PRUEBAS BIOQUIMICAS

Son aquellas que determinan la actividad metabólica de una cepa pura. Son empleadas
principalmente en la identificación y clasificación de bacterias y hongos. Su sistema de
funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una vía metabólica a
partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y la bacteria al crecer incorpora
o no.

KLIGGER
Medio de cultivo usado en microbiología de alimentos para la diferenciación de
enterobacterias, en base a la fermentación de hidratos de carbono y a la producción de
ácido sulfhídrico.

FUNDAMENTO:
Es un medio de cultivo utilizado para la diferenciación de enterobacterias y otras
bacterias Gram negativas en base a la fermentación de lactosa y glucosa, además
de la formación de ácido sulfhídrico.
El medio se solidifica en forma inclinada permitiendo tener dos cámaras de
crecimiento: una aeróbica, el pico de flauta y la otra anaeróbica, el fondo del tubo.
La fermentación de azúcares acidifica el medio lo cual se observa con el vire del
rojo de fenol a amarillo que es el indicador ácido-base incorporado. En caso de no
haber fermentación, el medio vira a rojo.
CONTENIDO
Peptona de carne y tripteína: Aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo
bacteriano.
Lactosa y glucosa: Hidratos de carbono fermentables.
Tiosulfato de sodio: Sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico.
Citrato de hierro de hierro y amonio: Fuentes de iones Fe3+ estos se combinan con el
ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro.
Rojo de fenol: Indicador de pH.
Cloruro de Sodio: Mantiene el balance osmótico.
Agar: Agente solidificante.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
1. Superficie alcalina(pico rojo) / Profundidad ácida (fondo amarillo)
El microorganismo solamente fermenta glucosa.
2. Superficie ácida (pico amarillo) / Profundidad ácida (Fondo amarillo)
El microorganismo fermenta glucosa y lactosa.
3. Superficie alcalina (Pico rojo) / Profundidad alcalina (Fondo rojo)
El microorganismo no fermenta azucares.
4. La presencia de burbujas o la ruptura del medio de cultivo indican que el
microorganismo produce gas.
 5. El color negro en el medio indica que el microorganismo produce ácido
sulfhídrico.

FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS.
La fermentación es un proceso metabólico de oxido-reducción que ocurre en un medio
ambiente anaerobio y, en lugar de oxígeno, un sustrato orgánico sirve como el aceptor de
prueba final (electrones)
La fermentación (degradación) de un compuesto orgánico se observa por la acidez en el
medio de cultivo y la formación de gas capturado en la campana de fermentación.
Las bacterias que fermentan carbohidratos son por lo general anaerobios facultativos.
La fermentación de glucosa cambia el medio a amarillo, pero debido a su baja concentración
(0.1%) esto sólo se observa en el fondo del tubo, mientras que la superficie cambia a rojo.
Una vez consumida la glucosa, el microorganismo comienza a metabolizar aminoácidos
liberando amoníaco, lo cual alcaliniza el medio, esto ocurre en la superficie.
La fermentación de lactosa cambia el medio a amarillo y dado que su concentración es
mayor (1%), la formación de ácido es suficiente para mantener el color amarillo tanto en el
fondo como en la superficie del tubo.

CONSIDERACIONES

Los tubos deben interpretarse en un periodo de 18-24 horas de incubación. Hacerlo antes
provocaría tener un falso positivo en la fermentación de glucosa y confundirla con lactosa.
 LIA (Agar Lisina Hierro)
Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente
salmonella spp, basado en la descarboxilación y desaminación de lisina y en la
producción de ácido sulfhídrico.
FUNDAMENTO:
En el medio LIA se puede detectar la producción de la lisina descarboxilasa ya que se
produce una reacción coloreada por un cambio en el pH del medio, que contiene como
indicador púrpura de bromocresol. Un cambio del color original del medio (morado) hacia
amarillo en el fondo indica una reacción ácida por la fermentación de una pequeña cantidad
de glucosa en el medio. Si el microorganismo produce lisina descarboxilasa, la acción de
esta enzima sobre la lisina dará lugar a la cadaverina, la cual provocará un cambio de pH
hacia la alcalinidad dando un color morado que sobrepasa la acidez debida a la glucosa.
Así pues, un fondo amarillo indica que no se produce lisina descarboxilasa y un color
morado que si es producida.

COMPOSICIÓN
La peptona y extracto de levadura: Aportan los nutrientes para el desarrollo
bacteriano.
Glucosa: Es el hidrato de carbono fermentable.
Lisina: Es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas
descarboxilasa y desaminasa.
Citrato de hierro y amonio y el tiosulfato de sodio: Son los indicadores de la
producción de acido sulfhídrico.
Purpura de bromocresol: Indicador de pH.
Agar: Agente solidificante.

Los microorganismos fermentadores de glucosa acidifican el medio provocando el

viraje del color purpura al amarillo.
El ambiente ácido favorece la actividad enzimática descarboxilasa y se metaboliza
la lisina a cadaverina elevando el pH del medio de cultivo y tornando al color purpura
o violeta. La descarboxilación es el proceso mediante el cual las bacterias que
poseen enzimas descarboxilasa especificas son capaces de atacar a los
aminoácidos en su grupo carboxilo dando una amina o una diamina y anhídrido
carbónico, La descomposición de los aminoácidos se produce anaeróbicamente.
La desaminación se produce ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro
y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio.
 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
Descarboxilación de lisina:
Positivo: Superficie alcalina (pico violeta) / Profundidad alcalina (Fondo violeta)
Negativo: Superficie alcalina (pico violeta) / Profundidad ácida (Fondo amarillo)
Desaminación de lisina:
Positivo: Superficie rojiza / profundidad ácida. Esto sucede con cepas del género
Proteus, Providencia y algunas de morganella spp.
Producción de SH2:
Positivo: Presencia de un color negro en el límite entre la superficie y la
profundidad.
Negativo: Sin presencia del color negro.

CITRATO DE SIMMONS
Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias en base a la capacidad de
usar citrato única fuente de carbono y energía.
FUNDAMENTO
Fosfato monoamónico: Unica fuente de nitrógeno.
Citrato de Sodio: Única fuente de carbono.
Sales de fosfato: Sistema buffer.
Magnesio: Cofactor enzimático
Cloruro de sodio: Mantiene el balance osmótico.
Azul de bromotimol: Indicador de pH.
Agar: Agente solidificante.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato
permeasa, a través del ciclo de ácido tricarboxilico. El desdoblamiento del citrato
genera progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un
medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de
carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al
azul y esto es indicativo de la producción del citrato permeasa.
 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
POSITIVO: Crecimiento bacteriano con un intenso color azul en el pico de la flauta.
NEGATIVO: Ausencia de crecimiento y permanencia del color verde del medio de
cultivo.

SIM (Movilidad, indol y ácido sulfhídrico)

Medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro
de hidrogeno por los microorganismos.
Es útil para diferencias miembros de la familia Enterobacterias.

FUNDAMENTO

Tripteína y peptona: Aportan nutrientes para el desarrollo microbiano.

Triptófano: Es un aminoácido constituyente de muchas peptonas y tripteina y

puede ser metabolizado por algunas bacterias para formar indol. Es el proceso
interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se
combina con el aldehído del reactivo de Kovacs para originar un compuesto rojo.

Tiosulfato de sodio: Los microorganismos generan ácido sulfhídrico que reacciona

con el hierro presente formándose un compuesto de color negro.

Agar: Agente solidificante.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

MOVILIDAD:
POSITIVO: Presencia de turbidez o crecimiento mas allá de la línea de siembra.
NEGATIVO: Crecimiento solamente en la línea de siembra.

PRODUCCIÓN DE SH2:
POSITIVO: Presencia de color negro a lo largo de la línea de siembra o en todo el
medio.
NEGATIVO: El medio permanece sin cambiar de color.

PRUEBA DE INDOL: Agregar al medio 3 a 5 gotas del reactivo de kovacs.

POSITIVO: Anillo de color rojo.
NEGATIVO: El color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento.
 MIO (Movilidad, Indol y Ornitina Descarboxilasa)

Medio utilizado en la identificación de miembros de la familia enterobacterias en

base a la movilidad, producción de indol y actividad enzimática ornitina
descarboxilasa.

FUNDAMENTO

Extracto de levadura, peptona y tripteina: Nutrientes.

Glucosa: carbohidrato fermentable.
Ornitina: Sustrato para la detección de la enzima ornitina descarboxilasa.
Purpura de bromocresol: Indicador de pH
Agar: Agente solidificante.

Las condiciones de acidez son favorables para la actividad enzimática ornitina

descarboxilasa, que actúa sobre a ornitina generando putrescina, con la
consecuente alcalinización del medio de cultivo y viraje a color purpura.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

MOVILIDAD:

POSITIVO: Presencia de turbidez o crecimiento mas allá de la línea de siembra.

NEGATIVO: Crecimiento solamente en la línea de siembra.

ORNITINA DESCARBOXILASA:

POSITIVO: Color purpura.

NEGATIVO: Color amarillo, A veces se puede desarrollar un color violáceo en la
superficie del medio.

UREA
Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad ureásica.
Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como proteus spp,
otras enterobacterias y estafilococos.

FUNDAMENTO

Tripteina y glucosa: Aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos.

Cloruro de sodio: Mantiene el balance osmótico.
Rojo de fenol: Indicador de pH.
Agar: Agente solidificante.
Las bacterias hidrolizan la urea por medo de enzimas de la ureasa liberan amoniaco
y dióxido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio de cultivo haciendo virar
el indicador rojo de fenol del color amarillo a rojo.
Es recomendado especialmente para la detección de la actividad ureasica en
bacterias que hidrolizan lentamente la urea ya que la fermentación de la glucosa
presente activa la enzima ureasa microbiana. Este es el caso de Klebsiella spp.
Enterobacter y Citrobacter.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
POSITIVO: El medio de cultivo es de color rosado-rojizo.
NEGATIVO: El medio de cultivo tiene el color inicial del medio.