PRACTICA. To de Enterobacterias

PRACTICA # 1 .
AISLAMIENTO DE ENTEROBACTERIAS
ASIGNATURA: PROCESAR CULTIVOS BACTERIOLOGICOS
INTRODUCCION:
Las enterobacteriáceas (Enterobacteriaceae) son una familia de bacterias Gram

negativas que contiene más de 30 géneros y más de 100 especies que pueden tener
morfología de bacilos o cocos. Los miembros de esta familia forman parte de la microbiota
del intestino (llamados coliformes) y de otros órganos del ser humano y de otras especies
animales. Algunas especies pueden vivir en tierra, en plantas o en animales acuáticos
Cuando se han aislado las bacterias causantes de un proceso infeccioso, éstas deben ser
identificadas hasta llegar a GENERO Y ESPECIE, para lograrlo se debe evaluar su
actividad bioquímica o metabólica. Del microorganismo aislado dependerá el tipo de
tratamiento que debe ser administrado al paciente.
Las enterobacterias son las responsables del 50% de todos los aislamientos clínicamente
significativos, producen el 50% de los casos de septicemia, del 60 al 70% de la enteritis
bacterianas, el 90% de las infecciones urinarias. Son causa importante de infección
nosocomial.
OBJETIVOS:
1. Sembrar, leer e interpretar algunas pruebas bioquímicas útiles en la identificación de

bacterias bacilares Gram negativas.
2. Determinar género y especie de la cepa problema.
MATERIAL BIOLOGICO
Muestra de materia fecal en frasco con tapa.
MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO
 Placas estériles de: agar EMB, agar Mc Conkey, agar salmonella-Shigella y agar
XLD
 Mechero, asa, incubadora bacteriológica a 37°C.
 Equipo de coloración de Gram
 Serie de tubos de cultivo para pruebas bioquímicas: Agar TSI, medio MIO, agar
citrato de Simmons, agar LIA.
METODO
GUIA DE IDENTIFICACION PRESUNTIVA
La prueba presuntiva para diferenciación de los bacilos entéricos gramnegativos se basa

en la valoración de la fermentación de la lactosa sobre medios de cultivo adicionados con
este carbohidrato, como el agar Mc Conkey o el agar EMB:
a) Enterobacilos que producen fermentación rápida de la lactosa: Escherichia coli,

Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae.
b) Enterobacilos que producen fermentación lenta de la lactosa: Edwarsiella, Serratia,

Citrabacter, Arizona, Providencia, Erwinia.
c) Enterobacilos que no producen fermentación de la lactosa: Shigella, Salmonella,

Proteus, Pseudomonas.
La manera de cómo metabolizan este azúcar en los diferentes medios de cultivo

selectivos se manifiesta por cambios en el color del medio con respecto al que
originalmente tenía o bien por la coloración de las colonias, la cual es típica en algunos de
ellos, al respecto, se sugiere utilizar la siguiente tabla:
AGAR ENDO O EMB AGAR S-S VERDE BRILLANTE

COLONIAS CON BRILLO
COLONIAS ROJAS: COLONIAS VERDES:
METALICO:
Escherichia coli Escherichia coli
Escherichia coli
Otras coliformes Otras coliformes
Otras coliformes
COLONIAS BLANCAS: COLONIAS COLONIAS ROJAS
BLANCAS
Salmonella Salmonella
Salmonella
Shigella Shigella
Shigella
Proteus Proteus
Proteus
Pseudomonas Pseudomonas
Pseudomonas
3) Efectuar análisis microscópico por el método de Gram de cada una de las placas para
confirmación de la morfología de los bacilos entéricos gramnegativos en los medios
selectivos.
4) Seleccionar en los medios selectivos una variedad de colonias consideradas como

sospechosas de pertenecer a algún género patógeno (segundo grupo en la tabla anterior)
y resembrarlas en los medios diferenciales para conocer sus REACCIONES
BIOQUÍMICAS como se indica a continuación:
III. REACCIONES BIOQUÍMICAS
1) Disponer a la temperatura ambiente en gradilla una serie doble de tubos de cultivo para
reacciones bioquímicas.
2) Resembrar del medio de cultivo que contiene las colonias de bacilos gramnegativos
selecionadas como sospechosas a los medios para bioquímicas dejando uno de uno sin
sembrar para emplearlo como control negativo.
a) En los medios inclinados sembrar por estrias.
b) En los medios verticales sembrar por picadura. asa
c) En los medios líquidos sembrar por emulsión.
3) Etiquetar con los datos escolares. Llevar a la incubadora por 24 horas.
AL DIA SIGUIENTE:
4) Retirar las series de tubos con las reacciones bioquímicas.
5) Interpretar las reacciones bioquímicas en cada uno de los tubos, de la siguiente

manera.
5.1 MEDIO DE KLIGER
El medio contiene sulfato ferroso como indicador de la formación de H2S, un indicador de

pH, glucosa, lactosa y sacarosa. Se utiliza como medio inclinado y sirve para la valoración
de tres parámetros o pruebas bioquímicas:
a) Superficie inclinada: Para la valoración de la fermentación de la lactosa o la sacarosa;

lo que origina que el medio tome un color amarillo debido a la formación de ácidos (A).
b) Profundidad: Los bacilos fermentadores de la glucosa forman suficiente ácido para

que el medio tome un color amarillo en la profundidad o medio entubado, relativamente
anaerobio, pero no en la superficie inclinada. La formación de gases es característica en
estas condiciones, lo cual hace que aparezcan burbujas e inclusive desplazamiento del
medio hacia la salida del tubo: ( G).
c) Sulfuro de hidrógeno ( H2S): Los bacilos productores de este gas hacen que el medio
tome un color enengrecido casí siempre en la profundidad.
5.2 AGAR ENDO O AGAR EMB
En estos medios que se usarón para la identificación de la Prueba Presuntiva de

fermentación de la lactosa aportan el parámetro para la lactosa (+) o la lactosa (-).
Observese en la tabla de reacciones bioquímicas que la lactosa solo es POSITIVA para el
primer grupo de Enterobacterias: la E. coli y otras tres especies.
5.3 LECHE
La leche descremada constituye un buen medio de cultivo para muchas bacterias, sin otra
modificación que añadir un indicador: púrpura de bromocresol o tornasol. Los cambios
bioquímicos que puede sufrir son:
a) Reacción alcálina: El cambio de pH a álcalino hará que la leche tome un color

púrpura.
b) Desarrollo de reacción alcálina con precipitación de caseína, como un verdadero

requesón, eventualmente con reducción del indicador
c) Desarrollo de la alcalinidad y precipitación de requesón seguido de peptonización o

digestión del mismo. El resultado es el aclaramiento y un color pardusco.
d) Formación de ácido generalemnte en 24 horas, con el cambio de color del medio a

amarillo; eventualmente con reducción del indicador.
e) Formación de ácido y precipitación de la caseína, generalmente con reducción del

indicador.
5.4 GELATINA
Se usa para valorar la licuefacción o licuación de la gelatina por acción de las gelatinasas
bacterianas producidas por algunas Enterobacterias. La reacción positiva hace que el
medio permanezca líquido después de la incubación aún después de dejarse en
refrigeración durabte media hora. La reacción negativa permite nuevamente la
solidificación.
5.5 CALDO UREA
Se utiliza para la valoración de la producción de ureasa por algunas enterobacterias. Este

medio contiene glucosa, peptona, urea y rojo de fenol. Las bacterias que producen ureasa
a partir de la urea dan lugar al carbonato de amonio y el indicador se vuelve rojo púrpura.
Obeservese en la tabla de reacciones bioquímicas que solo el género Proteus da esta
reacción positiva.
5.6 REACCIONES IMViC
Se designan con el término nemotécnico IMViC un grupo de cuatro reacciones

bioquímicas que se utilizan para la diferenciación fisiológica de los bacilos coliformes. Si
bien hay 16 combinaciones posibles de estas reacciones, el colibacilo clásico Escherichia
coli es (+), (+), (-), (-) y el grupo Aerobacter - Klebsiella es (-), (-), (+), (+). Las cuatro
reacciones bioquímicas son:
I: Formación de indol a partir de triptófano
M: Prueba del rojo de metilo
V: Prueba de Voges- Proskauer
iC: La utilización del citrato como fuente de carbono
a) Prueba del Indol (I): Esta prueba se analiza en el medio de SIM, el cual se utiliza
también para investigar la motilidad (M) y la producción de H2S (s). Este medio
enriquecido con triptófano, aminoácido suministrado por una peptona adecuada que se
descompone en indol por acción de algunas bacterias. Para comprobarlo pueden
realizarse las pruebas de Erlich o de Kovac´s: Se requiere agregar unas gotas de reactivo
de Erlich o de Kovac´s a la superficie del medio entubado después de que han crecido las
colonias. La reacción positiva hará que la solución cristalina adquiera un color rosa fuerte
o rojo. De no ocurrir esto la prueba es entonces negativa.
b) Prueba del rojo de metilo (M): Los microorganismos se cultivan en caldo peptona
glucosa con tapón de fosfato. Después de la incubación se añaden al caldo 4 gotas de
indicador rojo de metilo, un color rojo indica una reacción positiva ( ácida).
c) Prueba de Voges. Proskatuer (V): El medio empleado es idéntico al mencionado

antes. Después de dos días de incubación se añaden a 5 ml del medio 1 ml de KOH
( potasa) al 10 %; se observa de cuando en cuando las 24 horas siguientes. Un color rosa
de eosina indica una reacción positiva, debida a la producción de acetilmetilcarbinol
( CH3- CO- CHOH- CH3 ) a partir de glucosa. Se obtiene una reacción más rápida
añadiendo huellas de creatinina al medio incubado y luego 2.5 ml de NaOH al 40%, en
este caso el color rosa aparece en pocos minutos.
d) Prueba del citrato (iC) Para esta prueba se utiliza el agar de Simmons que contiene
citrato de sodio y azul de timol comoindicador. La única fuente de carbono en este medio
es el citrato. Si la reacción es positiva el indicador se vuelve azul. Los demás
microorganismos no crecen y el medio conserva su color verde, indicando una reacción
negativa.
5.7 MEDIO DE SIM
Este medio se uriliza para tres pruebas bioquímicas como ya se menciono anteriormente:
la del sulfuro de hidrógeno (S) de la misma manera que en el agar Kliger, la del indol (I) y
la motilidad (M).
La motilidad (M) a través del medio semisólido se traduce por diseminación de la
opacidad bacteriana a partir del trayecto de la picadura de inoculación ( reacción positiva).
Si la motilidad es negativa, el crecimiento se encuentra restringido al trayecto de la
picadura.
5.8 MEDIOS CON DESCARBOXILASA:
Se logra una mejor diferenciación entre las Enterobacteriaceae estudiando la actividad

específica de descarboxilasa sobre una serie de ácidos aminados como lisina, arginina y
ornitina. Los medios medios contienen una base nutritiva, además de glucosa, el ácido
aminado del caso y el azul de bromotimol como indicador. Si el ácido aminado es
descarboxilado, el pH del medio se vuelve alcálino, a pesar de la fermentación de la
glucosa, pués los productos de la descarboxilación son siempre alcálinos. Si no existe
esta reacción, el medio permanece ácido y conserva su color amarillo.
6) Recopilar en forma horizontal los resultados de todas las pruebas bioquímicas y

ubicarlos en la tabla de reacciones bioquímicas anexa a esta práctica para definir
excatamente la especie de los bacilos entéricos aislados.
7) Cuando se halla concluido el estudio del coprocultivo, proceder a esterilizar al

autoclave las placas y los tubos del cultivo de la manera establecida. lavarlos y secarlos.
REPORTE
1) Describir el análisis macroscópico del agar endo o EMB. Indicar el resultado de la

prueba presuntiva de la lactosa.
2) Describir el análisis macroscópico de los otros medios selectivos empleados.
4) Describir el análisis microscópico de cada placa.
5) Representar los resultados de cada una de las reacciones bioquímicas.
6) Localizar en la tabla de reacciones bioquímicas el agente etiológico aislado.
7) Incluir en forma de anexo una tabla de reacciones bioquímicas para Enterobacterias.

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ASIGNATURA: PROCESAR CULTIVOS BACTERIOLOGICOS

Las enterobacteriáceas (Enterobacteriaceae) son una familia de bacterias Gram

1. Sembrar, leer e interpretar algunas pruebas bioquímicas útiles en la identificación de

Muestra de materia fecal en frasco con tapa.

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO

 Mechero, asa, incubadora bacteriológica a 37°C.

 Equipo de coloración de Gram

GUIA DE IDENTIFICACION PRESUNTIVA

La prueba presuntiva para diferenciación de los bacilos entéricos gramnegativos se basa

a) Enterobacilos que producen fermentación rápida de la lactosa: Escherichia coli,

b) Enterobacilos que producen fermentación lenta de la lactosa: Edwarsiella, Serratia,

c) Enterobacilos que no producen fermentación de la lactosa: Shigella, Salmonella,

La manera de cómo metabolizan este azúcar en los diferentes medios de cultivo

AGAR ENDO O EMB AGAR S-S VERDE BRILLANTE

4) Seleccionar en los medios selectivos una variedad de colonias consideradas como

III. REACCIONES BIOQUÍMICAS

a) En los medios inclinados sembrar por estrias.

b) En los medios verticales sembrar por picadura. asa

c) En los medios líquidos sembrar por emulsión.

3) Etiquetar con los datos escolares. Llevar a la incubadora por 24 horas.

4) Retirar las series de tubos con las reacciones bioquímicas.

5) Interpretar las reacciones bioquímicas en cada uno de los tubos, de la siguiente

5.1 MEDIO DE KLIGER

El medio contiene sulfato ferroso como indicador de la formación de H2S, un indicador de

a) Superficie inclinada: Para la valoración de la fermentación de la lactosa o la sacarosa;

b) Profundidad: Los bacilos fermentadores de la glucosa forman suficiente ácido para

5.2 AGAR ENDO O AGAR EMB

En estos medios que se usarón para la identificación de la Prueba Presuntiva de

a) Reacción alcálina: El cambio de pH a álcalino hará que la leche tome un color

b) Desarrollo de reacción alcálina con precipitación de caseína, como un verdadero

c) Desarrollo de la alcalinidad y precipitación de requesón seguido de peptonización o

d) Formación de ácido generalemnte en 24 horas, con el cambio de color del medio a

e) Formación de ácido y precipitación de la caseína, generalmente con reducción del

5.5 CALDO UREA

Se utiliza para la valoración de la producción de ureasa por algunas enterobacterias. Este

Se designan con el término nemotécnico IMViC un grupo de cuatro reacciones

I: Formación de indol a partir de triptófano

M: Prueba del rojo de metilo

V: Prueba de Voges- Proskauer

iC: La utilización del citrato como fuente de carbono

c) Prueba de Voges. Proskatuer (V): El medio empleado es idéntico al mencionado

5.7 MEDIO DE SIM

5.8 MEDIOS CON DESCARBOXILASA:

Se logra una mejor diferenciación entre las Enterobacteriaceae estudiando la actividad

6) Recopilar en forma horizontal los resultados de todas las pruebas bioquímicas y

7) Cuando se halla concluido el estudio del coprocultivo, proceder a esterilizar al

1) Describir el análisis macroscópico del agar endo o EMB. Indicar el resultado de la

2) Describir el análisis macroscópico de los otros medios selectivos empleados.

4) Describir el análisis microscópico de cada placa.

5) Representar los resultados de cada una de las reacciones bioquímicas.

6) Localizar en la tabla de reacciones bioquímicas el agente etiológico aislado.

7) Incluir en forma de anexo una tabla de reacciones bioquímicas para Enterobacterias.

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