Inf BioQ6

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA N° 6
DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE
CREATININA
Integrantes:
1. Anampa García, Estrella Mayté (20151425)
2. Arias Ospina, Jenny Isabel (20151427)
3. Castillo Arispe, Meybi Ani (20151435)
4. Mollyk Montes, Anwar Rael (20151447)
Grupo: A* (martes/11am a 1pm)
Fecha de la práctica: 9 de mayo del 2017
Fecha de entrega de informe: 23 de mayo del 2017
2017-I
INTRODUCCIÓN
En el metabolismo muscular, la creatinina se sintetiza en forma endógena a

partir de la creatina y el fosfato de creatina. Si la función renal es normal, ésta sustancia
se filtra completamente a nivel glomerular y no se reabsorbe a nivel tubular.
De esta manera, la determinación del nivel de creatinina en sangre resulta útil

para el diagnóstico y control de insuficiencias renales agudas y crónicas como
consecuencia de nefropatías, nefrolitiasis y obstrucción de la vía urinaria por hiperplasia
prostática entre otras patologías.
La medición de creatinina en sangre también resulta útil para el control de la

diálisis renal. Las concentraciones de creatinina en orina pueden tomarse como valores
referencia de la excreción de algunos metabolitos, como la albúmina y la amilasa.
La mayoría de los métodos para la determinación de creatinina en una muestra

se basan en la reacción de Jaffé descrita por Popper y colaboradores, y modificada por
Bartels. Esas versiones que incluyen modificaciones tienen mayor sensibilidad y mejor
precisión que el método original de Jaffé.
Es un test cinético y colorimétrico, en el cual la creatinina presente en la muestra

reacciona con el picrato (proveniente del ácido pícrico) en solución alcalina, formando
un complejo amarillo-naranja cuya intensidad de color puede medirse mediante
fotometría. Esta intensidad de color es directamente proporcional a la concentración de
creatinina en la muestra [ CITATION Gon10 \l 10250 ].
MATERIALES Y REACTIVOS
 Espectrofotómetro
 Tubos de ensayos
 Pipetas graduadas y volumétricas
 Piceta
 Oxalato de sodio
 Papel filtro
 H2SO4 , NaOH 10%
 Tungstato de sodio
 Ácido pícrico 1.5%
 Solución stock de creatinina 100 mg%
 HCl
MÉTODO OPERATIVO
A. PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS
 Primero se realizó un proceso previo (desproteinización) por el método de Folin-

Wu. Para esto, se colocaron 2ml de sangre en tubo de prueba de 50ml .Se le
adicionó 14 ml de agua destilada y 2ml de tungstato 10% .Se agitó el tubo después
de cada adición.
 Posteriormente se agregó la solución H2SO4 y se agitó nuevamente. Se observó un
precipitado de color marrón chocolate. Luego se filtró a través de un papel filtro .La
muestra del líquido filtrado tiene que ser incolora.
B. REACCIÓN DE COLOR
Se rotularon tres tubos de prueba como blanco, estándar, muestra; y se preparó en

tubos de ensayo de la siguiente manera
 Tubo Blanco: se agregó 5 ml de agua destilada y 2.5 ml de solución de picrato
alcalino 1:1
 Tubo Estándar: Se mezcló 5.0 ml de solución stock de creatinina con 2.5 ml de
solución de picrato alcalino 1:1
 Tubo muestra: Se agregó 5 ml de muestra clarificada en 2.5 ml de solución de
picrato alcalino 1:1
RESULTADOS Y DISCUSIONES
TUBO BLANCO ESTANDAR MUESTRA

REACTIVO
  mL  
Sol. Estándar de
creatina
  mL 
Muestra clarificada
(filtrado)
   mL
H2O destilada
 mL  mL  mL
Sol.de picrato
alcalino
M1   

M2   
M3   
M4   
M5   
M6   
 Hallando la concentración de la solución estándar (Cst):
Sol. Stock: 100mg %

100mg --------- 100ml
0.6mg ---------0.6ml
0.6 mg ------- 100ml (Sol. estándar)

1.8 x 10-2 mg----- 3ml
1.8 x 10-2 ------ 4.5ml

4x10-3 mg/ml----- 1ml
 Hallando la concentración de la muestra problema (CM):
C (M ) C (St )
=
A (M ) A (St )
4 x 10−3 mg/ml
C(M) = x 0.064
0.147
C(M) = 1.74 x 10-3 mg/ml
A(St) : 0.205- 0.058= 0.147

A(m) :0.122- 0.058=0.064
 Calculando la concentración de creatinina en la muestra de sangre,

expresada en mg/dL.
1.74 x 10-3 mg------ 1ml (Tubo muestra)

7.84x 10-3 mg------- 4.5ml
7.84x 10-3 mg------- 3ml (filtrado)

0.052 mg------ 20ml (filtrado)
0.052 mg------2ml(sangre)
2.61mg---------- 100ml
La creatinina es un derivado aminoácido que se filtra libremente por el
glomérulo por lo que se puede utilizar como marcador del buen funcionamiento de los
riñones y diagnosticar si el paciente sufre de alguna enfermedad o mal funcionamiento
de estos [ CITATION Ave091 \l 10250 ].
La concentración de creatinina tiende a ser mayor (0.05 -0.1 mg/dl) en suero que
en plasma.
Como el nivel de creatinina está relacionado con la masa muscular, el valor de la

creatinina en vacunos será mayor que en humanos, alcanzando 1.5 mg/dl .En la práctica
de laboratorio tras la evaluación de la sangre se obtuvo 2.61 mg/dl de concentración de
creatinina .Como se puede observar el valor obtenido difiere bastante del valor normal,
esto indicaría que si la muestra provendría de una vaca común ,esta posiblemente tenga
problemas renales o que pueda haberse sometido a antibióticos antes de su medición de
la creatinina.
Sin embargo, debe tenerse en cuenta los posibles efectos del método analítico en
los resultados obtenidos.
Los valores tienden a ser algo más elevados (0.2mg/dl) cuando se emplea la
reacción de Jaffé que cuando se usa el método enzimático. Por otra parte, la reacción de
Jaffé no es completamente específica para la creatinina, lo que puede provocar falsas
elevaciones en la concentración de la misma debido a la interacción de otras sustancias
(“cromógenos no-creatinina”), sobre todo en animales sanos.
RECOMENDACIONES
1. Los instrumentos y equipos deben estar limpios y libre de sustancias que interfieran
con las reacciones
2. Para realizar la mediciones se recomienda primero hacer la desproteinización porque

las proteínas interfieren en la reacción de la creatinina [ CITATION Con05 \l 2058 ].
3. Cuando el reactivo tiene color, se tiene que usar un blanco de reactivo.

Normalmente se usa para todas las reacciones
4. Seguir al pie de la letra las indicaciones del profesor, para evitar realizar
experimentos innecesarios
5. Es necesario el uso correcto del espectrofotómetro para evitar daños en el equipo.
6. Es importante la utilización de la indumentaria adecuada como mandiles, guantes y

evitar accidentes mediante la manipulación de los reactivos.
CONCLUSIONES
 Se logró satisfactoriamente la cuantificación de la creatinina a través del método

espectrofotométrico de colorimetría utilizando la teoría y aplicación de las Leyes
de Lambert y Beer, empleando el método de factor de calibración
 Calculamos la concentración de la creatinina en la sangre (muestra), a través del

uso de factor de calibración, volviéndolo útil para futuras determinaciones de
concentraciones.
CUESTIONARIO
1. Una suspensión aislada de E.Coli da una absorbancia de 0,793 a 260 nm en una
celda de 1 cm a pH 4,5. Si el E11 %cm es 197, calcular la concentración en mg/mL.
Datos:
A= 0,793
E11 %cm= 197 = Absorbancia específica de 1%(p/v) en una celda de 1cm
A
E11 %cm =
%C∗b
0,793
197= → % C=0,00403
%C x 1
Calculando la concentración:
0,00403 g_______100ml
0,0000403g______1 ml
g 1000 mg mg
0,0000403 x =0,0403
ml 1g ml
2. Calcule el coeficiente de extinción molar a 361nm para la acuocobalamina en

tampón fosfato 0.1M a pH 7,0 a partir de los siguientes datos obtenidos en una
celda de 1cm.
SOLUCIÓN CONC. X 10-5 M Io I

A 2.23 93.1 27.4
B 1.90 94.2 32.8
Nota. - Halle el coeficiente de extinción molar para cada solución y luego el promedio
de estos valores.
AA= log (Io/I) =log (93,1/27,4)
AA =0,534
A A =abc
0,534=a1x1x2, 23(10-5) → a1= 23 946,188 cm-1 M-1
AB= log (94,2/32,8) =0,458
AB= abc
0,458 =a2x1x 1,9(10-5) →a2= 24 105, 263 cm-1 M-1
3. En una determinación de glucosa se obtuvieron los siguientes resultados:
Glucosa (mg%) 50 75 100 125 150 175 200 250

Transmitancia % 92,9 89,9 86,3 84,3 81,3 78,7 73,8 70,5
Hallar el factor de calibración promedio y la conc. De dos muestras de suero que

resultaron con transmitancia de 88,3 y 85,1.
Absorbancia 0,032 0,0462 0,064 0,074 0,09 0,1040 0,132 0,152

A= 2-logT
Hallando los factores de calibración, respectivamente:
Fc1 = 0.50 mg/ 0.032 = 15.625 mg

Fc2 = 0.75 mg/ 0.046 = 16.304 mg
Fc3 = 1.00 mg/ 0.064 = 15.625 mg
Fc4 = 1.25 mg/ 0.074 = 16.892 mg
Fc5 = 1.50 mg/ 0.090 = 16.667 mg
Fc6 = 1.75 mg/ 0.104 = 16.827 mg
Fc7 = 2.00 mg/ 0.132 = 15.152 mg
Fc8 = 2.50 mg/ 0.152 = 16.447 mg
Fc 1+ Fc 2+ Fc 3+ Fc 4+ Fc 5+ Fc 6+ Fc 7+ Fc 8
̅̅ xFc= = 16.0565
8
Cálculo de la concentración:
Amp = 2 - T%
Amp1 = 0.054
Amp2 = 0.070
Cmp = Fc x Amp
Cmp1 = 16.0565 x 0.0540 = 0.8611 mg/mL
Cmp2 = 16.0565 x 0.0700 = 1.1239 mg/mL
4. Para evaluar un metabolito “X” , una muestra fue sometida a dilución

tomando una parte de ella con 4 partes de agua y luego fue comparada
espectrofotométricamente con un estándar de 10 mg/ML obteniéndose las siguientes
lecturas de absorbancias: Blanco = 0.023,estandar 0.357 ,y muestra 0.677.Calcule la
concentración de muestra en mg%.
Ablanco = 0.023
AST = 0.357
AM = 0.677
[st] = 10 mg/mL
[M] = 0.25 mg / mL
Ast corregido = Ast - Ablanco = 0.357 - 0.023 = 0.334
Amp corregido = Amp - Ablanco = 0.677 - 0.023 = 0.654
Volumen = 0.2
Cmp = Cst x Amp /Ast = 10 mg/mL x (0.654/0.334) = 19.5808 mg/mL
5. ¿Qué es el factor de dilución? Explique mediante un ejemplo.
El factor de dilución se puede definir como el número de veces que una

disolución es más diluida que otra y se calcula dividiendo la concentración de la
disolución más concentrada por la más diluida.
Para una dilución de ½, el factor de dilución es 2/1 ó 2. Para una dilución de
1/10, el factor de dilución es 10/1 ó 10 ó 101. Para una dilución de 1/1.000.000 o 10-6,
el factor de dilución es 1.000.000/1 ó 1.000.000 ó 106.
Cuando se realiza por ejemplo un recuento de bacterias aerobias mesófilas, el
factor de dilución indica el número por el cual hay que multiplicar el número de
bacterias encontradas en las placas, para conocer cuánto hay en 1 mL original de la
suspensión bacteriana.
6. ¿Qué es el factor de calibración? .Explique mediante un ejemplo
El proceso de calibración se basa en la medida de una serie de fuentes de

referencia previamente calibradas y la comparación con los resultados indicados por el
activímetro con los valores de actividad certificados. Su objetivo es la determinación del
factor de calibración f, definido como: f=A/Ai
A: valor de referencia para la actividad de la fuente.
Ai: Valor neto indicado por el activímetro (=lectura – fondo)

7. Explique la preparación de la muestra problema (sangre) para la determinación
de creatinina.
Se realizó la desproteinización por el método de Folin-Wu. Para esto, se
colocaron 2 mL de sangre exaltada (con anticoagulante) en un tubo de prueba de
50 mL. Se le adicionó 14 mL de agua destilada y 2 mL de tungstato 10% y luego
se agitó el tubo después de cada adición.
Posteriormente se agregó a la solución H2SO4 y se agitó nuevamente. Se

observó un precipitado de color marrón chocolate. Luego se filtró a través de un
papel filtro rápido. La muestra del líquido filtrado era incolora.
Por último se llevó a cabo la reacción de JAFFÉ para determinar la
concentración de creatinina en la muestra de sangre.
8. Diferencias entre una solución stock ,solución estándar y solución trabajo

La solución stock son composiciones concentradas de nutrientes las cuales están
formuladas por sales minerales que se emplean en un medio particular. Debido
al elevado número de compuestos que incluye y a que algunos de ellos se
emplean a muy bajas concentraciones.
La solución estándar es una disolución que contiene una concentración conocida
de un elemento o sustancia específica, llamada patrón primario que, por su
especial estabilidad, se emplea para valorar la concentración de otras soluciones,
como las disoluciones valorantes.
La solución trabajo es la solución de procesado diluida a la concentración a la
que ha de utilizarse.
9. ¿Qué función bioquímica cumple la creatinina?
La creatinina es un compuesto orgánico generado a partir de la degradación de

la creatina (que es un nutriente útil para los músculos). Se trata de un producto
de desecho del metabolismo normal de los músculos que habitualmente produce
el cuerpo en una tasa muy constante (dependiendo de la masa de los músculos),
y que normalmente filtran los riñones excretándola en la orina. La medición de
la creatinina es el modo más simple de monitorizar la correcta función de los
riñones[ CITATION Día97 \l 10250 ].
10. ¿Qué papel cumplen los siguientes reactivos en la cuantificación de creatina?
Tungstato de sodio: Actúa como agente desproteinizante, formando H2WO4
Ácido sulfúrico: También participa en el proceso de desproteinización.
Na2WO4.2H2O + H2SO4 H2WO4 + Na2SO4
Ácido pícrico: se reduce a ácido picrámico al ponerse en contacto con creatinina
(reacción de Jaffé), coloración naranja-rojo cobrizo
11. El coeficiente de extinción molar de un complejo yodo-glucógeno a 450 nm es 0.20.

Calcule la concentración del glucógeno en una solución de complejo en yodo que
tiene una absorbancia de 0.36 en una cubeta de 3cm.
Absorbancia = e.c.l
Ɛ = coeficiente de extinción molar (M-1.cm-1).
c = concentración molar del soluto
l = longitud de la cubeta
Despejando e:
Ɛ= A/ c. l
0.20 =0.36/ c.3
C= 0.6M
BIBLIOGRAFÍA
 Concepción, J., Puerta, B., Claudia, P., & Ureña, P. (2005). Prácticas de
biología molecular. Colombia: Pontificia Universidad Javeriana.
 Díaz Portllo, j., Fernandéz del Barrio, T., & Paredes Salido, F. (1997). Aspectos
Básicos de Bioquímica Clínica. Madrid ,España: Díaz de Santos.
 Avendaño L, H. (2009). Nefrología Clínica . España: Médica Panamericana.
 González, M. (30 de setiembre de 2010). Determinación de nivel de creatinina

en sangre. Obtenido de La Guía de Química:
http://quimica.laguia2000.com/elementos-quimicos/determinacion-de-nivel-de-
creatinina-en-sangre

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1. Anampa García, Estrella Mayté (20151425)

2. Arias Ospina, Jenny Isabel (20151427)

3. Castillo Arispe, Meybi Ani (20151435)

4. Mollyk Montes, Anwar Rael (20151447)

Grupo: A* (martes/11am a 1pm)

Fecha de la práctica: 9 de mayo del 2017

Fecha de entrega de informe: 23 de mayo del 2017

En el metabolismo muscular, la creatinina se sintetiza en forma endógena a

De esta manera, la determinación del nivel de creatinina en sangre resulta útil

La medición de creatinina en sangre también resulta útil para el control de la

La mayoría de los métodos para la determinación de creatinina en una muestra

Es un test cinético y colorimétrico, en el cual la creatinina presente en la muestra

 Primero se realizó un proceso previo (desproteinización) por el método de Folin-

Se rotularon tres tubos de prueba como blanco, estándar, muestra; y se preparó en

TUBO BLANCO ESTANDAR MUESTRA

M1   

M6   

 Hallando la concentración de la solución estándar (Cst):

Sol. Stock: 100mg %

0.6 mg ------- 100ml (Sol. estándar)

1.8 x 10-2 ------ 4.5ml

A(St) : 0.205- 0.058= 0.147

 Calculando la concentración de creatinina en la muestra de sangre,

1.74 x 10-3 mg------ 1ml (Tubo muestra)

7.84x 10-3 mg------- 3ml (filtrado)

Como el nivel de creatinina está relacionado con la masa muscular, el valor de la

2. Para realizar la mediciones se recomienda primero hacer la desproteinización porque

3. Cuando el reactivo tiene color, se tiene que usar un blanco de reactivo.

6. Es importante la utilización de la indumentaria adecuada como mandiles, guantes y

 Se logró satisfactoriamente la cuantificación de la creatinina a través del método

 Calculamos la concentración de la creatinina en la sangre (muestra), a través del

2. Calcule el coeficiente de extinción molar a 361nm para la acuocobalamina en

SOLUCIÓN CONC. X 10-5 M Io I

AA= log (Io/I) =log (93,1/27,4)

0,534=a1x1x2, 23(10-5) → a1= 23 946,188 cm-1 M-1

AB= log (94,2/32,8) =0,458

0,458 =a2x1x 1,9(10-5) →a2= 24 105, 263 cm-1 M-1

3. En una determinación de glucosa se obtuvieron los siguientes resultados:

Glucosa (mg%) 50 75 100 125 150 175 200 250

Hallar el factor de calibración promedio y la conc. De dos muestras de suero que

Absorbancia 0,032 0,0462 0,064 0,074 0,09 0,1040 0,132 0,152

Hallando los factores de calibración, respectivamente:

Fc1 = 0.50 mg/ 0.032 = 15.625 mg

4. Para evaluar un metabolito “X” , una muestra fue sometida a dilución

Ast corregido = Ast - Ablanco = 0.357 - 0.023 = 0.334

Amp corregido = Amp - Ablanco = 0.677 - 0.023 = 0.654

Cmp = Cst x Amp /Ast = 10 mg/mL x (0.654/0.334) = 19.5808 mg/mL

5. ¿Qué es el factor de dilución? Explique mediante un ejemplo.

El factor de dilución se puede definir como el número de veces que una

6. ¿Qué es el factor de calibración? .Explique mediante un ejemplo

El proceso de calibración se basa en la medida de una serie de fuentes de

A: valor de referencia para la actividad de la fuente.

Ai: Valor neto indicado por el activímetro (=lectura – fondo)

Posteriormente se agregó a la solución H2SO4 y se agitó nuevamente. Se

8. Diferencias entre una solución stock ,solución estándar y solución trabajo

9. ¿Qué función bioquímica cumple la creatinina?

La creatinina es un compuesto orgánico generado a partir de la degradación de