Epigenética

¿Qué es la epigenética?
Ciencia que estudia los cambios hereditarios causados por la activación y desactivación de los
genes sin ningún cambio en la secuencia de ADN subyacente del organismo. La epigenética es
una palabra de origen griego y significa literalmente por encima (epi) del genoma.
Procesos moleculares que inducen cambios epigenéticos

Metilación del ADN

DNMT
ADN metil-tranferasas
• Adición de grupos metilo a bases nitrogenadas a bases nitrogenadas.
• La metilación del ADN suele asociarse con represión de la transcripción
• Es más común en las bases de citosina adyacentes a los nucleótidos de
guanina de la misma cadena. Desmetilasas
• Las regiones del DNA con muchas secuencias CpG se llaman islas CpG

• El ADN transcrpcionalmente activo en general no está metilado

Me
5' - C G – 3'
3' - G C – 5'
Me

Isla CpG
Procesos moleculares que inducen cambios epigenéticos

Metilación del ADN

islas CpG

Me
5' - C G – 3'
3' - G C – 5'
Me

Isla CpG
Procesos moleculares que inducen cambios epigenéticos

Metilación del ADN

¿Como se pueden conservar y replicar los cambios epigeneticos

durante la division celular?

La metilacion del ADN causa modificacion de las histonas. Las

bases metiladas atrae las enzimas desacetilasas que eliminan
grupos acetilo
Procesos moleculares que inducen cambios epigenéticos

Remodelación de la cromatina
 2. Remodelación de la cromatina
¿Cómo hacen los reguladores de transcripción y la ARN
polimerasa para ganar acceso a un ADN empaquetado-
compactado?

Los activadores de la transcripción dirigen

la modificación de la estructura local de la
cromatina
 Modificación de las histonas
• Acetilación • Metilación

• Fosforilación
Modificación de las histonas
Acceder a la información en el ADN puede ser un proceso
de múltiples pasos e involucra muchas proteínas

Un activador de la transcripción se une al

ADN empaquetado en cromatina y atrae
una histona acetil transferasa

Acetilación de:
Lisina 9 de la histona H3 (H3K9)
Lisina 8 de la histona H4 (H4K9)
3. Modificación de las histonas
Acceder a la información en el ADN puede ser un proceso
de múltiples pasos e involucra muchas proteínas

Una histona quinasa (atraída por el

activador) fosforila la serina 10 de la
histona H3 (H3S10)

Solo lo hace después de que la lisina 9

ha sido acetilada

Esta modificación de serina señala a la

histona acetil transferasa a acetiliar la lisina
14 de la histona 3 (H3K14)
3. Modificación de las histonas
Acceder a la información en el ADN puede ser un proceso
de múltiples pasos e involucra muchas proteínas

El factor de transcripción general TFIID y un

complejo de remodelación de la cromatina se
unen para promover los pasos posteriores del
inicio de la transcripción.

TFIID y el complejo de
remodelación reconocen ambas
colas de histonas acetiladas
Modificación de las histonas

No todas las regiones del genoma

tienen la misma accesibilidad

La accesibilidad no es equivalente a
la transcripción génica
Técnicas
moleculares
PCR, RT-PCR
Electroforesis
Secuenciación Sanger
Diagnóstico molecular
Reacción en
Cadena de la
polimerasa
https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/
 2. Reacción en Cadena de la Polimerasa
▪ Técnica de laboratorio común utilizada para hacer muchas copias (¡millones o miles de
millones!) de una región particular de ADN

▪ el ADN amplificado por PCR se puede secuenciar, visualizar por electroforesis en

gel o clonar en un plásmido para otros experimentos
 2. Reacción en Cadena de la Polimerasa
▪ Requiere de una enzima ADN polimerasa Taq polimerasa, se aisló de la
bacteria Thermus aquaticus
 2. Reacción en Cadena de la Polimerasa
▪ Requiere de cebadores, corta secuencia de nucleótidos que proporciona un punto de
partida para la síntesis de ADN
 2. Reacción en Cadena de la Polimerasa
▪ Requiere de cebadores, corta secuencia de nucleótidos que proporciona un punto de
partida para la síntesis de ADN
 2. Reacción en Cadena de la Polimerasa
▪ Condiciones para llevar a cabo una PCR:
1.Desnaturalización (96°C) Separar las
cadenas de ADN
2. Templado (55-65°C): Los cebadores se
unen a cada una de las cadenas
3. Extensión (72°C): se eleva la T° para que
la Taq Pol extienda los cebadores y se creen
nuevas cadenas

https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/
pcr/
Electroforesis

https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/
Electroforesis
Objetivo: permite separar moléculas en base a su tamaño o carga eléctrica.
Electroforesis
Elementos necesarios
Electroforesis
CÁMARA DE ELECTROFORESIS
Dispositivo que permite la generación de un campo eléctrico alrededor de un gel en
el que se depositan las muestras
 Electroforesis
GEL: compuesto por polímeros que forman una especie de microporos tridimensionales
a través de los cuales las moléculas avanzan, lo que permite la separación por tamaño
de los diferentes componentes de la muestra.

Gel de agarosa: ácidos nucleicos Gel poliacrilamida: proteínas

▪ Polisacárido extraído de algas marinas

▪ El gel de poliacrilamida es el resultado de
▪ Efectivo para separar fragmentos de
DNA (100 pb a 25 kb) la polimerización química de una mezcla
▪ Presenta menor poder de resolución de acrilamida y bisacrilamida
que el gel de poliacrilamida ▪ Acrilamida es una neurotoxina
▪ El tamaño de los poros depende de la
concentración utilizada ▪ Siempre se realiza en cámaras verticales
▪ Tamaño del poro inversamente ▪ Las proteínas se tratan con SDS para que
proporcional a la concentración
se rodeen de cargas negativas
▪ NO es tóxico
 Electroforesis
GEL: compuesto por polímeros que forman una especie de microporos tridimensionales
a través de los cuales las moléculas avanzan, lo que permite la separación por tamaño
de los diferentes componentes de la muestra.

Gel de agarosa: ácidos nucleicos

▪ Polisacárido extraído de algas marinas

▪ Efectivo para separar fragmentos de
DNA (100 pb a 25 kb)
▪ Presenta menor poder de resolución
que el gel de poliacrilamida
▪ El tamaño de los poros depende de la
concentración utilizada
▪ Tamaño del poro inversamente
proporcional a la concentración
▪ NO es tóxico
Electroforesis
Buffer de corrimiento

● Tien la misma composición y pH que el buffer con el que

se prepara el gel de resolución, ya sea de agarosa o de
acrilamida
● Permite la transmisión de la corriente eléctrica y mantiene
el pH sin variaciones mientras se realiza el corrimiento

❖ TBE: Tris base + ácido bórico + EDTA pH de 7.2.

❖ TAE: Tris base + ácido acético + EDTA, pH 8.5.
❖ El buffer de proteínas: Tris + SDS al 1% y glicina, a un pH 8.3
Electroforesis
Marcador de peso molecular

● Permiten determinar por comparación el

tamaño de las moléculas
● En el caso de marcadores de peso
molecular de ácidos nucleicos, éstos
pueden ser bacteriófagos o plásmidos
Electroforesis
Elementos necesarios

● Brinda peso, densidad y color a la muestra, lo que facilita su

depósito en el pocillo y evita su salida del gel
● Àcidos nucleicos: Tris, azul de bromofenol, azul de xileno y
glicerol.
● Proteínas: Tris-HCl, pH 6.8, ditiotritiol (DTT), SDS, glicerol y azul
de bromofenol
Electroforesis horizontal y
vertical
Electroforesis horizontal
 Electroforesis: Aplicaciones
Algunos de los usos de la electroforesis para ácidos nucleicos en geles de agarosa son:
● Determinar los tamaños moleculares de los ácidos nucleicos
● Analizar los fragmentos cortados con enzimas de restricción (mapa de restricción)
● Comparar los tamaños de distintos tipos de DNA
● Aislar y recuperar fragmentos de DNA purificados para clonaciones moleculares
● Analizar productos de PCR.
● Técnica previa a las técnicas de hibridación Southern Blot (ADN) y Northern Blot (RNA)
Electroforesis: ejercicio
● ¿De qué peso molecular es la banda de menor tamaño
del carril C?
● ¿De qué peso molecular es la banda de mayor tamaño
del carril D?
● ¿En qué carril y qué peso molecular presenta la banda
que tiene mayor concentración?
● ¿En qué carril y qué peso tiene la banda de menor
concentración?
● Suponiendo que son muestras de DNA digeridas por
enzimas de restricción, ¿qué carriles contienen
aparentemente la misma muestra. Explique su respuesta?
● ¿En qué carril se localiza el marcador de peso molecular?
● Indique el sentido de corrimiento de las muestras con
una flecha.
● Señale la polaridad correspondiente a cada extremo del
gel.
Secuenciacion del
ADN
Secuenciacion del ADN
La secuenciación de ADN es el proceso de determinar la secuencia de nucleótidos
de un fragmento de ADN
Método “didesoxi” de Sanger

● Emplea análogos de dNTP específicos de terminación de cadena

denominados didesoxinucleótidos trifosfatados ddNTP
Secuenciacion del ADN
La secuenciación de ADN es el proceso de determinar la secuencia de nucleótidos
(As, Ts, Cs y Gs) de un fragmento de ADN.
Secuenciación de Sanger: el método por terminación de cadena
La secuenciación de Sanger consiste en hacer muchas copias de una región blanco
de ADN y se requiere
● Una enzima ADN polimerasa
● Un cebador, que es un fragmento pequeño de ADN monocatenario que se une al
molde de ADN y actúa como un "iniciador" de la polimerasa.
● Los cuatro nucleótidos del ADN (dATP, dTTP, dCTP, dGTP).
● El molde de ADN que será secuenciado
● Versiones didesoxi, o terminadores de la cadena, de los cuatro nucleótidos
(ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), cada uno marcado con pigmentos de color
diferente.
Secuenciacion del ADN
Secuenciación de Sanger: el método por terminación de cadena
● Una enzima ADN polimerasa
● Un cebador, que es un fragmento pequeño de ADN monocatenario que se une al
molde de ADN y actúa como un "iniciador" de la polimerasa.
● Los cuatro nucleótidos del ADN (dATP, dTTP, dCTP, dGTP).
● El molde de ADN que será secuenciado}
● Versiones didesoxi, o terminadores de la cadena, de los cuatro nucleótidos
(ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), cada uno marcado con pigmentos de color
diferente.
Secuenciacion
del ADN

https://www.you
tube.com/watch?
v=oeJoTZCRrvU
TECNOLOGÍAS DE
SECUENCIACIÓN DE
NUEVA GENERACIÓN
 SECUENCIACIÓN DE NUEVA GENERACIÓN
Realizan secuenciación en paralelo, es decir, secuencian de forma simultánea, cientos
de miles o incluso millones de fragmentos de DNA
siguen un abordaje metodológico semejante
1. Segmentación del ADN en varios fragmentos
2. Marcaje del ADN por medio de primers o adaptadores que indican el punto de
partida para la replicación
3. Amplificación de los fragmentos de ADN marcados con adaptadores por métodos
basados en PCR
4. Secuenciación o lectura de los fragmentos de ADN
5. Reconstrucción de la secuencia completa por medio de secuencias de referencia
y exportación a ficheros de almacenamiento de datos
SECUENCIACIÓN DE
NUEVA
GENERACIÓN
Realizan secuenciación en paralelo, es
decir, secuencian de forma simultánea,
cientos de miles o incluso millones de
fragmentos de DNA

PIROSECUENCIACIÓN
SECUENCIACIÓN DE
NUEVA
GENERACIÓN
Realizan secuenciación en paralelo, es
decir, secuencian de forma simultánea,
cientos de miles o incluso millones de
fragmentos de DNA

ILUMINA

A. La amplificación de los fragmentos de ADN

para la generación del clúster (colonias del
mismo fragmento) se realiza mediante el
método de PCR en puente.
B. La detección de bases en la secuenciación se
hace a través de etiquetas fluorescentes
https://www.youtube.com/watch?v=womKfikWlxM
SECUENCIACIÓN DE
TERCERA GENERACIÓN
Se fundamentan en la idea de
eliminar la etapa de PCR, y tratar de
realizar la propia secuenciación a
partir de una única molécula de ADN
Single Molecule, Real-time (SMRT),

Utiliza la fluorescencia para secuenciar una única molécula de

ADN en tiempo real

● El diseño se basa en nanopocillos, por donde es posible

el paso de la luz.

● En cada pocillo, queda inmovilizada una única molécula

junto con una sola enzima de ADN polimerasa.

● Tras la incorporación de los nucleótidos, cada uno

marcado con un fluoróforo de un color distinto, se libera
el fluoróforo que es excitado por el haz de luz, siendo
detectable por el detector.

● Asì es posible saber que nucleótido se ha incorporado,

y elucidar la secuencia desconocida.
SECUENCIACIÓN DE
TERCERA GENERACIÓN
Se fundamentan en la idea de
eliminar la etapa de PCR, y tratar de
realizar la propia secuenciación a
partir de una única molécula de ADN
secuenciación mediante Nanoporos

Leer directamente el fragmento de ADN a

secuenciar mediante el paso de dicha
molécula única por un nanoporo, a la vez que
se va midiendo los efectos, a nivel iónico y
eléctrico, que supone el avance del ADN.

Se requiere de una gran cantidad de ADN,

para poder secuenciar y obtener un resultado
fiable
Mutagenesis
Mutagénesis
¿Qué es la biotecnología?
Uso de un organismo, o de algún componente de un organismo u otro sistema
biológico, para hacer un producto o proceso con un fin particular
1. Clonación
La clonación de ADN: es el proceso de hacer múltiples copias idénticas de un fragmento
particular de ADN.
▪ El gen de interés se inserta en un plásmido
▪ La inserción se realiza con enzimas que "cortan y pegan" ADN
▪ ADN recombinante, ADN ensamblado de fragmentos provenientes de múltiples fuentes

Plásmidos se insertan en bacterias

Se seleccionan las bacterias que

contengan el plásmido y se cultivan.
Clonación
La clonación de ADN: es el proceso de hacer múltiples copias idénticas de un fragmento
particular de ADN.
▪ La inserción se realiza con enzimas que "cortan y pegan" ADN
Clonación
Clonación
Transformación y selección bacteriana
Clonación
Transformación y selección bacteriana
Clonación
Transformación y selección bacteriana