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RESOLUCIÓN OENO 33/2004
DOSIFICACION DEL ACIDO SHIKIMICO EN EL VINO POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE
ALTO RENDIMIENTO Y DETECCION UV
LA ASAMBLEA GENERAL,
Visto el artículo 2 párrafo 2 iv del Acuerdo del 3 de abril de 2001 por el cual se creó la Organización Internacional de la Viña y el Vino,
A propuesta de la Subcomisión de los métodos de análisis y de apreciación de los vinos,
DECIDE completar el Anexo C del Compendio de los métodos internacionales de análisis de
los vinos y de los mostos con el método de tipo II siguiente:
1. Introducción
El ácido shikímico (ácido 3,4,5-Trihidroxiciclohex-1-eno-1-carboxílico) es biosintetizado a
partir del ácido quínico por deshidratación, y juega un papel fundamental como precursor de la fenilalanina, tirosina, triptófano y de alcaloides vegetales. [1]. El ácido shikímico un ácido carboxílico minoritario que se encuentra en forma natural en una gran variedad de frutas [2]. Se insta a los Estados miembros a continuar la investigación en este campo para evitar las evaluaciones no científicas de estos resultados.
La dosificación del ácido shikímico por CLAR fue validado en el marco de un estudio en colaboración internacional por análisis de muestras de vinos que presentan contenidos naturales de ácido shikímico que van desde 10 a 150 mg/l. La validez fue probada por una comparación inter-laboratorios utilizando respectivamente la CLAR , la GC/FID y la GC/MS [3]
2. Campo de aplicación
Este documento describe un método rutinario en modo isocrático que se aplica a la
determinación cuantitativa de ácido shikímico en vinos tintos, rosados y blancos (incluidos los vinos espumosos y vinos especiales) en un rango de concentraciones de 1 mg/l hasta 300 mg/l, utilizando la cromatografía líquida de alto rendimiento (CLAR). El método puede
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Federico CASTELLUCCI
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aplicarse a los vinos espumosos a condición de que las muestras sean previamente desgasificadas (por ejemplo por sonicación).
3. Principio
El ácido shikímico se determina directamente, sin preparación de muestra, por
cromatografía líquida de alta resolución, utilizando un sistema de columnas. En un primer paso, se realiza une separación preliminar de los ácidos orgànicos contenidos en el vino sobre una columna de fase inversa de tipo C18, la segunda columna es de tipo intercambiadora de cationes. Esta última se calienta a 65°C. Utilizando un agua ligeramente acidificada como solvente de elución, se obtiene una buena resolución a línea base del ácido shikímico no observándose inteferencia de matriz del vino. Gracias a la doble ligadura del ciclohexeno, el ácido shikímico presenta un máximo de absorción de 210 nm y puede entonces ser detectado fácilmente por un detector UV.
4. Reactivos y materiales
4.1 Acido shikímico (CAS 138-59-0), de una pureza de 98 % como mínimo
4.2 Acido sulfúrico 0,5 M
4.3 Agua bi-destilada
4.4 Preparación del solvente de elución (0,01 M H2SO4)
Introducir con una pipeta 20 ml de ácido sulfúrico 0,5 M (4.2) en un matraz aforado de 1000 ml, llenar con agua bi-destilada (4.3) hasta alrededor de 900 ml, agitar y ajustar a 1000 ml. Filtrar el solvente de elución por medio de un filtro cuyos poros tienen un diámetro inferior o igual a 0.45 µm y desgasificar.
4.5 Preparación de la solución madre patrón (500 mg/l de ácido shikímico)
Pesar exactamente 50 mg de ácido shikímico (4.1), transferir cuantitativamente en un matraz aforado de 100 ml, llenar con agua bi-destilada (4.3) hasta alrededor de 90 ml, agitar y ajustar a 100 ml. A –18°C la solución madre patrón puede ser conservada durante varios meses.
4.6 Preparación de las soluciones patrón de trabajo ( 5, 25, 50, 100, 150 mg/l de ácido shikímico) Diluir la solución madre a razón de 500 mg/l (4.5) con agua bi-destilada (4.3) para obtener cinco soluciones patrón de trabajo de 5, 25, 50, 100, 150 mg/l de ácido shikímico. Preparar a diario las soluciones patrón.
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5. Aparatos y material
Equipamiento habitual de laboratorio y en particular el material siguiente:
5.1 Sistema CLAR capaz de efectuar el análisis de una solución de ácido shikímico.
5.1.1 Cromatógrafo CLAR equipado de una válvula de inyección de 6 vías con bucle de muestreo de 5 µl o cualquier otro dispositivo, automático o manual, que asegure una inyección fiable de microvolúmenes.
5.1.2 Sistema de bombas de régimen isocrático para mantener un flujo constante o
programado con una precisión máxima
5.1.3 Sistema de calefactor de columna que permita calentar una columna de 300 mm a 65°C
5.1.4 Detector UV-VIS con célula de circulación y funcionamiento a una longitud de onda de 210 nm
5.1.5 Integrador u otro sistema de recolección de datos
5.2 Columnas CLAR de acero inoxidable
5.2.1 Pre-columna
Se recomienda anteponer a la columna analítica una pre-columna apropriada.
5.2.2 Sistema de columnas analíticas
1. Columna en fase invertida (a temperatura ambiente)
Material: acero inoxidable Diámetro interno: 4 - 4.6 mm Largo: 200 - 250 mm Fase estacionaria: material esférico, C18 en fase inversa, partículas de 5µ de diámetro*) Acoplado a 2. Columna intercambiadora de cationes (calentada a 65°C) Material: acero inoxidable Diámetro interno: 4 - 7.8 mm Largo: 300 mm Fase estacionaria: resina de tipo polistireno-divinilbenceno con índice de **) reticulación a 8% y reagrupamientos sulfónicos bajo forma hidrógeno (S-DVB)
*) LichrospherTM 100 RP-18 , HypersilTM-ODS or OmnichromTM YMC-ODS-A son ejemplos de columnas adaptadas disponibles a la venta. **) AminexTM HPX 87-H ou RezexTM ROA-Organic Acid son ejemplos de columnas adaptadas y disponibles a la venta.
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6. Muestreo Las muestras límpidas de vino se introducen directamente en los tubos para muestras y se analizan por cromatografía sin preparación previa. Las muestras turbias se filtran a través de una membrana filtrante con poros de un diámetro de 0.45 µm antes de la inyección, luego de la eliminación de las primeras fracciones de filtrados.
7. Procedimiento
7.1 Modo de operar el análisis CLAR
Inyectar 5 µl de vino en el aparato cromatográfico (sistema de inyección con bucle).
Flujo: 0,4 ml/min
(si el diámetro interno de la columna intercambiadora de cationes es de 4 mm) 0,6 ml/min (si el diámetro interno de la columna intercambiadora de cationes es de 7.8 mm)
Fase móvil: 0,01 M H2SO4
Calentamiento de la columna intercambiadora de cationes: 65 °C Duración: 40 min Tiempo necesario para la equilibración: 20 min (con el fin de que todas las substancias del vino hayan sido bien eliminadas). Longitud de onda de detección: 210 nm Volumen de inyección: 5 µL
Nota: en razón de la diferencia de propiedades de separación entre las columnas y las
diferencias de volumen muerto entre los diferentes instrumentos CLAR, el tiempo de retención absoluto (min) para el pico de ácido shikímico puede variar de manera más o menos significativa. A pesar de ello, el ácido shikímico puede ser identificado fácilmente calculando el factor de separación (α)respecto a un pico de referencia, el ácido tartárico, que es el primer pico y el pico dominante en el cromatograma. Ensayando diferentes columnas en fases invertidas C18 y diversas columnas intercambiadoras de cationes, se calculó un factor de separación (α) de 1.33 (± 0.2).
7.2. Límite de detección
El límite de detección de este método, calculado según el método OIV ha sido
estimado en 1 mg/l
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8. Calibración
Preparar una curva de calibración a 5 puntos a partir de las soluciones patrón de
trabajo (4.6). La determinación cuantitativa del ácido shikímico es efectuada siguiendo el método de calibrado externo midiendo las superficies de los picos de los tiempos de retención del ácido shikímico y comparándolos a la curva de calibración pertinente. Los resultados, en ácido shikímico, se expresan en mg/l a un decimal.
9. Estudio en colaboración
El método ha sido validado por un estudio colaborativo con la participación de 19
laboratorios internacionales según la resolución de la OIV Oeno 6/2000 “Protocolo para la validación de los métodos de análisis” y en particular las recomendaciones sobre la planificación, la conducción y la interpretación de los estudios de rendimiento de los métodos de análisis. El estudio se realizó sobre 5 muestras diferentes de vinos tintos y blancos con concentraciones de 10 a 120 mg/l. (ver anexo 3)
Las desviaciones estándar de repetibilidad y de reproducibilidad son correlacionadas a
la concentración de ácido shikímico (ver Anexo 2). Los parámetros reales de desempeño pueden ser calculados como sigue:
sr = 0.0146 x + 0.2716 sR = 0.0286 x + 1.4883 x: concentración de ácido shikímico (mg/l) Ejemplo: Acido shikímico: 50 mg/l sr:=±1.0 mg/l sR:=±2.92 mg/l
10. Anexo Un ejemplo de separación del ácido shikímico de los otros ácidos orgánicos se expone en el Anexo 1.
La correlación entre la concentración del ácido shikímico y la desviación estàndar de
repetibilidad y de reproducibilidad figura en el Anexo 2.
Las estadísticas provenientes de los resultados de un estudio inter-laboratorio
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Anexo 1: Cromatograma de los ácidos orgánicos del vino
200 mV
cid ic a tar tar
150 d cid aci ic a lic
100 kim ma shi
50
min -20 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0
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Anexo 2: Correlación de la concentración de ácido shikímico y
desviaciones tipo de repetibilidad y de reproductibilidad
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Anexo 3: Cuadro de rendimiento del método
Identificación A B C D E de las muestras Cantidad de 19 19 19 19 19 laboratorios participantes Cantidad de 17 18 17 18 18 laboratorios seleccionados promedio 58.15 30.05 11.17 122.17 91.20 sr2 0.54588 0.84694 0.19353 4.32417 2.67306 sr 0.73884 0.92030 0.43992 2.07946 1.63495 RSDr (%) 1.27 3.06 3.93 1.70 1.79 r 2.07 2.58 1.23 5.82 4.58 sL2 8.45221 13.27078 0.73013 24.62737 8.55508 sR 2 8.99809 14.11773 0.92366 28.95154 11.22814 sR 2.99968 3.75736 0.96107 5.38066 3.35084 RSDR (%) 5.16 12.50 8.60 4.40 3.67 R 8.40 10.52 2.69 15.07 9.38
sr2 varianza de repetibilidad
sr desviación estándar de repetibilidad RSDr (%) desviación estándar relativa de al repetibilidad r repetibilidad sL2 varianza“pura” inter-laboratorios sR 2 varianza estándar de reproducibilidad sR desviación estándar de reproducibilidad
RSDR (%) desviación tipo relativa/ reproducibilidad
R reproducibilidad
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