PRE – INFORME No 3 - Caracterización macro y microscópica de microorganismos

(Bacterios).

Objetivo General
- Determinar las características macro y microscópicas de bacterios mediante el uso
de diferentes técnicas como su crecimiento en medios de cultivo y uso de diferentes
coloraciones.

Objetivos Específicos
- Conocer la técnica de cultivo, uso e interpretación de las colonias producidas.
- Describir características macroscópicas de las colonias obtenidas por medios de
cultivo
- Reconocer elementos microscópicos de bacterios en cuanto a su forma, coloración,
estructura y agrupación mediante técnicas de tinción ya sean simples, compuestas o
diferenciales.

MARCO TEÓRICO

● ¿Cuáles son las características macro y microscópicas de los bacterios?

CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS

Morfología: Se da gracias a la observación de colonias bacterianas preferiblemente en

cultivos frescos en medios no selectivos para lo cual es importante el aislamiento de una
sola línea celular para facilitar su estudio.

- Forma de la colonia: está dada según su forma (puntiforme, circular, rizoide,

filamentosa, irregular y fusiforme), elevación (cóncava, convexa, aplanada, papilada,
etc) y los bordes (lisos, rugosos, aserrado, filamentoso, completo, ondulado,
irregulares, etc).
- Tamaño: suele ser uniforme si se trata de la misma especie, es así que los
estafilococos suelen tener mayor tamaño que los estreptococos como por ejemplo.
Los diferentes tamaños dependen de la medida de sus diámetros, así se pueden
observar colonias pequeñas con diámetro menor o igual a 0,5 mm, otras clasifican e
colonias medianas y corresponden a aquellas con tamaños entre 1 a 2 mm, las
colonias grandes tienen 4 y 6 mm y aquellas que crecen por toda la placa.
- Superficie: puede tener aspecto seco o viscoso y forma lisa o rugosa.
- Pigmentación: en algunos casos las colonias que crecen pueden verse
pigmentadas, como es el caso de la Pseudomonas aeruginosa, bacterias gram
negativas que forman pigmentos verdes y el de la Serratia marcescens gram
negativo también con pigmento rojo, estas coloraciones son útiles en la identificación
del microorganismo, aunque hay cepas de una misma especie que pueden no ser
pigmentadas.

Hemólisis: Se da en medios de cultivos a los cuales se les agrega sangre, esto para
conocer si el microorganismo produce hemolisinas, las cuales causan la lisis de los glóbulos
rojos; a partir de allí se puede establecer si se está en presencia de grupos de bacterios
beta hemolíticos que forman halos claros alrededor de la colonia, alfa hemolíticos que
forman halos verdosos alrededor de la colonia por la biliverdina, producto de la degradación
de la hemoglobina, o aquellos que no causan hemólisis denominados gama hemolíticos.

Se puede observar una colonia gama hemólica

ya que no hay presencia de hemólisis, con
bordes irregulares y aspecto de vidrio
esmerilado, donde el experimentador definió
un tamaño de 4 a 5 mm de diámetro.

Imagen 1. Colonia de Bacillus Anthracis. (Realpe, Hernández, & Agudelo, 2002)

Se puede observar una colonia beta hemólica

con presencia de halo claro, la superficie
rugosa en algunas partes y lisa en otras, con
bordes ondulados donde el experimentador
definió diámetros de la colonia entre 2 y 4
mm.

Imagen 2. Colonia de Bacillus Subtilis. (Realpe, Hernández, & Agudelo, 2002)

CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS
En estudio de las características microscópicas de microorganismos se pueden dar en
muestras frescas, aunque preferiblemente se hace uso de tinciones las cuales constituyen
un primer paso (a veces el único) para la identificación de poblaciones bacterianas
específicas gracias a la determinación de sus formas, tipo de agrupación, tamaño y
estructura; en el caso de bacterias que presentan otro tipo de estructuras como flagelos,
esporas, cápsulas u otros, requieren de técnicas más específicas de tinción.

Tamaño: Los tamaños de los bacterios son muy pequeños, y se mide en micras por lo cual
es necesario el uso del microscopio, en términos generales un tamaño promedio para
aquellos bacterios en forma de cocos es de 0,2 µm y en el caso de los bacilos es de 5 a 8
µm y 1,5 µm de largo y ancho respectivamente (Tévez et al, 2006).

Forma: La forma que tienen los bacterios está dada por la rigidez de su pared y es
característica de cada tipo; cuando es circular (cocoidea) tiene el nombre de “coco” y
cuando es cilíndrica (bacilar) tiene el nombre de “bacilo”, algunos de estos últimos
presentan incurvaciones donde podemos encontrar otra categoría, los vibrios, los cuales
tienen una sola incurvación en forma de coma, pero cuando tienen varias incurvaciones
tienen el nombre de espirilos, otras tienen aspecto de hongo y son llamadas bacterios
filamentosos, por último también se pueden encontrar bacterios con una forma intermedia
entre coco y bacilo que se denominan cocobacilos y que corresponden en su mayoría a las
primeras formas en el desarrollo de los bacilos.

Agrupación: Las diferentes agrupaciones que se pueden encontrar, representan la

asociación que hay entre dos bacterios o más aunque algunos como los espirilos no hacen
este tipo de asociaciones, esto permite una clasificación taxonómica de las mismas.
- Los cocos suelen asociarse en diplococos donde se ven emparejados y es por la
división de una célula, donde las dos hijas permanecen unidas, tétradas donde se
ven grupos de cuatro células en un mismo plano, estafilococos que forman racimos
de cocos y sarcinas que son agrupaciones cuboidales de ocho o más cocos.
- Los bacilos suelen asociarse en diplobacilos que son dos bacilos emparejados,
estreptobacilos donde se unen formando cadenas o formas irregulares las cuales no
se pueden identificar bajo las clasificaciones anteriores.

Estructura: Es necesario realizar una clasificación entre los elementos estructurales

obligados presentes en todos los bacterios como la membrana plasmática, pared celular,
ribosomas y núcleo o cromosoma y los elementos estructurales facultativos pueden o no
estar presentes como las inclusiones citoplasmáticas (esporas y vacuolas), cápsula,
flagelos, fimbrias o pilis.

● Explique las diferentes técnicas de coloración asociadas al estudio microscópico de

bacterios.

El estudio microscópico de los microorganismos se facilita con el uso de herramientas como

el microscopio óptico sin embargo las tinciones brindan grandes ventajas adicionales en
comparación con las muestras no teñidas a la hora de la caracterización morfológica y
bioquímica de diferentes especies. Como se mencionó, un colorante es capaz de dar color
a las células y sus diferentes elementos, químicamente se componen de un cromóforo los
cuales tienen la capacidad de emitir luz visible al ojo humano según la longitud de onda
absorbida, por otra parte se compone de un auxocromo, grupos funcionales o radicales que
intensifican el color dado por el cromóforo gracias a la presencia de átomos no saturados
pues van a trasladar a los cromóforos a longitudes de onda más largas para así intensificar
el color (López et al, 2014).

Las tinciones que se pueden denominar como rutinarias en el estudio microbiológico de

bacterios se encuentra el azul de metileno y la tinción de gram explicadas en el pre-informe
2, pero dentro de la práctica también se puede hacer uso de otras tinciones como:

- Tinción de Sheafer Foulton

También conocida como tinción de esporas bacterianas, representa un tipo de
tinción capaz de enfrentarse a los principales factores que hacen su tinción compleja
por los bajos niveles tanto de agua como de permeabilidad que poseen, sin embargo
esto se soluciona aplicando calor en la muestra, lo que la permeabiliza. En esta
tinción, a través del calentamiento con emisión de vapores, se aplica el colorante
principal que es el verde de malaquita, este es soluble en agua y casi no reacciona
con el material celular (por lo que solo teñirá las esporas); la muestra puede
decolorarse con el agua y contrateñirse con el colorante de contraste, la safranina
que sí presenta afinidad por el material celular, coloreando el resto del organismo y
 manteniendo el verde de las esporas. Generalmente se usa en muestras de los
géneros Bacillus y Clostridium (González et al, 2020).

- Tinción negativa (tinta china)

Considerado como un método de tinción negativo, es mayoritariamente usado para
el estudio de cápsulas, las cuales recubren la pared celular de distintos organismos.
Las cápsulas poseen un contenido alto de agua lo que las hace difícil de teñir de
buena manera, es por esto que se recurre a la tinción negativa en donde se tiñe "el
fondo" en este caso con tinta china que produce un fondo negro, es por esto que
nuestro objetivo de interés se verá "en negativo" por el contraste. Se hace uso de
colorantes ácidos, cargados negativamente, así los organismos que también estén
cargados negativamente no van a teñirse pues lo repele. Por otra parte, se aconseja
realizar la observación antes de que la muestra se seque completamente, ya que
esto dificulta la visualización de la misma.

Radica una gran importancia en detectar cápsulas en el ámbito médico, ya que

generalmente se asocia con un posible aumento de virulencia, en los organismos
estudiados con mayor frecuencia se pueden ubicar al género Klebsiella (gram
negativo) y al hongo Cryptococcus neoformans.

- Tinción de cápsula - Método de Anthony

También rigiéndose a los principios de la tinción con tinta china, el método de
Anthony es un tipo de tinción negativa por contraste, generalmente usado para el
estudio de cápsulas, las cuales destacan por su cualidad de difícil tinción. En este
método el colorante principal es el cristal violeta, el cual tiñe toda la muestra para
posteriormente realizar un lavado con sulfato de cobre, lo que dará como resultado
un fondo completamente violeta y permitirá la observación de cápsulas sin ningún
tipo de coloración. Esta técnica hace un poco más sencilla la observación de
cápsulas en comparación con el método de tinta china explicado anteriormente, sin
embargo se debe tener en cuenta que para este procedimiento la muestra debe
dejarse secar muy bien antes de realizar la observación, por lo cual puede
considerarse como un método más laborioso (Cuervo, 2010).

- Coloración diferencial - Ziehl Neelsen

Es utilizada para la observación de bacterios ácido -alcohol resistentes
(micobacterios) que tienen una pared celular bioquimicamente compleja, lo que
facilita su diferenciación de aquellos que no lo son. Esta técnica radica en el uso de
carbol fucsina el cual se calienta una vez puesto sobre la muestra para que se de la
solubilización de las ceras y lípidos que constituyen la pared celular de las
micobacterias, de esta forma se promueve el paso del colorante hacia el interior
pues este tiene afinidad por los acidos micólicos que hacen parte de la pared,
posteriormente se enfría la muestra con agua de tal forma que los lípidos de la pared
se solidificquen y resistan a la acción de la solución alcohol-acido y azul de metileno
que en este caso se utiliza como tinte de contratinción, al final el resultado positivo
de la tinción permitirá la observación de bacilos de color rojo. Las muestras para la
observación se pueden obtener de diferentes orígenes como el líquido pleural,
sinovial, pericárdico y cefalorraquídeo, así como abscesos y aspirados
 endotraqueales entre otros; se utiliza de manera rutinaria en el diagnóstico de
patologías como la tuberculosis (López et al, 2014).

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