Manual de métodos generales para determinación de carbohidratos

1. 1. MANUAL DE MÉTODOS GENERALES PARA DETERMINACIÓN DE

CARBOHIDRATOS ELABORADO POR: Leidy Milena Cristancho Cruz Ricardo
Alonso Monroy Soler UPTC 2014
2. 2. P á g i n a | 2 1. INTRODUCCION Los carbohidratos constituyen la mayor parte
de los componentes vegetales. Son carbohidratos los diferentes azúcares,
almidones, celulosa, hemicelulosas, pectinas y numerosas gomas. Los azúcares
como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan especialmente en el jugo
celular; los almidones son los carbohidratos de reserva y se encuentran en forma
de plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los polisacáridos que conforman el
material estructural y las gomas son productos de desecho. Dada la importancia de
estos compuestos se han desarrollado varios métodos para su determinación:
Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon, Hagerdorn-Hensen, etc., pero todos ellos
se basan en el mismo principio: Todos los azúcares con un grupo aldehído libre o
un grupo cetónico se clasifican como azúcares reductores y se transforman
fácilmente en enedioles (reductonas) al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos
enedioles son altamente reactivos y se oxidan fácilmente en presencia de oxígeno
u otros agentes oxidantes, por lo tanto, los azúcares en solución alcalina
rápidamente reducen iones oxidantes como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)63- y los
azúcares se oxidan formando mezclas complejas de ácidos. Esta acción reductora
es la que se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas.
Una de las técnicas analíticas más potentes consiste en determinar la cantidad de
una substancia disuelta midiendo la cantidad de radiación absorbida por la misma
es conocida como Espectrofotometría Dentro de la bromatologia un apartado
escencial son las pruebas analiticas las cuales no son otra cosa que la
identificacion y cuantificacion de los diversos carbohidratos presentes en un
alimento, pudiendo aprovechar un carbohidrato con fienes industriales o para
aseguarar la composicion que un producto alimentario pueda tener; la analitica
3. 3. P á g i n a | 3 permite entre otras cosas el control del estado de las materias
primas o los productos durante todo el proceso de transporte almacenamiento o
transformacion. El muestreo de los productos o materias primas hace uso de
analisis quimicos e intrumentales que no requieren cantidades grantes de muestra
para poder hacer un analisis y determinar su composicion; algunas tecnicas de
espectrofotometria tienen un carácter dual, al permitir la identificacion y la
cuantificacion de un compuesto de cualquier alimento; los analisis de cualificacion
de la molecual de carbohidrato utiliza tecnicas quimicoas de reacciones oxidativas,
adicion y demas, con lo que se logra catalogar un carbohidrato
4. 4. P á g i n a | 4 INDICE 1. INTRODUCCION 2 2. METODOS CUANTITATIVOS 5
2.1 DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS TOTALES POR
ESPECTROFOTOMETRIA UV (METODO DE FENOL-SULFURICO) 5 2.2
DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES TOTALES POR
ESPECTROFOTOMETRIA UV (METODO DE ACIDO DINITROSALICILICO DNS)
7 2.3 DETERMINACION DE AZUCARES POR EL METODO OPTICO DE
POLARIMETRIA 10 2.4 DETERMINACION DE AZUCARES (GLUCOSA,
SACAROSA Y FRUCTUOSA) POR HPLC (CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA
RESOLUCION) 12 2.5 DETERMINACION DE AZUCARES POR
ESPECTROSCOPIA POR INFRARROJO CERCANO 17 2.6 ANALISIS DE
POLISACARIDOS (DETERMINACION DE FIBRA DIETETICA) 20 3. METODOS
CUALITATIVOS 22 3.1 PRUEBA DE MOLISCH 22 3.2 PRUEBA DE BENEDICTO
23 3.3 PRUEBA DE LUGOL 24 3.4 PRUEBA DE BIAL 24 3.5 PRUEBA DE
SELIWANOFF 26 3.6 PRUEBA DE BARFOED 27 3.7 PRUEBA DE FEHLING 28
3.8 EZQUEMA DE ANALISIS CUALITATIVO PARA CARBOHIDRATOS 28 4.
BIBLIOGRAFIA 29
5. 5. P á g i n a | 5 2. METODOS CUANTITATIVOS 2.1 DETERMINACION DE
CARBOHIDRATOS TOTALES POR ESPECTROFOTOMETRIA UV (METODO DE
FENOL-SULFURICO) INTRODUCION El metodo por espectrofotometria UV hace
 referencia al uso de la luz para medir las concentraciones de ciertas sustancias
quimicas. Para que este fenomeno pueda llegar a medirse se debe tener presente
la concentracion de las especies abosorbentes dado a que esta es proporcional a
la absorbancia según la ley de lamber-bee donde: A = e × b × c  A es la
absorbancia (magnitud adimensional)  e es un coeficiente de proporcionalidad
denominado coeficiente de extinción molar. Indica la absorbancia de una
determinada sustancia a una longitud de onda dada y se expresa en M-1 .cm-1.  b
es el ancho o espesor de la celda donde se deposita la muestra y se expresa en
cm.  c es la concentración expresada en moles / Litro (M) FUNDAMENTO La
reaccion de color para medir la concetracion de carbohidratos solubles por
espectrofotometria se basa en la utilizacion del metodo colorimetrico de fenol-
sulfurico que depende de la deshidratacion de sacaridos derivados de hidrolisados
a furfural que transcurre en el proceso de la reaccion. Los derivados del furfural
con las formas del fenol coloreado abdorbe la luz en el rango visible a una longitud
de onda de 490 nm. Reaccion: FENOL+ H2SO4 (concentrado) + CARBOHIDRATO
HMF (amarillo naranja) Para hexosas (hidroximetil furfural) Para pentosas (metil
furfural) METODOLOGIA  Preparacion de la muestra A 2 ml de alícuota de una
solución de hidratos de carbono se mezcla con 1 ml de solución acuosa al 5% de
fenol en un tubo de ensayo. Posteriormente, se añade 5 ml de ácido sulfúrico
6. 6. P á g i n a | 6 concentrado rápidamente a la mezcla. Luego los tubos de ensayo
se dejan en reposo durante 10 min, se agitan durante 30 segundos y se colocan
durante 20 min en un baño de agua a temperatura ambiente para el desarrollo de
color. El blanco y la solución patrón se preparan conforme al procedimiento
anteriormente descrito, utilizando el carbohidrato de interés. Finalmente se lleva a
una celda donde se deposita en el espectrofotómetro para programar la longitud de
onda a 490 nm y se procede a leer la absorbancia (M. DuBois, K. Gilles, J.
Hamilton, P. Rebers y F. Smith, 1956).  Preparacion de la curva patron Se
procede a determinar las diferentes concentraciones del carbohidrato partiendo de
0.01 % que indica 0.1 gramos en 1000 ml de agua. Posteriormente se toman
alícuotas de 0.1; 0.2; 0.3 y se completa a volumen para 1.0 ml con agua destilada.
Por último se añade el fenol y el ácido sulfúrico siguiendo la metodología anterior,
para ser leídas en el espectrofotómetro (R. Matissek, F.M. Schnepel y G. Steiner,
1992). Tabla 1: Preparacion de las soluciones patrones para elaborar una curva
patron. N° de tubos patrón del azúcar (0.1 g/ 1000 ml) agua (ml) fenol 5% (ml)
H2SO4 (ml) Concentración μ/ml Absorbancia 1 0.1 0.9 1.0 5.0 10 μ/ml - 2 0.2 0.8
1.0 5.0 - - 3 0.3 0.7 1.0 5.0 - - 4 0.4 0.6 1.0 5.0 - - 5 0.5 0.5 1.0 5.0 - - 6 0.6 0.4 1.0
5.0 - - 7 0.7 0.3 1.0 5.0 - - 8 0.8 0.2 1.0 5.0 - - blanco 0.9 0.1 1.0 5.0 - - Fuente:
Análisis de alimentos. 2da edición, Editorial Acriba S.A Zaragoza España. Se
determina la concentración molar del carbohidrato patrón siguiendo la siguiente
relación: Entonces: 1000 ml 0.1 gramos de X azúcar 0.1 ml X X= 0.1 x0.1/ 1000 X
= 10ug/ml (así determinamos para cada una de las concentraciones del azúcar)
RESULTADOS
7. 7. P á g i n a | 7 Para leer los resultados de la muestra a analizar, es necesario
contruir una curva de calibracion o curva patron a diferentes concentraciones con
el carbohidrato de interes (disacaridos y monosacaridos) para determinar la
absorbancia. Para calibrar el espectrofotometro se procede a ubicar el blanco que
se tiene provisto en la celda, ajustandolo al 100% de transmitancia y 0,000 de
absorbancia. Una vez obtenida la absorvancia de cada concentracion, se grafica
sobre excel o una hoja de papel milimetrado absorvancia vs concentracion de cada
solucion preparada. La ecuacion de linealidad que arroje la grafica de la curva
patron se tomara como referencia para hallar matematicamente la concentracion
del azucar presente en la muestra. Luego se procede a medir la absorbancia de la
muestra de interes. Entonces: Se tiene que Y= mx+b (ecuacion de linealidad
expresada en la curva patron) Donde Y es la absorbancia del analito m. es la
pendiente (valor numerico) que tomo de la ecuacion de linealidad de la curva
patron x, es el dato que no conozco b. es el intercepto (valor numerico) que tomo
de la ecuacion de linealidad de la curva patron teniendo en cuenta los datos de la
 ecuacion lineal despejamos X (lo tomamos como concentracion del analito). Como
obtenemos la concentracion diluida en ppm se realizan los calculos necesarios
para determinar la concentracion en gramos de la muestra analizada en
determinado alimento. O de igual manera la absorbancia que obtenemos cuando
medimos la muestra se interpola o extrapola en la grafica según el valor arrojado.
2.2 DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES TOTALES POR
ESPECTROFOTOMETRIA UV (METODO DE ACIDO DINITROSALICILICO DNS)
INTRODUCCION Los azucares reductores poseen poseen un grupo carbonilo libre
formando un grupo hemiacetal que le confiere la caracteristica de poder reaccionar
con otros compuestos. El metodo de miller o DNS (acido dinitrosalicilico como
reactivo tiene la capacidad de oxidar los azucares reductores mostrando un
comportamiento diferencial hacia mono y disacaridos, dando resultados
colorimetricos que se puede medir con una longitud de onda de 575 nm.
8. 8. P á g i n a | 8 FUNDAMENTO En disolucion alcalina el azucar se hidroliza
produciendo un compuesto que se reduce a un grupo nitro del DNS, para dar el
producto monoamino correspondiente. Esta reaccion da un producto colorido en
solucion alcalina (SOUTHGATE, D.A.T, 1991). La reaccion que se lleva a cabo es
la siguiente: Imagen 1: Reaccion de reduccion del Acido dinitrosalicilico. Fuente:
Nielsen, 2003 METODOLOGIA  Preparacion del reactivo DNS Se prepara según
el metodo propuesto por Coughlan y Moloney. Se añade 10 g de ácido
dinitrosalicílico (DNS) y 300 g de tartrato de sodio y potasio (sal de Rochelle) a 800
ml de NaOH 0,5 N y se calienta suavemente para disolver los reactivos. El
volumen se completa hasta 1,0 L con agua destilada (MP Coughlan, AP Moloney,
1988).  Preparacion de la curva patron Se implementa el mismo metodo para
realizar la curva patron, como se describio en el metodo fenol-sulfurico. Emplendo
una solucion patron de glucosa con una concentracion de 1.0 g/L, para la cual se
disuelve 0.1 gramos de glucosa en 90 ml de agua y se lleva a volumen a 100 ml.
Esta solucion patron se prepara a difentes concentraciones adicionando a cada
tubo 1 ml del reactivo
9. 9. P á g i n a | 9 de DNS con agitacion constante. Posteriormente se lleva a baño
maria durante 15 minutos se deja enfriar y se añade agua destilada hasta
completar el volumen respectivo. Se determina la absorbancia de cada tubo a 575
nm en el espectrofotometro UV.  Preparacion de la muestra Se toma 1 ml de la
solucion acuosa de la muestra, enseguida se adiciona 1ml del reactivo de DNS y
se calienta por 15 minutos en baño maria. Se deja enfriar y se diluyen con 10 ml de
agua destilada. Se procede a leer la absorbancia junto con el blanco a la misma
longitud de onda que las muestras para la curva patron. RESULTADOS para
realizar la curva patron se grafica concentracion en ppm de la glucosa vs
absorbancia de las muestras diluidas a diferentes concentraciones. Imagen 2.
Cruva patron por Espectrofotometria. Fuente: Determinación de azucares
reductores por la técnica de Miller.
https://es.scribd.com/doc/56421369/DETERMINACION-DE-AZUCARES-
REDUCTORES-POR-LA-TECNICA-DE-MILLER Para determinar la concetracion
de azucares reductores en la muestra se aplica el mismo metodo matematico (con
el fenol-sulfirico) utilizando la ecuacion lineal de la curva patron. Tambien se puede
emplear una curva de calibracion para azucares reductores como la celobiosa u
otro tipo de azucar para determinar su respectiva absorbancia y asi su
concentracion.
10. 10. P á g i n a | 10 2.3 DETERMINACION DE AZUCARES POR EL METODO
OPTICO DE POLARIMETRIA INTRODUCCION La polarimetria es una tecnica no
destructiva basada en la medicion de la rotacion optica producida sobre un haz de
luz polarizada al pasar por una sustancia opticamente activa. La actividad optica
rotatoria de una sustancia tiene su origen en la asimetria estructural de los atomos
de carbono, nitrogeno, fosforo o azufre en la molecula, lo cual es conocido como
quiralidad. La quiralidad se describe como la imagen en un espejo de una molecula
la cual no puede suporponerse sobre ella misma. FUNDAMENTO Se coloca un
tubo de muestra que contiene un liquido en solucion, entre dos elementos
 polarizantes. El primer elemento (polarizador) polariza la luz antes de que esta
pase a traves de la muestra. El segundo elemento (analizador) puede girarse para
contrarrestar cualquier rotacion por la muestra y por tanto, localiza la posicion
angular resultante del plano de la luz, y por tanto la cantidad de rotacion causada
por la muestra, donde se expresa en grados angulares. En la industria del azucar
la rotacion se expresa sobre una escala diferente que se denota como °Z. A
continuacion un esquema de polarizacion de una muestra de azucar en solucion.
Imagen 3. Dsitribucion de la luz en polarimetria. Fuente:
https://es.scribd.com/doc/89862717/Analisis-polarimetrico.
11. 11. P á g i n a | 11 Cada sustancia opticamente activa tiene su rotacion especifica,
determinada por la siguiente ecuacion: [α] (t,λ) = α (t,λ) / c I Donde: [α] =rotacion
especifica a una determinada sustancia α =rotacion optica (viene determinada por
la estructura) c= concentracion I = paso optico a traves de la muestra t=
temperatura λ=longitud de onda Imagen 4.Esquema de un polarimetro Fuente:
TECNICAÑA., Manual de laboratorio para el análisis azucarero Tecnicaña. 1986. 1
- Entrada de luz de Na 2 - Lente de iluminación 3 - Filtro de luz 4 - Polarizador
12. 12. P á g i n a | 12 5 - Placa 6 - Cilindro conteniendo la solución a medir 7 -
Analizador 8 - Objetivo para el enfoque 9 - Ocular para visualización. 10 - Lupa 11 -
Panel de lectura 12 - Tornillo para la escala METODOLOGIA Se toman 13 gramos
de azucar y se disuelven en 40 ml de agua en un vaso precipitado en constante
agitacion, luego se traspasa a un matraz y se enraza a 50 ml con agua destilada.
Posteriormente se verte el contenido a un erlenmeyer y se añade 5 ml acido
concentrado. Se pone a baño maria de 7 a 15 minutos. Se deja enfriar la solucion y
se procede a agregarla en el tubo polarimetrico hasta llenarlo completamente
(CHEN C. P, James, 1996). Se registra la lectura del polarimetro una vez se
estabiliza. RESULTADOS Se determina la concentracion del azucar según la
ecuacion y el angulo de rotacion, junto con la temperatura al momento de la lectura
con el equipo: [α] (t,λ) = α (t,λ) / c I la concentracion del azucar se expresa en
gramos/ 100 ml de solucion. 2.4 DETERMINACION DE AZUCARES (GLUCOSA,
SACAROSA Y FRUCTUOSA) POR HPLC (CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA
RESOLUCION) INTRODUCCION La HPLC o cromatografia liquida de alta
resolucion es una tecnica cromatografica usada para separar componentes de una
muestra que se fraccionan entre una fase movil liquida y una fase estacionaria
solida compuesta por particulas muy finas contenidas en una columna, y donde se
utiliza una presion muy elevada para forzar el paso del disolvente a traves de ella,
consiguiendo asi separaciones de gran resolucion, permitiendo su identificacion y
cuantificacion. La cromatografía líquida de alta resolución tiene ventajas en el
análisis de los azúcares debido a su
13. 13. P á g i n a | 13 gran solubilidad en agua y su idoneidad para la separación de
especies no volátiles o termolábiles (Chicharro, Manuel 2007). FUNDAMENTO La
muestra se introduce en pequeños volumenes a la corriente de la fase movil
bombeada con alta presion a una columna rellena de fase estacionaria y alli el
analito se retarda preparandose por medio de interacciones quimicas con la fase
estacionaria mientras atraviesa la columna. El retardo se conoce como tiempo de
retencion, unico para cada analito. Para la separacion de carbohidratos como
sacarosa, glucosa y fructosa se utiliza una columna de separacion rellena de una
resina de intercambio cationico con base calcica, que exhiben propiedades como
intercambio de ligandos y exclusion por tamaños. La muestra diluida es
previamente filtrada para la inyección en la columna, dependiendo de la geometría
de los hidroxilos de los diferentes azúcares, estos interactúan con los cationes de
la resina por afinidad, variando gradualmente los resultados de los tiempos de
elución de las diferentes especies. El método se aplica a moléculas de bajo peso
molecular relativo, que puedan entrar en los poros de la resina y establecer
enlaces temporales con los iones contrarios. Las moléculas largas no entran
fácilmente en los poros y ellas eluyen con mayor rapidez. La estimación exacta de
la altura de pico para un azúcar se obtiene por un sistema de integración
electrónico que luego lo relaciona al obtenido por un estándar (Herrera,Ana C
 2011). MATERIALES Y EQUIPOS  Cromatógrafo líquido de alta resolución con
detector de índice de refracción WATERS I.  Inyector de la muestra automático 
Bomba isocrática de alta presión para HPLC  Columna rellena de resina de
intercambio con base cálcica, con tamaño de partícula de 10 – 15 μm, longitud
250-300m (Sugar Pack I).  Calentador de columna para 90 ºC  Integrador
electrónico  Instrumentos de filtración (Filtros de jeringa de 25 a 50 mm de
diámetro en conjunto con membranas de filtración de 0.45 μm,)  Balanza analítica
de precisión de ± 0.1 mg  Viales Reactivos  Sacarosa Grado analítico  Glucosa
Grado analítico  Fructosa Grado analítico
14. 14. P á g i n a | 14  EDTA (Cálcico) Grado analítico METODOLOGIA 
Preparacion de la fase movil Se preparan 1000 ml de solución de EDTA (Sal
Cálcica) de 50 ppm, se filtra por membrana de 0.45 μm y se desgasifica. 
Preparacion de estandares de calibracion externos Se preparan 100 ml de
soluciones para los estándares indicados en la tabla 1, registrando el peso exacto
utilizado en la preparación Tabla 2. Concentraciones de estandares de calibración
externos para HPLC Analito de calibracion Concentracion (ppm) Sacarosa 5
Glucosa 0.5 Fructosa 0.5  Preparacion de la muestra Se pesa aproximadamente
de 0,75 g a 1.0 g de melaza de caña, registrando el peso exacto de la muestra,
que se transfiere cuantitativamente a un matraz volumétrico de 100 ml y se diluye
100 ml y se homogeniza. La solución se filtra por una membrana de 0.45 μm
provista de un prefiltro Sepak.  Condiciones para la operación de HPLC Velocidad
de la Fase móvil : 0.5 a 0.6 ml/min en elución isocrática Presión ≤ 1300 psi
Temperatura de 80 a 85 ºC Volumen de inyección de muestras 20 μL
RESULTADOS Tres parametros instrumentales que afectan la sensibilidad son: la
temperatura del detector, presion del gas de nebulizacion y la ganancia. La
temperatura del detector se estudia a un intervalo de 40-60 °C. una temperatura de
45 es suficiente para permitir la evaporacion completa
15. 15. P á g i n a | 15 del disolvente y por lo tanto dando un ruido insignificante. Una
velocidad de flujo (presión) del sistema del aire a 3 bar y una ganancia de 5
proporcionaron una buena sensibilidad y una adecuada relación señal-ruido
(Luciana C. Nogueira 2005).  Cálculos Cálculo del Porcentaje Sacarosa, Fructosa
y Glucosa por HPLC El integrador suministra porcentajes de áreas y alturas con su
correspondiente tiempo de retención que se relacionan con las áreas de los
estándares de calibración externos de Sacarosa, Glucosa y Fructosa, con las
áreas de los picos cercanos a los tiempos de retención. Cálculo del porcentaje de
Sacarosa en la muestra Se toma el área de la sacarosa correspondiente a un
tiempo de elución de aproximadamente 7.53 minutos y se calcula el Factor de
Respuesta (FR). Donde: Area = Dada por el integrador para el estándar de
Calibración de Sacarosa Concentración = Gramos exactos de Sacarosa Pesados
Para hallar el % de sacarosa: % sacarosa= Area de la muestra a 7. 53 min x 100%
FR x concentracion muestra Cálculo del porcentaje de Glucosa en la muestra Se
procede igual que para el cálculo de la Sacarosa, teniendo en cuenta que el tiempo
de elución de la glucosa es en aproximadamente 9.52 min. Se toma el área de la
Glucosa correspondiente a un tiempo de elución de aproximadamente 9.52
minutos y se calcula el Factor de Respuesta (FR). Donde: Area = Dada por el
integrador para el estándar de Calibración de Glucosa Concentración = Gramos
exactos de Glucosa Pesados Para hallar el % de glucosa: % glucosa = Area de la
muestra a 9.52 min x 100% FR x concentracion muestra
16. 16. P á g i n a | 16 Cálculo del porcentaje de Fructosa en la muestra Se procede
igual que para el cálculo del porcentaje de Sacarosa y glucosa, se identifica el área
de la fructosa correspondiente a un tiempo de elución de aproximadamente 11.17
min y para el calculo el Factor de Respuesta (FR). Donde: Area = Dada por el
integrador para el estándar de Calibración de fructosa Concentración = Gramos
exactos de fructosa Pesados Para hallar el % de fructosa: % fructosa = Area de la
muestra a 11.17 min x 100% FR x concentracion muestra Imagen 5. Muestra un
cromatograma típico para la separación de los cinco hidratos de carbono utilizados
en el proceso de optimización. Fuente: Journal of Chromatography A, Volume
 1065, Issue 2, 2005, 207 – 210. (1) La fructosa (t R 8,76 min), (2) la glucosa (t R
9,71 min), (3) la maltosa (t R 15,45 min), (4) maltotriosa (t R 22,21 min), (5)
maltotetraosa (t R 29,41 min). La concentración de los estándares en la mezcla fue
de 2 g / L
17. 17. P á g i n a | 17 La figura anterior representa el método estándar externo que se
usa generalmente para calibrar el sistema cromatográfico para la cuantificación de
hidratos de carbono. Para ello, las soluciones estándar azúcares con diferentes
concentraciones (0,05-5,0 g / L para la fructosa, 0,05-5,0 g / L para la glucosa, 0,05
a 15,0 g / l de maltosa, 0,05 a 10,0 g / L para maltotriosa, y 0.05- Se utilizaron 5,0 g
/ L para la maltotetraosa), de acuerdo a la concentración de la muestra en el
alimento Y. (Wei, MI Ding J. Chromatogr. A, 904 (2000)) 2.5 DETERMINACION DE
AZUCARES POR ESPECTROSCOPIA POR INFRARROJO CERCANO
INTRODUCCION La espectroscopia por infrarrojo cercano (NIRS) es una
metodología instrumental que ha presentado un desarrollo creciente en los últimos
años en la industria azucarera mundial. Se la utiliza tanto en centros de
investigación como en diversas industrias, por ser una técnica no destructiva,
rápida, que no emplea reactivos químicos y que requiere menos mano de obra que
los métodos tradicionales empleados en el laboratorio. La espectroscopia estudia
la interacción de la radiación electromagnética con la materia. NIRS comprende el
segmento de luz de longitudes de ondas entre 800 y 2600 nm del espectro
electromagnético y analiza la absorción de energía en dicha región por los grupos
funcionales de las moléculas de la muestra (ZOSSI, Silvia; RUIZ, Roberto M 2010).
FUNDAMENTO La espectroscopia IR se fundamenta en la absorción de la
radiación IR por las moléculas en vibración. Una molécula absorberá la energía de
un haz de luz infrarroja cuando dicha energía incidente sea igual a la necesaria
para que se dé una transición vibracional de la molécula. Es decir, la molécula
comienza a vibrar de una determinada manera gracias a la energía que se le
suministra mediante luz infrarroja. Pueden distinguirse dos categorías básicas de
vibraciones: de tensión y de flexión. Las vibraciones de tensión son cambios en la
distancia interatómica a lo largo del eje del enlace entre dos átomos. Las
vibraciones de flexión están originadas por cambios en el ángulo que forman dos
enlaces. En principio, cada molécula presenta un espectro IR característico (huella
dactilar), debido a que todas las moléculas (excepto las especies diatómicas
homonucleares como O2 y Br2) tienen algunas vibraciones que, al activarse,
provocan la absorción de una determinada longitud de onda en la zona del
espectro electromagnético correspondiente al infrarrojo. En la zona del espectro
electromagnético IR con longitudes de onda del infrarrojo medio (entre 4000 y 1300
cm-1) se suelen observar una serie de bandas de absorción provocadas por las
vibraciones entre únicamente dos átomos de la molécula. Estas vibraciones
derivan de grupos que contienen hidrógeno o de grupos con dobles o triples
enlaces aislados. (Nakamoto K., 1997).
18. 18. P á g i n a | 18 Tabla 3. Intervalo de frecuencia de las bandas como medidas
estándar Intervalo de frecuencia (cm-1) Enlace Tipo de vibración 3600-3200 O-H
Tensión 3500-3200 N-H Tensión 3000-2800 C-H Tensión 1600-1700 O-H Flexión
1640-1550 N-H Flexión 1400-1200 C-H Flexión 1350-1000 C-N Flexión 900-800
As-O Tensión (simétrica) 700-750 As-O Tensión (anti-simétrica) 500-400 As-O
Flexión Fuente: Rubinson K.A., Rubinson J.F., “Análisis Instrumental”, Ed. Pearson
Educación, 2000 METODOLOGIA  Preparación de muestras liquidas Para medir
disoluciones diluidas de muestras sólidas y liquidas disueltas en disolventes
transparente al IR, se utiliza un tipo especial de celda. Los disolventes más
utilizados para este tipo de muestras son el CCl4 para la región 4000-1330 cm-1 y
el CS2 para la región 1330-625 cm -1. Ambos disolventes son bastante tóxicos por
lo que deben manejarse con precaución o sustituirse con n-hexano o n-heptano. La
preparación de disoluciones es un paso importante en los estudios por IR. Disolver
muestras sólidas, reducir la viscosidad de líquidos y sobre todo, diluir la muestra
para así poder usar caminos ópticos más largos y reproducibles en el análisis
cuantitativo. Típicamente se analizan disoluciones de una concentración de 0,05 %
 a 10% en células de 0,1 a 1 mm de espesor. Una combinación práctica puede ser
un 10 % de concentración y un camino óptico de 0,1 mm. Puesto que se necesitan
volúmenes pequeños de muestra, se suele utilizar el método gravimétrico en su
preparación (B. Stuart John Wiley & Sons 2004).  Preparación de muestras
solidas Generalmente las muestras sólidas se debe pulverizar hasta que el tamaño
de sus partículas sea menor que la longitud de onda de la radiación (<2 μm) para
evitar los efectos de la dispersión de la misma. Una de las técnicas más populares
es la formación de pastillas de KBr (también se han usado otros haluros de
metales alcalinos). Las sales de haluros tienen la propiedad de flujo en frío (cold
flow), por lo que, cuando se somete a la presión adecuada este material finamente
pulverizado, sinteriza y forma una tableta transparente que se asemeja a un cristal.
Al usar
19. 19. P á g i n a | 19 esta técnica, se mezcla a fondo un miligramo o menos de la
muestra finamente pulverizada, con aproximadamente 100-300 mg de polvo de
KBr. La mezcla se puede realizar con un mortero y su mano o en un pequeño
molino de bolas. Posteriormente se presiona la mezcla en un troquel especial entre
700 y 1000 kg/cm2 hasta obtener un disco transparente. Se obtienen mejores
resultados si el disco se prepara a vacío para eliminar el aire ocluido. A
continuación, el disco se coloca en la trayectoria del haz del instrumento para su
examen espectroscópico. Los espectros obtenidos presentan a menudo bandas a
3450 y 1640 cm-1 debidas a la humedad absorbida. Imagen 6. Troquel para
fabricar discos uniforme con reproducibilidad  Análisis cuantitativo Para el análisis
cuantitativo en el caso del IR se utiliza la cantidad de radiación electromagnética
absorbida, y el parámetro a medir es el cociente entre la intensidad de la radiación
(de una longitud de onda determinada) antes y después de atravesar la muestra.
La ley de Beer describe la relación entre esta magnitud determinada
experimentalmente y la concentración: A = -log (I/Io) = a · b · c Donde b es el
espesor de la celda que atraviesa la radiación y a, la absortividad molar, es una
constante para cada sustancia a una longitud de onda. Esta relación de
proporcionalidad directa motiva que sea la absorbancia la magnitud utilizada en
estudios cuantitativos, mientras que la transmitancia se prefiere en los estudios
cualitativos. Así pues, una representación de la absorbancia frente a la
concentración debe ser lineal con una pendiente ab y debe pasar por el origen.
Para analizar una disolución de concentración desconocida se deben preparar
disoluciones patrón, elegir una banda adecuada, medir la absorbancia a esa
longitud de onda y dibujar una
20. 20. P á g i n a | 20 recta de calibrado. La concentración de la muestra problema se
hallará en esta recta de calibrado a partir del dato experimental de absorbancia
medido en el aparato (Nakamoto, k. 2004). RESULTADOS Para los compuestos
carbonilicos, como aldehídos, cetonas, ácidos carboxílicos y sus derivados, el
grupo funcional principal en los carbohidratos es el que absorbe con una alta
intensidad en la región del infrarrojo en la zona de 1850- 1650 cm-1. Estas
vibraciones generalmente por alargamiento de este grupo específicamente.
Imagen 7. Representación del espectro de la molécula de glucosa Fuente:
Mc.Murry J. Química Orgánica, quinta edición .Thomson Editores México 2000).
Los picos que identifican cada banda en el espectro se relaciona a la longitud de
onda entre los enlaces de la molécula. Así tenemos enlace C-C, C-H etc. 2.6
ANALISIS DE POLISACARIDOS (DETERMINACION DE FIBRA DIETETICA)
INTRODUCCION La fibra dietética se define como los polisacáridos y lignina que
no son digeridos por enzimas humanas (Lee y Prosky, 1995). Los métodos (AOAC
985.29, 993.21, Horwitz, 2005) se fundamentan en aislar la fracción de interés con
la precipitación selectiva y después determinar su peso. Una muestra gelatinizada
de alimento seco, desengrasado se digiere enzimáticamente con alfa-amilasa,
amiloglucosida y proteasa para hidrolizar el almidón y la proteína. El contenido total
21. 21. P á g i n a | 21 de la fibra de la muestra se determina agregando etanol al 95%
a la solución para precipitar toda la fibra. La solución entonces se filtra, se
recupera, se seca y se pesa, el residuo se reporta como fibra. (Prosky et al, 1984,
 Prosky et al, 1985) FUNDAMENTO Muestras en duplicado de alimentos secos y
desgrasados son gelatinizados con a – amilasa térmicamente estable y luego
digerida enzimáticamente con proteasa y amiloglucosidasa para remover la
proteína y el almidón. La fibra dietética soluble es precipitada por la adición de
etanol, el residuo total se filtra, se lava, se seca y se pesa. En el residuo en
duplicado se determina proteína, y en el otro cenizas (Official Methods of Analysis.
A.O.A.C 1990). Fibra dietética total = Peso del residuo - Peso (proteína + cenizas).
METODOLOGIA Correr un blanco a lo largo de toda la determinación. Pesar por
1g de muestra (exactitud de 0.1g) en matraces de 500 mL. El peso de las muestras
no debe diferir en más de 20 mg. Adicionar 50 mL de buffer de fosfatos 0.08M pH 6
0, Medir pH y ajustar a pH 6± 0.2 si es necesario. Adicionar 0.1 mL de la solución
de amilasa y cubrir el matraz con papel aluminio, colocar el matraz en un baño a
ebullición durante 15 min. Agitar suavemente cada 5 minutos. Verificar con
termómetro que los matraces mantengan 95-100°C durante 15 minutos. Enfriar a
temperatura ambiente Ajustar a pH 7.5± 0.2 adicionando 10 mL de NaOH 0.275N,
agregar 5 mg de proteasa (disolver 50 mg de proteasa en 1mL de buffer de
fosfatos. Adicionar 0.1mL de la solución a cada matraz). Cubrir el matraz con papel
aluminio y colocarlos en un baño a 60°C por 30 minutos con agitación continua.
Enfriar a temperatura ambiente, adicionar 10 mL de HCL 0.325N. Ajustar el pH a
4.0- 4.6, adicionar 0.1mL de amiloglucosidasa, incubar a 60°C por 30 minutos con
agitación continua. Adicionar 280 mL de etanol 95% precalentado a 60°C (medir el
volumen antes de calentar). Dejar en reposo 1 h. Pesar el crisol conteniendo la
celita, humedecer y redistribuir la cama de celita con etanol 78%. Aplicar succión.
Mantener la succión y cuantitativamente transferir el precipitado de la digestión
enzimática. Lavar el residuo con 3 porciones de 20 mL de etanol 78%, lavar con 2
porciones de 10 mL de etanol 95%, lavar con 2 porciones de 10 mL de acetona, si
se forma una forma una goma, mover con la espátula para mejorar la filtración
Secar el crisol conteniendo el residuo toda la noche a 70°C
22. 22. P á g i n a | 22 Enfriar en desecador y pesar Restar el peso del crisol con la
celita para conocer el peso del residuo RESULTADOS Cálculo de fibra dietética
total: % FDT = [ (masa del residuo - P - C - B)/ masa de la muestra)] x 100 Donde: -
m = masa de la muestra = promedio de la masa de 2 muestras (mg). - m1 = masa
del residuo = promedio de las masas de las muestras determinadas en duplicado
(mg). - P y C = masa (mg) de proteína y cenizas, respectivamente en los residuos
de las muestras. Informar el % de fibra al 0,1 %, sobre la base de la muestra
original considerando que ha sido desgrasada en el caso de contener más de 10 %
de grasa. 3. METODOS CUALITATIVOS 3.1 PRUEBA DE MOLISCH Es la prueba
específica para determinar la presencia de carbohidratos en una muestra, al
deshidratar el glúcido (monosacáridos-alta reacción y disacáridos, polisacáridos-
baja reacción) forma Furfural; este al reaccionar con α-Naftol produce un complejo
de color morado (Condensación del Furfual) (Quesada, 2007; Amalesh, Et.Al.,
2006). Imagen 8. Reacción química en la Prueba de Molisch. Fuente: Fuente:
Harper College (n.d.).
23. 23. P á g i n a | 23 Método: se colocan 1-2 mililitros (ml) de una solución “muestra”
en un tubo de ensayo, se añaden dos gotas de reactivo de Molisch (una solución
de α-napthol en etanol al 95%). se vierte luego lentamente por la pared del tubo
(Quesada, 2007) 1-2 ml de ácido sulfúrico concentrado de (Harpercollege, n.d.).
Resultados: la formación de una capa intermedia de color Purpura es indicativo de
la presencia de furfural (Glúcido deshidratado) condensados; el tiempo que demore
la reacción es indicativo del número de carbonos que tenga el glúcido, así, una
pentosa (5c) tiene una alta reacción y por el contrario una hexosa (6c) tiene una
baja reacción (Harpercollege, n.d.). 3.2 PRUEBA DE BENEDICTO Cuando un
carbohidrato posee en su estructura un grupo carbonilo libre (C=O) esta reducirá el
reactivo de Benedicto por oxidación con los iones cobre en una solución de pH
alcalino y la acción del calor (Punto de ebullición); y formara acido carboxílico; al
reaccionar se puede denominar como azúcar reductor (Sakuta, n.d.). Imagen 9.
Reacción de Oxidación del cobre en presencia del glúcido-reductor Fuente:
 Fuente: Harper College (n.d.). Método: Coloque 2-5 ml de solución de Benedicto
en un tubo de ensayo pequeño y el calor en un baño de agua hirviendo
suavemente durante 2-3 minutos. Añadir 10 gotas de la solución de hidratos de
carbono a ensayar, mezclar bien, y colocan de nuevo en el baño de agua hirviendo
durante 5 minutos adicionales (Universidad Nacional, n.d.; Firdouse y Alam, 2011).
Un cambio de color de azul a verde a rojo ladrillo amarillo y finalmente (Cu2O)
indica que el hidrato de carbono es un azúcar reductor. La velocidad de reacción
es muy importante. La fructosa reacciona muy rápidamente, glucosa y galactosa
más lentamente. Incluso el almidón y la celulosa darán resultados débiles si la
solución se calienta ampliamente (UNIVERSIDAD NACIONAL, n.d.). Resultados: la
reacción positiva es una coloración que va desde verde, amarillo, naranja y rojizo,
el grado de coloración y el tono radica en la concentración de cobre oxidado
(Cu2O); esta reacción indica que es un azúcar reducido.
24. 24. P á g i n a | 24 3.3 PRUEBA DE LUGOL La interacción del yodo o yodo
potásico con el almidón forma coloraciones azules oscuras, debido a la ocupación
de los espacios libres del glúcido, este es un glúcido alterado, al cual, sus
propiedades físicas son modificadas, como la no absorción lumínica Método: se
toman 2 ml de la solución de muestra, se colocan en un tubo de ensayo; se agrega
dos gotas de lugol y 1 ml de agua (HARPER COLLEGE, n.d.); o agregar 1 ml de
reactivo para un peso de muestra de 100 mgr (Girish, Et.Al., 2009). Resultados: la
formación de un complejo azul oscuro, debido a la adhesión del colorante a la
molécula de azúcar. Imagen 10. Resultados negativos de la prueba de Lugol
Fuente: HARPER COLLEGE, n.d. Imagen 11. Resultado positivo de la prueba de
Lugol Fuente: HARPER COLLEGE, n.d. 3.4 PRUEBA DE BIAL Esta prueba
detecta las pentosas. El reactivo deshidrata las pentosas formando furfural
(derivados de las pentosas). Estos derivados de las pentosas además reaccionan
con orcinol y los
25. 25. P á g i n a | 25 iones de hierro presentes en el test reactivo, generan productos
de color azul (HARPER COLLEGE, n.d.). Imagen 12. Reacción de deshidratación y
formación de furfural. Fuente: Fuente: Harper College (n.d.). Método: tomar dos ml
o 1-2 gotas (Mahesh, Murugesh y Mohana, 2006) de una muestra de solución y
colocarla en un tubo. Tomar dos ml del reactivo de Bial (solución de orcinol, HCl y
cloruro férrico) y adicionarlo en el tubo. Entonces calentar la solución lentamente
con un mechero Bunsen o en baño de María (HARPER COLLEGE, n.d.). Se debe
calentar a 60 º C durante 10 minutos (Díaz, Jorrín y Bárcena). Resultados: es
positivo si se observa un derivado azulado. Otros colores indican negativo (ver
imagen 13). Las hexosas generalmente producen un resultado de color verde, rojo
o café (HARPER COLLEGE, n.d.). Imagen 13. Resultados negativos de la prueba
de Bial Fuente: HARPER COLLEGE, n.d. Imagen 14. Resultado positivo de la
prueba de Bial Fuente: HARPER COLLEGE, n.d.
26. 26. P á g i n a | 26 3.5 PRUEBA DE SELIWANOFF Esta prueba detecta cetosas
(hexosas). En el test se provoca una reacción de deshidratación de cetohexosas
para formar 5 hidroximetilfurfural. La formar 5 hidroximetilfurfural además reacciona
con el resorcinol presente en el test (HARPER COLLEGE, n.d.). Imagen 15.
Reacción de deshidratación de Cetohexosas Fuente: Fuente: Harper College
(n.d.). Metodo: tomar 0.5-2 ml (CRUZADO, GUTIERREZ y RUIZ, 2007) de muestra
de solución y colocarla en un tubo. Tomar 1-2 ml del reactivo de Seliwanoff
(solución de resorcinol y HCl) y adicionarlo. Calentar la solución en un baño de
Maria por dos minutos (HARPER COLLEGE, n.d.) o llevar la muestra son reactivo
a ebullición y luego adicionar el reactivo y observar (CRUZADO, GUTIERREZ y
RUIZ, 2007). Resultados: Un producto rojo indica un resultado positivo; debido a la
formacion de 5 hidroximetilfurfural, reaccionando junto con el resorcinol. Imagen
16. Resultado positivo de la prueba de Seliwanoff Fuente: HARPER COLLEGE,
n.d. Imagen 17. Resultado negativo de la prueba de Seliwanoff Fuente: HARPER
COLLEGE, n.d.
27. 27. P á g i n a | 27 3.6 PRUEBA DE BARFOED Se utiliza para detectar
monosacaridos reductores en disolución. Los monosacaridos reductores son
 oxidados por el ion de cobre, formandose ácido carboxilico y una precipitacion
rojiza de ion cobre. Los disacaridos reductores tiene la misma reacción pero lo
hacen mas lento (HARPER COLLEGE, n.d.). Imagen 18. Reacción de oxidación y
formación de ácidos carboxílicos. Fuente: Fuente: Harper College (n.d.). Metodo.
Tomar 1 ml de la solución y colocarla en un tubo. adicionar 1-3 ml del reactivo de
Barfoed (Danmalam, Et. Al., 2009) (solución de acetato cúprico y ácido acético) y
adicionarla. Calentar la solucion al baño de maria durante tres minutos (HARPER
COLLEGE, n.d.). Resultados: la formacion de precipitaciones rojizas dentro de los
tres minutos indican un resultado positivo (HARPER COLLEGE, n.d.). Imagen 19.
Resultado positivo de la prueba de Barfoed Fuente: HARPER COLLEGE, n.d.
Imagen 20. Resultado negativo de la prueba de Barfoed Fuente: HARPER
COLLEGE, n.d.
28. 28. P á g i n a | 28 3.7 PRUEBA DE FEHLING La prueba hace reduce el cobre
(Cu++) por oxidacion con los todos los azucares reductores, siempre que este en
medio alcalino con una presencia de tartrato de sodio y potasio para permitir la
estabilizacion del cobre (De, Dey y Ghosh, 2010); (ver imagen 9). Metodo: se
llevan las dos fracciones del reactivo a un tubo de enzayo; la fraccion A es el
sulfato de cobre 7% disuelto en agua y la fraccion B es el Tartrato de potacio 35%
y hidroxido de sodio 10% diluidos en agua, una vez completado el reactivo (A:1-
2ml+B:1-2ml) (UNIVERSIDAD DE LA LAGUNA, n.d.) se mescla bien y se
adicionan 1-5 ml del la muestra al tubo de enzayo y se lleva al baño de maria por 5
minutos (Danmalam, Et. Al., 2009) Resultado: la reaccion positiva forma un
presipitado de color rojo ladrillo por la oxidacion del cobre (reduccion). Imagen 21.
Coloracion positiva (derecha) y negativa (Izquierda) de Fehling. Fuente: University
of Oregon (n.d.) 3.8 EZQUEMA DE ANALISIS CUALITATIVO PARA
CARBOHIDRATOS La secuencia de analisi cualitativo a carbohidratos en cadena
e identifica las cualidades de los carbohidratos analisados, una vez es terminado el
esquema puede ser determinadas algunas propiedades y estrcutura de varios
glucidos. Imagen 22. Ezquema de analisis a carbohidratos.
29. 29. P á g i n a | 29 Fuente: Fuente: Harper College (n.d.). 4. BIBLIOGRAFIA 1.
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