RT-PCR

Retomando la extracción de ADN, conversión a ADNc, amplificación por PCR, más adelante, se
verán características de PCR cuantitativa (qPCR).
RT-PCR transcripción inversa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa. Método que
permite analizar la expresión de un gen en particular en una muestra, es decir, si el gen esta
expresado o no. 0.35
Conversión de ARN a ADNc. Evalua la expresion del gen pero no de manera cualitativa.
 Cualitativa Punto final PCR
 Cuantitativa Tiempo real pcr
Rna humano usa oligodt como base para transformar el rna a adnc por el efecto de la cola de poliA
del mensajero.
El bacteriano, fúngico y demás, se utiliza (2:02) hexámeros para hacer la transformación. Porque
son 6 nt aleatorios que se van a pegar al rna en cualquier sección y apartir de el se hace el adnc.

SIGUIENTE IMAGEN:
1) Se Need Extraer El Arn, tener
el extracto celular,
cuantificarlo: calidad
(electroforesis)
2) RT: AMLV o MMLV son
enzimas mas comunes
3) Por ultimo PCR 2:50
 1) rna humano de sangre periférica: se aisla
linfocitos con gradiente de densidad. Sln salina +
EDTA
2) Ponerla sobre la sln de lympoprep, relación
1:1
3) Centrifugar, después se recupera el anillo de
mononucleares q incluye linfocitos y
monocitos, se lava con sln salina fría para
elimina algún linfocito que quede
4) Sln salina fría, se centrifuga, decanta, el pellet
de pastilla queda en el tubo completamente
blanco para buena calidad.
5) ya que se tiene el anillo, se resuspende e trizol, eso para la extracción de rna se
resuspenden perfectamente las cells
6) Se transfieren a un tubo eppendorf de 1.5 y
se puede conservar a -70 a -20 o se procesa
directamente.

PROCESAMIENTO (5:40): agg cloroformo,

procesa en vortex, lisis cell, separacon de fases,
recuperar sobrenadante, de ese sbn se precipita
el arn con isopropanol, el resto se deja para
xtraccion de proteínas y adn.

(6:10) Después de separar el sbn, se agg

isopropanol, se incuba, decanta se lava con etanol al
80, centrifugación, se seca a temp ambiente x 5 min
con una gasa para minimizar corrientes de aire q
contaminen con rnasa. Se resuspende en agua
inyectable a temp de 45-42 grados 5 min se
resuspende por pipeteo y se tiene el rna.

CUANTIFICACION/ INTEGRIDAD (gel agarosa)  7:15

Se tienen que ver las 2 sub unidades, después se ajusta
la [] para hacer la rx de RT. RNA se puede conservar a
-70 C pero no es muy recomendable, lo ideal es q se
procese de manera continua para mejorar calidad. Si se
conserva se repite la cuantificación.
7:55 RT simpe. Se toma el arn total a partir de
arnm se hibridan con el oligodt y a partir de
eso la rt va a extender y generar el adnc.

TRANSCRIPCION INERSA 8:25

Se hace en 2 etapas: se tiene rna total, el 50%
es mensajero y el otro es ribosoma y de
transferencia.
Por cada 1 ug de arn total se agg 0.5 ug de
oligoDT.
El arn se calienta a 70 C después se enfria para la hibridación, aquí solo se tiene rna, buffer, y
oligoDT. Después se agg la transcriptasa, más componentes, nucleótidos trifosfatados y se eleva la
temp a 37 o 42 C dependiendo de la enzima usada. Se deja la extensión por 1 hr. Y se completa la
cadena de adnc.
(10:00) Cuando se pasa lo anterior a PCR, el 1 paso de desnat… inicial a 95 C, va a eliminar el arn
que se encuentra. El proceso es en 2 etapas, porque primero se pone el oligoDT, agua, rna, para rx
final, se incuba a 70 C x 2 min.  Esto elimina estr 2 del arn mensajero
Se enfria x 2 min (hibridación de la cola poli A con oligo dt), se agg el buffer DTT (desnaturaliza
proteínas q estén contaminando o rnasas) se agg nt y la enzima MMLV-RT (virus de leucemia
mulina de muroni) trabaja a 37C, buena, económica, practica. La otra es AMV: virus de muloni
aviar, trabaja a 42 C, trabaja con arn largos o si se busca arn largos, si se trabaja con bacterias u
hongos que no tienen oligoDT. Es un poco mas eficiente
2 etapas  rt y pcr ….. La polimerasa tiene capacidad de tener actividad de RT por lo q funciona
al mismo tiempo  esto se hace continuo no en 2 etapas. La limitante es que te deja detectar solo
un amplificado.
Cuando son 2 etapas, se convierte todo el arnm a adnc y apartir de este adnc se detecta varios
mensajeros al mismo tiempo, siempre y cuando la cantidad que se tenga sea suficiente  esta rx
se prepara en 20 ul y la cantidad de rna usada es de 2-4 ug por lo tanto se usa 1 ug de oligoDT. LA
RELACION MAS COMUN
PCR. Se ponen los iniciadores, sustrato q es el adnc, el molde, nucleótidos, pol, buffer. La
amplificación se da.
 Durante la polimerización se copia la primera cadena del cdna lo que genera un dsDNA
2 ETAPA PCR 14:35

CONDICIONES ESTÁNDAR DE UNA PCR

2 ug = 2 ul de rx
La [ ] final siempre va a ser de 1 x , [ ]
MgCl2 varia entre 1.5 – 3.5 ml
dNTPS varia entre 0.2 – 0.3 o 0.4 dependiendo de la
extensión o del tamaño del fragmento.
Iniciador sentido/antisentido: 0.2 ug
Cantidad total de la rx es de 50 UL, 20 uL

TERMOCICLADOR  15:47
Es para punto final
Pre pcr desnt 94-94, alin 5-10 min
Pcr
Todo esto pasa a la electroforesis para observar
tamaño del amplificado q corresponda con el
amplificado.
 PCR A TIEMPO REAL O PCR CUANTITATIVA (qPCR)
Es una variación de la pcr estándar q se emplea para la cuantificación de ADN y ARN en una
muestra.
Utilizando iniciadores específicos puede medir el # de copias de ARNm q contiene una muestra 
RT-PCR para la medida de la expresión genética.
 Utilizan un revelador (fluoroforo fluorescente) q monitorea el proceso de replicación del
material genético.
1:21 se mide después de 30-40 ciclos de
amplificación. Misma cantidad de material de inicio
puede dar lugar a diferente cantidad de producto
final. Por contaminantes q modifican la eficiencia.
 Dif cantidad material al inicio da la misma
cantidad de producto final. Por la eficiencia
exponencial hace que se produzca la misma
cantidad de producto.

SOLUCION: PCR TIEMPO REAL  2:09

La principal característica esq detecta la
acumulación del amplicon durante la rx y se
realiza por la fluorescencia. El producto de pcr
marcado con un fluorocromo llamado reporter.
Cantidad de fliorescencia es directamente
proporcional al producto
+ Fluorescencia + producto
Cantidad de fluorescencia se cuantifica en cada
ciclo en una gráfica. Fluorescencia vs # ciclo pcr
Se analizan los datos y se hace una cuantificación.
Lo que le da alta precisión. 2 a la n
TIPOS DE FLUOROFOROS ( 4:00 aprox) . Son sondas de hibridación (stim lop), son 3 hibridaciones:
foward, reverse y sonda de hibridación. Cuando se distancia el fluroforo del quencher, hace q el
reportero de una señal. HAY SONDAS HIBRIDACION Y DE HIDROLISIS. Las de hibridación se pegan
y se despegan, y las otras hidrolisis se quedan quitas pero por el efecto de exonucleasa 5’-3´ de la
pcr se van degradando x lo q el reportero se libera del apagador, por lo q esas sondas son
acumulativas.
El reportero o el donador cuando se exita lo q emite hace q se exite la 2 sonda o aceptor, por lo
que en vez de aceptar la señal del primero, se capta la señal del aceptor. Tiene una distancia de 2-
5 nt , después del efecto hay una incorporación de 2 nt  estas sondas hibridación especificas
permiten ver mutaciones, snips de inserción, delesion.
La mas usada pero con limitantes es sybergreen. Es un agente intercalante 10 mil veces mas
sensible q bromuro de etidio
Sondas de hibridacion se detectan en el paso de alineamiento y en sondas intercalantes en
extensión al extenderse en la doble cadena, solo funciona adnds
 7:20 DEFINICIONES
UMBRAL. Punto donde se puede medir o detectar
de manera confiable la fluorescencia
BASELINE: no hay cambios significativos en la pcr,
también se toma como ruido de fondo.
CICLO UMBRAL. Ciclo donde la fluorescencia
sobrepasa el umbral de detección y empieza la fase
exponencial de la amplificación.
EXPLICACION DE LAS GRAFICAS 8:30
VALOR Ct: conocido como Cq, hay una señal de
fondo un fluoroforo de referencia q se utiliza para
normalizar las señales.
EQUIPOS EN TIEMPO REAL 9:34 curva de disociación q simula la electroforesis, esta sirve para
conocer el tamaño del producto amplificado. Cada secuencia amplificada tiene una temperatura
de disociación específica y eso es lo que observa el equipo. Este genera un aumento gradual de
temperatura y monitorea la fluorescencia con forme se aumenta la temp.
CURVAS  10:43
A. Curva de Tm con solo iniciadores dará un
pico menor a los 80 C porque solo son los
primers, disociación de los dímeros de los
iniciadores
B. Curva Tm con iniciadores correctos
diseñados, solo se vería el producto de pcr
su temperatura de disociación.
C. Iniciadores malos se ve los primers, los
dímeros + el producto de pcr, el ultimo pico
tiene que ser mas grande.

DISCRIMINACIÓN ALELICA/ DETECCION DE SNP POR

CURVA Tm  11:46
Detectar cambios de nt por el cambio de temp de
disociación. Muestra curvas de disociación de alta
resolución, se ve derivadas etc. Se ve un pico el primero,
para el estado normal N86 y para el mutado Y86, los picos
dobles son para los heterocigotos (combinación
N86+Y86).
EQUIPOS  12:35

COMPOSICION GRAL DE LA MEZCLA DE RX PARA qPCR  12:52

Misma rx para pcr pero se agg el sistema de detección sybergreen , sondas hibridacion están
mezcladas con iniciadores.
 CUANTIFICACION ABSOLUTA 13:20
2 tipos de variaciones: una cuantificación absoluta
donde a partir de una curva estándar generada (a
partir de los ct de las muestras estándares.) o de
plásmidos o adn conocido se hacen diluciones log
de la muestra y se detecta la señal. A partir de la
muestra desconocida se detecta el ct se interpola
en la curva de calibración y asi se obtiene la [] de
ADNc.
Una curva estándar perfecta tiene una diferencia
de curva log con cambios logarítmicos de la
cantidad de muestra, tiene una diferencia de ct de 3.3 ciclos
ACTINA B  14:50 en colores se muestra la escala de los estándar. Los colores rojo café y cyan son
muestras desconocidas el adn de control q no amplifican y el blanco que no amplifica están por
debajo del umbral.
CURVA DE DISOCIACION 15:23 a partir de los datos pasados, se corrobora q sea el producto de
actina q se conoce 91.5
CURVA AUTOMATICA  15:39 se obtiene la curva con el umbral definido de all muestras con
todas las características en un rango de [ ] de 7-12 log de ADN
CUANTIFICACION RELATIVA MDR1/ACTINA B 15:57 se interpola y se hace la relación. Esta es
otro tipo de cuantificación y es relativa. La cuant.. Absoluta sirve cuando se need saber
CANTIDAD de bacterias, plásmidos en una muestra de planta etc., donde se tiene control y se
ocupa una cantidad específica. Cuando es difícil conocer una [] se establece una [] relativa.
Hay genes denominados constitutivos  su expresión es cte independiente… de lo que le pase al
individuo. Genx vs gen constitutivo están en una relación indefinida, la cuantificación relativa no
tiene unidades, es una relación entre parámetros.
En el control se define la relación q es de 1 pq es normal  18:14 no entendí esta parte
Es 1.2 veces más en cantidad de r1 q la cantidad q produce el individuo control en condiciones
normales.

18:50. postPCR o sea que se puede omitir la

electroforesis cuando se pueden hacer curvas

Eliminación de contaminación…. Esto es cuando se

utilizan el par de primer+ sonda, o sea 3 cosas q se
tienen que hibridar.

Muy sensible, detecta productos inespecíficos, detecta +

de una rx,