Practica No.

7 TECNICAS DE TINCIÓN

INTRODUCCION:
En la mayoría de los casos, las bacterias se observan en frotis teñidos y no en estado vivo, ya
que el tamaño, la forma y la disposición de las células se aprecian mejor si estas se tiñen por medio
de reacciones con ciertos colorantes. Los colorantes pueden usarse como tinciones directas de
material biológico, como indicadores de desviaciones de pH en medios de cultivo, como indicadores
de oxido – reducción para demostrar la presencia o ausencia de condiciones anaerobias. Los
colorantes biológicos son derivados del alquitrán mineral (o de hulla). La estructura química básica
de la mayoría de ellos es el anillo de benceno, en general pueden contener dos o más anillos
conectados por uniones químicas bien definidas (cromóforos) que se asocian con la producción de
color.

En términos químicos los colorantes se denominan ácidos o básicos, lo cual no

necesariamente indican una reacción de pH en solución; un colorante básico es aquel constituido por
un agrupamiento de átomos orgánicos con carga positiva (catiónicos) que será la parte activa del
colorante y que tendrá afinidad por los ácidos nucleicos que se encuentra constituido por átomos
orgánicos con carga negativas (aniónicos) y por lo cual reaccionan con sustancias básicas, como
estructura citoplasmáticas. Un colorante neutro es una sal compuesta de un colorante ácido y un
colorante básico.

CLASIFICACIÓN DE LAS TINCIONES.

TINCIÓN SIMPLE: Una tinción simple se lleva acabo cubriendo con un colorante un frotis seco y
fijado al calor. Esta tinción es usada para teñir una gran variedad de microorganismos. El colorante
más utilizado para esta tinción es el azul de metileno de Loeffler.

TINCIÓN DIFERENCIAL: Las bacterias se diferencian unas de otras tanto física como
químicamente, así su reacción con algunos colorantes también es diferente, dando lugar a grupos
que se caracterizan por sus propiedades tintoriales. Dentro de esta clasificación encontramos a la
tinción de Gram y a la tinción de Ziehl – Neelsen, que se describirán a continuación:

TINCION DE GRAM.

Esta tinción es una de las más comúnmente usadas en microbiología, el mecanismo de

reacción de los colorantes de Gram, actúan en la estructura y composición de la pared celular.

Las bacterias Gramnegativas contienen un porcentaje más alto de lípidos que las bacterias
Grampositivas, la pared celular de las Gramnegativas son también más delgadas que las
Grampositivas por lo que no retienen el colorante inicial cuando se les agrega el alcohol acetona.

Está tinción utiliza cuatro reactivos que son: Cristal Violeta, lugol o yodo de Gram, etanol –
acetona al 95% y safranina. El cristal violeta que es el colorante inicial tiñe a todos los
microorganismos, a que es un colorante básico, en segundo lugar está el yodo que actúa como
mordiente para aumentar la afinidad entre el colorante inicial y la célula. El etanol actúa como
decolorante sobre el microorganismo, lavando el colorante inicial en caso de que no se afín con este.
La safranina es el colorante usado como contraste que teñirá a los microorganismos que no se
colorean con el cristal violeta.
Manual de Laboratorio De Microbiología 33
 Los microorganismos que retienen el colorante de cristal violeta después de la decoloración y
se ven de color violeta se conocen como microorganismos Grampositivos. Los Gramnegativos no
son capaces de retener el cristal violeta después de la decoloración y se contratiñen de rojo con el
colorante de safranina.

Figura 11.- Membrana de una Bacteria Gram Figura 12. Bacteria Gram negativa
positiva

TINCIÓN DE ZIEHL – NEELSEN.

Los bacilos Acido – resistentes se denominan así por que están rodeados por una envoltura
cérea que es resistente a la tinción. Por eso es necesario calor para que el colorante penetre en la
cápsula, una vez teñidos los microorganismos resisten a la decoloración.

Esta tinción consta de tres reactivos: Carbolfucsina, alcohol ácido al 3% y azul de metileno.
Los carbolfucsina se utiliza para la tinción primaria ya que atraviesa el material céreo de los bacilos
ácido – resistentes. Se aplica calor con la llama de una lámpara de alcohol o de un mechero para que
el colorante penetre en la cápsula. El alcohol ácido se utiliza para decolorar; las bacterias ácido –
resistentes no sufren decoloración mientras que otras bacterias se destiñen. El azul de metileno sirve
como colorante de contraste.

TINCIÓN NEGATIVA.

Los preparados con tinta china o nigrosina se usan para exámenes microscópicos directos de
cápsulas de muchos organismos, los finos gránulos de la tinta china dan un fondo semiopaco contra
el cual pueden verse claramente las cápsulas. Este método colorea fondo, dejando la célula incolora
y transparente. Existe una variante de esta coloración hecha por Bonifaz, donde se utiliza fucsina
para dar coloración a las células dejando incoloras las cápsulas, dando la imagen de un cielo
estrellado. Esta tinción se utiliza para detectar el hongo Cryptococcus neoformans, a las cápsulas de
Klebsiellas y algunas veces también para identificar espiroquetas las cuales no se pueden teñir
fácilmente con colorantes básicos.

RECOMENDACIONES PARA LA ELABORACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO.

Manual de Laboratorio De Microbiología 34

Para obtener un frotis bacteriano adecuadamente teñido que permita estudiar e identificar
correctamente los microorganismos, es necesario seguir ciertas recomendaciones.

1. Los portaobjetos para los frotis deben estar limpios, libres de grasa y polvo, sin ralladuras o
despostillados. Un portaobjetos sucio puede ocasionar pérdida de material y dificultad para
la localización del microorganismo en estudio.
2. Las muestras deben tomarse con el asa o la aguja de inoculación.
3. Un frotis de un caldo de cultivo, se aplica directamente al portaobjetos sin dilución. Cuando
se prepara de un medio sólido se debe colocar una gota solución salina isotónica, evitar
tomar una gran cantidad de inóculo, si no se obtendrá un frotis en el cual no se podrá hacer
una buena observación. Se recomienda fijar el frotis con calor, ya que esto ayuda a inactivar
las enzimas y adherir las células al portaobjetos, evitando que se desprendan en el proceso de
tinción. Una vez seco el frotis este deberá tener un color blanquizco.
4. Cuando se lleva a cabo el proceso de tinción, se debe respetar el tiempo indicado para cada
reactivo ya que en caso contrario se obtendrá un frotis que puede tener características
inadecuadas en la colaboración o en la morfología de las células.
5. Al lavar el exceso de tinción del portaobjetos con agua corriente se debe mantener el
portaobjetos en una posición paralela al chorro de agua. De esta manera se pierden menos
organismos que cuando el agua incide directamente.
6. Cuando un frotis está terminado se debe dejar secar antes de observarlo en el microscopio.
7. Los frotis mejor elaborados pueden escogerse para tomarlos como muestras permanentes.
Para su conservación es necesario que después de ser observados el frotis se lave con xilol
para eliminar el aceite de inmersión. Secar al aire. Se le añade al frotis una gota de bálsamo
de Canadá o permount, con cuidado se coloca un cubreobjetos, se hace presión alrededor de
tres minutos, se guarda la preparación de manera horizontal por dos semanas. También se
puede utilizar en caso de no contar con bálsamo de Canadá el barniz de uñas transparente.

FUNDAMENTO:

Los colorantes son preparados acuosos orgánicos que tiñen a los microorganismos de una
gran variedad de colores ayudando a su diferenciación.

OBJETIVO:

Conocer y aplicar las técnicas de tinción básicas más frecuentes.

PROCEDIMIENTOS

Manual de Laboratorio De Microbiología 35

 7.1 TINCIÓN SIMPLE

MATERIAL Y EQUIPO:

Portaobjetos
Asa bacteriológica
Mechero Bunsen
Microscopio
Puente de tinción

REACTIVOS:
Aceite de inmersión
Solución salina
Azul de metileno de Loeffler

MATERIAL BIOLÓGICO :
Cepas: Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

METODOLOGÍA:

1.- Preparar un frotis como se indica en la Figura No.13 dejándolo secar perfectamente.

2.- Cubrir el frotis con azul de metileno de Loeffler por un minuto.

3.- Lavar con agua corriente suavemente y dejar secar.

4.- Observar con el objetivo de inmersión.

Manual de Laboratorio De Microbiología 36

Figura 13. Procedimiento para realizar un frotis bacteriano.

Manual de Laboratorio De Microbiología 37

 7.2 TINCIÓN DE GRAM

MATERIAL Y EQUIPO
Portaobjetos
Asa bacteriológica
Mechero Bunsen
Microscopio
Puente de tinción

REACTIVOS:
Aceite de inmersión Cristal violeta
Desinfectante Lugol de Gram
Solución salina Alcohol-acetona
Metano Safranina

MATERIAL BIOLOGICO:
Cepas: Escherichia coli y Staphylococcus aureus

TÉCNICA:

1.- Se preparan frotis de las cepas proporcionadas de la manera indicada en la figura 13.
2.- Se recomiendan fijar las muestras biológicas con metanol por un minuto.
3.- Los frotis se tiñen con cristal violeta durante un minuto.
4.- Lavar con agua corriente.
5.- Teñir con lugol 30 segundos.
6.- Lavar con agua corriente.
7.- Decolorar con alcohol – acetona 30 segundos.
8.- Lavar con agua corriente.
9.- Se tiñe con safranina de 25 a 30 segundos.
10.- Lavar con agua corriente y dejar secar.
11.- Observar con objetivo 10X para identificar el campo, e inmediatamente pasar a objetivo 100X,
colocando una gota muy pequeña de aceite de inmersión.

INTERPRETACION
Microorganismos color violeta: Gram positivos.
Microorganismos color rosado: Gram negativos

Manual de Laboratorio De Microbiología 38

 7.3 TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN

MATERIAL Y EQUIPO

Portaobjetos
Asa bacteriológica
Mechero Bunsen o lámpara de alcohol
Microscopio
Aceite de inmersión
Puente de tinción
Desinfectante
Solución salina
Fucsina fenicada
Alcohol-ácido
Azul de metileno
Muestra en esputo sospechosa de Mycobacterium tuberculosis.

METODOLOGÍA

1.- Se prepara un frotis de la muestra, dejándola secar.

2.- Se cubre perfectamente con fucsina.
3.- colocar sobre un puente de vidrio el portaobjetos y con una lámpara de alcohol, calentar hasta
que haya emisión de vapores, durante 5 minutos, sin hervir, en caso de que el frotis llegase a secarse
se agrega más fuscina y se sigue el tiempo.
4.- Enjuagar con agua corriente.
5.- Decolorar con alcohol – ácido 30 segundos.
6.- Lavar con agua corriente.
7.- Teñir con Azul de metileno durante 30 segundos. Dejar secar el frotis.
8.- Observar con objetivo 10X para identificar el campo, e inmediatamente pasar a objetivo 100X,
colocando una gota muy pequeña de aceite de inmersión, observar.

INTERPRETACIÓN:

Microorganismos color rosa son conocidos como BAAR (Bacilos Ácido Alcohol Resistentes).

Esta tinción es utilizada principalmente para identificar el agente causal de la tuberculosis.

Manual de Laboratorio De Microbiología 39

OBSERVACIONES:

CONCLUSIÓN

BIBLIOGRAFÍA
1. INGRAHAM JOHN, INGRAHAM CATHERINE. Introducción a la microbiología.Reverte,
1998

2. TORTORA GJ. Introduccion a la Microbiología. (9ª Ed.) Ed. Panamericana. 2007

3. KONEMAN W.F. Diagnóstico Microbiológico texto y atlas en color. 6ª Edición. Editorial

Panamericana. 2008

4. MURRAY, P. R.; ROSENTHAL, K. S; PFALLER, M. H.: Microbiología Médica. (6ª Ed.)

Elsevier, 2009.

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