UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ

FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

“AÑO DEL BICENTENARIO DEL PERÚ: 200 AÑOS DE INDEPENDENCIA”

“INFORME PRACTICA: 6 DETERMINACION
ESPECTOFOTOMETRICA DE CREATININA”

CATEDRÁTICO: ING. DE LA CRUZ CARHUAMACA, Mabel Cindy

CÁTEDRA: BIOQUÍMICA GENERAL

CICLO: V
ESTUDIANTE:
 ERQUINIO BRAVO, Lizbeth
 MOSCOSO LEÓN, Anabel
 PAULINO CANGALAYA, Leda

Ciclo académico
2021-I
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I. INTRODUCCIÓN
La creatinina es un derivado de los aminoácidos arginina, glicina y metionina, el cuerpo
la fábrica en el hígado, los riñones y el páncreas, además puede obtenerse a través de
una dieta rica en carne o pescado. Es un compuesto sumamente difusible y distribuido
de manera uniforme en el agua corporal, una vez formada la creatinina se difunde
lentamente en el torrente circulatorio, luego sale por la acción de filtración glomerular
del riñón que es útil del funcionamiento renal.
La determinación de creatinina es un indicador útil para evaluar la función glomerular
renal, así también para el diagnóstico de las enfermedades renales agudas o crónicas y
también para el monitoreo de la diálisis renal, teniendo en cuenta que la producción de
creatinina y su excreción sean iguales.
Es importante en el control de otras condiciones patológicas ales como obstrucciones
urinarias que son afectadas de próstata, vejiga, uréter, suspensión de la secreción de
orina a cálculos renales y daño a los riñones (nefropatía).
Actualmente en los laboratorios clínicos se emplean los métodos Jaffe cinético y punto
final para la determinación de creatinina en suero, lo cuales requieren de la preparación
de muestras y reactivos de trabajo. Este método tiene como desventaja la poca
sensibilidad ante pequeño cambios de concentración y un insuficiente intervalo de
análisis, lo cual limita su uso en pacientes pediátrico y geriátrico; es por ello que la
mayoría de laboratorios clínicos a nivel mundial prefieren los métodos enzimáticos.
Los métodos enzimáticos para este analito garantizan mayor especificidad, exactitud y
precisan dentro de la práctica diaria; con resultados comparables a un método de
referencia como la cromatografía liquida de alta eficacia, aunque existe diversidad de
métodos enzimáticos en esta práctica, el método que se aplicó para determinar la
creatinina, se realizó con la lectura en un espectrofotómetro y uso de un único estándar,
que principalmente es para la cuantificación de creatinina. Para ello se usó una solución
stock de creatinina (100mg de creatinina en 100 ml de HCl 0.1 N) y una solución
estándar de trabajo (0.6 ml de solución stock, 1 ml de HCl y agua destilada).
Los objetivos en esta práctica son los siguientes:

 Observar la aplicación directa y útil de la Ley de Lambert y Beer en los métodos

espectrofotométricos con uso de un único estándar, particularmente para la
cuantificación de creatinina.
 Ejercitarse en el uso del concepto de Factor de calibración para cálculos de
concentraciones en espectrofotometría.

II. REVISIÓN DE LITERATURA

La creatinina es el producto final del metabolismo muscular y se origina a partir de la
creatina por pérdida de una molécula de agua. Es un compuesto sumamente difusible y
distribuido de manera uniforme en el agua corporal. Una vez formada, la creatinina se
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difunde pasivamente en el torrente circulatorio, de donde sale por la acción de la

filtración glomerular del riñón, siendo un índice excepcionalmente útil del
funcionamiento renal. La determinación de la creatinina se utiliza en el diagnóstico de
las enfermedades renales agudas o crónicas y también para el monitoreo de la diálisis
renal. Como un marcador adicional, es importante en el control y monitoreo de otras
condiciones patológicas como obstrucciones urinarias por afectaciones de próstata,
vejiga, uréter; anurias reflejas secundarias a cálculos uretrales y nefropatías.
Actualmente en los laboratorios clínicos de nuestro país se emplean los métodos Jaffé
cinético y punto final para la determinación de creatinina en suero, los cuales requieren
de la preparación de muestras y de reactivos de trabajo. Estos métodos tienen como
desventaja la poca sensibilidad ante pequeños cambios de concentración y un
insuficiente intervalo de análisis, lo cual limita su uso en pacientes pediátricos y
geriátricos. Es por ello que los laboratorios clínicos en el mundo prefieren los métodos
enzimáticos. Los métodos enzimáticos para este analito garantizan mayor especificidad,
exactitud y precisión dentro de la práctica diaria; con resultados comparables a un
método de referencia como la cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) con este
mismo objetivo. Aunque existe diversidad de métodos enzimáticos, en este estudio el
fundamento de la técnica se basa en un método colorimétrico cinético en el cual se
forma la sarcosina luego de la hidrólisis de la Creatinina, debido a la acción de las
enzimas creatininasa y creatinasa. La reacción es catalizada por peroxidasa para obtener
quinoneimina, complejo de color púrpura, que se determina espectrofotométricamente
a 550 nm. Este método se considera como de gran necesidad diagnóstica para el Sistema
Nacional de Salud. Por esta razón, como parte de la asimilación de un método
enzimático colorimétrico de análisis cinético propuesto para la determinación de
creatinina en suero y orina; a partir de la transferencia tecnológica de una firma de
reconocido prestigio comercial en el campo de la química clínica; la investigación resulta
de interés para la Empresa de Producción de Biológicos "Carlos J. Finlay” de La Habana,
Cuba, por lo que es su objetivo validar el método enzimático colorimétrico de análisis
cinético para la determinación de creatinina en suero y orina desarrollado con reactivos
de producción nacional para su aplicación en los laboratorios clínicos.
MÉTODOS COLORIMÉTRICOS
Perozzi, (20179Los métodos colorimétricos se basan en la reacción de Jaffé, que data del
año 1886 (3). La creatinina reacciona con el ácido pícrico en medio alcalino formando un
complejo de color rojo a una longitud de onda entre 510- 520 nm. La creatinina no es la
única que reacciona, por eso es que tiene baja especificidad. Existen interferentes
positivos, entre ellos las proteínas, glucosa, acetoacetato, ácido ascórbico y ácido úrico,
e interferentes negativos, y de ellos el más importante es la bilirrubina. Frente a
muestras con bilirrubinas elevadas, los valores de creatinina se ven disminuidos porque
la bilirrubina en el medio alcalino se oxida a biliverdina formando un compuesto incoloro
que disminuye el color de la reacción. Otra interferencia negativa, pero que adquiere
más relevancia en neonatología es la hemoglobina de origen fetal, que a diferencia de la
hemoglobina del adulto, es resistente al álcali; de esta manera, hace que cambie
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lentamente el color a lo largo del curso de la reacción, alterando y disminuyendo la

coloración de la reacción.
MÉTODOS ENZIMÁTICOS
Actualmente, se está tendiendo a usar métodos enzimáticos porque son los de mayor
especificidad, exactitud y precisión, y dentro de la práctica diaria son los métodos de
laboratorio que tienen resultados más comparables a un método de referencia. Los
métodos enzimáticos permiten trabajar con muestras con concentraciones de
bilirrubinas de hasta 25 mg/dL, resultando ser los métodos de elección para medir
creatinina en neonatología. Además, no poseen otras interferencias tales como la
hemoglobina fetal, proteínas, glucosa, acetoacetato y cefalosporinas. Son un posible
método de referencia aplicable a los laboratorios de rutina. (Angerosa, 2018)
VALORES DE REFERENCIA DE CREATININA PROPUESTOS LUEGO DE LA
ESTANDARIZACIÓN
La estandarización de la metodología permite minimizar el sesgo en la determinación de
creatinina y, en consecuencia, unificar los valores de referencia. Los valores de
referencia de creatinina propuestos post-estandarización se muestran en la Tabla I y
varían según edad y sexo (6). Cabe aclarar que las embarazadas suelen presentar valores
más bajos de este analito. Al evaluar la creatinina y el IFG hay que tener en cuenta la
edad, el sexo, la masa muscular, el estado de nutrición del paciente y su función renal.
La generación de creatinina depende directamente de la masa muscular y en menor
proporción de la ingesta proteica. La pérdida de masa muscular, la desnutrición y la
restricción proteica que ocurren en pacientes con insuficiencia renal, pueden resultar en
una baja generación de creatinina. Cuando el IFG disminuye entre 25-50 mL/min, los
pacientes disminuyen su ingesta proteica por prescripción médica disminuyendo su
masa muscular y la generación de creatinina, por lo tanto la creatinina plasmática será
menor a la esperada para ese nivel de IFG. (Bioquím Clín Latinoam, 2011)
III. MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES

 Espectrofotómetro
 Tubos de ensayo de 50 mL
 Tubos de ensayo de 20 Ml
 Pipetas graduadas
 Pipetas volumétricas
 Cristales de oxalato de sodio
 Papel filtro - 2 ml Sangre
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REACTIVOS

 H2SO4 2/3 N
 Tungstato de sodio 10%
 Ácido piprico 15% (P/V)
 Solución de picrato alcalino (debe prepararse en el momento de la determinación
usando solución saturada de ácido piprico y NaOH 10% (proporción 1:1)
 NaOH 10%
 HCl 0.1 N

MÉTODO Y PROCEDIMIENTO

Precipitación de proteínas
Para la determinación de creatinina y de otros compuestos en sangre total, la
presencia de proteínas perturba las reacciones necesarias para su cuantificación por
ello es que debe realizarse un proceso previo (desproteinización) con el cual aparte
de remover las proteínas se logra:
Disminuir o impedir turbidez y opacidad.
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 Evitar formación de espuma Evitar formación de precipitados Hacer

posible la obtención de líquidos traslucidos (que absorben cierta cantidad
de radiación y deja pasar otra)
 El siguiente es un método químico de desproteinización que hace uso de
ácido como desproteinizante al desnaturalizar y precipitar la proteína por
cambio brusco de pH.
 Este método de desproteinización es conocido como “Desproteinización
de Folin-Wu”. El agente desproteinizante es el ácido túngstico obtenido
mediante la siguiente reacción:

 En esta reacción se observa que el ácido tungstico (H2WO1) es el agente

desproteinizante.
En un tubo de ensayo de 50 mL de capacidad colocar 2 mL de sangre oxalatada (con
anticoagulante), adicionar 14 mL de agua destilada, 2 mL de tungstato 10%. Agitar el
tubo después de cada adición. Observar la precipitación de proteínas de la sangre
por formación de un precipitado marrón chocolate por formación de
metahemoglobina oxidada. Filtrar a través de papel filtro rápido. Desechar el
precipitado y reservar el líquido filtrado como muestra clarificada.

Reacción de color (Reacción de JAFFE)

Rotular 3 tubos de prueba como: Blanco, St, Muestra, preparar la siguiente batería
de tubos:

IV. RESULTADOS Y DISCUCIÓN

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RESULTADOS

Nº TUBO REACTIVO BLANCO STANDAR MUESTRA

Solución de - 3.0 m -
creatinina Muestra
clarificada - - 3.0 m
H2O destilada 3.0 m - -
Solución de 1.5 m 1.5 m
picrato alcalino 1.5 mL
1:1
Preparado al
momento
Mezclado y agitado por inversión por 10 minutos y leído a 520nm

Cálculos:

Donde:
𝐶𝑠𝑡 = concentración del estándar
100 = para referir a porcentaje 𝐴
𝑠𝑡 = Absorbancia del estándar
𝐴𝑚𝑝 = Absorbancia de la muestra problema

Cr (mg) = 0.006 x 100 x 0.1

0.005 3ml
Cr (mg) = 0.4mg%
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DISCUSIONES:
Al evaluar la creatinina debemos tener en cuenta la edad y el sexo, la masa muscular, estado
de nutrición del paciente y su función renal. La generación de creatinina depende
directamente de la masa muscular y en menor proporción de la ingesta proteica. La pérdida
de masa muscular, la desnutrición y la restricción que ocurren en pacientes con insuficiencia
renal, pueden resultar en una baja generación de creatinina. (Di Gioia MC, 1976)
Según el Instituto de Cirugía Urológica Avanzada (2002). En otro caso el método enzimático
para medir creatinina, y que está disponible en el mercado es el que utiliza la enzima
creatinina-amidohidrolasa. El método consiste en cuatro pasos de reacción, pero en
definitiva lo que se mide es la disminución del NADH (lectura a 340 nm) (4).
A diferencia del otro método enzimático que es con lectura fotométrica fuera del rango UV,
éste es con lectura en UV. Este método está disponible en el mercado y tiene una excelente
correlación con el método de referencia.

Otro método enzimático para medir creatinina, pero que prácticamente ya no está en uso es
el que utiliza la enzima creatinina-deaminasa (5). A partir de la creatinina, por desaminación
se produce amonio como uno de los productos de reacción. El amonio es acoplado a una
reacción con el NADPH donde también se determina en el UV la disminución de NADPH a
NADP (lectura a 340 nm). Este método requiere de una preincubación para eliminar el
amonio endógeno que podrían tener las muestras, lo cual lo hace más engorroso, y por ello
se ha dejado de utilizar siendo reemplazado por el método descripto previamente.

La creatinina es un producto final del metabolismo muscular. Se origina a partir de la

creatina por pérdida de una molécula de agua. A su vez, la creatina se produce por hidrólisis
del fosfato de creatina, por acción de la creatin-fosfo-kinasa (CPK), apareciendo como
metabolitos de dicha reacción el fosfato energético y la creatina. El radical fosfato puede
aportar energía directamente por dicha reacción o a través de su acoplamiento a una
molécula de ADP para formar ATP y posterior hidrólisis por acción de ATPasa.

Según (anónimo 2012) en estudios realizados para la determinación de creatinina cinética,

tomando la cantidad de reacción a los 30s y a los 90s. Se puede notar, mientras se esperar
los segundos, el incremento de la medida de absorbancia en el espectrofotómetro. Por cual
trabajamos junto al espectrofotómetro para tener una medida más exacta y, al colocar el
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reactivo en la cubeta inmediatamente iniciar la medición de la absorbancia. El color del

reactivo fue azul, una vez actuado sobre la muestra y estándar resultó amarillo. Para
obtener el resultado se restó la absorbancia de los 90s menos la de los 30s, una vez
obtenido el resultado se dividió la muestra para el estándar y este resultado se multiplicó
para la cantidad conocida del reactivo estándar: 2 mg/dl. Así obteniendo el resultado de
0,66 mg/dl, el cual entra en el rango de la normalidad.

Según el Instituto de Cirugía Urológica Avanzada (2002) Los adultos con mucha masa
muscular pueden tener más creatinina en la sangre que la población normal. Las personas
ancianas, por otro lado, pueden tener menos creatinina en la sangre de lo normal.

V. CONCLUSIÓN

o Se observó que si es muy útil la ley de Lamber y Beer en el método que se

aplicó (de manera espectrofotométrica), ya que la lectura en el
espectrofotómetro resulto de acuerdo a la absorbancia de luz y las
propiedades del material que se usó, fue atravesado.
o Se realiza una determinación de creatinina, tomando la cantidad de
reacción por 10 minutos y se observa la medida de absorbancia en el
espectrofotómetro a 520 nm, el espectrofotómetro es muy importante
en la determinación de creatinina ya que nos da una medida más exacta.

VI. BIBLIOGRAFÍA

 Aranzamendi M, Calderón NB, Challa U, Gonzalo MP. (2016) La Creatinina [obtenido

de monografía, consultado el 29 junio 2021]. Recuperado de
https://www.monografias.com/trabajos109/cretinina/cretinina.shtml
 Carrión IR, García L, Suárez Y, Rodríguez B, Aja G. (2015) Validación del método
enzimático para la determinación de creatinina en suero y orina [obtenido de
Articulo]. Revista Cubana de Francia.
 Di Gioia MC. Medida de la función renal Nephron 1976; 16: 31-41.
 Fraga A (SAN), Inserra F (SAN), Alles A with IDMS traceable (gold standard) serum
(SAN), Gómez A (ABA), Mazziotta D (FBA). Creatinina values. J Am Soc Nephrol 2005.
Fundación Bioquímica Argentina-adecuado de Sociedad Argentina de Nefrología.
 Instituto de Cirugía Urológica Avanzada (2002). Creatinina. Recuperado de
http://www.urologia.tv/icua/es/diagnostics.aspx?cod=7
 Levey AS, Coresh J, Greene T, Marsh J, Nefrol Dial Transplant 2003; 23: Stevens LA,
Kusek J, et al. Expressing the study equation for estimating GFR.
 Bioquím Clín Latinoam, (2011). Creatinina en sangre: calidad analítica e influencia en
la estimación del Índice de Filtrado Glomerular. Recuperado de
https://www.redalyc.org/pdf/535/53521168003.pdf