Bradford

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUIÍMICA
LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS
PRÁCTICA: DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE

BRADFORD
PROFESOR: HERNANDEZ DERRAMADERO FERNANDO
GRUPO 5QM2
ALUMNO: DULCE GRISEL ZARATE LUNA
FECHA: 23 OCTUBRE 2020

OBJETIVOS
• Realizar una curva de calibración para poder cuantificar proteínas por

medio de un método colorimétrico y fotométrico como Bradford
• Analizar si existen diferencias estadísticamente significativas en la
precisión y exactitud entre dos métodos (BCA y Bradford).
• Analizar el efecto que tienen algunas sustancias no proteicas, que
pudieran interferir en el método de Bradford.
FUNDAMENTO
Se basa en la formación de un complejo colorido entre el colorante azul brillante de
Cooomassie G-250 y las proteínas en solución. La absorbancia de este se lee 595
nm y la intensidad de absorción depende del contenido de aminoácidos básicos y
aromáticos, todo esto se lleva en condiciones acidas.
RESULTADOS
Tabla 1. Curva de calibración de Hemoglobina por el método Bradford.
Tubo Concentración de Proteína A595nm
No. (µg/mL) Serie a Serie b
1 y 1´ 2 0.108 0.113
2 y 2´ 4 0.237 0.225
3 y 3´ 6 0.285 0.294
4 y 4´ 8 0.363 0. 371
5 y 5´ 10 0.416 0.423
CURVA DE CALIBRACIÓN y = 0.0377x + 0.0573

R² = 0.9755
0.5
Abs 595 nm
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 2 4 6 8 10 12
ug/mL HEMOGLOBINA
Figura 1. Curva de Calibración por el Método de Bradford (Hemoglobina).

a) Calcule y escriba los valores de la pendiente, la ordenada y el coeficiente de
correlación; diga como se interpretan para la curva de calibración ajustada.
Ecuación de la recta: y=mx + b por lo tanto y= 0.0377x + 0.0573
m=0.0377
b= 0.0573
R2=0.9755
R=0.9876
b) ¿Cumple su curva la ley de Bouger y Beer? ¿Entre que límites de
concentración de proteína?
La ley de Bouger y Beer explica que, si hay una línea recta, se dice que se
cumple la ley, con ayuda de los coeficientes de relación debe ser cercano a 1
entonces podríamos decir que si cumple la ley. Y los límites de proteínas va de 2
a 10 µg/mL
c) A partir de la recta ajustada por regresión lineal y la ecuación de la misma,
obtenga la expresión matemática para calcular la concentración de
proteína.
Primero se consigue una lectura con un espectrofotómetro de la absorbancia de
cada uno de los tubos. Se obtiene una ecuación de la recta donde se grafica la
absorbancia sobre la concentración de la proteína. Teniendo en cuenta la ecuación
de la recta se tiene y= 0.0377x + 0.0573 entonces despejamos x
𝑦 − 𝑏 𝐴𝑏𝑠 (595𝑛𝑚) − 0.0573
𝑥= =
𝑎 0.0377
X=Concentración de Hemoglobina (µg/mL)

Y= Abs (595 nm)
Donde se sustituye los valores de absorbancia de cada uno de lo tubos para poder
llevar a cabo el análisis estadístico del método Bradford. Ejemplo tubo 1:
0.312−0.0573
𝑥= =6.75
0.0377
Tabla 2. Replicas para el análisis estadístico Bradford.
Tubo A595 nm Concentración de Hemoglobina(µg/mL)
0.312 6.7559
0.321 6.9946
0.35 7.7639
0.3 6.4376
0.326 7.1273
0.291 6.1989
0.314 6.808
0.287 6.0928
0.283 5.9867
0.294 6.2785
Tabla 3. Replicas para el análisis estadístico BCA.

Concentración de Hemoglobina
Tubo A562 nm (µg/mL)
1 0.214 6.8906
2 0.215 6.9228
3 0.211 6.7942
4 0.212 6.8263
5 0.199 6.4083
6 0.212 6.8263
7 0.238 7.6623
8 0.216 6.9549
9 0.201 6.4726
10 0.213 6.8585
Tabla 4. Resultados del análisis estadístico Bradford.
X S S2 C.V I.C 95% PRESICION EXACT

6.645 0.554 0.3066 8.33709556 7.0405 91.66 89.25
6.25
Tabla 5. Resultados del análisis estadístico BCA.

X S S2 C.V I.C 95% PRESICION ERROR
6.86168 0.3363626 0.1131 4.90204442 7.1021 95.0979 85.64
6.621
Tabla 6. Efecto de sustancias no proteicas en el método de Bradford.
HEMOGLOBINA LIMITES CONFIANZA
Sustancia A595nm Proteína (µg/mL) 6.25 7.04
Fenol 0.2% 0.282 5.96 INTERFERENCIA NEGATIVA
Detergente comercial 0.2% 0.17 2.989 INTERFERENCIA NEGATIVA
SDS 0.2 0.152 2.512 INTERFERENCIA NEGATIVA
Mercaptoetanol 0.002% 0.258 5.324 INTERFERENCIA NEGATIVA
EDTA 6mM 0.279 5.881 INTERFERENCIA NEGATIVA
Tabla 7. Efecto de sustancias no proteicas en el método de BCA.

HEMOGLOBINA LIMITES CONFIANZA
Sustancia A562nm Proteína (µg/mL) 6.62 7.10
Fenol 0.2% 0.224 7.20 INTERFERENCIA POSITIVA
Detergente comercial 0.2% 0.232 7.46 INTERFERENCIA POSITIVA
SDS 0.2 2.129 68.45 INTERFERENCIA POSITIVA
Mercaptoetanol 0.002% 2.402 77.22 INTERFERENCIA POSITIVA
EDTA 6mM 0.191
6.13 INTERFERENCIA NEGATIVA
Tabla 8. Comparación entre métodos de Bradford y BCA.

BCA Bradford di (Di-di) ^^2
6.8906 6.7559 0.1347 0.00688
6.9228 6.9946 -0.0718 0.0834
6.7942 7.7639 -0.9697 1.408
6.8263 6.4376 0.3887 0.0294
6.4083 7.1273 -0.719 0.876
6.8263 6.1989 0.6274 0.1684
7.6623 6.808 0.8543 0.4061
6.9549 6.0928 0.8621 0.4161
6.4726 5.9867 0.4859 0.0723
6.8585 6.2785 0.58 0.1317
di prom 0.21726
Suma D 0.632
Tabla 9. Método de Fisher Tabla10. Método de Student
Ho: s2-s2=0 µ-µo=0

Ha= s2-s2 < > 0 µ-µo 0
Fcalculada 2.71 t Calculada 1.08
F Tabulada 3.179 t Tabulada 2.26
P valor 0.469 P valor 1.18
Por lo tanto, Ho se acepta y no hay Por lo tanto, Ho se acepta y no
diferencia significativa. hay diferencia significativa.
DISCUSIÓN
Se llevo a cabo una serie de 5 tubos por duplicado, en donde se prepararon con
una solución de proteína, agua destilada y el reactivo de Bradford, esto para poder
ayudar a cuantificar la cantidad de µg/mL de hemoglobina para este método como
muestra la figura 1. En la ecuación de la recta obtenemos diferentes datos, el
coeficiente de correlación el cual nos dio un valor de 0.9876, nos explica que hay
una linealidad entre el compuesto y en este caso se ve implícito la ley de Bouger y
Beer, la cual nos dice que hay una relación exponencial entre la transmisión de luz
a través de una sustancia y la concentración de esta. Al afirmar esto podríamos
decir en general que si hay una línea recta se cumple esta ley. Aunque su
coeficiente de correlación fue de 0.9876 es cercano a uno podríamos decir que es
confiable y valida.
ANALISIS ESTADISTICO
Mediante una serie de 10 tubos, en la cual contenían 300 µg/mL de proteína en
este caso hemoglobina, se llevó a cabo el análisis estadístico de este método
Bradford, en cual se llevaron a las mismas condiciones que el tubo 3, con la ayuda
del espectrofotómetro se procedió a medir sus absorbancias con cada uno de los
tubos, y con la ayuda de la curva de calibración, se procedió a medir la
cuantificación de esta proteína en cada uno de los tubos tabla 2.A estos valores se
les procedió a sacar su media, desviación estándar, varianza, coeficiente de
variación, intervalos de confianza, precisión y exactitud , este mismo procedimiento
se llevó a cabo para el método de BCA ,como se muestran en las tablas los valores
de BCA se ven un poco mas elevado que en el método de Bradford tabla 3 y
4.Aunque el valor de la media es más acertado para el método de Bradford ya que
se acerca más al valor de referencia que es 6.Cuando obtenemos diferentes datos
estadísticos como los estudiados, nos ayuda determinar la exactitud y precisión de
cada método individual. Teniendo en cuenta esto podemos decir que la precisión
se puede definir como el grado de concordancia entre los resultados analíticos
individuales cuando el procedimiento se aplica repetidamente a diferentes
porciones de una muestra, se evalúa la repetibilidad y reproducibilidad. Mientras
que el método de exactitud es el grado de concordancia entre el valor obtenido
experimentalmente y un valor de referencia. Retomando los resultados BCA nos
dio un resultado de 95.09% para precisión y una exactitud de 85.04% mientras que
en el método Bradford nos dio una precisión de 91.66% y una exactitud de
85.64%. Esto nos indicaría que BCA es más precisa que Bradford, pero es menos
exacta individualmente. Al realizar una comparación ente métodos con la ayuda de
los métodos de F de Fisher y T de student tabla 8, nos ayudó a medir la exactitud y
precisión, para evaluar si había diferencia significativa de ambos métodos, como se
muestra en las tablas 9 y 10, no se observó ninguna diferencia significativa entre
estos métodos, lo que significa que hay una similitud en la precisión y exactitud en
los dos métodos.
EFECTO DE SUSTANCIAS NO PROTEICAS
Durante los análisis estadísticos obtuvimos los intervalos de confianza, en el
método de BCA obtuvimos intervalos de confianza de 6.62-7.10, mientras que en el
método de Bradford fue de 6.25-7.04. Esto nos ayudó a poner de manifiesto que
pueda a ver diferentes sustancias no proteicas que afecten a este tipo de métodos,
donde puede tener tanto interferencias positivas (superando el intervalo) como
negativas (por debajo de los intervalos de confianza). En la tabla 7 observamos los
resultados de los efectos de sustancias no proteicas en el método de BCA en este
caso, la mayoría tuvo interferencias positivas el fenol tuvo una interferencia
positiva, ya que este método se ve afectado por estructuras de aminoácidos con
grupos aromáticos, como el triptófano, tirosina y por la similitud estructural entre
estos. En el caso de detergentes en este método afecta principalmente ya que sus
colas interaccionan con las cadenas laterales apolares del interior de las proteínas y
crea así un desplegaiento. En el caso de EDTA, como es un quelante reacciona con
un metal que en este caso es el cobre y por lo tanto genera la única interferencia
negativa. En la tabla 6 observamos los resultados de los efectos de sustancias no
proteicas en el método Bradford, en este caso todos los resultados tuvieron una
interferencia negativa. El fenol y el EDTA tuvieron valores mayores que los demás,
pero aun así no llegan al intervalo de confianza, en el caso del EDTA, al no tener
que interactuar con ningún metal, como era en el caso del método de Bradford, el
EDTA no tendrá con quien reaccionar y no genera ningún complejo. En El caso del
mercaptoeptanol, el método de Bradford tiene cierta afinidad por agentes
reductores, lo cual, de igual manera con el SDS y el detergente comercial, ya que
este tipo de reactivos intervienen en la unión de la proteína con el complejo azul
brillante de coomassie, ya que este recubre la proteína.
CONCLUSIONES
• Se cuantificaron las concentraciones de proteínas por los dos métodos

Bradford y BCA.
• El método de BCA es más precisa que Bradford, pero es menos exacta que el
mismo, hablando individualmente.
• No hay diferencia significativa entre ambos métodos
• Los detergentes interfieren positivamente en el método de BCA, mientras
que en el de Bradford sí.
BIBLIOGRAFÍA
Marcos, D. (16 de 10 de 2020). CURVAS DE CALIBRACION EN LOS METODOS
ANALITICOS. Obtenido de
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/CURVASDECALIBRACION_23498.pdf.
Pilar, R. (2003). BIOQUIMICA.TÉCNICAS Y MÉTODOS. Madrid: Hélice. Pp 148-158
Kruger N. The Bradford method for protein quantitation. Methods Mol Biol. 1994;32:9-15.
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FECHA: 23 OCTUBRE 2020

• Realizar una curva de calibración para poder cuantificar proteínas por

CURVA DE CALIBRACIÓN y = 0.0377x + 0.0573

Figura 1. Curva de Calibración por el Método de Bradford (Hemoglobina).

X=Concentración de Hemoglobina (µg/mL)

Tabla 3. Replicas para el análisis estadístico BCA.

Tabla 4. Resultados del análisis estadístico Bradford.

X S S2 C.V I.C 95% PRESICION EXACT

Tabla 5. Resultados del análisis estadístico BCA.

Tabla 7. Efecto de sustancias no proteicas en el método de BCA.

Tabla 8. Comparación entre métodos de Bradford y BCA.

Ho: s2-s2=0 µ-µo=0

• Se cuantificaron las concentraciones de proteínas por los dos métodos

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