Miniprep y PCR.

Práctica Miniprep y PCR
En esta práctica se realiza el aislamiento de un fragmento de ADN plasmídico a partir

de un cultivo de Escherichia coli, mediante la técnica de “Miniprep”. Este fragmento
debe tener integrado un gen específico (pDONR-22A), lo cual se comprueba
posteriormente mediante PCR.
1. Miniprep
Para realizar la miniprep se utilizan en total 3ml de cultivo de Escherichia coli
centrifugados y posteriormente resuspendidos para obtener una solución donde solo se
encuentren las células necesarias para realizar apropiadamente esta práctica.
Se lisan las células obtenidas mediante una solución alcalina y se adhiere

posteriormente una sustancia tampón para detener la lisis y que no se desnaturalice el
ADN plasmídico.
Se procede a su centrifugado para retirar los restos de células muertas y se transfiere el

sobrenadante a una columna para aislar de forma más precisa el ADN, ya que en este
sobrenadante pueden quedar restos de proteínas u otros compuestos que pueden
estropear la muestra.
Ya en la columna, se realizan varias repeticiones de añadido de solución de lavado

(WB) + centrifugación. De esta forma el ADN queda retenido en la columna y el resto
de compuestos no necesarios son descartados.
Para resuspender el ADN contenido en la columna, se añade agua destilada y la

solución obtenida debe tener el ADN plasmídico con el gen que se ha especificado
anteriormente.
2. PCR
Una vez obtenido el ADN de las células de Escherichia coli, se procede a comprobar si
el gen pDONR-22A está contenido en la muestra mediante PCR.
La técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) consta de varios pasos:
1. Desnaturalización: se produce la desnaturalización de las cadenas de ADN,

donde las hebras se separan.
2. Anillamiento: se produce la unión de los primers a las hebras de ADN,
imprescindibles para que se inicie la elongación del resto de la cadena de ADN.
Estos primers se unen de forma específica a los inicios de sección del ADN que
se quieren amplificar.
3. Polimerización: la enzima polimerasa recrea la cadena complementaria del ADN
molde al que se han unido los primers, formándose miles de copias de esta. Las
polimerasas utilizadas en estas reacciones pertenecen a organismos termófilos
que sobreviven en ambientes con temperaturas de más de 50 ºC (Thermus
aquaticus). El objetivo de usar estas enzimas es que son capaces de soportar las
altas temperaturas requeridas durante el proceso de PCR sin desnaturalizarse.
Para la correcta realización de la PCR son necesarios varios componentes:
- Sustancia tampón, que mantenga un pH constante durante todo el proceso.
- Primers, tanto para elongar la cadena en sentido 3’5’ como en sentido 5’3’.
- Desoxirribonucleótidos (Adenina, Guanina, Citosina y Timina) todos en igual cantidad

para que se produzca la replicación del ADN.
- Cloruro de magnesio, usado como fuente de iones magnesio, cofactor de la

polimerasa. Dependiendo de su concentración, la eficiencia de la reacción será mayor o
menor.
- Taq, enzima polimerasa encargada de la replicación del ADN.
- ADN molde
- Agua destilada para completar el volumen necesario para que se produzca la reacción.
Además de nuestra muestra, se preparan otras dos soluciones a las que se les realizará la
PCR, una que será el control positivo y otra que será el control negativo. Al control
positivo se añade una muestra de ADN conocida, la cual va a amplificar en la reacción a
menos que haya algún compuesto contaminado. Al control negativo se añade
generalmente agua destilada, la cual no contiene material genético por lo que no debería
producirse amplificación de ningún compuesto, a menos que la muestra esté
contaminada.
Se realiza la preparación de la “Master Mix”, mezcla en tubo de ensayo de todos los

reactivos anteriormente descritos en las cantidades adecuadas, siempre multiplicando
x1 más de la cantidad necesaria para que al preparar cada muestra por separado haya
master mix de sobra. (p. ej. Si se van a preparar tres tubos Eppendorf para la PCR, en la
master mix se añaden cantidades de cada compuesto como para realizar cuatro de estos
tubos)
Para esta PCR se va a emplear un programa de 30 ciclos con los siguientes pasos:
1. 2 minutos a 95 ºC. Se inicia la rotura de los puentes de hidrógeno de las hebras

de ADN.
2. 15 segundos a 95 ºC. Se mantienen las hebras separadas entre sí.
3. 15 segundos a 55 ºC. Hibridación de los cebadores o primers a las cadenas
complementarias de ADN.
4. 15 segundos a 72 ºC. Elongación de la cadena de ADN por parte de la
polimerasa.
Por último se deja la muestra durante 5 minutos a 72 ºC para dar tiempo a la polimerasa
de finalizar la elongación de la cadena.
Al terminar se deja el termociclador a 10 ºC para detener la reacción y que el ADN se
conserve.
3. Gel Agarosa 1%
Con el fin de determinar si la PCR se ha producido adecuadamente, se prepara un
polímero de gelatina que crea un entramado donde las moléculas quedan retenidas a
medida que “corren” por este cuando se les aplica un voltaje determinado. Las
moléculas correrán más o menos dependiendo de su tamaño y de la densidad del gel.
La preparación del gel se realiza con una solución tamponada que mantenga un pH
constante (TBE: Tris-HCl, Boric acid y EDTA), agar y un fluoróforo para teñir los
ácidos nucleicos (en este caso se emplea Gel-Red 20.000x).
A cada muestra obtenida tras la PCR se añade LB (Loading Buffer, compuesto que
contiene glicerol (provoca que la muestra vaya al fondo al colocarla en el pocillo del
gel) y azul de bromofenol (colorante que marca por donde corre la muestra)).
En el gel se coloca también un marcador de peso molecular, que contiene distintas

moléculas de varios tamaños de las cuales conocemos su peso molecular y que correrán
junto con la muestra. De esta forma se puede estimar el tamaño de nuestra muestra.
Ramón Montes Garrido

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Práctica Miniprep y PCR

En esta práctica se realiza el aislamiento de un fragmento de ADN plasmídico a partir

Se lisan las células obtenidas mediante una solución alcalina y se adhiere

Se procede a su centrifugado para retirar los restos de células muertas y se transfiere el

Ya en la columna, se realizan varias repeticiones de añadido de solución de lavado

Para resuspender el ADN contenido en la columna, se añade agua destilada y la

La técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) consta de varios pasos:

1. Desnaturalización: se produce la desnaturalización de las cadenas de ADN,

Para la correcta realización de la PCR son necesarios varios componentes:

- Sustancia tampón, que mantenga un pH constante durante todo el proceso.

- Desoxirribonucleótidos (Adenina, Guanina, Citosina y Timina) todos en igual cantidad

- Cloruro de magnesio, usado como fuente de iones magnesio, cofactor de la

- Taq, enzima polimerasa encargada de la replicación del ADN.

Se realiza la preparación de la “Master Mix”, mezcla en tubo de ensayo de todos los

1. 2 minutos a 95 ºC. Se inicia la rotura de los puentes de hidrógeno de las hebras

En el gel se coloca también un marcador de peso molecular, que contiene distintas

Ramón Montes Garrido

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