Analisis de AFLP

UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS “ESPE”
Nombre:Carol Lisseth Borja Cuadro Docente: Dr. Eduardo

Argotti
Materia: Biología Molecular Fecha: 19/08/2020
1. TEMA
“Análisis artículo científico: Marcadores AFLPs”
2. OBJETIVO
- Conocer la metodología y aplicación de la técnica AFLP dentro de la
amplificación de PCR como base en los conocimientos de la carrera de
ingeniería en biotecnología.
3. INTRODUCCIÓN
Los polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados, más conocidos

por su acrónimo inglés AFLP ("Amplified fragment length polymorphism"), son
un tipo de marcador molecular que está basado en la restricción del ADN
genómico mediante enzimas de restricción y en la subsecuente amplificación de
algunos de esos fragmentos mediante la reacción en cadena de la polimerasa.
Son una herramienta poderosa de análisis del genoma dado que poseen un alto
poder de detección de la variabilidad genética. El ensayo de AFLP combina la
especificidad, resolución y poder de muestreo de la digestión con enzimas de
restricción con la velocidad y practicidad de la detección de polimorfismos
mediante PCR, sin necesidad de disponer de información previa del genoma a
estudiar, lo cual supone una ventaja considerable pues otras técnicas para
detección de variabilidad genética necesitan una etapa previa en la cual se
secuencia el DNA genómico.
4. DESCRIPCIÓN DE LA METODOLOGÍA
Se uso como la secuencia principal de adaptadores de AFLP como se conoce se uso una
secuencia central y otra específica teniendo en cuenta que la estructura del adapator
EcoRI es:
5-CTCGTAGACTGCGTACC
CATCTGACGCATGGTTAA-5
En cuanto a la estructura del adaptador MseI consto de la siguiente manera:
5-GACGATGAGTCCTGAG
TACTCAGGACTCAT-5
Mientras que, los adaptadores para otras enzimas de 'cortador raro' eran idénticos al
adaptador EcoRI con la excepción de que se utilizaron extremos cohesivos, que son
compatibles con estas otras enzimas. El adaptador TaqI era idéntico al adaptador MseI
con la excepción de que se utilizó un extremo cohesivo compatible con TaqI.
En cuanto a la metodología y modificación del ADN con la respectiva preparación de
diez placas fue dde la siguiente manera, el ADN genómico de 0.5g se lo incubo en el
tiempo de una 1 hora a 37°C junto con los adaptadores EcoRI y MseI, las cuales
requierierón de 6-8 bases en secuencia específica para poder hidrolizar, lo que genera
fragmentos muy grandes debido a la baja frecuencia de estos sitios de corte. Para
aumentar el número de cortes, por otro lado, la digestión se llevó a cabo en combinación
con otra enzima TaqI que solamente necesita 4 bases y que, por lo tanto, generó mayor
número de fragmentos. En ambos casos, las enzimas tienen alta especificidad,
garantizando la reproducibilidad del patrón de fragmentos de ADN.
A los fragmentos generados se les acopla unos "adaptadores" (oligonucleótidos

sintéticos) de doble cadena, de 10-30pb, en los extremos, utilizando la enzima T4 ADN
ligasa. Estos "adaptadores" de secuencia conocida, son utilizados para la amplificación
por PCR, utilizando primers complementarios. Los primers contienen además una
extensión de 1 a 3 nucleótidos en el extremo 3’ y, si es necesario para su detección, una
marca radioactiva o fluorescente. Con estos primers, solamente se amplificaron los
fragmentos que contuvieron los nucleótidos extras, además de aquellos del "adaptador".
Esto permitió llevar a cabo la amplificación bajo condiciones astringentes, dándole
selectividad y reproducibilidad al método. Los productos amplificados fueron separados
en un gel de poliacrilamida y el polimorfismo se identifica por la presencia o ausencia
de una banda determinada.
5. RESULTADOS
Se detectaron todos los fragmentos predichos para los ADN del fago X y AcNPV,
También para Acinetobacter y ADN de levadura, el número de fragmentos se
correspondía bien con los tamaños del genoma de estos organismos, al hacer la adición
de nucleótidos selectivos a los cebadores de AFLP redujo el número de bandas en 4
veces con cada base selectiva adicional, y al añadir un nucleótido extra como una huella
digital, fue como un subconjunto de la huella digital original indicando que los
nucleótidos selectivos fueron de forma precisa al tomar en cuenta un conjunto
específico de restricción. Los principales experimentos con toma de huellas de AFLP
que contenían ADN de animales y plantas demostraron que se requeria de cebadores de
AFLP con al menos tres nucleótidos selectivos tanto cebador EcoRI como el MseI
dando que estos generan patrones de banda útiles. En el paso de preamplificación dio
como resultado dos diferencias importantes en comparación con la amplificación directa
de AFLP en la primera fase se redujo las manchas de los patrones de huellas dactilares y
el ellas con combinaciones de cebadores carecían de bandas en comparación con las
huellas dactilares generadas pero sin preamplificación con los cebadores AFLP lo
cuales tienen tres nucleótidos selectivos dando como resultado un novel bajo de
productos de amplificación de desajustes dando como resultado fragmentos de
restricción sin ajustes. Estos resultados demuestran que el procedimiento AFLP. es
insensible a la concentración de la plantilla de ADN, aunque se observarán huellas
dactilares aberrantes en diluciones de plantilla muy altas que dan sólo unas pocas
moléculas de plantilla al comienzo de la reacción. Lo más probable es que los
fragmentos de restricción individuales no se distribuyan aleatoriamente a
concentraciones de ADN tan bajas, lo que explica las diferencias observadas en las
intensidades de las bandas. Esta hipótesis está respaldada por nuestro hallazgo de que la
comparación de una serie de huellas dactilares de AFLP individuales obtenidas con solo
2,5 pg de ADN molde mostró una alta variación en la intensidad de las bandas
individuales.
6. CONCLUSIÓN
- Con el análisis del estudio realizado de la técnica AFLP con ensayos

polifórmicos se comprueba que la ausencia o presencia de fragmentos
amplificados de un dado tamaño, está determinada por mutaciones puntuales,
inversiones, inserciones y deleciones que llevan a la pérdida o ganancia de un
sitio de restricción o la alteración de la secuencia reconocida o amplificada por
los iniciadores.
Bibliografía
Vos, P., Hogers, R., & Bleeker, M. (1995). AFLP: a new technique for ADN
fingerprinting. Nucleic Acids Research, 4407-4414.

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