UNIVERSIDAD DE CIENCIAS Y

ARTES DE CHIAPAS
INSTITUTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

T E S I S

Actividad anticancerígena de extractos

acuosos de Curatella americana L.
(DILLENEACEAE) y Salvia longispicata M.
(LAMIACEAE) en cultivos de la línea
neoplásica de colon Caco2

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

LICENCIADO EN BIOLOGÍA

PRESENTA
Jazmín Nava Martínez

Tuxtla Gutiérrez, Chiapas Octubre de 2016

 UNIVERSIDAD DE CIENCIAS Y
ARTES DE CHIAPAS
INSTITUTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

T E S I S

Actividad anticancerígena de extractos

acuosos de Curatella americana L.
(DILLENEACEAE) y Salvia longispicata M.
(LAMIACEAE) en cultivos de la línea
neoplásica de colon Caco2

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

LICENCIADO EN BIOLOGÍA

PRESENTA
Jazmín Nava Martínez

DIRECTORA
Dra. María Adelina Schlie Guzmán
Laboratorio de Biología Molecular y Genética
UNICACH

Tuxtla Gutiérrez, Chiapas Octubre de 2016.

 AGRADECIMIENTOS

Al Instituto de Ciencias Biológicas de la Universidad de Ciencias y

Artes de Chiapas por la formación académica recibida.

A la Doctora María Adelina Schlie Guzmán, directora de esta tesis,

gracias por aceptarme como su tesista, por su paciencia, orientación,
sugerencias y grandes conocimientos brindados, así como el tiempo que
me ha dedicado y sus buenos consejos, pero sobre todo por su confianza,
buena comunicación, cariño y respeto en todo momento.

A la Dra. Lorena Mercedes Luna Cazáres por su tiempo dedicado a

la revisión y sugerencias al presente trabajo.

A la cDra. Christian Anabí Riley Saldaña por sus sugerencias y

valiosos comentarios realizados a este trabajo.

Al personal del Herbario CHIP del Instituto de Historia Natural por la

valiosa ayuda al corroborar las especies.
 DEDICATORIAS
Gracias Dios!
porque más que pedirte, tengo mucho que agradecerte…
A mi mamá Maribel Martínez Gómez por mi existir y el valioso sacrificio
para guiarme en el buen camino para mi superación, pero sobre todo por el
tiempo, amor y cariño para terminar un logro más en mi vida.

A mis hermanos Jacqueline, Geovanny y Vianney por formar parte de mi

vida y hacer de ella una vida feliz.

A mi tía Margoth Martínez Gómez por su apoyo en momentos necesarios

para continuar este proyecto.

A José Martín por su amor, tiempo, compañía, comprensión, fortaleza y

sobre todo el apoyo incondicional para concluir este proyecto de vida.

A Julio César Burguete Gutiérrez, compañero y encargado del Laboratorio

de Biología Molecular y Genética; por brindarme su apoyo y conocimiento en
las actividades realizadas en el laboratorio.

A T.C.L. Patricia Ramírez Cobaxin, por brindarme el apoyo en materiales

y espacio para la realización de actividades necesarias en este proyecto.

A todas aquellas personas mencionadas y a quienes compartieron su

tiempo y apoyo directamente e indirectamente, quiero compartirles este logro y
darle las…
GRACIAS!!!
 “Hay una fuerza motriz
más poderosa que el vapor,
la electricidad y la energía atómica:
LA VOLUNDAD”

Albert Einstein
 ÍNDICE
I. INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 1
II. MARCO TEÓRICO ................................................................................................ 3
2.1. El cáncer ....................................................................................................... 3
2.1.1. Generalidades sobre el cáncer ............................................................ 3
2.1.2. El ciclo celular ...................................................................................... 6
2.1.3. Las alteraciones genéticas y el cáncer ................................................ 7
a) Oncogenes........................................................................................ 8
b) Genes supresores de tumores .......................................................... 9
2.1.4. Generalidades del cáncer colorrectal ................................................. 10
2.2. Los Metabolitos secundarios de las plantas ................................................ 12
2.2.1. Compuestos fenólicos ....................................................................... 13
2.2.2. Terpenos ........................................................................................... 15
2.2.3. Compuestos secundarios nitrogenados ............................................. 17
2.3. Las especies analizadas Curatella americana L. (Dilleneaceae) y Salvia
longispicata M. (Lamiaceae) .................................................................. 18
2.3.1. La familia Dilleniaceae ....................................................................... 18
2.3.2. El género Curatella ............................................................................ 18
2.3.3. Curatella americana L. ....................................................................... 19
2.3.3.1. Ubicación taxonómica ............................................................ 21
2.3.3.2. Distribución y hábitat de Curatella americana L. ..................... 22
2.3.4. La familia Lamiaceae ......................................................................... 22
2.3.5. El género Salvia ................................................................................ 23
2.3.6. Salvia longispicata M. ........................................................................ 24
2.3.6.1. Ubicación taxonómica ............................................................ 25
2.3.6.2. Distribución y hábitat de Salvia longispicata M. ...................... 26
III. ANTECEDENTES ............................................................................................... 27
IV. OBJETIVOS ....................................................................................................... 31
4.1. General ....................................................................................................... 31
4.2. Específicos ................................................................................................. 31
V. MÉTODO ............................................................................................................. 32
 5.1. Zona de recolecta ....................................................................................... 32
5.2. Recolecta de las estructuras vegetales ....................................................... 33
5.3. Preparación de los extractos ....................................................................... 33
5.4. Características generales de la línea celular Caco2.................................... 35
5.4.1. El mantenimiento de la línea celular ................................................. 35
5.4.2. Conteo de células viables con azul de tripán ..................................... 36
5.5. Los ensayos de proliferación celular ........................................................... 37
5.5.1. El ensayo colorimétrico para cuantificar la viabilidad celular con
MTT .................................................................................................. 37
5.5.2. Preparación de las diferentes concentraciones de los extractos
acuosos ............................................................................................ 38
5.5.3. Los ensayos de inhibición de la proliferación celular .......................... 38
5.5.4. Análisis estadístico de los resultados................................................. 40
5.6. Identificación de Metabolitos secundarios (MS) .......................................... 40
VI. RESULTADOS ................................................................................................... 43
6.1. Registro del material vegetal ....................................................................... 43
6.2. Extractos acuosos de Curatella americana y Salvia longispicata ................ 43
6.2.1. Rendimiento ...................................................................................... 43
6.3. Ensayos de proliferación celular utilizando células de cáncer de colon
Caco2.................................................................................................... 44
6.3.1. Cuantificación de células viables con azul de tripán .......................... 44
6.3.2. Relación entre el número de células viables y su cuantificación
con el reactivo MTT........................................................................... 45
6.4. Efecto de las concentraciones de Curatella americana sobre la línea
neoplásica de colon Caco2 ................................................................... 46
6.5. Efecto de las concentraciones de Salvia longispicata M. sobre la línea
de neoplásica de colon Caco2 .............................................................. 48
6.6. Presencia de metabolitos secundarios en los extractos acuosos de
Curatella americana L. .......................................................................... 50
6.7. Presencia de metabolitos secundarios en los extractos acuosos de
Salvia longispicata M. ............................................................................ 51
VII. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS ............................................................... 52
VIII. CONCLUSIONES ............................................................................................. 55
IX. PERSPECTIVA DEL TRABAJO ........................................................................ 56
X. LITERATURA CITADA ....................................................................................... 57
XI. ANEXOS ............................................................................................................ 64
Anexo 1. Rendimiento de los extractos acuosos. ............................................... 64
Anexo 2. Grupos de metabolitos secundarios presentes en las diferentes
estructuras de Curatella americana L. y Salvia longispicata M. ............. 64
Anexo 3. Resultados de la prueba con el reactivo Dragendorff para identificar
fenoles. ................................................................................................. 65
Anexo 4. Resultados de la prueba de Shinoda para identificar flavonoides. ...... 65
Anexo 5. Resultados de la prueba de Molish para identificar glucósidos. .......... 66
Anexo 6. Resultados de la prueba de Baltej para identificar lactonas
sesquiterpénicas. .................................................................................. 66
Anexo 7. Resultados de la prueba de espuma para identificar saponinas. ........ 67
Anexo 8. Resultados de la prueba para la identificación de taninos
hidrolizables y condensados. ................................................................ 67

ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Características de la línea neoplásica Caco2. ................................... 35

ÍNDICE DE DIAGRAMAS
Diagrama 1. Obtención de extractos. ................................................................. 34
Diagrama 2. Ensayo de proliferación celular utilizando concentraciones
diferentes de los extractos de Curatella americana y Salvia
longispicata. ................................................................................ 39
Diagrama 3. Identificación de Metabolitos Secundarios ..................................... 42
 ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Diferencias a nivel de invasión de vasos sanguíneos entre tumores
benignos y malignos.............................................................................. 6
Figura 2. Representación esquemática de las cuatro fases sucesivas del ciclo
celular. Intervalo 1 (Gap1), síntesis (S), intervalo 2 (Gap2) y mitosis
(M) ........................................................................................................ 7
Figura 3. Desarrollo del cáncer colorrectal. ........................................................ 11
Figura 4. Distribución de la Familia Dilleniaceae. ............................................... 18
Figura 5. Distribución del género Curatella. ....................................................... 19
Figura 6. Curatella americana L. A, Árbol; B, Tallo; C, Hoja; D, Racimo; E,
Flor.. .................................................................................................... 20
Figura 7. Distribución de Curatella americana.................................................... 22
Figura 8. Distribución de la Familia Lamiaceae .................................................. 23
Figura 9. Distribución del género Salvia. ............................................................ 24
Figura 10. Salvia longispicata M. A, Árbol; B, Tallo; C, Hoja; D, Flor.................. 25
Figura 11. Distribución de Salvia longispicata M. ............................................... 26
Figura 12. Mapa de la Localidad de Sierra Morena, Municipio de Villa Corzo,
Chiapas. .............................................................................................. 32
Figura 13. Detalle de la Cámara de Neubauer. ................................................. 37
Figura 14. Esquema de una microplaca y su la distribución de los pocillos para
la prueba de proliferación celular......................................................... 39
Figura 15. Línea celular Caco2. ......................................................................... 44
Figura 16. Extractos de Salvia longispicata con reactivo MTT. .......................... 48

ÍNDICE DE GRÁFICAS
Gráfica 1. Rendimiento de los extractos acuosos de Curatella americana L. y
Salvia longispicata M. ....................................................................... 43
Gráfica 2. Prueba de viabilidad con MTT. .......................................................... 45
Gráfica 3. Efecto de las concentraciones de Curatella americana L. sobre la
proliferación celular de Caco2. .......................................................... 47
Gráfica 4. Efecto de las concentraciones de Salvia longispicata M. sobre la
proliferación celular de Caco2. .......................................................... 49
Gráfica 5. Grupos de metabolitos secundarios presentes en hojas y tallo de
Curatella americana L. ...................................................................... 50
Gráfica 6. Grupos de metabolitos secundarios presentes en hojas y tallo de
Salvia longispicata M. ....................................................................... 51
 RESUMEN
Algunos agentes anticancerígenos provienen de fuentes naturales, como los
alcaloides obtenidos de Chatharantus roseus L. que se utilizan para tratar la leucemia
infantil (Lee, 2004). En México Curatella americana se ha utilizado para aliviar ulceras
gástricas e inflamación y algunas especies de Salvia como antidiarreica y antiemética,
diurética e hipoglucemiante (Argueta y Cano, 1994), aunque también existen reportes
de la asociación de estos géneros con actividades antioxidante y antineoplásicas (Wu
et al., 2016). Por lo anterior, el propósito de este trabajo fue conocer la actividad de los
extractos acuosos de Curatella americana L. y Salvia longispicata M. sobre la
proliferación de la línea neoplásica de colon Caco2 así como los principales grupos de
metabolitos secundarios disueltos en ellos.

Los ensayos de proliferación se realizaron en microcultivos exponiendo las

células a diferentes concentraciones de los extractos (500, 250, 125, 62.5, 31.2, 15.6
y 7.8 µg/mL). Los grupos de metabolitos secundarios más importantes se identificaron
a través de pruebas colorimétricas y de precipitación (Domínguez, 1973).

En C. americana se encontró seis grupos de metabolitos secundarios, siendo en

tallos los más abundantes: los fenoles, glucósidos y saponinas, en tanto que en hojas
se encontró a los fenoles y taninos. El extracto de tallos de C. americana redujo la
proliferación celular y alcanzó la DI50 desde la menor concentración utilizada (7.8
µg/mL). En las hojas, el inicio de la actividad significativa así como la DI50 fue de 31.2
µg/mL.

En los extractos tanto de hoja como de tallo de S. longispicata se identificó con

mayor intensidad: fenoles, flavonoides, glucósidos y lactonas sesquiterpénicas. Su
actividad sobre la proliferación de la línea neoplásica fue moderada con excepción de
las concentraciones altas. El extracto de tallos a partir de 250 µg/mL y en hojas a partir
de 125 µg/mL nulificó la proliferación celular.

A partir de los resultados se determinó que los extractos acuosos de Curatella

americana inhiben significativamente la proliferación de la línea neoplásica de Caco2
por lo que sería importante identificar los metabolitos secundarios asociados a esta
actividad.
 I. INTRODUCCIÓN

Desde la aparición del hombre sobre el planeta, las plantas han jugado un papel muy
valioso en lo individual y en lo social. El conocimiento de la flora ha permitido mejorar
las condiciones de vida del hombre, al utilizarlas en diferentes tipos de industrias como
la de construcción, fabricación de papel, química, textil y farmacéutica entre otras
(Fernández et al., 2001).

Las plantas producen gran una variedad de moléculas de bajo peso molecular
denominados metabolitos secundarios, los que además de tener un importante papel
para la protección, supervivencia y desarrollo de las plantas, presentan actividades
biológicas que han sido aprovechadas por el hombre para curar diversos
padecimientos (Argueta y Cano, 1994). Algunos de estos ejemplos son: la morfina y la
codeína, alcaloides de la amapola Papaver somniferum; el glucósido cardiotónico
digitoxina extraído de Digitalis purpurea, el alcaloide con efecto antimuscarínico
atropina (o dl-hioscina), extraída de Atropa belladona y el analgésico ácido salicílico
cuyo derivado es la aspirina, que naturalmente se encuentra en las especies de sauce
Salix entre otros compuestos (Anaya y Espinosa-García, 2006).

En el área oncológica es significativo que alrededor del 62% de los agentes

anticancerígenos se deriven de una forma u otra de fuentes naturales, incluyendo
plantas, organismos marinos y microorganismos, entre los que se encuentran los
alcaloides vinblastina y vincristina obtenidos de Chatharanthus roseus L.
(Apocynaceae) que se utilizan para tratar la leucemia infantil (Lee, 2004) y los
alcaloides diterpénicos de Taxus spp. (Taxaceae) conocidos como taxoides en el
tratamiento del cáncer de ovario, seno, próstata y pulmón (Barrales-Cureño y Soto-
Hernández, 2012).

Nuestro país alberga una gran biodiversidad con más de 3 mil 600 tipos de
plantas medicinales, sin embargo menos de 50 especies han sido analizadas para
conocer sus posibles efectos farmacológicos; su consumo entre la población, se
orienta en muchos casos, por el conocimiento tradicional que se preserva en distintas
regiones del país (La Jornada, 2015).

1
 Actualmente, el cáncer colorrectal es una de las enfermedades malignas más
frecuentes y ocupa el segundo lugar después del cáncer de pulmón en hombres y el
tercero después del cáncer de pulmón y de mama en las mujeres (Tortora y Derrickson,
2006).

En la medicina alopática los principales medios para tratar a personas con

cáncer son la cirugía, las radiaciones y la quimioterapia (Stehman et al., 2003).
Infortunadamente, estos tipos de tratamientos producen efectos adversos como
náuseas, diarrea, caída del cabello, fatiga y resistencia disminuida a las enfermedades,
debido a la toxicidad inducida por estos antineoplásicos (Omoti y Omoti, 2006; Tortora
y Derrickson, 2006).

Si bien la búsqueda de nuevos medicamentos anticáncer a partir de extractos de

hoja, corteza, tallo, flora y fruto, es una de las áreas más dinámicas de la farmacología,
uno de los mayores retos es la búsqueda de compuestos que puedan brindar no solo
tratamientos más efectivos o una mejor calidad de vida, sino que también sea una
alternativa terapéutica al alcance de las personas que son víctimas de esta
enfermedad (Gonzales y Valerio, 2006).

Por lo anterior, surge el interés de evaluar el efecto de los extractos acuosos de

Curatella americana L. y Salvia longispicata M. sobre la proliferación de la línea
neoplásica de colon Caco2, contribuyendo al conocimiento de la actividad biológica de
estos recursos vegetales, así como a la búsqueda de mejores alternativas terapéuticas
para las personas que padecen cáncer.

2
 II. MARCO TEÓRICO

2.1. El cáncer

2.1.1. Generalidades sobre el cáncer

Las neoplasias malignas o cáncer maligno son la segunda causa de muerte a nivel
mundial después de las enfermedades crónico-degenerativas. En 2010 la
Organización Mundial de la Salud (OMS) previó que a nivel mundial, la mortalidad por
cáncer aumentaría un 45% entre 2007 y 2030 (pasaría de 7.9 millones a 11.5 millones
de defunciones). En 2012 hubo aproximadamente 14 millones de nuevos casos y 8.2
millones de muertes relacionadas con el cáncer, por lo que se prevé que el número de
nuevos casos aumente en aproximadamente un 70% en los próximos 20 años. En
2012, los cánceres diagnosticados con más frecuencia en el hombre fueron los de
pulmón, colon y recto, próstata, estómago e hígado; en la mujer fueron los de mama,
pulmón, colon y recto, cuello uterino y estómago (OMS, 2015).

Aproximadamente el 30% de las muertes por cáncer son debidas a cinco

factores de riesgo conductuales y dietéticos: índice de masa corporal elevado, ingesta
reducida de frutas y verduras, falta de actividad física, consumo de tabaco y consumo
de alcohol (Ibíd).

Aunque los fármacos anticancerígenos han conseguido prolongar la

supervivencia de los pacientes cancerosos, existen en ellos varios inconvenientes:

a. Presentan costos elevados que en muchas ocasiones impiden que sean

accesibles a las poblaciones de bajos recursos económicos.
b. Presentan una alta toxicidad ya que exigen la adición de disolventes para
conseguir su más fácil absorción. Estos disolventes no sólo disminuyen la
potencia de los medicamentos sino que también producen efectos tóxicos.
c. Su actividad es inespecífica y afecta a todas las células de división rápida
del organismo, por lo que su administración lleva efectos adversos en
diversos órganos y sistemas del organismo.

3
 d. Inducen mecanismos de multiresistencia a los fármacos (MDR) en las
células cancerosas, lo que impide la acción de uno o varios tipos de
medicamentos antineoplásicos (Aznavoorians et al., 1993).

El término “cáncer” agrupa a una colección de enfermedades con la característica

común de la reproducción incontrolada de células que no responden a los mecanismos
reguladores del ciclo celular y de cooperación intercelular que requieren los
organismos multicelulares. Por consiguiente, continúan proliferando y robando los
nutrientes a las células normales y por último invadiendo los tejidos sanos circundantes
(Izquierdo, 2012).

A principios del siglo XX, el cáncer era considerado una enfermedad hereditaria.
Con el tiempo, las causas del cáncer se centraron en aspectos ambientales y modos
de vida. En la actualidad, se piensa que del 70 al 90 % de los cánceres están causados
por el entorno que nos rodea (polución, luz solar, rayos X, etc.) y por nuestros hábitos
de vida (fumar, comer, beber, etc.); pero existen numerosos tipos de cánceres que
tienen sin duda un componente hereditario (OMS, 2015).

En la mayoría de los casos, lo que se hereda es un defecto en uno de los dos

alelos de un oncogen o de un gen supresor de tumores, que predispone a que se inicie
un proceso de carcinogénesis; sin embargo esto no es suficiente para desarrollar un
cáncer y será necesario una o más alteraciones en el otro alelo y en otros genes para
que finalmente se desarrolle una neoplasia (Izquierdo, 2012).

Como consecuencia de uno o varios cambios en el ADN, se advierten 3

posibilidades para la célula: a) pueden actuar los mecanismos de reparación del daño
y la célula regresar a la normalidad, b) la célula puede morir, c) o puede pasar a ser
una célula iniciada en la transformación. En el último de los casos, se afecta de modo
irreversible las constricciones que normalmente impiden la división celular iniciándose
así la producción de una masa celular diferenciable del resto del tejido original
denominado tumor (Paniagua et al., 2002).

Dependiendo del daño originado, las células anormales pueden formar tumores
benignos o malignos. Los tumores benignos, que son de crecimiento lento y limitado a

4
una localización específica, no se consideran cancerosos y en pocas ocasiones
causan la muerte. Por el contrario, los tumores malignos suelen ser fatales debido a
que las células cancerosas emigran a través de la sangre o de los vasos linfáticos a
lugares distantes del cuerpo donde surgen nuevos tumores malignos (metástasis) que
interfieren con las funciones normales de órganos y tejidos y produciendo la muerte
(Figura 1) (Izquierdo, 2012).

A nivel biológico y clínico, la clasificación más importante de los tumores se

resume a continuación:

 Los tumores benignos:

1. No necesariamente avanzan hacia la malignidad.
2. Mantienen el parecido con el tejido de origen.
3. No todos los tipos celulares del tejido han de estar implicados.
4. Muchas veces están separados del tejido normal que lo rodea, por una
especie de “cápsula” de tejido conjuntivo (Ibíd).

Citológicamente, no se diferencian mucho de células normales. Los problemas

clínicos surgen en muchos casos de modo indirecto por presión de la masa tumoral en
nervios u otros tejidos cercanos. Ejemplos de tumores benignos son las “verrugas” o
los papilomas. La terapia más extendida en estos casos son la extirpación quirúrgica,
y el pronóstico es bueno.

 Los tumores malignos, por el contrario presentan numerosas anormalidades

citológicas, como:
1. Variaciones en la forma y tamaño.
2. Aumento de la densidad y tamaño del núcleo celular.
3. Mitosis anormales.
4. No se encapsulan sino que destruyen las membranas basales
invadiendo vasos sanguíneos y nódulos linfáticos (Izquierdo, 2012).

5
Figura 1. Diferencias a nivel de invasión de vasos sanguíneos y de la membrana basal entre tumores
benignos y malignos (Izquierdo, 2012).

Los tumores primarios son los que se forman en el tejido original y las metástasis
los que derivan de la invasión de células cancerígenas a otros tejidos. La terapia hasta
el momento ha sido la extirpación quirúrgica, acompañada en la mayoría de los casos
de radioterapia y/o quimioterapia, pero debido a las características mencionadas,
nunca se tiene la seguridad de que no se hayan escapado células cancerígenas a
otros lugares del organismo. El pronóstico no es bueno (Ibíd).

2.1.2. El ciclo celular

El ciclo celular es el proceso a través del cual las células se multiplican o proliferan. Su
correcta ejecución en un organismo pluricelular como el hombre, contribuye a
establecer en él, una integración estructural y funcional adecuada para hacer frente a
las condiciones impuestas por el ambiente. Su desregulación puede desembocar en
células que se multiplican sin control (Vogelstein y Kinzler, 1993).

El ciclo celular de las células animales se divide en 4 intervalos (Figura 2).

Después de la mitosis (profase, metafase, anafase y telofase), la célula entra en el
intervalo G1, durante el cual la célula es metabólicamente muy activa pero no hay
síntesis de ADN (ácido desoxirribonucleico); siendo diploide (contiene 2N de ADN) y

6
aumentando generalmente de tamaño. La célula prosigue a continuación al intervalo
S (síntesis), durante el cual se produce la duplicación de ADN; al final de éste la célula
posee 4 veces el contenido haploide del genoma (4N). A continuación se entra en el
segundo intervalo (G2), en donde la célula completa su crecimiento y está lista para
su división lo cual se produce durante la mitosis y cuyo resultado final será dos células
hijas diploides. El tiempo que tarda cada tipo de células en completar un ciclo es
variable. Una célula en cultivo en fase exponencial, por ejemplo, tardará 20 horas en
completar el ciclo: 8 horas en G1, 8 en S, 3 en G2 y 1 en la mitosis (Izquierdo, 2012).

Figura 2. Representación esquemática de las cuatro fases sucesivas del ciclo celular. Intervalo 1
(Gap1), síntesis (S), intervalo 2 (Gap2) y mitosis (M) (Izquierdo, 2012).

El tránsito por estas cuatro fases del ciclo celular está dirigido por una red de
interacción de proteínas altamente compleja y finamente regulada. De entre estas
proteínas se destacan las enzimas de acción fosforilante denominadas quinasas
dependientes de ciclinas (CDKs o Cyclin-dependent kinases de los tipos 1, 2, 4 y 6) y
sus subunidades activadoras las ciclinas (de tipo A, B, D y E) (Kim y Zhao, 2005). La
elucidación de estas redes de interacción ha llevado a entender muchos otros
fenómenos celulares como el cáncer.

2.1.3. Las alteraciones genéticas y el cáncer

El cáncer llega a afectar a uno de cada tres individuos a lo largo de su vida. El proceso
se inicia a partir de una célula normal que se transforma en neoplásica (tumoral),

7
proceso conocido como transformación maligna. Se considera que muchos tumores
se originan como resultado de una multitud de pasos, entre los cuales, una alteración
mutagénica no reparada del ADN podría ser el paso inicial. Este conjunto de
alteraciones determina que las células inicien un proceso de proliferación
descontrolada e invadan tejidos normales (Vogelstein y Kinzler, 1993).

Las diferencias entre tumores benignos y malignos a nivel molecular no están

claramente definidas. Si consideramos que cada célula posee una serie de genes que
“controlan” las funciones de crecimiento y división celular, un tumor surge por la
expansión clonal de una célula en la que algunos de sus genes han sido
independientemente mutados o alterados (Izquierdo, 2012).

Estos genes se dividen en dos grandes categorías: proto-oncogenes y genes

supresores de tumores. Para que se produzca un tumor debe haber al menos, dos
mutaciones, una en un gen supresor de tumor que lleve a su inactivación y otra que
derive en la activación de un proto-oncogenes a oncogén (Paniagua et al., 2002).

a) Oncogenes

Las células normales poseen varios genes que controlan actividades habituales de la
célula y cuya mutación determina que codifiquen proteínas cuyo efecto es la pérdida
del control de la proliferación celular, llevando a la célula al estado tumoral. Las formas
no alteradas (inactivas) de estos genes en las células normales se denominan proto-
oncogenes y su alteración (activación) los convierte en oncogenes (del griego onkos =
tumor). Los oncogenes actúan de forma dominante, es decir, basta la mutación de un
cromosoma del par de homólogos para que el oncogén se active. Se ha identificado
un centenar de oncogenes, muchos incluidos en el genoma de virus ARN. Según la
función de la proteína codificada se distinguen diferentes tipos de oncogenes, que se
explica a continuación (Paniagua et al., 2002):

Oncogenes que codifican proteínas G. El oncogén más común en tumores

humanos es el ras, que codifica una pequeña proteína G monómera, localizada en la
superficie interna de la membrana plasmática. En condiciones de normalidad genética,
esta proteína actúa para que el GTP se hidrolice a GDP, lo que provoca la

8
desactivación de la proliferación celular. El oncogén ras es responsable de que la
proteína permanezca en su forma activa (no hidroliza el GTP) y continúa la
proliferación celular (Ibíd).

Oncogenes que codifican factores de crecimiento o sus receptores. Entre ellos

está el oncogén sis (virus de sarcoma de simio), que codifica el factor de crecimiento
derivado de las plaquetas (PDGF). La producción de grandes cantidades de este factor
propicia que la proliferación celular esté muy estimulada. Otro es el gen de la
eritroblastosis aviaria (erbB) que dirige la formación de un receptor para el factor de
crecimiento epidérmico (EGF). La forma alterada de este receptor actúa como la forma
normal unida al factor de crecimiento, por lo que la proliferación celular está
continuamente estimulada (Ibíd).

Oncogenes que codifican proteínas quinasas de serina-treonina y de tirosina.

Entre ellos está el oncogén raf, que es una quinasa de serina-treonina situada al inicio
de la cascada del cAMP, la vía primaria para el control de la proliferación en muchos
tipos celulares. La forma oncogénica mantiene la proteína en la forma activa, evitando
que se desactive la proliferación celular. Otro es el oncogén src, que fue el primer
oncogén descubierto y es una quinasa de tirosina, la cual interviene en la producción
de numerosas señales intracelulares, muchas de ellas relacionadas con la proliferación
celular (Ibíd).

Oncogenes que codifican factores de transcripción nuclear. Como el oncogén

myc que provoca el paso de células en G₀ a G₁ iniciando una proliferación celular que
no debería tener lugar (Ibíd).

Oncogenes que codifican productos que afectan a la apoptosis, como el oncogén

bcl-2, cuya sobreexpresión suprime la apoptosis (Ibíd).

b) Genes supresores de tumores

Estos genes codifican proteínas que restringen el crecimiento celular y evitan que las
células se malignicen. Los genes actúan de forma recesiva por lo que es necesario la
alteración o deleción del gen en ambos cromosomas homólogos, para la pérdida de
su función protectora. Si a una célula tumoral en cultivo con ambos alelos alterados de

9
un se le introduce el gen correspondiente normal, esta célula dejará de ser tumoral. Se
conocen una docena de este tipo de genes, siendo los más conocidos:

RB. Su alteración causa el tumor retiniano y se ha observado una transmisión

hereditaria. Los sujetos que han heredado un solo alelo alterado no tienen por qué
padecer el tumor, pero poseen mayor predisposición, ya que basta una mutación del
alelo sano para contraer la enfermedad. En algunos pacientes con tumores diferentes
del retinobastoma, como cáncer de mama, próstata o pulmón, también se ha
observado la doble alteración de este gen (Paniagua et al., 2002).

P53. Es un “policía” que vela por la integridad del ADN antes de iniciarse la
división celular. La proteína P53 hace un reconocimiento del estado del ADN antes de
permitir la replicación del material genético anterior a la división celular. Mutaciones o
alteraciones en este gen permiten la división celular en presencia del ADN dañado; el
resultado será una célula muy inestable y si el daño ha afectado a funciones
relacionadas con el control de la propia división celular, tendremos una célula
potencialmente maligna. El P53 es uno de los genes que con mayor frecuencia se
encuentra alterado en todos los tipos de cánceres humanos descritos hasta el
momento. Éste se localiza en el cromosoma 17 del cariotipo humano y su producto es
una proteína nuclear que se fosforila y que interacciona con otras proteínas activando
la transcripción en determinados promotores y parando el ciclo celular en el intervalo
G1 (del inglés gap 1) (Ibíd).

2.1.4. Generalidades del cáncer colorrectal

Es una de las enfermedades malignas más frecuentes. La genética desempeña un

papel importante y se establecido que la predisposición hereditaria contribuye con más
de la mitad de los casos de cáncer colorrectal, aunque el consumo de alcohol y las
dietas con alto contenido de grasa animal y de proteínas se asocian con un aumento
de riesgo de padecer la enfermedad, mientras que las dietas ricas en fibra, retinoides,
calcio y selenio pueden prevenirla. Los signos y síntomas del cáncer colorrectal son
diarrea, estreñimiento, cólicos, dolor abdominal y sangrado rectal, tanto visible como
oculto en las heces. Las excrecencias precancerosas de la mucosa, llamadas pólipos,
también incrementan el riesgo de desarrollo de cáncer colorrectal. La detección de la

10
enfermedad se basa en el análisis de la materia fecal para detectar sangre, el examen
digital del recto (tacto rectal), la sigmoidoscopia, la colonoscopia y el enema de bario.
Los tumores pueden extirparse por vía endoscópica o quirúrgicamente (Tortora y
Derrickson, 2006).

El cáncer colorrectal se desarrolla en mucho tiempo. Debido a que las células

somáticas son diploides, la pérdida de los genes supresores de tumores APC, DCC y
p53 requieren en general dos mutaciones. Las investigaciones recientes sugieren que
las mutaciones de los genes que participan en los procesos de reparación del ADN
pueden suceder durante las primeras fases del cáncer de colon (Mckee y Mckee,
2003). El desarrollo del cáncer colorrectal se presenta esquemáticamente en la figura
3.

Figura 3. Desarrollo del cáncer colorrectal (McKee y Mckee, 2003).

11
2.2. Los Metabolitos secundarios de las plantas

Las células vegetales realizan procesos metabólicos que conducen a la formación de

compuestos esenciales para la vida celular, y en general para la planta. Existen dos
tipos de metabolitos, los primarios (aminoácidos, nucleótidos, carbohidratos simples,
ácidos grasos y derivados) y los secundarios que incluyen moléculas de bajo peso
molecular y con una gran diversidad de estructuras químicas (Piñol et al., 2000).

La función de los metabolitos secundarios (fenoles, flavonoides, taninos,

cumarinas, esteroides, alcaloides y otros compuestos) se ha relacionado con la
comunicación de las plantas con su entorno, pero al ser químicamente activos, pueden
interaccionar con receptores o moléculas blanco de otros sistemas biológicos,
modificando sus procesos fisiológicos y exhibiendo de manera natural actividades
biológicas como la antifúngica, antimicrobiana, insecticida, citotóxica, etc. (Anaya y
Espinosa-García, 2006), convirtiéndose así, en compuestos de gran interés
biotecnológico para el hombre.

Los metabolitos secundarios (MS) difieren de los primarios debido a que tienen
una distribución limitada en el reino vegetal, se encuentran en una única especie de
planta o en un grupo relacionado de especies, mientras que los compuestos primarios
se encuentran en todo el reino. Sin embargo ambas clases de metabolitos están
interconectados debido a que algunos MS derivan biosintéticamente de ciertos
compuestos primarios (Taiz y Zeiger, 1998). Desde el punto de vista ultraestructural,
los metabolitos secundarios se encuentran principalmente en las vacuolas, la periferia
adyacente interna o el centro de los orgánulos citoplasmáticos, además de que sus
concentraciones se diferencian en las distintas partes de la planta (García, 2004).

De este modo, el metabolismo primario proporciona un gran número de

moléculas simples, como el ácido shiquímico, el acetato y los aminoácidos, los cuales
constituyen los materiales de partida para las rutas biosintéticas de MS. La ruta del
ácido shiquímico da origen a muchos compuestos aromáticos, entre ellos los
aminoácidos, los ácidos cinámicos y algunas estructuras polifenólicas. El acetato es el
precursor de los ácidos grasos y de los policétidos en la ruta del acetato-malonato, los
terpenos o isoprenos son sintetizados en la ruta del acetato-mevalonato y los

12
aminoácidos son precursores de los alcaloides y de los antibióticos peptídicos (García,
2004).

De manera muy general, los metabolitos secundarios son clasificados de acuerdo

a su origen biosintético en tres grandes grupos: compuestos fenólicos, los terpenos y
los compuestos secundarios nitrogenados (Almaraz-Abarca et al., 2006).

2.2.1. Compuestos fenólicos

Forman un grupo químicamente heterogéneo que contiene un grupo fenol, un grupo

hidroxilo en un anillo aromático. Son solubles en solventes orgánicos. De acuerdo con
su diversidad química, los fenoles tienen funciones muy diversas en las plantas.
Muchos tienen papeles en la defensa de las plantas contra herbívoros o patógenos.
Otros participan en el soporte mecánico, en la atracción de polinizadores y
dispersantes de frutos y en la reducción del crecimiento de las plantas competidoras
(Ávalos y Pérez-Urria, 2009).

a) Flavonoides

Químicamente son sustancias de naturaleza fenólica y se caracterizan por poseer dos

anillos aromáticos bencénicos unidos por un puente de tres átomos de carbono, con
la estructura general C6-C3-C6, los cuales pueden formar o no un tercer anillo. Los
anillos son denominados A, B y C; los átomos de carbono individuales son referidos
por un sistema numérico, el cual utiliza números ordinarios para los anillos A y C y
números primos para el anillo B. Presentan al menos tres hidroxilos fenólicos y se
encuentran generalmente combinados con azúcares en forma de glicósidos, aunque
también se presentan con relativa frecuencia como agliconas libres. Varios subgrupos
de flavonoides son clasificados de acuerdo con la sustitución del anillo C. En esta
clasificación son de suma importancia el estado de oxidación del anillo heterocíclico y
la posición del anillo B (Cartaya y Reynaldo, 2001).

Son muy importantes para el desarrollo y buen funcionamiento de las plantas, ya

que actúan como atrayentes de animales en la oviposición, como agentes protectores
contra la luz UV o contra la infección por organismos fitopatógenos; también son
pigmentos naturales ampliamente distribuidos en plantas, frutas y verduras. Además,

13
estos compuestos presentan propiedades relacionadas con la salud humana, lo cual
está basado en su actividad antioxidante (Ibíd).

En función de sus características estructurales se pueden clasificar en:

 Flavanos, como la catequina, con un grupo -OH en posición 3 del anillo C.

 Flavonoles, representados por la quercitina, que posee un grupo carbonilo en
posición 4 y un grupo -OH en posición 3 del anillo C.
 Flavonas, como la diosmetina, que poseen un grupo carbonilo en posición 4 del
anillo C y carecen del grupo hidroxilo en posición C3.
 Antocianidinas, que tienen unido el grupo -OH en posición 3 pero además
poseen un doble enlace entre los carbonos 3 y 4 del anillo C (Martínez-Flores et
al., 2002).

b) Fenoles

Son compuestos más simples que presentan un anillo fenólico sustituido, los lugares
y el número de grupos hidroxilos (OH) en el anillo parece que están relacionados
directamente con la toxicidad frente a los microrganismos, de forma que un aumento
en la hidroxilacion, está ligada a una mayor toxicidad (Morrison y Boyd, 1998).

c) Taninos

Estos compuestos no solo poseen un elevado peso molecular, sino además presentan
suficientes grupos hidroxilo unidos a estructuras fenólicas que les confieren la
característica de formar complejos con proteínas, minerales y otras macromoléculas
(Reed, 2010). Comprende compuestos fenólicos muy diferentes entre ellos, pero se
caracterizan por ser sustancias capaces de dar combinaciones estables con las
proteínas y con otros polímeros vegetales como los polisacáridos; se puede dividir en
hidrolizables y condensados. En las plantas, los taninos tienen una acción inhibitoria
del crecimiento de insectos y perturban la digestión de rumiantes (Domingo y López-
Brea, 2003).

Los taninos hidrolizables, como los galotaninos o elagitaninos, provienen de la

esterificación de compuestos polifenólicos no flavonoides, como el ácido gálico o

14
elágico, respectivamente. Por su parte, los taninos condensados o proantocianidinas,
provienen de la esterificación de compuestos polifenólicos flavonoides, como las
catequinas o flavonoles (Vázquez-Flores et al., 2012).

2.2.2. Terpenos

Los terpenos, también llamados terpenoides constituyen el mayor grupo de

metabolitos secundarios y se caracterizan por ser insolubles en agua; todos derivan
de la unión de unidades de isoterpenos (5 átomos de carbono). De esta forma, los
terpenos se clasifican por el número de unidades de isopreno (C5) que contienen; los
terpenos de 10 C contienen dos unidades C5 y se llaman monoterpenos; los de 15 C
tienen tres unidades de isopreno y se denominan sesquiterpenos, y los de 20 C tienen
cuatro unidades C5 son los diterpenos. Los triterpenos tienen 30 C, los
tetraterpenos tienen 40 C y se habla de politerpenos cuando contienen más de 8
unidades de isopreno (Ávalos y Pérez-Urria, 2009).

Se sintetizan a partir de metabolitos primarios por dos rutas; la del ácido

mevalónico, (activa el citosol), en la que tres moléculas de acetil-CoA se condensan
para formar ácido mevalónico que reacciona hasta formar isopentenil difosfato (IPP),
o bien por la ruta del metileritriol fosfato (MPE) que funciona en cloroplastos y genera
también IPP (Ibíd). Son toxinas repelentes para un gran número de insectos y
microorganismos patógenos que se alimentan de las plantas, de forma que
desempeñan un importante papel defensivo en el reino vegetal (Almaraz-Abarca et al.,
2006).

a) Glucósidos

Los terpenos en los vegetales pueden estar libres o formando glucósidos, también
llamados heterósidos. En términos amplios se puede definir a los glucósidos como los
productos de condensación de azúcares con diversas clases de hidroxicompuestos
orgánicos, con la restricción adicional de que el OH de la porción hemiacetal del hidrato
de carbono debe participar en la condensación. La propiedad más característica es su
susceptibilidad a la hidrólisis, por lo cual se desdoblan en sus porciones de azúcar y
no azúcar (Marcano y Hasegawa, 2002).

15
 La porción no azúcar se denomina aglicona (o aglucon) o genina. En la
terminología moderna suelen clasificar a los glucósidos de acuerdo con la identidad de
su porción de azúcar, así en los glucósidos propiamente dichos la porción azúcar es
glucosa, en los fructosidos es fructosa, en los galactosidos es galactosa; también se
clasifica de acuerdo con la complejidad de la porción azúcar; por ejemplo monosidos
si el azúcar es un monosacárido, diosidos si es un disacárido y triosidos si es un
trisacárido (Gennaro, 2003).

Los glucósidos tienen una amplia distribución en el reino vegetal; se encuentran

en muchas frutas y en otras partes de las plantas (semillas, cortezas y hojas) y también
en los pigmentos de las flores (antocianinas) (Marcano y Hasegawa, 2002).

b) Saponinas

Se encuentran como glicósidos esteroideos, glicósidos esteroideos alcaloides o bien

glicósidos triterpenos. Son por tanto triterpenoides o esteroides que contienen una o
más moléculas de azúcar en su estructura. Se pueden presentar como agliconas, es
decir, sin azúcar. Son un grupo de glicósidos amorfos coloidales muy hidrosolubles
que producen espuma cuando se agita la solución acuosa y que son excelentes
agentes emulsionantes (Gennaro, 2003).

La gran diversidad estructural de las saponinas se refleja en sus diferentes

propiedades biológicas y fisicoquímicas, se utiliza para la producción de jabones, como
agentes antimicrobianos, anticancerígenos y hemolíticos entre otros. Muchas
saponinas son muy tóxicas y se denominan sapotoxinas, por lo general las saponinas
ejercen una poderosa acción hemolítica sobre los eritrocitos (Ibíd).

c) Esteroides

Entre los triterpenos se encuentran los esteroides y esteroles derivados del escualeno,
una molécula de cadena lineal de 30 C de la que derivan todos los triterpenos cíclicos.
Los esteroides que contienen un grupo alcohol, y es el caso de casi todos los
esteroides vegetales, se denominan esteroles. Los más abundantes en plantas son el

16
estigmasterol y el sitosterol, en donde el segundo difiere del primero en la ausencia
del doble enlace entre C 22 y C 23 (Ávalos y Pérez-Urria, 2009).

d) Lactonas sesquiterpénicas

Las lactonas sesquiterpénicas o sesquiterpenólidas constituyen un extenso grupo de

productos naturales con más de 4500 registros reportados. De forma esporádica, se
encuentran en hongos y plantas hepáticas (Ruíz-Reyes y Suarez, 2015).

Presentan diversas actividades biológicas que parecen asociarse a una

estructura parcial común; una Y-lactona ɑ, β-insaturada, o con una ɑ-metil Y lactona
(Marcano y Hasegawa, 2002). La relación entre la estructura química y la bioactividad
de las lactonas sesquiterpénicas ha sido estudiada en varios sistemas, especialmente
relacionándola con su actividad citotóxica, antiinflamatoria y antitumoral (Ruíz-Reyes
y Suarez, 2015).

2.2.3. Compuestos secundarios nitrogenados

Existe una gran cantidad de metabolitos secundarios que contienen nitrógeno en su

estructura; los alcaloides y glicósidos cianogénicos que son de gran interés debido a
su toxicidad para el hombre y sus propiedades medicinales; los glucosinolatos y los
aminoácidos no proteicos producen sustancias tóxicas para los insectos y
microorganismos. Pertenecen a este grupo de compuestos secundarios los alcaloides,
los glicósidos cianogénicos, los glucosinolatos o glicósidos de aceite de mostaza y los
aminoácidos no proteicos (Almaraz-Abarca et al., 2006).

a) Alcaloides

Los alcaloides se sintetizan a partir de unos pocos aminoácidos comunes, como la

lisina, tirosina y triptófano. Son solubles en agua, contienen al menos un átomo de
nitrógeno en la molécula y exhiben actividad biológica. Actualmente se cree que la
mayoría de los alcaloides actúan como defensas frente a predadores debido a su
toxicidad y capacidad de disuasión (Almaraz-Abarca et al., 2006). Los alcaloides están
distribuidos en todos los órganos de las plantas: hojas, frutos, flores, semillas, cortezas
y raíces (Claramunt et al., 2013).

17
2.3. Las especies analizadas Curatella americana L. (Dilleneaceae) y
Salvia longispicata M. (Lamiaceae)

A continuación se describen las características de las especies utilizadas en el

presente trabajo.

2.3.1. La familia Dilleniaceae

La familia se compone de 12 géneros, que se encuentran en los trópicos y subtrópicos

(figura 4). La mayoría de los miembros son plantas herbáceas, leñosas-lianas o
árboles. Las hojas son anchas y bien desarrolladas; sin embargo, en Pachynema y
ciertas especies de Hibbertia están muy modificadas. Las flores son vistosas y
coloridas con componentes reproductivos visibles (Naturalista, 2015).

Figura 4. Distribución de la Familia Dilleniaceae (Jardín Botánico de Missouri [JBM], 2016).

2.3.2. El género Curatella

Es un género monotípico de plantas perteneciente a la familia Dilleniaceae. Su única

especie es Curatella americana L.; es originaria de América (Figura 5) (Naturalista,
2015).

18
 Figura 5. Distribución del género Curatella (JBM, 2016).

2.3.3. Curatella americana L.

Son árboles o arbustos hermafroditas con gran resistencia a los incendios. Alcanzan
un tamaño de 2–15 m de alto, con pubescencia áspera. La corteza es de color marrón
claro y la madera es de color crema muy dura.; las hojas son ovadas a elípticas, de 8–
20 cm de largo y 5–10 cm de ancho, redondeadas, emarginadas u obtusas en el ápice,
decurrentes en la base, margen irregular y ligeramente ondulado, escabrosas,
estrellado-pubescentes en ambas superficies y escasamente pilosas en la haz;
pecíolos subalados, de 1–1.5 cm de largo (Naturalista, 2015).

Las inflorescencias ocurren al inicio de la temporada seca en forma de racimos o

panículas, axilares de 4–13 cm de largo. Las flores tienen un olor dulce y son visitadas
por las abejas quienes posiblemente realizan la polinización, de 7–12 mm de ancho,
pediceladas; con 4–5, sépalos obovados de 5–7 mm de largo, pubescentes; pétalos
obovados de 5–7 mm de largo, blancos a rosados; los estambres son de 80–100; con
2 carpelos connados en la base, ovario súpero completamente cubierto por tricomas
híspidos (Naturalista, 2015).

19
 Los frutos son de dos lóbulos con un tamaño de 4-8 mm, capsulares, coriáceos,
pubescentes con semillas (1–2) por carpelo de 4 mm de largo, negras, nítidas, con
arilo blanco) Los frutos inmaduros son verdes y peludos (Figura 6) (Ibíd).

Figura 6. Curatella americana L. A, Árbol; B, Tallo; C, Hoja; D, Racimo; E, Flor. (Composición del
autor).

De acuerdo con Argueta et al. (1994) Curatella americana L. presenta la

siguiente sinonimia popular: en Guerrero: tachicon; en Oaxaca: xo poí lijar, en Chiapas:
hojamán.

El uso más común de esta planta es en padecimientos gastrointestinales, para

aliviar la diarrea, inflamación del riñón, hepatitis y tiricia (estado de inapetencia,
desgano y palidez; se presenta por lo común en personas que sufren de tristeza,

20
desilusión y mal humor) (Argueta et al., 1994). En la comunidad de Sierra Morena,
Chiapas, las hojas se emplean para gastritis y úlceras gástricas (Comunicación
personal).

El análisis fitoquímico de extractos alcohólicos de hojas de C. americana ha

mostrado la presencia de flavonoides, terpenos, compuestos fenólicos, saponinas y
esteroides los cuales también han sido aislados en otras especies de la familia
Dilleniaceae. Entre los compuestos fenólicos, los taninos se han encontrado en
cantidades considerables (El-Azizi et al., 1980).

Hiruma-Lima et al. (2009) identificaron proantocianidinas oligoméricas y

poliméricas mediante cromatografía de líquidos de alta resolución y han discutido la
posibilidad de que estos compuestos sean responsable de su efecto gastroprotector.

2.3.3.1. Ubicación taxonómica

De acuerdo a la base de datos de Trópicos.org del Jardín Botánico de Missouri (2016)

la clasificación taxonómica es la siguiente:

Reino: Plantae

División: Angiospermae

Clase: Eudicotyledoneae

Subclase: Dilleniidae

Orden: Dilleniales

Familia: Dilleniaceae

Género: Curatela (LOEFL)

Especie: Curatella americana L. Carlos Lineo.

21
2.3.3.2. Distribución y hábitat de Curatella americana L.

Es una especie americana común en bosques secundarios y sabanas, en las zonas

Atlántica y Pacífica. Se distribuye desde el centro de México a Brasil, también en las
Antillas (Figura 7) (Naturalista, 2015).

Figura 7. Distribución de Curatella americana (JBM, 2016).

2.3.4. La familia Lamiaceae

La familia tiene una distribución cosmopolita con alrededor de 236 géneros (Figura 8).
Los géneros con mayor de especies son: Salvia (900), Scutellaria (360), Stachys (300),
Plectranthus (300), Hyptis (280), Teucrium (250), Vitex (250), Thymus (220) y Nepeta
(200) (Naturalista, 2015). El nombre original de la familia fue Labiatae, porque las flores
suelen tener pétalos soldados en un labio superior y un labio inferior. A pesar de que
el nombre de Labiatae todavía se considera un nombre alternativo aceptable, la
mayoría de los botánicos utilizan actualmente el nombre de "Lamiaceae" al referirse a
esta familia. Comisión Nacional para el Conocimiento y Uso de la Biodiversidad
(CONABIO, 2016).

22
 Las flores son bilateralmente simétricas con 5 pétalos unidos y 5 sépalos unidos,
por lo general son bisexuales y verticiladas. Las hojas emergen de forma opuesta,
cada par en ángulo recto con la anterior o verticiladas. Los tallos son frecuentemente
de sección transversal cuadrada, pero esto no se encuentra en todos los miembros de
la familia, y en ocasiones se encuentra en otras familias de plantas (CONABIO, 2016).

Figura 8. Distribución de la Familia Lamiaceae (JBM, 2016).

2.3.5. El género Salvia

Salvia es el género más diverso de la familia Lamiaceae, con cerca de 1000 especies
distribuidas alrededor del mundo. México es considerado como una de las áreas con
mayor diversidad con aproximadamente 300 especies, que en un porcentaje
importante (85–88%) son endémicas (CONABIO, 2016).

La mayor diversidad de especies del género Salvia se presenta en las zonas

montañosas de México, principalmente en el centro–sur del país (Figura 9). En
consecuencia, los bosques templados y en particular los de coníferas y encinares, son
los tipos de vegetación que albergan la mayor proporción de especies; no obstante,
también se encuentran en los bosques tropicales caducifolios y subcaducifolios, zonas
áridas y desérticas (Ibíd).

23
 Las formas de crecimiento en Salvia incluyen hierbas anuales y perennes,
arbustos y raramente arbustos trepadores; la característica diagnóstica de Salvia
respecto a los otros géneros de Lamiaceae es la presencia de 2 estambres en los
cuales la parte estéril del conectivo funciona como una palanca, lo que permite que el
polen se adhiera a la cabeza o cuerpo de los polinizadores, principalmente abejas o
colibríes (Cornejo–Tenorio e Ibarra–Manríquez, 2011).

Figura 9. Distribución del género Salvia (JBM, 2016).

2.3.6. Salvia longispicata M.

Es un arbusto perenne nativo del suroeste de México. El epíteto "Longispicata" se

refiere a los grupos de pequeñas flores de un azul morado intenso que sobresalen y
se asemejan a pequeñas mazorcas de maíz. Las inflorescencias de 12-16 centímetros
en espirales apretados de flores no se elevan por encima del follaje como sucede en
muchas otras especies de Salvia. Esta especie es de crecimiento rápido, alcanzando
más de 1 metro de alto en una temporada (Figura 10) (Naturalista, 2015).

24
 Figura 10. Salvia longispicata M. A, Árbol; B, Tallo; C, Hoja; D, Flor. (Composición del autor).

En la comunidad de Sierra Morena, Chiapas, las hojas y tallos se emplean para

lavados vaginales en aquellas personas que tienen quistes o infección (Comunicación
personal).

2.3.6.1. Ubicación taxonómica

De acuerdo a la base de datos de Trópicos.org del Jardín Botánico de Missouri (2016)

la clasificación taxonómica es la siguiente:

25
Reino: Plantae

División: Angiospermae

Clase: Eudicotyledoneae

Subclase: Asterids

Orden: Lamiales

Familia: Lamiaeae

Género: Salvia

Especie: Salvia longispicata M. Martens y Galeotii.

2.3.6.2. Distribución y hábitat de Salvia longispicata M.

Es una especie que se encuentra en bosques cerca de cuerpos de agua, en algunas

ocasiones se puede encontrar en bosques perturbados. Su distribución es en todo
México (Figura 11) (Naturalista, 2015).

Figura 11. Distribución de Salvia longispicata M. (JBM, 2016).

26
 III. ANTECEDENTES

Los reportes de la actividad biológica de Curatella americana son, en su mayoría,

dirigidos a su efecto analgésico o hipoglucemiante, posiblemente dirigidos por la
farmacopea tradicional, entre los más significativos se encontraron los siguientes:

Alexandre-Moreira et al. (1999) utilizaron roedores para observar el efecto anti-

inflamatorio y analgésico de un extracto hidroalcohólico (HAE) de la corteza de tallo de
C. americana. Reportaron que en la oreja de los ratones experimentales, el extracto
fue efectivo en inhibir el edema inducido por acetato de o-tetradecanoil forbol (TPA) y
por la capsaicina. El HAE administrado diariamente por vía intraperitoneal a los
animales, disminuyó significativamente la artritis inducida por adyuvante (50 mg/kg.
i.p.), las contorsiones inducidas por ácido acético (DI50 23.2 ± 0.8 mg/kg, i.p.) y la
respuesta tardía de lamerse la pata como respuesta a la formalina (DI50 11.9 ± 1.2
mg/kg, i.p.). Los autores concluyeron que el HAE mostró actividades anti-inflamatoria
y actividades analgésicas periféricas, cuando se administra a los animales de
experimentación por vía intraperitoneal.

Brandstetter et al. (2009) evaluaron el potencial citotóxico y genotóxico de un

extracto etanólico de la corteza mediante la prueba de inducción de profago λ (SOS
inductest). Para evaluar la citotoxicidad, cultivos de la cepa lisogénica de Escherichia
coli WP2s (λ) fueron tratados con diferentes concentraciones del extracto de C.
americana, y posteriormente sembradas en laboratorio e incubadas durante 24 horas
a 37°C. Para el caso de la genotoxicidad, la cepa se trató con diferentes
concentraciones del extracto, posteriormente se añadió una cepa indicadora (RJF013)
y finalmente se sembraron en las condiciones descritas anteriormente. El número de
colonias o placas en los cultivos fue contado después de 24 h.Los resultados obtenidos
mostraron que aunque el extracto de Curatella americana no modificó la supervivencia
de las bacterias (p> 0.05) (citotoxicidad) generó un aumento significativo en la
inducción de profago λ (genotóxicidad) especialmente a las concentraciones altas (p
<0.05).

27
 Hiruma-Lima et al. (2009) estudiaron la capacidad del extracto etanólico (CEB) y
la infusión (BI) de la corteza de C. americana para prevenir y curar la úlcera de la
mucosa gástrica. Las acciones preventivas y curativas se evaluaron mediante modelos
in vivo en roedores que simulaban ésta enfermedad. Únicamente el CEB disminuyó
significativamente la severidad del daño gástrico inducido por HCl/etanol,
indometacina/betanecol, y la ligadura del píloro. La acción gastroprotectora de CEB
aumentó la mucosa gástrica (48%) y los compuestos de sulfhidrilo endógenos, que
son importantes en la producción de la barrera mucosa contra agentes perjudiciales.
CEB también presentó acción curativa eficaz en la enfermedad gástrica crónica (1.90
± 0.55 vs 6.86 ± 0.46 mm2 en el control). Los mecanismos de acción fueron un
aumento de la PGE2 (40%) y en los niveles de somatostatina (269%) mientras que
disminuyó el nivel de gastrina en el plasma de las ratas experimentales (79%). Los
autores concluyeron que en el efecto gastroprotector y la curación de la enfermedad
gástrica, podrían deberse a la modulación de los niveles de PGE2, somatostanina y
gastrina, debido a la presencia de oligómeros y polímeros de proantocianidinas
presentes en la corteza de tallo.

Ospina et al. (2005) estudiaron la actividad, hipoglucemiante y antidiabética de

una fracción del extracto clorofórmico de la corteza de C. americana L. (chaparro) en
ratones normoglicémicos y en ratas diabéticas por aloxano. Junto con los niveles de
glicemia se determinó el nivel de insulina y su actividad contra especies de oxígeno
reactivos como radicales superóxido, radical hidroxilo y ácido hipocloroso. Los autores
encontraron un importante efecto antihipoglucemiante, un efecto protector contra la
diabetes aloxánica y disminución de la glicemia en el estado diabético sin que esto se
acompañara de una mejoría en la producción de insulina. Los extractos mostraron una
marcada actividad contra el radical superóxido y menor contra ácido hipocloroso por
lo que establecen la necesidad de aislar los principios activos.

Tellez et al. (2004) evaluaron el potencial citotóxico de los metabolitos de doce

plantas colombianas de los géneros Ageratina, Pentacalia, Curatela, Espeletia,
Ageratina y Stemmadenia sobre células las líneas celulares cancerígenas HEP-2
(laringe), MCF-7 (seno) y cuatro líneas de cáncer de seno obtenidas y caracterizadas
en el Instituto Nacional de Cáncer de Colombia, denominadas CSC-1170, CSC- 1595,

28
CSC-3322 y CSC-3325. Los resultados obtenidos señalan que el triterpeno acetato de
lupeol aislado de C. americana presentó una actividad citotóxica a una concentración
de 20 µg/mL.

En cuanto a Salvia longispicata no se encontró literatura sobre los usos de esta

especie. Sin embargo el género Salvia es el más numeroso de la familia de las
Lamiáceas y entre las moléculas características del grupo se encuentran los abietanos
diterpénicos, que presentan una gran variedad de actividades biológicas, como
antioxidantes, antifúngicas, antibacterianas y antiulcerosas (San Feliciano et al., 1993).
Así mismo numerosos estudios indican que este género contiene compuestos que
poseen propiedades citotóxicas en una gran variedad de líneas celulares de cáncer
(Fronza et al., 2012), especialmente los diterpenos tipo-abietano denominados
tanshinonas (Wu et al., 2016).

Al no encontrar literatura sobre los usos de Salvia longispicata, a continuación se

presentan trabajos realizados con Salvia miltiorrhiza en donde se ha encontrado una
buena actividad anti cáncer relacionada con las moléculas características del grupo:
los diterpenos tipo-abietano denominadas transhinonas.

Salvia miltiorrhiza Bunge es un remedio herbal de la medicina tradicional China

útil en el tratamiento de trastornos relacionados con accidentes cardiovasculares y
cerebrovasculares. De la raíz de la planta se han aislado más de 40 diterpenos
hidrofóbicos denominados tanshinonas, los que en las últimas 2 décadas se han
reportado con actividades inhibidoras en diversas líneas celulares de cáncer y en
algunos casos con confirmación de su eficacia en modelos preclínicos de cáncer en
animales (Ibíd).

Wu et al. (2016) realizaron la revisión de la literatura hasta 2012 sobre la

propiedades de Salvia miltiorrhiza y de los compuestos activos aislados de ella contra
diversos tipos de cáncer. Esta revisión señaló que en modelos animales, los
resultados pueden variar desde cero en la prevención de una carcinogénesis de
próstata hasta una la fuerte inhibición utilizando xenoinjertos o aloinjertos de células
cancerosas. Los autores resaltan que la falta de uniformidad de excipientes, dosis y
vías de administración, impiden una buena valorización de los datos. Adicionalmente

29
los estudios clínicos en humanos hasta ahora tratados con tanshinone IIA y en ensayos
a pequeña escala en la República Popular de China no son suficientes para soportar
ninguna indicación del uso de tanshinones contra el cáncer.

Gong et al. (2011) determinaron los efectos de un grupo de tanshinonas

denominados criptotanshinona (CT), tanshinona IIA (T2A) y tanshinona I (T1) sobre
las líneas celulares cancerosas de próstata humano andrógeno-independiente PC-3
y DU145. Los estudios in vitro e in vivo mostraron que todos los compuestos analizados
inhibieron el crecimiento de las líneas celulares de una manera dependiente de la
dosis con interrupción del ciclo celular y la inducción de la apoptosis.

Lee et al. (2010) estudiaron el potencial anticanceroso de los compuestos

criptotanshinona, dihidrotanshinona, tanshinona I, y tanshinona IIA, obtenidos de S.
miltiorrhiza sobre células del carcinoma hepatocelular humano resistentes a los
fármacos (HCC) debido a la expresión de la P-glicoproteína (Pgp) y por alteraciones
en la expresión del oncogén p53. Los resultados mostraron que la criptotanshinona
suprimió el flujo de salida de la doxorrubicina, mediado por la glicoproteína P, sin
embargo la tanshinona IIA con un efecto citostático moderado y efectos pro-
apoptóticos, proporcionó con la doxorubicina una mejor sinergia contra las células
cancerosas.

30
 IV. OBJETIVOS

4.1. General
Determinar la actividad anticancerígena de los extractos acuosos de Curatella
americana L. y Salvia longispicata M. sobre la línea neoplásica de colon Caco2.

4.2. Específicos

 Evaluar el efecto de diferentes concentraciones de los extractos acuosos de

hojas y tallos de Curatella americana L. y Salvia longispicata M. sobre la
proliferación celular en cultivos de la línea neoplásica de colon Caco2.

 Conocer el porcentaje de proliferación de la línea neoplásica Caco2 de los

extractos acuosos de hojas y tallos de Curatella americana L. y Salvia
longispicata M.

 Determinar la DI50 (dosis inhibitoria 50) de los extractos ensayados.

 Identificar los grupos más importantes de metabolitos secundarios contenidos

en los extractos acuosos de hojas y tallos de Curatella americana L. y de Salvia
longispicata M.

31
 V. MÉTODO

5.1. Zona de recolecta

La zona de colecta se realizó en la localidad de Sierra Morena del Municipio de Villa

Corzo (Chiapas) al sureste de la Reserva de la Biosfera La Sepultura.

La ruta para llegar a la localidad de Sierra Morena es la siguiente. En la ciudad

de Villaflores se toma el libramiento y aproximadamente a 2 Km se vira a la derecha
en un crucero; se continua por un camino pavimentado que posteriormente se
convierte de terracería y aproximadamente 36 Km se encuentra la localidad. El
recorrido total desde Tuxtla Gutiérrez hasta Sierra Morena es de aproximadamente 4
horas. La localidad tiene 143 habitantes y se encuentra a 1120 msnm (CTSM, 2015).

La recolecta de Salvia longispicata M. (pajón) se realizó en Sierra morena y la

recolecta de Curatella americana L. (hojamán) se realizó en el tramo de la carretera
Sierra Morena-Villaflores (Figura 12).

Figura 12. Mapa de la Localidad de Sierra Morena, Municipio de Villa Corzo, Chiapas. Primera
recolecta de Salvia longispicata M. ( ); Segunda recolecta de Salvia longispicata M. ( ); Recoleta
de Curatella americana L. ( ) (Composición del autor).

32
Clima

El clima es semicálido húmedo con abundantes lluvias en verano (CONABIO, 2015).

Fauna

Entre los animales que habitan la región destacan los siguientes: águila solitaria,
ocofaisán, zopilote rey, pava cojolita, loro cabeza blanca, tucanes, tejón, puma,
ocelote, tigrillo, tapir, jaguar, venados, tepezcuintle, mono araña, tejones, jabalí y
armadillo (Ibíd).

Flora

Existen cuatro tipos de vegetación: selva mediana subperennifolia, bosque de pino-

encino, bosque de niebla y vegetación secundaria. Entre las especies de plantas,
destacan por su importancia: pinabeto (Abies sp.), espadaña (Ceratozamia sp.) encino
(Quercus) liquidámbar (Liquidambar sp.), palo mulato (Bursera sp.), roble (Ehretia sp.)
y palma camedor (Chamaedorea sp.) (Ibíd).

5.2. Recolecta de las estructuras vegetales

La recolecta de Salvia longispicata M. (Pajón) se realizó en Sierra Morena, localidad

del municipio de Villa Corzo, Chiapas; y la recolecta de Curatella americana L.
(Cacaito-Hojamán) en el tramo de la carretera de Sierra Morena-Villaflores, Chiapas
en Julio de 2015. Las estructuras recolectadas fueron hojas y tallos, los cuales se
depositaron en bolsas negras de polietileno para su traslado a Tuxtla Gutiérrez.

Adicionalmente se recolectaron tres ejemplares con flor de cada especie, los

cuales se prensaron (en una prensa de madera y periódico), se colocaron en una
secadora y posteriormente se llevaron al herbario CHIP del Instituto de Historia Natural
para la identificación de ambas especies.

5.3. Preparación de los extractos

Se limpió el polvo de las hojas, corteza o tallos del material vegetal recolectado con
un trapo semihúmedo y se dejó secar a luz y temperatura ambiente. Una vez secas se

33
molieron en una licuadora industrial hasta lo más fino posible, en el caso de los tallos
primero se cortaron con una tijera de podar y posteriormente se molieron en la
licuadora industrial.

Los extractos se obtuvieron empleando el método de decocción, denominado

también cocimiento, para ello se pesaron 50 gr de la muestra vegetal y se agregó agua
destilada (proporción 1:10 p/v) dejando hervir por 15 minutos, después se dejó enfriar
por 10 minutos y se filtró el extracto para eliminar residuos (Lock, 1998).

El extracto acuoso se vertió en una capa delgada dentro de recipientes de

cristal, y se dejó secar al ambiente. El extracto seco se raspo con una navaja (Gillet) y
se obtuvo un polvo seco que se pesó para calcular el rendimiento de cada muestra
vegetal (Diagrama 1).

Diagrama 1. Obtención de extractos.

34
5.4. Características generales de la línea celular Caco2

La línea celular con la que se llevaron a cabo los experimentos presenta las siguientes
características (Cuadro 1).

Cuadro 1. Características de la línea neoplásica Caco2.

Caco2
Número ATCC HTB-37TM Denominación: Caco-2 [Caco2]

Propiedades de crecimiento: Adherentes Morfología: Epitelial

Organismo de Homo sapiens Adenocarcinoma
Enfermedad:
procedencia: (humano) colorectal
Tejidos: Colon Tipo de células: Células epiteliales
Productos Queratina, ácido retinoico proteína de unión I y retinol proteína
celulares: de unión II.

Para alcanzar la confluencia, las células expresan las

Comentarios:
características de diferenciación enterocitica.

Fuente: ATCC, 2016.

5.4.1. El mantenimiento de la línea celular

El mantenimiento de la línea celular se realizó en medio de cultivo D-MEM (Medio de

Eagle modificado por Dulbecco) adicionado con suero fetal bovino al 15 %, y
antibióticos (100 u/mL de penicilina y 100 pg/mL de estreptomicina) denominado medio
completo. Todo el manejo con las líneas celulares se realizó en condiciones de estricta
esterilidad en una campana de flujo laminar.

El mantenimiento de las líneas celulares se realizó de acuerdo a la metodología

descrita por Morgan y Darling (1993) que a continuación se describe:

1) Cuando el cultivo celular se encontró confluente se aspiró y desechó el medio.

2) Se lavó la monocapa celular con PBS 0.15 mM a pH 7.2 y se agregó de 2 a 3

mL de una solución de 0.25% (p/v) de tripsina 0.53 mM de EDTA.

35
 3) Se observó bajo el microscopio invertido hasta que las células perdieran su
adherencia al sustrato (usualmente de 5 a 15 minutos).

4) Se agregó de 6 a 8 mL de medio completo y las células se colectaron en un

tubo cónico estéril.

5) Se centrifugó por 3 minutos a 1000 rpm, se desechó el sobrenadante y las

células fueron resuspendidas en medio de cultivo completo.

6) Se transfirieron alícuotas de la suspensión celular a nuevas placas con medio

de cultivo fresco.

7) Se incubaron las células a 37 ºC en una atmósfera húmeda conteniendo 5 % de

CO2.

5.4.2. Conteo de células viables con azul de tripán

El procedimiento se basa en la capacidad de las células vivas de excluir el colorante,

por lo que bajo el microscopio se observan refringentes. Las células muertas por lo
tanto aparecen teñidas de azul (Hartmann, 2007).

1) El azul de tripán se ajustó a una concentración de 0.25 % en amortiguador salino

de fosfatos (PBS) 0.15 M, pH 7.2.
2) Para el conteo, se mezclaron 25 µL de la suspensión celular con 75 µL del
colorante (dilución ¼).
3) Se colocaron 10 µL de la suspensión celular en cada reglilla de una cámara de
Neubauer y se examinó microscópicamente con un ocular 10X y objetivo 10X.
4) Se contaron las células refringentes en el cuadro superior derecho de la cámara
(con 16 divisiones) (Figura 13) y se utilizó la siguiente fórmula para determinar
el número de células por mililitro en la suspensión original:

No. de células contadas

x 10,000 (factor de conversión) x 4 (dilución) =
No. de cuadrados contados

= (No. de células contadas en un cuadrado multiplicadas por su dilución, es igual al

No. de células X 103 /mL).

36
 Figura 13. Detalle de la Cámara de Neubauer (Composición del autor).

Finalmente para determinar el porcentaje de viabilidad, se contó el número total

de células y se comparó con el número de células refringentes al azul de tripán.

5.5. Los ensayos de proliferación celular

5.5.1. El ensayo colorimétrico para cuantificar la viabilidad celular con MTT

Para medir la viabilidad celular en un bioensayo se debe recurrir a un método que sea
suficientemente rápido para procesar una cantidad grande de muestras y específico
para detectar las células vivas en una mezcla de células vivas y muertas. El colorante
3-(4,5-dimetil-tiazoil-2)-2,5-bromuro de difeniltetrazolio (MTT), ha sido ampliamente
utilizado para medir la proliferación celular y en especial de linfocitos (Mosman, 1983).
El colorante es reducido por las deshidrogenasas mitocondriales a formazán de color
púrpura, por lo que la reacción ocurre únicamente en células activas (Mosman, 1983;
Scudiero et al., 1998).

1) El tetrazolio (MTT) se preparó a 5 mg/mL en PBS, protegiéndolo de la luz, esta

solución es estable por 15 días en refrigeración.
2) En los tiempos establecidos, se añadieron 10 µL de la solución de MTT al cultivo
celular y se incubó por 3 horas a 37 ºC.
3) Se determinaron las densidades ópticas (DO) a 570 nm en un lector de
microplacas (Biorad, modelo 680). Las DO fueron consideradas como resultado

37
 de la actividad mitocondrial en donde los valores elevados reflejan un mayor
número de células activas o viables.

5.5.2. Preparación de las diferentes concentraciones de los extractos acuosos

Antes de cada ensayo, los extractos acuosos de ambas especies se ajustaron a 1

mg/mL con medio de cultivo completo y se guardaron a 4 ºC (solución stock).

Se realizaron ocho concentraciones de los extractos, con un ajuste de 1000, 500,

250, 125, 62.5, 31.25 y 15.6 µg/mL con medio de cultivo completo para posteriormente
ser utilizados en los diferentes ensayos.

5.5.3. Los ensayos de inhibición de la proliferación celular

Los ensayos se realizaron de acuerdo al diseño experimental de efectos fijos según

Cochran y Cox (1983) siguiendo el Diagrama 2:

1) Se ajustó 1,000,000 células en 10 mL de medio de cultivo completo,

2) Se distribuyó 100 µL de la suspensión celular en cada pocillo de una
microplaca de 96 (obteniendo aproximadamente 10 000 células por pocillo) y
se incubó a 37 °C en atmósfera húmeda con 5 % de CO2 durante toda la
noche.
3) A cada pocillo se le agregó 100 µL de las diferentes concentraciones del
extracto, lo que permitió obtener las concentraciones finales de 500, 250, 125,
62.5, 31.2, 15.6 y 7.8 µg/mL.
4) Al término del paso anterior, se incubaron las microplacas a 37 °C por 48
horas, hasta su cuantificación con el reactivo de MTT (10 µL de la solución
MTT a cada pocillo con células) de acuerdo a lo descrito anteriormente
(Diagrama 2).
5) Los ensayos fueron realizados con cuatro repeticiones (Figura 14), obteniendo
los valores medios y la desviación estándar por cada condición.
6) Los porcentajes de proliferación fueron obtenidos considerando las células
control o sin exposición a ningún extracto como el 100 %.

38
 7) Se obtuvieron las curvas de dosis-respuesta y se estableció la dosis inhibitoria
50 (DI50) como la concentración capaz de inhibir la proliferación celular al 50
% respecto a las células control.

Figura 14. Esquema de una microplaca y su la distribución de los pocillos para la prueba de
proliferación celular (Composición del autor).

Diagrama 2. Ensayo de proliferación celular utilizando concentraciones diferentes de los extractos de

Curatella americana y Salvia longispicata.

39
5.5.4. Análisis estadístico de los resultados

Para el análisis estadístico, inicialmente el valor de los extractos (D.O. a 570 n.m.) en
sus diferentes concentraciones (sin células), se restó del obtenido en los microcultivos
tratados correspondientes. Posteriormente los datos se sometieron a un análisis de
varianza (ANDEVA) de una sola vía, con el programa STATA versión 8, a fin de
determinar la diferencia entre los tratamientos y los controles (controles vs tratamiento)
considerando un resultado significativo si P≤ 0.05.

5.6. Identificación de Metabolitos secundarios (MS)

Se preparó una disolución de cada extracto acuoso (2 de Curatella americana y 2 de

Salvia longispicata) que consistió de 10 mg del polvo del extracto en 2 mL de agua
destilada; lo anterior permitió obtener una concentración final de 5 mg/mL del extracto.

Para la identificación de los metabolitos secundarios (MS), se realizó de acuerdo

a la metodología descrita por López-Méndez (2012) con ligeras modificaciones. Para
ello, se colocó 100 µL de la solución de los extractos a 5 mg/mL en cada uno de nueve
tubos de ensayo (un tubo como control y ocho de pruebas); las pruebas se realizaron
por duplicado y los resultados se anotaron mediante un sistema de cruces para
especificar la presencia o ausencia de los grupos de metabolitos siguiendo los criterios
de: abundante (+++), medio (++), ligero (+) y ausencia (-) (diagrama 3). Lo anterior se
realizó para cada extracto.

Alcaloides: Prueba con el reactivo de Dragendorff

Preparación del reactivo:
 Solución A= 0.85 g de nitrato de bismuto, en 10 mL de ácido acético glacial en
40 mL de agua destilada.
 Solución B= 8 g de Yoduro de potasio en 20 mL de agua destilada.
 Reactivo= 5 mL de solución A + 4 mL de solución B en 100 mL de agua destilada
(Domínguez, 1988).

40
 A un tubo de ensayo con 5 mg de extracto seco, se añadieron 1 mL HCL al 10%,
y dos gotas del reactivo de Dragendorff. Un precipitado marrón indico la presencia de
este metabolito.

Fenoles: Prueba de cloruro férrico

A un tubo de ensayo con 5 mg de extracto seco, se le añadió 1 mL de etanol y tres
gotas de FeCl3 al 3 % en etanol. La aparición de una coloración verde correspondió a
una reacción positiva.

Flavonoides: Prueba de Shinoda

A un tubo de ensayo con 5 mg de extracto seco, se le añadieron 1 mL etanol, 3 trocitos
de magnesio y 2 gotas de HCI concentrado. El desarrollo de un color naranja indicó la
presencia flavona, color rojo para flavonona, rojo azuloso para flavonol y violeta para
xantinas (Idem). Si hay presencia de clorofilas, al filtrado añadirle un volumen igual de
solución de acetato de plomo al 4 % que contenga ácido acético al 0.5 %, agitar, dejar
reposar 15 minutos y filtrar. Con el filtrado realizar el ensayo.

Glucósidos: Prueba de Molish

A un tubo de ensayo con 5 mg de extracto seco, se le añadió 1 mL de etanol, luego se
agregaron dos gotas de alfa-naftol al 5 % en etanol y 1 mL de H2SO4, gota a gota
dejando resbalar por las paredes del tubo poco a poco. La formación de un anillo de
color violeta en la interfase indicó una reacción positiva.

Saponinas: Prueba de espuma

A un tubo de ensayo con 5 mg de extracto seco, se añadió 1 mL de agua destilada, se
tapó y agitó vigorosamente durante 30 segundos, la aparición de espuma durante 2
minutos indicó la presencia de saponinas.

Taninos: Prueba para taninos hidrolizables y condensados

A un tubo de ensayo con 5 mg de extracto seco, se le añadieron 1 mL de agua y dos
gotas de solución acuosa de FeCl3 al 2 %. La aparición de una coloración azul indicó
que se trataba de taninos hidrolizables y una coloración verde la presencia de taninos
condensados.

41
Terpenos-esteroides: Prueba de Liebermann-Buchard
Preparación del reactivo:
 Solución A= colocar 1 mL ácido acético anhídrido en 1 mL de cloroformo.
 Reactivo= Resbalar por la pared 1 gota de ácido sulfúrico a la solución A
(Domínguez, 1988).

A un tubo de ensayo con 5 mg de extracto seco, se le añadió 1 mL de cloroformo

y 1 mL del reactivo de Liebermann-Buchard. La reacción fue positiva para esteroides
si se desarrolló una coloración azul o azul verde o de color rojo, rosa o violeta si eran
terpenos.

Lactonas-sesquiterpénicas: Prueba de Baljet

Preparación del reactivo:
 Solución A= colocar 1 g de ácido pícrico en 100 mL de agua destilada.
 Solución B= 10 g de NaOH en 100 mL de agua destilada.
 Reactivo= solución A + solución B (Domínguez, 1988).

A un tubo con 5 mg de extracto seco, se le agregó 1 ml de etanol y se agitó.

Posteriormente se le añadió 1 mL del reactivo de Baljet. La presencia de una
coloración roja (++) o precipitado de color rojo (+++) indicó una prueba positiva.

Diagrama 3. Identificación de Metabolitos Secundarios.

42
 VI. RESULTADOS

6.1. Registro del material vegetal

La identificación taxonómica de Hojamán (Curatella americana L.) en etapa de

floración fue corroborada por el personal del herbario CHIP de Tuxtla Gutiérrez,
Chiapas. La cual se ingresó a la colección con el número de registro 48824, y la
identificación taxonómica en etapa de floración de Pajón (Salvia longispicata M.),
también fue corroborada en el mismo herbario y anexada a la colección con el número
de registro: 49243.

6.2. Extractos acuosos de Curatella americana y Salvia longispicata

6.2.1. Rendimiento

El rendimiento obtenido en los extractos acuosos para ambas especies fue muy
variado, ya que los extractos acuosos (hojas y tallos) de Salvia longispicata,
presentaron un mayor rendimiento en comparación con los extractos obtenidos de
Curatella americana. En la primera especie, los extractos de hojas, tuvieron un
rendimiento ligeramente mayor a los del tallo (Gráfica 1, Anexo 1).

12 11

10 9.6
Rendimiento (%)

6
4.4
3.8
4

0
hoja tallo hoja tallo
Curatellaamericana
Curatella americanaL. Pajon
Salvia longispicata M.

Gráfica 1. Rendimiento de los extractos acuosos de Curatella americana L. y Salvia longispicata M.

43
6.3. Ensayos de proliferación celular utilizando células de cáncer de
colon Caco2

6.3.1. Cuantificación de células viables con azul de tripán

Las células Caco2 fueron desprendidas del sustrato con tripsina al 5 %. Debido a que
el uso de tripsina puede dañar a las células, es necesario cerciorarse de la viabilidad
celular antes de realizar los ensayos. Para ello, se realizó la cuantificación de estas
utilizando el colorante azul de tripán. Los grupos cargados amino y sulfato de este
colorante le impiden atravesar las membranas celulares a las células viables, por lo
que éstas se observan refringentes, en cambio aquellas células dañadas o muertas
permiten la entrada de éste, tiñéndose de azul (Figura 15). Así, es posible realizar el
conteo de células teñidas y refringentes y su porcentaje. En los ensayos realizados,
siempre se utilizaron cultivos con un porcentaje de viabilidad no menor al 90 %.

100µm 10µm

Figura 15. Línea celular Caco2. A) en cultivo, b) viabilidad y conteo celular con azul de tripán. Objetivo
10x y ocular 10x.

44
6.3.2. Relación entre el número de células viables y su cuantificación con el
reactivo MTT

De acuerdo con Mosmann (1983) para confirmar si las variaciones de las D.O. a 570
nm refleja la incorporación del reactivo 3-(4, 5-dimetil-tiazoil-2-yl) 2,5 bromuro de
difeniltetrazolio (MTT) en diferente número de células vivas, se incubó por tres horas
un número creciente de linfocitos de ratón normal con el reactivo. Los resultados
indicaron una relación lineal entre el número de células (partiendo de 5000 hasta
25000 células por pozo) y la cantidad de MTT incorporado por las deshidrogenasas
mitocondriales y leído como densidades ópticas a 570 nm. Los resultados señalan un
coeficiente de correlación de Pearson (R cuadrada) de 0.91, indicando la utilidad de la
prueba para los ensayos de proliferación realizados (Gráfica 2).

Prueba de viabilidad con MTT

0.9

0.75
Densidades ópticas a 570 nm

0.6
y = 3E-05x + 0.0004
0.45 R² = 0.9108

0.3

0.15

0
0 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000
Numero de células
linfocitos murinos Lineal (linfocitos murinos)

Gráfica 2. Prueba de viabilidad con MTT. Relación entre el número de células viables y la cantidad de
MTT incorporado por las deshidrogenasas mitocondriales y leído a 570 nm.

45
6.4. Efecto de las concentraciones de Curatella americana sobre la
línea neoplásica de colon Caco2

De los extractos acuosos de Curatella americana, el de tallo fue el que inhibió más
eficientemente la proliferación de la línea de cáncer colorrectal Caco2; esta actividad
fue estadísticamente significativa respecto a las células control (p ≤ 0.05), se presentó
en todas las concentraciones utilizadas.

La fuerte actividad del extracto se manifestó en la DI50 (Dosis que inhibe el 50%
de la proliferación celular, también llamada dosis inhibitoria 50) la cual fue inclusive
encontrada en la concentración menor del extracto. El porcentaje de proliferación
permitida por la menor concentración de extracto (7.8 µg/mL) fue de un 49.0% y ésta
disminuyó hasta 10 % en células tratadas con 125 µg/mL; las concentraciones
mayores no permitieron la sobrevivencia celular.

El extracto hecho con las hojas se comportó de diferente manera, pues las
concentraciones menores de 7.8 µg/mL no presentaron ningún efecto. El inicio de la
actividad inhibitoria significativa respecto a las células control (p ≤ 0.05), así como la
DI50 coincidieron en 31.2 µg/mL.

El efecto de inhibición se observó a partir de la concentración de 15.6 µg/mL con

un 88% de proliferación, disminuyendo hasta un 14.9% en la concentración de 62.9
µg/mL; concentraciones mayores de extracto no permitieron la sobrevivencia celular
(Gráfica 3).

Las líneas de tendencia muestran que ambos extractos tienen actividad, pero el
tallo pudiera ser efectivo aún en concentraciones más pequeñas a las analizadas en
este trabajo.

46
 Curatela americana
110

100

90

80
Proliferación celular (%)

70

60

50

40

30

20

10

0
7.8 15.6 31.2 62.5 125 250 500

Concentración (µg/mL)

Tallos
tallo hojas
Hojas Lineal
al (tallo)
(tallos) Lineal (hojas)

Porcentaje de proliferación celular

Concentraciones 7.8 15.6 31.2 62.5 125 250 500
(µg/mL)
Extractos acuosos 49 51.32 41.27 16.19 10.52 0 0
de tallos
Extractos acuosos 100 88 40 14.99 0 0 0
de hojas

Gráfica 3. Efecto de las concentraciones de Curatella americana L. sobre la proliferación celular de

Caco2.

*Los cuadros marcados de color rosa señalan proliferaciones menores o iguales a 50 %.

47
6.5. Efecto de las concentraciones de Salvia longispicata M. sobre la
línea de neoplásica de colon Caco2

De acuerdo con los resultados, la actividad de las hojas y tallo de los extractos acuosos
de Salvia longispicata sobre las células cancerígenas de colon fue moderada con
excepción de las concentraciones altas. Sin embargo debemos mencionar que los
extractos presentaron una coloración verde intensa aún después de ser centrifugados
y filtrados, lo que pudiera estar interfiriendo con la absorción de la luz a 570 nm, o bien
encubriendo los valores reales de la incorporación del reactivo de MTT en las células.
El reactivo de MTT en solución es amarillo y al ser incorporado a las mitocondrias y
leído a 570 nm de acuerdo al método utilizado, se observa como una solución azul
(Figura 16).

La proliferación celular de la línea cancerosa de colon Caco2 se afectó en las

concentraciones menores llegando a ser de 70% y 64.8% en las células expuestas a
15.6 µg/mL de los extractos de tallo y hojas respectivamente. El extracto de hoja a las
concentraciones más altas de 250 y 500 µg/mL nulificó la proliferación celular y el de
tallo a partir de 125 µg/mL. A partir de las líneas de tendencia de los datos, podemos
mencionar que a mayor concentración, mayor inhibición y que la DI50 pudiera situarse
entre 62.5 a 125 µg/mL para el extracto de hojas y entre 125 a 250 µg/mL para el
extracto de tallo. En general se observó una mayor actividad del extracto de hojas en
relación al extracto de tallos (Gráfica 4).

Figura 16. Extractos de Salvia longispicata con reactivo MTT.

48
 Salvia longispicata
110

100

90

80
Proliferación celular (%)

70

60

50

40

30

20

10

0
7.8mg 15.6mg 31.2mg 62.5mg 125mg 250mg 500mg

Concentración (µg/mL)

Tallos
Tallo Hojas al (Tallo)
Lineal (tallos) Lineal (Hojas)

Porcientaje de proliferación celular

Concentraciones
(µg/mL)
7.8 15.6 31.2 62.5 125 250 500
Extractos acuosos
de tallos 72.8 70 87 90.91 82.5 0 0
Extractos acuosos
de hojas 100 64.8 73 81.78 0 0 0

Gráfica 4. Efecto de las concentraciones de Salvia longispicata M. sobre la proliferación celular de

Caco2.

*Los cuadros marcados de color verde, señalan proliferaciones menores a 50 %.

49
6.6. Presencia de metabolitos secundarios en los extractos acuosos
de Curatella americana L.
La identificación de los principales grupos de metabolitos secundarios en los extractos
acuosos de hojas y tallos de Curatella americana, mostró que ambas estructuras
comparten los mismos grupos de compuestos como: fenoles, flavonoides, glucósidos,
saponinas, taninos y lactonas sesquiterpénicas, sin embargo entre ambas estructuras
existen diferencias en su concentración (Gráfica 5, Anexo 2).

Tallos Hojas
Intensidad de reacción

3
+++

++2

+1

Grupos de MS en los extractos

Gráfica 5. Grupos de metabolitos secundarios presentes en hojas y tallos de Curatella americana L.

En general, se observó una baja concentración de flavonoides de tipo flavona y

taninos de tipo condensados en el tallo de C. americana L; Las lactonas-
sesquitepénicas en concentración media, mientras que los fenoles, glucósidos y
saponinas, en concentraciones altas. Por su parte los extractos de hojas exhibieron
flavonoides de tipo flavona, glucósidos, saponinas y lactonas-sesquiterpénicas en
concentración media en tanto que los fenoles y taninos de tipo hidrolizable en
concentraciones altas.

50
6.7. Presencia de metabolitos secundarios en los extractos acuosos
de Salvia longispicata M.
La identificación de los principales grupos de metabolitos secundarios de los extractos
acuosos de hojas y tallos de Salvia longispicata mostró que comparten los mismos
compuestos y en concentración semejante, a excepción de los taninos. En ambos
extractos (hojas y tallo) se identificaron los siguientes metabolitos secundarios:
fenoles, flavonoides, glucósidos, saponinas, taninos y lactonas sesquiterpénicas
(Gráfica 6, Anexo 2).

Tallos Hojas
Intensidad de reacción

+++
3

++2

+1

Grupos de MS en los extractos

Gráfica 6. Grupos de metabolitos secundarios presentes en hojas y tallos de Salvia longispicata M.

La presencia de fenoles, flavonoides, glucósidos y lactonas-sesquiterpénicas se

observó alta en ambas estructuras (tallos y hojas), la de saponinas baja y los taninos
de tipo condensado con intensidad media en el tallo y alta en las hojas. Los flavonoides
en el tallo mostraron ser de tipo flavonona, y en las hojas de tipo flavona.

51
 VII. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS

Se han descrito alrededor de 50,000 metabolitos secundarios en las plantas y es

posible que este número con una gran variedad de estructuras, pudiera ser mucho
mayor. Dado que estas moléculas son activas sobre diversos sistemas biológicos han
sido utilizadas en diversas áreas de la salud. En el área oncológica, uno de los mayores
retos en la lucha contra el cáncer es la búsqueda de nuevas moléculas que actúen
sobre los tumores y que no produzcan efectos adversos en los pacientes (Anaya y
Espinosa-García, 2006).

Desde el siglo XVI, Fransisco Hernández reportó a Salvia longispicata con usos
medicinales en tanto que Argueta et al. (1994) menciona que Curatella americana y
diversas especies de Salvia son utilizadas por pobladores de diversas regiones de
México. Es interesante que estas plantas de origen americano estén dentro de la
farmacopea tradicional y que sean usadas en el mantenimiento de la salud o su
complemento.

En el presente trabajo, se decidió trabajar con los extractos acuosos de las

plantas debido a que las formas habituales en las que son utilizadas por las
poblaciones humanas es por ingestión preparándolas por infusión o por decocción en
agua, a fin de disolver las sustancias activas (Argueta et al., 1994).

El rendimiento de los extractos acuosos fue variable, pero en general Salvia

longispicata duplicó el valor en gramos al obtenido en Curatella americana (Gráfica 1).
Esto pudiera explicarse por la diferente dureza de las partes empleadas. Curatella
americana es un árbol con hojas gruesas en tanto que Salvia longispicata es un
arbusto pequeño con hojas delgadas lo que pudiera facilitar la disolución de los
compuestos.

En C. americana los metabolitos secundarios variaron de tallo y hoja, lo cual

pudiera ser indicativo de su síntesis diferencial en las estructuras o bien en su
transporte (Anaya y Espinosa-García, 2006); los encontrados en mayor cantidad
fueron en tallo: los fenoles, glucósidos, saponinas y en menor concentración lactonas
sesquiterpénicas, flavonoides y taninos. En hojas corresponden en mayor cantidad de

52
metabolitos a fenoles y taninos, en tanto que en menor concentración se encontraron:
flavonoides, glucósidos, saponinas y lactonas sequiterpénicas (Gráfica 5). El-Azizi et
al., 1980 reportaron en extractos etanólicos de hojas la presencia de flavonoides,
terpenos y compuestos fenólicos como taninos, lo que corresponde a nuestros
resultados, a excepción de los terpenos. Hiruma-Lima et al. (2009) reportaron
proantocianidinas oligoméricas con probable efecto gastoprotector; las
proantocianidinas son llamadas también "taninos condensados" siendo abundantes en
las uvas y arándanos además que han sido relacionados con actividades antioxidantes
y anticancerígenas (Khtar et al., 2009).

De los extractos acuosos de Curatella americana, el obtenido de tallos fue el que

inhibió más eficientemente la proliferación de la línea de cáncer colorrectal Caco2; esta
actividad estadísticamente significativa respecto a las células control (p ≤ 0.05), se
presentó desde 7.8 µg/mL y continuó hasta en las concentraciones más altas; la
actividad de las hojas se observó desde 31.2 µg/mL hasta las concentraciones
mayores (Gráfica 3). Estos resultados podrían asociarse a la alta actividad reportada
contra el radical superóxido en los extractos de tallo de esta especie (Ospina et al.,
2005), además que algunos compuestos como el triterpeno acetato de lupeol de C.
americana han mostrado actividad citotóxica sobre diversas líneas cancerosas
humanas a concentración de 20.0 µg/mL (Tellez et al., 2004).

La molécula de ADN es uno de los principales blancos del ataque por radicales
libres (superóxido, hidroxilo y peróxido de hidrógeno) que pueden producir mutaciones
y llevar a la célula a un estado de proliferación incontrolada, ante ello, las moléculas
antioxidantes se han vislumbrado como una opción en la prevención del cáncer
(Zorrilla-García et al., 2004). Si C. americana ha mostrado una actividad captadora de
radicales libres oxigenados y con actividad citotóxica contra células cancerosas, sería
importante iniciar trabajos con el fin de identificar a mayor detalle las moléculas
responsables de dicha actividad tanto para la prevención como para el tratamiento del
cáncer.

El género Salvia comprende entre 700 y 900 especies de arbustos, herbáceas

perennes y anuales, distribuidas especialmente en el viejo y nuevo continente. Su

53
uso ha sido ornamental, medicinal y gastronómico (Clebsch, 2003).

Argueta et al., (1994) en el Atlas de Medicina tradicional Mexicana, menciona

varias especies de salvia con uso antidiarreico y antivomitiva, diurética,
hipoglucemiante y para la esterilidad femenina. La semilla de chía (Salvia hispanica)
se ha utilizado desde las civilizaciones precolombinas en la elaboración de
medicamentos, compuestos nutricionales e incluso pinturas y recientemente ha
llamado la atención por su alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados como
omega 3, antioxidantes y fitoesteroles (Bautista-Justo et al., 2007).

Aunque Francisco Hernández en el siglo XVI en la Historia de las plantas de

nueva España comenta el uso de Salvia longispicata como excitante y sudorífico,
pocos estudios sobre ella se ha hecho a la fecha.

En el presente estudio se identificó seis de los ocho grupos de MS en los

extractos acuosos de hojas y tallos de Salvia longispicata: fenoles, flavonoides,
glucósidos, saponinas, taninos y lactonas sesquiterpénicas en cantidades semejantes,
con excepción de una mayor cantidad de taninos en las hojas (Gráfica 6). A pesar de
que existen reportes de la actividad anticáncer de abietanos diterpénicos en diferentes
especies de Salvia (San Feliciano et al., 1993), no se logró identificar terpenos en
nuestros extractos. Dado que muchos terpenos son el principal constituyente de los
aceites esenciales, es posible que con el método de extracción acuoso utilizado, no se
hayan solubilizado en cantidades necesarias para su detección por el método utilizado.

De acuerdo con los resultados obtenidos, los extractos acuosos de las hojas y
tallo de Salvia longispicata presentaron una actividad moderada sobre la proliferación
celular de las células cancerígenas Caco2, con excepción de las más altas que no
permitieron su sobrevivencia (Gráfica 4). Aunque las líneas de tendencia de la
actividad pudieran señalar una posible actividad, será necesario profundizar en estos
trabajos o buscar un aclarado de los extractos sin modificar los compuestos presentes
en ella. Si bien el rendimiento de los extractos acuosos de Salvia longispicata fue
mayor al doble que en Curatella americana, la presencia alta de algunos pigmentos
pudieran estar interfiriendo con la detección de su actividad antiproliferativa.

54
 VIII. CONCLUSIONES

 Los extractos acuosos de hojas y tallos de Salvia longispicata presentaron un

mayor rendimiento que los de Curatella americana.

 Los metabolitos secundarios extraídos por decocción de hojas y tallos de Salvia

longispicata son manera cualitativa más abundantes que los extraídos de igual
manera de Curatella americana.

 Los extractos acuosos de Curatella americana, inhiben significativamente la

proliferación de la línea de cáncer colorectal Caco2 en concentraciones desde
7.8 µg/mL en tallo y de 31.2 µg/mL en hojas.

 Los extractos acuosos de Salvia longispicata tienen actividad de moderada a

leve sobre la proliferación de la línea de cáncer colorectal Caco2.

 La DI50 (Dosis inhibitoria 50) de los extractos de C. americana, en hojas se

localizó entre 15.6 a 31.2 µg/mL y en tallo desde 7.8 µg/mL.

 La DI50 (Dosis inhibitoria 50) de los extractos de Salvia longispicata, en hojas

puede estar entre 62.5 µg/mL y 125 µg/mL y en tallo entre 125 µg/mL y 250
µg/mL.

 Para ambas especies, en hojas y tallo se identificaron seis de los ocho grupos
de MS: fenoles, flavonoides, glucósidos, saponina, tanino y lactonas
sesquiterpénicas.

55
 IX. PERSPECTIVA DEL TRABAJO

Sería conveniente poder profundizar los resultados con Curatella americana con los
siguientes estudios, entre otros:

 Conocimiento a mayor profundidad de los metabolitos secundarios que se

encuentran en los extractos e identificar cual o cuales sería las moléculas
activas que están produciendo la actividad inhibitoria de la proliferación en la
línea neoplásica Caco2.
 Se puede intentar extractos con otros solventes orgánicos como formol, etanol
o hexano y buscar un mayor rendimiento de los metabolitos.
 Conocer in vitro e in vivo la actividad por los extractos de C. americana en
diferentes líneas neoplásicas humanas.
 Puede ser interesante conocer en qué etapa de la vida de la planta se producen
en mayor cantidad los metabolitos activos o inclusive buscarlos en la raíz, frutos
semillas, etc.

En el caso se Salvia longispicata se necesitan más pruebas para determinar su

actividad sobre la proliferación celular de Caco2, ya que las intensidades que se
obtuvieron pueden estar interfiriendo en el conteo o lectura de las células por lo que:

 Es necesario realizar métodos de separación de metabolitos secundarios e

identificar en qué grupo es más eficiente la inhibición de la proliferación celular
de la línea neoplásica Caco2 u otras.
 Dado su reporte por Hernández en el siglo XVI como excitante y sudorífico y
con nulos estudios posteriores, es necesario salvar su uso por las comunidades
y rescatar su conservación, a través de la importancia y utilidad de esta especie.

56
 X. LITERATURA CITADA

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63
 XI. ANEXOS
Anexo 1. Rendimiento de los extractos acuosos.
Material Cantidad Rendimiento
Especie Estructura vegetal obtenida (%)
(g) (g)
Curatella americana Hoja 1.9 3.8
Tallo 2.2 4.4
Salvia longispicata Hoja 50 5.5 11
Tallo 4.2 9.6

Anexo 2. Grupos de metabolitos secundarios presentes en las diferentes estructuras

de Curatella americana L. y Salvia longispicata M.

Curatella americana L. Salvia longispicata M.

Grupos de metabolitos
Tallo Hojas Tallo Hojas
secundarios
Alcaloides - - - -
Fenoles + + + +
Flavona + + - +
Flavonoides
Flavonona - - + -
Glucósidos + + + +
Lactonas-sesquiterpénicas + + + +
Saponinas + + + +
Condensados + - + +
Taninos
Hidrolizables - + - -
Terpenos – Esteroides - - - -
Total (+) 6 6 6 6
Presencia (+); Ausencia (-)

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Anexo 3. Resultados de la prueba con el reactivo Dragendorff para identificar fenoles.

Curatella americana L. Salvia longispicata M.

Anexo 4. Resultados de la prueba de Shinoda para identificar flavonoides.

Curatella americana L. Salvia longispicata M.

65
Anexo 5. Resultados de la prueba de Molish para identificar glucósidos.

Curatella americana L. Salvia longispicata M.

Anexo 6. Resultados de la prueba de Baltej para identificar lactonas-sesquiterpénicas.

Curatella americana L. Salvia longispicata M.

66
Anexo 7. Resultados de la prueba de espuma para identificar saponinas.

Curatella americana L. Salvia longispicata M

Anexo 8. Resultados de la prueba para la identificación de taninos hidrolizables y

condensados.

Curatella americana L. Salvia longispicata M.

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