PROGRAMA BACTERIOLOGIA Y

LABORATORIO CLÍNICO

CURSO BIOLOGÍA MOLECULAR y GENÉTICA

GUÍA DE LABORATORIO
EXTRACCIÓN ÁCIDOS NUCLEICOS

Introducción

La extracción de Ácidos nucleicos es un procedimiento general que consiste en tres etapas

consecutivas: disgregación de las células o tejidos (lisis celular), inactivación de las nucleasas
intracelulares y en separación de los ácidos nucleicos de los demás componentes celulares.

LISIS CEULAR. Durante la lisis celular se procede a la destrucción de las estructuras formadas por
lípidos y proteínas permitiendo la liberación de los ácidos nucleicos del núcleo celular. La lisis se
lleva a cabo mediante una solución salina que suele contener detergentes que desnaturalizan las
proteínas y/o proteasas. Una vez separados los ácidos nucleicos de las proteínas y lípidos se lleva
a cabo su purificación.

PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS. Los métodos de purificación presentan una gran

variabilidad y están desarrollados en función de las propiedades físico-químicas de las moléculas
de ADN y ARN.

PRECIPITACIÓN MEDIANTE SALES Y ALCOHOLES: Tras la lisis celular y la eliminación de las

proteínas de la muestra, se precipitan los ácidos nucleicos añadiendo isopropanol o etanol. Este
método permite la obtención de ADN de gran pureza y presenta la ventaja de que las soluciones
utilizadas son muy seguras para la salud del personal técnico que realiza la extracción.

EXTRACCIÓN CON SOLVENTES ORGÁNICOS: En este protocolo el lisado celular se mezcla con
fenol, cloroformo y alcohol isoamílico para la separación de los ácidos nucleicos y las proteínas.
Este método permite obtener un alto rendimiento pero es frecuente que restos de solventes
orgánicos contaminen la muestra. Además, el uso de estas sustancias tóxicas para la salud hace
necesario que todo el proceso se lleve a cabo en una campana de extracción de productos
químicos.

ADSORCIÓN EN COLUMNA DE SÍLICE: En presencia de ciertas sales los ácidos nucleicos quedan
retenidos por adsorción en columnas de sílice. Posteriormente las columnas se lavan con
soluciones salinas que eliminan las partículas que no se han unido y finalmente los ácidos
nucleicos son eluídos con agua o una solución con una baja concentración de sales.

SEPARACIÓN MAGNÉTICA: En este método las muestras lisadas se mezclan con esferas
magnéticas con capacidad de unirse a los ácidos nucleicos. Tras una serie de lavados para
conseguir la máxima purificación del material genético las esferas son retiradas de la solución
mediante un separador magnético.
MÉTODO DE PRECIPITACIÓN POR SALES.

Principio.En primer lugar, se procede a una lisis celular con un detergente aniónico que solubiliza
los componentes celulares e inhibe la acción de las nucleasas intracelulares. A continuación, se
desnaturalizan y se eliminan las proteínas por precipitación salina. El ADN en solución se precipita
con isopropanol y se lava con etanol para finalmente ser resuspendido en un tampón estabilizante
para ADN. Se puede utilizar para muestras de sangre, células bacterianas, tejidos y muestras de
saliva entre otras.

Dado que se utilizan diferentes kits basados en el método de precipitación por sales se recomienda
seguir las instrucciones específicas de cada kit respecto a cantidades de reactivos, los tiempos de
incubación, así como los tiempos y velocidades de centrifugación indicados de forma específica para
cada tipo de muestra.

PROTOCOLO GENERAL

✓ Se añade solución de lisis a la muestra. En este paso es necesario asegurar una lisis celular
eficiente, por lo que si la muestra se observa homogénea se puede continuar con el paso
siguiente del protocolo; por el contrario, si se observa la presencia de cuerpos celulares enmla
solución se recomienda una incubación a 37ºC o 65ºC hasta una homogeneización completa de
la muestra. En cualquier caso, las muestras son estables en solución de lisis durante al menos 2
años a temperatura ambiente, de modo que el proceso puede pararse en este paso,
manteniendo las muestras en oscuridad, y continuar en días posteriores.

✓ Si se pretende obtener una muestra libre de ARN se procede a la adición de RNAsa con una
incubación a 37ºC de entre 15- 45 min. Este paso no es necesario en muestras de sangre periférica
en las que la contaminación por ARN es prácticamente indetectable. Sí que es aconsejable en otro
tipo muestras como células, saliva o tejidos. No obstante, la cantidad de RNAsa a añadir es
proporcional al tipo y cantidad de muestra de partida, recomendándose seguir las indicaciones del
protocolo específico correspondiente para cada tipo de muestra.

✓ Se añade una solución salina que permite la precipitación de las proteínas citoplasmáticas y
nucleares de la muestra. Se procede a una agitación vigorosa de la muestra (con vórtex) durante 20-
30 segundos. A continuación, se lleva a cabo una centrifugación a la velocidad y tiempo necesarios
para asegurar la precipitación total de las proteínas. Las proteínas precipitadas se observarán en el
fondo del tubo como un botón de color marrón. El sobrenadante debe observarse sin turbidez o
presencia de partículas o trazas de color marrón; si no fuese así, debe procederse a una incubación
de la muestra durante 5 minutos en hielo repitiendo de nuevo la centrifugación.
✓ El sobrenadante que contiene el ADN en solución se transfiere a un nuevo tubo con isopropanol.
La muestra se mezcla con el isopropanol invirtiendo el tubo suavemente aproximadamente 50
veces. En este paso se puede observar la aparición de la hebra de ADN. No obstante, la
observación de esta hebra va a depender de la cantidad de muestra de ADN procesada.

✓ Se procede a la centrifugación de la muestra para precipitar el ADN en el fondo del tubo. El

ADN se observará como un precipitado de color blanquecino.

✓ Con mucho cuidado, se elimina el sobrenadante por decantación y el tubo con el precipitado
de ADN se coloca invertido sobre una hoja limpia de papel absorbente para eliminar al
máximo el remanente de isopropanol.
 ✓ Se añade Etanol al 70%, se tapa el tubo y se invierte con suavidad varias veces para lavar el
precipitado de ADN.

✓ La muestra se centrifuga y el etanol se elimina por decantación o extracción mediante

punta de pipeta (con mucho cuidado puesto que el ADN puede despegarse del fondo del tubo).
Debemos asegurarnos de que el precipitado de ADN sigue observándose en el fondo o en las
paredes del tubo.

✓ El exceso de etanol se elimina mediante inversión del tubo sobre una hoja limpia de papel
absorbente o dejando secar el tubo al aire durante unos minutos hasta que no se observen restos
de etanol. No obstante, es importante evitar que el precipitado quede demasiado seco porque de
este modo se dificulta su posterior resuspensión.

✓ Se procede a la hidratación del ADN con una solución tamponada adecuada, o bien con
tampón TE (Tris HCl 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM) o agua estéril.

✓ Se recomienda realizar una incubación durante aproximadamente 1 hora a 65ºC para

facilitar la resuspensión del ADN.

Muestras de sangre total: para este tipo de muestras es necesaria la realización previa de una lisis
selectiva de glóbulos rojos. Para ello se añaden tres volúmenes de una solución de lisis de glóbulos
rojos al volumen inicial de sangre total a lisar. La muestra se mezcla por inversión y se deja actuar
durante 5 minutos invirtiendo el tubo con suavidad varias veces durante la incubación. Si la muestra
se ha lisado completamente se observará un cambio de color hacia una tonalidad bastante más
oscura. Posteriormente se procede a una centrifugación para precipitar los leucocitos de la muestra
que quedan pegados en el fondo del tubo mientras que el sobrenadante que contiene los glóbulos
rojos lisados se elimina por decantación.
Es conveniente dejar un pequeño volumen de líquido residual de 200-400 μl para resuspender los
leucocitos mediante un vigoroso vórtex de aproximadamente 20 segundos. A continuación, se
procede a la lisis celular de los leucocitos correspondiente al paso 1 del protocolo general descrito
anteriormente.

BIBLIOGRAFÍA Elkins K. M, Chapter 4 - DNA Extraction, Editor(s): Kelly M. Elkins,Forensic DNA

Biology, Academic Press, 2013, Pages 39-52.

Barbosa C,Nogueira S, Gadanho M, Chaves S ,Chapter 7 - DNA extraction: finding the most suitable
method, Editor(s):

Cook N, D'Agostino M, K,Thompson C, Molecular Microbial Diagnostic Methods, Academic Press,

2016, Pages 135-154. 2004.

-Nucleic Acid Isolation and Purification Manual. www.roche-applied-science.com. -DNA Isolation

Methods. World of Forensic Science, 2006. Gale Cengage.
 PRÁCTICA EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE SANGRE HUMANA
OBJETIVO: Obtener ADN a partir de una muestra de sangre humana empleando el kit comercial,
Wizar Genomic de Promega.

MATERIALES Y EQUIPOS

Lapicero Sharpie
punta DELGADA

Gradilla y Tubos
eppendorf

Cajas para
guardar ADN

MUESTRA DE SANGRE KIT EXTRACCIÓN DE

ADN PROMEGA ISOPROPANOL ETANOL 70%
FRIO
 METODOLOGÍA

LISIS CELULAR

1-Adicione 900 μl (microlitros) de Buffer DE LISIS CELULAR

(frío) en un tubo de eppendorf.

2.Adicione 900 μl (microlitros) de sangre tomada previamente

en un tubo con EDTA tapa lila.

3.Mezcle por inversión unas 20 veces

4. Incube por 10 minutos a Temperatura Ambiente.

5-Centrifugue a 13.000 gravedades por 3 minutos

6. DESCARTE EL SOBRENADANTE (glóbulos rojos lisados)

7. El precipitado ó pellet (glóbulos blancos en el fondo del

tubo), se mezcla en un vortex durante 30 segundos

LISIS NUCLEAR
8. Adicione 300 μl(microlitros) de SOLUCIÓN LISIS NUCLEAR,
mezcle por inversión 20 veces.

PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS

9. Adicione 100ul de la SOLUCIÓN DE PRECIPITACIÓN DE

PROTEÍNAS; llevar al vortex por 20 segundos.

. 10. Centrifugue a 13.000 gravedades por 3 minutos. SE DEBE

OBSERVAR UN PRECIPITADO o BOTÓN MARRON QUE
CORRESPONDE A LAS PROTEÍNAS PRECIPITADAS
PRECIPITACIÓN Y REHIDRATACIÓN DEL DNA
11.Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo que contenga
300 microlitros de isopropanol frío y mezclar por inversión
unas 20 veces

12. Centrifugar a 13000 gravedades por 1 minuto. El ADN

DEBE QUEDAR PRECIPITADO Y TIENE UN ASPECTO BLANCO.

13. Descarte el sobrenadante. Adicionar 300 microlitros de

etanol al 70%

14. Centrifugue a 13000 gravedades durante 1 minuto

15. Descarte el etanol, volteando directamente el tubo en un

recipiente de descarte, sin sacudirlo para que el ADN no se
desprenda del fondo del tubo, con cuidado voltear el tubo sobre
un papel absorbente para que escurra el etanol durante 10 a 15
minutos.

16. Rehidrate el ADN adicionando 100 microlitros de buffer de

rehidratación de ADN. Dejar en la gradilla de tubos de eppendorf
durante unas dos horas a temperatura ambiente. Conserve
el ADN en refrigeración a 40 C o en congelación a -200 C.
 TALLER

1- Realice un flujograma del protocolo utilizado para extraer ADN a partir de una Célula
Procariota de importancia en su carrera profesional. ¿Qué diferencia observa con el
método de extracción de ADN a partir de una muestra de sangre?

2- ¿Realice la extracción de ADN a partir de Saccharomyces cerevisae, Indique el paso

a paso en un flujograma

3- Muestre el paso a paso para obtener ácidos nucleicos a partir de una muestra
nasofaríngea con sospecha infección Covid-19.