Tesis - RolandoMendez 2019

CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN QUÍMICA APLICADA
PROGRAMA DE POSGRADO EN AGROPLASTICULTURA
Tesis
Efectividad antibacterial in vitro e in vivo de nanopartículas de plata

biosintetizadas a partir de extractos de Larrea tridentata contra Clavibacter
michiganensis en plantas de Solanum Lycopersicum
PRESENTA
Rolando Méndez Andrade
Para obtener el grado de:
MAESTRO EN CIENCIAS EN AGROPLASTICULTURA
Asesor: Dra. Ileana Vera Reyes
Co-asesor: Dr. Luis Alfonso García Cerda
Saltillo, Coahuila, Octubre 2019-

Dedicatoria
A mis padres, que me dieron la vida, además por el apoyo incondicional a pesar
de las adversidades que hemos pasado como familia a que no simplemente nos
debilita, sino, por lo contrario que nos fortalece más y seguir luchando en la vida.
A mis hermanos, por su comprensión y tolerancia, por ser excelentes personas,

que hay que seguir luchando por lo que realmente se quiere y no dejarlo a la
deriva.
A mis compañeros, que durante estos dos años convivimos y compartimos

excelentes momentos de conocimiento
A todos aquellos que han aportado a mi conocimiento

Agradecimientos
Al CONACYT por la beca 636630 otorgada para realizar mis estudios de posgrado
Al CIQA por permitirme estudiar el posgrado y las instalaciones para realizar el

presente trabajo de tesis.
Al proyecto interno de CIQA 6385, titulado: Biosíntesis de nanopartículas obtenidas

de extractos de plantas de las zonas áridas del norte de México para su uso en la
agricultura.
A la Dra. Ileana Vera Reyes quien me dio la oportunidad de ser parte de su equipo
de trabajo, por su apoyo y asesoría, quien siempre estuvo atenta a los que se estaba
realizando durante mi estancia en CIQA
Al Dr. Luis Alfonso García Cerda quien participo como Co-asesor de este trabajo de
investigación, por su apoyo y asesoría durante mi estancia en CIQA
Al Dr. R. Hugo Lira Saldívar, Dr. José Humberto Valenzuela y a la Dra. Ana
Margarita Rodríguez Hernández, por formar parte de los sinodales y brindar sus
puntos de vista a este trabajo de investigación.
A la Q.F.B. Bertha Alicia Puente Urbina quien me asesoro durante mi estancia en el

laboratorio de síntesis de nanomateriales.
A la Dra. Norma A. Ruiz Torres quien me dio la oportunidad de trabajar en el

laboratorio de Tecnología de Semillas de la Universidad Autónoma Antonio Narro.
Al Dr. Jorge Arturo Cañas Montoya de la Universidad Autónoma de Coahuila por su

ayuda en la toma de imágenes en microscopia electrónica de barrido (SEM)
A la Dra. Yolanda Ortega Ortega quien por su apoyo técnico durante mi estancia en
el laboratorio de Agrobiotecnología y Microbiología.
Al Ing. Felipe Hernández Castillo por ayuda y facilitación de herramienta en las

actividades en campo
Índice
Índice de figuras ..................................................................................................... III
Índice de cuadros ................................................................................................... VI
Abreviaturas .......................................................................................................... VII
Resumen ................................................................................................................ IX
Abstract ................................................................................................................... X
I. Introducción ...................................................................................................... 1
I.1 Producción de tomate en México ............................................................... 1
I.2 Clavibacter michiganensis.......................................................................... 2
I.3 Nanotecnología .......................................................................................... 3
I.3.1 Aplicación de nanopartículas en la agricultura ........................................ 4

I.4 Nanopartículas de plata ............................................................................. 5
I.5 Síntesis de nanopartículas ......................................................................... 6
I.5.1 Síntesis de nanopartículas usando extractos de plantas ........................ 8

I.5.2 Metabolitos secundarios como agentes reductores de nanopartículas . 10
I.6 Larrea tridentata ....................................................................................... 11
I.6.1 Propiedades antimicrobianas de Larrea tridentata ................................ 12

I.7 Mecanismos de acción antibacterial de las nanopartículas de plata ........ 13
II. Hipótesis ......................................................................................................... 17

III. Objetivos ..................................................................................................... 17
III.1 Objetivo general ....................................................................................... 17
III.2 Objetivos específicos ............................................................................... 17
IV. Materiales y métodos .................................................................................. 18

IV.1 Material vegetal ........................................................................................ 18
IV.2 Preparación del extracto .......................................................................... 18
IV.3 Caracterización del extracto ..................................................................... 19
IV.3.1 Cuantificación de fenoles ................................................................... 19
I
IV.3.2 Cuantificación de flavonoides ............................................................ 19
IV.3.3 Presencia de taninos ......................................................................... 20
IV.3.4 Cuantificación de clorofila total .......................................................... 20
IV.3.5 Extracción y purificación de compuestos del extracto ....................... 20
IV.3.6 Cromatografía capa fina .................................................................... 21
IV.4 Biosíntesis de las nanopartículas ............................................................. 22
IV.5 Caracterización de las nanopartículas ..................................................... 23
IV.6 Antagonismo in vitro contra Clavibacter michiganensis ........................... 24
IV.7 Análisis de muestras biológicas en microscopía electrónica de barrido ... 25
IV.8 Antagonismo in vivo contra C. michiganensis .......................................... 26
IV.8.1 Evaluación de incidencia y severidad de C. michiganensis en plantas

de Solanum lycopersicum ............................................................................... 28
IV.8.2 Evaluación del crecimiento de C. michiganensis en plantas de
tomate… ......................................................................................................... 29
IV.8.3 Medición de variables fisiológicas...................................................... 30
V. Resultados y discusión ................................................................................... 31
V.1 Biosíntesis de las nanopartículas ............................................................. 31
V.2 Extracción y cuantificación de compuestos reductores ............................ 36
V.3 Cinética de crecimiento de Clavibacter michiganensis............................. 44
V.4 Antagonismo in vitro de las NPs Ag ......................................................... 45
V.5 Evaluación del potencial antibacteriano de nanopartículas de Ag contra C.

michiganensis en plantas de tomate .................................................................. 50
V.6 Evaluación del crecimiento bacteriano en tejido de Solanum lycopersicum

……………………………………………………………………………………53
VI. Conclusiones ............................................................................................... 61

VI.1 Perspectivas............................................................................................. 62
VII. Referencias ................................................................................................. 63

VIII. Anexos ........................................................................................................ 76
II
Índice de figuras
Figura 1.- Mecanismo propuesto de la participación de los fenoles en la reducción

de los iones de plata, liberación de átomo de hidrógeno por el grupo hidroxilo
participante. (Tomada de Ahmad et al., 2010). ............................................. 11
Figura 2.- Posible mecanismo de acción antibacterial de las NPs Ag. 1) Atracción
electroestática, 2) Producción de radicales libres, 3) Modificación de proteínas,
4) Interacción con grupo sulfhidrilo, 5) Interacción con moléculas que contienen
fósforo (Tomado de: Durán et al., 2016). ...................................................... 14
Figura 3.- Espectros de UV- Vis obtenidos durante la reacción de la formación de

NPs Ag a diferentes concentración de extracto de Larrea tridentata:AgNO3.31
Figura 4.- Patrones de difracción de rayos X, muestras a concentraciones 1:1, 1:2 y

1:5 (extracto:AgNO3) a diferentes temperaturas: A) 4 °C, B) 10 °C, C) 25 °C y
D) Concentración 1:5 a 25 y 80 °C. .............................................................. 33
Figura 5.- Micrografía de TEM e histograma de distribución de tamaños de partícula

de NPs Ag obtenidas con una relación de extracto:AgNO3 de 1:5 a la
temperatura de: A) 25 °C y B) 80 °C. ............................................................ 35
Figura 6.- Presencia de taninos en el extracto acuoso de Larrea tridentata por medio
de colorimetría a verde oscuro...................................................................... 36
Figura 7.- Biosíntesis de nanopartículas de plata, utilizando tres fracciones del

extracto de Larrea triedentata; A) Azúcares y carbohidratos, B) Polifenoles, C)
Antocianinas. ................................................................................................ 38
Figura 8.- Patrones de difracción de rayos X de las nanopartículas obtenidas usando

las fracciones de carbohidratos, polifenoles y antocianinas del extracto acuoso
de Larrea tridentata....................................................................................... 39
Figura 9.- Separación de los compuestos polifenólicos del extracto de Larrea

tridentata obtenidos de fracciones de acetato de etilo mediante cromatografía
III
en capa fina. A) ácido clorogénico, B) ácido gálico, C) ácido protocatéquico y
D) siringaldehído. Referencia a la banda 1.- Flavona, 2.- Ácido ferulico, 3.-
Siringaldehído, 4.- Ácido protocatéquico, 5.- Ácido trans-cinámico, 6.- Ácido
clorogénico, 7.- Ácido gálico, 8.- Catequina, 9.- Fracción acetato de etilo y 10.-
Fracción de antocianinas. ............................................................................. 40
Figura 10.- Cromatografía liquidad de alta eficiencia. A) Fracción de polifenoles del

extracto de Larrea tridentata; B) Estándares. ............................................... 41
Figura 11.- Estructura química del ácido nordihidroguaiarético............................. 41
Figura 12.- Espectro de infrarrojo de transformada de Fourier obtenidos de: A)

Extracto acuoso de Larrea. tridentata; B) NPs Ag biosintetizadas. ............... 43
Figura 13.- Cinética de crecimiento de Clavibacter michiganensis en medio de

cultivo LB. ..................................................................................................... 44
Figura 14.- Antagonismo in vitro contra Clavibacter michiganensis. A) comparación

del antagonismo con NPs Ag; B) extracto acuoso liofilizado de Larrea tridentata
y C) bactericida químico Cuprimicín 100 Hyper. ........................................... 45
Figura 15.- Micrografía de C. michiganensis crecida en medio de cultivo Luria

Bertani (LB). A) sin tratamiento; B) Medio de cultivo adicionado con 2.015 mg
L-1 de nanopartículas de plata; C) Medio de cultivo adicionado con 9.331 mg
L-1 de nanopartículas de plata....................................................................... 49
Figura 16.- Descripción de los diferentes tratamientos para evaluar el efecto

antibacteriano de las nanopartículas de plata contra Clavibacter michiganensis
en plantas de tomate. ................................................................................... 51
Figura 17.- A) Hoja de planta sana; B) Hoja de planta infectada con Clavibacter.
michiganensis. .............................................................................................. 51
Figura 18.- Incidencia de la enfermedad cancro bacteriano en plantas de tomate

inoculadas con Clavibacter michiganensis y tratadas con nanopartículas de
plata y un producto comercial cuprimicín 100 Hyper. (Análisis de varianza
(ANVA) comparación de medias prueba SLD Fisher (p < 0.05), letras diferentes
muestran diferencia significativa entre tratamiento). ..................................... 52
IV
Figura 19.- Efecto de los tratamientos en el índice de severidad de los síntomas de
la enfermedad causada por Clavibacter michiganensis. (Análisis de varianza
muestran diferencia significativa entre tratamiento). ..................................... 53
Figura 20.- Incremento de Clavibacter michiganensis en el tejido de plantas de

tomate infectadas; A) Plantas control; B) Plantas asperjadas con soluciones
de NPs Ag y C) Plantas de semillas imbibidas y asperjadas con NPs Ag.
(Análisis de varianza (ANVA) comparación de medias prueba SLD Fisher (p <
0.05).............................................................................................................. 54
Figura 21.- Desarrollo radicular de plantas de tomate infectadas con C.

michiganensis y tratadas con diferentes concentraciones de nanopartículas de
plata. ............................................................................................................. 59
V
Índice de cuadros
Cuadro 1.- Ejemplos de algunos extractos de plantas utilizados para la síntesis de

nanopartículas de Ag ...................................................................................... 9
Cuadro 2.- Principales compuestos fitoquímicos de Larrea tridentata .................. 12
Cuadro 3.- Evaluación de variables morfológicas de las plantas de tomate bajo

diferentes tratamientos 42 días después de la infección .............................. 58
VI
Abreviaturas
CA (clorofila A)
CB (clorofila B)
CB (contenido de biomasa)
CBM (concentración mínima bactericida)
CMI (concentración mínima inhibitoria)
CPD (secado de punto crítico)
ddi (días después de infección)
dds (días después de siembra)
DRX (difracción de rayos X)
ERO (especies reactivas de oxígeno)
FT-IR (espectroscopia infrarroja trasformada de Fourier)
HR (humedad relativa)
ICDD (Centro internacional de Datos de Difracción)
ISTA (Asociación Internacional de Evaluación de semillas)
LMP (longitud media de plúmula)
LMR (longitud media de raíz)
msnm (metros sobre el nivel del mar)
NMs (nanomateriales)
NPs (nanopartículas)
NPs Ag (nanopartículas de plata)
NPs AgCl (nanopartículas de cloruro de plata)
NPs CuO (nanopartículas de óxido de cobre)
NPs MgO (nanopartículas de óxido de cobre)
NPsCm (Plantas obtenidas de semillas embebidas en solución de 18.66 mg L -1 de
NPs Ag, infectadas con la bacteria, las plantas de estas semillas se
asperjaron semanalmente con agua destilada estéril)
NPsCm25 (Plantas obtenidas de semillas embebidas en solución de 18.66 mg L-1
de NPs Ag, infectadas con la bacteria, las plantas de estas semillas se
VII
asperjaron semanalmente con la solución de NPs Ag a una concentración de
25 mg L-1)
NPsCm50 (Plantas obtenidas de semillas embebidas en solución de 18.66 mg L -1
de NPs Ag, infectadas con la bacteria, las plantas de estas semillas se
asperjaron semanalmente con la solución de NPs Ag a una concentración de
50 mg L-1)
NT (nanotecnología)
PA (plántulas normales).
ROS (especies reactivas al oxigeno).
SSTCm25 (plantas de semillas imbibidas con agua, infectadas con la bacteria,
asperjadas semanalmente con la solución de NPs Ag 25 mg L -1).
SSTCm50 (plantas de semillas imbibidas con agua, infectadas con la bacteria,
asperjadas semanalmente con la solución de NPs Ag 50 mg L -1).
VIII
Resumen
En el presente trabajo se utilizó extracto acuoso de Larrea tridentata para la

síntesis de nanopartículas de plata (NPs Ag). El extracto contenía como
componente principal ácido nordihidroguaiayarético (NDGA) y otros compuestos
fenólicos como ácido clorogénico, ácido protocatéquico, ácido gálico, siringaldehído
y flavonoides, los cuales en conjunto intervinieron en la formación y estabilización
de las NPs Ag. La formación de NPs Ag se validó mediante difracción de rayos X
(DRX) y microscopia electrónica de transmisión, habiendo determinado que las NPs
Ag presentaron una estructura cubica y una morfología semiesférica con tamaños
entre 2-26 nm. Por otra parte, se evidenció el poder bactericida de las NPs Ag contra
C. michiganensis al exhibir una CMI a 2.015 mg L-1 y una CMB a 50 mg L-1. Se
realizaron pruebas de germinación estándar en semillas de tomate evaluando el
efecto de NPs Ag, las cuales demostraron tener efectos positivos, ya que
incrementaron su porcentaje de germinación, dando como resultado plántulas con
mejor desarrollo radicular y mayor contenido de biomasa a 18.66 mg L -1. Las NPs
Ag sintetizadas fueron capaces de disminuir la incidencia a un 20 % y la severidad
de la enfermedad causada por C. michiganensis en 23 ± 1.91 % en plantas de
tomate con respecto a plantas infectadas sin tratamiento, cuando estas fueron
asperjadas a una concentración de 50 mg L-1. Además de disminuir hasta en 99.99
% el crecimiento bacteriano en tejido, reduciendo los síntomas de marchitamiento,
presentando bajos índices de severidad de la enfermedad causada por esta
bacteria.
IX
Abstract
In this work a simple chemical reaction for the synthesis of silver nanoparticles
(AgNPs) from Larrea tridentata has been developed. Silver nitrate was used as the
metal precursor and the plant extract as a reducing agent. Fourier transform infrared
spectroscopy has confirmed the involvement of functional groups of bio-compounds
in the capping and stabilization of the silver nanoparticles which further has been
supported by quantitative phytochemical analysis of leaf extract. Phytochemical
screening confirmed the involvement of nordihydroguaiayretic acid (NDGA) and
other phenolic compounds such as chlorogenic acid, protocacheic acid, gallic acid,
syringaldehyde, and flavonoids. Transmission electron microscopy (TEM) and X-ray
diffraction (DRX) were used to characterize the nanoparticles obtained from L.
tridentata. Semispherical AgNPs with sizes between 2- 26 nm were obtained. The
XRD analysis confirmed the formation of metallic silver with traces of AgCl. In
addition, the obtained AgNPs has the potential for agronomic applications. The MIC
of AgNPs against C. michiganensis was 2.015 mg L-1 and MBC was 50 mg L-1, these
values were significantly lower than commercial bactericidal (p < 0.05). The results
showed that application of AgNPs was effective in reducing the severity of C.
michiganensis. In AgNPs-treated plants reduction in disease severity (23 ± 1.91 %)
was correlated with lower bacterial growth in leaf tissue (up to 99 %) during the time
of infection. Standard germination tests were carried out under tomato seeds under
the effect of AgNPs, showing an increase of germination percentage and seedling
vigor in all doses assayed
X
I. Introducción
I.1 Producción de tomate en México
La producción de tomate (Solanum lycopersicum) en México entre los años

2005 y 2015 creció a una tasa promedio anual de 3.3 %, ubicándose en 3.1 millones
de toneladas anuales, teniendo hasta el año 2015 una superficie de 50,596 ha
sembradas. En ese mismo año el tomate fue el producto de mayor importancia en
el valor de las exportaciones agropecuarias mexicanas (FIRA, 2016). Para el 2017
la producción de tomate fue de 4.02 millones de toneladas con una superficie de
92,993 ha sembradas y rendimiento de 4.56 ton/ha (FAO, 2019), ocupando una
producción del 21.8 % de las hortalizas cultivadas en México (SIAP, 2017). Hoy en
día la productividad de tomate por unidad de superficie continúa creciendo en
condiciones de agricultura protegida, pero no en campo abierto debido a los
problemas de enfermedades fungosas, bacterianas y por plagas de insectos
vectores de virus.
Desafortunadamente la producción de tomate se está viendo afectada por el

cancro bacteriano, el cual es una enfermedad causado por C. michiganensis, que
puede ocasionar pérdidas que van desde el 70 % hasta la pérdida total del cultivo
(FIRA, 2016), siendo una de las principales limitantes en las zonas productoras de
tomate del mundo, esta enfermedad se considera una de las más devastadoras en
este tipo de cultivo y de gran importancia económica (Nandi et al., 2016; Flores et
al., 2009), llegando a causar daños tanto en campo abierto como en invernaderos.
Los efectos más severos se presentan en invernadero dónde su principal

fuente de infección es la propagación por medio de semillas infectadas, trasplantes
de plántulas de tomate infectado de forma latente y restos de la planta localizada en
el suelo (Kawaguchi et al., 2010). Esta bacteria puede permanecer en residuos de
cosecha hasta por más de dos años, en el suelo de 3 a 4 semanas, en la semilla
contaminada hasta por 5 años, en algunas plantas hospederas del género Solanum,
1
en invernaderos con superficie de cemento y plástico al menos un mes y en sustrato
hasta un año (Infoagro, 2017).
I.2 Clavibacter michiganensis
Clavibacter michiganensis es una bacteria Gram-positiva estrictamente

aeróbica, no produce endosporas, causa infección sistémica, dentro del tejido
vascular y superficial en la planta de tomate (Nandi et al., 2018; EPPO, 2016). Los
síntomas de las plantas infectadas muestran clorosis, amarillamiento y presencia de
cancros en el tallo, provocando el marchitamiento (SIAP, 2014), una vez que la
bacteria penetra al tejido vascular a través de heridas, estomas, tricomas e hidátidos
de la hoja ocasiona un marchitamiento marginal en los foliolos presentando uno de
los primeros síntomas en la planta, posteriormente aparecen estrías necróticas que
se extienden desde el pecíolo hasta unirse con el tallo, por eso se considera que
esta bacteria es un invasor sistémico de tejidos de floema, medula y corteza de la
planta, al final la planta se llena de cancro bacteriano y se marchita, adquiriendo un
color castaño (Nandi et al., 2018; Flores et al., 2009). El parénquima vascular en
particular presenta un aspecto harinoso blanco, esto como resultado de la
degradación bacteriana y la producción de exudados (EPPO, 2016).
Nandi et al. (2018), consideran que C. michiganensis desarrolla dos tipos de

infecciones en plantas de tomate, la primera infección sistémica o también llamada
infección primaria cuando las plantas se infectan en etapas tempranas de su ciclo
de vida (semillas infectadas o en plántulas jóvenes) afectando la calidad y
rendimiento de los frutos, conduciendo a la muerte de la planta. La segunda
infección foliar o infecciones secundarias consiste en plantas en etapa fisiológica de
producción y cosecha causando clorosis en las hojas sin afectar la calidad y
rendimiento del cultivo. Se desarrolla a un temperatura optima de 26 °C,
presentando un rango de infección de 2 a 34 °C y una humedad relativa mayor al
80 %, generando pérdidas entre 20 a 100 toneladas por ha (SIAP, 2014).
2
Actualmente se han utilizado productos químicos contra C. michiganensis para
su prevención y control, como Kasuminin (8 % kasugamicina) (500 mg L-1),
estreptomicina (100 mg L-1), Antibak RZ (21 ml L-1), Param (1.5 ml L-1), Orthopol (5
ml L-1), Betanol (50 % 8-hidroxiquinolina) (1 ml L-1) mancozeb y acibenzolar-s-metil
(De León et al., 2008; Khot et al., 2012). Asimismo, Kasselack et al. (2011)
reportaron que el nitrito acidificado tiene la actividad de desinfectar semillas
contaminadas con C. michiganensis, y que el hidróxido de cobre (3 g L-1) controla
esta enfermedad, pero son productos preventivos mas no la erradica por completo.
Para controlar este tipo de pérdidas se han llevado a cabo prácticas agrícolas
derivadas de la revolución verde, las cuales conllevan un uso excesivo de químicos
para la mejorar la producción de alimentos, ya sean fertilizantes o pesticidas, los
cuales se sabe que aumentan sus rendimientos, pero disminuyen la calidad de los
alimentos, la fertilidad del suelo, afectan la salud humana y contaminan los
ecosistemas (Athanassiou et al., 2018). Por lo anterior surge la necesidad de
mejorar las prácticas agrícolas convencionales usando tecnologías avanzadas
como la nanotecnología para apoyo de la agricultura sostenible.
I.3 Nanotecnología
La nanotecnología (NT) es un área de la investigación que se ocupa de la

síntesis y la manipulación de partículas (u otros materiales) con tamaños de 1 a 100
nm. Las aplicaciones de este tipo de nanomateriales (NMs) están creciendo
rápidamente en varios frentes, debido a sus nuevas propiedades mejoradas en
función de su tamaño, distribución y morfología (Ahmed et al., 2016b). Una de sus
aplicaciones es preparar materiales con la propiedad de controlar diversas
enfermedades e infecciones causadas por microrganismos patógenos (Tahir et al.,
2016).
El desarrollo de la NT y la biotecnología han tomado importancia

significativamente en el dominio de aplicación de NMs en el desarrollo de la
agricultura (Khot et al., 2012), la integración de estas dos ciencias conllevan al
3
concepto de bionanotecnología para desarrollar procesos biosintéticos y
respetuosos con el medio ambiente para la síntesis de NMs (Rai et al., 2009;
Logeswari et al., 2015). La bio-nanotecnología es considerada como una de las
próximas ramas de la NT en las que las fuentes biológicas se pueden usar de
manera efectiva para la síntesis de una gran cantidad de nanopartículas (NPs) con
diferentes formas y tamaños (Prasad et al., 2018). Los avances en su fabricación
conlleva a crear propiedades únicas dirigidas a aplicaciones específicas como
agentes de protección y producción de alimentos en el sector agrícola (Khot et al.,
2012).
I.3.1 Aplicación de nanopartículas en la agricultura
El uso de nano-formulaciones, nano-encapsulados y nano-materiales

funcionalizados son la próxima generación de fertilizantes y pesticidas, los cuales
permiten una entrega controlada de ingredientes activos en el lugar y momento
correcto y reducir la acción de agentes externos que conducen a pérdidas de
degradación, lixiviación, escorrentía y volatilización (Chhipa, 2017; Pérez-de-Luque,
2017; Khot et al., 2012), además otro efecto benéfico sería reducir en la cantidad de
productos químico activos incorporados a las plantas y los suelos, lo que conlleva a
una reducción del impacto negativo hacia el medio ambiente (Pérez-de-Luque,
2017). La nano-formulación de pesticidas convencionales con polímeros o con NPs
metálicas es un área altamente demanda por la industria.
Entre todas las NPs, el uso de NMs metálicos tienen una amplia área de
aplicaciones debido a sus características fisicoquímicas que influyen en sus
propiedades ópticas, catalíticas, electrónicas, magnéticas y antibacterianas
(Anandalakshmi et al., 2016), ofreciendo biodisponibilidad mejorada a una mayor
solubilidad y permeabilidad utilizando pequeñas dosis de liberación lenta ofreciendo
una entrega dirigida al caso de estudio en comparación con los productos químicos
sintéticos, en la protección de cultivos contra organismo fitopatógenos (Haq y Ijaz,
2019). La agricultura puede beneficiarse del desarrollo de NMs más eficientes
contra factores que puedan afectar la producción, con nuevas técnicas para su
4
manipulación genética, y mayor eficiencia en el ámbito fitosanitario (Fraceto et al.,
2016; Pérez-de-Luque y Hermosín, 2013). Siendo las NPs Ag las que tiene un gran
potencial al ser un agente de amplio espectro de acción contra fitopatógenos como
Botrytis cinerea, Fusarium culmorum, Trichoderma sp. y Rhizoctonia solani entre
otras (Chhipa, 2017; Paret et al., 2013; Sharon, 2010). Por lo que las NPs tienen un
gran potencial para utilizarse en la protección de cultivos agrícolas (Mishra et al.,
2017).
I.4 Nanopartículas de plata
Está bien documentado que las NPs Ag muestran una alta eficiencia
bactericida contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (Zhang et al., 2016;
Tran et al., 2013), incluyendo cepas altamente resistentes como Staphylococcus
aureus (Zhang et al., 2016). La plata en forma de sal tiene efectos antimicrobianos,
por lo que actualmente se utiliza para controlar el crecimiento de microrganismos,
se conoce que los iones y los compuestos basados en Ag son altamente tóxicos,
mostrando claros efectos antimicrobianos (Flores et al., 2009). Una de las ventajas
de usar NPs Ag es que son menos reactivos que los iones de Ag, por lo tanto son
adecuadas para uso en aplicaciones en la industria médica (Ahmed et al., 2016),
cosmética (Mameneh et al., 2019), como en la agricultura (Khot et al., 2012; Kim et
al., 2005).
Diversos estudios han demostrado el potencial bactericida in vitro que las NPs
Ag pueden tener tanto con patógenos humanos como fitopatógenos ( Zhang et al.,
2016; Paret et al., 2013; MubarakAli et al., 2011; Sharon, 2010; Shrivastava et al.,
2007). Se ha reportado que el uso de NPs es altamente eficiente al disminuir el
crecimiento bacteriano en su totalidad en concentraciones de 25 μg mL-1 contra
bacterias como Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella typhus
(Shrivastava et al., 2007). También se ha reportado que las NPs Ag tienen mayor
inhibición en el crecimiento de bacterias Gram-negativas que con bacterias Gram-
positivas.
5
I.5 Síntesis de nanopartículas
La síntesis de NPs Ag es de gran interés para la comunidad científica y para

la formulación de agroplaguicidas, por su amplia gama de aplicaciones, por lo que
se han empleado diferentes técnicas para síntesis de NPs clasificados en dos
grupos: 1) Enfoque “top to bottom”, donde las NPs se preparan a partir de materiales
de tamaño macro métrico disminuyendo su tamaño a materiales nanométricos y 2)
Enfoque de “bottom to up”, se basa en la agregación y la acumulación de átomos
incorporados en NPs (Mazhar et al., 2017; Ahmed et al., 2016a). A su vez la síntesis
se puede realizar por métodos físicos, químicos y biológicos.
En el método físico las NPs Ag se han preparado por medio de evaporización

y condensación en un horno tubular a presión atmosférica, estos métodos incluyen
descarga de chispas y pirólisis para la síntesis, que requieren un alto consumo de
energía y son de baja eficiencia en rendimiento (Zhang et al., 2016).
El método químico se basa en una solución con una sal metálica, un agente
reductor y una agente estabilizador de fijación para controlar el crecimiento de las
NPs (Tran et al., 2013), este enfoque es el más común para la síntesis de NPs Ag
mediante agentes reductores orgánicos e inorgánicos tales como citrato de sodio,
ascorbato, borohidruro de sodio, hidrógeno elemental, proceso poliol, reactivo de
Tollens, N,N-dimetilformamida (DMF) que se han utilizado para la reducción de
iones de Ag conduciendo a la formación de Ag metálica (Iravani et al., 2014);
algunos de los reactivos químicos utilizados en este proceso son tóxicos y pueden
ser absorbidos sobre la superficie de las NPs y al mismo tiempo ocasionar efectos
adversos en su aplicación (Rehana et al., 2017).
Sin embargo, los métodos químicos y físicos para la síntesis de NPs son
robustos pero no son rentables, demandan mucha energía e incluso requieren de
compuestos tóxicos como agentes reductores, son responsables de diversos
riesgos biológicos debido a que generan una gran cantidad de subproductos tóxicos,
es por esto que se busca el desarrollo de procesos de síntesis amigables con el
6
ambiente (Haq y Ijaz, 2019; Khan et al., 2018; Ahmed et al., 2016). Entre los
métodos mencionados esta la síntesis de NPs por métodos biológicos o de síntesis
verde.
La síntesis verde de NPs Ag se ha realizado usando diferentes extractos

obtenidos de plantas (hojas, tallos raíz y corteza), por biomasa de células
microbianas como bacterias y hongos; conteniendo agentes reductores
ampliamente distribuido en el sistema biológico (Stikar et al., 2016).
Por medio de moléculas biológicas derivadas de fuentes vegetales en forma

de extracto, sometiéndolas a un ensamblaje altamente controlado, consistiendo en
una recolección de la muestra a utilizar (hojas, raíz, tallo, etc.) y en combinación de
AgNO3, monitoreando la formación de NPs por resonancia de plasmon en un rango
de 400 a 500 nm, (rango significativo para las NPs Ag) (Ahmed et al., 2016b; Stikar
et al., 2016).
La síntesis de NPs Ag empleando cultivos bacterianos, producen material

inorgánico que se convierte en un bio-reductor de las NPs Ag, este proceso consiste
en cultivar a la bacteria resistente a la plata, a altas concentraciones de AgNO 3,
además el medio de cultivo promueve a la bacteria a la síntesis intracelular y
extracelular de material inorgánico, indicando la bio-reducción de un cambio de color
amarillo blanquecino a marrón (Rafique et al., 2017; Rauwel et al., 2015)
Por otra parte, está la síntesis de NPs Ag utilizando cultivos fúngicos, al igual
que las bacterias han sido de gran interés en la producción biológica de
nanopartículas metálicas debido a su tolerancia y capacidad de acumular aniones
de estos metales, los hongos secretan grandes cantidades de enzimas que se
utilizan para reducir los iones de plata, hipotéticamente se cree que esto se lleva a
cabo en el micelio del hongo y no en la solución del medio (Rafique et al., 2017;
Rauwel et al., 2015).
7
I.5.1 Síntesis de nanopartículas usando extractos de plantas
La síntesis por métodos biológicos basados en extractos de plantas tienen una

mayor eficiencia, son más rentables, más simple (involucrando solo un proceso de
bio-reducción de un solo paso), rápidos, confiables, no tóxicos y ecológicos para el
ambiente, se pueden producir NPs con tamaño y morfología controlada (Haq y Ijaz,
2019; Zhang et al., 2016).
La literatura menciona una gran diversidad de biosíntesis de NPs Ag utilizando

plantas (Khan et al., 2019; Ahmed et al., 2016a; Ahmed et al., 2016b; Hernández-
Pinero et al., 2016), demostrando la reducción de la NPs mediante un método,
simple, económico y amigable con el ambiente, utilizando los compuestos
biológicamente activos de las plantas (metabolitos secundarios); como las
sapogeninas, taninos, fenoles y flavonoides. El uso de extractos de plantas para
este propósito ofrece una gran ventaja sobre los microrganismos debido a su fácil
obtención, manipulación para su escalamiento y menor riesgo biológico, además de
ser más económico en costos de producción comparado con el mantenimiento de
cultivos celulares (Ahmed et al., 2016b).
De acuerdo con la literatura revisada se han realizado varias investigaciones

donde se ha utilizado extractos de plantas para sintetizar NPs Ag como se muestra
en el Cuadro 1. Estos extractos se utilizaron para reducir los iones de Ag, cada uno
a diferente concentración de AgNO3 en combinación con cada extracto, unos de los
primeros cambios que se visualizan es el cambio de coloración de amarillo claro a
oscuro marrón, monitoreando la síntesis por UV-Vis en un rango de 350 a 600 nm,
conforme aumentaba el tiempo de reacción la formación de NPs Ag aumentaba (Li
et al., 2019; Sharman et al., 2019; Abdullah et al., 2015). La bibliografía señala que,
dependiendo el extracto, el tiempo, la temperatura de reacción, la concentración de
extracto y AgNO3, se pueden obtener diferentes tamaños y formas de NPs Ag
(Manosalva et al., 2019; Sharman et al.,2019; Almadiy et al., 2018).
8
Cuadro 1.- Ejemplos de algunos extractos de plantas utilizados para la síntesis de
nanopartículas de Ag
Planta Tamaño (nm) Referencia
Galega officinalis 23 Manosalva et al. (2019)
Ocicum gratissimum 12-90 Sharma et al. (2019)
Lippia citriodora 20 Li et al. (2019)
Ougeinia oojeinensis 5-100 Kumar et al. (2019)
Hibiscus rosa 5-50 Vijayaraj y Kumaran, (2017)
Cassia roxburghii DC. 10-20 Balashanmugam et al. (2015)
Catharanthus roseus 10-50 Gozali et al. (2015)
Centella asiática 5-40 Netala et al. (2015)
Thevetia peruvianan 10-30 Rupiasih et al. (2013)
Mentha piperita 90 Mubarakali et al. (2011)
Ocicumm sanctum (Tulsi) 4-30 Singhal et al. (2011)
Dwivedi y Gopal (2010) reportaron un método sencillo y rápido de biosíntesis

de NPs Ag usando un extracto de la maleza Chenopodium album, el extracto acuoso
de la hoja fue usado como agente reductor para la síntesis a partir de soluciones de
nitrato de plata. Estos autores concluyeron que conforme aumenta la cantidad del
extracto de hoja, se presenta una disminución en el tamaño de las NPs. Por otro,
lado también se han reportado que el tamaño de las NPs metálicas biosintetizadas
dependen del tiempo de reacción, conforme este aumenta, se incrementa el tamaño
de las mismas (Abdullah et al., 2015).
En la síntesis de NPs realizada con extractos de plantas, que comprenden

varias biomoléculas como esteroides, sapogeninas, carbohidratos y flavonoides que
actúan como agentes reductores, además contribuyen como agentes de protección,
9
lo que le proporcionan estabilidad a las NPs Ag (Prasad et al., 2018; Ahmed et al.,
2016b; Jha et al., 2009).
Hoy en día las NPs Ag se pueden usar dispersas en soluciones líquidas, por
su método de síntesis biológico pueden quedar recubiertas y exhibir propiedades
hidrofílicas (Tran et al., 2013). Los compuestos polifenólicos son considerados
antioxidantes que contienen grupos funcionales hidroxilo sobre anillos aromáticos
pertenecientes a un grupo muy variados de moléculas desde las más simples a las
más complejas, como lo es un anillo aromático con unos o más grupos hidroxilos y
biopolímeros de alto peso molecular (Espinosa-Manrique et al., 2016).
I.5.2 Metabolitos secundarios como agentes reductores de

nanopartículas
Estudios recientes reportan que los metabolitos secundarios presentes en los

materiales vegetales actúan como agentes reductores y brindan electroestática en
la síntesis verde de NPs metálicas (Sathishkumar et al., 2018). Rehana et al., (2017)
reportaron que los flavonoides presentes en el extracto de plantas reducen las NPs
formando complejos con los metales mediante sus grupos funcionales.
Así mismo, se han reportado que los polifenoles tienen la capacidad de reducir
los metales, por la capacidad de su grupo funcional hidroxilo de donar electrones o
átomos de hidrogeno, siendo responsable de la conversión de Ag + en Ag0 (Figura
1) (Nazeruddin et al., 2015; Ahmad et al., 2010).
Otros autores señalan que los polifenoles al interactuar con las NPs mediante
enlaces de hidrógeno mejoran la solubilidad de estas en medios acuosos
(Sathishkumar et al., 2016; Li et al., 2015), entre los principales compuestos
capaces de reducir los metales se menciona a los flavonoides, los cuales se
componen de quince carbonos que involucran anillos aromáticos unidos con
puentes de tres carbonos (C6-C3-C6). De acuerdo con Raghavan et al. (2015)
quienes sintetizaron nanopartículas de oro utilizando Kaemferol, atribuyen que los
10
grupos hidroxilo presentes en su estructura participan activamente en la síntesis de
nanopartículas.
Figura 1.- Mecanismo propuesto de la participación de los fenoles en la reducción

de los iones de plata, liberación de átomo de hidrógeno por el grupo hidroxilo
participante. (Tomada de Ahmad et al., 2010).
I.6 Larrea tridentata
Larrea tridentata es un arbusto perenne de 1 a 3 m de altura ramificados y

nudoso, con hojas opuestas y foliolos asimétricos que miden hasta 1 cm de longitud,
se localiza en las regiones áridas del norte de México y en el sur de los Estados
Unidos, también conocido como creosota, gobernadora, chaparral, hediondilla y
creosote bush (en Estados Unidos), esta planta ha sido utilizada como remedios
tradicional de algunas enfermedades por tribus de Norte américa (Gnabre et al.,
2015; Arteaga et al., 2005).
La planta de L. tridentata es una fuente natural de ácido

nordihidroguaiayarético (NDGA) el cual es un potente antioxidante (Arteaga et al.,
2005), la planta puede contener aproximadamente un 50 % de peso seco de materia
extraíble de las hojas, además de contener compuestos polifenólicos (Favela-
Hernández et al., 2012; Schmidt et al., 2012) los cuales podrían participar como
11
agentes reductores en la biosíntesis de NPs Ag, además que los compuestos de
esta planta pudieran tener un efecto sinérgico antimicrobiano debido a los reportes
que existen en la literatura de los efectos de la gobernadora contra diversos
microorganismos (Lira-Saldívar, 2003; Verástegui et al., 1996; Brinker, 1993;), en el
Cuadro 2 se describen algunos compuestos fitoquímicos reportados en varias
investigaciones en L. tridentata.
Cuadro 2.- Principales compuestos fitoquímicos de Larrea tridentata
Tipo Compuesto Referencia

Lignanos 3′-demetoxi-6‐ O ‐demethylisoguaiacin Favela-Hernández et al.
Fenolicos (2012)
4- epi- larreatricina Favela-Hernández et al.
(2012)
Ácido dihidroguaiarético (Favela-Hernadez et al.,
2012; Briker, 1993)
Ácido nordihidroguaiarético (López-Aguirre et al.,
2016; Briker, 1993)
Hemi-norisoguaicin Briker (1993)
Nordihidroguaiacin Briker (1993)
Flavoniodes 5,8,4′-trihydroxy-3,7-dimethoxyflavone Briker (1993)
4′-dihidroxi ‐ 7 ‐ metoxiflavona Favela-Hernández et al.
(2012)
5,4′-dihidroxi ‐3,7,8 ‐ trimetoxiflavona Favela-Hernández et al.
(2012)
5,4′-dihidroxi-3,7,8,3′-tetrametoxiflavona Favela-Hernández et al.
(2012)
Apigenin Briker (1993)
Kaemferol (López-Aguirre et al.,
2016; Briker, 1993)
Tripterpenos Ácido larréico Briker (1993)
Larreagenin A Briker (1993)
I.6.1 Propiedades antimicrobianas de Larrea tridentata
Diversos estudios han demostrado que los extractos de gobernadora tienen

acción antifúngica bajo condiciones in vitro en al menos 17 hongos fitopatógenos de
importancia económica sintetizado (Lira-Saldívar, 2003; Brinker, 1993). Por su
12
parte, Verástegui et al. (1996) demostraron el efecto inhibitorio de extractos
etanólicos de L. tridentata en el crecimiento de hongos, levaduras y bacterias que
afectan la salud de humanos y animales.
El trabajo de Brinker (1993) enfocado a los usos etnobotánicos de L. tridentata,

reportó que más de 45 bacterias, 10 levaduras, nueve hongos y tres parásitos
intestinales son susceptibles a la resina de L. tridentata o sus constituyentes. La
resina de gobernadora ha probado tener efectos bactericidas y bacteriostáticos a
bajas dosis, como lo demuestra el trabajo de Velásquez (1983) al evaluar in vitro
diversas dosis del extracto etanólico contra bacterias fitopatógenas. Por lo que la
utilización de este extracto podría brindarnos un efecto sinérgico entre las NPs Ag
y los metabolitos residuales que queden en su estructura provenientes del extracto
de gobernadora.
I.7 Mecanismos de acción antibacterial de las nanopartículas de plata
Los mecanismos de acción antibacteriana que presentan las NPs metálicas no

están bien definidos, se han propuesto tres mecanismos que son los más aceptados
y reportados en la literatura.
1. Acumulación y disolución de NPs metálicas en la membrana plasmática

generan un cambio en su permeabilidad, con la consecuente liberación
de lipopolisacáridos, proteínas de membrana y biomoléculas
intracelulares (Khan et al., 2012; Prabhu y Poulose., 2012).
2. Generación de especies reactivas de oxígeno (ERO) generando daños
oxidativos a las estructuras celulares como el DNA, la membrana
plasmática y las proteínas de membrana (Fang et al., 2007), causando
apoptosis celular por el estrés oxidativo (Mameneh et al., 2019).
3. Adsorción de iones metálicos derivados de las NPs o las mismas NPs en
el interior de las células, seguido por el agotamiento de la producción de
13
ATP intracelular y la interrupción de la replicación del ADN (Durán et al.,
2016; Lok et al., 2006).
Las NPs Ag pueden liberar iones de plata y generar ERO que interactúan con
las proteínas de la membrana; afectando su permeabilidad; y así pueden entrar en
la célula y afectar el DNA (Neal, 2008). En la figura 2 se puede apreciar las
interacciones entre las NPs Ag y los iones de plata con una célula bacteriana.
Figura 2.- Posible mecanismo de acción antibacterial de las NPs Ag. 1) Atracción
electroestática, 2) Producción de radicales libres, 3) Modificación de proteínas, 4)
Interacción con grupo sulfhidrilo, 5) Interacción con moléculas que contienen fósforo
(Tomado de: Durán et al., 2016).
Además, las NPs Ag tienen efecto antagonista sobre hongos, estudios previos
reportaron que tienen actividad contra fitopatógenos como Bipolaris sorokiniana y
Magnaporthe grisea actuando sobre la formación de esporas y disminuyendo el
desarrollo de la enfermedad (Jo et al., 2009).
Un estudio realizado por Saharan et al. (2015), demostró la eficiencia

antifúngica de NPs Cu-quitosano contra Alternaria solani y Fusarium oxysporum en
un experimento con plantas de tomate en macetas. Contra Alternaria solani
registraron un 55 % de la gravedad de la enfermedad en plantas control, mientras
que en las plantas tratadas con NPs Cu-quitosano a concentraciones de 0.08 a 0.12
14
% p/v (peso/volumen), aplicando 10 mL por planta, mostraron una severidad de la
enfermedad de 15.3 y 6.6 % respectivamente.
Malandrakis et al. (2019) demostraron que las NPs Ag presenta una inhibición
más eficaz de los síntomas del moho causado por B. cinerea en ciruelas (Prunus
domestica) con 85 y 100 % a concentraciones de 100 y 1000 g/mL,
respectivamente. Mishra et al. (2014) evaluaron NPs Ag de forma esférica con
tamaños entre 10 y 20 nm contra la enfermedad causada por un hongo de la mancha
en trigo en condiciones de invernadero, dónde sometieron a las hojas de trigos a
varias concentraciones de 2, 4 y 10 µg mL-1 inhibieron el 100 % de la germinación
de los conidios del hongo. Por otro lado, Chikte et al. (2019) hicieron estudios de
aplicaciones foliares para reducir la severidad de las enfermedades fitopatógenas,
en este caso fueron NPs Cu contra el tizón bacteriano causado por Xanthomonas
axonopodis pv. punicae en plantas de granada Punica granatum L. donde realizaron
una aplicación foliar de a una concentración de 400 µg mL-1 reduciendo la severidad
de la enfermedad en 90 % en plantas tratadas en etapas tempranas y un 15 % en
plantas infectadas de 6 meses de edad, las etapas tempranas contaban con un 10
% de la severidad de la enfermedad comparadas con el control donde se estableció
en 40 %.
Lara et al. (2011) reportaron que las NPs Ag son capaces de inhibir la
multiplicación de un agente viral y de impedir su mutación, causando así una menor
resistencia al agente antiviral. El mecanismo propuesto para de las NPs Ag como
antivirales detalla que son capaces de interactuar con proteínas de la cápside viral
(Galdiero, 2011). El uso de NPs como agentes antimicrobianos ha sido ensayado
en diferentes microorganismos, y no cabe duda de que estas nanoestructuras son
un gran avance para el tratamiento y prevención de enfermedades de humanos y
plantas.
La ventaja de usar NPs Ag radica en el hecho de que no afecta la fertilidad del

suelo en comparación con los agentes antifúngicos tradicionales (Ruparelia et al.,
15
2008). Las NPs Ag surgen como un prometedor agente antimicrobial que podría ser
utilizado para enfrentarnos a enfermedades causadas por bacterias como C.
michiganensis, las cual actualmente afectan el campo mexicano causando grandes
pérdidas, debido a su resistencia a productos agroquímicos convencionales.
Por lo anteriormente mencionando, las altas pérdidas de casi el 70 % del

cultivo hortícola de Solanum lycopersicum por la bacteria C. michiganensis, que
provoca cancro bacteriano, debido al bajo control de esta enfermedad, conlleva un
uso incontrolado de productos químicos para mejorar la producción, pero a la vez
pueden afectar la salud humana y contaminar los ecosistemas. Debido a esto se
buscan nuevas prácticas agrícolas sustentable de bajo impacto ambiental. Una
alternativa es el uso de NPs Ag ya que tienen un gran potencial como agente
antimicrobiano, utilizando concentraciones bajas con mayor eficiencia debido en
parte la mayor área de contacto generada por su tamaño nanométrico.
.
Adicionalmente el uso de extractos de plantas, como la L. tridentata, para la
síntesis de NPs Ag, es un método de síntesis verde con el que se pueden obtener
nanopartículas estables para inhibir el crecimiento de C. michiganensis y controlar
la enfermedad causada por esta bacteria en plantas de tomate y otras especies
cultivadas.
16
II. Hipótesis
Las nanopartículas de plata biosintetizadas a partir de extractos de L.

tridentata reducirán la severidad del efecto de la enfermedad causada por la bacteria
C. michiganensis en plantas de tomate infectadas intencionalmente comparadas
contra las plantas sin tratamiento de NPs Ag.
III. Objetivos
III.1 Objetivo general
Evaluar in vitro e in vivo el efecto de las NPs Ag biosintetizadas a partir de

extractos de L. tridentata contra la infección de C. michiganensis en cultivo de
tomate.
III.2 Objetivos específicos
1) Obtener el extracto de L. tridentata utilizado para la biosíntesis de NPs Ag y

caracterizarlo químicamente para determinar los posibles compuestos que
pudieran actuar como agentes reductores.
2) Biosintetizar y caracterizar NPs Ag a partir de extractos acuosos de hojas de
L. tridentata.
3) Determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración
mínima bactericida (CMB) de las NPs Ag biosintetizadas contra C.
michiganensis.
4) Evaluar el potencial antibacteriano en planta el efecto de las NPs
biosintetizadas contra C. michiganensis en plantas de tomate.
17
IV. Materiales y métodos
IV.1 Material vegetal
Se colectaron hojas de L. tridentata en Saltillo, Coahuila, en la siguiente

ubicación: N 25°13´03.7” W 101°03´48.7”, altitud 2198 msnm. Cabe señalar que las
plantas se encontraban en etapa de floración, posteriormente fueron elicitadas con
etanol grado reactivo a campo abierto, el cual fue asperjado al follaje, después de
la aplicación las plantas fueron cubiertas con una película plástica para crear un
microclima por 2 h, con el objetivo de activar los mecanismos de defensa de la
planta; y de esta manera poder tener en mayor proporción de enzimas y metabolitos
secundarios relacionados con las respuestas al estrés abiótico, los cuales pueden
actuar como agentes reductores.
Las hojas del follaje fueron obtenidas realizando cortes de las ramas con tijera
y congeladas inmediatamente con ayuda de hielo seco, para ser transportadas al
laboratorio de Agrobiotecnología en el CIQA, en donde las muestras se congelaron
a -80 ºC. Posteriormente se realizó una molienda del material vegetal con ayuda de
una licuadora comercial para obtener un polvo (manteniendo la cadena en frío) y la
muestra fue liofilizada para eliminar humedad evitando la oxidación del mismo. El
material vegetal se almaceno en bolsas hasta su uso como materia prima para la
biosíntesis de NPs Ag.
IV.2 Preparación del extracto
Se hicieron pequeñas modificaciones a la metodología establecida por Vargas-

Martínez et al., (2017) a la cual se le adicionaron pasos para eliminar restos
celulares del extracto. A partir de la biomasa (liofilizada) provenientes de hojas de
L. tridentata, se preparó un extracto por decocción a 60 °C por 1 h, utilizando una
relación 1:10 (p/v) (extracto liofilizado / agua desionizada). Posteriormente se dejó
enfriar a temperatura ambiente, se separaron los residuos sólidos usando de papel
filtro No. 1 con un tamaño de poro de 11µm, seguido de centrifugación a 10,000 rpm
durante 15 min. Para finalizar este proceso se filtró por medio de un embudo con
18
disco de vidrio sinterizado con tamaño de poro de 10-15 µm para eliminar la mayor
cantidad de restos celulares.
IV.3 Caracterización del extracto
IV.3.1 Cuantificación de fenoles
Se tomaron 200 mg del extracto liofilizado, al que se extrajeron los compuestos

con metanol al 80 %, la mezcla se sonificó por 15 min, pasado el tiempo se filtró, el
sobrenadante se utilizó para cuantificar fenoles con el reactivo Folin-Ciocalteu de
acuerdo con la metodología reportada por Georgé et al. (2005). La mezcla de
reacción estuvo constituida por 20 μL del extracto, 2.5 mL de reactivo de Folin
Ciocalteu al 10 % (v/v), 2 mL Na2CO3 (75 g L-1) y 480 μL de agua desionizada
aforando a 5 mL, las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 30
min, se determinó la absorbancia a 765 nm en un espectrofotómetro (Genesis 10
uv, Thermo Spertronic). Finalmente, se realizó una curva estándar de 0 a 100 µg de
ácido gálico (Anexo A).
IV.3.2 Cuantificación de flavonoides
El contenido total de flavonoides se determinó mediante el método

colorimétrico de cloruro de aluminio de acuerdo con la metodología de Chang et al.
(2002), se tomaron 200 mg del extracto liofilizado, los cuales se resuspendieron en
1 mL de metanol al 80 %. A continuación, se tomaron 20 μL del extracto y se
mezclaron con 480 μL metanol al 80 %, 3.2 mL de agua desionizada, 150 μL de
NaNO2 al 5 %, 150 μL AlCl3 al 10 % y 1 mL de NaOH (0.5 M), las muestras se
incubaron a temperatura ambiente durante 30 min. Se determinó la absorbancia a
510 nm en un espectrofotómetro (Genesis 10 UV, Thermo Spertronic); para
correlacionar el contenido total de flavonoides y se realizó una curva patrón de 0 –
300 µg Catequina (Anexo B).
19
IV.3.3 Presencia de taninos
Se realizó de acuerdo con la metodología reportada por Mathur et al. (2011).

Se mezclaron 500 µl del extracto acuoso con 10 mL de agua desionizada. Se
adicionó FeCl3 al 6 % hasta que se observó un cambio de color a verde profundo lo
que confirmo la presencia de taninos.
IV.3.4 Cuantificación de clorofila total
La extracción de la clorofila se realizó mediante la técnica propuesta por

Ábrahánm et al. (2010), se pesaron 100 mg del extracto liofilizado y se re-
suspendieron en 2 mL de etanol frío, consecutivamente se centrifugó la muestra a
14,000 rpm por 5 min. Se tomaron 200 μL del sobrenadante, los cuales se colocaron
en un tubo de microcentrífuga, al cual se le adicionó 1 mL de etanol frío, la mezcla
se incubó durante 1 h en baño de hielo. Pasado el tiempo la muestra se centrifugó
a 12,000 rpm durante 5 min. Al sobrenadante se midió la absorbancia a dos
longitudes de onda (645 y 663 nm), el proceso se realizó por triplicado.
La concentración de clorofila se calculó mediante las siguientes ecuaciones:

CA mg/L = 12.7 (A663) – 2.63 (A645)
CB mg/L = 22.9 (A645) – 4.68 (A663)
Donde:
CA = Concentración de clorofila A.
CB = Concentración de clorofila B.
A633 = Absorbancia a 663 nm.
A645 = Absorbancia a 645 nm.
IV.3.5 Extracción y purificación de compuestos del extracto
Se llevó a cabo el protocolo descrito por Rodriguez-Saona y Wrolstad (2001).

Se utilizó una extracción en fase sólida con mini columnas Hypersep C18
500mg/6ml (p/v) (Thermo Scientific USA), se obtuvieron tres diferentes fracciones
de acuerdo con la polaridad del solvente utilizado como eluyente, para lo cual se
20
acondicionó la columna con metanol (dos veces el volumen de la columna), seguido
de tres lavados con agua acidificada (0.01 % HCl), esto para eliminar el metanol
presente en la columna. Se resuspendieron 10 mg de extracto en 10 mL en agua
desionizada, forzando el paso del extracto acuoso a través de la columna (la
columna solo permite una carga del extracto de aproximadamente de 10 mg), se
obtuvo la primer fracción del extracto pasando dos veces el volumen de la columna
con agua acidificada (0.01 % HCl) separando azúcares y carbohidratos,
posteriormente se utilizó como eluyente acetato de etilo para obtener una segunda
fracción separando compuestos fenólicos, por último se eluyeron los compuestos
de la tercera fracción con metanol acidificado (0.01 % HCl) separando antocianinas.
Se eliminaron los solventes mediante un secado con aire (administración de aire
mediante una bomba).
A cada una de estas fracciones se le evaluó su capacidad de actuar como

agente reductor de la plata, aquellas fracciones que presentaron esta capacidad se
analizaron por cromatografía de líquidos de alta eficiencia con detector de arreglo
de diodos (HPLC-DAD) para determinar los componentes principales y de esta
manera encontrar los componentes del extracto que permiten la formación de las
NPs Ag.
IV.3.6 Cromatografía capa fina

Con la finalidad de identificar los compuestos que pueden estar interactuando
en la biosíntesis de las NPs, se realizó una cromatografía en capa fina (TLC)
utilizando el sistema de solventes propuesto por Malbaša et al. (2004) en la cual se
utilizó como fase móvil cloroformo, acetato de etilo y ácido fórmico con una relación
5:4:1 (v/v/v). Se utilizaron como compuestos de referencia flavona, ácido ferúlico,
siringaldehído, ácido protocatéquico, ácido trans-cinámico, ácido clorogénico, ácido
gálico y catequina. Se utilizaron cromatoplacas de Silica gel 60 F 254. Los
compuestos separados se identificaron por detección UV a 254 nm mediante el
factor de retardo (Rf), en solventes utilizados:
21
𝑎
𝑅𝑓 =
𝑏
Donde:
Rf = Factor de retardo.
a = Es la distancia desde del origen hasta el centro del punto a
identificar.
b = Es la distancia desde del origen hasta el frente de la fase móvil.
IV.3.6.1 Identificación de compuestos por cromatografía líquida de alta

eficiencia por luz difusa (HPLC-DAD)
Las muestras (fracciones 2 y 3) se suspendieron inicialmente en una solución

de metanol al 80 % [metanol (grado HPLC) en agua (milliQ)] a una concentración
de 1 mg mL-1. Las muestras se concentraron a 1 mg mL-1, para esto se llevó a
sequedad un volumen de 2 mL de la solución a 50 °C. Cada muestra se suspendió
en 0.5 Ml de MeOH al 80 % quedando a una concentración de 4 mg/Ml. Las
muestras fueron pasadas a través de filtros de 0.45 µm HV (Merck Millipore LTd.)
previo a inyectarlas en el HPLC. Se identificaron los principales compuestos de cada
fracción obtenida por HPLC DAD Waters (Módulos; bomba 1525, detector 2996 y
automuestreador 717, con software Empower 3), inyectando 50 µL en una columna
Phenomenex Luna 150x4.6mm 5µm C18(2) con pre-columna, fase móvil: A;
metanol B; agua al 0.1 % de ac. fórmico. Fase móvil con 30 % de A por 15 min, 60
% de A por 5 min, 70 % de A por 30 min a 0.5 mL/min.
IV.4 Biosíntesis de las nanopartículas
La preparación de las NPs Ag se realizó con modificaciones a la metodología

propuesta por Vargas-Martínez et al. (2017). Se utilizaron diferentes relaciones de
extracto acuoso de L. tridentata y nitrato de plata (50 mM) a diferentes temperaturas,
las relaciones fueron 1:1, 1:2 y 1:5 (v/v) a 4, 10, 25 y 80 °C. El procedimiento fue el
siguiente: la solución conteniendo el extracto se acondiciono a la temperatura
deseada, después a esta se añadió la cantidad de nitrato de plata gota a gota en un
22
periodo de 15 min, esto para realizar una interacción lenta del ión plata con el
extracto y se dejó en agitación durante 2 h. Una vez trascurrido este tiempo se
separaron las NPs Ag del medio acuoso mediante centrifugación a 9,000 rpm
durante 15 min, posteriormente el sobrenadante de la reacción fue eliminado por
decantación, el precipitado se lavó tres veces con metanol para eliminar restos del
extracto y finalmente se dejó secar a temperatura ambiente.
IV.5 Caracterización de las nanopartículas
Las NPs Ag se caracterizaron mediante espectrofotometría de UV-Visible

utilizando como blanco el extracto de L. tridentata. Las muestras se analizaron por
difracción de rayos X (DRX) usando un difractómetro (Rigaku Ultima IV) en un rango
de barrido de 10 a 80° en escala 2θ, a una velocidad de 0.02 °/s, con radiación tipo
CuKα a una longitud de onda 1.54 Å, con condiciones de operación de 44 mA y 40
KV. La identificación de las fases cristalinas presentes en la muestra se realizó
mediante su comparación con los patrones estándar reportados en el banco de
datos del International Centre for Diffraction Data (ICDD).
La morfología de las muestras se caracterizó mediante microscopía

electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) utilizando un microscopio
FEI-TITAN 80–300 kV operado a un voltaje de aceleración de 300 kV. La muestra
para estos estudios se preparó depositando una gota de la solución coloidal sobre
rejillas de cobre recubiertas de carbono.
Se analizaron muestras del extracto liofilizado de L. tridentata por

espectroscopía infrarroja de transformada de Fourier (FT-IR); para detectar los picos
característicos y sus grupos funcionales. Se analizaron muestras del extracto
liofilizado de L. tridentata y NPs Ag, las muestras se midieron en el rango de longitud
de onda de 400 a 4000 cm-1 con una resolución de 4 cm-1; utilizando el
espectrofotómetro FT-IR Nicolet Is10 (Thermo Scientific).
23
IV.6 Antagonismo in vitro contra Clavibacter michiganensis
Se determinó el efecto antagonista in vitro de las NPs obtenidas contra la

bacteria fitopatógena C. michiganensis, la cual fue proporcionada por el Laboratorio
de Microbiología Aplicada en Agricultura y Ambiente del área de Coordinación para
la Innovación y Aplicación de la Ciencia y la Tecnología (CIACyT) de la UASPL, la
cual fue obtenida de plantas de tomate inoculadas experimentalmente en
condiciones de aislamiento.
Se utilizó el medio de cultivo Luria Bertani (LB), el cual se compone de 10 g L-

1 de Bacto triptona, 10 g L-1 de cloruro de sodio (NaCl) y 5 g L-1 de extracto de
levadura, se solidificó con 15 g L-1 de agar bacteriológico, posteriormente esterilizó
en una autoclave a 121 °C por 15 min.
El efecto antagonista de las NPs Ag contra la bacteria se determinó usando la

técnica de microdilución en caldo de acuerdo con Taroco et al. (2016), ya que
consiste en exponer a la cepa bacteriana a diferentes concentraciones del
bactericida, en este caso NPs Ag, en diluciones a la mitad aproximadamente en un
medio líquido manteniendo a una agitación constante mediante la pruebas de
antagonismo, este ensayo se llevó a cabo de esta manera debido a que si las NPs
al ser sometidas a altas temperaturas pueden cambiar su tamaño presentando
aglomeración (Manosalva et al., 2019; Sharman et al., 2019; Almadiy et al., 2018),
además no solubles y tienden a precipitarse.
Se preparó una solución de NPs Ag a una concentración de 200 mg L -1 por

medio de dilución se obtuvieron las siguientes concentraciones 200, 120, 72, 43.2,
25.92, 15.552, 9.331, 5.598, 3.359, 2.015, 1.209 y 0 mg L-1. Con estas
concentraciones se determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI) y la
concentración mínima bactericida (CMB), utilizando la metodología de micro
dilución en caldo. Se preparó el medio de cultivo líquido en 12 diferentes
concentraciones de NPs Ag por duplicado en tubos de ensayo que contuvieran la
misma cantidad de este medio de cultivo. Cada tratamiento se inoculó con 100 μL
24
de la bacteria con aproximadamente 50x106 UFC, se incubaron a 28 °C por 24 h
con agitación constante a 150 rpm, después se realizaron diluciones de cada
tratamiento, se sembraron por triplicado en cajas Petri con medios de cultivo LB
sólido, las cajas fueron incubadas a 28 °C por 32 h, posteriormente se realizó el
conteo de las colonias que eran capaces de crecer después del tratamiento con las
NPs Ag.
La determinación de la CMB de las NPs Ag se realizó tomando 100 μL de los

tubos de ensayo donde no se observó crecimiento bacteriano y se sembraron en
cajas petri con agar nutritivo, incubando a 28°C por 32 h como lo reporta Tarpay et
al. (1980). Para corroborar la concentración a la cual no hay crecimiento de la
bacteria, los experimentos de actividad antimicrobiana se efectuaron por triplicado.
IV.7 Análisis de muestras biológicas en microscopía electrónica de barrido
Para observar el efecto de las NPs Ag sobre la morfología de la bacteria

después del tratamiento, se tomaron micrografías mediante microscopía electrónica
de barrido (SEM), para lo cual se realizó el siguiente procedimiento para la fijación
de la bacteria.
Se preparó una solución amortiguadora de fosfatos a 0.2 M y pH 7.2, a la cual

se le adicionó formaldehido al 10 %. Las muestras se sumergieron en el fijador
durante 24 h manteniéndolas en refrigeración a 4 °C y en ausencia de luz, por regla
general se depositaron 20 partes de la solución fijadora con respecto a la muestra.
Las muestras se colocaron (500 µL) en bolsas elaboradas en base de membranas
optimizadas para la trasferencia de ácidos nucleicos (Amershan HybondTM-N+ GE
Healthcare). Posterior al proceso de fijación la muestra se deshidrató con etanol
etílico (C2H6O) a diferentes concentraciones graduales (30, 50, 70, 85 y 96 %)
dejando la muestra durante una hora en cada concentración. Las muestras se
secaron empleando CO2 líquido grado II, utilizando el equipo de secado de punto
crítico CPD tousimis samdri-795 semiautomático. Al finalizar las muestras se
recubrieron con oro empleando el equipo Denton Vacuum Desk II, se depositaron
25
aproximadamente 150 angstroms de espesor. El equipo utilizado fue UHR FE-SEM
Hitachi 8010.
IV.8 Antagonismo in vivo contra C. michiganensis
El diseño experimental fue completamente al azar, teniendo 8 tratamientos con

4 repeticiones, cada repetición con 5 plantas, cada tratamiento contó con 20
unidades experimentales, se realizó en el área campo experimental agrícola de
CIQA, bajo condiciones de invernadero de baja tecnología. Las semillas de tomate
(S. lycopersicum) variedad floradade previamente embebidas con NPs Ag, se
germinaron en charolas de poliestireno de 200 cavidades utilizando turba como
sustrato. La concentración de NPs Ag fue de 18.66 mg L-1 que se seleccionó de
acuerdo a los resultados obtenidos en el bioensayo del antagonismo in vitro y de los
ensayos de germinación realizados (Ver Anexo G). Se llevaron a cabo dos tipos de
experimentos:
1) Semillas de tomate pre-tratadas con una solución de 18.66 mg L -1 de
NPs Ag por 18 h.
2) Semillas sin tratamiento previo.
Ambos tratamientos se sembraron en las charolas de germinación; después

de la aparición de las primeras hojas verdaderas de ambos tratamientos (1 y 2),
estás se trasplantaron a macetas de 1200 mL conteniendo como sustrato
turba:perlita (1:1 v/v),
Cuando las plantas contaron con 8 hojas bien desarrolladas se infectaron de

acuerdo con la metodología reportada por Meletzus et al. (1993) con la bacteria C.
michiganensis con una suspensión bacteriana 1x10-7 UFC/mL, posteriormente
fueron cubiertas con una bolsa Sun bag transparent (Sigma-Aldrich) con un tamaño
de poro de 0.02 μm, se dejó durante toda la noche retirándola al día siguiente a las
primeras horas del día, esto fue con la finalidad de dar las condiciones adecuadas
a la bacteria para que por medio de los estomas e hidatidos entre al sistema vascular
de la planta con un 80 % HR.
26
Diez días después de la infección las plantas provenientes de cada tratamiento
se asperjaron con la solución de NPs Ag, cada 8 días se trataron las plantas con
NPs Ag y agua, este procedo se llevó a cabo durante 42 días, monitoreando el grado
de severidad de la bacteria hacia la planta comparándolas con los controles.
Se aplicaron los siguientes tratamientos:

• Control absoluto: plantas asperjadas semanalmente con agua.
• Control positivo, plantas infectadas con la bacteria asperjadas
semanalmente con agua.
• Control químico, con Cuprimicín 100 Hyper, planta infectada con la
bacteria y fueron asperjadas semanalmente con una solución de 600
mg L-1 del bactericida comercial.
• Control NPs, semillas imbibidas en solución de 18.66 mg L -1 de NPs
Ag, infectadas con la bacteria, las plantas de estas semillas se
asperjaron semanalmente con agua.
• NPsCm50, el cual consistió en plantas obtenidas de semillas imbibidas
en solución de 18.66 mg L-1 de NPs Ag, infectadas con la bacteria, las
plantas de estas semillas se asperjaron semanalmente con la solución
de NPs Ag a una concentración de 50 mg L-1
• NPsCm25, el cual consistió en semillas embebidas en solución de
18.66 mg L-1 de NPs Ag, infectadas con la bacteria, las plantas de
estas semillas se asperjaron semanalmente con la solución de NPs Ag
a una concentración de 25 mg L-1.
• SSTCm50, plantas infectadas con la bacteria, asperjadas
semanalmente con la solución de NPs Ag 50 mg L-1.
• SSTCm25, plantas infectadas con la bacteria, asperjadas
semanalmente con la solución de NPs Ag 25 mg L-1.
NOTA: De acuerdo con los tratamientos se les denomino la nomenclatura

anterior, por ejemplo, NPsCm50 y SSTCm50 donde:
27
NPs = Semillas tratadas con NPs Ag
SST = Semillas sin tratamiento de NPs Ag
Cm = Plantas infectadas con C. michiganensis
50 = Representa la concentración de la solución de NPs Ag que fueron
asperjadas (en este caso fueron dos 50 y 25 mg L-1).
IV.8.1 Evaluación de incidencia y severidad de C. michiganensis en

plantas de Solanum lycopersicum
Los daños de incidencia y severidad se realizaron por métodos directos

comprendiendo valoraciones visuales del avance de la pat0ogénesis de la
enfermedad, tomando como patrón estándares visuales en la planta, teniendo como
referencia lo señalado por Ivancovich et al. (1998), tomando en cuenta las siguientes
características de las escalas para la evaluación de la enfermedad en campo.
• Debe ser apropiada y acoplarse a la enfermedad a evaluar

• Al momento de medir una enfermedad con una escala se debe
contemplar la fecha de evaluación, condiciones ambientales, estado
fisiológico del cultivo y tejido a evaluar.
• El método debe ser reproducible, fácil y rápido de usar.
Se evaluó la incidencia de la enfermedad, vinculada al porcentaje o proporción

de individuos enfermos con relación a la población total. Los individuos pueden ser
plantas, hojas, flores, foliolos, espigas, etc., en este caso se realizó por plantas,
determinada de la siguiente manera
No. de plantas enfermas

Incidencia (I) = 𝑥 100
Total de plantas muestral
La severidad de la bacteria en la planta de tomate se evaluó de la siguiente

manera, mediante la cual se contempló el porcentaje del órgano enfermo, en este
caso la hoja afectada variando de 0 a 100, parámetro que refleja con precisión la
relación de la enfermedad con respecto al daño que provoca a la planta, se realizó
28
una escala cuantitativa de los síntomas de marchitamiento de acuerdo con Mohd
Nadzir et al., (2019)
• 0 = Sin síntomas
• 1 = 0-25 % de hojas marchitadas en la planta.
• 2 = 26-50 % de hojas marchitadas en la planta
• 5 = Plantas muertas.
La severidad de la enfermedad se determinó de acuerdo con la ecuación

reportada por Anfoka (2000) y tomando en cuenta el nivel de clasificación otorgado
de acuerdo el porciento de la incidencia de la enfermedad de la siguiente manera.
(Ʃ(𝑁𝑜. 𝑑𝑒 𝑐𝑙𝑎𝑠𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛 × 𝑁𝑜. 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛 𝑒𝑠𝑎 𝑐𝑙𝑎𝑠𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛)

ISE = × 100
𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑁𝑜. 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑎𝑠 × 𝑐𝑙𝑎𝑠𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑚𝑎𝑠 𝑎𝑙𝑡𝑎
Cada una de estas dos variables fueron analizadas con el Software estadístico
InfoStat versión 2018I, con una comparación de medias mediante la prueba SLD-
Fisher con un valor de significancia (p < 0.05).
IV.8.2 Evaluación del crecimiento de C. michiganensis en plantas de

tomate
Se monitoreó el avance de la enfermedad a partir de los 4 días después de la

infección (ddi), se realizó la primera toma de muestra de 12 plantas por tratamiento
para cuantificar la población bacteriana de acuerdo a la metodología reportada por
Katagiri et al. (2002), se retiró asépticamente de la planta una muestra en forma de
disco con un taladro de corcho de 0.5 cm2, durante 10 min se mantuvo en hipoclorito
al 10 %, luego se colocó en una solución de etanol al 70 % (para eliminar cualquier
contaminación presente sobre la superficie de la muestra), posteriormente se
sumergieron en agua destilada estéril para eliminar residuos de la las soluciones
anteriores, se retiraron y se secaron sobre toallas de papel. Por lo general la toma
29
de muestra de dos o más plantas replicadas independientes se agrupan para una
sola muestra de tejido. Los discos de la muestra se colocaron en un tubo
microcentrífuga de 1.5 mL con 100 µL de de NaCl2 al 85 %, se trituraron y se aforo
a 1 mL (se aplicó para todas las muestras).
Posteriormente las muestras se agitaron para distribuir uniformemente las

bacterias, se centrifugó a 400 rpm durante 15 seg y se tomó una muestra de 100 µL
diluyendo en 900 µL de NaCl2 al 85 % creando una serie de diluciones de 1:10 para
cada muestra, para cada una de las diluciones se tomaron 100 µL y se colocó por
triplicado en caja Petri con medio LB, se incubaron a 28 °C durante 32 h para realizar
un conteo de UFC viables. Las UFC/g de tejido se calcularon de la siguiente manera:
el peso de la muestra × el volumen plaqueado × el número de colonias × el factor
de dilución con estos datos se realizó una curva del progreso de la enfermedad de
4, 8, 12, 21, 28, 36 y 45 ddi para calcular la incidencia de la bacteria en planta de
acuerdo Tancos et al. (2013), para poder comparar contra las plantas tratadas con
NPs Ag, realizando un aislamiento de la bacteria a partir de tejido de la planta y
realizando diluciones para su conteo.
IV.8.3 Medición de variables fisiológicas
Se realizaron mediciones semanalmente de altura (cm), número de hojas,

diámetro de tallo (mm), longitud de raíz (cm), contenido de biomasa seca (gr). El
diseño fue completamente al azar con un total de 8 tratamientos con cuatro
repeticiones de 5 plantas, realizando un análisis estadístico con el Software
estadístico InfoStat versión 2018I de comparación de media con la prueba LSD
Fisher a un nivel de significancia (p < 0.05).
30
V. Resultados y discusión
V.1 Biosíntesis de las nanopartículas
La espectroscopía de UV-Vis se empleó para darle seguimiento a la reacción

de formación de las NPs Ag. En la Figura 3 se muestran los espectros de UV-Vis
obtenidos durante la reacción usando diferentes relaciones de extracto: AgNO 3. En
todas las muestras se observa una banda ancha de absorción entre 350-700 nm, la
cual conforme se aumentó la cantidad de AgNO3 se volvió más estrecha. En
específico la Figura 3C presenta una banda de resonancia de plasmon centrada a
450-460 nm similar a las reportadas en la literatura de reducción de NPs Ag a partir
de extractos de plantas (Behrayan et al., 2019; Valsalm et al., 2019; Ghozali et al.,
2015: Netala et al., 2015; Rajaram et al., 2015) esto confirma la reducción de Ag+ a
Ag0 y que corresponde a la formación de Ag.
Figura 3.- Espectros de UV- Vis obtenidos durante la reacción de la formación de

NPs Ag a diferentes concentración de extracto de Larrea tridentata:AgNO3.
31
Los cambios en los picos de absorbancia en la formación de las NPs Ag
pueden variar de acuerdo con el tipo de extracto utilizado, por ejemplo Manosalva
et al. (2019) reportaron una resonancia de plasmon a los 410 nm utilizando como
agente reductor extracto de Galega officinalis, Sharma et al. (2019), reportaron
biosíntesis de NPs Ag a una resonancia de plasmon entre 436 a 450 nm utilizando
extracto de Ocimum gratissimum, Behravan et al. (2019) reportó una resonancia de
plasmon a los 450 nm con extracto de Berberis vulgaris y Valsalam et al. (2019)
reportó biosíntesis de NPs Ag a 463 nm con extracto de Tropaeolum majus. De
manera general se observó que al aumentar el tiempo de reacción la intensidad de
los picos de absorción se incrementó debido a la formación de un número mayor de
NPs Ag en la solución en función del tiempo.
+
Para corroborar la formación de NPs Ag se utilizó la técnica de difracción de
rayos X. En la Figura 4 se presentan los patrones de difracción de las muestras de
NPs Ag obtenidas con tres diferentes concentraciones del extracto de la
planta:AgNO3 a las diferentes temperaturas estudiadas (4, 10, 25 y 80 °C). En todas
las muestras se observa la presencia de picos característicos localizados a 38.2,
44.2, 64.5 y 77.2° atribuidos a las reflexiones de los planos (111), (200), (220) y
(311) de Ag con una estructura cristalina cúbica centrada en las caras (FCC)
(JCPDS No. 04-0783), adicionalmente se observan otros picos a 27.8, 32.2, 46.2,
54.9 y 57.6°, que corresponden a las reflexiones (111), (200), (220), (311), (222), de
una fase identificada como AgCl con estructura FCC (JCPDS No. 31-1238).
La temperatura tiene un rol importante para la formación de las NPs Ag, si se

considera la intensidad de los picos principales de Ag y del AgCl en 38.2 y 32.2°, se
puede observar que en las muestras obtenidas a 4 y 10 °C, la relación de
intensidades de estos picos es similar en todos los casos estudiados. Al aumentar
la temperatura a 25 °C, se observa que la intensidad del pico correspondiente a la
Ag es mayor que para el AgCl, lo cual confirma la formación de mayor cantidad de
Ag a esta temperatura, sin embargo, el AgCl sigue presente. Al incrementar la
temperatura a 80 °C (figura 4), se puede observar que la presencia del AgCl es
32
mínima, ya que la fase que esta dominando el patrón de difracción es la Ag. La
formación de AgCl se atribuye a la presencia de algunas sales (cloruros) en el
extracto de L. tridentata, ya que es una planta que se localiza en las regiones áridas
del norte de México.
Figura 4.- Patrones de difracción de rayos X, muestras a concentraciones 1:1, 1:2

y 1:5 (extracto:AgNO3) a diferentes temperaturas: A) 4 °C, B) 10 °C, C) 25 °C y D)
Concentración 1:5 a 25 y 80 °C.
33
La presencia de cloruro de plata en las NPs biosintetizadas por extractos de
acuerdo a Jo et al. (2009) puede disminuir el efecto antimicrobiano de las NPs Ag
utilizadas. En un estudio realizado por Song y Kim (2009), demostraron que a
medida que se aumenta la temperatura de reacción, aumenta la velocidad de
síntesis, así como la conversión final de la NPs, además en su caso, el tamaño de
partícula disminuyó a medida que aumentó la temperatura de la reacción, debido a
que la velocidad de reacción aumenta y, por lo tanto, la mayoría de los iones de
plata se consumen en la formación de núcleos, lo que detiene el proceso de
reducción secundaria en la superficie de los núcleos preformados.
Analizando los patrones de difracción de rayos X se decidió utilizar la relación

de extracto y AgNO3 de (1:5) a una temperatura de 80 °C (Figura 4D), los resultados
demostraron que a esta temperatura la formación de cloruro de plata disminuyó casi
en su totalidad al compararla con el patrón de difracción de rayos X de la muestra
obtenida a 25 °C.
En la Figura 5A se presenta la micrografía de TEM perteneciente a las NPs Ag

obtenidas a 25 °C usando una relación de extracto:AgNO3 de 1:5. Se puede apreciar
que las NPs exhiben una morfología semiesférica y presentan tamaños entre 4-28
nm en donde aproximadamente el 75 % de estas tiene un tamaño menor a 12 nm.
Respecto a las NPs Ag obtenidas a 80 °C, estás también presentan una morfología
semiesférica con tamaños entre 2-26 nm (Figura 5B) de las cuales
aproximadamente el 70 % es menor a 14 nm.
34
Figura 5.- Micrografía de TEM e histograma de distribución de tamaños de partícula
de NPs Ag obtenidas con una relación de extracto:AgNO3 de 1:5 a la temperatura
de: A) 25 °C y B) 80 °C.
De acuerdo a estos resultados se decidió utilizar las NPs Ag biosintetizadas

con una relación 1:5 (extracto:AgNO3) a una temperatura de reacción a 80 °C por la
reducción de la fase de AgCl, además de obtener NPs Ag con tamaños por debajo
de los 30 nm. Diversos autores señalan que el efecto bactericida de las NPs es
dependiente del tamaño siendo más efectivas a menores tamaños (Raza et al.,
2016; Adams et al., 2014; Raghupathi et al., 2011). Morones et al. (2005)
consignaron que las NPs Ag entre 1 a 10 nm tenían mayor efecto bactericida debido
a que estas se unen a la superficie de la membrana celular y perturban su función
permeable; además que el tamaño de las NPs afecta la eficiencia de la captación
celular y el tipo de endocitosis (Wu et al., 2019), si estas son de mayor tamaño
actúan liberando iones en la superficie de la membrana celular, la cual a su vez es
dependiente de la morfología (Cheon et al., 2019). Por lo tanto, será posible
controlar la actividad antimicrobiana controlando la forma y el tamaño de los NP de
Ag.
35
En el caso de cepas fitopatógenas Gautam et al. (2019) reportaron que las
NPs Ag de tamaños entre 1 a 10 nm biosintetizadas con extractos de Allium cepa,
Zingiber officinale y Allium sativum, mostraron efecto bactericida contra Erwinia sp.
Psedomonas jeringa, Bacillus megaterium, Fusarium avenaceum, Fusarium
culmorum, y Fusarium graminearum.
Por otra parte, de Mishra et al. (2017) reportaron un efecto antifúngico de NPs
Ag con tamaños entre 5-30 nm contra Sclerotium rolfsii, un hongo que causa
pudrición en el tallo del garbanzo.
V.2 Extracción y cuantificación de compuestos reductores
Al extracto de L. tridentata obtenido, se le cuantificó la presencia de

fitoquímicos como flavonoides, fenoles y clorofila que pueden estar involucrados en
la reducción y estabilización de los iones metálicos (Jayaprakash et al., 2017;
Khodadadi et al., 2017). El contenido total de fenoles fue de 73.87 mg de ácido
gálico/g PS, calculado a partir de la curva de calibración de ácido gálico (Anexo A,
R2= 0.9969), con un mayor contenido de flavonoides de 194.86 mg de catequina/g
PS de acuerdo con la curva de calibración (Anexo C, R2=0.9925), además de dar
positivo para el ensayo de taninos (Figura 6) y un contenido de clorofila total 0.10655
mg L-1
Figura 6.- Presencia de taninos en el extracto acuoso de Larrea tridentata por medio
de colorimetría a verde oscuro.
36
Cabe destacar que el contenido de flavonoides en el extracto de L. tridentata
fue mayor, estudios recientes han destacado que los flavonoides que existen en los
extractos vegetales son fundamentales en la reducción del metal para la formación
de NPs (Sathishkumar et al., 2018; Sathishkumar et al., 2016). Además de que los
flavonoides pueden interactuar con el metal mediante sus grupos carbonilos
incrementando la actividad antimicrobiana de las NPs (Muniyappan y Nagarajan,
2014).
Existen pocos estudios del mecanismo para la interacción de los flavonoides

con iones metálicos para la formación de NPs metálicas, Raghavan et al. (2015)
argumentan que los grupos hidroxilo presentes en los anillos B y C de kaempferol
pueden participar en la formación de NPs Au. Por otro lado, Nazeruddin et al. (2014)
reportaron que el grupo enol de la luteolina libera hidrógeno reactivo, el cual es
responsable de la conversión de Ag+ a Ag0. Makarov et al. (2014) proponen que la
quecertina puede quelatar los metales involucrando grupos carbonilos, hidroxilos y
el catecol de los carbonos C3, C4 y C5. Estos grupos tienen la capacidad quelatar
diferentes iones metálicos mediante los siguientes pasos: i) son adsorbidos en la
superficie de metal; ii) empieza el desarrollo de las NPs y posteriormente continúa
iii) la agregación y biorreducción (Makarov et al., 2014). Sin embargo, Stolarczyk et
al. (2017) recientemente propusieron el mecanismo de formación de complejos de
genisteína-NPs Au de la siguiente manera: (i) hay una transferencia de electrones
de la genisteína al Au, (ii) la genisteína reduce el Au3 + a Au0, el cual (iii) actúa
además como un agente estabilizador para formar una capa de iones negativos que
le confieren carga a la superficie de las NPs.
Con el objetivo de poder dilucidar qué tipos de compuestos está reduciendo

las NPs Ag se realizó un fraccionamiento de los extractos se obtubieron tres
fracciones: (1) azúcares y carbohidratos, (2) polifenoles y (3) antocianinas, de
acuerdo a Rodriguez-Saona y Wrolstad (2001), utilizando una columna C-18. Para
lo anterior se utilizó un total de muestra del extracto acuoso a una concentración de
10 mg. La primera fracción se realizó con agua acidificada (0.01 % de HCl)
37
obteniendo 0.0035 g de azúcares y carbohidratos, la segunda fracción con acetato
de etilo se obtuvo 0.0015 g de compuestos polifenólicos y la tercera utilizando
metanol acidificado para obtener 0.0028 g de antocianinas. Cada una de estas
fracciones obtenidas se utilizó para llevar a cabo la formación de NPs Ag, la
segunda y tercera fracción dieron positivo, validando con el cambio de coloración
(Figura 7) (Li et al., 2019; Sharman et al.,2019; Abdullah et al., 2015).
Figura 7.- Biosíntesis de nanopartículas de plata, utilizando tres fracciones del

extracto de Larrea triedentata; A) Azúcares y carbohidratos, B) Polifenoles, C)
Antocianinas.
Adicionalmente el material obtenido se estudió por difracción de rayos X, en la

Figura 8 se presentan los patrones de difracción de rayos X de estos, Cuando se
usa la fracción de carbohidratos, no se obtuvo algún material cristalino, el patrón es
amorfo (sin reflexiones) para el caso de estas partículas obtenidas en la fracción de
polifenoles, se observan 4 reflexiones características a la Ag (discutidas
anteriormente en la Figura 4) y para el caso de la fracción de antocianinas, el patrón
de difracción presentó varias reflexiones que corresponden a la fase de AgCl
(también discutidas en la Figura 4).
38
Antocianinas
Intensidad (U.A.)
Polifenoles
Carbohidratos
PDF#04-0783 - Ag
PDF#31-1238 - AgCl
10 20 30 40 50 60 70 80
2 (Grados)
Figura 8.- Patrones de difracción de rayos X de las nanopartículas obtenidas
usando las fracciones de carbohidratos, polifenoles y antocianinas del extracto
acuoso de Larrea tridentata.
Para identificar el tipo de compuestos presentes en las fracciones obtenidas

con acetato de etilo y metanol (segunda y tercera fracción), se llevó a cabo la
identificación de estos por cromatografía en capa fina (TLC). En la Figura 9 se
observa la placa cromatográfica observada a una longitud de onda de 254 nm, en
donde mediante compuestos de referencia y literatura se identificaron los siguientes
compuestos presentes en el extracto, ácido clorogénico con un factor de retención
(Rf) = 0.071 mm, ácido gálico Rf = 0.58 mm, ácido protocatéquico Rf = 0.81 mm y
siringaldehído Rf = 0.92 mm.
39
Figura 9.- Separación de los compuestos polifenólicos del extracto de Larrea
tridentata obtenidos de fracciones de acetato de etilo mediante cromatografía en
capa fina. A) ácido clorogénico, B) ácido gálico, C) ácido protocatéquico y D)
siringaldehído. Referencia a la banda 1.- Flavona, 2.- Ácido ferulico, 3.-
Siringaldehído, 4.- Ácido protocatéquico, 5.- Ácido trans-cinámico, 6.- Ácido
clorogénico, 7.- Ácido gálico, 8.- Catequina, 9.- Fracción acetato de etilo y 10.-
Fracción de antocianinas.
Adicionalmente, las fracciones fueron analizadas mediante HPLC-DAD, en

donde se logró identificar en la muestra de la fracción de polifenoles, el compuesto
ácido nordihidroguaiarético con un tiempo de retención (tR) de 30.7 min que
coincide con el tR y espectro UV de estándar (Figura 10). Es importante mencionar
que esta fracción contenía componentes polifenólicos principalmente NDGA y otros
fenoles encontrados en la superficie de las hojas de L. tridentata que funcionan
como agentes antimicrobianos y como protección contra los herbívoros, la radiación
UV y la pérdida de agua en la planta (Konno et al., 1990).
40
Figura 10.- Cromatografía liquidad de alta eficiencia. A) Fracción de polifenoles del
extracto de Larrea tridentata; B) Estándares.
El NDGA es una estructura de o-dihidroxi (catecol) que contiene polifenoles

(Figura 11); posee cuatro grupos hidroxilo fenólicos. Como tal, el NDGA es
reconocido como un fuerte antioxidante con varios efectos beneficiosos para la
salud (Lü, et al., 2010)
Figura 11.- Estructura química del ácido nordihidroguaiarético
41
El grupo de Floriano-Sánchez (2006) demostró que NDGA es un potente
eliminador in vitro de especies reactivas de oxígeno (ERO) como peroxinitrito
(ONOO−), oxígeno singlete (1 O2), radical hidroxilo (• OH), anión superóxido (O2−
•), peróxido de hidrógeno (H2O2) y ácido hipocloroso (HOCl); Las propiedades de
eliminación de ERO por NDGA ayudan a explicar su participación como posible
agente reductor de la plata, confirmado por el cambio de coloración (Figura 7B) y el
patrón de DRX con la segunda fracción rica en NDGA (Figura 8), y flavonoides, los
cuales son fundamentales en la reducción del metal para la formación de
nanopartículas (Sathishkumar et al., 2018; Sathishkuma et al., 2016). Debido a la
interacción de los grupos hidroxilo (OH), tienen la capacidad de quelatar diferentes
iones metálicos mediante los siguientes pasos: i) son adsorbidos en la superficie de
metal; ii) empieza el desarrollo de las NPs y posteriormente continúa iii) la
agregación y biorreducción (Makarov et al., 2014).
Se realizaron análisis NMR de los extractos acuosos en donde se observaron

señales de correlación entre hidrógenos aromáticos y dobles enlaces (6 a 9 ppm) e
hidrógenos de cadenas alifáticas unidas a grupos polares (2 a 4 ppm; Anexo D)
características de compuestos fenólicos.
Adicionalmente, se llevó a cabo un análisis de espectroscopía infrarroja de

transformadas de Fourie (FT-IR; Espectrofotometro FT-IR Nicolet Is10 Marca
Thermo Scientific) para la identificación de grupos funcionales presentes en el
extracto de L. tridentata que permiten la reducción, encapsulación y estabilización
eficiente de las NPs Ag sintetizadas. En el espectro de IR tomado al extracto de
gobernadora (Figura 12A) se observa claramente la presencia de polifenoles, lo cual
se demuestra con las bandas asociadas a los alargamientos O-H en 3230 cm-1
(traslapada con C-H en aproximadamente 3050 cm-1) y C=C de anillos aromáticos
en 1594 cm-1, además a los 1380 cm-1 se observa un estiramiento del grupo
carbonílico especificando una banda ancha perteneciente a al ácido carboxílico, en
42
1280 cm-1 se observan el enlace Califático-N. Además, se aprecian bandas
relacionadas a estiramientos y flexiones de enlaces C-O entre 1000 y 1100 cm-1.
El análisis por IR de las nanopartículas de Ag sintetizadas a partir del extracto

de L. tridentata (Figura 12B) muestra que continúa la presencia de la matriz
funcionalizante muy probablemente recubriendo la partícula, con excepción que
disminuyó el porcentaje de transmitancia en los grupos de ácido carboxílico y
carbono alifático con nitrógeno, esto por la detección de bandas asociadas a los
grupos funcionales orgánicos ya mencionados (compuestos fenólicos), atribuyendo
a estos compuestos como los responsables en la reducción de las NPs Ag, puesto
que actúan como un agente reductor de iones de Ag + al interactuar con el grupo O-
H de las biomoléculas del extracto acuoso de L. tridentata, que posteriormente
sufren oxidación a las formas -C=0 y -COOH e interactuando como un agente de
protección a las NPs Ag (Kumar et al., 2015).
A)
% de trasmitancia
C-H
C-H
0-H
-(C=O)OH
C=C
C-O
B)
C-H
C-H
-(C=O)OH
0-H
C-O
C=C
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Longitud de onda (cm-1)
Figura 12.- Espectro de infrarrojo de transformada de Fourier obtenidos de: A)

Extracto acuoso de Larrea. tridentata; B) NPs Ag biosintetizadas.
43
V.3 Cinética de crecimiento de Clavibacter michiganensis
Para conocer el crecimiento de la bacteria in vitro se realizó una cinética de

crecimiento de C. michiganensis en medio de cultivo LB, el cultivo se muestreo cada
2 h, se evaluó el crecimiento bacteriano por densidad óptica a 600 nm (OD600) con
respecto al tiempo y determinar la OD600 viable para su inoculación, evaluando el
tiempo de adaptación de la bacteria que oscila entre las 2 h, pasando a su fase de
crecimiento exponencial dentro de 3 a 8 h, se determinó de a acuerdo a la densidad
y tiempo en incubación dentro de 6 h se obtenía la OD600 = 0.5-0.6 que corresponden
a 1x10-5 y 1x10-6 UFC/mL respectivamente, para inocular cada diferente tratamiento
a esta concentración de UFC, ya que si esta la OD600 es mayor a una absorbancia
de 0.6 la bacteria está en una fase estacionaria de crecimiento, es decir, la bacteria
entra a una fase de metabolismo bajo y donde los nutrientes del medio no son
suficientes para seguir regenerando su colonia entrando a la fase de muerte, la
bacteria no es viable (Figura 13).
2
1.8
1.6
1.4
Absorbancia (UA)
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 5 10 15 20 25
Tiempo (Horas)
Figura 13.- Cinética de crecimiento de Clavibacter michiganensis en medio de

cultivo LB.
44
V.4 Antagonismo in vitro de las NPs Ag
La concentración mínima bactericida se obtuvo a una concentración de 50 mg

L-1 (CMB) (Anexo E) a esta concentración no hubo crecimiento de la bacteria, la
concentración mínima inhibitoria (CMI) se presentó a 2.015 mg L-1, con un 64.47 %
de inhibición de crecimiento de la bacteria con respecto al control (Figura 14A), en
el anexo F se muestran los UFC/mL contabilizadas en el ensayo.
Figura 14.- Antagonismo in vitro contra Clavibacter michiganensis. A) comparación

del antagonismo con NPs Ag; B) extracto acuoso liofilizado de Larrea tridentata y
C) bactericida químico Cuprimicín 100 Hyper.
45
Es importante mencionar que se utilizaron controles de L. tridentata y
cuprimicín 100 Hyper, a las mismas concentraciones de las NPs Ag contra C.
michiganensis. En el extracto de L. tridentata se observó que a las mismas
concentraciones no presentó inhibición de la bacteria (Figura 14B). Sin embargo,
diversos autores señalan el efecto antimicrobial de extractos etanolicos de L.
tridentata en macroorganismos como: Listeria monocytogenes, Clostridium
perfringens (Gram-positiva), Shigella dysenteriae, Yersinia enterocolitica; Proteus
vulgaris (Verástegui et al., 1996), y hongos fitopatógenos como Fusarium
oxysporum radici-lycopersici (Peñuelos-Rubio et al.,2017). Por otro lado, Talibi et al.
(2011) demostró que la inhibición del crecimiento de C. michiganensis es posible
utilizando extractos acuosos de plantas del género Rubus; Anvillea y Pistacia.
Aunque el extracto de L. tridentata no demostró actividad bacteriostática a las

concentraciones utilizadas en el ensayo (Figura 14B) no se descarta que el extracto
a mayores concentraciones pudiera tener efectos antagonistas contra C.
michiganensis, por lo que la actividad antibacteriana se le atribuye a las NPs Ag.
Respecto al control químico (Cuprimicín 100 Hyper) (Figura 14C) utilizando la

concentración recomendada por el proveedor que fue de 600 mg L-1 y evaluando
las mismas concentraciones utilizadas con los ensayos anteriores, se observó que
a 15.5 mg L-1 del bactericida químico inhibe el 56 % del crecimiento bacteriano
atribuyéndole la CMI, utilizando 7.6 veces más cantidad de producto con respecto
a las NPs Ag.
La plata es un agente antimicrobiano con una amplia gama de más de 650

microorganismos de diferentes clases como bacterias Gram-negativas y Gram-
positivas, hongos, virus y levaduras. La plata se usa generalmente como sales de
nitrato, pero cuando se utiliza en forma de nanopartículas de plata, hay un gran
aumento en su eficiencia (Ahmed et al., 2016b).
46
Por otra parte, Kora y Sashidhar (2008) demostraron que las NPs Ag con
tamaño de partícula de 5 nm inhibieron el crecimiento de Staphylocucus aureus
bacteria Gram-positiva, con una CMI de 10 mg L-1 y una CMB de 12 mg L-1. Otros
estudios demuestran el efecto NPs Ag contra bacterias Gram-positivas como
Staphylocucus aureus con CMI de 12.4 mg L-1, Micrococcus aureus 8.8 mg L-1 y
Bacillus subtilus 9.2 mg L-1 (Balashanmugam y Kalaichelvan, 2015).
En comparación con trabajos anteriores, en este trabajo donde las NPs Ag

biosintetizadas con extracto de L. tridentata fueron evaluadas contra C.
michiganensis (Gram-positiva), se evidenció una CMI de 2.015 mg L-1 con NPs Ag
de 2 a 26 nm, demostraron tener mayor efecto a concentraciones bajas, esto puede
ser debido a que las nanopartículas quedaron recubiertas con residuos del extracto
de L. tridentata, el cual pudiera tener un efecto sinérgico bactericida, lo anterior
soportado por los resultados obtenidos por Song et al. (2019), donde la curcumina
utilizada por ellos no solo desempeñó un papel de agente reductor, sino que también
actuó como agente de protección de las NPs Ag las cuales tuvieron mayor efecto
bactericida con respecto a NPs Ag estabilizadas con polivinil pilovirrona (PVP).
Por otro lado, se ha reportado que las bacterias Gram-positivas son menos
susceptibles a la Ag+ que las bacterias Gram-negativas. Esto debido a que la pared
celular de las bacterias Gram-positivas es más gruesa que la de Gram-negativas, la
cual consiste en una cadena de polisacáridos lineales reticulados por péptidos
cortos que forman una estructura rígida, dificultando por esto la penetración de las
NPs Ag (Fayaz et al., 2010), por lo que se demostró con los resultados de este
trabajo que las NPs Ag biosintetizadas con extractos de L. tridentata, fueron
efectivas en el antagonismo in vitro contra C. michiganensis siendo una bacteria
Gram-positiva.
En general las NPs Ag como agente antibacteriano se han destacado con gran
importancia, pero su efecto puede variar dependiendo de los parámetros
fisicoquímicos incluyendo la forma, tamaño, la carga superficial, la concentración y
47
el estado coloidal (Dakal et al., 2016). El efecto antimicrobiano de las NPs Ag
depende del tamaño de partícula, concentración y tiempo de exposición, así como
del tipo de bacteria (Gram-negativa o Gram-positivo), debido que se ha demostrado
que las NPs Ag muestran una mayor acción antimicrobiana contra bacterias Gram-
negativas, debido a la ausencia de la capa gruesa de peptidoglucano de la pared
celular (Tareq et al., 2017)
Por su parte, Abbas et al. (2019) reportaron que las NPs Ag tuvieron mayor
efecto inhibitorio contrala la bacteria fitopatógena Erwinia carotovora subsp.
atroseptica en comparación con el antibiótico estreptomicina, lo anterior es
consistente con los hallazgos de Allahverdiyev et al. (2011) y Sarkar et al. (2007)
quienes reportaron que las NPs Ag tienen un mayor efecto antibacteriano en
comparación con la penicilina y amoxicilina. En este trabajo se obtuvieron resultados
similares en donde las NPs Ag controlaron mejor el crecimiento de la bacteria
comparado con el bactericida comercial.
Con el objetivo de observar el efecto de las NPs Ag en la morfología de la

bacteria se realizó un análisis por SEM después de ser sometida a diferentes
concentraciones de NPs Ag en un medio de cultivo LB. En la Figura 15A se puede
observar la morfología característica de C. michiganensis (muestra control), la
micrografía (Figura 15B), corresponde a la bacteria sometida a una concentración
de 2.015 mg L-1, a la que se le atribuye la CMI, y se puede observar la bacteria
colapsada. Lo anterior se puede deber a su efecto antimicrobiano a través de
mecanismos propuestos en la literatura (Aziz, 2019; 2016; Dakal et al., 2016; Durán,
2016; Prabhu y Poulose, 2012). Conforme se aumentó la concentración de NPs Ag
(9.331 mg L-1), no fue posible observar la presencia de la bacteria ya que solo se
observaron rastros de restos biológicos (Figura 15C).
Un efecto similar fue observado en B. subtilis y E. coli tratadas con NPs Ag

estabilizadas con curcumina en estudios de SEM y TEM. Donde después del
tratamiento con las NPs, la membrana del citoplasma se contrajo y la pared celular
48
se degradó. Las bacterias mostraron una gran cantidad de NPs en la superficie
bacteriana, por lo tanto, se creó una alta concentración de Ag+ temporal y local cerca
de la superficie de la bacteria causando la muerte celular (Song et al., 2019).
Figura 15.- Micrografía de C. michiganensis crecida en medio de cultivo Luria

Bertani (LB). A) sin tratamiento; B) Medio de cultivo adicionado con 2.015 mg L-1 de
nanopartículas de plata; C) Medio de cultivo adicionado con 9.331 mg L-1 de
nanopartículas de plata.
Uno de los mecanismos mediante el cual las NPs Ag son capaces de

interactuar con la pared celular es por medio de atracción electroestática, causando
daños estructurales en la membrana, afectando la permeabilidad de la misma y
causando muerte celular (Prabhu y Poulose, 2012). Otro mecanismo posible, es que
los iones de Ag+ interactúan con grupos de tiol, carboxilo, hidroxilo, amino, fosfatos
y enzimas de la membrana celular, penetrando a través de membranas, se sabe
49
que las NPs Ag inducen la producción de especies reactivas de oxígeno dañando
biomoléculas como el ADN, el ARN, las proteínas, los lípidos, enzimas involucradas
en la síntesis de adenosina trifosfato (ATP) y polisacáridos, ocasionando
modulación de las vías de transducción de señales enzimáticas (Aziz et al., 2016,
2019; Dakal et al., 2016).
También se ha señalado que la adhesión de las NPs Ag a las células

microbianas ocurre mediante atracción electroestática ocasionando una
interrupción de flujo de iones de Ag, lo que da como resultado una acumulación de
estos y por lo tanto interrumpe los procesos celulares como la respiración y su
metabolismo (Durán et al., 2016)
V.5 Evaluación del potencial antibacteriano de nanopartículas de Ag contra

C. michiganensis en plantas de tomate
En la Figura 16 se describen los tratamientos utilizados para evaluar la

efectividad in vivo de las NPs Ag biosintetizadas sobre la enfermedad causada por
C. michiganensis. Se obtuvieron dos tipos de plantas de tomate: unas que provenían
de semillas imbibidas en NPs Ag (18.66 mg L-1) y otras que solo fueron tratadas con
agua.
La concentración de imbibición de semilla utilizada fue debido a que fue la

concentración que favoreció el proceso de germinación (Anexo G). Además de
favorecer el crecimiento radicular y el desarrollo de la plúmula. Este pre-tratamiento
en semillas pudiera ser efectivo contra microorganismos fitopatógenos, ya que uno
de los principales problemas de la infección por C. michiganensis es por infecciones
sistémicas ocasionada en etapas tempranas principalmente por semillas
contaminada (Nandi et al., 2018).
50
Figura 16.- Descripción de los diferentes tratamientos para evaluar el efecto
antibacteriano de las nanopartículas de plata contra Clavibacter michiganensis en
plantas de tomate.
Las plantas de tomate fueron infectadas con la bacteria con la finalidad de

observar su efecto en los síntomas causados por la enfermedad. A los 7 días
después de la infección las plantas mostraron los primeros síntomas, caracterizados
principalmente por un marchitamiento foliar (Figura 17), en los días siguientes se
observó un incremento de plantas infectadas con respecto del tiempo.
Figura 17.- A) Hoja de planta sana; B) Hoja de planta infectada con Clavibacter.
michiganensis.
51
Los tratamientos mostraron diferencias significativas en la incidencia de la
enfermedad (Figura 18), la mayor incidencia se detectó en las plantas control (sin
tratamiento, 35 % y en las plantas que fueron tratadas con NPs Ag a 25 mg L -1, sin
imbibición de la semilla (SSTCm25) de un 36 % incidencia de la enfermedad. Por
otro lado, las plantas tratadas con NPs Ag a 50 mg L-1 con tratamiento previo en la
semilla (NPsCm50) mostraron solo un 20 % de incidencia después de 42 ddi, siendo
el mejor tratamiento para controlar la incidencia de la enfermedad en plantas
infectadas con C. michiganensis, en los demás tratamientos utilizados no se
encontraron diferencias significativas (Figura 18).
Figura 18.- Incidencia de la enfermedad cancro bacteriano en plantas de tomate

inoculadas con Clavibacter michiganensis y tratadas con nanopartículas de plata y
un producto comercial cuprimicín 100 Hyper. (Análisis de varianza (ANVA)
comparación de medias prueba SLD Fisher (p < 0.05), letras diferentes muestran
diferencia significativa entre tratamiento).
En los ensayos de índice de severidad (ISE), los tratamientos no presentaron

diferencias significativas a los 7, 14 y 21 ddi; al día 28 ddi el tratamiento de
NPsCm50 (semilla embebida con 18.66 mg L-1, y planta-asperjada con 50 mg L-1 de
NPs Ag) disminuyó el ISE 0.63 veces (23 ± 1.91 %) con respecto del control (36 ±
1.63 %). En el resto de los tratamientos el comportamiento fue similar al de las
52
plantas control. La aplicación de nanopartículas por vía foliar redujo
significativamente el ISE, la mayor disminución de la enfermedad fue alcanzada por
aquellas plantas con el tratamiento NPsCm50 desde el día 28 hasta los 42 días
después de inoculación (Figura 19).
Figura 19.- Efecto de los tratamientos en el índice de severidad de los síntomas de

la enfermedad causada por Clavibacter michiganensis. (Análisis de varianza
muestran diferencia significativa entre tratamiento).
V.6 Evaluación del crecimiento bacteriano en tejido de Solanum

lycopersicum
Con el objetivo de dar un seguimiento al progreso de la enfermedad en el

tejido, se contabilizó la cantidad de bacteria presente. El crecimiento de C.
michiganensis fue reducido en todos los tratamientos evaluados comparados con el
tratamiento control (Figura 20), el efecto inhibitorio fue observado a partir del día 4
ddi y fue monitoreado hasta el día 45 ddi., a partir del 8 ddi los tratamientos
presentan un diferencia significativa en el crecimiento de C. michiganensis en tejido
de S. lycopersicum, esto se debe a que son los primeros 4 ddi, aún está en un
proceso de adaptación e inoculación en el tejido, además de coincidir con los
53
primeros síntomas de marchitamiento. La primera aplicación de tratamiento se
realizó a parir los 10 ddi (NPs Ag o cuprimicín 100 Hyper) semanalmente, durante
cuatro semanas.
Los resultados mostraron un efecto diferencial entre las plantas de las semillas
que tuvieron un tratamiento previo con NPs Ag (18 mg L-1) NPsCm 50 99.99 % en
comparación con las plantas que solo fueron asperjadas foliarmente después de la
infección con C. michiganensis SSTCm25 (95.6 %), ambos tratamientos redujeron
la población de la bacteria drásticamente (Figura 20 B y C).
Figura 20.- Incremento de Clavibacter michiganensis en el tejido de plantas de

tomate infectadas; A) Plantas control; B) Plantas asperjadas con soluciones de NPs
Ag y C) Plantas de semillas imbibidas y asperjadas con NPs Ag. (Análisis de
varianza (ANVA) comparación de medias prueba SLD Fisher (p < 0.05).
54
En la caso de las plantas asperjadas con las soluciones de NPs Ag a una
concentración de 50 mg L-1, desde los 8 a los 45 ddi se mantuvo un 98 % de
inhibición del crecimiento de la población en el tejido (1033.98 ± 573.94 UFC/g de
tejido) con respecto al control (61460.33 ± 5037.10 UFC/g de tejido; figura 20B) fue
estadísticamente diferente; mientras que en el tratamiento de 25 mg L -1 las
aplicaciones periódicas hicieron que se alcanzará un 96.9 % de inhibición del
crecimiento (1866.14 ± 573.94 UFC/g de tejido) a los 45 ddi de C. michiganensis,
con respecto al control (61460.33 ± 5037.10 UFC/g de tejido) con diferencia
estadísticamente significativa (p < 0.05), en el tratamiento NPsCm25 a partir de la
cuarta aplicación empezó a controlar el crecimiento bacteriano en el tejido, durante
las primeras tres aplicaciones a esta concentración fue bacteriostática, es decir, se
aplicaron las NPs Ag y controlaba el crecimiento, sin embargo esta se recuperaba
y de la misma manera durante las siguientes dos aplicaciones.
Por otro lado, se observó un efecto marcado en disminución de la población

bacteriana en los tratamientos con semilla imbibidas con NPs Ag y asperjadas
semanalmente con las mismas (Figura 20C), en donde el crecimiento de la bacteria
se inhibió el 99.25 % con la dosis de 25 mg L-1 (460.75 ± 64.71 UFC/g de tejido) y
el 99.99 % en la de 50 mg L-1 (en donde no se detectó ningún crecimiento) con
diferencia estadísticamente significativa (p < 0.05) con respecto al control (61460.33
± 5037.10 UFC/g de tejido).
Cabe señalar que el tratamiento previo de imbibición de NPs Ag a la semilla,

protegió a la planta de la infección bacteriana al no permitir el crecimiento de la
población de C. michiganensis en el tejido, alcanzando una inhibición del
crecimiento de 95.88 % (2528.75 ± 494.8 UFC/g de tejido) a los 45 ddi con diferencia
estadísticamente significativa (p < 0.05) con respecto al control (61460.33 ± 5037.10
UFC/g de tejido). El tratamiento NPsCm solo son plantas obtenidas de semillas
pretratadas con NPs Ag, y después fueron infectadas, durante los primeros 12 ddi
presento un control de la inhibición del crecimiento bacteriano en tejido, a partir del
55
día 28 ddi presentó efectos bacteriostáticos. Siendo el mejor tratamiento aquel en
donde las semillas recibieron tratamiento previo y las plantas obtenidas de estas
fueron espejadas con NPs Ag, al tener el mayor efecto en la reducción de
crecimiento de C. michiganensis en el tejido y controlar de la severidad de la
enfermedad en las platas de tomate.
Todos los tratamientos con NPs Ag demostraron un mejor control de la

población bacteriana en el tejido comparadas con el control químico (Cuprimicín 100
Hyper) debido a que este, pudo disminuir la población bacteriana en un 94.66 %
(3280.2 ± 340.10 UFC/g de tejido) hasta después de 45 ddi con respecto del control
(61460.33 ± 5037.10 UFC/g de tejido). Este fue aplicado a las concentraciones
recomendadas por el fabricante de 600 mg L-1 semanalmente, la cual es 12 veces
mayor que la concentración de NPs Ag más alta utilizada (50 mg L-1).
Un estudio similar a este trabajo, reportado por Cumplido-Nájera et al. (2019)

en donde realizaron un estudio in vivo para el control de C michiganensis en plantas
de tomate, las cuales trataron con una dosis de 250 mg L-1 de nanopartículas de
cobre con silicio (NPs Cu-Si), estas fueron capaces de reducir la severidad de la
enfermedad en 28 % con respecto del control, siendo esta concentración superior a
los resultados obtenidos en este trabajo con del NPs Ag (50mg L-1). Por otro lado,
Ocsoy et al. (2013) reportaron el uso de NPs Ag para el tratamiento y control de
Xantomonas perforans en plantas de tomate en condiciones de invernadero, las
cuales redujeron la severidad de la enfermedad en esas plantas en comparación
con el control, sin embargo, el tratamiento no presento diferencia significativa contra
las plantas tratadas con un agroquímico comercial (cobre+Mancozeb). En un
estudio reciente Liao et al. (2018) obtuvieron buenos resultados para combatir a X.
perforans en plantas de tomate con nanopartículas de óxido de magnesio a
concentraciones de 1000 y 200 µg mL-1
56
Diversos estudios reportan el uso de NPs Ag sintetizadas con extractos de
plantas para el control de enfermedades bacterianas de cultivos de importancia
agrícola como el realizado por Santiago et al. (2019) quienes reportaron la síntesis
verde de NPs Ag en combinación con quitosano utilizando extractos de hojas de
tomate, redujeron la incidencia de la marchitez bacteriana causada por R.
solanacearum. Mishra et al. (2017), reportaron el efecto in vivo de NPs Ag
biosintetizadas con una cepa bacteriana (Stenotrophomonas sp. BHU-S7 MTCC
5978) en donde la aplicación de estas a una concentración del tratamiento con 10
mg L-1 logró inhibir al 100 % la podredumbre del garbanzo causada por Sclerotium
rolfsii en condiciones de invernadero. Por otro lado, Savchenko et al. (2016) lograron
la eliminación de microorganismos fitopatógenos recurrentes en invernaderos al
aplicar NPs Ag en el tratamiento de aguas, inhibiendo del 90 al 99 % del crecimiento
Pseudomonas sp. (bacteria Gram-negativa), Fusarium oxysporum (hongo) y
Paenibacillus (una bacteria Gram-positiva) reduciendo el daño de estas
enfermedades en raíz.
Por su parte, Vanti et al. (2018) utilizaron extractos acuosos de Gossypium

hirsutum para la síntesis de NPs Ag las cuales inhibieron el crecimiento de dos
bacterias fitopatógenas X. axonopodis pv. malvacearum y X. campestris pv.
Campestris y además no mostraron efectos fitotóxicos en su aplicación en plantas
de Vigna unguiculata. En este sentido, en el presente trabajo se evaluaron
parámetros agronómicos como número de hojas, altura, diámetro de tallo y biomasa
de raíz, en donde se encontró que las NPs Ag aplicadas foliarmente a una
concentración de 50 mg L-1 (NPsCm50) mantuvieron el número de hojas al igual
que en las plantas del control absoluto (sin tratamiento y no infectadas con la
bacteria) (Cuadro 3) a diferencia de las plantas del tratamiento control infectadas
con C. michiganensis y de las plantas tratadas con Cuprimicín 100 Hyper.
57
Cuadro 3.- Evaluación de variables morfológicas de las plantas de tomate bajo
diferentes tratamientos 42 días después de la infección
Altura Diámetro de Biomasa seca Longitud de

Tratamiento No. Hojas
(cm) tallo (mm) de raíz (g) raíz (cm)
Control 14 ± 0.3 cd 57.85 ± 0.35 c 12.13 ± 0.57 ab 6.35 ± 0.51 bc 19.95 ± 0.7 a
Cuprimicín 14 ± 0.2 d 44.92 ± 4.3 d 11.84 ± 0.62 ab 3.59 ± 0.09 de 21.47 ± 1 a

100 Hyper
NPsCm 15 ± 0.3 b 62.63 ± 3.26 bc 11.79 ± 0.39 ab 6.78 ± 0.66 abc 21.09 ± 1 a
NPsCm25 14 ± 0.3 bc 66.23 ± 2.15 ab 10.86 ± 0.41 b 5.42 ± 0.83 cd 23.69 ± 2.14 a
NPsCm50 17 ± 0.2 a 67.57 ± 1.23 ab 12.47 ± 0.46 a 9.12 ± 1 a 20.43 ± 0.77 a
SSTCm25 14 ± 0.2 bc 64.38 ± 2.51 abc 11.24 ± 0.2 ab 8.15 ± 0.99 ab 23.5 ± 1.5 a
SSTCm50 15 ± 0.3 b 62.98 ± 3.32 bc 11.35 ± 0.51 ab 8.55 ± 1.61 ab 21.04 ± 0.98 a
Control 17 ± 0.3 a 72.5 ± 2.16 a 10.86 ± 0.51 b 4.53 ± 1.55 cd 23.59 ± 1.92 a
absoluto
*Análisis de varianza (ANVA) comparación de medias prueba SLD Fisher (p < 0.05), letras
diferentes muestran diferencia significativa entre tratamiento.
En la variable de altura, todas las plantas de los diferentes tratamientos

asperjadas con NPs Ag presentaron comportamientos estadísticamente iguales, las
cuales obtuvieron valores superiores comparados con las plantas control (57.85 ±
0.35 cm) incrementando su altura hasta en un 14.48 % en las plantas del tratamiento
NPsCm50 (66.23 ± 2.15 cm); sin embargo, este tratamiento fue menor en 9.4 % en
comparación de las plantas del control absoluto (72.5 ± 2.16 cm), cabe mencionar
que las plantas tratadas con control químico redujeron su altura un 61.4 % (44.92 ±
4.3 cm), comparadas con el control absoluto.
La biomasa seca de raíz presentó una diferencia significativa (p < 0.05) entre
los tratamientos resultando superior el tratamiento NPsCm50 con un incremento de
biomasa del 88 % con respecto al control absoluto y un 34 % en comparación a las
plantas control infectadas (Cuadro 3 y Figura 21), se pude observa que el desarrollo
radicular del tratamiento NPsCm50 presentó mayor producción de raíces
secundarias en comparación del tratamiento con cuprimicín 100 Hyper donde el
58
desarrollo radicular se muestra afectado, la inhibición del alargamiento de la raíz en
las plantas es mediada por la activación de ACC (ácido aminociclopropano-
1carboxílico) que tiene un efecto cascada sobre varias enzimas que inhiben la
biosíntesis de etileno (Siddiqui et al., 2015). Este comportamiento observado es
similar al estudio realizado por Lira-Saldívar et al. (2016) quienes demostraron que
el uso de NPs ZnO combinadas con Ag promovieron el crecimiento en plantas de
Capsicum annuum obteniendo porcentajes superiores de altura en un 16.8 %,
número de hojas en 32.6 %, biomasa seca de raíz de 112.5 % y longitud de raíz de
24.4 %, en comparación con el control. Sin embargo, no se observó diferencias
significativas en las variables de diámetro de tallo y longitud de raíz entre los
tratamientos infectados con la bacteria.
Figura 21.- Desarrollo radicular de plantas de tomate infectadas con C.

michiganensis y tratadas con diferentes concentraciones de nanopartículas de
plata.
Las plantas infectadas por C. michiganensis se vieron drásticamente afectadas

en la producción de hojas, por ser una enfermedad que causa marchitamiento en
las hojas, el número de estas disminuyó por la severidad de la enfermedad en la
planta. También afectó directamente el crecimiento de la planta al ser una bacteria
que provoca una infección al sistema vascular ya que una vez que llega al xilema
ocasiona obstrucción al tránsito de minerales y reduce el metabolismo de la planta,
59
provocando un estrés tanto nutricional como hídrico causando el marchitamiento
(Nandi et al., 2018; EPPO. 2016; Flores et al., 2009).
En este trabajo se comprobó el efecto in vivo de las NPs Ag contra la bacteria,

pese a que diversos estudios señalan que, en la aplicación de las NPs vía foliar, las
hojas pueden presentar una tasa de asimilación baja, debido a solamente una ligera
parte son trasportadas a otros tejidos de las plantas (Wang et al., 2019). Eso se
debe a una de las primeras barreras que se encuentran las NPs en las plantas es
la cutícula de las hojas, al estar cubierta por pubescencia y una capa cerosa que
controla los flujos de gases, agua y solutos, limitando la penetración de las NPs a la
planta (Pollard et al., 2008).
Por otro lado, se ha demostrado que la absorción de sustancias hidrofílicas a traves

de las aberturas de los estomas, la cual es la unica via confirmada de absorción de
NPs mediante aplicaciones foliares hacia los tejidos internos (Lv et al., 2019). Por
su parte, Pérez-de-Luque (2017) consigna que, mediante esta ruta, las NPs deben
de penetrar la cutícula y cruzar varios tejidos como epidermis, endodermis y
barreras como la franja caspariana antes de llegar a los tejidos vasculares, para
poder seguir el movimiento vía simplástica o apoplástica. Esta es una posible ruta
por la cual las NPs Ag pudieran estar translocándose por el sistema vascular de la
planta y de esta manera reducir el crecimiento de C. michiganensis resultando en
una menor severidad de la enfermedad; al ser una bacteria que causa una infección
sistémica provocando la obstrucción del sistema vascular de la planta (Nandi et al.,
2018; EPPO, 2016), por ende, al reducirse dentro del tejido, los sintomas de
marchitamiento se reducen y por consiguiente se reduce o detiene la severidad
causada por C. michiganensis.
60
VI. Conclusiones
La síntesis de NPs Ag con un rango de tamaños menores a los 30 nm, fue

posible utilizando como agente reductor extractos acuosos de hojas de L. tridentata,
mediante fitocompuestos de la planta (biorreductores naturales), renovables y de
bajo costo para la producción de estas, pudiendo reducir o evitar de esta manera el
uso de solventes tóxicos y peligrosos para el ambiente. El componente principal del
extracto acuosos al que se le atribuye la reducción de NPs Ag fue NDGA y una
combinación de otros fenoles.
Se demostró que las NPs Ag biosintetizadas son efectivas para el control de

C. michiganensis a concentraciones 12 veces que un producto comercial,
disminuyendo la severidad de la enfermedad cuando estas fueron aplicadas
foliarmente en concentraciones de 50 mg L-1.
Los resultados obtenidos en este trabajo demostraron buena efectividad de las

NPs Ag en el manejo y control de la enfermedad provocada por C. michiganensis
en plantas de tomate, además de tener un efecto promotor de germinación y
crecimiento de estas, lo que indica la posibilidad de realizar una formulación
nanobactericida utilizando como componente las NPs biosintetizadas, para ser
empleado en enfermedades causadas por bacterias en plantas de importancia
agrícola. Esto implica que dichas NPs pudieran coadyuvar en el desarrollo de
paquetes tecnológicos para un manejo sustentable del cultivo de S. lycopersicum,
así como de otras solanáceas y quizás en otra especie agrícola de alto valor
económico.
61
VI.1 Perspectivas
• Es necesario investigar la traslocación de las NPs en la planta, seguir

todo el ciclo de cultivo para observar los efectos de NPs Ag en la
productividad y calidad de los frutos.
• Evaluar las NPs Ag biosintetizadas y su interacción con bactericidas
comerciales, realizar pruebas contra hongos fitopatógenos.
• Realizar estudios de estabilidad para poder tener este compuesto como
ingrediente activo en la formulación de un nanobactericida.
• Se considera que este trabajo debería repetirse en todo el ciclo de
cultivo y validarse con C. michiganensis, así como en otras especies.
• Es importante estudiar el efecto de las NPs Ag contra microrganismo
benéficos del suelo.
62
VII. Referencias
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75
VIII. Anexos
Anexo A. Curva estándar de ácido gálico para cuantificar fenoles del extracto de
Larrea tridentata
1.4
y = 0.0123x + 0.0037
1.2 R² = 0.9969
Absorbancia (UA)
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 20 40 60 80 100 120
Concentración (μg)
76
Anexo B.- Curva estándar de catequina para cuantificar flavonoides del extracto de
Larrea Tridentata.
0.25
y = 0.0007x - 0.0084
0.2
Absorbancia (UA)
R² = 0.9925
0.15
0.1
0.05
0
0 50 100 150 200 250 300 350
Concentración (μg)
77
Anexo C. Curva de imbibición de semillas de tomate variedad. floradade
0.75
0.7
0.65
Peso (gr)
0.6
0.55
0.5
0.45
0.4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Tiempo (h)
78
Anexo D. Reporte de resultados de Análisis por Resonancia Magnética Nuclear de
extractos liofilizados de Larrea tridentata (Gobernadora) Por la Dra. Alma Leticia
Saucedo Yañez, Departamento de Química Analítica. Facultad de Medicina, UANL
Datos y descripción de las muestras
Identificador Peso de las Descripción

muestras
EG 50.1 mg Extracto acuoso liofilizado de

Larrea tridentata pesado
individualmente por triplicado
Preparación de las muestras
Para la obtención de los espectros de RMN se evaluaron tres disolventes

diferentes:
1. Metanol tetradeuterado (MeOD-d4, Sigma Aldrich).

2. Dimetilsulfóxido hexadeuterado (DMSO-d6, Sigma Aldrich).
3. Agua deuterada (D2O, 99.9 % al 0.75 % de 3-trimetilsililpropionionato de
sodio-d4 (TSP), Sigma Aldrich) adicionada con un amortiguador de
Na2HPO4/NaH2PO4 100 mM preparado con H2O (destilada) y ajustado a pH
7.0, la relación D2O:H2O es 90:10.
Para la preparación de las muestras, a los 50.1 mg de extracto liofilizado

(contenido previamente en un tubo cónico de plástico) se la añadieron 600 µL de
disolvente utilizando una micropipeta (Eppendorf Research Plus 1000 Q13537E,
Alemania). Las muestras fueron homogenizadas por agitación en vórtex, sonicadas
durante 5 minutos, y centrifugadas a 13000 xg por 5 minutos. Finalmente, 550 µL
79
del sobrenadante fueron trasferidos a tubo de RMN de 5 mm (Bruker, BioSpin,
USA).
Obtención de espectros
Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) fueron obtenidos en un
espectrómetro Bruker 400 MHz Avance III HD (Bruker, BioSpin, USA) equipado con
una sonda BBO SP 5mm con gradientes de campo en Z.
Los espectros de 1H-RMN de las muestras disueltas en MeOD-d4 y DMSO-d6

fueron adquiridos utilizando la secuencia PROTON, con 16 incrementos a 25°C (298
K). La escala de desplazamiento químico de 1H fue referenciada con la señal
multiplete del disolvente residual a 3.31 ppm para el MeOD-d4 y 2.5 ppm para el
DMSO-d6.
Para la muestra disuelta en D2O/H2O el espectro de 1H-RMN fue adquirido

utilizando la secuencia NOESYPRGP1D para realizar la supresión de la señal agua
en 4.7 ppm, con 16 incrementos a 25°C (298 K). El espectro de 13C-RMN fue
adquirido con 12288 incrementos mediante la secuencia C13CPD. Los espectros
bidimensionales 1H-1H-TOCSY y 1H-13C HSQC fueron obtenidos con 16
incrementos y 256 transcientes, el espectro 1H-13C HMBC fue obtenido con 16
incrementos y 128 transcientes. La escala de desplazamiento químico fue
referenciada con la señal de 3-trimetilsililpropionato-d4 de sodio (TSP) a 0.0 ppm,
tanto para 1H como para 13C.
Todos los experimentos fueron realizados a 25°C (298 K), a un valor de ganancia
fijo (rg=36) y fueron procesados de forma manual con el software TopSpin 3.6.1
(Bruker BioSpin, Alemania).
Espectros de 1H-RMN
En general, en los espectros de 1H-RMN de las distintas muestras analizadas se

observan señales múltiples y bien definidas que distribuyen en un intervalo de
80
desplazamiento químico que va 0.5 a 9.5 ppm, sin embargo, al hacer la comparación
de los espectros que se muestran en la Figura 1, es notable que el espectro de
obtenido en D2O/H2O hay un mayor número de señales y éstas presentan en varios
casos una mayor intensidad.
Figura 1. Espectros de la 1H-RMN obtenidos a 400 MHz de los extractos liofilizados

de L. tridentata. A. Espectro del extracto liofilizado disuelto en DMSO-d6. B. Espectro
del extracto liofilizado disuelto en MeOD-d4. C. Espectro del extracto liofilizado
disuelto en D2O/H2O en buffer de fosfatos 100 mM a pH=7.0.
En los espectros de 13C-RMN se observa una tendencia similar en relación a la

intensidad y el número de señales. En el espectro de obtenido en D2O/H2O hay un
mayor número de señales, éstas presentan en varios casos una mayor intensidad y
están distribuidas en un intervalo más amplio de desplazamiento químico, ver Figura
2. Vale la pena aclarar que el corrimiento que se observa en algunas señales está
asociado al cambio de disolvente.
81
Figura 2. Espectros de la 13C-RMN obtenidos a 100 MHz de los extractos liofilizados
de L. tridentata. A. Espectro del extracto liofilizado disuelto en DMSO-d6, la señal
intensa que se observa alrededor de 40 ppm corresponde al disolvente. B. Espectro
del extracto liofilizado disuelto en MeOD-d4, la señal intensa que se observa
alrededor de 50 ppm corresponde al disolvente. C. Espectro del extracto liofilizado
disuelto en D2O/H2O en buffer de fosfatos 100 mM a pH=7.0, la señal intensa que
se observa en 0.0 ppm corresponde TSP.
Para apreciar mejor las señales de los espectros acuosos, en la Figura 3 se

muestran de forma individual.
82
Figura 3. Espectro de 1H-RMN obtenido a 400 MHz (panel superior) y espectro de
13C-RMN obtenido a 100 MHz (panel inferior) de extractos liofilizado de L. tridentata
disuelto en D2O/H2O en buffer de fosfatos 100 mM a pH=7.0.
Espectros de RMN bidimensionales
83
A continuación, se muestran los espectros bidimensionales COSY, TOCSY y HSQC
que fueron obtenidos para el extracto liofilizado que fue disuelto en D 2O/H2O en
buffer de fosfatos 100 mM a pH=7.0. Estos espectros son utilizados ampliamente
en el análisis metabolómico por RMN para verificar la asignación de señales y la
identidad de distintos compuestos.
Espectro COSY
En este espectro las señales observadas son correlaciones 1H-1H por la interacción
de núcleos que están unidos de forma covalente a 2 y 3 enlaces de distancia, Figura
4. Este espectro tiene como principal ventaja que el tiempo requerido para su
obtención es relativamente corto y su interpretación es relativamente sencilla, ya
que las señales fuera de la diagonal son generadas por el acoplamiento entre
núcleos vecinos. En el espectro de la Figura 4 son claramente observadas señales
de correlación entre hidrógenos aromáticos y dobles enlaces (6 a 9 ppm) e
hidrógenos de cadenas alifáticas unidas a grupos polares (2 a 4 ppm).
Figura 4. Espectro COSY del extracto liofilizado disuelto en D2O/H2O en buffer de

fosfatos 100 mM a pH=7.0.
84
Espectro TOCSY
En este espectro las señales observadas son correlaciones 1H-1H por la interacción
de núcleos que están unidos de forma covalente en cadena, Figura 5. Este espectro
proporciona información adicional al COSY, ya que las correlaciones observadas
son generadas por el acoplamiento de sistemas de espín (a más de 3 enlaces
covalentes de distancia. El espectro TOCSY es particularmente útil para la
identificación de carbohidratos y aminoácidos. En la figura 5 son claramente
observadas señales generadas por la presencia de sistemas de espín entre 8 y 9
ppm, así como entre 0.5 y 5.5 ppm).
Figura 5. Espectro TOCSY del extracto liofilizado disuelto en D2O/H2O en buffer de

Espectro HSQC
En este espectro las señales observadas son correlaciones 1H-13C por la interacción
de núcleos que están unidos de forma covalente un enlace de distancia. Este
espectro es particularmente útil debido a que tiene una buena resolución y que
debido a la dispersión de señales en la dimensión de 13C se reducen los problemas
de traslape de señales. En la figura 6 son claramente distinguibles señales en toda
la ventana espectral de 13C, sin embargo, hay un mayor número de señales en la
85
región de 60 a 90 ppm, que corresponde a átomos de carbono unidos a grupos
polares como hidroxilos, aminas, etc.
Figura 6. Espectro HSQC del extracto liofilizado disuelto en D 2O/H2O en buffer de

86
Anexo E. Ensayo de antagonismo in vitro de las NPs Ag contra C. michiganensis,
siembra directa de los tubos de ensayo
87
Anexo F.- Unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC/mL) del antagonismo
in vitro, de las NPs Ag, L. tridentata y cuprimicín 100 Hyper contra C, michiganensis,
comparación de las medias prueba Duncan (p< 0.05). Cada uno en ensayos
separados.
mg L-1 NPs Ag L. tridentata Cuprimicín 100 Hyper
0 2.31x109 ± 2.65x107 a 7.53x108 ± 3.76x107 d 5.87x108 ± 2.91x107 a
1.209 1.88x109 ± 4.16x107 b 1.77x109 ± 4.16x107 a 5.63x108 ± 5.21x107 a
2.015 8.9x108 ± 5.8x106 c 105x109 ± 1.07x108 c 4.63x108 ± 1.2x107 b
3.359 4.9x108 ± 1.21x07 d 1.12x109 ± 1.45x107 bc 3.67x108 ± 8.8x106 c
5.598 4.67x107 ± 0 e 1.23x109 ± 4.48x107 bc 3.5x108 ± 1x107 c
9.331 0±0e 1.26x109 ± 1.14x108 bc 3.17x108 ± 8.8x106 c
15.552 0±0e 1.07x109 ± 3.67x107 bc 2.53x108 ± 8.8x106 d
25.92 0±0e 7.23x108 ± 1.33x107 de 1.17x108 ± 8.8x106 e
43.2 0±0e 6.77x108 ± 2.9x107 de 1x107 ± 0 f
72 0±0e 6.17x108 ± 4.26x107 de 0±0f
120 0±0e 6.77x108 ± 2.33x107 de 0±0f
200 0±0e 5.3x108 ± 9.5x107 e 0±0f
600 - - 0±0f
*Análisis de varianza (ANVA) comparación de media prueba SLD de Fisher (p <

0.05), letras diferentes muestran diferencia significativa entre tratamiento.
88
Anexo G.- Ensayos de germinación de semilla de tomate variedad Floradade con
nanopartículas de plata.
Metodología
Antes del ensayo de antagonismo in vivo, se evaluaron diferentes

concentraciones en un rango de 0 a 86.4 mg L -1 de NPs Ag con el objetivo de
observar a que concentraciones las NPs Ag afectan la germinación y el desarrollo
de plántulas de S. lycopersicum.
Lo anterior se realizó acorde a lo reportado por Ruiz-Torres et al. (2016),

previamente se determinó el tiempo de imbibición las semillas de tomate variedad
floradade mediante una curva, para esto fueron depositadas 50 semillas en caja
Petri a peso constante con tres repeticiones, estas fueron abastecidas con agua
destilada, cada hora las semillas fueron pesadas (eliminando el exceso de agua)
(Anexo C) para determinar el tiempo en el cual las NPs Ag estarían en contacto con
las semillas.
El ensayo consistió en imbibir semillas de tomate a diferentes concentraciones

de NPs Ag por 18 h, se sembraron 25 semillas en papel anchor por repetición,
contando con 5 repeticiones por concentración de NPs Ag (0, 4.03, 6.72, 18.66,
51.84 y 86.4 mg L-1), se incubaron en una cámara de crecimiento (tipo Phytotron,
Marca Equitec) a 25 °C y fotoperiodo de 16/8 (día/noche) considerando cada semilla
como unidad experimental. Se establecieron 2 momentos de evaluación de acuerdo
a los criterios de la International Seeds Testing Association (ISTA) para semillas de
tomate, la primera a los 5 días después de la siembra (dds) para evaluar el número
de semillas germinadas y la segunda evaluación a los 14 dds para evaluar el número
de plántulas con desarrollo normal.
Los bioensayos se realizaron utilizando los criterios de la (ISTA), los cuales

incluyendo el estudio de las estructuras morfológicas características de una
plántula: desarrollo del sistema radicular, coloración típica de la raíz, tamaño del
89
vástago (se evaluó; la longitud de la plúmula debe ser por lo menos tres veces mayor
el tamaño de la semilla), porcentaje de plántulas anormales, longitud media de la
plúmula (LMP), longitud media de la radícula (LMR) y contenido de biomasa (CB).
Este ensayo se realizó en las instalaciones de la Universidad Autónoma

Agraria Antonio Narro (UAAAN), en el laboratorio de Tecnología de Semillas. Para
cada bioensayo realizado se utilizó un diseño experimental completamente al azar.
De las dos evaluaciones mencionadas algunos de los datos obtenidos se

sometieron a las ecuaciones de reportadas por Maukrad et al. (2014), para
determinar el porcentaje de germinación (%G) e índice de germinación expresado
en unidades porcentuales (IG %). Dichas ecuaciones se muestran a continuación:
𝑆𝐺 × 100
%𝐺 =
𝑇𝑆
Donde:
%G = Porcentaje de germinación.
SG = Número de semillas germinadas.
TS = Número de semillas totales.
% 𝐺𝐶 − % 𝐺𝑇
𝐼𝐺 % = ( ) 100
% 𝐺𝐶
Donde:
IG % = Índice de germinación.
%GC = Porcentaje de germinación del lote control.
%GT = Porcentaje de germinación del lote tratado con NPs Ag.
Para determinaran la longitud media de plúmula y longitud media de raíz se

utilizó una cinta métrica. Para la obtención del porcentaje de plántulas anormales,
se contaron las plántulas que no cumplieron con los criterios antes mencionados en
90
cuanto a la morfología característica para los periodos establecidos e incorporar el
dato a la siguiente relación:
𝑁𝑃𝐴 𝑥 100
𝑃𝐴 =
𝑇𝑆𝐺
Donde:
PA = Porcentaje de Plántulas Anormales
NPA = Número de plántulas anormales
TSG = Total de Semillas Germinadas
Los datos obtenidos se análizaron con el Software estadístico InfoStat versión

2018I de comparación de media con la prueba LSD Fisher a un nivel de significancia
(p < 0.05).analizaron mediante un análisis de varianza (ANVA) y se realizó la
comparación de medias mediante la prueba Duncan (α≤ 0.05).
Resultados
Se estudió el efecto de las NPs Ag en la germinación de semillas, debido a

que es la etapa más temprana en el crecimiento de la planta. Además de que estos
ensayos son ampliamente utilizados para realizar pruebas de fitotoxicidad debido a
varias ventajas como sensibilidad, simplicidad y bajo costo (Lü et al., 2018). El
estudio tuvo como objetivo evaluar si las concentraciones de NPs Ag utilizadas en
las pruebas de antagonismo in vitro pudieran generar cambios significativos en la
morfología de plantas de (Solanum lycopersicum).
Diversos estudios han evidenciado que las NPs Ag pueden tener impactos
positivos y/o negativos en las plantas que dependen de factores que regulan la
absorción y acumulación en las plantas (Tripathi et al., 2017; Wang et al., 2015). La
absorción, translocación, y la acumulación de las NPs Ag en las células depende
del diámetro de la partícula y propiedades celulares como estructura y
permeabilidad (Li et al., 2015). Además, las NPs deben cruzar varios tejidos
epidermis, endodermis y barreras como la franja caspariana y cutícula antes de
llegar a los tejidos vasculares, pueden seguir la ruta simplástica y apoplástica
91
(Pérez-de-Luque, 2017). Su tamaño nanométrico les permite transitar a través de
los poros de la pared celular y eventualmente alcanzar la membrana plasmática
(Yan y Chen, 2019) y al entrar en la célula son capaces de crear alteraciones
morfológicas y bioquímicas (Jha y Pudake, 2016).
En el Cuadro 1 se presentan los resultados obtenidos de las variables

analizadas a los 14 días posteriores de la imbibición de las semillas en las diferentes
concentraciones de NPs Ag. Se observa una diferencia estadística en el porcentaje
de germinación (p > 0.05), tras imbibir las semillas en las suspensiones de NPs Ag,
sin tener una diferencia significativa entre concentraciones de estas. Cabe destacar
que las semillas presentaron una germinación del 54 % (control) y que
incrementaron su germinación en un promedio de 90 % al utilizar las NPs. Un
estudio realizado por Thangavelu et al., (2019) demostraron que las NPs Ag son
capaces de romper la dormancia de semillas de Withania somnifera incrementando
el porcentaje de germinación en 50 % y en menor tiempo, este porcentaje se mejoró
con respecto a diferentes tratamientos con giberelinas y otros compuestos
inductores de germinación.
De acuerdo con la literatura se menciona que las NPs Ag forman complejos

con la cubierta de la semilla que permiten el paso de agua, mejorando su absorción
o activación de enzimas necesarias para el proceso de germinación, mejorando la
actividad de α-amilasa, producen más especies reactivas de oxígeno e inciden en
la hidrolisis del almidón para mantener el crecimiento del embrión, que da como
resultado de una semilla vigorosa (Mahakham et al., 2017; Lawar y Raskar, 2014).
92
Cuadro 1.- Comparación de las variables evaluadas en el ensayo de germinación
de semillas tomate imbibidas en suspensiones de nanopartículas de plata.
Índice de
NPs Ag Germinación Vigor de plántula
germinación
(mg L-1) (%) (%)
(%)
0 54.40 ± 7.33 b 0.00 32 ± 0.02 d
4.03 92.80 ± 3.44 a 70.59 56.80 ± 8.80 bc
6.72 92.00 ± 2.83 a 69.12 70.40 ± 6.14 ab
18.66 96.00 ± 2.53 a 76.47 81.60 ± 2.71 a
51.84 96.80 ± 1.50 a 77.94 85.60 ± 3.25 a
86.4 90.40 ± 3.49 a 66.18 60 ± 5.80 bc
*Análisis de varianza (ANVA) comparación de media prueba Duncan (p < 0.05),

letras diferentes muestran diferencia significativa entre tratamiento.
Resultados similares a este trabajo, en promover el proceso de germinación

han sido reportados por Almutairi y Alharbi (2015) en donde evaluaron el efecto de
NPs Ag sobre la germinación de tres especies de plantas: maíz, sandía y calabacita,
en donde las NPs Ag mejoraron la tasa de germinación para las tres plantas;
además de incrementar el porcentaje de germinación para plantas de sandía y
calabacita en comparación con semillas no tratadas. Sin embargo, observaron que
este tratamiento tiene un efecto tóxico en las raíces del maíz. En general, la
toxicidad de las NPs Ag depende de propiedades como el recubrimiento, diámetro,
forma, área y carga superficial y de la especie de planta (Haghighi y da Silva, 2014;
Scherer et al., 2019).
El porcentaje de vigor de germinación obtuvo la mejor respuesta con la

concentración de 51.84 mg L-1, siendo el valor obtenido 2,67 veces mayor (85.60 ±
3.25 %) con respecto al control (32 ± 0.02 %). Cabe destacar que a la concentración
más alta utilizada la diferencia fue 0.5 veces mayor (60 ± 5.80 %) con respecto al
control (32 ± 0.02 %) sin embargo, se empezaron a notar efectos adversos cuando
se incrementa la concentración de NPs Ag a 86.4 mg L-1. El vigor de germinación
93
describe diversas características que determinan su nivel de actividad y el
comportamiento en ambientes adversos. Esas características están asociadas a los
siguientes aspectos del comportamiento de las semillas como velocidad y
uniformidad de germinación y crecimiento de las plántulas. Las pérdidas de vigor
están relacionadas con la reducción de la habilidad que tienen las semillas para
llevar a cabo todas las funciones fisiológicas que les permiten germinar y emerger.
En el largo de la plúmula (LP) se obtuvo una respuesta significativa (p > 0.01),

donde los tratamientos con mejor respuesta fueron con 6.72 y 18.66 mg L -1 (4.83 ±
0.14 cm; 4.78 ± 0.14 cm), siendo sus plántulas 0.66 veces más altas con respecto
al control (3.23 ± 0.15 cm; Cuadro 2). Por otro lado, el largo de la raíz presento un
comportamiento similar siendo las concentraciones de 6.72 y 18.66 mg L -1,
incrementando su longitud 0.53 veces más (8.33 ± 0.30 cm; 8.19 ± 0.26 cm) con
respecto al control (3.23 ± 0.15 cm). Sin embargo, a la concentración de 86.4 mg L -
1 inhibió el crecimiento de la raíz en 0.75 veces (3.34 ± 0.19 cm) con respecto al
control (4.45 ± 0.30 cm).
Cuadro 2.- Comparación de las variables evaluadas a los 14 días en el ensayo de

germinación de semillas tomate imbibidas en suspensiones de nanopartículas de
plata.
NPs Ag Longitud de Longitud de raíz Peso seco

(mg L-1) plúmula (cm) (cm) (mg)
0 3.23 ± 0.15 b 4.45 ± 0.30 cd 16.80 ± 0.00 c
4.03 3.75 ± 0.12 b 4.96 ± 0.29 d 20.40 ± 3.07 bc
6.72 4.83 ± 0.14 a 8.33 ± 0.30 a 26.66 ± 3.30 ab
18.66 4.78 ± 0.14 a 8.19 ± 0.26 a 27.02 ± 1.92 ab
51.84 4.63 ± 0.13 a 6.96 ± 0.22 b 34.36 ± 1.70 a
86.4 3.80 ± 0.11 b 3.34 ± 0.19 e 22.40 ± 2.44 bc
*Análisis de varianza (ANVA) comparación de media prueba Duncan (p < 0.05),

letras diferentes muestran diferencia significativa entre tratamiento.
94
Diversos estudios han referido que estos efectos de elongación se deben a la
regulación positiva que tienen las NPs Ag en proteínas como la CDK-2 (ciclo de
división celular quinasa-2), 1,6-bisfosfato aldolasa, protoclorofilida oxidorreductasa.
También a la expresión de genes implicados en el metabolismo celular, IAA-8
(proteína 8 de ácido acético de indol), RD22 (sensible a la deshidratación) y NCED3
(dioxigenasa de 9-cis-epoxicarotenoide) (Siddiqui et al., 2015). También se han
registrado impactos negativos de las NPs Ag en la germinación de semillas de:
arroz, cebada, frijol y nabo, los cuales son dependiente de la dosis (Thuesombat et
al., 2014; Thiruvengadam et al., 2014; El-Temsah y Joner 2012). En Arabidopsis
thaliana, la inhibición del alargamiento de la raíz en las plántulas es mediada por la
activación de ACC (ácido aminociclopropano-1-carboxílico) que tiene un efecto
cascada sobre varias enzimas que inhiben la biosíntesis de etileno (Siddiqui et al.,
2015).
Las NPs Ag biosintetizadas con extracto de gobernadora no tuvieron efecto

negativo en la germinación y desarrollo de las plántulas provenientes de semillas
imbibidas en soluciones con concentraciones que fueron efectivas in vitro para el
control de C. michiganensis. Por lo que se realizó el experimento de la infección in
vivo imbibiendo semillas en solución de 18.66 mg L-1 de NPs Ag, que fue la
concentración con mayor efecto en la germinación de semillas.
95

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CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN QUÍMICA APLICADA

PROGRAMA DE POSGRADO EN AGROPLASTICULTURA

Efectividad antibacterial in vitro e in vivo de nanopartículas de plata

Rolando Méndez Andrade

Para obtener el grado de:

MAESTRO EN CIENCIAS EN AGROPLASTICULTURA

Asesor: Dra. Ileana Vera Reyes

Co-asesor: Dr. Luis Alfonso García Cerda

Saltillo, Coahuila, Octubre 2019-

A mis hermanos, por su comprensión y tolerancia, por ser excelentes personas,

A mis compañeros, que durante estos dos años convivimos y compartimos

A todos aquellos que han aportado a mi conocimiento

Al CIQA por permitirme estudiar el posgrado y las instalaciones para realizar el

Al proyecto interno de CIQA 6385, titulado: Biosíntesis de nanopartículas obtenidas

A la Q.F.B. Bertha Alicia Puente Urbina quien me asesoro durante mi estancia en el

A la Dra. Norma A. Ruiz Torres quien me dio la oportunidad de trabajar en el

Al Dr. Jorge Arturo Cañas Montoya de la Universidad Autónoma de Coahuila por su

Al Ing. Felipe Hernández Castillo por ayuda y facilitación de herramienta en las

I.2 Clavibacter michiganensis.......................................................................... 2

I.3 Nanotecnología .......................................................................................... 3

I.3.1 Aplicación de nanopartículas en la agricultura ........................................ 4

I.5 Síntesis de nanopartículas ......................................................................... 6

I.5.1 Síntesis de nanopartículas usando extractos de plantas ........................ 8

I.6.1 Propiedades antimicrobianas de Larrea tridentata ................................ 12

II. Hipótesis ......................................................................................................... 17

III.2 Objetivos específicos ............................................................................... 17

IV. Materiales y métodos .................................................................................. 18

IV.2 Preparación del extracto .......................................................................... 18

IV.3 Caracterización del extracto ..................................................................... 19

IV.3.1 Cuantificación de fenoles ................................................................... 19

IV.5 Caracterización de las nanopartículas ..................................................... 23

IV.6 Antagonismo in vitro contra Clavibacter michiganensis ........................... 24

IV.7 Análisis de muestras biológicas en microscopía electrónica de barrido ... 25

IV.8 Antagonismo in vivo contra C. michiganensis .......................................... 26

IV.8.1 Evaluación de incidencia y severidad de C. michiganensis en plantas

V.2 Extracción y cuantificación de compuestos reductores ............................ 36

V.3 Cinética de crecimiento de Clavibacter michiganensis............................. 44

V.4 Antagonismo in vitro de las NPs Ag ......................................................... 45

V.5 Evaluación del potencial antibacteriano de nanopartículas de Ag contra C.

V.6 Evaluación del crecimiento bacteriano en tejido de Solanum lycopersicum

VI. Conclusiones ............................................................................................... 61

VII. Referencias ................................................................................................. 63

Figura 1.- Mecanismo propuesto de la participación de los fenoles en la reducción

Figura 3.- Espectros de UV- Vis obtenidos durante la reacción de la formación de

Figura 4.- Patrones de difracción de rayos X, muestras a concentraciones 1:1, 1:2 y

Figura 5.- Micrografía de TEM e histograma de distribución de tamaños de partícula

Figura 7.- Biosíntesis de nanopartículas de plata, utilizando tres fracciones del

Figura 8.- Patrones de difracción de rayos X de las nanopartículas obtenidas usando

Figura 9.- Separación de los compuestos polifenólicos del extracto de Larrea

Figura 10.- Cromatografía liquidad de alta eficiencia. A) Fracción de polifenoles del

Figura 11.- Estructura química del ácido nordihidroguaiarético............................. 41

Figura 12.- Espectro de infrarrojo de transformada de Fourier obtenidos de: A)

Figura 13.- Cinética de crecimiento de Clavibacter michiganensis en medio de

Figura 14.- Antagonismo in vitro contra Clavibacter michiganensis. A) comparación

Figura 15.- Micrografía de C. michiganensis crecida en medio de cultivo Luria

Figura 16.- Descripción de los diferentes tratamientos para evaluar el efecto

Figura 18.- Incidencia de la enfermedad cancro bacteriano en plantas de tomate

Figura 20.- Incremento de Clavibacter michiganensis en el tejido de plantas de

Figura 21.- Desarrollo radicular de plantas de tomate infectadas con C.