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PRUEBA DE LA CATALASA
Objetivo: Separar la Flia. Micrococacceae (catalasa +) de los Géneros Streptococcus y
Enterococcus (catalasa -). Fundamento: La enzima catalasa descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno bajo la fórmula 2 H2O2----2 H2O + O2. De esta manera las bacterias se protegen del efecto tóxico del H2O2, que es un producto final del metabolismo aerobio de los azúcares. Procedimiento: Se coloca una gota de H2O2 al 3% sobre un portaobjetos y luego se transfiere una porción de colonia sobre el H2O2 realizándose una emulsión. En lo posible debe tomarse la colonia a partir de un medio sin sangre ya que los eritrocitos tienen actividad de catalasa y pueden falsear los resultados. Esta prueba también puede realizarse en un aislamiento en tubo, simplemente colocando unas gotas de H2O2 dentro del mismo. Interpretación de resultados: El desprendimiento de burbujas se considera una prueba positiva PRUEBA DE LA COAGULASA Objetivo: Permite separar S.aureus, que posee coagulasa, de las otras especies de estafilococos que genéricamente se denominan coagulasa negativos. Fundamento: S.aureus posee dos tipos de coagulasa: a. Una endocoagulasa o coagulasa ligada o "clumping factor" que está unida a la pared celular. Esta actúa directamente sobre el fibrinógeno provocando la formación de coágulos o grumos cuando se mezcla una suspensión bacteriana con plasma citratado (test en lámina) BILIS ESCULINA Objetivo: Separar los estreptococos del grupo D de los demás grupos de estreptococos. Fundamento: Se basa en la capacidad de los estreptococos del grupo D de crecer en un medio de cultivo que contiene un 40% de bilis y de hidrolizar la esculina a esculetina, la cual se combina con el citrato ferroso que posee el medio, dando un complejo de color negro. La concentración de bilis es fundamental, ya que existen estreptococos del grupo Viridans que son capaces de crecer a concentraciones menores de bilis. se basa en la capacidad de ciertas bacterias(estreptococos del grupo D) para hidrolizar la esculina en presenciade 1-4% de sales biliares. Procedimiento: Se realiza sembrando en superficie tubos de agar bilis esculina inclinado. Interpretación de resultados: Una reacción positiva se evidencia como ennegrecimiento del medio PRUEBA DEL PYR Fundamento: detecta la enzima pirrolidonil arilamidasa se utiliza como sustrato el reactivo L-pirrolidonil- beta-naftilamida (PYR), parala identificación rápida de nterococos. Procedimiento: Realizar un alto inóculo (2 MacFarland) e introducir un disco de PYR. Tiempo y Tº de incubación: 30 minutos a 35º C. Tiempo de lectura: 5 minutos. Interpretación: Disco rosado o rojo (+)Disco y/o solución amarillo a incoloro (-) Consideraciones: Algunas especies de Staphylococcus y los estreptococos del grupo A dan, también, una prueba positiva. Triple Azúcar Hierro TSI (TRIPLE AZÚCAR HIERRO AGAR) Fundamento: Sirve para detectar la fermentación de hidratos de carbono. El medio contiene: glucosa al 0.1%, lactosa 1%, sacarosa al 1% y peptonas; también tiene un indicador rojo de fenol y sulfato de hierro para evidenciarla formación de SH2.Procedimiento: El medio se fracciona en picos de flauta con una capa basal profunda (2 cm. por lo menos). Con el ansa en punta se siembra por punción y estría. El medio no inoculado es anaranjado-rojizo o rojo pálido. Incubar 24 hrs. a 35º C. CITRATO Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismos que utilizan el citrato como única fuente de carbono, el indicador es azul de bromo timol. Procedimiento: El color original del medio es verde, y se encuentra fraccionado en pico de flauta, la siembra se hace por estría, se incuba 24-72hs a 35ºC.Interpretación: Si el microorganismo utiliza citrato, se produce alcalinización del medio de cultivo pasando éste a color azul intenso, lo cual indica prueba positiva para el citrato. UREA Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismos que poseen la enzima ureasa. Procedimiento: El medio fraccionado en pico de flauta contiene urea y rojo de fenol como indicador, el color original del medio es amarillo (o sea ácido) La siembra se realiza con ansa de punta tanto en profundidad como en la superficie. Se deja incubar 24 hs a 35º Interpretación: Si el microorganismo es productor de ureasa, desdobla la urea produciendo amoníaco, consecuentemente produce alcalinidad que se manifiesta porque el medio toma un color fucsia. LIA Agar de ensayo para la demostración simultánea de lisina decarboxilasa (LD) y de la formación de hidrogeno sulfurado (H2S) para la identificación de enterobacterias. La prueba consiste básicamente en demostrar la presencia de la enzima lisina descarboxilasa, capaz de reaccionar con el grupo carboxilo del aminoácido L- lisina. ► La lisina puede ser descarboxilada por microorganismos LD positivas que la transforman en la amina cadaverina. Esto produce un viraje al violeta del indicador de pH púrpura de bromocresol, puesto que la descarboxilación sólo tiene lugar en medio ácido (pH inferior a6.0). Es necesario que se produzca previamente la acidificación del medio de cultivo, por fermentación de la glucosa. Este medio de cultivo solo puede utilizarse para la diferenciación de bacterias que fermentan glucosa. ► Los microorganismos LD negativos, pero fermentadores de la glucosa, producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. La incubación prolongada puede ocasionar alcalinización en la zona de la superficie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un viraje al violeta. La formación de H2S produce una coloración negra debido al sulfuro de hierro producido MIO Es una prueba bioquímica que se utiliza para ayudar en la identificación de especies de bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. Es bastante nutritivo y está compuesto por glucosa, extracto de levadura, peptona, tripteína, clorhidrato de L- ornitina, púrpura de bromocresol y agar.
Fundamento
Peptona, extracto de levadura y tripteína
Estos elementos contribuyen al poder nutritivo de este medio. Sirven como fuente de nutrientes y aminoácidos esenciales para el desarrollo bacteriano.
Además, la tripteína es una fuente de triptófano para evidenciar la presencia de la
enzima triptofanasa, que degrada el triptófano por una desaminación reductiva liberando indol, ácido pirúvico, amoníaco y energía.
El indol es incoloro, por tanto su presencia se revela al agregar cinco gotas del reactivo de Ehrlich o de Kovacs, ambos con p-dimetilaminobenzaldehído.
El grupo aldehído de este compuesto reacciona con el indol, generando un producto de
color rojo fucsia en forma de anillo en la superficie del agar.
Cualquier vestigio de color se debe considerar como una prueba positiva. La prueba debe leerse inmediatamente, pues pasado el tiempo el color se degrada.
Por otra parte, esta prueba debe revelarse después de haber anotado los resultados de la motilidad y la descarboxilación de la ornitina.
Interpretación
Prueba positiva: formación de un anillo de color rojo fucsia al agregar las gotas del reactivo de Kovacs.
Prueba negativa: no hay formación de anillo.
OXIDASA. Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromo oxidasa que activa la oxidación del citocromo el cual es reducido por el oxígeno molecular produciéndose agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromo oxidasa sólo se encuentra en las bacterias aerobias, algunas anaerobias facultativas y, excepcionalmente, en algún microaerófilo (Vibrio fetus), pero las bacterias anaerobias estrictas carecen de actividad oxidasa. Asimismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica.
Las Pruebas Bioquímicas Se Basan en La Determinación de La Presencia o Ausencia de Diferentes Enzimas Codificadas Por El Material Genético Del Cromosoma Bacteriano
Las Pruebas Bioquímicas Se Basan en La Determinación de La Presencia o Ausencia de Diferentes Enzimas Codificadas Por El Material Genético Del Cromosoma Bacteriano
