Unidad: III

Microbiología

~1~
CONTENIDO
OBJETIVO....................................................................................................................................................3
REVISIÓN DE CONCEPTOS....................................................................................................................4
Tabla de métodos para el conteo viables .......................................................................................8
Tabla de método para el conteo total ............................................................................................12
FUNDAMENTOS .......................................................................................................................................15
MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO ...................................................................................................17
Material...................................................................................................................................................17
Reactivos o cultivos ...........................................................................................................................19
Equipo ....................................................................................................................................................20
METODOLOGÍA DIAGRAMA DE BLOQUES .....................................................................................22
Crecimiento bacteriano .....................................................................................................................22
Técnica Turbidimétríca ..................................................................................................................22
RESULTADOS ..........................................................................................................................................29
Tabla No. Resultados de la medición del crecimiento microbiano con diferentes
técnicas ..................................................................................................................................................29
Tabla No. Mediciones del crecimiento de Escherichia coli en espectrometría ..................30
Gráfica D.O contra tiempo ................................................................................................................31
CUESTIONARIO .......................................................................................................................................32
REFERENCIAS .........................................................................................................................................35

~2~
OBJETIVO
El alumno aplicará técnicas de cuantificación directa e indirecta para determinar las fases de la
curva de crecimiento de Escherichia coli, mediante la medición de turbidez del cultivo por
espectrofotometría, su crecimiento mediante el recuento celular en cámara de Neubauer y el
crecimiento de Trichoderma por el método de peso seco.

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REVISIÓN DE CONCEPTOS
Define el termino de crecimiento microbiano: El crecimiento de un microorganismo se define
como el aumento de sus componentes celulares, que puede tener como resultado un incremento
de su (amaño o del número de su población, o de ambos. El crecimiento puede definirse como
un incremento en los constituyentes celulares; este crecimiento ocasiona un aumento del número
de células en el caso de los microorganismos que se multiplican por procesos como gemación y
fisión binaria. En el último caso, células individuales se agrandan y dividen para originar dos
células hijas de un tamaño aproximadamente igual. (Prescott, Harley, & Klein, 2002)

Fases del crecimiento microbiano y los cambios fisiológicos que ocurren en la célula
bacteriana y fúngica durante cada fase.

EI crecimiento de un cultivo bacteriano se ve claramente en la representación gráfica, cuando se

expresan los logaritmos del número de células viables frente al tiempo. Una curva de crecimiento
típica. tiene un aspecto sigmoidal y permite diferenciar varias Cases de crecimiento que se
presentan regularmente de una forma más 0 menos acusada: fase de latencia (0 lag), fase
exponencial (logarítmica), fase estacionaria y fase de muerte.

El crecimiento sobre medios de cultivo solidos es semejante, aunque las densidades celulares
alcanzadas son muy superiores. (Schlegel & Zaborosch, 1997)

Fase de latencia. La fase de latencia abarca el lapso de tiempo entre la inoculación y el momento
en que se alcanza la tasa de división máxima. La duración de la fase de latencia depende sobre
todo del cultivo previo, de la edad del inoculo, así como de lo apropiado que sea el medio de
cultivo. Si el inoculo procede de un cultivo previa viejo (fase estacionaria de crecimiento) la célula
tiene que adaptarse primero a las nuevas condiciones de crecimiento mediante la síntesis de
RNA, ribosomas y enzimas. Si las fuentes de energía y de carbono del nuevo caldo de cultivo se
diferencian de las del cultivo previo, la adaptación a las nuevas condiciones va Iigada
frecuentemente a una nueva síntesis de enzimas que no eran necesarios en el cultivo previa y
que no habrán sido sintetizados. La formación de los nuevos enzimas esta inducida por el nuevo
sustrato. (Schlegel & Zaborosch, 1997)

Fase exponencial. La fase de crecimiento exponencial (logarítmico; fase exp. O fase log) se
caracteriza por un tiempo de generación constante y mínimo. El tiempo de generación durante la
fase log es un parámetro específico de cada especie bacteriana y depende del medio. Las
Enterobacterias se dividen cada 15-30 min, Escherichia coli a 37°C aproximadamente cada 20

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minutos. En otras bacterias el tiempo de generación es considerablemente superior, y para
muchas bacterias del suelo es de 50-150 min, en Nitrosomas y Nitrobacte incluso 5-10 horas.

En muchas bacterias el tamaño celular y el contenido en proteínas de la célula es constante

durante la fase log; el cultivo está compuesto hasta cierto punto por “células estándar”. Si este
comportamiento está claramente demostrado y el número de células, proteínas y masa seca
aumenta con las mismas tasas, entonces puede seguirse el crecimiento midiendo una de estas
magnitudes. Pero en muchos casos en un cultivo discontinuo las células se modifican durante el
crecimiento exponencial, ya que el ambiente también se modifica continuamente, desciende la
concentración de sustrato, aumenta la densidad celular y se acumulan productos metabólicos.
Debido a la relativa constancia del tiempo de generación durante la fase log, ésta resulta idónea
para la determinación de la tasa de crecimiento. Para el estudio de la influencia de factores
ambientales (pH, potencial redox, temperatura, aireación o semejantes) así como la capacidad
de utilizar diversos sustratos se sigue el incremento del número de células o bien la turbidez
(extinción) durante el crecimiento exponencial. (Schlegel & Zaborosch, 1997)

Fase estacionaria. La fase estacionaria se instaura cuando las células ya no crecen. La tasa de
crecimiento es dependiente de la concentración de sustrato; como consecuencia, al disminuir la
concentración de sustrato ya aparece una disminución de la tasa de crecimiento antes de su total
consumo. La transición de la fase exponencial a la estacionaria tiene lugar por tanto
paulatinamente. Además de la disminución de sustrato, la densidad de población parcial de O 2
baja y la acumulación de productos metabólicos tóxicos pueden hacer disminuir la tasa de
crecimiento e introducir la fase estacionaria. En la fase estacionaria pueden utilizarse aún
materiales de reserva, descomponerse parte de los ribosomas y sintetizarse enzimas. Los
procesos aislados dependen del factor que limite el crecimiento. Sólo las células muy simples
mueren rápidamente. Siempre que pueda obtenerse energía necesaria por respiración de
materiales de reserva o proteínas las bacterias permanecen largo tiempo vivas.

En muchos procesos microbianos de producción conducentes a la formación de un metabolito

secundario (por ejemplo, penicilina) la fase estacionaria es la verdadera fase de producción.
Por ello, en biotecnología se diferencia una trofosase (fase de nutrición o crecimiento) y una
idiofase (fase de producción). A pesar de que estas células no crezcan durante la idiofase, si
añaden sustratos, éstos aún son aprovechados y se incorporan precursores del producto.

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La masa bacteriana alcanza en la fase estacionaria se denomina rendimiento o producción.
Depende del tipo y cantidad de los nutrientes añadidos y de las condiciones de cultivo. (Schlegel
& Zaborosch, 1997)

Fase de muerte. La fase de muerte y las causas de la muerte de las células bacterianas en
soluciones nutritivas normales se han estudiado aún poco. Relativamente claras son las
condiciones cuando se acumulan ácidos (Escherichia, Lactobacillus). El número de células
viables puede descender exponencialmente. En según qué circunstancias las células pueden
lisarse por acción de propios enzimas (autolisis). (Schlegel & Zaborosch, 1997)

Adaptado: Desarrollo microbiano [𝑰𝒎𝒂𝒈𝒆𝒏 ]por, Blog de CEUPE,

2020, https://www.ceupe.com/blog/desarrollo-microbiano.html

En la actualidad, los métodos recomendados para el recuento total de hongos filamentosos y

levaduras son los clásicos métodos de recuento en placa a partir de diluciones decimales
seriadas de la muestra. Es posible realizar un recuento simultaneo de de hongos filamentosos y
levaduras ya que, dada la naturaleza filamentosa de los hongos ambos forman colonias
diferentes.

~6~
Se han descrito muchos medios de cultivo para dicho recuento, pero ninguno de ellos permite el
recuento de todos los de hongos filamentosos y levaduras ni en todos los alimentos. La norma
ISO 21527 recomienda el uso del agar Diclorán Rosa de Bengala con Cloranfenicol
(DRBC; Dichloran-Rose Bengal Chloramphenicol agar) en muestras de alimentos con una
actividad de agua alta y el Diclorán 18% Glicerol (DG18; Dichloran 18% Glycerol agar) en las que
tengan una actividad de agua inferior o igual a 0,95. (Coli, s.f.)

~7~
Realiza una tabla indicando los diferentes métodos utilizados para cuantificar el
crecimiento microbiano, su fundamento, en qué casos se usa cada uno y sus
ventajas y desventajas.
Tabla de métodos para el conteo viables
MÉTODOS PARA EL CONTEO DE MICROORGANISMOS VIABLES
MÉTODO FUNDAMENTO EN QUE CASOS SE VENTJAS Y
USA DESVENTAJAS
Vaciado en La técnica recuento de bacterias Ésta se usa El método podría
placa utilizada es la de vaciado en ampliamente para ocasionar la muerte
placa, que consiste en colocar determinar el número selectiva de algunas
1ml de muestra de cada una de de coliformes presentes cepas sensibles a
las diluciones seriadas en las en muestras de agua y calor, en este método
placas, donde se vacía alimentos. (Lugo, y se evita el plaqueo de
posteriormente el medio de otros, 2012) las diluciones, pero el
cultivo a punto de gelificar (agar número de placas y
aproximadamente a 45°C). medio de cultivo
(Lugo, y otros, 2012) requerido es
equivalente.
Aunque algunas
agrupaciones no
pueden ser separadas
por las diluciones.
(Lugo, y otros, 2012)
Extendido en La metodología de recuento en En el caso de realizar el Esta metodología
placa placa por plaqueo es una recuento de bacterias a tiene la ventaja de
metodología ampliamente partir de muestras cuya tener un buen límite
utilizada que consiste en realizar población se desconoce de detección,
diluciones seriadas 1:10 y se requiere realizar el sin embargo,
extender 100µl de cada dilución extendido (Lugo, y consume mucho
en una placa; las placas se otros, 2012) tiempo durante los
incuban hasta que las colonias plaqueos (Lugo, y
son apreciables para su otros, 2012)
recuento.
El extendido requiere de 7
diluciones y la muestra original
(para cada conteo) lo que
significa consumir 8 placas de
cultivo y alrededor de 25 minutos
para los plaqueos, sin tomar en
consideración repeticiones. Para
disminuir el tiempo de
procesamiento de muestra, la
metodología ha sufrido
modificaciones al paso del
tiempo y en la actualidad se usan
bolitas de acrílico en lugar de un
asa de vidrio para extender las
muestras. (Lugo, y otros, 2012)

~8~
Asa calibrada La utilización de agujas o asas El uso más frecuente Entre las ventajas de
calibradas permite tomar de este método es en las asas calibradas de
volúmenes pequeños, que son el urocultivo. Se metal con respecto a
inoculados en la superficie del determinan las UFC/g o las plásticas
agar mediante la técnica de mL de muestra. desechables, se tiene
siembra masiva. Las colonias (Herrera, y otros, 2010) que son más
son contadas y se multiplican por eficientes en la
el factor de dilución del asa siembra de cultivos,
empleada. (Herrera, y otros, son de fácil
2010) manipulación, y
además permiten
realizar contajes
semi-cuantitativos de
distintas bacterias con
mayor certeza.
La principal
desventaja radica en
su alto costo, ya que
las asas son
importadas y
fabricadas con
metales nobles, lo
que dificulta que
muchos laboratorios
de bajo presupuesto
puedan adquirirlas.
(Herrera, y otros,
2010)
Miles y Mirsa Este método requiere el empleo Cuando se busca Duplicado o triplicado
de pipetas cuentagotas determinar el número en la misma caja.
calibradas a 50 gotas por ml de unidades Muestras líquidas y
(0,02 ml por gota). Se preparan formadoras de colonias sólidas.
diluciones del cultivo de raz6n en una bacteriana Más rápido que otros
10, mezclándose 0,1 ml con 0,9 suspensión o métodos.
ml de diluyente, cambiando de homogeneizar. Se ha Produce menos
pipetas para cada dilución (en demostrado que el contaminación en la
algunos laboratorios se prefiere método de Miles y superficie de trabajo
emplear volúmenes mayores). Misra es preciso. Se (Hedges, 2002)
Las placas de agar se secan en encontró que tal
la estufa con la tapa cerrada estimación era posible
durante 24 horas a 37° C y y que las distribuciones
después se siguen secando se aproximaban lo
durante 2 horas con la tapa suficiente a la normal
entreabierta. Las placas deben para la construcción de
estar lo suficientemente secas intervalos de confianza
para absorber una gota de 0,02 (IC) por el método
ml en 15 a 20 minutos y para ello habitual. (Hedges,
suele bastar el procedimiento 2002)
originario de secado durante dos
horas. Cuando se deposita en
esas placas una gota de 0,02 ml

~9~
 a una altura de 2,5 em, la gota
cubre una superficie de 1,5 a 2,0
em de diámetro. Se preparan de
6 a 8 diluciones del cultivo y
simultáneamente, en secciones
numeradas, se deposita una
gota de cada una de las
diluciones en cada una de las 6
placas; una vez que se han
absorbido las gotas, las placas
se in cuban de la manera
habitual. En las superficies de
las gotas procedentes de las
concentraciones más altas del
cultivo se forman manchas
circulares de proliferaci6n
confluente. Los recuentos se
hacen en las zonas que
contienen el mayor número de
colonias sin signos de
confluencia ni gran disminución
del tamaño de la colonia por
proliferaci6n excesiva. El
número de colonias se calcula a
partir del valor medio de los seis
recuentos. El promedio de
colonias por gota, multiplicado
por 50 veces el factor de diluci6n
en la gota, dará el número de
gérmenes viables por mililitro
contenidos en la suspensión que
se examina. (ALTON, JONES, &
PIETZ, 1976)
Filtración Se basa en el crecimiento, la Se utiliza porque la Ventajas
identificación y el recuento de membrana de celulosa Buena
las colonias de los retiene a los reproducibilidad. Con
microorganismos retenidos en la microorganismos en su frecuencia se
superficie de un filtro, a través malla con poros de obtienen resultados
del cual se ha filtrado un 0.25- 0.45mm. Esta en un solo paso.
volumen conocido de muestra membrana se transfiere Los filtros pueden
de agua. Incubada en un medio a un medio de cultivo intercambiarse entre
de cultivo durante un tiempo y a para el desarrollo de medios diferentes.
una temperatura adecuadas. Se colonias. (AMMFM, s.f.) Pueden procesarse
ha convertido en el método más grandes volúmenes
común y preferido para evaluar de agua, para
las características aumentar la
microbiológicas del agua. sensibilidad del
El método consiste en: ensayo.
Pasar una muestra de agua a Ahorro de tiempo
través de un filtro de membrana considerable.

~ 10 ~
 (0,45 µ tamaño de poro y 47 Posibilidad de realizar
mm de diámetro). la filtración in situ.
Transferir el filtro con las El coste es bajo en
bacterias atrapadas a la comparación con el
superficie de un medio sólido método NMP.
(con agar) o a un soporte Desventajas
absorbente, conteniendo el El agua con mucha
medio líquido deseado (sin turbidez puede limitar
agar). el volumen de las
El uso del medio apropiado muestras.
permite la detección rápida de Poblaciones
los CT, CF y EF. (AMMFM, s.f.) numerosas de
bacterias ocasionan
una formación
excesiva de colonias,
incontables.
Los metales y los
fenoles pueden
adsorberse en los
filtros e inhibir el
crecimiento.
(AMMFM, s.f.)
Número (NMP) Es una estrategia eficiente de Se usa para obtener La capacidad de
más estimación de densidades datos cuantitativos en estimar tamaños
probable poblacionales especialmente concentraciones de poblacionales
(NMP) cuando una evaluación elementos discretos a basadas en atributos
cuantitativa de células partir de datos de relacionados a un
individuales no es factible. La incidencia proceso (selectividad)
técnica se basa en la positiva/negativa. Es Provee una
determinación de presencia o una estrategia eficiente recuperación uniforme
ausencia (pos o neg) en réplicas para estimar de las poblaciones
de diluciones consecutivas de densidades de microbianas de suelos
atributos particulares de población que se diversificados
microorganismos presentes en emplea cuando una Determino solo
muestras de suelo u otros evaluación cuantitativa organismos vivos y
ambientes. Por lo tanto, un de elementos activos
requisito importante de este individuales no es metabólicamente
método es la necesidad de poder factible. (Hylary, 2014) Suelen ser más
reconocer un atributo particular rápido igual de
de la población(es) en el medio confiable de los
de crecimiento a utilizarse. El métodos tradicionales
estimado de densidad de espaciamiento en
poblacional se obtiene del patrón plantas de cultivo
de ocurrencia de ese atributo en entre otras
diluciones seriadas y el uso de Se utiliza para contar
una tabla probabilística. (Hylary, microorganismos que
2014) son diferentes de
cultivar en medio
solido (Hylary, 2014)

~ 11 ~
 Tabla de método para el conteo total
Método para el conteo de microorganismos totales
MÉTODO FUNDAMENTO EN QUE CASOS VENTAJAS Y
DE USA DESVENTAJAS
Recuento Cuenta de Un volumen conocido de la Cuando se quieren Son muy rápidos.
microscopico Breed muestra (generalmente 0.01 ml) identificar las células Económico.
se extiende sobre un vivas. Equipo Sencillo.
portaobjetos normal, en una Se trata de un método Desventajas
superficie conocida. Se examina para el "recuento de No distinción de
en un microscopio calibrado, totales", dado que se microorganismos
donde se conoce el diámetro del contabilizan los Las pequeñas células
campo microscópico. Se microorganismos vivos son difíciles de ver
cuentan las células en diversos y muertos. Cuando el Solo se es adecuado
campos. Se obtiene el valor método solamente para el recuento de
medio de células recuenta organismos población de baja
por campo y se multiplica por el vivos se denomina concentración.
número de campos "recuento de viables" (OLIVAS & ALARCON,
microscópicos comprendidos en (UTFSM, 2014) s.f.)
la preparación. El resultado
corresponde al número de
células en el volumen extendido
(0.01 ml). Multiplicando este
valor por 100 se obtiene el
número total de organismos por
ml o por gramo de muestra.
(OLIVAS & ALARCON, s.f.)
Cámara de El recuento de leucocitos La cámara de Ventajas
Neubauer mediante cámara consiste en Neubauer, hematímetro Es rápido
determinar el número de ellos o hemocitómetro, es un Los frotis se pueden
presentes en un volumen instrumento de guardar
determinado de sangre diluída. laboratorio que consiste Las exigencias de
A esta muestra se le lisan los en una placa de vidrio equipo son mínimas.
hematíes para facilitar la especial grueso. Esta Se pueden observar las
visualización y recuento de cámara sirve para diferencias morfologías
leucocitos. La muestra de realizar recuentos de de los
sangre se diluye lo suficiente algunos tipos celulares microorganismos.
para que los leucos estén como hematíes, Se observan las
separados unos de otros y así glóbulos blancos y diferentes morfologías
poder contarlos. El recuento se plaquetas, aunque Se observan tanto los
realiza en una cámara de puede ser usado para microorganismos
Neubauer o similar de recuento de esporas, viables como los no
dimensiones conocidas. espermatozoides, viables.
La profundidad de la cámara es parásitos, etc. Desventajas
de 0,1 mm. Los cuadrados de (Camacho & Álvarez, La cantidad de muestra
las esquinas miden 1 mm2 de s.f.) analizada es poca
superficie y están subdivididos Provoca cansancio del
en 16 cuadrados más pequeños operador.
de 0,25 mm de lado. El Sólo sirve para
cuadrado del centro está muestras con cargas
dividido en 16 cuadrados de 0,2

~ 12 ~
 mm de lado y éstos a su vez superiores a 10.000 por
están subdivididos en 16 mL.
cuadrados de 0,05 mm de lado. Es difícil distinguir los
(Rodríguez, 2019) microorganismos de las
partículas de muestra.
Una inadecuada
distribución de la
muestra sobre la
superficie del
portaobjetos puede
ocasionar serios
errores. (Dauguet,
1977)
Cámara de Es una placa de vidrio con una Cuando se quieren Ventajas es un método
Prettof cuadrícula en depresión donde identificar las células que se realiza
Hausser se deposita la muestra medida. vivas o muertas. fácilmente.
Es posible relacionar el número Es un método que Su proceso es rápido
de células observadas en la resulta ser bastante Si se realiza
superficie de un cuadro, con el exacto debido a que adecuadamente muy
volumen de esa área. tiene una dimensión exacto
Considerando los volúmenes en que facilita el conteo de Desventajas
la cuadrícula se puede calcular los microorganismos No es posible
la concentración de por cuadrante. (Vullo, diferenciar
microorganismos por ml. 2000) (Dauguet, 1977) microorganismos vivos
(OLIVAS & ALARCON, s.f.) de microorganismos
muertos (Camacho &
Álvarez, s.f.)
Turbidimetría En una suspensión microbiana, Cuando se quieren Ventajas
la cantidad de células está identificar las células Rápido
directamente relacionada con la vivas o muertas Poca muestra
turbiedad o densidad óptica de (Dauguet, 1977) (Vullo, Sensible
la misma e inversamente 2000) Desventajas
relacionada con la cantidad de No debe tener materia
luz que pasa a través de ella. orgánica en suspensión
Esto permite determinar con Es total
bastante exactitud la La curva no esta hecha
cantidad de microorganismos en a base de bacterias si
la suspensión mediante la no de sales (Camacho
determinación de la turbiedad & Álvarez, s.f.)
mediante un nefelómetro o un
espectrofotómetro. Los
resultados se comparan con
una curva estándar construida
con una suspensión testigo de
concentraciones conocidas. La
turbiedad que resulta en la
suspensión microbiana se
aproxima a la producida por un
cierto número de células

~ 13 ~
en suspensión. Esta técnica es
útil solamente para organismos
unicelulares de pocos µm, como
las bacterias, lo que les permite
mantenerse suspendidos y
homogéneamente distribuidos.
(OLIVAS & ALARCON, s.f.)

~ 14 ~
FUNDAMENTOS
Durante varios años, se han desarrollado métodos y técnicas para determinar la cuantificación
de la población microbiológica en diferentes industrias. La comprensión del concepto de técnica
y método no suelen estar claros, por esta razón es necesario emplear adecuadamente el
significado de los términos mencionados, debido a que suelen ser empleados de forma
indiscriminada. Es así como el método es un procedimiento de tipo universal que permite la
realización de una tarea, mientras que la técnica es aquella que se basa en procedimientos,
normas o protocolos, es decir, es la manera por la cual es aplicado un método. Con base en esto,
los métodos de cuantificación facilitan el análisis del comportamiento microbiano, teniendo en
cuenta valores numéricos que permiten el estudio e identificación del potencial benéfico o
perjudicial de un microorganismo. (Diaz & Leguizamo, 2020)

La cuantificación de microorganismos es un elemento crítico en los estudios de ecología

microbiana y microbiología clínica. No solo es importante conocer al responsable de un efecto
benéfico o identificar al microorganismo potencial de causar alguna infección severa, sino también
es importante saber el número de microorganismos implicados, para establecer si éstos serán
capaces de desarrollar una función benéfica o perjudicial. (Lugo, y otros, 2012)

Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la técnica

comúnmente utilizada es la cuenta en placa. En realidad, esta técnica no pretende poner en
evidencia todos los microorganismos presentes. La variedad de especies y tipos diferenciables
por sus necesidades nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento, oxígeno
disponible, etc., hacen que el número de colonias contadas constituyan una estimación de la cifra
realmente presente y la misma refleja si el manejo sanitario del producto ha sido el adecuado.
Por otra parte, el recuento de termofílicos, psicrofílicos y psicotróficos es importante para predecir
la estabilidad del producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento. Para obtener
resultados reproducibles y por lo tanto significativos, es de suma importancia seguir fielmente y
controlar cuidadosamente las condiciones. Esta técnica puede aplicarse para la estimación de
microorganismos viables en una amplia variedad de alimentos.

El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de

elección después de un cierto tiempo y temperatura de incubación, presuponiendo que cada
colonia proviene de un microorganismo de la muestra bajo estudio. El método admite numerosas

~ 15 ~
fuentes de variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores.
(NORMA, 1995)

~ 16 ~
 MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO
Material
Matraces Erlenmeyer Probetas 100ml..
250ml.

Tubos de ensaye con Micropipeta.

tapa rosca. Sirve para el
transporte y el cultivo.

Puntas Micropipeta. Celdas de cuarzo.

Son puntas que están Diseñados para
ajustadas para volúmenes sostener muestras
diferentes. La punta para experimentos
presenta también en un de espectroscopia y
volumen de 0,1 µl análisis ópticos.
un nivel de líquido
claramente visible.
Paletizadas en una
plataforma gris

Vasos pp 250ml. Papel filtro. El

"papel filtro" se usa
principalmente en
laboratorios
analíticos para filtrar
soluciones
heterogéneas.

~ 17 ~
 Embudos chicos. Pinzas de
El embudo es un disección. Este
instrumento instrumento permite
empleado para canalizar sujetar tejidos y
líquidos y materiales materiales mediante
sólidos granulares en la fuerza ejercida por
recipientes con bocas la presión de las
angostas y calentar ramas. Proporcionan
muestras. un firme sostén en
los tejidos duros y
piel.
Pizeta. El frasco lavador o Cubre objetos.
también nombrado piseta Sirve para fijar la
o matraz de lavado, es un muestra y evitar que
frasco cilíndrico de se mueva fuera del
plástico o vidrio con una alcance de nuestra
abertura parecida a la de observación.
una pajita, que se utiliza
en el laboratorio de
química o biología para
contener algún solvente,
Pipeta Pasteur. La pipeta Bisturí. Es un
de Pasteur es similar a un instrumento en
cuentagotas, forma de cuchillo
generalmente formada por pequeño, de hoja
un tubo de vidrio con fina, puntiaguda, de
borde cónico. Sirve para uno o dos cortes,
hacer la transferencia de que se usa en
pequeñas cantidades de procedimientos de
líquidos cirugía, disecciones
anatómicas y
autopsias.
Asa bacteriológica. Sirve
para trasportar, arrastrar
inóculos desde la solución
madre al medio de cultivo.
También sirve para la
realización de frotis

~ 18 ~
 Reactivos o cultivos
Medio LB. Medio Agua.
recomendado para
mantener y cultivar cepas
recombinantes. Para el
crecimiento y
mantenimiento de las cepas
recombinantes de E. coli
utilizadas en procedimientos
de microbiología molecular

Alcohol. Caldo de Malta.

El extracto
de malta proporciona
las fuentes de carbono,
proteínas y nutrientes
necesarias para el
crecimiento de
microorganismos.
Escherichia coli. Trichoderma.
La Trichoderma
bacteria E. coli normalmente harzianum es un hongo
vive en nuestros intestinos, beneficioso para las
donde ayuda a nuestro plantas, ampliamente
cuerpo a descomponer y a utilizado como agente
digerir los alimentos que de control biológico
comemos. contra diversos
Lamentablemente, ciertos patógenos vegetales.
tipos de E. coli (o "cepas") Se utiliza en
pueden salir de los aplicaciones foliares,
intestinos y llegar a la tratamiento de semillas
sangre. y suelo para el control
de diversas
enfermedades
producidas por hongos.

Fenol al 2%.
La matricectomía química
por fenol alcohol es una
técnica quirúrgica usada
para el tratamiento definitivo
de la uña encarnada.

~ 19 ~
 Equipo
Balanza analítica. Autoclave.

Campana de flujo Agitadora. Sirve para

laminar. Proporcionan mezclar o revolver por
un área delimitada por medio de la agitación de
superficies fáciles de algunas sustancias.
limpiar y desinfectar con También sirve para
un flujo de aire filtrado a introducir sustancias
través de prefiltros que líquidas de alta reacción
retienen las partículas por miedo de
más grandes que están escurrimiento y evitar
presentes en el aire. accidentes.

Espectrofotómetro Incubadora.
UV-VIS. Equipo que
permite la
determinación
cuantitativa de
compuestos
absorbentes de
radiación
electromagnética en
solución, para
longitudes de onda
comprendidas entre 200
y 1100 nm.
Horno de secado. Se Cámara Neubauer. Una
utiliza para secar y cámara de Neubauer o
esterilizar diferentes hemocitómetro es un
recipientes de vidrio o instrumento utilizado en
metal. medicina y biología para
realizar el recuento de
esporas y células en un
medio líquido, que puede
ser; un cultivo celular,
sangre, orina, líquido
cefalorraquídeo, líquido
sinovial, etc.

~ 20 ~
Microscopio.
Este aparato permite
observar lo que es
invisible a simple vista.
Los microscopios de luz,
compuestos u ópticos,
usan lentes, para
enfocar y amplificar los
rayos de luz que pasan
a través de un
espécimen o rebotan en
él.

~ 21 ~
METODOLOGÍA DIAGRAMA DE BLOQUES
Crecimiento bacteriano
Técnica Turbidimétríca
Preparación del preinóculo

Preparación del
preinóculo

Se siembra E. coli en un matraz

con 25 ml de medio LB, y se
cultiva a 37ºC en agitación a 120
r.p.m. en un agitador orbital
durante 18 h.

~ 22 ~
Inoculación e incubación del cultivo.

Inoculación e incubación
del cultivo

A partir de este cultivo reciente, se

inocula con puntas estériles 1 ml
en un matraz con 50 ml de LB, se
homogeniza y se mide la D.O. en
el espectrofotómetro

Esta medida corresponde al tiempo

0. La D.O. debe medirse cada 30 min
por 6 h y realizar dos últimas lecturas
de D.O. a las 16 y 20 hrs, teniendo
cuidado de agitar el matraz antes de
tomar la muestra para realizar las
medidas

Colocar el matraz en una incubadora

orbital a 37ºC y 120 r.p.m.

~ 23 ~
Medida del crecimiento por espectrofotometría.

Medida del crecimiento

por espectrofotometría

Encender el espectrofotómetro 15
minutos antes de realizar la lectura.

Cargar el programa de longitud de

onda programable

Fijar la longitud de onda a 600 nm,

para absorbancia máxima de E.coli y
mínima del
medio de cultivo.

Colocar el blanco correspondiente al

medio de cultivo sin inocular en el
lugar de las muestras y calibrar el
equipo medio de cultivo.

Para medir las muestras, tomar 3 ml de

cultivo bien homogeneizado en un tubo y
situarlo en el lugar de las muestras y
anotar la absorbancia (D.O.).

~ 24 ~
Técnica de cuenta directa en cámara de Neubauer

Técnica de cuenta directa en

cámara de Neubauer

Se coloca 1 mL de la muestra en un tubo de

ensaye. En muestras muy concentradas se
preparan diluciones con solución salina.
Agregar 0.5 mL de solución de fenol al 2 % y
dos gotas de safranina. Mezclar y dejar
reposar durante 5-10 min

Lavar la cámara de Neubauer sin frotar la

zona del centro y el portaobjetos. Secar con
papel suave. Colocar el portaobjetos en la
zona central limitada por dos excavaciones
laterales, donde se aprecia una zona
cuadriculada a simple vista.

Homogenizar la muestra, tomar una muestra

con una pipeta Pasteur y depositar una gota
entre la cámara y el cubre objetos por el
borde de la cámara. Dejar que la muestra se
distribuya por capilaridad, evitando el exceso
de muestra.

Dejar reposar por 5 min., colocar la cámara

en la platina del microscopio y localizar con el
objetivo seco débil (10X) la zona
cuadriculada.

~ 25 ~
 Localizar el cuadro central grande que miden
1.0 mm por lado, que se encuentra dividido
en 5X5 cuadros pequeños limitados por triple
línea que miden 0.2 mm por lado. Estos
cuadros pequeños a su vez se encuentran
divididos en 16 cuadros más pequeños de 0.5
mm de lado.

Hacer la cuantificación de las células con el objetivo

seco fuerte (40X), contando el número de células que
se localicen en los cuadros de 1 mm. Se empieza a
contar de la parte superior de los cuadros de 0.2 mm y
se continua hasta la base. Si las células tocan los
límites de los cuadros, deberán contarse solamente
aquellas que toque la parte superior y el lado derecho
del cuadro. Si las células tocan la parte inferior o el lado
izquierdo no se cuentan

Cuente hasta cerca de 200 a 250 células

antes de determinar el número de células por
mL.
Durante el conteo se pueden presentar tres
situaciones:

a) Si hay de 200 a 250 células por cuadro

grande (1.0 mm), multiplicar directamente
X104 para reportar el número de células por
mL.

b) Con menos de 200 células por cuadro de

1.0 mm será necesario contar algunos de
los cuadros de las esquinas (miden 1X1
mm de lado y divididos en 4X4). De esta
manera se cuantificarán más de 200
células. Después dividir el número total de
células entre el número de cuadros
empleados y sacar el valor promedio por
cuadro (1 mm). Después multiplicar este
valor por X104 para reportar el número de
células por mL
~ 26 ~
 c) En el caso de que se observen más de
200 células por cuadro (1 mm), se deberán
contar las células de los cuadros de mayor
tamaño (0.2mm) hasta contar cerca de 200
células. Dividir este valor entre el número de
cuadros usados para la cuenta para sacar el
valor promedio por cuadro (0.2 mm).
Multiplicar este valor promedio por 25 para
obtener el número de células aproximado en
un cuadro de 1 mm y después multiplicar por
X104 para reportar el número de células por
mL.

El factor de 104 por el cual se debe de

multiplicar el número de células por cuadro
(1 mm) es porque este cuadro contiene un
volumen de 0.1 mm3 (mide 1 mm por lado y
la cámara tiene una profundidad de 0.1 mm).

# células/cuadro grande (25 cuadros

0.2 mm) = # células/0.1mm3 X 104 =
# células /mL

En el caso de que el # de células sea

muy grande, la suspensión deberá
diluirse y se hará la corrección como
sigue:

# células/mL en la muestra diluida X

(factor de dilución) = # células/mL en
la suspensión original

~ 27 ~
Crecimiento fúngico

Crecimiento fúngico

Se siembra un inoculo de 1 cm2 de

Trichoderma en 7 matraces que contengan
25 ml del medio extracto de malta y se
cultiva a 28ºC durante 7 días. Cada 24 h,
se tomará un matraz y se realizará la
filtración mediante papel filtro previamente
pesado y secado.

El filtrado obtenido se colocará en el horno

de secado a 60º C/24 h y se determinará el
peso del filtrado.

Lo mismo se hará con los siguientes

matraces en los días posteriores.

~ 28 ~
 RESULTADOS
I. Reportar en la tabla los resultados de cuantificación de los cultivos, aplicando las
técnicas realizadas. Indicar los cálculos hechos para cada metodología. Tabla No.
Resultados de la medición del crecimiento microbiano con diferente.

Tabla No. Resultados de la medición del crecimiento microbiano con diferentes

técnicas.
Microorganismos Densidad óptica Cuenta en cámara Peso seco
de Neubauer (# de
células
totales/mL)

~ 29 ~
 II. Registrar en la tabla los resultados de cuantificación del crecimiento de Escherichia
coli por la técnica turbidimétrica.

Tabla No. Mediciones del crecimiento de Escherichia coli en espectrometría.

Tiempo de muestreo Turbidez (D.O)

0.5

~ 30 ~
 III. Realiza una gráfica de D.O. contra tiempo, identificando las fases de crecimiento y su
duración.

Gráfica D.O contra tiempo

~ 31 ~
CUESTIONARIO
1. Menciona diferentes métodos para medir crecimiento poblacional unicelular
Métodos directos:

 Determinación del peso seco. Suspensión celular, se separan las células por
centrifugación, se lavan y secan en estufa hasta peso constante
 Recuento de células totales (recuento directo). Cámaras de recuento especiales
(Neubauer, Petroff-Hauser). Son portaobjetos excavados de volumen perfectamente
conocido cuando se sella herméticamente con cubreobjetos resistentes.
 Método de recuento de placa. Se basa en la capacidad de una célula viable de formar
una colonia en un medio de cultivo adecuado Standard (PCA). Por lo tanto, se cuentan
colonias, cada una proviene de una sola célula viable. (Célula viable: capaz de dividirse
y formar células hijas.) (Método de extensión en placa y método de vertido en placa).

Métodos indirectos:

 Medida de la turbidez (ópticos). En una suspensión celular, las células difractan (o

dispersan) la luz incidente en forma proporcional a su concentración Requiere la
construcción de una curva de calibración. (FCEQN, s.f.)
2. ¿Qué métodos se utilizan para cuantificar masa celular?

Métodos directos:

En estos métodos se requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas.

Determinación del peso húmedo

 Se tara un tubo de centrífuga

 Se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante
 Se determina el peso del sedimento

Determinación de peso seco

 Como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105ºC, toda la
noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-
15% de los valores de peso húmedo.

Determinación del nitrógeno total

 Peptidoglucano, ADN, ARN, proteínas, ATP, clorofilas en organismos fotosintéticos

~ 32 ~
Métodos indirectos

Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por unidad de tiempo.

 Ejemplos: consumo de oxígeno (QO2) y consumo de carbónico (QCO2), determinados por

el respirómetro de Warburg. Producción de ácidos.

Métodos turbidimétricos (ópticos)

 Son muy usados en la práctica cotidiana del laboratorio. La base común de estos métodos
consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un
cultivo bacteriano. (Eianez, s.f)
3. ¿Qué diferencia existe entre velocidad de crecimiento y tiempo de
generación?

La velocidad de crecimiento es el incremento en el número de células o en la masa celular por

unidad de tiempo. La velocidad específica de crecimiento es característica para cada tipo de
microorganismo y medio de cultivo (sustrato).

El tiempo de generación es el tiempo requerido para que, a partir de una célula, se formen dos
células, es decir, es el tiempo que tarda una población microbiana en duplicarse. Este tiempo
varía considerablemente con los microorganismos y las condiciones ambientales como la
temperatura. (Schlegel & Zaborosch, 1997)

4. ¿En qué consiste la medición de actividad biológica y determinación de

constituyentes celulares para la cuantificación de poblaciones microbianas?

La actividad biológica es considerada como un índice de la fertilidad de los suelos. Varias son las
metodologías desarrolladas para cuantificar la misma, resultando de gran interés práctico la
determinación de la biomasa microbiana (BM), ya sea a través de medidas directas, así como la
medición de parámetros fisiológicos, tales como la respiración inducida por sustrato También, la
actividad enzimática en el suelo constituye otro método para evaluar tanto la fertilidad actual como
potencial de este recurso natural.

La determinación del crecimiento de poblaciones bacterianas se puede expresar en función de:

 aumento de masa del cultivo

 aumento del número de células

~ 33 ~
 Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre sí en cultivos que estén en crecimiento
balanceado (en el que todos los componentes aumentan una misma proporción por unidad de
tiempo).

5. ¿Qué condiciones ambientales y nutrimentales causaran una disminución o

eliminación de la fase lag en la curva de crecimiento. Qué condiciones la
incrementaría?

Tamaño del inoculo

Bondad del inoculo

 Si el inóculo procede de células en fase estacionaria de un cultivo anterior, la fase lag es larga.
Ello se debe a que los contenidos en coenzimas y otros constituyentes de las células son
bajos, y las células deben reponerlos en el medio fresco.
 Si las células están dañadas por algún agente, el lag también es largo, ya que necesitan un
tiempo para la reparación de los daños.
 Si las células del inóculo se tomaron de un cultivo previo en fase logarítmica, el lag es más
corto.

Medio del que procede el inoculo

 Si el medio es similar al medio fresco, el lag es más corto.

 Si el medio del inóculo era un medio rico y el medio fresco es más pobre, la fase de retardo se
hace más larga, porque las bacterias necesitan un tiempo adicional para activar la síntesis de
las enzimas biosintéticas que estaban reprimidas en el medio rico.

Pero aun cuando la inoculación se hace desde un cultivo previo en fase logarítmica, cuyo medio
sea idéntico al medio fresco, se observa siempre una fase lag.

 Necesidad de neutralizar sustancias tóxicas en el medio fresco.

 Porque se produce dilución de ciertos metabolitos intracelulares al inocular las bacterias en el
medio nuevo; por lo tanto, hasta que no se vuelva a alcanzar una concentración de esos
metabolitos adecuada para el crecimiento, éste no “arranca”. (Eianez, s.f)

~ 34 ~
REFERENCIAS
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