Análisis sistemático de orina. Nuevas metodologías automatizadas. Mérida de la Torre, F.J.

For Cont Lab Clin 2019;4;1-12

TEMA 4

ANÁLISIS SISTEMÁTICO DE ORINA.

Francisco Javier Mérida De la Torre

1
 ANÁLISIS SISTEMÁTICO DE ORINA. NUEVAS METODOLOGÍAS
AUTOMATIZADAS
Francisco Javier Mérida De la Torre
Jefe de Servicio de Laboratorio Clínico.
Área de Gestión Sanitaria Serranía de Málaga.
Servicio Andaluz de Salud.

ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN 6. RESUMEN
2. ANÁLISIS SISTEMÁTICO DE ORINA 7. BIBLIOGRAFÍA
3. CITOMETRÍA DE FLUJO 8. ENLACES DE INTERNET DE INTERÉS
4. MICROSCOPÍA DIGITAL EVALUACIÓN
5. PLATAFORMAS O INTEGRACIÓN DE
SISTEMAS

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Una vez superado el tema los alumnos serán capaces de abordar el estudio de las muestras de
orina mediante nuevas tecnologías:
1. Repasando aspectos semiológicos del estudio sistemático de la orina y las nuevas
determinaciones.
2. Aplicando los distintos elementos de la citometría de flujo al análisis de orina.
3. Integrando los conocimientos adquiridos en el flujo de trabajo de su laboratorio

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1. INTRODUCCIÓN
La orina ha sido uno de los especímenes que más precozmente ha estudiado el hombre por
la facilidad de obtención y observación de sus características (color, olor, sabor, etc.). A pesar
de ello, su estudio, desde el punto de vista del laboratorio, no ha seguido una evolución
continua como ha ocurrido con otros especímenes y no ha sido hasta un pasado reciente
cuando éste ha experimentado un cambio sustancial. Tradicionalmente, el estudio de la orina
se ha dividido en análisis sistemático (análisis de las principales características bioquímicas)
y sedimento (caracterización de los diferentes elementos formes y su cuantificación), sujeto
este último a una enorme variabilidad intra observador y con escasa reproductibilidad. El
estudio de la orina ha experimentado cambios hace relativamente poco tiempo,
permaneciendo hasta ese momento el panel de pruebas bastante limitado. Esta ausencia de
innovaciones en nuevos parámetros, unido a un volumen creciente de muestras a analizar y a
una importante automatización, han hecho que esta sección no sea de las más atractivas
para el profesional del laboratorio. El objetivo de esta unidad didáctica será, en primer lugar,
revisar las técnicas vigentes en el estudio sistemático de orina para adentrarnos
posteriormente en las nuevas determinaciones disponibles. En segundo lugar, conocer los
fundamentos básicos de las nuevas tecnologías en el escenario actual de los laboratorios
como es la citometría de flujo. Por último, aplicar e integrar estos conocimientos a los flujos de
trabajo de nuestros laboratorios en los que los resultados obtenidos por las tecnologías
empleadas deben formar parte de un árbol de decisión que nos ayude a un mejor diagnóstico
de la patología de los pacientes.
2. ANÁLISIS SISTEMÁTICO DE ORINA
Abordaremos un breve repaso de las determinaciones disponibles actualmente en las tiras
reactivas comúnmente empleadas en los laboratorios, para dar paso a las nuevas
determinaciones.
El fundamento teórico de la medición en el análisis sistemático de orina es por fotometría de
reflectancia. El espécimen entra en contacto con una tira reactiva que contiene diferentes
sustratos de reacción que virarán de color ante la presencia o no de determinadas
sustancias. Esta variación de color es detectada por un fotómetro y trasladada a resultados
cuantificados indirectamente. Los principales parámetros medidos son:
pH. Nos informa sobre la capacidad del riñón para concentrar de manera efectiva los
hidrogeniones. Oscilando su valor entre 5.5 y 6.5.
Densidad. Muestra la relación entre disolvente y solutos. Su valor oscila entre 1015 y
1025.
Proteínas. Inferior a 25mg/dL, debido a la capacidad del glomérulo para evitar la pérdida
de las mismas.
Glucosa. En situaciones normales debe ser indetectable.
Cuerpos cetónicos. Su presencia indicaría un fracaso del metabolismo hidrocarbonado
efectivo. Su valor debe ser nulo.
Urobilinógeno y bilirrubina. Inferior a 0.2 mg/dL y no detectable, respectivamente. Sus
aumentos informan sobre afectaciones hepáticas.
Nitritos. Clásico indicador de presencia de bacteriuria. En situaciones normales debe
ser indetectable. No debemos confundir con infección bacteriana por lo que su hallazgo
debe ser analizado cuidadosamente.
Hemoglobina. No debe detectarse. Ya sea en forma de hemoglobina o como
mioglobina, su hallazgo debe ser corroborado por el sedimento.
Leucocitos. No deben detectarse. Su presencia indicaría infección y daño glomerular.
Su hallazgo debe ser corroborado por el sedimento.

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 Hasta aquí quedarían reflejadas las determinaciones de lo que se suele llamar “tira de
nueve parámetros”. Sin embargo, la necesidad de avanzar en el diagnóstico precoz de
patologías como la diabetes y sus complicaciones ha motivado que determinadas empresas
hayan introducido el concepto de “tira de once parámetros” donde aparecen dos nuevos
parámetros relacionados en forma de cociente:
Albúmina/Creatinina. La inclusión de este parámetro en la tira supone un paso más en el
cribado de la nefropatía diabética. Un valor positivo obtenido en la tira reactiva del análisis
sistemático de orina nos orientaría sobre la necesidad de la cuantificación de
microalbuminuria mediante inmunoturbidimetría en un analizador convencional mientras que
un resultado negativo excluye ésta, no siendo necesarios análisis posteriores. El carácter de
cribado ofrece la posibilidad de analizar un importante número de muestras en muy poco
tiempo y la posibilidad de detectar casos patológicos en pacientes que no habían sido
diagnosticados. Este tipo de algoritmos reduce mucho el tiempo de análisis a la vez que
permite una mejor gestión de la muestra de orina de una manera más integrada.
3. CITOMETRÍA DE FLUJO
Aunque la técnica se descubrió a mediados de los setenta, su uso se orientó principalmente
al estudio de los elementos formes de la sangre. No es hasta hace, relativamente, poco
tiempo cuando esta tecnología es aplicada al estudio de las orinas. Básicamente, se trata de
un capilar de calibre muy reducido por el que hacemos pasar el fluido y las partículas que lo
forman de manera laminar a la vez que es sometido a la acción de una luz láser que al
interaccionar con los distintos elementos es recogida por diferentes fotomultiplicadores y
detectores.
La citometría con fluorescencia emplea dos sustancias que presentan apetencias por
estructuras diferentes lo que contribuirá a la mejor caracterización de estas. De un lado la
fenantridina que presenta una apetencia especial por los ácidos nucleicos lo que la hace de
elección para marcar los núcleos de los elementos celulares de la orina, leucocitos, bacterias,
etc. Por otro lado, la carbocianina que muestra especial apetencia por los fosfolípidos de las
membranas celulares. Estos elementos responderán de manera diferente a la acción de una
luz láser y según la luz dispersa, la fluorescencia y la impedancia detectadas permitirán
caracterizar los elementos formes ya sean celulares o no.
El elemento principal es el capilar (Flow cell) por donde va a discurrir el fluido, la orina en
este caso, previamente teñida con fenantridina y carbocianina. Sobre ese capilar va a incidir

Figura 1. Esquema de un citómetro de flujo. Imagen cedida por cortesía de Sysmex.

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una luz láser (laser diode) que proyectará su luz sobre el capilar. Para evitar que la luz se
pueda dispersar en varias direcciones se disponen dos elementos que van a ayudar a
concentrar la luz, una lente colimadora (colimator lens), que evita la dispersión proyectando
una luz donde todos los rayos tienen las mismas características, y una lente condensadora
(condenser lens), cuya misión será reunir en un punto concreto ese haz de luz sobre el
capilar. La luz que excita las partículas y células que discurren por ese flujo laminar y el efecto
de la luz sobre los elementos hace que se obtengan tres tipos de lecturas que son las
derivadas de la luz frontal, luz lateral y luz fluorescente.
- La luz frontal es de alta intensidad, informa sobre el volumen celular y su intensidad es
modulada por un dispositivo (Beam stopper) y corregida por una lente condensadora,
siendo registrada en un detector. Este sería el sistema de luz frontal (Front scattered light
system).
- La luz lateral se proyecta sobre un espejo dicroico cuya finalidad es dejar pasar la luz
fluorescente y no la luz lateral que es detectada por un fotodiodo. Ofrece información
sobre la complejidad celular como son los orgánulos y núcleo. Esto es lo que se
denomina sistema de luz lateral (Side scattered light system).
- La luz fluorescente, filtrada previamente por el espejo dicroico es modulada por un filtro
de interferencias y analizada en un fotomultiplicador necesario para intensificar la luz
recibida ya que es de muy baja intensidad. Sería el sistema de luz fluorescente lateral
(Side scattered light system).
Este esquema puede adquirir un mayor nivel de complejidad si añadimos más detectores
que operen en diferentes longitudes de onda, como ocurre en analizadores actualmente
disponibles. El uso de un detector que trabaje en la longitud de onda de 488 nm va a permitir
una mejor detección de la intensidad de la birrefringencia de los elementos formes. Por el
contrario, el detector que trabaja en la longitud de onda de 635 nm nos permitirá analizar de
forma más exhaustiva la complejidad interna de los elementos formes (figura 2).

Figura 2. Representación esquemática de un citómetro de flujo de

Para una mejor compresión gráfica de cómo se obtienen los datos de los elementos formes
analizados, se representa un esquema de funcionamiento (figura 3). Dependiendo del tipo de
elemento y de la respuesta a la acción de la luz láser, ésta será diferente si incide sobre el
citoplasma o bien sobre el núcleo. El análisis de la intensidad de la señal emitida al
interaccionar con las diferentes estructuras del elemento estudiado permitirá inferir el tipo de
que se trata.

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 Figura 3. Representación del mecanismo de detección de la señal emitida tras incidir
la luz láser en un elemento forme. Imagen cedida por cortesía de Sysmex.
El uso de los diagramas de dispersión obtenidos tras el análisis de una muestra requiere
cierto grado de adiestramiento. Para ello se detallarán a continuación varios esquemas
teóricos de los posibles hallazgos y su localización en base a los diferentes sistemas de luz
comentados anteriormente.
En la figura 4, se va a analizar el canal de sedimentos empleando el sistema de luz frontal
(S_FSC: Sediment channel_Forward Scattered light signal) y la fluorescencia de alta
intensidad (S_FLH: Sediment cannel Fluorescence signal high). El primero informará sobre
el tamaño, grosor y longitud de las partículas, mientras que el segundo se basa en la tinción
de las mismas.

Figura 4. Diagrama de dispersión empleando luz frontal y fluorescencia alta.

Analizando el diagrama, se observa como con muy escasa fluorescencia y con tamaño
variable se pueden localizar los diferentes cristales en la orina. A continuación, y también con
fluorescencia baja se situarían los glóbulos rojos que pueden presentar distintos tamaños.
Con intensidad fluorescente baja y tamaño bajo estarían localizadas las bacterias. Con
tamaño e intensidad fluorescente intermedia las levaduras y también próximos los
espermatozoides y con un tamaño mayor y con alta intensidad fluorescente los glóbulos
blancos.

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 Si se cambia uno de los sistemas de medida, empleando el sistema de luz frontal (S_FSC:
Sediment channel_Forward scattered light signal) como antes y la fluorescencia de baja
intensidad (S_FLL: Sediment cannel Fluorescence signal low) se observa como aparecen
nuevos elementos (figura 5). El primero informará sobre el tamaño, grosor y longitud de las
partículas, como ya se vio antes, mientras que el segundo se basa en la tinción de las mismas,
pero con una señal menos intensa.

Figura 5. Diagrama de dispersión empleando luz frontal y fluorescencia baja.

Si se compara este diagrama con el anterior se puede observar que prácticamente son
iguales a excepción de que han desaparecido los cristales y en el rango de fluorescencia alta
aparecen las células epiteliales.
A continuación, se va a analizar exclusivamente la fluorescencia, para ello se combinarán
dos canales de sedimento de luz fluorescente de baja amplitud (S_FLLW y S_FLLW2).
Informan de la longitud de las partículas (figura 6).

Figura 6. Diagrama de dispersión empleando luz fluorescente de baja amplitud.

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 En este diagrama se analizan por un lado la tinción de las partículas y por otro la tinción de
las inclusiones de las mismas. En esta representación gráfica, los glóbulos blancos se sitúan
en el margen inferior correspondiendo a escasa tinción celular y escasa tinción de las
inclusiones. A continuación, aparecen las células redondas pequeñas que han resultado ser
muy útiles en los casos de fallo renal, aunque su rendimiento en rutina aún está en estudio.
Respecto a las células epiteliales, que antes se localizaban en el margen derecho, con esta
nueva medición se sitúan en el centro. Por debajo de estas, se pueden localizar los cilindros
hialinos.
Finalmente, se analizará el canal de bacterias, muy útil para el cribado de urocultivos donde
esta técnica es “gold standard”, se combinan la señal la luz frontal (B_FSC: Bacterium
channel_Forward scattered light signal) junto a la fluorescencia de baja intensidad (B_FLH
Fluorescence signal high). La primera informa sobre el tamaño, grosor y longitud de las
partículas mientras que la segunda lo hace sobre la tinción de las mismas (figura 7).

Figura 7. Diagrama de dispersión empleando luz frontal y luz fluorescente de baja amplitud.
Imagen cedida por cortesía de Sysmex.

Se puede observar como el grueso del diagrama es ocupado por las bacterias mientras en
la zona de baja tinción se localizan los restos celulares. Este es el canal específico para
bacterias que incluso de manera orientativa puede informar sobre el tipo bacteriano
facilitando así una primera impresión diagnóstica.
4. MICROSCOPÍA DIGITAL
El “gold standar” para el estudio de las partículas en orina es el contaje con microscopía en
cámara. Obviamente, las cargas de trabajo crecientes, la necesidad de emitir resultados con
rapidez unido a unos precios más reducidos hace que las diferentes empresas del sector
hayan incorporado sistemas de microscopía digital a las plataformas de urianálisis. En
síntesis, se trata de un microscopio de 40X con captura digital y almacenamiento de
imágenes unido a una biblioteca de elementos formes que permite una caracterización de los
hallazgos y una propuesta de resultados que son configurables por el usuario. Una de las
características de estas plataformas que serán desarrolladas en el apartado siguiente es la
posibilidad de establecer reglas de uso combinado de diferentes sistemas de medición.

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5. PLATAFORMAS O INTEGRACIÓN DE SISTEMAS
Una de las grandes aportaciones que presentan las nuevas tecnologías en el laboratorio de
orinas es la capacidad de combinar diferentes sistemas de medición para establecer una
secuencia entre los distintos equipos que permitan hacer un diagnóstico más certero, más
rápido y a la vez que agilice el trabajo del laboratorio evitando la repetición de pruebas
innecesarias.
Actualmente, hay dos tipos plataformas disponibles en el mercado, aquellas que combinan
equipos de análisis bioquímico de la orina unido a un sistema de microscopía digital y
aquellas que combinan los tres sistemas integrados, es decir analizadores sistemáticos de
orina, citometría de flujo y análisis óptico.
Las primeras plataformas permiten que una misma muestra sea analizada desde un punto
de vista bioquímico y tras superar los filtros o reglas establecidas por el facultativo, pase de
manera automática a ser analizada mediante microscopía para la realización de su
sedimento o en caso de no superar estas reglas desestimar la realización de dicho estudio.
En este sentido hay que tener que todo laboratorio deberá diseñar sus propias reglas y éstas
dependerán del tipo de laboratorio, experiencia en este tipo de plataformas y consenso con el
resto de los profesionales implicados (figura 8). Una definición incorrecta de las reglas puede
ocasionar que más muestras de las deseadas pasen a sedimento o bien por el contrario que
algunas se queden sin procesar, perdiéndose una valiosa información.

Muestra de orina

Sistemáco

Si Leucocitos > ó = 75

Si Hemaes > ó = 10
Microscopía ópca

Si Proteínas > ó = 30

Si Nitritos = Posivo

Figura 8. Esquema de trabajo para una plataforma combinada de sistemático de orina y

Por el contrario, existen otras plataformas que combinan los tres sistemas de forma
secuencial, enlazando los resultados de un sistema con el siguiente (figura 9) En este caso
se combinan un sistema de análisis sistemático de orina, un citómetro de flujo y un sistema de
microscopía digital. Presenta la ventaja de disponer la citometría de flujo que es “gold
standar” para el cribado de urocultivos, si esta actividad está en nuestra cartera de servicios,
mostrando un rendimiento mucho más alto que el sembrado tradicional. Una de las
características que presentan estas plataformas es la capacidad de repetir una muestra si
existen discrepancias ente el resultado del sistemático de orina y la citometría, en estos
casos recomendamos repetir y pasar a microscopía digital y validación manual.

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 Muestra de orina

Sistemáco

Si Leucocitos > ó = 2 M
C ic
it Si proteínas > ó = 4 ro
o
m sc
Si Hemaes > ó = 3 e o
tr p
ía Si Cristales > ó = 1 ía
d ó
Si Proteínas > ó = 4 e p
fl ti
u ca
jo Si Cilin. Patolog. > ó = 1
Si Nitritos > ó = 2

Figura 9. Esquema de trabajo para una plataforma combinada de sistemático de orina,

Tanto en uno como en otro caso hay que añadir que, a partir de estos esquemas básicos, se
puede añadir mucha más complejidad si se deciden elaborar reglas de autovalidación o
validación automática, validación facultativa, etc.
Una de las mayores ventajas que presenta el uso combinado de las tres plataformas es
como prueba de cribado ante la demanda de urocultivo. Frente a la práctica habitual de
sembrar las orinas y evaluar su crecimiento o no, se plantea la alternativa validada y
actualmente técnica de referencia por la que la negatividad obtenida por el uso de la tira y
sobre todo del citómetro, excluiría la necesidad de realizar el urocultivo. Quedarían excluidos
las pacientes embarazadas, los pacientes pediátricos y los enfermos renales por sus
especiales características, donde la negatividad del estudio por citometría no excluiría el
urocultivo. Aunque la recomendación es el empleo de la citometría de flujo, la práctica
asentada en muchos centros de microbiología hace que se siga realizando el urocultivo de
manera sistemática sin cribado previo o sólo mediatizado por el resultado de la tira de orina.
6. RESUMEN
El urianálisis ha experimentado un cambio en su realización, pasando de ser una técnica
con escaso compromiso tecnológico a verse afectada por todos los avances actuales. El uso
de tecnologías como la citometría de flujo, tradicionalmente reservada a análisis de mayor
relevancia ha irrumpido de forma importante en las rutinas de muchos centros. El manejo de
la misma y el conocimiento de su potencial así como sus limitaciones se ofrecen como una
potente herramienta para el estudio del urianálisis. Sumado a esto está la cada vez más
creciente tendencia al uso de plataformas integradas que combinan diferentes metodologías
de trabajo y que permiten sistematizar y estandarizar los análisis de orina de una manera
rápida, segura y efectiva mediante el uso de reglas y algoritmos.

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7. BIBLIOGRAFÍA
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8. ENLACES DE INTERNET DE INTERÉS
1. International Society of Nephrology: https://www.theisn.org
2. Sociedad Española de Nefrología: http://www.senefro.org
3. American Journal of Kidney Diseases: https://www.ajkd.org
4. Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica:
https://seimc.org
5. International Society for Infectious Diseases: http://www.isid.org
6. International Society fod Advancement of Cytometry: http://isac-net.org
7. American Society of Nephrology: https://www.asn-online.org
8. Asociación Española de Nefrología Pediátrica. http://aenp.es

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EVALUACIÓN
1. El fundamento teórico del análisis sistemático de orina con tira reactiva es:
a. Inmunoturbidimetría
b. Nefelometría
c. Fotometría de reflectancia
d. Enzimoinmunoensayo
2. ¿Qué parámetro no encontraremos en una tira de orina?
a. Bacterias
b. Leucocitos
c. Glucosa
d. Proteínas
3. ¿Qué parámetro nuevo podemos encontrar en las tiras de orina de once
parámetros?
a. Creatinina/proteína
b. Albúmina/proteína
c. Proteína/creatinina
d. Albúmina/creatinina
4. Identifique cuál de los siguientes elementos no forma parte de un citómetro de
flujo.
a. Luz láser
b. Fotomultiplicador
c. Calibrador
d. Detector
5. La citometría de flujo por fluorescencia emplea sustancias que tienen especial
apetencia por determinadas estructuras con objeto de mejorar su caracterización.
Indique qué elemento forme no presentará fluorescencia positiva si empleamos
fenantridina?.
a. Leucocitos
b. Hematíes
c. Bacterias
d. Espematozoides
6. Indique la utilidad del espejo dicroico empleado en los citómetros de flujo.
a. Captar la luz frontal dispersa
b. Reunir en un punto concreto el haz de luz
c. Filtrar la luz fluorescente pero no la lateral
d. Incrementar la intensidad de la luz fluorescente
7. En el diagrama de dispersión o escategrama de luz fluorescente (FLH/Fsc), ¿dónde
localizaremos los leucocitos?
a. Esquina superior derecha
b. Esquina superior izquierda
c. Esquina inferior derecha
d. Esquina inferior izquierda

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8. Indique la afirmación correcta
a. Las bacterias presentan mayor fluorescencia que los leucocitos
b. Los hematíes presentan menor fluorescencia que los leucocitos
c. Los cristales presentan una alta fluorescencia
d. Los cilindros no tienen fluorescencia
9. La técnica de referencia para el cribado de urocultivos es:
a. Citometría de flujo
b. Siembra sistemática
c. Fotometría de reflactancia
d. Impedanciometría
10. Una de las siguientes afirmaciones es una ventaja de las plataformas integradas en
urianálisis:
a. No permiten el uso de diferentes tecnologías
b. Supone la manipulación excesiva de la muestra
c. Permite trabajar con reglas para optimizar los procesos
d. Aumenta el tiempo de proceso

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NOTAS

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c/ Modesto Lafuente, 3 - entreplanta C y D
28010 Madrid
Tel.: 91 593 84 90 - Fax: 91 593 01 34
Correo electrónico:
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