PRACTICA I

OBTENCIÓN DE MUESTRAS SANGUÍNEAS

OBJETIVO
Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtención de muestras
sanguíneas con un adecuado control de calidad, ya que de ello depende que el resultado del
análisis de la muestra sea el correcto. Se efectuará en ayunas o no, dependiendo de la
prueba a usar.

OBTENCIÓN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA

Materiales y equipos requeridos

Algodón.
Alcohol al 70%.
Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo.
Jeringas de 5 ml_.
Viales con anticoagulante EDTA.

Obtención de la muestra
Verificar que los elementos por utilizar estén listos, y que el paciente se sienta cómodo.
Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de la flexión del codo o a
10 cm del codo, sujetar con un medio nudo (Fig. 1).
Limpiar la zona con alcohol al 70% o alcohol yodado, en un área de 2 pulgadas (Fig. 2).
El paciente deberá abrir y cerrar la mano durante unos segundos y después la mantendrá
cerrada, esto ayudará a visualizar las venas superficiales (Fig. 3).
Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de tal manera que el bisel se
encuentre hacia arriba (Fig. 4).
Se coloca la aguja en dirección paralela a la vena, se perfora la piel haciendo avanzar la
agujo 0,5-1 cm en el tejido subcutáneo, luego se perfora la vena (Fig. 5).

PUNTOS PARA LA EXTRACCIÓN DE SANGRE

(Toma de muestra)
Se obtiene de las venas de la fosa cubital
 PROCEDIMIENTO

FIG.1 FIG.2 FIG.3

FIG.4 FIG.5

FIG.6 FIG.7

OBTENCION DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIO

Materiales requeridos
 Algodón.
 Alcohol al 70%.
 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo.
 Tubos al vacío con anticoagulante EDTA (K3), EDTA (Na2) u otro
anticoagulante.
 Agujas con dispositivo para extracción de sangre al vacío:
 N° 21 para adultos.
 N° 22 para niños y neonatos.
 De preferencia, ambas de bisel cortó para evitar la coagulación.
Obtención de la muestra
 Repetir los pasos de 3.2.2.1 a 3.2.2.4.
 Se retira el estuche protector de la aguja y éste se enrosca al dispositivo para
extracción de sangre al vacío.
 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexión del codo o 10 cm por
encima de éste y pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para
favorecer la dilatación de las venas.
 Una vez escogida la vena, desinfectarla con una pieza de algodón embebido en
etanol al 70%.
 Se coloca la aguja en dirección paralela a la vena, se perfora la piel haciendo
avanzar la aguja entre 0,5 cm y 1 cm en el tejido subcutáneo, se inserta el tubo al
vacío por la parte posterior y no preocuparse por la cantidad de sangre extraída ya
que el mismo sonido del vacío avisará que la extracción terminó (Fig. 8).
 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado.
 Colocar un pedazo de algodón seco sobre la parte donde se encuentra oculta la
aguja. Sacar la aguja con un movimiento rápido y depositarla en el recipiente de
metal con desinfectante (Fig. 9).
 Pedir al paciente que presione firmemente el algodón durante 3 minutos, con el
brazo extendido. No se recomienda que se flexione el brazo a causa del riesgo que
se forme un hematoma.
 Mezclar por inmersión suave la sangre con el anticoagulante contenido en el tubo.
No agitar el contenido.

Fig. 8 Fig. 9

VENTAJAS DE UNA EXTRACCIÓN DE SANGRE VENOSA

 Pueden hacerse repetidos exámenes con la misma muestra.

 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referencia futura.

DESVENTAJAS DE UNA EXTRACCIÓN DE SANGRE VENOSA

 La punción venosa, por su largo procedimiento, requiere mayor preparación que
el método capilar.
 El método es técnicamente difícil en niños, individuos obesos y pacientes en
shock.
 La hemolisis debe ser evitada, pues se puede obtener una disminución en el
recuento de eritrocitos.
 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete, pues
 produce hemolisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado
para el análisis de gases, recuentos celulares, determinación de pH sanguíneo y
algunas pruebas de coagulación.
 La sangre anticoagulada si no es de obtención reciente no debe ser utilizada en
extensiones de sangre, pues algunos antícoagulantes producen cambios en las
plaquetas que pueden causar aglutinaciones, agregación plaquetaria y dificultan la
identificación de leucocitos.
 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables, los recuentos
de leucocitos y plaquetas e índice de sedimentación deben realizarse antes de que
pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra.

OBTENCIÓN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA

Materiales requeridos
Algodón.
Alcohol al 70%.
Jeringas de 5 mL.
Viales con anticoagulante EDTA.
3.4.2 Obtención de la muestra
El paciente es cubierto por una sábana de manera que los brazos permanezcan
inmovilizados a lo largo del cuerpo.

EXTRACCION DE SANGRE CAPILA

FIG. 10

FIG. 11
 PRACTICA II

ANTICOAGULANTES

Una vez extraída la sangre, ésta puede conservarse coagulada o mantenida incoagulable
mediante la adición de un anticoagulante.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MÁS USADOS
EN HEMATOLOGÍA
No alterar el tamaño de los hematíes.
No producir hemolisis.
Evitar al máximo la agregación plaquetaria.
No alterar la morfología de los leucocitos.

La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible, incluso mantenida
bajo refrigeración (4 °C) si no pasan de las 2 horas. El tiempo máximo entre la extracción
de la sangre y su procesamiento depende del coagulante de elección y no debe ser más de
4 horas, a excepción del anticoagulante EDTA (etilendiaminotetracético) que puede ser
hasta 24 horas (en refrigeración a 4 °C).
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma sólida o líquida. Los primeros están
indicados para la determinación de los parámetros hematológicos, ya que no producen,
como los anticoagulantes líquidos, dilución de la sangre.

ANTICOAGULANTES SÓLIDOS

EDTA
Es la sal disódica o tripotásica del ácido etilendiaminotetracético. La sal disódica
(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotásica (K3EDTA). Estos compuestos
realizan su acción a través de un efecto quelante sobre el calcio, al fijarlo impiden su
activación y, por ende, la coagulación sanguínea.

Ventajas

Respeta la morfología eritrocitaria (especialmente la sal tripotnsie.n) y

leucocitaria, de manera que permite una demora de dos horas en la realización dei
írotis sanguíneo después de la extracción sanguínea.
Asegura la conservación de los elementos formes sanguíneos duranto 24 horas si
la sangre se mantiene a 4 °C.
Al inhibir la aglutinación de las plaquetas, facilita su recuento o su expresión
semicuantitativa a partir del frotis.
La concentración recomendada de EDTA es de 1,5 mg/mL de sangre. Una mayor
cantidad de anticoagulante puede producir retracción celular, con disminución del
hematocrito, y un aumento de la concentración media de la hemoglobina. Un
exceso de sangre con relación al anticoagulante produce formación de
 microagregados que pueden alterar los resultados. El empleo de tubos al vacío con
una gota (50/.¿L) de EDTA tripotásica comercial para 5 mL de sangre es de
interés práctico dado que es cien veces más soluble facilitando la mezcla de
sangre con anticoagulante.

Desventajas
Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos, a los cuales les produce
encogimiento y cambios en su forma, por ello debe cuidarse de agregar la cantidad
correcta de sangre al anticoagulante.

Anticoagulante de Wintrobe
Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio. Actúa por precipitación del calcio, es fácil
de preparar. Se emplea en forma de polvo en proporción de 2 de oxalato de amonio por 1
de oxalato de potasio. La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre. Este
anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones
de hemoglobina, hematocrito y recuento globular, pero para los extendidos queda
limitada a los primeros minutos, tampoco es útil para el recuento plaquetario porque
produce formación de agregados plaquetarios.

Heparina
El nombre de heparina proviene del griego hepar, que significa hígado, ya que fue aislado
por primera vez de las células de este tejido. Es un mucopolisacárido ácido. Presenta el
inconveniente de que si no se agita rápidamente con la sangre después de extraída pueden
formarse microcoágulos, aunque no altera el volumen eritrocitario ni la morfología de los
leucocitos. No es recomendable para el frotis sanguíneo porque produce un fondo azul en
la lámina.

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma sólida o líquida, en proporción de 0,1 -
0,2 mg de heparina por 1 mL de sangre.

ANTICOAGULANTES LÍQUIDOS
Citratotrisódico.

Es de elección para las pruebas de hemostasía y la velocidad de sedimentación. Actúa a

través de la precipitación del calcio. La concentración depende de la prueba por realizar.
Para pruebas de hemostasía se emplea en proporción de 1: 9 (0,5 mL de anticoagulante
para 4,5 mL de sangre total).
Para la determinación do la VSG (Velocidad do Sedimentación Globular) os 1:4 (0,5 mL
do antlcoagulanto para 2 mL do sangre).

OXALATO SÓDICO

Recomendado También para las pruebas de hemostasia. Se emplea en proporción do un

volumen do anticoagulanto para 4 vol. de sangre.
 PRACTICA III

REALIZACIÓN Y TINCIÓN DEL FROTIS SANGUÍNEO

La práctica del frotis sanguíneo, también llamado extendido, es do gran importancia en

hematología ya que el diagnóstico de muchas enfermedades hematológicas puede
realizarse con sólo observar las características morfológicas de las células sanguíneas, de
manera que éste no debe ser excesivamente grueso ni excesivamente fino. Todas las
láminas por usar, sobre todo nuevas, deben ser limpiadas con algodón y alcohol al 70%
para eliminar la grasa quo viene adherido.

MÉTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

MATERIALES
Alcohol al 70%.
Algodón.
Lanceta descartable.
Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm).

FUNDAMENTO
Consiste en la extensión de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75),
empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensión (Fig. 12).

PROCEDIMIENTO
Una vez extraída la sangre con cualquiera de las metodologías, se coloca una pequeña
gota de sangre (5//.L) (aprox. 3 mm de diámetro) sobre un portaobjeto a 2 cm
aproximadamente de uno de los extremos.
Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficie del primer portaobjeto
(en la que se encuentra la gota de sangre) formando un ángulo de 45°.
Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre el otro en sentido
longitudinal, hasta que la gota de sangre quede bien extendida sobre la superficie del
primer portaobjeto. El grosor de frotis sanguíneo puede variar según sea el ángulo que
formen entre sí ambos portaobjetos. Así, sí es superior a 45°, la extensión obtenida será
gruesa y corta, sí es inferior a 45° será larga y fina. El secado del frotis es a temperatura
ambiente y en posición horizontal.
FIG. 12
  Zona excesivamente gruesa: Se halla en la región inmediata al punto de partida de
la extensión (cabeza). En ella se aprecia siempre un aumento de linfocitos.
 Zona excesivamente fina: Corresponde al final de la extensión y termina en un
área donde las células adoptan una posición acartonada (barbas). En esta región
existe un exceso de granulocitos y monocitos.
 Zona ideal: Corresponde a la región intermedia del frotis y en ella existe un
reparto equilibrado de células.

COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis, se procede a la tinción hematológica con el colorante de
Romanowsky, constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno. Dentro de éstas
tenemos:

 Colorante de Giemsa.
 Colorante de May-Grunwald.
 Colorante de Wright.
 Colorante de Leishman

Preparación de colorantes (Anexo A)

 Para el estudio de las células sanguíneas utilizar el colorante

 Para el estudio de hemoparásitos utilizar el colorante
 Utilizar el colorante para casos especiales en que se desee observar con mayor
claridad y especificidad los gránulos de los neutrofilos.

TINCIÓN CON COLORANTE DE WRIGHT

Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para cstudlor la sangre y
determinar las variaciones y anormalidades de estructura, formo y tamaño de los
eritrocitos, su contenido de hemoglobina y sus propiod;uhif¡ •!" coloración. La
información obtenida de un frotis de sangre perifonea dopondl en gran parte de la calidad
del extendido y la coloración.

Materiales
 Colorante de Wright (Anexo A).
 Frasco gotero.
 Solución amortiguada tamponada (Anexo A).

Procedimiento
 Una vez obtenido el frotis sanguíneo, se le dejará secar entre 15 y 20 minutos.
 Luego se coloca la preparación en un soporte y se cubre con el colorante de
Wright, dejándolo por espacio de 5 minutos.
  Posteriormente se añade solución amortiguada tamponada en partos ¡guales hasta
obtener un brillo metálico, dejando 6 minutos adiciónalos.
 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar.
 Se coloca en el microscopio y, con pequeño aumento, se revisa la calidad de la
coloración, la cantidad aproximada de glóbulos blancos y se escoge El sitio para
iniciar el recuento. Se coloca una gota do aceite de inmersión y se enfoca a un
aumento de 100x
 La forma de los glóbulos rojos se examinará detenidamente observando
 además del color (cantidad de hemoglobina), presencia de plaquetas, su
agrupación y distribución.
 Posteriormente, se hace el recuento diferencial de glóbulos blancos en 100
células, para lo cual se deberá conocer las diferencias entre neutrófilos,
eosinófilos, linfocitos y monocitos.

Una extensión de sangre bien teñida debe caracterizarse por una buena diferenciación de
las estructuras subcelulares en los leucocitos, una coloración rosada de los hematíes y la
ausencia de precipitados. Los defectos más frecuentes observados en la tinción del frotis
sanguíneo son:

Coloración excesivamente azul, debido a:

 Frotis excesivamente grueso.
 Lavado insuficiente.
 Tinción muy prolongada.
 Empleo de colorante excesivamente alcalino.

Coloración con una tonalidad rosada:

 El colorante, el tampón o el agua de lavado tienen un pH demasia
do ácido.
Presencia de precipitados:
 Obedecen a una acción excesiva del colorante. Esto se puede evitar con la
filtración.
 PRACTICA IV

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exámenes de laboratorio más usados en

el campo de la hematología. Comprende las siguientes pruebas:

RECUENTO LEUCOCITARIO Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liquido que permite evidenciar los leucocitos,
manteniéndolos visibles, mientras que los eritrocitos son hemolizados. El recuento del
número de leucocitos o glóbulos blancos se expresa por mm3 (milímetro cúbico).

Equipos
 Microscopio.
 Hemocitómotro (Cámara de Neubauer).

Consta de los siguientes elementos:

♦ Una lámina portaobjeto gruesa, en el centro se hallan dos superficies

cuadriculadas iguales separadas del resto de la lámina por surcos y dos barras
transversales algo más elevadas.
♦ Una laminilla cubreobjetos ópticamente plana, que, al colocarse sobre las barras
elevadas de la lámina forma una cámara entre el cubreobjetos y la superficie
cuadriculada.

La altura entre el cubreobjetos y la lámina portaobjetos es de 0,1 mm. Cada cuadrícula

mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandes. Cada uno de los cuales mide 1
mm2 de superficie, que se subdivide a su vez en 16 cuadrados medianos. El cuadrado
grande central se divide en 25 cuadrados pequeños y cada uno de ellos en 16 cuadraditos.
Cada cuadrado pequeño mide 0,2 mm de lado (0,04 mm2 de superficie), y cada cuadradito
mide 0,05 mm de lado (0,0025 mm2 de superficie).

Materiales y reactivos requeridos

 Pipeta de glóbulos blancos (De Thoma) o pipeta automática (de 0 a 100 /zL).
Presenta cerca del extremo superior una marca de 11,inmediatamente continúa
una dilatación (bulbo) que contiene una perla que funciona como mezcladora,
luego sigue el extremo más largo de la pipeta (tallo) que está dividida en 10 partes,
con 2 marcas: 1 (parte final del bulbo) y 0,5 (a la mitad del tallo). Se le acopla a su
extremo superior 1 tubo de goma y una bombilla para aspirar.
 Diluyente de glóbulos blancos: Solución de Turk al 1%.
 Contador manual (Sólo si fuera necesario).
 Papel filtro.
Procedimiento
Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar del dedo, so procedo a
aspirar la sangre con la pipeta de glóbulos blancos hasta la marca de 0,5 y a limpiar la
punta con papel absorbente.
Introducir la pipeta en el tubo que contenga solución de Turk y absorber hasta la marca de
11 (no debe haber burbujas).
Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en un rotador automático por
2 ó 3 minutos.
Monte la laminilla de vidrio en la cámara para recuento que debe estar limpia y seca.
Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocar una gota pequeña
de esta solución en la cámara.
Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las células se sedimenten.
Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angulares. Cuando se usa la
pipeta automática, se toma 20 //L (0,02 ml) de sangre total con anticoagulante o sangre
capilar con anticoagulante y se diluye en un tubo que contenga 380 /µL de solución de
Turk (aquí tenemos una dilución 1:20).

LECTURA

Fig. 13

La lectura se realiza en los campos 1, 3, 7 y 9 como está indicado en la figura. Además de

los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes, se deben contar todos los
leucocitos que se encuentren adheridos en la línea horizontal superior y vertical exterior,
o de lo contrario, todos los leucocitos, adheridos a la línea horizontal inferior y vertical
interior.

Resultados
Leucocitos contados en 4 campos
N° de leucocitos x mm3 Altura x dilución x área

Leucocitos contados en 4 campos

Reemplazando
1/10 x 1/20 x 4

Leucocitos contados en 4 campos

4/200

X/1 = leucocitos contados x 50

4/200
VALORES DE REFERENCIA
5000 - 10 000 leucocitos / mm3

Corrección de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el líquido de dilución, por lo tanto pueden
observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con los leucocitos, de tal
manera que se debe emplear la siguiente fórmula:

Cálculo:
La concentración del número de normoblastos (por litro) es:
Número de normoblatos contados x concentración o número de leucocitos
100 + N° de normoblastos contados

Ejemplo:
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentración del número de leucocitos es 16 x 109/l,
la concentración del número de normoblastos será:

50 x 16=5,3 x 10g/I
100+50

Y la concentración de leucocitos corregida será: 16 - 5,3 = 10,7 x 109/l

En unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitos se expresan
por milímetro cúbico. En tales unidades el cálculo correspondiente al ejemplo que se ha
dado sería:

50 16 000 = 5300 / mm3 100 + 50

100+50

Recuento corregido de glóbulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 / mm3

Fuente: manual de técnicas básicas para un laboratorio de salud .ops. N2

RECUENTO DE GLÓBULOS ROJOS

Principio
La sangre se diluye en un líquido que nos permite observar claramente los hematíes,
luego esta dilución se coloca en una cámara de Neubauer con la ayuda de una pipeta
automática o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopio a un objetivo de 40x para
calcular el número de glóbulos rojos por mm3.
Equipos
 Microscopio.
 Hemocitómetro (cámara de Neubauer).

Materiales y reactivos requeridos

 Pipeta de glóbulos rojos (De Thoma) o pipeta automática (de 0-100 /.iL). Presenta
cerca del extremo superior una marca de 101, inmediatamente continúa una
dilatación (bulbo) que contiene una perla roja mezcladora, luego sigue el tallo
(extremo más largo), el cual está dividido en 10 partes con 2 marcas: 1 acabando
el bulbo y 0,5 a la mitad del tallo. Se requiere igual que el recuento de leucocitos
una boquilla para aspirar.
 Diluyente de glóbulos rojos: Cloruro de Sodio al 0,9% (ver anexo).
 Diluyente de Hayem (ver anexo).
 Contador manual (sólo si fuera necesario).
 Papel filtro.

Procedimiento
 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar.
 Llenar la pipeta de glóbulos rojos con sangre hasta la marca de 0,5 para realizar
una dilución de 1/200, y si se carga hasta 1, la dilución será 1/100. Limpiar la
punta con gasa o papel absorbente.
 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem) y llenar
de líquido de dilución hasta la marca de 101.
 Se coloca en un rotador automático o se hace rotar manualmente de 2 a 3 minutos.
 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo, luego colocar una gota
pequeña cerca de un extremo de la cámara para que por capila-ridad se llene
exactamente.
 Hacer el recuento con objetivo de 40x.

Se puede realizar con la pipeta automática, se toma 20 /¿L (0,02mL) de sangre total con
anticoagulante, o sangre capilar y se deposita en un tubo de 12 x 75 que contenga 4 ml de
solución de Hayem (aquí se tiene una dilución de 1:200). Se deja reposar
aproximadamente 5 minutos y se procede a cargar la cámara con la misma pipeta usando
un nuevo tip. El inconveniente aquí es el gasto de reactivo (4 mL) pero las medidas son
más exactas.
Dejar en reposo por 3 minutos.
Enfocar la cuadrícula a 10x, luego con el objetivo de 40x contar sobre el cuadrado grande
central de la cámara sólo en 5 cuadrados pequeños: uno central y cuatro angulares (80
cuadraditos en total).
En el recuento se incluyen las células que cubren o tocan por dentro o por fuera las líneas
limitantes superior e izquierda en el cuadrado pequeño de recuento y no se consideran los
correspondientes a los límites inferior y derecho. Se hace el recuento en los puntos ABCD
y E y se sigue los mismos parámetros del recuento de leucocitos.
Resultados

Hematíes contados en 5 cuadrados pequeños

N° de hematíes x mm 3
= Altura x dilución X área

Hematíes contados en 5 cuadrados pequeños

Reemplazando = 1/10x1/200x1/5

Hematíes contados en 5 cuadrados pequeños

1/10 000

Hematíes contados x 10 000

Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de células/mm3).

Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Niños (4 años) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recién nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente: Manual do técnicas básicas para un laboratorio de salud. OPS, N° 2.

DETERMINACIÓN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fracción que comprende a los glóbulos rojos (masa globular), respecto al
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar. Puede expresarse en porcentaje o
como valor decimal.

Altura de la columna de glóbulos rojos

Hto = Altura de la columna de sangre total
(Glóbulos rojos más plasma)

MÉTODO DE WINTROBE

Materiales requeridos:
 Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm.
 Pipetas Pastcur o pipetas do transferencia.
 Tapón de goma.

Procedimiento:
 Llenar la sangre extraída con anticoagulante con una pipeta Pasteur, comenzando
desde el fondo hasta la marca superior de 100 mm, teniendo cuidado de no
provocar espuma.
 Tapar el tubo con un tapón de goma para evitar la evaporación.
 Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos.

Resultados (lectura):
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de glóbulos rojos.

Valores de referencia:
Hombres: 40% - 54%
Mujeres: 38% - 48%
Fuente: Manual de técnicas básicas para un laboratorio de salud. OPS, N° 2.

Método de Microhematocrito

Materiales requeridos:
 Capilares rojos y azules (75 mm x 1,5 mm).
 Plastilina.
Procedimiento
 Tomas la muestra en capilares rojos Heparinizados Directamente del pulpeja
del dedo, o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosa con
anticoagulanto de Wintrobe o EDTA. Debe llenarse aproximadamente
 70 % - 80% del capilar.
 Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina.
 Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centrífuga de
microhematocrito, con el extremo ocluido adherido al reborde externo de la
plataforma.

 Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 -12 000 rpm.

Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio.
Uso de la escala:
 Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columna de
eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismo nivel de
la línea horizontal correspondiente al cero.
 Desplace el tubo a través de la escala hasta que la línea marcada con el número 1,0
quede al nivel del tope de la columna de plasma. Vigile que el fondo de la
columna de eritrocitos continúe sobre la línea cero. El tubo debe encontrarse
completamente en posición vertical.
 La línea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicará la fracción
de volumen de éstos.

Valores de referencia:
Hombres 40% - 50%
Mujeres 38% - 44%
Niños (5 años) 38% - 44%
Lactantes (3 meses) 37% - 42%
Recién nacidos 50% - 58%
 La disposición celular es:

Parte superior, una columna de plasma.

En la interfase están los leucocitos y plaquetas.
Parte inferior está la columna de eritrocitos (fig. 15)

Fig. 15

Fuente: Manual de técnicas básicas para un laboratorio de salud. OPS, N° 2.

DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio
La sangre se diluye en líquido de Drabkin, el cual hemoliza los hematíes y convierte la
hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemíglobina). La solución que se
produce se lee por medio de un espectrofotómetro o fotocolorímotro. Su grado de
absorbancia es proporcional a la cantidad de hemoglobina que contenga la sangre.

Materiales y Reactivos
 Un colorímetro fotoolóctrico o un espectrofotómetro.
 Pipetas:
 Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 0,02 mL, con tubo de
goma y boquilla.
 Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL.
 Tubos de ensayo.
 Reactivo de Drabkin para dilución.
 Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1 litro de agua
destilada. Si se dispone de una balanza analítica la preparación se puede hacer en
el laboratorio. Esta solución se puede conservar durante un mes en un frasco de
vidrio oscuro. Deséchese si se enturbia.
El líquido de Drabkin no debe enfriarse demasiado, pues puede causar una decoloración
con reducción del ferrocianuro.
Referencia para cianometahemoglobina (estandarizada):
Esta solución se puede adquirir en el comercio o en un laboratorio de referencia.
En las soluciones de referencia comerciales casi siempre indica la concentración en
miligramos por 100 mL(generalmente en mg%).
Se preparan diluciones con reactivo de Drabkin de tal manera que los patrones contengan
concentraciones de 60 mg, 40 mg, 20 mg de CNHi.
Leer los tubos en absorbancia con filtro verde a 540 nm, llevando el fotómetro a cero con
el reactivo de Drabkin.
Para calcular la concentración de hemoglobina en cada tubo, realizar el siguiente cálculo:

P X D
Hb en g/100 mL 100

P = Concentración del patrón.

D = Dilución de la muestra de sangre,
Que os 251 veces.
Para una concentración de patrón de:

60 mg 15 g/100 mL
40 mg 10 g/100 mL
20 mg 5 g/100 mL

Luego graficar una curva patrón colocando en el eje de las ordenadas las lecturas en
absorbancia y en la abcisa la concentración de hemoglobina en g/100 mL.

Calibración del colorímetro

Antes de usar el colorímetro para calcular la hemoglobina se debe elaborar una curva de
calibración. Con esta curva se puede preparar un gráfico y un cuadro de valores de
hemoglobina.

Procedimiento
En un tubo de 13 x 100 colocar exactamente 5 mL de reactivo de Drabkin.
La sangre que puede utilizarse es de punción del dedo (sangre capilar) o de sangre venosa
recién extraída.
Con una pipeta automática o pipeta de Salhi se toma exactamente 0,02 mL (20 /xL) de
sangre total, limpiar luego la punta de la pipeta y se vierte en el tubo que contenga
reactivo de Drabkin. Se enjuaga 3 veces y se mezcla.
Dejar en reposo por espacio de 5 a 15 minutos.
Leer en absorbancia con filtro verde a 540 nm llevando a cero el fotómetro con agua
destilada / Drabkin.
Resultados
La lectura en absorbancia del problema debe ser comparada en la curva patrón para
encontrar a que concentración de hemoglobina corresponde expresándose en g/100 mL.

Valores de referencia:
Niños al nacer 13,6 - 19,6 g/dL
Niños de 1 año 11,3 - 13,0 g/dL
Niños de 10-12 años 11,5 - 14,8 g/dL
Mujeres 11,5 - 16,5 g/dL
Hombres 14,0 -18,0 g/dL

Fuente: Manual de técnicas básicas para un laboratorio de salud. OPS, N° 2.

 PRACTICA V

FROTIS DE SANGRE PERIFÉRICA

Se debe considerar lo siguiente: 6.5.1 Calidad del frotis
Debe abarcar 80% de la lámina con cabeza, cuerpo y cola. Extensiones gruesas dificultan
la visualización e identificación celular, mientras que las delgadas originan una
distribución anormal de los elementos.

Eritrocitos
Se estudia su tamaño, forma, color y si existen inclusiones o elementos extraños como se
verá más adelante.

Plaquetas
Estudiar tanto cualitativa como cuantitativamente, debiendo observarse de 3 a 10
plaquetas aproximadamente por 100 glóbulos rojos o varias plaquetas y grupos
ocasionales por campo. Visto con objetivo de inmersión, no debe existir menos de una
plaqueta por campo.

FÓRMULA LEUCOCITARIA
La fórmula leucocitaria tiene por objetivo determinar los porcentajes de las distintas
clases de leucocitos normales y anormales en la sangre. A partir de los porcentajes puede
incluso calcularse el número real de cada clase de leucocitos por mm3de sangre (valor
absoluto), conociéndose el total de leucocitos.
Por ejemplo:
Si se tiene 60% de neutrófilos segmentados y el recuento total de leucocitos total es de 20
000, entonces la cifra absoluta de neutrófilos segmentados sería:
60/100 x 20 000 = 12 000 (valor absoluto)
Valores de referencia absolutos de neutrófilos segmentados = 3000 - 5000

Conclusión: Los valores relativos sólo nos sirven cuando los valores totales de leucocitos
se encuentran dentro del valor normal. En caso contrario (leucocitosis o leucopenia) se
debe emplear la fórmula para obtener el valor real, y así determinar que elemento celular
se encuentra fuera del rango normal, sea elevado o disminuido.

Procedimiento
Se examina la lámina a pequeño aumento para comprobar si los elementos celulares están
bien distribuidos.
Si es favorable so examina con el objetivo de inmersión. La parto ideal para visualizar
células para la fórmula leucocitaria es en la parta final del cuerpo y comienzos de la cola,
recorriendo la lámina de izquierda a derecha o de arriba hacia abajo hasta contar 100
leucocitos incluidos los agranulocitos y granulocitos. Aquí no se incluyen los elementos
inmaduros de sangre roja.
A medida que se va contando, se va anotando el número de cada una de las clases de
glóbulos blancos observados.
Se determina luego los porcentajes de cada uno de ellos para luego comparar con los
porcentajes normales.
Si se tiene en el recuento de leucocitos valores por encima de 10 000 y por debajo de 5000
se debe repetir el recuento.

VALORES DE REFERENCIA

LEUCOCITOS VALORES RELATIVOS (%) VALORES ABSOLUTOS (%)

Neutrófilos segmentados 55-65 3000-5000

Neutrófilos abastonados 3-5 150-400
Eosinófilos 0,5-4,0 20-350
Basófilos 0-0,5 10-60
Monocitos 4-8 100-500
Linfocitos 25-35 1500-4000

Fuente: Manual de técnicas básicas para un laboratorio do salud. OPS, N° 2.

 VELOCIDAD VI

VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN

La velocidad de sedimentación es un examen hematológico que no está incluido en el

desarrollo de un hemograma; sin embargo, es una prueba1 muy importante por su gran
sensibilidad, pues resulta normal en las enfermedades funcionales, así como en los
procesos inactivos o estrictamente locales.

MÉTODO DE WESTERGREN
Fundamento
Este examen mide la tendencia de los eritrocitos a sedimentar, al colocar sangre
anticoagulada en un tubo en posición vertical. Se lee macroscópicamente la columna de
plasma al cabo de una hora de reposo.

Materiales
Tubos de Westergren.
Soporte para tubos de Westergren.

Procedimiento
En un tubo que contiene 0,5 mL de anticoagulante citrato de sodio al 3,8% se extrae
sangre venosa, se mezcla mediante movimientos rotatorios sobre una superficie lisa.
Se vierte mediante una pipeta Pasteur o una jeringa de metal en el tubo de Westergren, el
cual tiene una graduación de 0 a 200 mm de arriba hacia abajo y presenta ambos extremos
abiertos.
La sangre debe llenarse hasta la marca cero, se coloca en posición vertical sobre una
gradilla especial que obtura ambos extremos.

Resultados
Medir los milímetros descendidos de glóbulos rojos mediante la columna de plasma por
encima del paquete globular.

Valores de referencia
Hombres : 1-10 mm de altura/hora
Mujeres : 3-14 mm de altura/hora

MÉTODO DE WINTROBE FUNDAMENTO

Al igual que el método de Westergren, este método mide la tendencia de los eritrocitos a
la sedimentación al colocar sangre anticoagulada en un tubo pequeño. Se lee la columna
de plasma al cabo de una hora de reposo.

Procedimiento
El mismo que para el método de Westergren.
Resultados
Medir los milímetros descendidos de glóbulos rojos mediante la columna de plasma por
encima del paquete globular.

Valores de referencia
Hombres : 0-5 mm/hora
Mujeres : 0-10 mm/hora
Fuente: Manual de técnicas básicas para un laboratorio de salud. OPS. N° 2.