesaria del diluyente para llegar a una dilución 1/10 (ej.50
g de muestra en 450 ml del diluyente)
3.5.1.2.3. Pueden usarse una variedad de diluyentes dependiendo de
la naturaleza del producto. Los más comunmente usados son el buffer
fosfato de Butterfield y peptona al 0.1 %.
Agitar por 2 minutos a baja velocidad (aproximadamente 8000 rpm)
para dispersar el material. El tiempo de agitación puede variar
dependiendo del tipo de alimento. Algunos agitadores pueden operar
a velocidades menores a 8000 rpm. Es preferible usar inicialmente
una velocidad mayor por pocos segundos. No se deberá demorar más
de 15 minutos desde el momento en que la muestra es agitada hasta
hacer todas las diluciones en el medio apropiado.

Transferir con una pipeta 1 ml de la suspensión inicial en un tubo con
9 ml del diluyente estéril.
apropiado de microorganismos para realizar el recuento.
3.5.2.1. Agar DRBC
118
Mohos y Levaduras
3.5.2.1.1. Se recomienda agregar al agar DRBC, cloranfenicol 100

µg/ml. El agregado puede hacerse antes de la esterilización en
autoclave.
3.5.2.1.2. Se vierten 15 - 20 ml del medio en placas de Petri de 9 cm
de diámetro y luego de se secan a temperatura ambiente por una
noche (21 - 25°C). Almacenar las placas de DRBC en la oscuridad
para evitar la fotogeneración de inhibidores a partir del colorante rosa
de bengala.
3.5.2.1.3. Inocular 0.1 ml de la dilución decimal apropiada por
duplicado sobre el agar solidificado y distribuir en toda la superficie
usando una espátula de vidrio estéril.
Si el recuento estimado de la muestra es menor a 100 UFC/g o ml,
inocular 1 ml dividiendo el volumen en cuatro placas, tres con 0.3 ml
y una con 0.1 ml.
3.5.2.1.4. Incubar las placas sin invertir por 5 días a 22 - 25°C en
pilas de no más de 3 placas; sin tocar hasta que las colonias puedan
contarse, ya que el movimiento de las placas puede provocar un
crecimiento secundario (debido al desplazamiento de esporas) e
invalidar el resultado final. Contar las placas que contengan entre 15
- 150 colonias. Contar por el lado inferior de la placa luego que el
desarrollo de hongos haya ocurrido.
En la placa seleccionada, contar separadamente las colonias con
aspecto filamentoso, algodonoso o pulverulento lo que es
característico de los mohos y registrar el resultado.
En la misma placa, las colonias remanentes pueden ser levaduras o
bacterias. Seleccionar al menos cinco colonias y verificar la
morfología de las células al microscopio, observando si el cultivo es
de levaduras, bacterias o una mezcla de ambos. Determinar el
número de levaduras.
Para calcular el número total de mohos y levaduras, sumar al número
de colonias de mohos el número confirmado de levaduras y
multiplicar por la inversa de la dilución.
3.5.2.1.5. Informar el recuento como UFC por gramo o ml de
muestra.
3.5.2.2. Agar PCA suplementado con cloranfenicol

El método es igual al descripto en 3.5.2.1. excepto que el agar PCA
es suplementado con 100 µg/ml de cloranfenicol y las placas no
necesitan ser almacenadas en la oscuridad.
3.5.2.3. Agar DG18

Cuando son testeados alimentos con baja actividad acuosa tales
como cereales, harinas, nueces y especias, el agar DG18 es el mejor
porque permite que los hongos xerófilos sean enumerados. El método
es similar al descripto en 3.5.2.1, pero las placas no necesitan ser
almacenadas en la oscuridad.
119
Mohos y Levaduras
4. ANEXOS


2. Agua peptona al 0.1%
Peptona 1.0 g
Disolver los componentes en agua destilada. Ajustar el pH a 7.0 ± 0.1

a 25°C. Distribuir en frascos o tubos de acuerdo a las necesidades
analíticas. Esterilizar a 121°C durante15 minutos.
3. Buffer fosfato de Butterfield
3.1. Solución stock
Potasio dihidrógeno fosfato (KH2PO4) 34 g

Agua destilada csp 1000 ml
Disolver el fosfato monopotásico en 500 ml de agua. Ajustar el pH a

7.2 ± 0.2 con 175 ml con solución de NaOH 1N. Diluir a un litro y
esterilizar 121°C por 15 minutos. Almacenar en heladera.
3.2. Buffer fosfato de Butterfield
Solución stock 1,25 ml

Agua destilada c.s.p. 1000 ml
Tomar 1.25 ml de la solución stock preparada y llevar a un litro de

volumen con agua. Dispensar en botellas y esterilizar por 15 minutos
a 121°C.
120
Mohos y Levaduras
4. Agar dicloran – rosa de bengala cloranfenicol (DRBC)

(Dichloran – rose bengal chloramphenicol agar)

D-glucosa (C6H12O6) 10.0 g
Sulfato de magnesio (MgSO4.H2O) 0.5 g
Dicloran (2,6-dicloro-4-nitroanilina)
0.002 g
(1 ml de una solución al 2 % p/v en etanol)
Rosa de bengala
0.025 g
(0.5 ml de una solución al 5 % p/v en agua)
Agar 15 g
Cloranfenicol 0.1 g
Dispensar los ingredientes en agua y hervir hasta disolver el agar.

Esterilizar a 121°C por 15 minutos.
pH final: 5.6 ± 0.2
Almacenar el medio preparado en la oscuridad para evitar la
descomposición del rosa de bengala. Las soluciones de rosa de
bengala y dicloran no necesitan esterilización y son estables por
largos períodos.
Precaución, el cloranfenicol es tóxico; el contacto con la piel deberá
evitarse.
Preparar las placas con 15 ml de agar, dejar solidificar, utilizar
inmediatamente o conservar en la oscuridad
5. Agar dicloran glicerol 18 % (DG18)

D-gGlucosa (C6H12O6) 10.0 g
Sulfato de magnesio (MgSO4.H2O) 0.5 g
Dicloran (2,6-dicloro-4-nitroanilina)
0.002 g
(1 ml de una solución al 2 % p/v en etanol)
Glicerol anhidro 220 g
Agar 20 g
Cloranfenicol 0.1 g
Suspender los ingredientes excepto el glicerol en 800 ml de agua

grado reactivo y calentar hasta disolver el agar antes de añadir el
121
Mohos y Levaduras
agua para llegar a un litro. Añadir el glicerol y esterilizar a 121°C por

15 minutos.
pH final: 5.6 ± 0.2
Preparar las placas con 15 ml de agar, dejar solidificar, utilizar
inmediatamente o conservar en la oscuridad.
6. Agar Plate Count (PCA) con cloranfenicol
Triptona 5g
Dextrosa 1g
Agar 15 g
Cloranfenicol 0.1 g
Suspender los ingredientes en agua, calentar hasta ebullición para

disolver el agar y esterilizar a 121°C por 15 minutos.
122
Mohos y Levaduras

de mohos y levaduras
Homogeneización: 11 g de muestra + 99 ml del

diluyente (dilución 1/10)
Preparación de diluciones decimales: transferir 1

ml de la dilución 1/10 a 9 ml del diluyente (dilución
1/100) y así sucesivamente
Inoculación e incubación: transferir por duplicado

0,1 ml de las diluciones preparadas en placas de Petri
con DRBC o DG 18, Incubar a 22 - 25°C, 5 días
Recuento y selección de las colonias

características: seleccionar en las placas las colonias
típicas de mohos y contar. Para el recuento de
levaduras, seleccionar 5 colonias presuntivas.
Confirmación
Confirmar por observación microscópica las colonias
presuntivas de levaduras. En base al % de colonias
confirmadas estimar el recuento de levaduras
Sumar el número de colonias de mohos y el de
levaduras para informar el recuento en UFC/g o ml
123
Mohos y Levaduras
ANEXO 3: FOTOS
1. Agar PCA con cloranfenicol
1.1. Las levaduras en el interior del medio desarrollan como colonias

redondas y lenticulares
1.2. Los mohos desarrollan en la superficie del medio como

propágulos o gérmenes planos o afelpados (vellosos) o con
cuerpos de fructificación o esporangios coloreados. Los mohos
en el interior del medio pueden desarrollar como colonias
redondas y lenticulares.
124
Mohos y Levaduras
2. Agar Dicloran – rosa de bengala cloranfenicol (DRBC)
Mucor racemosus
125
Mohos y Levaduras
3. Agar Dicloran glicerol 18% (DG18)
Rhodotorula mucilaginosa
Mucor racemosus
126
Mohos y Levaduras
(1) Compendium of Methods for the Microbiological Examination of

Foods, 4a. edición, 2001, American Public Health Association
(2) Microbiological Examination Methods of Food and Water, A

Laboratory Manual, Neusely da Silva y colaboradores, Institute of
Food Technology - ITAL, Campinas, SP, Brazil.
127
Mohos y Levaduras
NOTAS PERSONALES
128
Anaerobios Sulfito
Reductores
Anaerobio Sulfito Reductores
129
Anaerobios Sulfito
Reductores
130
Anaerobios Sulfito
Reductores
Anaerobios sulfito reductores

1. Generalidades
Los anaerobios sulfito-reductores constituyen un grupo bacteriano

asociado al género Clostridium. Se caracterizan por ser organismos
Gram positivos, anaeróbicos, formadores de esporas que tienen la
propiedad de reducir el ion sulfito a sulfuro en presencia del citrato
férrico u otra sal de metales pesados, formando colonias negras
características. Generalmente, las células vegetativas tienen forma de
bacilos, pudiendo variar desde bacilos cocoides cortos a largos bacilos
filamentosos. Pueden aparecer sueltos, en parejas o en cadenas.
La mayoría son móviles por flagelos peritricos, (con la excepción de

C. perfringens) son de tamaño variable midiendo 0.3 – 2.0 μm de
diámetro y 1.5 - 20 μm de longitud. Las esporas pueden ser central,
subterminal y terminal, resistentes al calor. Son Gram positivos en
cultivos jóvenes pero se decoloran en los envejecidos.
A pesar de ser bacterias anaerobias obligadas, no todos tienen la

misma sensibilidad al oxígeno. Crecen a temperatura de 37ºC, la
actividad acuosa (aw) mínima para su desarrollo es 0.95 (1) y a un pH
entre 7 y 7.4, de modo que son fácilmente inactivadas a pH ácido o
básico, como el ácido estomacal, el de limpiadores y desinfectantes
como el cloro e incluso el pH de ácidos orgánicos.
Los Clostridium no tienen un sistema citocromo completo y por lo

tanto son oxidasa negativa. La mayoría de las cepas son catalasa y
superóxidodismutasa (SOD) negativa, aunque se han reportado
pequeñas cantidades de actividad para algunas especies.
Clostridium spp. tienen diversas vías metabólicas y pueden ser

sacarolíticos, proteolíticos, ambos o ninguno. Los productos finales
del metabolismo fermentativo son mezclas de ácidos y alcoholes, una
característica que se puede utilizar para fines de identificación en el
laboratorio.
Las exotoxinas extracelulares y enzimas producidas por Clostridium

son los principales factores de virulencia. Los Clostridium producen
una mayor diversidad de toxinas que cualquier otro género de
bacterias.
2. Taxonomía
La clasificación taxonómica según el Comité Internacional de

Sistemática de Procariotas (ICSP), ubica a los Clostridium en el
131
Anaerobios Sulfito
Reductores
Phylum Firmicutes, Clase Clostridia, Orden Clostridiales, familia

Clostridiaceae, género Clostridium.(2).
La clasificación de los microorganismos pertenecientes a este género
se ha establecido tradicionalmente de acuerdo con las características
morfológicas, culturales y bioquímicas, asociación con determinadas
enfermedades, patogenicidad, toxigenicidad y propiedades
serológicas.
En los últimos tiempos, ésta clasificación se basa en homologías
existentes en la secuencia del ADN y del ARN ribosómico 16S. La
amplia variedad en el contenido de guanina y citosina del ADN (% de
G+C)de las especies del género Clostridium sugiere que éste podría
dividirse al menos en dos géneros: las especies con un contenido en
G+C del 22 % al 34 % y aquellas que tienen de 40 % a 55 %.
Actualmente, en la Lista de nombres procariotas del Manual de
Bergey (LPSN),”List of Prokaryotic names with Standing in
Nomenclature” año 2014-1 se citan 203 especies y 5 subespecies del
género Clostridium spp de las cuales, cerca de 30 especies son
potencialmente patógenos para el hombre.
3. Reservorio
Las bacterias del género Clostridium son ubicuas en el medio

ambiente, y sus esporas se encuentran habitualmente en el suelo,
polvo, sedimentos, medio acuático, vegetación en descomposición y
en el tracto digestivo de los animales, incluido el hombre. En
consecuencia, pueden transmitirse a una amplia gama de alimentos,
tanto crudos, como parcialmente tratados tales como:las carnes
curadas (principalmente embutidos), conservas, fermentados,
ahumados, productos envasados al vacío, semiconservas vegetales y
las especias.
Las esporas de Clostridium explican su persistencia en ambientes

hostiles y también su adquisición exógena por los seres humanos.
4. Etiología
Las especies del género Clostridium comúnmente asociadas a

enfermedades transmitidas por los alimentos (ETA) son: Clostridium
botulinum cuya toxina afecta al sistema nervioso, causando la
toxiinfección llamada botulismo y Clostridium perfringens cuya
enterotoxina afecta al sistema digestivo.
La intoxicación por C. perfringens es generalmente breve,

autolimitada y rara vez es mortal. Sin embargo, las neurotoxinas de
C. botulinum se encuentran entre los más tóxicos de sustancias que
132
Anaerobios Sulfito
Reductores
se producen naturalmente y causa graves enfermedades, a veces

mortales, con síntomas persistentes durante varios meses.
En los alimentos, recuentos elevados de los anaerobios sulfito-

reductores pueden indicar la existencia de éstos patógenos. Además,
evidencian una posible deficiencia en las buenas prácticas de
fabricación a lo largo del proceso de transformación, o materia prima
de baja calidad.
Debido a las características que poseen los anaerobios sulfito-

reductores se suelen usar como indicadores de la calidad higiénica del
agua y de los alimentos.
5. Determinación
La detección de Clostridium sulfito reductores, así como el recuento,

se puede hacer:
- investigando la presencia de formas vegetativas y esporuladas,
conjuntamente.
- investigando la presencia de formas esporuladas, únicamente.
La detección y el recuento se realiza utilizando medios de cultivo que

en su fórmula contienen sulfito de sodio, sobre el cual estos
microorganismos, ejercen su acción reductora transformándolo en
sulfuro que al actuar sobre el hierro forma sulfuro de hierro. La
presencia de sulfuro de hierro se pone de manifiesto por la aparición
del color negro de las colonias.
El cultivo de los Clostridium exige una atmosfera exenta de oxígeno,
lo que se consigue:
- Con la regeneración de los medios de cultivo antes de ser
sembrados. Por el cultivo en anaerobiosis
- Mediante jarras para anaerobiosis
- Por la obturación del medio sembrado con una capa de parafina
estéril
- Por la siembra en profundidad del medio
Para obtener únicamente las formas esporuladas de Clostridium

sulfito reductores, se aprovecha su termorresistencia, calentando a
80ºC el producto, la suspensión madre o las diluciones decimales. De
esta manera, se destruyen las formas vegetativas.
6. Legislación
El Código Alimentario Argentino (C.A.A.) establece la detección o el

recuento de anaerobios sulfito reductores para diversos alimentos.
133
Anaerobios Sulfito
Reductores
Los productos comprendidos en salazones y chacinados, están

sujetos, para su análisis microbiológico, aun programa de atributos
de 3 clases, que incluye al Recuento de anaerobios sulfito reductores.
La metodología que establece el C.A.A. para el análisis de estos

alimentos cárneos, es la Norma ISO 15213:2003.
7. Referencias
(1) (1)Sven-OlofEnfors, (2008), Food Microbiology. The ecological

basis of food spoilage, cap. 2 KTH – Biotechnology Stockholm p. 12.
(2) (2)George M. Garrity et al( 2007) Taxonomic Outline of the

Bacteria and Archaea (Formerly the Taxonomic Outline of the
Prokaryotes).
(3) Health Protection Agency (2008) IDENTIFICATION OF

CLOSTRIDIUM SPECIES National Standard Method (NSM)BSOP ID 8
Issue nº: 3.
(4) EFSA (2005) Opinion of the Scientific Panel on Biological Hazards

on the request from the Commission related to Clostridium spp. in
foodstuffs.
http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/199.pdf
(5) Pascual Anderson,M.R. & Calderón y Pascual V. (2000)

Microbiología Alimentaria, Metodología Analítica para Alimentos y
Bebidas 2 edición, Investigación y recuento de Clostridium sulfito-
reductores, Capítulo 9. EdicionesDíaz de Santos, pp.73-75.
(6) Euzéby JP (2014).Clostridium. List of Prokaryotic names with

Standing in Nomenclature.
http://www.bacterio.net/clostridium.html (consulta: 11 de junio
2014)
(7) Argentina, Código Alimentario Argentino.

http://www.anmat.gov.ar/ ativas_alimentos_caa.asp
134
Anaerobios Sulfito
Reductores
NOTAS PERSONALES
135
Anaerobios Sulfito
Reductores
Método Horizontal para el Recuento

de bacterias sulfito reductoras que
crecen en anaerobiosis
1. OBJETIVO

realizar el recuento de bacterias sulfito-reductoras que crecen bajo
condiciones anaeróbicas por el método horizontal en muestras de
2. ALCANCE
Este procedimiento es un método horizontal para la enumeración de

bacterias sulfito-reductoras que crecen bajo condiciones anaeróbicas.
Aplicable a productos para consumo humano y animal y muestras
ambientales en el área de producción y manipuleo de alimentos.

procedimiento son indispensables las normas citadas en el anexo 5.
Referencias.
3. DESARROLLO
3.1. Definiciones
Bacterias sulfito-reductoras que crecen bajo condiciones de

anaerobiosis: bacterias que forman colonias típicas bajo las
condiciones especificadas en esta Norma Internacional.

3.2.3. Agar Sulfito hierro (Iron sulfite agar)
3.2.5. Autoclave
136
Anaerobios Sulfito
Reductores
3.2.6. Estufa de incubación: 37°C ± 1°C, y si fuera necesario, a 50°C

± 1°C
temperatura a 44°C y 47°C
3.2.9. Pipetas de 1 ml de capacidad y de 10 ml graduadas en
intervalos de 0.1 y 0.5 ml respectivamente
3.2.10. Ansas de platino/irídio o níquel/cromo de aproximadamente 3
en particular de 16 mm x 160 mm o bolsas de plásticos estériles de
capacidad 500 ml
3.2.12. Equipo para mezclado (tipo stomacher) para muestras de
alimentos sólidos
diámetro o de 140 mm en caso que fuere necesario
3.2.15. Jarra de anaerobiosis, con equipo para generación de
atmósfera anaeróbica que incluye un sistema para controlar las
condiciones de anaerobiosis

3.3.2. Se preparan por duplicado placas con agar (ó tubos) del
medio sulfito-hierro. Usar una cantidad específica de muestra si el
producto inicial es líquido, ó usar una cantidad específica de la
suspensión inicial y diluciones sucesivas en caso de otros productos.
3.3.3. Las placas o tubos son incubadas bajo condiciones anaeróbicas
a 37°C ± 1°C por 24 h a 48 h (lectura final después de las 48 h) o
posiblemente a los 50°C si se sospecha la presencia de bacterias
termófilas. Se cuentan colonias características negras rodeadas de
una zona negra debido a la formación de sulfuro ferroso como
resultado de la reacción entre los iones sulfuro y el Fe +3 presente en
el medio (reducción).
3.3.4. El número de bacterias sulfito-reductoras por mililitro o por
gramo de muestra se calcula del número de colonias obtenidas en las
placas (ó tubos).
3.4. Muestreo
Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea

verdaderamente representativa que no esté dañada o haya sido
cambiada durante el transporte o almacenamiento.
137
Anaerobios Sulfito
Reductores
El muestreo no es una parte del método especificado en esta técnica.

Si no hay una técnica internacional específica para trabajar con el
muestreo del producto en cuestión es conveniente que las partes
involucradas lleguen a un acuerdo sobre este tema.
3.5. Procedimiento

diluciones de acuerdo con ISO 6887-1, ISO 8261 o cualquier
técnica específica apropiada para el producto en cuestión.
El tratamiento térmico de la suspensión inicial puede ser necesario

para eliminar formas vegetativas de bacterias esporuladas y/o
bacterias no esporuladas. Temperaturas y tiempo de calentamiento
varían de acuerdo a las necesidades, desde combinaciones que
produzcan una pasteurización definitiva a una temperatura moderada
para provocar un efecto activador (ej. 75°C durante 20 minutos),
hasta hervir durante varios minutos. En este caso, los resultados son
número de esporas de bacterias sulfitos reductoras que crecen bajo
condiciones anaeróbicas.
específicas para el alimento en cuestión (ver anexo 5. Referencias).

alimento.

estéril.
138
Anaerobios Sulfito
Reductores


es de 30 minutos.
3.5.2.1. Transferir por medio de una pipeta estéril 1ml de la muestra

en placa de Petri estéril, por duplicado, si el producto es líquido, ó
1ml de suspensión inicial en caso de otros productos.
3.5.2.2. Tomar dos placas de Petri estéril. Usar otra pipeta estéril,
transferir a cada placa 1ml de la primer dilución decimal (10-1) de la
muestra si el producto es líquido, ó 1ml de la primer dilución decimal
de la suspensión inicial (10-2 ) en caso de otros productos.
Repita el procedimiento descripto con las diluciones sucesivas.
3.5.2.3. Verter en cada caja de Petri aproximadamente 15 ml de agar
sulfito-hierro el cual ha sido enfriado a 44°C - 47°C en un baño de
agua. El tiempo transcurrido entre la inoculación de la caja de Petri y
la adición del agar no debería exceder los 15 minutos.
Cuidadosamente mezclar el inóculo con el medio por movimientos
horizontales y permitir que el medio solidifique.
Después que el medio ha solidificado, verter 5 ml ó 10 ml del mismo
medio en la placa.
3.5.2.4. Si se usan tubos, inocular un volumen de 1 ml de cada
dilución dentro de tubos, por duplicado, con medio mantenidos a
44°C - 47°C. Mezclar suavemente sin formar burbujas y dejar
solidificar el medio en un baño de agua frío.
Después que el medio ha solidificado, verter 2 ml ó 3 ml del mismo
medio en cada tubo.
3.5.2.5. Después que solidifique el medio incubar las cajas de Petri en
jarra de anaerobiosis a 37°C ± 1°C por 24 h a 48 h.
139
Anaerobios Sulfito
Reductores
Si se sospecha la presencia de bacterias termófilas, preparar una

segunda serie de placas de Petri e incubar a 50°C ± 1°C.
En el caso de tubos, la incubación en jarra de anaerobiosis no es

necesaria.
3.5.3. Recuento, selección de las colonias y confirmación
Después de la incubación por 24 h y 48 h, dependiendo del grado de

ennegrecimiento y la tasa de crecimiento del microorganismo, contar
las colonias negras, posiblemente rodeadas por un halo negro, como
bacterias sulfito-reductoras.
NOTA 1: puede ocurrir un difuso e inespecífico ennegrecimiento del

medio, especialmente cuando la inoculación se realiza en tubos con
agar en lugar de placas de Petri. El crecimiento de bacterias
anaerobias, que solo producen hidrógeno y no anhídrido sulfuroso,
también puede reducir el sulfito presente y llevar a un
ennegrecimiento general del medio.
Contar las colonias de bacterias sulfito-reductoras en cada placa que

contenga menos de 150 colonias típicas y menos de 300 colonias en
total.
Cuando el número de colonias es alto, algunos tubos pueden ser
ilegibles. En este caso, solo los tubos donde las colonias están
claramente separadas deben ser considerados para el recuento.
NOTA 2: Esta Norma Internacional puede ser usada solo para el

recuento de Clostridium. Luego de obtener colonia típica, elegir 5 de
cada placa, y confirmar el género Clostridium con test de
confirmación (por ejemplo pruebas de respiración, pruebas de
formación de esporas).
Se informa recuento de bacterias sulfito-reductoras en la porción de

muestra analizada (por gramo o mililitros para muestras líquidas).
Ver anexo 3: Cálculo y expresión de los resultados (ISO 7218:2007).
3.5.5. Informe del ensayo
El informe del ensayo debe especificar:

a) Toda la información necesaria para la completa identificación de
la muestra.
b) El método de muestreo usado si se conocen.
140
Anaerobios Sulfito
Reductores
c) El método de análisis usado, incluyendo la temperatura de

incubación, uso de tubos, y cualquier tratamiento térmico para
destruir células vegetativas.
d) Todos los detalles operativos no identificados en la Norma

Internacional, o considerados opcionales, junto con detalles de
cualquier incidente que pueda haber influenciado en los
resultados del análisis.
e) Los resultados obtenidos.
El informe del ensayo también debe establecer si se realizarán más

análisis en un laboratorio de referencia, o si se realizaron, cuáles
fueron los resultados.
141
Anaerobios Sulfito
Reductores
4. ANEXOS

de bacterias sulfito-reductoras que crecen bajo condiciones
anaeróbicas

de diluyente (dilución 1/10)
Inoculación e incubación: transferir por duplicado

1 ml de las diluciones preparadas en placas de Petri
y/ó tubo con agar sulfito hierro, Incubar a 37°C ±
1ºC, por 24 h a 48 h
Recuento y selección de las colonias

características: seleccionar las placas con colonias
negras y contar entre 150-300 colonias
142
Anaerobios Sulfito
Reductores
1. Diluyente: Agua peptona bufferada (BPW)


2. Diluyente: Solución salina peptonada (SFP)


3. Agar Sulfito hierro (Iron sulfite agar)

Digesto pancreático de soja 5.0 g
Bisulfito de sodio (Na2S2O5) 1.0 g
Citrato de amonio hierro (III) 1.0 g
Agar 9.0 - 18 ga
Agua 1000 ml
a
dependiendo de la fuerza de gel del agar
Disolver los ingredientes en agua calentándolos. Si es necesario,

ajustar el pH para que luego de la esterilización sea de 7.6 ± 0.2 a
25°C. Verter 250 ml de medio en frascos de 500 ml.
Si el recuento se realiza por medio de tubos de ensayos, verter 20 a
25 ml de medio en los tubos. Esterilizar 15 minutos en autoclave a
121°C. Antes de usar, desairar el medio.
143
Anaerobios Sulfito
Reductores

7218:2007)
1.1 Método de cálculo: caso general


(1)
Donde:





productos).
Ejemplo 1: El recuento ha proporcionado los siguientes resultados:

144
Anaerobios Sulfito
Reductores
= 168 + 14 = 182 = 16545

1 x 1,1 x 10-2 0,011

microorganismos es de 17.000 o 1.7 x 104 por mililitro o por gramo
de producto.

placa (muestra para análisis o suspensión inicial o primera dilución)
contiene menos de 10 colonias

gramo o ml”.
Ejemplo: Si la dilución inoculada es 10-1:

Hay microorganismos presentes, pero a un nivel inferior a 40 UFC/g ó
ml

contiene colonias



Ejemplo:
< 10 UFC /ml o g
145
Anaerobios Sulfito
Reductores
< 100 UFC /ml o g


manera:
Ejemplo:
- Si la última dilución (más diluida) sembrada fue: 10-3
> 300.000 microorganismos / ml o g
> 3x105 UFC/ml o g
146
Anaerobios Sulfito
Reductores
ANEXO 4: FOTOS
Agar sulfito-hierro
147
Anaerobios Sulfito
Reductores


preparation of the initial suspension and decimal dilutions.
ISO 8261, Milk and milk products- General guidance for the
preparation of test samples, initial suspensions and decimal dilutions
for microbiological examination.


Bibliografía
NMKL N° 95:1997, Sulfite reducing Clostridia: Determination in food.
148
Anaerobios Sulfito
Reductores
NOTAS PERSONALES
149

Analisis Microbiologico de Los Alimentos

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ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO

METODOLOGÍA ANALÍTICA OFICIAL

Versión 1: diciembre 2011

1. Salmonella spp. en alimentos………………………………………………. pág. 1

2. Detección, aislamiento e identificación de Salmonella spp. en

3. Detección, aislamiento e identificación de Salmonella spp. en

4. Escherichia coli O157:H7/NM en alimentos………………………………. pág. 55

5. Detección, aislamiento e identificación de Escherichia coli

6. Detección de Escherichia coli O157:H7/NM en alimentos

7. Detección de Escherichia coli O157:H7/NM en alimentos.

8. Listeria monocytogenes en alimentos……………………………………... pág. 101

9. Detección de Listeria monocytogenes en productos cárnicos.

10. Detección de Listeria monocytogenes en muestras de alimentos.

11. Detección de Listeria monocytogenes en muestras de alimentos.

12. Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) en fórmulas infantiles en

13. Detección, aislamiento e identificación de Enterobacter sakazakii

El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Son bacilos

S. entérica subespecie entérica (I): comprende la mayoría de los serotipos

b. Salmonella bongori (antes subespecie V)

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El presente procedimiento tiene como objetivo describir la metodología llevada

Este procedimiento se aplica para realizar la detección, aislamiento e

3.1. Medios de cultivo, reactivos, materiales y equipos

El método está basado en las siguientes etapas:

3.2.1. Pre-enriquecimiento en medio líquido no selectivo: La muestra se

- Caldo Rappaport - Vassiliadis con Soja (RVS): se incuba a 41.5ºC ± 1ºC

- Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)

3.2.4. Confirmación de colonias presuntivas aisladas: Las colonias

Para la preparación de la suspensión inicial se utiliza en general como

NOTA: Preparación de muestras compuestas (pool)

Enriquecimiento para chocolate y alimentos que contienen chocolate (ej.

Enriquecimiento para alimentos ácidos: asegurarse que el pH no caiga por

3.3.2. Enriquecimiento selectivo

Transferir 0.1 ml del cultivo obtenido en 3.3.1. a un tubo con 10 ml de caldo

3.3.3. Aislamiento e identificación

Tomar un ansada de los cultivos obtenidos en 3.3.2. (caldo RVS y MKTTn) y

3.3.4. Confirmación bioquímica

Para la confirmación por propiedades bioquímicas pueden utilizarse kits

Agar urea: Con un aguja de inoculación estriar el pico de flauta.Incubar a 37ºC

β- Galactosidasa: Utilizar discos siguiendo las instrucciones del fabricante.

Medio para Voges- Proskauer (VP): Resuspender un ansada de la colonia

Medio para reacción de indol: Resuspender una ansada de la colonia

3.3.5. Confirmación serológica y serotipificación

3.3.5.1. General: La detección de la presencia de los antígenos O, Vi Y H de

3.3.6. Interpretación de reacciones bioquímicas y serológicas

Reacciones Auto-aglutinación Reacciones serológicas Interpretación

Una vez identificado el microorganismo como Salmonella spp. por propiedades

3.3.8. Expresión de los resultados

De acuerdo a los resultados de la interpretación (3.3.6) indicar presencia o

3.3.9. Control positivo

ANEXO 1: Diagrama de flujo del procedimiento para la detección de Salmonella

Preenriquecimiento: X g de muestra + 9 X ml de BPW (dil. 1/10). Incubar a

Aislamiento: a partir de RVS y MKTT sembrar una ansada por agotamiento

Seleccionar colonias típicas y estriar en agar nutritivo. Incubar a 37°C ± 1°C,