Universidad Nacional “Jorge Basadre Grohmann”- Facultad de Ciencias E. P.

Biología-Microbiología

Curso de Microbiología Docente: Dr. Mblgo. César Julio Cáceda Quiroz

PRÁCTICA 09

DETERMINACIÓN DEL MIC Y EL MCB DE UN ANTIBIÓTICO

I.- INTRODUCCIÓN:

Los Antibióticos

Los antibióticos son sustancias químicas producidas por varias especies de

microorganismo (bacterias, hongos y actinomicetos) que suprimen el crecimiento de
otros microorganismos, y originan su destrucción. En los últimos tiempos, el uso del
término se ha ampliado para incluir compuestos sintéticos, como las sulfonamidas y
las quinolonas, que presentan también actividad antibacteriana.

Sensibilidad

Un microorganismo es sensible a un determinado antimicrobiano cuando el agente

antimicrobiano puede alcanzar niveles plasmáticos iguales, por lo menos a la
concentración mínima inhibitoria, en el lugar de la infección.

Microorganismo de sensibilidad intermedia. Es el microorganismo no afectado por

dosis normales de agente antimicrobiano dadas a intervalos normales, pero si se
produce una acumulación en el lugar de la infección sin llegar a dosis que produzcan
efectos tóxicos, se puede eliminar el microorganismo.

El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos es una de

las funciones más importantes de los laboratorios de microbiología clínica. Su
realización se desarrolla mediante las pruebas de sensibilidad o antibiograma, cuyo
principal objetivo es evaluar en el laboratorio la respuesta de un microorganismo a uno
o varios antimicrobianos, traduciendo, en una primera aproximación, su resultado
como factor predictivo de la eficacia clínica. El antibiograma define la actividad in vitro
de un antibiótico frente a un microorganismo determinado y refleja su capacidad para
inhibir el crecimiento de una bacteria o población bacteriana. Su resultado, la
farmacología del antimicrobiano, en particular en el lugar de la infección, y los
aspectos clínicos del paciente y de su infección, sustentan la elección de los
antimicrobianos en el tratamiento de las enfermedades infecciosas. Asimismo, ofrece,
en su conjunto, elementos objetivos de actuación en los tratamientos empíricos.

Resistencia

La definición clínica de un microorganismo resistente, a diferencia de uno sensible,

está asociada con la habilidad que tenga un antimicrobiano de ser efectivo en el
tratamiento de una infección específica.

Características de la resistencia a los antimicrobianos.

- Puede ser una propiedad natural de una especie o una característica adquirida.
- Implica generalmente cambios genéticos estables, trasmitidos a otras
generaciones.
- Puede ser observada in vivo e in vitro.
- Ocurren variaciones morfológicas o fisiológicas en los microorganismos.
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Principios de la Resistencia

a) De acuerdo con el tiempo de uso del antibiótico, la resistencia aparecerá.

- No hay antibióticos a los que no haya aparecido

resistencia eventualmente.
- La resistencia del Streptrococcus pneumoniae a la
penicilina tomó 25 años, mientras que la de las enterobacterias a las
fluoroquinolonas tomó 10 años en emerger clínicamente.

b) La resistencia es progresiva, evolucionando de niveles bajos a intermedios y

altos.
- Se manifiestan pequeños incrementos en la MIC (Concentración Mínima
Inhibitoria).
- El incremento de las MIC se considera como marcadores de resistencia
futura.
- La resistencia a la fluoroquinolona en E. coli requiere de mutaciones
secuenciales para ser clínicamente relevante.
- Las pocas cepas de S. aureus insensibles a la vancomicina son avisos de
cepas futuras con resistencia completa.

c) Los organismos resistentes a un medicamento tienen probabilidad de adquirir

resistencia a otros.

- Los primeros gonococos resistentes a la tetraciclina aparecieron entre

aquellas cepas que ya eran resistentes a la penicilina.

d) Los mecanismos de resistencia de las bacterias a los antimicrobianos pueden

ocurrir simultáneamente en un mismo tipo de microorganismo, mientras que un
único mecanismo puede originar resistencia a diferentes clases de antibióticos.

Mecanismos de Resistencia.

- Alteración del sitio blanco.

- Alteraciones en la permeabilidad o transporte.
- Inactivación del antibiótico.

Los antibióticos se pueden clasificar de acuerdo a:

1. Por su origen:
a) Biológicos: son producidos por microorganismo.
b) Sintéticos: son producidos exclusivamente por síntesis química.
c) Semisintéticos: sobre el núcleo básico del antibiótico producido por el
microorganismo, se engarza en la posición más adecuada radicales
obtenidos por síntesis, de esta manera se logra la mejora del espectro, de la
farmacocinética, disminución de la toxicidad, etc.
2. Por su espectro de acción: Amplio espectro, espectro intermedio y de corto
espectro.
3. Por su forma de actuación (bactericida o bacteriostática).
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4. Por el mecanismo de acción: para que el antimicrobiano ejerza su acción es

necesario que llegue al foco infeccioso, penetre en la bacteria y alcance
intracelularmente la concentración.
5. Por la estructura química

Antibiograma
Un antibiograma es un estudio de la sensibilidad del microorganismo, productor de una
enfermedad, a los antimicrobianos.
Las pruebas de sensibilidad son técnicas que investigan la actividad de distintos
agentes quimioterápicos frente al microorganismo; sirven para identificar el
microorganismo y para implantar la terapia más efectiva.
Las pruebas de sensibilidad, el antibiograma, es una técnica estandarizada, en la que
los resultados en cuanto a sensibilidad y resistencia se comportan paralelamente in
vitro e in vivo.

Concentración Inhibitoria Mínima

La susceptibilidad a un antimicrobiano es una característica cuantitativa que se
expresa generalmente como la Concentración Mínima Inhibitoria (MIC), que
representa la concentración más baja de un antimicrobiano para inhibir el crecimiento
de una bacteria bajo condiciones normalizadas de laboratorio.

La Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) de un antibiótico se define como la mínima

cantidad de antibiótico capaz de impedir el crecimiento bacteriano. Se expresa en
microgramos o unidades internacionales por mililitro de medio de cultivo (mcg o UI/ml).

La Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) para una cepa determinada es la menor

concentración de antibiótico en la cual no hay crecimiento tras su incubación. La forma
adecuada de expresar la MIC correspondiente a un gran número de aislamientos,
consiste en expresar los resultados obtenidos refiriéndose al 50% (MIC 50) y al 90%
(MIC90) de las cepas ensayadas. De esta forma se pone de manifiesto el grado de
resistencia de la población, que la sensibilidad es distinta para cada especie y que es
distinta para cada una de las cepas.

Concentración Mínima Bactericida

Concentración Mínima Bactericida (CMB) se define como la menor concentración de
antibiótico capaz de provocar, no sólo la suspensión del crecimiento, sino la
destrucción de la bacteria. Sin embargo, con determinados antibióticos (aunque sean
bactericidas) y microorganismos no se consigue obtener la CMB; es decir, la bacteria
"tolera" el antibiótico, por eso a este fenómeno (distinto de la resistencia) se le
denomina tolerancia antibiótica. Su consecuencia práctica es que el antimicrobiano
"tiene" MIC, pero no CMB, frente al microorganismo estudiado.

La Concentración Mínima Bactericida (CMB), en contraposición con la MIC, es la

concentración más baja de una droga, en μg/ml, que produce la muerte de más del
99,9% de las bacterias probadas.

Unos pocos antibióticos inhiben el crecimiento bacteriano sin destruir a los

microorganismos, pero la mayor parte de los antibióticos modernos ejercen actividad
letal. La concentración de la droga que inhibe el crecimiento está muy próxima a la
concentración que produce la muerte de las bacterias (dentro de 1 a 2 diluciones
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dobles). En algunas situaciones, existe una gran diferencia entre la concentración

inhibidora y la letal.

Los microbiólogos, con relación al uso de antibióticos pueden asistir en dos maneras:
Primero, evaluar las interacciones in vitro entre un microorganismo aislado y los
agentes antimicrobianos que podrían ser apropiados para el tratamiento de una
infección en vivo (antibiograma). Segundo, su trabajo en el ámbito de laboratorio
puede brindar datos que ayuden a definir las dosis adecuadas a seleccionar para un
tratamiento. Existen una serie de técnicas que permiten cumplir con las aseveraciones
anteriores, entre las cuales están:
- Concentración Mínima Inhibitoria (MIC),
- Difusión en Discos (Antibiograma),
- Concentración Mínima Bactericida (CMB),
- Niveles Antimicrobianos Séricos,
- Niveles Bactericidas del Suero, y
- Las Pruebas de Sinergia.

Sensibilidad in vitro a antibióticos

Se emplean dos grupos de técnicas en la determinación de sensibilidad de los

microorganismos a los antibióticos.

Técnica de difusión. Se basa en la difusión del antibiótico a partir de un disco de

papel impregnado con una cantidad determinada de antibiótico. Esta técnica, basada
en el método de Kirby-Bauer, es un método suficiente para la determinación de la
sensibilidad de las bacterias de crecimiento rápido. Los discos con el antibiótico son
colocados sobre una placa de agar Mueller-Hinton, previamente sembrada con un
inóculo estándar del microorganismo a estudiar. Las placas, después de ser incubadas
por 18 horas, presentan zonas de inhibición bacteriana alrededor de cada disco que
contiene un antibiótico activo frente al microorganismo. El diámetro de la zona en
inhibición determina si existe sensibilidad o resistencia.

Técnica de dilución. El antibiótico es diluido sucesivamente a la mitad, ya sea en

medio líquido o sólido. Luego se procede a inocular el microorganismo en
concentración adecuada en cada una de las diluciones efectuadas.

Esta técnica permite establecer la concentración inhibitoria mínima (CIM) para cada
microorganismo analizado, valor que está dado por la concentración de antibiótico
presente en el último tubo que no presenta desarrollo.

La determinación de sensibilidad por difusión es habitualmente suficiente como

indicador de la sensibilidad de un microorganismo, sin embargo, en ciertas situaciones
se recomienda la determinación de CIM por dilución.

Estas situaciones pueden resumirse en la endocarditis bacteriana, septicemia y

meningitis bacteriana.

Técnicas rápidas de determinación de resistencia. Existen dos técnicas usadas en

la determinación rápida de resistencia a antibióticos. Una de ellas es la detección de
betalactamasas, que permite establecer la presencia de penicilinasa o
cefalosporinasa, enzimas que inactivan a los antibióticos betalactámicos. Otra técnica
que puede emplearse es la detección de resistencia al cloramfenicol, mediante la
acetiltransferasa, enzima que altera la estructura del cloramfenicol, inactivándolo.
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Monitoreo de la terapia antibiótica. Una forma de prever la respuesta de la infección

a los antibióticos, consiste en determinar el poder bactericida del suero, conocido
también como test Schlichter. Para esto se necesita la cepa causante de la infección y
el suero del paciente en período pico y valor de la concentración plasmática. El suero
del paciente es puesto en contacto con la cepa, en diluciones sucesivas a la mitad,
determinándose la dilución máxima capaz de inhibir o destruir el microorganismo. Se
utiliza en la endocarditis bacteriana, en la cual se necesita de una actividad bacteriana
para la erradicación del agente etiológico. Se considera eficaz el poder bactericida del
suero en los casos en que es capaz de inhibir el desarrollo del microorganismo en
diluciones entre 1:32 y 1:64, según se trata de concentraciones valle o peak. Es una
técnica poco usada, por no existir una estandarización adecuada entre los diferentes
laboratorios.

Niveles séricos de antibióticos. En el manejo de los pacientes críticos, es importante

establecer los niveles séricos de algunos antibióticos, especialmente de aquellos con
estrecho margen terapéutico, como es el caso de los aminoglucósidos, o en los con
toxicidad proporcional a la concentración sérica, como son la vancomicina, el
cloramfenicol y el cotrimoxazol. La toxicidad puede prevenirse al mantener los niveles
séricos de estos antibióticos por debajo del umbral establecido.

OBJETIVOS:
Determinar el MIC y el MCB de un antibiótico de concentración conocida frente a una
cepa de Escherichia coli.

MATERIALES:
- Cepa de Escherichia coli de 06 horas de incubación en Agar Mueller Hinton
- Cápsulas de cloranfenicol (antibiótico).
- Caldo de cultivo Casoy (100 ml).
- 07 Placas Petri con Agar Mueller Hinton.
- Solución Salina Fisiológica.
- 15 Tubos de ensayo de 15x125 mm estériles.
- 08 Pipetas serológicas de 0,5; 1,0 y 2 ml.
- 02 Matraces de 500 ml de capacidad.
- 01 Probeta de 100 ml
- 02 Baguetas.
- 02 Gradillas.
- 04 Mecheros.
- Cámara cuenta colonia.
- Estufa regulada a 37°C.
- Nefelómetro de Mac Farland (tubo Nº 0,5).
- Asa de Kolle.
- Asa de Drigalsky.
- Alcohol y Ron de quemar.
- Agua destilada 400 ml.

PROCEDIMIENTO (SEGÚN LA TÉCNICA DE DILUCIÓN):

A) DETERMINACIÓN DEL MIC.

1. Preparar una serie de 10 tubos de 15 x 125 mm, sabiendo que los

primeros nueve tubos son de ensayo y el décimo tubo es el control.
2. Disolver la cápsula de antibiótico en 250 ml de agua destilada estéril.
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3. Las distintas diluciones del agente antimicrobiano se tendrán en tubos

de ensayos estériles, según el siguiente cuadro:

Tubo Nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Antibiótico
320 160 100 80 60 40 20 10 05 Control
(μg/ml)

Calcular el volumen necesario de la solución del antimicrobiano de

concentración conocida que permita obtener la concentración preestablecida
(μg/ml).
4. Completar cada tubo con Caldo de Cultivo, teniendo en cuenta que el
volumen final para cada dilución deberá ser de 9 ml. Entendiéndose que en el
tubo Nº 10 sólo se colocará 9 ml del caldo de cultivo y cero antibióticos.
5. Preparar el inóculo de la siguiente manera: en un tubo de 15 x 125 mm
estéril colocar en forma aséptica unos 12 ml de Solución Salina Fisiológica
estéril e inocular y disolver varias asadas de la cepa de Escherichia coli hasta
lograr una turbidez análoga al tubo Nº 0,5 (de la escala de Mac Farland).
6. Inocular cada uno de los diez tubos de prueba, con 1 ml del inóculo
preparado. Llevar a incubar a 37°C por 20 horas finalizadas las cuales
establezca el MIC respectivo. Para ello, ubicar el último tubo en el cual se
observa crecimiento (turbidez), la concentración de cloranfenicol que contiene
representa el MIC de dicho antibiótico para la bacteria de prueba.

7. Llenar el siguiente cuadro:

Tubo Nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Antimicrobiano
Control
(μg/ml)
Volumen de caldo
de cultivo (ml)
Inóculo de E. coli
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
(ml)
TOTAL (ml) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

Ino culo

SIEMBRA
Medio de cultivo I II III IV V VI VII VIII IX X
+
Ino culo
+
Antimicrobiano
en ug/ml 100 Control
320 160 80 60 40 20 10 5

INCUBACION
I II III IV V VI VII VIII IX X

LECTURA
CM I ug /m l

320 160 100 80 60 40 20 10 5 Control

DETERMINACION DE LA MIC
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B) DETERMINACIÓN DEL CMB.

1. A partir del inóculo preparado en la prueba anterior, realizar diluciones

de 10-3, 10-6 y 10-8 en Solución Salina Fisiológica.
2. Sembrar en placas con Agar Mueller Hinton por diseminación de las dos
últimas diluciones, incubar a 37°C por 24 horas y determinar el número de
UFC/ml (recuento del inóculo) presente en cada uno.
3. Terminada la prueba del MIC, sembrar en placas de Agar Mueller
Hinton por diseminación alícuotas del tubo del MIC y de los tres tubos
anteriores a éste. Incubar a 37°C por 20 horas, realizar el recuento de UFC/ml
de cada uno de ellos y establecer aquel en el cual sólo estén viables menos del
0,1% de la población inicial.
4. La concentración de antibiótico correspondiente a dicho recuento es el
CMB respectivo.

A B C D E F
Ino culo

MIC
1 2 3
Siem bra po r
disem ina cion
en Ag a r M H

INCUBACION (37°Cx20 h)

10 -3 10 -6 10 -8 Recuent o UFC/m l
Siem bra CM B : Co ncentra cio n del Antib.
por disem inacio n que corre spo nde a l tubo en el cual
en Ag a r M H solo e st an via bles m eno s del 0 ,1 %
de la pobla ci’o n o rig ina l
INCUBACION (37°Cx24 h)

Recuent o del Ino culo UFC /ml

DETERMINACION DE LA CMB
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RESULTADOS:

TABLA 01

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBIÓTICA

FRENTE A Escherichia coli.
Tubo Nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Antibiótico
32 16 10 8,0 6,0 4,0 2,0 1,0 0,5 Control
(μg/ml)
Intensidad
de
crecimiento

TABLA 02

VALORES OBTENIDOS PARA EL MIC Y EL MCB DEL CLORANFENICOL EN

Escherichia coli.
MIC CBM

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 GRANADOS PEREZ, Raquel (2002). “Microbiología”. Tomo I. Editorial Paraninfo.

 MINSA (1999). “Procedimientos de Laboratorio”.

08/VIII/2021