Efectos antihipertensivos y vasodilatadores de los gránulos de Qingda por

supresión de la afluencia de calcio y la vía AKT

Abstracto
La formulación del gránulo Qingda (QDG) se simplificó a partir de la decocción Qingxuan
Jiangya, que se ha utilizado en China para tratar la hipertensión durante décadas. Sin
embargo, los mecanismos moleculares de QDG en la antihipertensión siguen siendo en
gran parte desconocidos. Por lo tanto, evaluamos la eficacia terapéutica de QDG
contra la presión arterial elevada y exploramos su mecanismo subyacente. El
tratamiento con QDG disminuyó la presión arterial elevada y aumentó la elasticidad
vascular de los anillos aórticos torácicos a la estimulación de KCl en ratas
espontáneamente hipertensas. El tratamiento con QDG aumentó la relajación de los
anillos aórticos torácicos aislados pre contraídos con norepinefrina (NE) o KCl de una
manera independiente del endotelio, que se atenuó mediante el tratamiento con
verapamilo, pero no mediante el tratamiento con TEA, 4-AP, Gli o BaCl2. Además, el
pretratamiento con QDG atenuó el CaCl2-constricción inducida de anillos aórticos
torácicos aislados en soluciones libres de Ca2+ que contienen K+- o NE. Además, el
pretratamiento con QDG inhibió significativamente la afluencia de Ca2+ en las células
A7r5 inducida por una solución de Ca2+ que contenía K+ o NE y disminuyó los niveles de
p-AKT, pero no tuvo ningún efecto sobre los niveles de proteína AKT total en anillos
aórticos torácicos aislados. Teniendo en cuenta estos resultados, el tratamiento con
QDG atenuó la presión arterial elevada y promovió la vasorelajación de los anillos
aórticos torácicos al inhibir la afluencia de Ca2+ y activar la vía AKT.
INTRODUCCIÓN
La hipertensión es una de las afecciones clínicas más frecuentes y un factor de
riesgo importante para muchas enfermedades cardiovasculares, como el infarto de
miocardio, la hipertrofia cardíaca, la aterosclerosis y la hipertrofia vascular. La
hipertensión también se conoce como presión arterial alta, que generalmente no causa
síntomas, mientras que a largo plazo de presión arterial elevada puede causar
modificaciones de la función y estructura vascular.1–4 Por lo tanto, la reducción de la
presión arterial es una de las estrategias para reducir los eventos de enfermedad
cardiovascular causada por la presión arterial elevada.5–7
La disfunción de la vasoconstricción y la vasodilatación está estrechamente relacionada
con la hipertensión porque la hipertensión es causada por un aumento constante de la
tensión vascular periférica como resultado de la actividad vasomotora anormal, que
depende principalmente de las células del músculo liso vascular (VSMC). Por lo tanto,
mantener la homeostasis vascular de los VSMC en la función vasomotora normal es uno
de los objetivos en el control de la hipertensión.8–12 En condiciones fisiológicas, los VSMC
regulan la tensión vascular a través de la contracción, dilatación y secreción o
liberación de varios factores reguladores vasculares para mantener la función normal
de los vasos sanguíneos. Los canales de calcio y potasio son los 2 canales iónicos más
importantes en los VSMC.13,14 Los canales K +
juegan un papel importante en la regulación
de la tensión vascular al cambiar el potencial de membrana en reposo en los vasos
sanguíneos. Por lo tanto, muchos agentes y fármacos vasoactivos inducen vasodilatación
o contracción al abrir o cerrar canales K+.15–19 Además, la contracción y relajación de
los músculos lisos también están reguladas por canales Ca2+ dependientes del voltaje y
canales Ca2+ operados por receptores.20–23 Por lo tanto, la afluencia de calcio puede
reducirse inhibiendo la apertura de canales de calcio, lo que eventualmente conduce a la
vasodilatación. Por lo tanto, la regulación de los canales iónicos para mantener la
homeostasis vascular de los VSMC es una de las estrategias para controlar la
hipertensión.
Se ha demostrado que múltiples vías de señalización participan en procesos de
vasoconstricción y vasodilatación. Por ejemplo, la vía PI3K/AKT gobierna la contracción
de VSMC mediante el acoplamiento de receptores de membrana a canales de calcio.24
Un estudio de Viard et al25 se encontró que la entrada de calcio inducida por PI3K
ocurre a través de la fosforilación del canal Ca2+ de tipo L Cavβ2 bis subunidad en
un sitio de consenso AKT, que promueve su translocación a la membrana plasmática.
Además, se ha demostrado que los principales vasoconstrictores (incluida la angiotensina
II) activan la vía PI3K/AKT y las corrientes de Ca2+ de tipo L en vsMC a través del
receptor AngII tipo 1, que se inhibe mediante el bloqueo selectivo de PI3K; esto sugiere un
papel crucial para esta isoforma PI3K en particular en la regulación de la contractilidad
de VSMC.26–29 La inhibición de la vía PI3K/AKT podría ser una estrategia para prevenir
la disfunción de la hipertensión inducida por vasoconstricción y vasodilatación.

Las medicinas tradicionales chinas se han utilizado durante mucho tiempo como remedios
alternativos para una variedad de enfermedades, incluidas las enfermedades
cardio-cerebrovasculares. La formulación del gránulo Qingda (QDG) se simplificó a
partir de la decocción Qingxuan Jiangya (QXJYD), que fue prescrita por el académico
Ke-ji Chen, y se ha utilizado durante mucho tiempo como una fórmula de medicina
tradicional china para tratar la hipertensión.30,31 QDG está formulado a partir de 4
hierbas chinas, incluyendo Gastrodia elata Blume, Scutellaria baicalensis, Ramulus
uncariae y Nelumbo nucifera. Nuestros datos no publicados muestran que QXJYD y QDG
exhibieron efectos similares en la reducción de la presión arterial elevada en ratas
espontáneamente hipertensas (SHR). Sin embargo, el papel de QDG en la antihipertensión
y su mecanismo subyacente son en gran parte desconocidos. Por lo tanto, el objetivo
de este estudio fue investigar los efectos de QDG sobre la presión arterial elevada en
los SHR y sobre la vasodilatación y constricción de los anillos aórticos torácicos de
rata. También exploramos el mecanismo subyacente del efecto antihipertensión QDG
mediante el estudio de la activación de los canales K+ y Ca2+ y la vía AKT.
MATERIALES Y MÉTODOS
Reactivos
La noradrenalina fue comprada a Aladdin Bio-Chem Technology Co, Ltd (Shanghai, China).
El cloruro de acetilcolina, (±)-clorhidrato de verapamilo, cloruro de bario, cloruro de
magnesio, HEPES, cloruro de tetraetilamonio y cloruro de potasio se compraron a
Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). La 4-aminopiridina y la glibenclamida se obtuvieron de
MedchemExpress (Shanghai, China). EGTA y glucosa fueron comprados a Solarbio Life
Sciences Co, Ltd (Beijing, China). Fluo-4/AM se obtuvo de Thermo Fisher Scientific
(Grand Island, NY).

Animales
Los protocolos experimentales con animales en este estudio fueron aprobados por el
Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Medicina Tradicional China de
Fujian y se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud
de los Estados Unidos para el Cuidado y Uso de Animales de laboratorio. Se utilizaron
ratas macho Wistar Kyoto (WKY) con un peso de 250-350 g (Shanghai SLAC
Laboratory Animal Co, Ltd, Shanghai, China) para los experimentos de tensión vascular.
Para los experimentos in vivo se utilizaron un total de 6 WKY masculinos (edad: 6
semanas; peso: 200 ± 20 g) y 12 SHR (edad: 6 semanas; peso: 200 ± 20 g). Los animales
se mantuvieron en condiciones de temperatura controlada (22 ° C) y un ciclo de luz /
oscuridad de 12 horas. Se proporcionaron alimentos y agua ad libitum durante todo el
experimento.

Administración de QDG y mediciones de la presión arterial

QDG fue proporcionado por Jiangyin Tianjiang Pharmaceutical Co, Ltd (Jiangsu, China;
Cat no. 180351) y se disolvió en NaCl al 0,9% y se almacenó a 4°C. Después de la
aclimatación durante 1 semana, las ratas se dividieron en 3 grupos (n = 6 por grupo): los
grupos WKY, SHR y SHR + QDG. Las ratas en el grupo SHR + QDG recibieron
administración intragástrica de QDG (0,8 g / kg) en solución salina todos los días,
mientras que a las ratas en los grupos WKY y SHR-control se les administraron
volúmenes iguales de solución salina. La presión arterial de las ratas se midió al final del
experimento utilizando el método de pletismografía con manguito de cola y el sistema de
presión arterial no invasivo CODA (Kent Scientific, Torrington, CT) después de varias
veces de entrenamiento. Después de la administración de QDG durante 8 semanas, las
ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico al 2% (50 mg/kg). Se recolectaron
sangre y aortas torácicas para su posterior estudio.

Preparación del anillo vascular

Después de que las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico al 2% (50 mg /
kg), las aortas torácicas se eliminaron rápidamente y se transfirieron a una placa de
Petri llena de solución de Krebs modificada oxigenada fría (4 ° C) que contenía 135.5 mM
NaCl, 1.2 mM MgCl2, 5.9-mM KCl, 2.5-mM CaCl2, 11,6 mM de glucosa y 11,6 mM de HEPES, y
el pH se ajustó a 7,4 con NaOH. Después de la eliminación de la grasa y el tejido
conectivo adherente, las aortas torácicas aisladas se cortaron en anillos de 3 a 4 mm
de largo.

Medición de la tensión vascular

Los anillos aórticos aislados se suspendieron entre 2 estribos de acero inoxidable de
forma triangular en cámaras de órganos llenas con 20 ml de solución de Krebs
modificada, mantenidas a 37 ° C y gaseadas con 95% de O2/5% CO2. La contracción
isométrica se midió utilizando un transductor de fuerza (BL-420S; Chengdu Techman
Software Co Ltd, Chengdu, China). Los anillos se estabilizaron con una tensión en
reposo de 2 g durante ≥60 minutos con cambio constante de la solución de Krebs
(cada 15 minutos) para evitar la acumulación de metabolitos que de otro modo podrían
conducir a la mala interpretación de los resultados. Después del período de equilibrio, los
anillos aórticos se contrajeron dos veces usando KCl de 60 mM y luego se lavaron 4
veces con solución de Krebs a intervalos de 5 minutos para restaurar la tensión en
reposo. Los cambios en la amplitud del tono vascular <10% se consideraron indicativos de
buena contractibilidad. La integridad endotelial se evaluó cualitativamente por la
presencia o ausencia de relajación causada por la acetilcolina (ACh; 10 μM) en
presencia de tono contráctil inducido por norepinefrina (NE; 1 μM).

Detección de tensión basal

Para evaluar el efecto de la concentración de QDG en anillos aórticos aislados, se
agregó QDG (0,25, 0,5, 0,75 o 1 mg/ml) a los anillos intactos de endotelio de forma
acumulativa. La contracción isométrica se midió utilizando un transductor de fuerza
(BL-420S; Chengdu Techman Software Co Ltd), y se obtuvo una curva acumulativa de
concentración-respuesta para QDG.

Medición de contracciones inducidas por KCl y NE

Después de 60 minutos de equilibrio, los anillos aórticos con el endotelio se
precontrataron con KCl (60 mM) o NE (1 μM), y luego, se agregaron concentraciones
acumulativas de QDG (0.25, 0.5, 0.75 o 1 mg / ml) para evaluar las actividades de
vasodilatación del tratamiento con QDG. La vasodilatación, que se define como el cambio
porcentual en la relajación después del tratamiento con QDG en anillos aórticos
precontractados KCl o NE, se calculó de la siguiente manera:
donde A = contracción antes de la precontracción con KCl o NE, B = contracción de la
meseta de los anillos aórticos después de la precontracción con KCl o NE, y C =
contracción de los anillos aórticos con tratamiento.

Determinación de la función endotelial

La vasodilatación implica vías dependientes e independientes del endotelio. Para estimar el
papel del endotelio en la vasodilatación mediada por QDG en la aorta torácica de rata, el
endotelio se eliminó mecánicamente frotando suavemente la luz con una pequeña aguja
de acupuntura. Los anillos se consideraron desnudos de endotelio cuando los efectos
relajantes inducidos por ACh fueron <10% e intactos de endotelio cuando los efectos
relajantes fueron >50%. Luego, los anillos aórticos con y sin el endotelio precontractado
con NE (1 μM) se incubaron con concentraciones acumulativas del QDG (0,25, 0,5, 0,75
o 1 mg/ml). Se registraron las curvas concentración-respuesta y se calculó el cambio
porcentual en la relajación.

Medición de las actividades del canal K+

Para probar más directamente la participación de los canales K+ en la vasorelajación
inducida por QDG, se evaluaron los efectos de varios bloqueadores de los canales K+
sobre la vasorelajación. Los anillos aórticos desnudos de endotelio se preincutaron con
los bloqueadores del canal K+ de TEA (10 mM), Gli (0,01 mM), 4-AP (1 mM) o BaCl2 (1 mM)
durante 20 minutos antes de añadir NE (1 μM). Una vez que se alcanzó la meseta, se
agregaron varias concentraciones de QDG (0.25, 0.5, 0.75 o 1 mg / ml) por separado.
Se registraron las curvas concentración-respuesta y se calculó el cambio porcentual
en la relajación.

Detección de actividades de canal Ca2+

Para evaluar el efecto del canal de calcio de tipo L sobre la vasorelajación inducida por
QDG, los anillos aórticos desnudos con endotelio se preincutaron con un inhibidor del
canal de calcio de tipo L, verapamilo (10 μM), durante 20 minutos y luego se
precontrataron con NE (1 μM) para establecer la contracción máxima. Una vez que se
alcanzó la meseta, se agregó QDG en varias concentraciones (0.25, 0.5, 0.75 o 1 mg /
ml). Se consideró que la no incubación con verapamilo era el grupo control. Para
evaluar más a fondo las posibles funciones del Ca2+ extracelular en la vasorelajación
inducida por QDG, se permitió que los anillos aórticos desnudos con endotelio se
estabilizaran en la solución normal de Krebs, que luego se reemplazó con una solución
libre de Ca2+ que contenía EGTA (0,5 mM) durante 30 minutos para eliminar el Ca2+ de
los tejidos. Los anillos se enjuagaron en solución de Krebs libre de Ca2+ y alta en K+ (60
mM) o NE (1 μM). Las curvas acumulativas de concentración-respuesta para CaCl2
(0,5, 1, 1,5, 2 o 2,5 mM) se obtuvieron en ausencia de QDG (grupo control) o después de
una incubación de 30 minutos con QDG (1 mg/ml). Finalmente, los efectos contráctiles
inducidos por CaCl2 se compararon entre la ausencia (grupo control) y la presencia de
QDG. La no incubación con QDG se consideró el grupo control.

Cultivo celular
Las células A7r5 derivadas del músculo liso de la aorta torácica embrionaria de rata se
obtuvieron del Banco de Células de la Academia china de Ciencias (Shanghai, China). Las
células fueron cultivadas en el medio modificado de Eagle de Dulbecco (DMEM; Gibco,
Carlsbad, CA) con alto contenido de glucosa al 10% de suero fetal bovino (Gibco), 100
unidades/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina (Hyclone, Logan, UT). Las líneas
celulares se cultivaron a 37°C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2.

Medición de [Ca2+]Yo por Microscopía de fluorescencia confocal láser

Las células A7r5 se sembraron en una placa de Petri a una densidad de 0,5 × 105
células/pozo. Después de la incubación durante 24 horas, las células fueron pretratadas
con o sin QDG (1 mg/ml) durante 24 horas. Al final del tratamiento, se agregó fluo-4/AM
(5 μM) en solución salina tamponada (HBSS) libre de Ca2+ hepes al plato y se incubó
durante 30 minutos a 37 ° C en la oscuridad. El sobrenadante se retiró con cuidado y
las células se lavaron tres veces con HBSS libre de Ca2+. Después de la incubación con
HBSS que contiene Ca2+ durante 10 minutos, la intensidad de fluorescencia se detectó
mediante el uso de un microscopio confocal de disco giratorio PerkinElmer Ultraview
(se agregó 60 mM KCl durante la detección), y las imágenes se procesaron utilizando el
software Volocity (PerkinElmer Inc, Waltham, MA). Evaluar el efecto de QDG sobre
[Ca2+]Yo inducidas por la estimulación NE, las células A7r5 con o sin tratamiento QDG
se estabilizaron en un HBSS libre de Ca2+ durante 10 minutos después de la incubación
con fluo-4/AM (5 μM), y luego, CaCl2 (2,5 mM), seguido de NE (1 μM). Un cambio en la
fluorescencia se expresó como F/F0, donde F representa la intensidad de
fluorescencia de cada píxel en la imagen de fluorescencia original y F0 se define como
el valor F al principio de las imágenes cuando se suponía que la celda estaba en estado
de reposo.

Análisis de Western Blot

Los anillos aórticos se transfirieron al medio de cultivo DMEM y se incubaron a 37°C,
con 5% de CO2. Se añadió NE (1 μM) al medio durante 30 minutos, seguido de QDG (1
mg/ml) durante 30 minutos. Los anillos aórticos tratados se transfirieron a nitrógeno
líquido y la proteína se extrajo en un tampón de lisis de ensayo de
radioinmunoprecipitación (Thermo Fisher, Carlsbad, CA). Cantidades iguales de proteína
total (cuantificadas por el ensayo de ácido bicinchonínico) se resolvieron mediante
electroforesis en gel de dodecil sulfato de dodecil-poliacrilamida al 10% y se
transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno. Las membranas se bloquearon
durante 2 horas con albúmina sérica bovina al 5% y se incubaron con anticuerpos
primarios específicos durante la noche a 4 °C, incluidos anti-AKT (Cat No. 4691S; 1:1000),
anti-p-AKT (Cat No. 4060S; 1:1000) y anti-GAPDH (Cat No. Abp57259; 1:5000). Luego, la
membrana se lavó e incubó con el anticuerpo secundario de la peroxidasa de rábano
picante anti-conejo de cabra, como se describe en las instrucciones del fabricante. El
Las imágenes de Western blot se adquirieron utilizando un sistema Chemi Doc MP y un
software Image Lab, seguido de la cuantificación de las manchas mediante el uso del
software Image J (programa de procesamiento de imágenes Java de código abierto @
https://imagej.net/ImageJ). Todos los anticuerpos se obtuvieron de Cell Signaling
Technology Inc (Beverly, MA), y se utilizó el nivel de proteína de GAPDH como control
de carga.

Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando SPSS 22.0 (SPSS Inc). Las
comparaciones de los datos de medición entre 2 grupos se realizaron mediante la
prueba t de Student pareada o independiente y entre los grupos de ≥3 mediante el
análisis de varianza de 1 vía cuando los datos cumplieron con la distribución normal. Los
datos de ≥3 experimentos independientes se presentaron como la media ± de la DE, y P
< 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

RESULTADOS
QDG disminuyó la elevación de la presión arterial y aumentó la respuesta vascular a KCl
en los anillos aórticos torácicos de los TRH
Las mediciones de la presión arterial indicaron que la PAS, la presión arterial diastólica
y la presión arterial media en los SHR aumentaron significativamente en relación con las
de las ratas WKY, que obviamente se aliviaron después del tratamiento con QDG durante
8 semanas (Figs. 1A-C). Además, investigamos la vasoconstricción en los anillos aórticos
torácicos de cada grupo utilizando un transductor de fuerza conectado a un polígrafo
BL-420S. Como se muestra en la Figura 1D, los anillos aórticos torácicos del grupo SHR
exhibieron una respuesta KCl más baja que el grupo WKY, que aumentó
significativamente en el grupo QDG.
F1
FIGURA 1.: Efectos del tratamiento con QDG sobre la presión arterial y las respuestas
contráctiles de los anillos aórticos torácicos. A, SBP, (B) DBP y (C) MAP se miden en
ratas WKY, SHR y SHR + QDG (n = 6 por grupo). D, Se determinaron las respuestas
contráctiles de las aortas de cada grupo a la estimulación KCl. Los datos se muestran
como la media ± SD. *P < 0,05 versus el grupo WKY; #P < 0.05 versus el grupo SHR.
PAD: presión arterial diastólica; MAP: presión arterial media.
QDG promovió la vasorelajación de la aorta torácica de una manera independiente del
endotelio
Para evaluar más a fondo el efecto del tratamiento con QDG sobre la vasorelajación
de la aorta torácica en ratas WKY, primero detectamos la tensión en reposo de la
aorta torácica de las ratas WKY pretratadas con varias concentraciones de QDG
(0,25, 0,5, 0,75 o 1 mg/ml). Como se muestra en la Figura 2A, el pretratamiento con
QDG no tuvo ningún efecto sobre la vasodilatación de la tensión en reposo en las
arterias torácicas intactas con endotelio. Investigaciones adicionales indicaron que el
tratamiento con QDG (0,25, 0,5, 0,75 o 1 mg/ml) aumentó significativamente la
vasorelajación de los anillos aórticos intactos del endotelio precontracturados con NE (1
μM; Figura 2B) o KCl (60 mM; Figura 2C). Además, evaluamos si la vasodilatación es
dependiente del endotelio y encontramos que el tratamiento con QDG relajó
significativamente los anillos aórticos intactos y desnudos con endotelio de ratas WKY
(Fig. 2D).

F2
FIGURA 2.: Efectos del QDG sobre la vasorelajación de los anillos aórticos torácicos.
Los anillos aórticos intactos del endotelio de ratas WKY fueron pretratados con varias
concentraciones de QDG (0,25, 0,5, 0,75 o 1 mg/ml). A, Detección de la tensión en
reposo de anillos aórticos intactos del endotelio. B, Vasorelajación de anillos aórticos
intactos de endotelio precontracturados con NE (B) o KCl (C). D, Pretratamiento de los
anillos aórticos intactos de endotelio (Endo+) y desnudos de endotelio (Endo-) de ratas
WKY con diversas concentraciones de QDG (0,25, 0,5, 0,75 o 1 mg/ml), seguido de la
detección de la vasorelajación de anillos aórticos precontracturados con NE. Los datos
se muestran como la media ± DE. *P < 0,05 frente al grupo control.
QDG Constricción dependiente del canal de calcio de tipo L atenuado de anillos aórticos
torácicos aislados
Debido a que los canales de calcio y potasio son los 2 canales iónicos más importantes
en los VSMC, primero evaluamos el efecto del tratamiento con QDG sobre la
vasorelajación de los anillos aórticos desnudos por endotelio torácico después del
pretratamiento con los inhibidores de los canales K+ (TEA: 10 mM; 4-AP: 1 mM; Gli: 0.01
mM, o BaCl2: 1 mM). Como se muestra en las Figuras 3A-D, el pretratamiento con la
KCa2+ inhibidor del canal TEA (10 mM) (Fig. 3A), el KV inhibidor de canal 4-AP (1 mM) (Fig.
3B), el KATP inhibidor de canal Gli (0,01 mM) (Fig. 3C), o el K ir inhibidor de canal BaCl2 (1
mM) (Fig.3D) no tuvo ningún efecto sobre la vasorelajación inducida por el QDG antes
del tratamiento de los anillos arteriales desnudos de endotelio precontracturados con
NE (1 μM). Por el contrario, el pretratamiento con el inhibidor del canal de calcio tipo L,
verapamilo, redujo significativamente la promoción de la vasorelajación después del
tratamiento con QDG en anillos aórticos desnudos de endotelio precontracturados con
NE (1 μM) (Fig. 4A). Además, la evaluación del tratamiento con QDG sobre la
constricción de anillos aórticos aislados desnudos de endotelio indicó que el tratamiento
obviamente atenuó los anillos aórticos aislados desnudos de endotelio CaCl2-constricción
inducida en la solución libre de Ca2+ de 60 mM K+ (Fig. 4B) y 1 μM NE (Fig. 4C).

F3
FIGURA 3.: Efectos de los bloqueadores del canal K+ sobre la vasorelajación inducida
por QDG de los anillos aórticos torácicos desnudos con endotelio. Anillos aórticos
desnudos de endotelio preincutados con los bloqueadores del canal K+, (A) TEA (10 mM),
(B) Gli (0.01 mM), (C) 4-AP (1 mM) o (D) BaCl2 (1 mM) durante 20 minutos, seguido de
estimulación NE (1 μM); después de que se alcanzó la meseta, se agregan varias
concentraciones de QDG (0.25, 0.5, 0.75 o 1 mg / ml) y se detecta la vasorelajación de
los anillos aórticos. Los datos se presentan como la media ± SD. *P < 0,05 versus el
grupo control.

F4
FIGURA 4.: Efectos del tratamiento con QDG en las actividades del canal Ca2+. A, Los
anillos aórticos desnudos de endotelio se preincuban con un inhibidor del canal de calcio
de tipo L, verapamilo (10 μM), y se precontratan con NE (1 μM), seguidos de
tratamiento QDG (0,25, 0,5, 0,75 o 1 mg/ml) y detección de la vasorelajación de los
anillos aórticos. Después de la incubación con EGTA, los anillos aórticos desnudos de
endotelio se enjuagan en solución de Krebs libre de Ca2+ y alta en K+ (B) o NE (C),
seguida de CaCl2 (0.5, 1, 1.5, 2 o 2.5 mM) estimulación con o sin tratamiento QDG. Los
datos se muestran como la media ± SD. *P < 0,05 frente al grupo control.
QDG inhibió la afluencia de calcio extracelular en células A7r5
Para examinar más a fondo el efecto de QDG sobre la afluencia de calcio extracelular
en las células A7r5, se evaluó la afluencia de calcio extracelular mediante un ensayo de
enfoque confocal con láser después de la tinción fluo-4/AM para medir las
concentraciones intracelulares de calcio en las células A7r5. Como se muestra en la
Figura 5A, las intensidades medias de fluorescencia de las células A7r5 en estado de
reposo fueron similares entre los grupos de control y QDG, mientras que las
posteriores a la estimulación de KCl aumentaron significativamente en el grupo de
control en relación con las del grupo de QDG. Como se muestra en la Figura 5B, no
hubo diferencias significativas en las intensidades medias de fluorescencia de las células
A7r5 entre los grupos de control y QDG después de la estimulación ne. Sin embargo,
después de la adición de CaCl2, las células A7r5 exhibieron un aumento significativo en la
intensidad media de fluorescencia, que no mostró un cambio significativo en el grupo
QDG. Estos resultados sugirieron que la inhibición de la afluencia de calcio extracelular
en las células A7r5 podría estar involucrada en el mecanismo subyacente de QDG en la
promoción de la vasorelajación.

F5
FIGURA 5.: Los efectos del tratamiento con QDG sobre la afluencia de calcio
extracelular en las células A7r5 se tratan previamente con 1 mg/ml de QDG, seguido de
estimulación KCl o NE. La concentración intracelular de calcio en las células A7r5 se
mide mediante un ensayo de enfoque confocal con láser después de la tinción
fluo-4/AM. A, Las imágenes se toman con un microscopio de fluorescencia confocal a
un aumento de ×10. A, Tiempo real [Ca2+]Yo se monitorea cada 30 segundos y se dibuja
la curva de la concentración de calcio intracelular. QDG inhibe la entrada de calcio
inducida por KCl en las células A7r5. Las células B, A7r5 se colocan en una solución
libre de calcio; luego, después de la estimulación NE, CaCl2 (2.5 mM) se agrega, y en
tiempo real [Ca2+]Yo se registra durante este proceso. Los datos se muestran como
la media ± SD. *P < 0,05 frente al grupo control.
QDG suprimió la activación de la vía AKT
Utilizando el análisis de Western blot, examinamos la activación de la vía AKT en anillos
aórticos aislados desnudos de endotelio pretratados con o sin QDG. Como se muestra
en la Figura 6, encontramos que la estimulación de NE aumentó ligera pero
significativamente la expresión de AKT y aumentó significativamente la expresión de
p-AKT en anillos aórticos desnudos con endotelio, mientras que el tratamiento con QDG
inhibió significativamente el aumento de la expresión de p-AKT inducida por la estimulación
de NE, lo que sugirió que la vasodilatación inducida por QDG probablemente ocurrió a
través de la inhibición de la Vía de señalización AKT.

F6
FIGURA 6.: Efectos del tratamiento con QDG sobre la activación de la vía AKT. Los
anillos aórticos se incuban en medios de cultivo DMEM que contienen 1 μM de NE
durante 30 minutos, seguidos de tratamiento con QDG (1 mg/ml) durante otros 30
minutos. Las expresiones de AKT y p-AKT se detectan mediante el análisis de Western
blot. GAPDH se utiliza como control de carga. La cuantificación de los blots se realiza
utilizando el software Image J. Los datos se muestran como la media ± DE. *P < 0,05
frente al grupo control; #P < 0.05 versus el grupo NE.
DISCUSIÓN
El control de la presión arterial elevada es un medio esencial para reducir el riesgo de
daño a los órganos diana, como el corazón, el cerebro y los riñones, causado por la
hipertensión.32–34 Debido a la toxicidad y los efectos secundarios relativamente
menores, la medicina tradicional china ha atraído gradualmente la atención de los
investigadores de todo el mundo. En este estudio, QDG, simplificado a partir de QXJYD,
se asoció con una reducción significativa de la presión arterial elevada en los SHR, que
es similar al efecto observado con el tratamiento con QXJYD. Después de confirmar
aún más este efecto, exploramos el mecanismo subyacente del efecto del tratamiento
con QDG de la hipertensión.

Como la vasoconstricción y la vasodilatación juegan un papel esencial en el desarrollo de

la hipertensión, la evaluación de la vasoconstricción indicó que el tratamiento con QDG
aumentó significativamente la respuesta vascular a KCl en los anillos aórticos torácicos
de los SHR y la vasorelajación de anillos aórticos WKY intactos del endotelio
precontracturados con NE o KCl. Investigaciones adicionales sobre los anillos aórticos
intactos y desnudos con endotelio de ratas WKY indicaron que el tratamiento con QDG
obviamente promovió la vasorelajación de una manera independiente del endotelio. Sin
embargo, la evaluación del tratamiento con QDG sobre la vasoconstricción y la
vasodilatación de las arterias pequeñas y medianas requiere más estudios.

Como los 2 canales iónicos más importantes en los VSMC, se ha demostrado que los
canales de calcio y potasio desempeñan un papel esencial en los procesos de
contracción y relajación del músculo liso.13–18 Por lo tanto, también exploramos el
mecanismo subyacente del efecto de QDG en la reducción de la vasoconstricción y el
aumento de la vasorelajación mediante la determinación de la activación de los canales de
calcio y potasio. Los resultados mostraron que el tratamiento con QDG tuvo efectos
similares en la promoción de la vasorelajación de los anillos aórticos desnudos de
endotelio precontractados con NE (1 μM) con o sin tratamiento con inhibidores del
canal K+ (incluyendo TEA, 4-AP, Gli y BaCl2), que sugirió que el tratamiento con QDG
promovió la vasorelajación de los anillos aórticos desnudos de endotelio
independientemente de los canales K+. Por el contrario, la inhibición de los canales de
calcio de tipo L utilizando verapamilo redujo significativamente la promoción de la
vasorelajación después del tratamiento con QDG en anillos aórticos desnudos de
endotelio precontracturados con NE (1 μM). Además, el tratamiento con QDG
obviamente atenuó la constricción de anillos aórticos aislados desnudos de endotelio en
una solución libre de Ca2+ que contiene K+ y NE. Además, QDG inhibió la afluencia de
calcio extracelular en las células A7r5. Tomados en conjunto, estos resultados
sugirieron que QDG indujo una reducción significativa de la afluencia de calcio
extracelular en las células A7r5, que podría ser uno de los mecanismos subyacentes de
QDG en la promoción de la vasorelajación y la reducción de la presión arterial elevada.
Sin embargo, el mecanismo subyacente de QDG en la reducción de la afluencia de calcio
extracelular debe explorarse más a fondo.

Recientemente, los estudios han demostrado que la activación de la vía PI3K / AKT
aumentó significativamente la entrada de calcio a través de la fosforilación del canal
Ca2+ de tipo Lvβ2 bis subunidad en un sitio de consenso AKT, que fue activada por
vasoconstrictores (incluida la angiotensina II) en VSMC a través del receptor AngII tipo 1
y se inhibió mediante el bloqueo selectivo de PI3K; esto sugirió un papel crucial para esta
isoforma PI3K en particular en la regulación de la contractilidad VSMC24–29 y que la
inhibición de la vía PI3K/AKT podría ser una estrategia para prevenir la disfunción de la
vasoconstricción y la vasodilatación durante el desarrollo de la hipertensión. Debido a
que el tratamiento con QDG atenuó significativamente la elevación de la presión arterial
y promovió la vasorelajación dependiente del canal Ca2+ de tipo L de los anillos aórticos
torácicos, evaluamos aún más el efecto del tratamiento con QDG sobre la activación de
la vía PI3K / AKT. Se encontró que el tratamiento con QDG suprimió significativamente
la activación de la vía PI3K/AKT. Estos resultados sugirieron que la supresión de la vía
PI3K/AKT podría ser uno de los mecanismos subyacentes del efecto de QDG en la
prevención o el tratamiento de la hipertensión. Sin embargo, las expresiones de PI3K y
pPI3K deben evaluarse más a fondo, junto con la parte posterior de la vía AKT. Además,
debido a que múltiples vías de señalización participaron en los complejos procesos de
vasorelajación y vasoconstricción, así como en el desarrollo de la hipertensión, la
evaluación del efecto del tratamiento con QDG en otras vías de señalización debe
explorarse en estudios futuros.
CONCLUSIONES
Encontramos que el tratamiento con QDG atenuó significativamente la elevación de la
presión arterial, promovió la vasorelajación y disminuyó la constricción dependiente de
Ca2+ de los anillos aórticos torácicos al suprimir la activación del canal Ca2+ de tipo L y
la vía PI3K/AKT.