REVISION DE LYTERATURA A. Bloseparaciones Bn los procesos biotscnolégices se realizan dos procesos fundamentales. 1 primero corresponde a los procesos biolégicos para la formacién del producto y el segundo a las operaciones necesarias para su separacién, Al conjunto de éstas Gltinas se les conoce cono bicseparaciones y son las més importantes después de la fermentacién. Su inportancia se debe a que representan hasta un 60% del costo de 1a produccién total dependiendo del grado de pureza, el origen y destino del producto. Los procesos de bioseparacién pueden describirse en cuatro etapas: primero 1e remocién de insolublee, que consiste en clarificar el caldo que sale del fermentador mediante operaciones de filtracién 6 centrifugacién; e1 aislamiento del producto 0 concentracién del misno utilizando cualesquiera de las siguientes operaciones: evaporacién, ultrafiltracién, Gonosis inversa, precipitacién y destilacién, entre otras; La tercera seccién es purificacién, 1a cual depende de las caracteristicas del producto que se desea obtener involucra operaciones de extraccién con solventes 6 diferentes tipos de cronatogratia; por Gitime se tiene 1a seceién de acabade, con operaciones como 1a cristalizacién, secado 6 liofilizacién, que se utilican para garantizar la esterilidad y estabilidad del producto.. 6 Todas las operaciones de separacién se basan en las diferencias que existen en las propiedades fisico-quimicas de Jos compuestos del caldo de cultivo y su secuencia depende de Ja naturaleza del producto, si es intracelular 6 extracelular. Para hacer una buena seleccién del proceso de bioseparacién, se deben considerar las caracteristicas del producto y los aspectos tanto técnicos cono econénicos, para lograr procesos cada vez mas eficientes a menor costo (Belter y col.,1988). B. Operaciones Tipicas en un Proceso de Bioseparacién Los procesos de bioseparacién, involucran algunos pasos de recuperacién y purificacién de productos provenientes del biorreactor. Comprenden todos los tratamientos que reguiere el caldo de cultivo para 1a obtenc: n del producto en 4as condiciones de pureza y actividad deseadas (Kalk, 1986). 1. Seleccién del proceso de bioseparacion La seleceién del proceso de separacién involucra, desde el principio, la tona de decisiones sobre el grado de pureza exigido a1 producto y 1a concentracién en la que se desea obtener el mismo (Null, 1967). Se deben considerar tres conceptos muy importantes en la seleccién de un esquena depurificacién de cualguier producto: a) grado de pureza deseado b) fuente u origen del producto y ©) estrategia de purificacion (Asenjo, 1990). ‘ La fuente de la proteina enzinética, se determina segin e1 objetivo que se pretende, 1a cantidad de enzimas © enzimas seleccionadas que se desea obtener. Sin perder de vista 1a Aisponibilidad y el potencial de reproduccién de 1a fuente seleceionada. una vez fijadas 1a fuente de la proteina y el nivel de purificacién deseados es necesario seleccionar el nétodo 0 los métodos que nos pernitan conocer el estado de purificacién de 1a proteina (Giral, 1987). 2. operaciones en productos intracelulares , En la naturaleza, 1a nayoria de las enzinas y de las proteinas se localizan en las células biolégicas, dentro de éstac, la mayoria de las enzinas y proteinas se subdividen en pequefios sistenas innovilizados de organelos intracelulares, ee por esto que 1a primers alternativa que ee noe plantes en tun esquena de purificacién es la posicién de 1a proteina; si esta dentro de 1a célula o es excretada al nedio extracelular. (Giral, 1987).‘ 8 Cosecha de Células. El primer paso en un proceso para la recuperacién de productos intracelulares es 1a cosecha de células (Montesinos, 1992). En esta etapa, es importante considerar el periodo de produccién de 1a proteina, ya que seria inGtil tratar de aislarla antes de,que se produzca; asiniono se deben valorar las posibilidades de induccién para contar con mayor cantidad (Giral, 1987). La centrifugacién y 1a filtracién por membrana gon las Gnicas téenicas usadas para cosecha de células a gran escals Ronpiniento de Células. £1 segundo paso en 1a obtencién de los productos intracelulares es el: rompimiento de 1a célula, esta operacién puede realizarse de distintas maneras: 1) Medica nécanicos: molines de arena, agitacién a alta velocidad con perlas de vidrio y oscilaciones sénicas. 2) Medios fisicos: tratamiento térmico y choque ésmotico. |3) Medios quimicos: solventes organicos y detergentes. 4) Medios enziméticos: Lisozina, Papaina y 1a conbinacién de algunas de ellas (Asenjo, 1990). Frecuentenente, el rompimiento de bacterias y levaduras es realizado en honogenizadores a alta presién o en molino de perlas (Nontesinos, 1992). Remocién de Desechos Celulares. este término se refiere al proceso de separacién de la fraccién donde se encuentra 1a proteina problena después de la ruptura, Se puede encontrar en la fraccién de sobrenadante en forma soluble o precipitadapor lo que la centrifugacién es un proceso casi de rutina para la separacién de las dos fracciones que también dependeré de 1a naturaleza de la proteina, de 1a fuerza y el tiempo de centrirugacion (Girai, 1987). otras operaciones que tambien son utilizadas son: microfiltracién, filtres rotatorios al vacio, filtros prensa, filtracién profunda 6 extraccién. cuando se usa la operacién de centrifugacién a continuacién debe efectuarse un filtrado para eliminar las particulas més peque ae as cuales pueden ocasionar problemas en etapas posteriores como la cromatografia (Montesinos, 1992). 3. Operaciones en productos extracelulares Eliminacién de biomasa. La elininacién de bionasa es el primer paso que se realiza en un proceso de separacién, cuando el producto es extracelular, Los equipos més enpleados son: 1a centrifuga decantadora, los filtros prensa y de menbranas. (Montesinos, 1992). operaciones de alta resolucién concentracién. Después de 1a primera clarificacién del caldo obtenide del biorreactor o una vez rota la célula, el producto se encuentra diluido. En la concentracién de éste las operaciones usadas son: ultrafiltracién, extraccién, osnosis Anversa, evaporacién, precipitacién y destilacién.eC) Purificacién. Las operaciones de purificacién final dependen fuertenente de la pureza con que se requiere el producto, para productos de alta pureza, las operaciones de purificacién Einales con normainente 1a cromatografia y la ultrafiltracién. La cronatografia es una operacién que se realiza al final de un proceso, en concordancia con la regia heuristica “realizar las separaciones nés dificiles y caras al final". Existen varios tipos de cronatografia entre las cuales se encuentran: intercambio Lénico, filtracién por gel y afinidad. (Montesinos, 1992). c. Purificacién de proteinas . La purificacién de las proteinas es un paso muy importante en su procesamiento. Para separar una proteina del resto de los conponentes que se encuentran en la célula se utilizan las propiedades caracteristicas de las proteinas coo son 1a solubilidad selectiva, comportaniento cromatogrético y peso molecular. Para todas las etapas de purificacién es inportante conocer 1a actividad especifica de la enzima, es decir 1a actividad enzinatica por miligramo de proteina 1a cual nus permite caleular el grado de pureza de 1a proteina, con el peso total (Burgess, 1987). Pureza = Enzima / Proteina totalaa 1, Naturaleza del problema #1 problena de 1a purificacién de proteinas se comprende mejor cuando se considera 1a mezcla de macronoléculas que estan presentes en el, extracto celular aconpafiando a la proteina de interés. Estas otras proteinas estén presentes en el extracto junto con acidos nucleicos, polisacéridos, 1{pidos y pequeflas moléculas. Una proteina especifica podria estar presente por arriba del 10% o por debajo de una milésima parte del total de proteinas en la célula. El problema de 1a purificacién de la proteina de interés es la separacién de todos los componentes de la célula, especialmente las proteinas contaminantes fo deseadas. cuando una proteina es purificada para ser producida a gran escala, el nivel de purificacién depende del producto final; por ejemplo hay una diversidad de usos de las |Proteinas en las que no se requiere que éstas sean completamente puras, pero también existen otras reas como las que ce dedican a estudios enzinéticos y estudios quimicos de proteinas que requieren preparaciones de proteinas altamente purificadas, para medir sus bases fisicas y algunas de sus propiedades (Burgess,1967). En la Tabla 1 aparecen los requerimientos de pureza para diferentes usos de proteinas.a2 Tabla 1. cantidad de Pureza requerida para diferentes usos de proteinas Usos cantidad Pureza necesaria -requerida Inmunologia g-eg Anticuerpos policlonales aita Anticuerpos monoclonales Mediana Enzimologia ng Alta (295%) Proteinas fisicas ng-g Alta Quimica de Enzimas y Proteinas —mg-g Alta Estructura g Alta Investigacién de Enzimas ug-ng variable Farmaceutico ng-kg Muy Alta oom Enzimas Industriales kg-ton Variable, YOESREL Bee oye Fuente: Burgess, (1987).aa 2. Propiedades de las proteinas y su manejo en la purificacién una de las razones que explica 1a capacidad que se tiene en un laboratorio para purificar una proteina de una nezcla es que las proteinas varian considerablenente en sus propiedades fisicas y quinicas. La explotacién de esta diferencia entre las proteinas de interés y las dends que se encuetran en la nezcla, permiten disefiar una serie racional de pasos para su separacién. Entre estas propiedades, se pueden citar las siguientes: mamafio y Forma. La mayoria de proteinas varian en,tanafo desde péptidos con pocos aminoécidos y pesos moleculares de cientos de daltons hasta proteinas de gran tamafio que contienen por arriba de 3,000 aminoscides con pesos noleculares por encina de 300,000 daltons. £1 movimiento de una proteina a través de la solucién durante la centrifugacién o a través de pequenos poros en membranas, Lecnos, 0 geles es influenciado por el tamafio, asi cono por la forna de la proteina que puede ser globular 6 bastante asinétrica. carga de las proteinas, se determina por las cargas positivas y negativas de sus aninogcidos. $i una proteina contiene muchos residuos de Scido aspértico y glutamico, tendré una carga neta negativa y puede ser llamada proteina acida. Por otro lado, si tiene muchos residuos cono lisina, arginina,a4 y en algunos casos histidina, pueden considerarse proteina basica; obviamente 1a carga de una proteina es determinaaa por el pl de 1a solucién. Punto iscelécrico, el punto isceléctrico,, (PI), es el pli al cual 1a carga neta sobre 1a proteina es nula y es determinado por la curva de titulacién de las cargas positivas y negativas de los aminoscidos de las proteinas. El PI de las proteinas goneralnante ects en el rango de 4.5 - 2.5, Distribucién de cargas, Los residues de aminofcido cargados se distribuyen uniformemente en la superficie de la proteina o pueden estar agrupadas de tal manera que una regién sea muy positiva mientras que otra sea muy negativa. Tal distribucion de las cargas puede ser utilizada para la discriminacién entre proteinas. Solubilidad, Las proteinas varian drasticamente en su solubilidad en diferentes solventes. En unos pueden ser esencialmente insolubles y en otros solubles hasta niveles de niles de miligranos por mililitro de solucién. Las variables claves que afectan 1a solubilidad de las proteinas incluyen e1 pH, fuerza iénica y polaridad de solventes. Densidad. La densidad de la mayoria de las proteinas es aproximadamente 1.4 g/cm” y generalmente no es usada como una propiedad para fraccionamiento de proteinas. Sin enbargo, las‘ a5 proteinas pueden contener fracciones de fosfatos o fracciones de Lipidos que las hacen més 6 menos densas, respectivanente. Esto puede ser usado para que sean separadas del grueso de una awevla de pruteinas utilizande métodos de gradientes de densidad. . Hidrofobicidad, 1 ndmero y 1a distribucién espacial de residuos de aminodcidos hidrofébicos presentes en la superficie de las proteinas determinan la habilidad de la proteina para enlazarse a otros materiales hidrofébicos del empaque de una colunna cronatogréfica, y por lo tanto su capacidad de fraccicnamiento. Afinidad. Muchas enzimas se unen a sustratos, efectores, cofactores, tripletes de ADN y a ciertos iones metélicos cono por ejemplo cu”, zn, ca®, co” formando enlaces muy furtes. Estos enlaces pueden ser usados para ligar 1a enzima en una columna en la que el ligando apropiado o los iones metAlicos ha sido inmovilizado (Burgess, 1987). 3, Métodos de fraccionamiento Precipitacién. E1 fraccionamiento basado en precipitacién de 1a proteina puede lograrse modificando: el pH, la fuerza iénica, las propiedades dieléctricas del solvente, carga eléctrica y el tamafo.16 pH. Aunque no es uno de los métodes que més se utilizan, 1a manipulacién del pH permite eliminar facilnente algunos contaminantes. Una proteina es menos soluble a pH ieoeléctrico, que ee ol pit al cual 1a moléoula no tiene carga neta, En estas condiciones no hay repulaién electrostética entre moléculas de proteins vecinas, por lo que tienden a aglutinarse y a precipitar. Fuerza iénica. Las sales neutras influyen mucho en la solubilidad de las proteinas, por lo que es uno de los métodos casi obligados en cualguier purificacién proteica. A concentraciones bajas, las sales aumentan la solubilidad de muchas proteinas. Esto se debe a cambios en 1a tendencia de los radicales de los grupos aminos a ionizarse en la proteina.A medida que la concentracién de sales aumenta, 1a solubilidad de 1a proteina disminuye y, cuando la fuerza Aénica es suficientenente alta se llega al punto en que la solubilidad de 1a enzina es igual a su concentracién y 1a proteina precipita en solucién. £1 rango de concentracién en el cual precipita depende de: la naturaleza de la proteina, la naturaleza de 1a sal ahadida, la temperatura y el pil. Propiedades dieléctricas del solvente, La adicién de solventes orgdnicos neutros no miscibles con el agua, en especial el etanol y 1a acetona, disminuyen 1a solubilidad en agua de la mayoria de las proteinas globulares.v Algunos estudios cuantitatives han denostrade que 1a solubilidad de una proteina a un pi y una fuerza iénica fijos es una funcién de la constante dieléctrica del medio. Cono el Etanol tiene una constante dieléctrica més baja que la del agua, cuando éste se adiciona a una solucién acuosa de proteinas, aunenta las fuerzas de atraccién entre cargas opuestas y disminuye el grado de ionizacién de los grupos R de 1a proteina, estimulando 1a precipitacion. carga eléctrica, En cada molécula de proteina hay un cierto nGmero de grupos que pueden disociar o unir protones, formando en el primer caso aniones y, en el ‘segundo cationes. Debido a que cada proteina tiene una composicién y secuencia de sus aminodcidos distinta, tendra propiedades Scido-base caracteristicas. Los nétodos de separacién y andlisis de proteinas, en base a su conportamiento écido-base se pueden Aividir on treet cromategrafia de intercambio iénico, electroforesis y adsorcion. ‘Tamafio. Una caracteristica de las proteinas es el gran tanafio de ou molécula, propiedad que ce aprovecha en el disefio de nétodos relativamente sencillos para la separacién de otras moléculas de tamafio pequefo. Entre estos nétodos, los nas comunes son: aiélisis y ultrafiltraci6n, centrifugacién y cromatografia de exclusién molecular (Giral,1987).|. Enzinas Las enzimas son sustancias que se encuentran en las of lulas en cantidades pequefisinae y participan en todos lee cantiwe que se asocian al proceso de 1a vida. En cierta forma se puede considerar a las enzimas cono la parte activa de 1a eélula. Como las enzimas son proteinas © proteinas conbinades con otros grupos quimicos, poseen las misnas propiedades caracteristicas: se desnaturalizan con el calor, precipitan con Etanol 6 concentraciones elevadas de sales inorgénicas cono el Sulfato de Anonio y no dializan a través de menbranas seniperneables. Las moléculas de enzina son muy eficientes para acelerar 1a transfornacién de sustratos a productos finales. una sola molécula de enzina puede efectuar el cambio de 10 000 hasta 1 millén de moléculas de sustrato por minuto. Esta propiedad y el hecho de que 1a enzina no se consune ni altera durante 1a reaccién, nos explica porque se necesitan pequenas cantidades de enzina para que se efectGen los procesos celulares y todas las reacciones catalizadas por enzimas. Las caracteristicas més sobresalientes de las enzinas a) au alto poder catalitico. b) eu alto grado de especificidad por los sustratos. (Pelczar, 1977).Las enzimas son muy utilizadas en la industria Biotecnolégica principaimente, porque se pueden producir facilmente y en grandes cantidades mediante técnicas géneticas y pueden reutilizarse utilizando téenicas de inmovilizacién en Goportes inertes. Generalmente la accién de las enzimas, se describe por un modelo sencillo, donde 1a enzima Ey el sustrato S se combinan para formar el complejo enzima-sustrato BS, que deepuée ce ronpe para producir el producto P y liberar la enzima. En la reaccién: xa ke c+s == ep ==> P xe ke ki, ka, ka, ks son las velocidades especificas de las B. MStodoe para Medir Proteina y Actividad Enzinética. Antes de discutir la purificacién de una enzima, es importante entender los problenas involucrados en 1a determinacién de 1a cantidad de proteina y actividad enzinética en la muestra ya que éstos datos son necesarios para la investigacién y para muchos otros propésitos tales cono 1a deterninacién de pureza y evaluacién de rendimientos. (Burgess, 1987).4 aa @iferenciales de color en respuesta a varias concentraciones de proteina. gn algunas aplicaciones de 1a investigacién, e2 nétodo de Bradford renplaza al método de Lowry por las siguentes razones: ¢1 nétodo Bradford es més facil de usar requiere de un reactivo y 5 min para hacer 1a deterninacion comparado con tres reactives y 30 a 40 min de 1a determinacién de Lowry; 1a absorbancia del complejo colorante-proteina os relativanente estable y no es afectada por muchos de los compuestos que limitan le eplicacién de la determinacién de Lowry (Becker y col., 1990). 2. Determinacién de actividad enzinstica Para poder realizar un ensayo cuantitativo de la actividad enzinética es necesario conocer lo siguiente: a) La naturaleza de la reaccién catalizada. bb) Cudles son los cofactores y coenzinas necesarios. ©) Las concentraciones necesarias tanto para el sustrato cono para el cofactor 0 coenzina. 4) El pit 6ptino requerido. e) La temperatura éptina. £) Un nétodo analitico simple para determinar la desaparicion doi custrate © 1a aparicién de productos de 1a reaccién. (Pelezar, 1977). Para estudiar una enzima es necesario disponer de un nétodo para determinar su actividad catalitica. Los nétodos estan disefados para medir 1a velocidad de formacién deB 22 producto o la velocidad de desaparicién del sustrato, a menudo se mide 1a cantidad de producto formado en un periode de ‘tiempo mediante una determinacién a tiempo fijo. La forma en que se determina la cantidad de producto depende de sus propiedades quimicas y figicas. Si el producto es coloreado o puede sufrir una reaccién para producir un color, entonces puede medirse 1a absorbancia de la luz a una longitud de onda adecuada (método colorinétrico), 1a cual se Felacicna con 1a concentracién de producto presente en el momento de tomar la muestra. Los métodos espectrofotonétricos son muy Gtiles debido a que se puede seguir de forma continua el progreso de 1a reaccién mediante nétodos cinéticos (Bradley, 1982). . La actividad enzimética de @-Galactosidasa puede ser medida f&cilmente con sustratos cromogénicos, los cuales son reactivos que producen compuestos coloridos cuando son hidrolizados. -Galactosidasa es una enzima que hidroliza B-D-galactosidos como la lactosa. Un sustrato cromogénico comunmente utilizado es el o-nitrofenil-g-galactopiranésido (ONPG). Este compuesto incolore es convertide, en presencia de f-Galactosidasa en galactosa y o-nitrofenol. Este Gltino es color amarillo y puede ser medido en un espectrofotonetro Por su absorcién @ 420 nm. La cantidad de o-nitrofenel producido es proporcional a 1a cantidad de enzima presente bajo condiciones de exceso de ONPG, proporcionando un método de determinacién cuantitativa de @-Galactosidasa (Becker, 1987).F. obtencién de g-Galactosidasa Existen varios métodos para la obtencién de la enzina b-Galectosidasa en la Tabla 2 se presenta le comparacién de ties métodos de purificacién. Un método mas reciente que utiliza Escherichia coli nodificada genéticamente (Becker y col., 1990) ha sido utilizado para integrar técnicas biotecnolégicas. G. Usos de 1a enzima p-calactosidasa La @-Galactosidasa hidroliza a 1a lactosa en sus monosacérides glucoga y galactesa. eta enzima se utiliza desde hace algunos afios en 1a preparacién de productos deslactosados a base de leche o suero (Vassilis y Lépez, 1985) Los productos con lactosa hidrolizada presentan ventajas nutricionales, ya que favorecen el consumo de 1écteos por personas con intolerancia al disécarido (Nijpels, 1981). Por otro lado la Hidrolisis de la lactosa ofrece ventajas tecnolégicas debido a que la glucosa y galactosa son mis dulces y solubles que 1a lactosa, aunado a que ambos azdcares son més facilmente fermentados (Brodsky y Grootwassink, 1986). Al hidrolizar la lactosa se evitan problemas de eristalizacién en helados, leches condensadas y productos que gon elaberades con leche y suero dulce de leche. Asimismo, dado el mayor poder edulcorante que presentan la glucosa y la24 Tabla 2. Conparacién de nétodos de purificacién para 8-Galactosidasa Método 1 Método 2 Método 3) (Publicado, 1965) (Publicado, 1971) (Publicado, 1978) células de E.coli células de E.coli Células de E.coli Cosechadas por cosechadas por cosechadas por centrifugacion centritugacion centritugacion Rompiniento por Ronpimiento por Rompimiento por sonicacion sonicacion honogenizacién Fraccionamiento Fraccionaniento ‘Tratamiento con (NHs) 2804 con. (NH«) 250¢ con calor Precipitacién cromatografia de Precipitacién con (NH«) 2504 Afinidad sobre con. (NHe) 250 Agarosa cromatografia sobre DEAE Sephadex A-50 Produccién y Actividad Aproximadas Método a 2 3 Modo Batch Batch Senicontinuo Actividad Especifica (unidades/mg) 340 320 asa Rendimiento 39 o.18 25 g/h Gacesa, (1989).25 galactosa con respecto a la lactosa, se puede disminuir 1a cantidad de sacarosa a utilizar en productos lacteos que se emplean cuando la leche a sido deslactosada. Es importante senalar que este aunento del poder edulcorante no va asociado a un aumento del poder calorifico del producto, lo cual es importante para productos cono el yogurt natural, debide a que son consumidos frecuentemente por personas con problenas de sobrepeso. 1 pretratamiento de 1a leche con 1a enzina conduce a una acidificacién nas répida y segura. reduciendose e1 tiempo de coagulacién. En el caso del queso cuajada, ésta es mas firme pudiendose aumentar el rendimiento hasta un 10 & aproximadanente. La f-Galactosidasa es una enzima producida por una gran variedad de seres vivos: bacterias, hongos, levaduras, plantas y animales. fn la Tabla 3 aparecen las fuentes posibles de f-Galactosidasa.26 ‘Tabla 3. Fuentes posibles de 8-Galactosidasa. organismos superiores Plantas Aninales Durazno Intestino ‘Almenara, Tejide cerebral Albericoque Microorganisnos Bacterias Levaduras Hongos E. coli” K, lactis * N. crasa B, megaterium K, fragilis * A. niger” S. lactis ©. pseudotropicalis A. orizae L, bulgaricus W. roberstsit M, pucillus L. sporogenes * Fuentes utilizadas para la preparacién comercial de 1a Fuente: (Vassilis y Lépez, 1985).27 H. Cromatografia En un proceso de bioseparacién, 1a purificacién es el Paso que sigue a 1a concentracion, puede realizarse con una amplia variedad de técnicas cono 1a cronatografia, 1a precipitacién, ultrafiltracién y electroforesis. La cronatografia es comunnente realizada en una colunna enpacada con adsorbentes s61idos, s61idos porosos, 6 geles y fal igual que la adsorcién. Ambas difieren en el objetivo y necanisno de separacién; mientras que en la adsorcién la meta es concentrar el solute en un adsorbente para después elufrlo, en la elucién cronatografica el objetivo es purificar el producto, esto se ogra inyectando un puiso de muestra en 1a columna, este pulso entra a la colunna como un pico estrecho (concentrado) y sale en forma dispersa (diluido) por la adicién del solvente. A diferencia de la adsorcién que asocia el anélisis de su comportamiento a una curva de ruptura, a cronatografia se asocia a un conportaniento Gaussiano. En la cromatografia por elucién los componentes de 1a muestra salen a diferentes tiempos ya que son retardados de acuerdo a su afinidad por el adsorbete, que puede ser de intercambio ionico, de afinidad 0 exclusién cronatografica. La diferencia en el tienpo de elucién de los solutes de una nezela inyectada a la colunna es el origen de 1a purificacién (Belter y col., 1988).1. Tipos de cronatografia Za cromatografia abarca una gran variedad de técnicas de separacion sunanente efectivas. La caracteristica comin de todas ellas es que los componentes de 1g muestra se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria mientras que 1a otra se mueve a través de los insterticios o sobre la superficie fija del adsorbente. 1 desplazaniento de la fase mévil se manifiesta en una nigracién diferencial de los componentes de 1a muestra. De las muchas posibilidades de combinaci6n de materiales,de mecanismos de distribucién y de métodos de operacién de las columnas cromatograficas algunas ‘son de importancia comin, tales como: Cromatografia liguido-s6lido © de adsorcién. Ha sido amplianente usada en andlisis orgénico y bioguimico. £1 gel de silice 0 aldnina que presentan una superficie muy grande en relacién con el volunen y que tienen sitios quimicos actives, son los materiales de empaque tipicos para las colunnas. A nenudo el coeficiente de distribucién para la adgoreién depende de 1a concentracién total y esto constituye una Limitacién, pues esto se manifiesta en picos inclinados, con largas colas o sea en separaciones incompletas.29 Cromatografia de intercambio ionico, El procedimiento de intercambio iénico es una técnica muy efectiva y con poder de resolucién alto, La fase estacionaria esta conpuesta por una sustancia s6lida que participa realente en el proceso, Initeractuando directamente con los componentes de 1a mezcla. Estos materiales se llanan intercambiadores iénicos y la mayoria son materiales sintéticos (1lanados resinas) que se fabrican en forma de esferas pequefias con grupos ionizables unides a lo large de una cadena. come las particulas de resina estan estacionarias, el efecto de intercambio es retardar el movimiento de los solutes i6nicos a través de la coluana a medida que los materiales disueltos avanzan en la fase mévil. Los solutos con carga neta mayor interactuan con las particulas de resina con carga contraria en mayor grado; asi que estas migran mas lentamente a través de 1a colunna (Bohinski, 1987) . cronatografia de filtracién en gel. La cronatografia de filtracién en gel es una forma de particién cromatogrética donde las noléculas son separadas de una solucién de acuerdo a su tamafio efective, usando matrices de porosidad definida. El extenso uso de la cromatografia de filtracién en gel para la separacién de material polinérico, especialmente en nezclas de proteinas, puede ser atribuide a varios factores incluyendo costos relativanente bajos, simplicidad de operacién y habilidad para procesar relativamente grandes cantidades de material. Para estos aspectos preparativos 1a30 cromatografia de filtracién en gel puede ser usada para caracterizacién de productos (por ejemplo deterninacién del peso molecular), estimacién de la pureza del producto y en la caracterizacién de varias interaccionas moleciiares (¥Yarmish y col., 1985). . 2. Tipos de operacién Existen varias formas de llevar a cabo un proceso cromatogréfico, dependiendo de cémo se introduce la muestra y cono se desplaza a través de la fase estacionaria. Los nétodos més comunes son: elucién, desplazamiento y anélisis frontal, representados esquematicanente en la Fig. 14 descritos a continuacién. Elucién, La muestra se coloca en capa delgada en 1a parte superior de 1a colunna, 1a fase mévil inerte fluye a través de 1a colunna arrastrando los componentes de la muestra, las nolécuias se se Aistritnyen en las dos fasas y permanecen una cierta fraccién de tiempo en cada fase de acuerdo con el coeficiente de distribucién y la velocidad de la fase movil. Desplazamiento. En vez de la fase mévil inerte empleada en el método de elucién, 20 omplea una face névil activa para docplazar 1a muestra, practicanente en su totalidad, de la fase estacionaria. Los componentes de la muestra que nés se retienen tienden, a desplazar a los que se retienen menos.an Concentracién AL ml de efluente 2(a). Cromatografia de elucién concentracién ml de efluente 2(b). Cromatografia por desplazamiento Concentracién ml de efluente 2(¢). cromatografia frontal Fig.1. Fornas de llevar a cabo un proceso cromatogratico dependiendo de como se introduce 1a muestra y como se desplaza ‘a través de la fase estacionaria. Fuente: Pecksoc y Shields, (1963).32 Se desarrollan asi zonas, en orden decreciente de sus coeficientes de distribucién, y una zona desplaza a la innediata anterior hasta que todas han salido de 1a colunna. Anélisis Frontal. La muestra ce agrega cqnstantenente nezclada con la fase mévil. Dado que los componentes tienen coeficientes de distribucién diferentes, 1a colunna presenta capacidad diferente para cada uno. El que se retiene menos es el primero en salir, pero no lo hace hasta que 1a columna se ha saturado con el. (Pecsok y shields, 1983). I. Cromatografia de exclusién molecular , La cromatografia de exclusién molecular (CEM) constituye uno de los medics més poderosos y Gtiles para la separacion de proteinas entre si, en este tipo de cronatografia 1a mezcla de pkoteinas disueltas en un buffer apropiado se dejan fluir por gravedad a 1o largo de una columna empacada con particulas de un material inerte, de elevado grado de hidratacién, y que ha sido previanente lavada y equilibrada con 1a solucién buffer. Los materiales més comunes para el empaque de columnas son el Sephadex nombre comercial del polisacérido dextran; Bio-Gel, derivado comercial de poliacrilamida, y 1a Agarosa que es otro polisacérido, los cuales pueden estar preparados con diferente grado de porasidad interna, £n las colunnas de cronatografia por filtracién en gel, las proteinas de diferentes tamafiorr) molecular van penetrando en los pores internos de los granulos, en grados diferentes de intensidad, y descendiendo a 1o largo de la colusna a velocidades distintas como se muestra en la Fig. 2.: E1 volumen hidrodinémico de una nolécula pequenia permite que esta pueda penetrar nds efectivamente en el interior de 1a fase estacionaria removiendose del flujo de solvente para penetrar en los pores, consecuentenente los componentes pequefios comparados con los interticios de 1a matriz atraviezan 1a colunna muy lentamente y aparecen nas tarde en el cromatograna (Fig. 3c). Las moléculas grandes, comparadas a la porogidad de 1a matriz con completamente excluidas de la fase estacionaria y se mueven répidamente a través de 1a colunna, apareciendo primero en el cromatograma (Pig. 3a). Las noléculas de tamafio intermedio entran a los interticios pero tardan menos tiempo dentro de la fase estecionaria que las particulas pequefas (Pig. 3b). Estos componentes atraviezan a velocidades consistentes con su tamafo particular. A partir de las medidas de concentracién de proteinas en pequefias fracciones del eluato se puede construir una curva de elucién como la que aparece en la Fig. 4. La cronatografia de exclusién molecular puede ucilizarse tampicn para separar mezclas de otras clases de macronoléculas asi cono bicestructuras muy grandes, por ejenplo, virus, los ribosonas, nicleos celulares o incluso bacterias, simplemente utilizando resinas 0 geles con Giferentes grados de porosidad interna (Lehninger, 1970).Fig. 24 ae Ne aa SegSES . ad Bee + Separacién de 2 proteinas de diferente tamafo en una columna de exclusién molecular, (a) Una mezcla de proteinas entra en la colunna, (b) las proteinas se empiezan a separar, (c) Las proteinas se separan y pueden ser colectadas en fracciones, (d) las moléculas pequefias penetran en-los poros del gel y son retardadas, (e) las moléculas grandes no pueden penetrar en los poros y son excluidas. Fuente: Lenhinger, (1970).Pig. 3. Representacién esquematica de la cromatografia de exclusién molecular: (a) Las moléculas grandes no penetran en el gel y aparesen primero en el cromatograna; (b) Las moléculas de tamafio intermedio se retardan un poco y aparecen después de las grandes; (c) Las moleculas mas pequefias penetran en el gel y aparecen al final en el cronatograma. Fuente: Yarmush, (1989).Fig. 4. 26 : g A B | c Eo 100,000 67,000 25,000 ae bks 60 70 80 30 700 Volumen de elucion, ml Elucién de proteinas en una columna de exclusién molecular y determinacién del peso molecular; para caliprar 1a colunna se pasan a través de le columne tres proteinas de peso molecular conocido (A,B, y C) y se grafica el volumen del pico de elucién contra el logaritno de sus pesos moleculares. Fuente: Lehninger, (1970).1. Materiales EL componente nas importante en el disefio de una separacién por exclusién, es el material de enpaaue de la Golumna, ya que esta caracteristica tiene un gran efecto sobre el tamafio de 1a colunna, sobre lo que ocurre a través de ella y en la eficiencia de separacién. Los’ parémetros importantes en la seleccién del material de enpague apropiado son: Reactividad. £1 material de empaque ideal debe ser inerte con respecto a las proteinas u otros compuestos que estan siendo separados. En la practica esto significa que el material de enpaque debera ser hidrofilico debido a que las proteinas tienden a adsorberse y se desnaturalizan irreversiblenente sobre superficies hidrofobicas. Los enpagues que tienen cargas en su superficie se consideran generalmente indeseables pprque las cargas introducen efectos electrostéticos. una proteina cargada es entonces atraida o repelida por el empaque lo cual disminuye o aunenta 1a velocidad de paso a través de la columna. Los empaques altanente cargados no pueden ser usados debide a gue las proteinas son irreversiblenente adsorbidas. Rigidez, Los materiales de empaque generalnente se clasifican en 2 grupos conpresibles y rigides. Algunos de ellos se presentan en la Tabla 4. Debido a que 1a caida’ de presion atravieza un Soperte compresible, la velocidad de flujo seTabla 4. Materiales de empaque compresibles y rigidos. Tango Bet Fas (CPeas Meaio pi °c (ensn)__ (en #20) Empaques conpresibles Dextran, entrecruzado >2 >i2z0 <7, 60-38, Dextran, bisacrilamida 3-21 9120-25-40. 300-70 Poliacrilamida 2-10 120, >2.8- 100-20 Agarosa 49 40 np 100-30 Agarosa, poliacrilanida 3-10 40 so-8 Das agarosa, entrecruzada 3-14 e120 30-25 120-50 celulosa asa 220 np* ND Empaques rigidos superficie modificada de vidrio. <2 >1z0 Superficie modificada de silica entrecruzada <2 >120 Hidroxietilnetacrilato entrecruzado ND >120 + Temperatura méxina » Flujo maximo © Caida de presién méxina 4 ND = Dato no disponible Fuente: Dechow, (1989).39 increnenta hasta un maximo y declina. Esta linitacién de 1a velocidad de flujo méxima conduce a largos tiempos de separacién. Por otra parte, la limitacién por e2 tamano de 1as particula no es muy severa cuando se nanejan materiales rigidos. tas particulas peguefas aunentan la eficiencia de separacién por 1a reduccién de la resistencia intraparticula a la transferencia de masa y a la dispersién. Por lo tanto de pueden emplear colunnas de volumen pequefio para una separacién dada, conduciende a bajos costos y cortos tiempos de separacién. Estabilidad, £1 material de empaque debe ser insoluble y estable en el rango de pH y temperatura al cual es*expuesto. Por lo tanto, éste no debe ser degradable por los solventes, sales caétropicas o bacterias. Distribuci6n del tamafio de poro. La distribucién del tamaiio “ae poro requerido es determinada por 1a aplicacién particular. Por ejemplo cuando se desea desalar una soluci6n particular de macronoléculas, se necesitan poros muy pequefios para que las macronoléculas de interés sean exclufdas del poro de la matriz. Por otre lade la separacién de proteinas requiere de clerta diferencia de accesibilidad al poro de las proteinas individuales para que ccurra una adecuada separacién (Yarmush, 1989). Desarrollos recientes han permitido 1a introduccién de nuevos materiales; actualnente los soportes nas utilizados son: 40 los geles de dextran entrecruzados, poliacrilamida, agarosa y combinaciones de ellos. De los goles ol més ompleado para 1a purificacién de 1a mayoria de las macromoléculas de interés bioquimico se prepara a partir de dextran, polisacaride que se sintetiza por accién de 1a bacteria Leugonostoc mesenteroides sobre la sacarosa. Las unidades de glucosa tienen tres grupos oxidrilo libres que confieren al dextran un caracter polar, La reaccién de entrecruzamiento se efecttia con epiclorhidrina, CHe-cHCHeCh: Nol variando las condiciones se puede controlar cuidadosamente e1 nimero de enlaces cruzados y, por lo tanto, el tamafio de poro. Los geles de sephadex son insolubles en agua, y estables frente a bases, 4cidos débiles, agentes reductores y oxidantes suaves. #1 sephadex es Suceptipie al ataque bacteriano, por lo tanto debe almacenarse en presencia de un agente antimicrobiano. Es estable con respecto a la , temperatura hasta 120°C. Los geles se clasifican por 1a cantidad de agua que recuperan, esta caracteristica es una funcién de la cantidad de enlaces cruzados o de 1a holgura de 1a estructura. En la Tabla 5 aparecen algunas propiedades de los geles de exclusién (Pecsok y Shields, 1983).Tabla 5. Algunas propiedades de los geles de exclusion. an Nombre ‘comercial Sephadex’ 6-10 G15 G25 6-50 c-75 G-100 G-150 G-200 Bio-cel® P=, Poa P-6 P10 P-30 P60 P-100 P-200 =300 Biu-cel® 720.5n, ACLiSn A-5.0m, A-15m A-50m, Ar150n Peso molecular rango de < 700 = 1500 900-5 000 500-30 000 000-70 000 000-250 000 000-400 coo 000-800 000 200-2600 1 000-5000 5 000-17 000 20 000-50 000 30 000-70 000 40 000-200 000 80 000-300 000 100 000-400 000 <500 000 <1 500 000 <5 000.000 <15 000 000 £15 000 000 <150 000 000 Retencién gu fraccionamiento (ml/g gel) a Volumen de lecho (ml/g gel) 12 a5. 20 20 35 40 Sephadex es un polinero de dextran entrecruzado con epiclorohiarina. » Bio-Gels P son geles de poliacrilamida. © Bio-Gels A son geles de Agarosa. Fuente: Dryer, (2929).el a ») ° a e £) ‘ 42 Los siguientes son parémetros que hay que considerar en material poroso: Forma de particula: generalnente redonda. ‘Tamafio de particula: Se expresa con el niimero de malla, que se expresan con un nimero 0 con palabras, burdo, mediano, fino y extra fino. Tamafio de poro: Se expresa en micras o més comunnente cono Limite de exclusién. Limite de exclusién: Se expresa con un nGmero inferior y otro superior, y representan el peso molecular de moléculas que pueden penetrar en los poros. Aquellas moléculas de peso molecular superior al nimero superior del Limite de exelusién se dice que se excluyen del fraccionimiento o sea que no penetran en los poros, y saldran al principio de la welucién. Las moléculas de peso molecular mefor al ninero interior aéi 1imite de exclusion, si penelearau pere por ser tan pegueflas pasarén sin fraccionarse. Ganancia de agua: Es la cantidad de agua que las particulas de sephadex van a unir para formar el gel cuando se pone en contacto con agua para cu hidratacién. Volumen de empaque: Son los mililitros de lecho o empaque que dar un grano de sephadex seco, cuando éste ya ha sido completamente hidratado (Garcilaso, 1983).2. Equipo El equipo necesario para CEM incluye 3 elerentos bésicos: E1 solvente de elucién, una columna empacada y tubos para eélectar fracciones. algunos arreglos nodgrnos no solanente ineluyen 1a interconeccién de estos elexentos, sino que cuentan con un equipo autonatizado con capacidad de onitoreo ae varios parénetros dei sistena, un arreglo tipico para opérar en un Jaboratorio cuenta con los siguientes elenentos, los cuales se presentan en la Fig. 5. Bl solvente de elucién (2) es bombeado a través de 1a colunna con una bonba peristaltica (2), alternativanente s@ puede usar alinentacién por gravedad en lugar de una bomba. la muestra se ihtroduce a través de un puerto de la vélvula de 3 vies (2) y es bonbeada a través de la colunna (4) en una direccién descendente o ascendente; 1a muestra separada es identificada por un agtector (5) conectado a un graficador (7) y colectado en volunenes predeterminados en tubos en un colector de fracciones (6) (Yarmush, 1989).Fig. 5. Equipo utilizado para cronatografia de exclusion. (1) Solvente de elucién, (2) Vélvula de 3 vias, (3) Bomba peristaltica, (4) Colunna cromatografica (5) Detector de concentracién, (6) Colector de fracciones, (7) Graficador del cromatograma de elucién. Fuente: Yarmush, (1989). 4445 3. Aplicaciones de la CEM Las diversas técnicas de cronatografia y electroforesis se enplean extensamente para prépositos cono: a) aislamiento y purificacién de un gran ndnero de sustancias. b) medicién de peso molecular de polineros. ©) caracterizacion de atrerentes aspectos ae 1a estructura de las sustancias. @) evaluacién de 1a pureza de sustancias aisladas. Otro importante uso de la cronatografia de exclusién es en los cases de purificacién de proteinas que pueden estar contaminadas por sales o especies similares de pequefias moléculas. En este caso es posible desalar un producto pasandolo a través de la colunna de exclusién en gel, que nto Justamente excluye el producto daseado pero admite Libr las especies contaminantes. £1 producto puede eluir en el volumen vacio mientras que los contaminantes son retardados e! los poros del gel (Dryer, 1989).46 4. Teoria La Cromatografia de exclusién molecular es considerada una forma de particién cromatografica donde los componentes gue se separan son distribuidos entre dos fases: una fase névil y una fase estacionaria. £1 proceso de separacién requiere una matriz de gel empacada en una columna rodeada por el solvente. £1 volumen total de 1{guido en el lecho pueden ser divididos en dos partes distintas: (1) Las moléculas de solvente dentro del gel o volumen interno vi (fase estacionaria) y (2) el volumen insterticial o volunen fuera del lecho de gel Ve a través del cual el solvente fluye (fase mévil). . 1 comportamiento de un soluto particular es comunnente representado por el volumen de elucién, Vs, éste volumen es el requerido para transportar el soluto a través de la columna desde que entra 1a muestra hasta que sale su concentracién maxima. Las moléculas totalmente excluidas de el volunen interno de poros (V1) eluyen con el volumen vacio: Ve = Ve @ Si el volumen interno es totalmente accesible al solute entonces su volunen de elucién esta dado por: Ve= Ve + vi @) Ve es el volumen requerido para que el soluto salga. Los“7 solutos que son parcialmente excluides de los poros eluyen con un volumen descrito por la ecuacién : Vem Vo + Ke Vi @) donde e1 coeficiente de particién Ki es definido cono 1a fraccién de el volunen interno disponible para el soluto. Rearreglando 1a ecuacién anterior se tiene la siguiente expresién para Ks: Ka = (Ve - Vo) / Vi a) Cuando Ve = Vo, Ki = 0; y cuando Ve.= Vi + Ve, Ke = 2. Los valores de Ki mayores que 1 indican adsorcién u otros efectos de interferencia, Estes relaciones entre el volunen de elucién y otros parametros volunetricos se muestran en la Fig 6. Ks es un parénetro conveniente cuando se conpara la separacién resultante obtenida con difrentes colunnas, ya que éste es independiente de el tanafio de lecho y densidad del empaque. Sin embargo el valor obtenido para Ks puede ser imprecise ya que depende de Vi, el cual en algunos casos es un valor estinado. Por ejemplo Vi puede ser calculado por la siguiente expresién: Wea W (5) Donde, a, es igual a la cantidad de gel seco (gramos) y Wr, es e1 agua retenida por el gel (g de #20 x g de gel / p #20); donde p es 1a densidad de el agua. Una determinacién de v148 concentracién Volumen Relacién de Kd y parametros volumetricos; los V+ para los picos respectivos aparecen en el centro del perfil de elucion. Fuente: Yarmush, (1989).49 incluye con el volunen interno, el agua de hidratacién ' asociada al gel, el cual es generalmente inaccesibe para las moléculas de soluto grandes. Por otra parte a es 1a cantided exacta de gel seco empacado en 1a colunna, y es conunnente desconocida. Este problema se resuelve usando 1a densidad de el gel hGmedo, d, en este caso: . atawrp a (1 + Wp) a= ——___ - —____ (6) vet ve We > Ve donde Vi = Ve + Vi + Va, y Va es el volumen de la matriz de gel s6lido de tal manera que Wea vw = ———— (n - v) mM ata Los valores para d y Wr son generalmente especificados por la casa comercial. Otra forma de obtener el valor de Vi, ignorando las objeciones antes mencionadas es, registrando el volumen de elucién Vs al cual las moléculas pequefias dejan de salir y restando a este valor vs Yo es generalnente determinado colectando el volumen necesario para eluir las particulas de soluto més grandes. este volunen es comunnente una tercera parte de el volunen de leche; We - Vi / 2 eats relacién volunetrica £ué investigada usando esferas rigidas horogeneas. La cantidad de agya que ecupa el volunen vacio esté entre el 34 y 26% del volunen total (Yarmush y col., 1985).50 5. Modelos te6ricos para calcular Ki Varios modelos han sido propuestos para describir Ks como una medida de 1a ohstaculizacién para que el solute penetre en los pores de gel. Esta aproximacién considera el gel cono una barrera fisica para noléculas de cierto tandfio definido y es comunnente referida para cada exclusién aproximada. Los tres modelos del comportaniento de solute antes descritos (ecs. 1, 2, y 3) asumen una forma estructural para las particulas de gel. otra definicién de Ks supone gue el volumen penetrable (de cada forma) dentro de el gel esta distribuide al azar con respecto al tamafio de las moléculas y ellas pueden aconodarse, esto supone que 1a frecuencia de distribucién de tamafio sigue una curva normal y 1a regién disponible para 1a penetracién es caracterizada por el radio, a, de las moléculas grandes que pueden aconodarse. La fraccién de volumen interno vi que es perietrable por una melécula de colute de radio 2 co representada por una curva gaussiana. La fraccién de volumen total, dentro del gel, ocupado por una especie dada de radio a es consecuentemente 1a fraccién disponible para esta . molécula, Matenéticanente esto se expresa como la funcién error (erfc) de la distibucién gaussiana de la siguiente Ka = erfe ( (a ~ a) / &) (@) 6 a= as + bs ert Ks 9)51 donde, ao es’ 1a posicién del méximo valor de 1a distribucién y to es una medida de la desviacién estandar. Los datos experimentales tienen excelente concordancia con una relacién lineal entre a y erf™* Ks (Yarmush y Col., 1985). 6. Dispersion de 1a banda En la CEM una muestra que contiene una concentracién de soluto Ci, que se aplica a la columna como una banda estrecha, es eluida cono una banda dispersa en forma de canpana, siguiendo un conportamiento Gaussiano, cono resultado de varios factores difusionales (Yarmush, 1989). Asumiendo que 1a cromatogratia no es un 1echo empacado sino una serie ae etapas cono se muestra en la Fig.7. Cada etapa es semejante a un tangue perfectanente mezclado de volunen fijo en el cual 1a solucién y el adsorbente estan en equilibrio. £1 solvente fluye de una etapa a la préxima, pero el adsorbente se nantiene en la misma etapa. Este modelo de cronatografia puede describirse con un balance de masa de soluto en cada etapa. Por ejemplo, para la etapa n, se tiene: Jae solute en [_[en el Aujo|_fer eluse ewe Be (eye MP = (yet = vm) 30)SME Fig. 7. Modelo de etapas en equilibrio para la elugién cromatografica; el flujo de solvente # es asunido con constante, para cada una de las etapas de separacién. Las concentraciones son identificadas por el ninero de etapa de 1a cual a salido. Funte: Belter, (1988)53 donde © es 1a fraccién de volunen de liquide en 1a etapa Ve es el volunen de 1a etapa, ys es 1a concentracién de solute en e1 Liquide en la etapa » (definido cono solute por volunen de solvente). qr oe 1a concentracién en o1 adeorbente (dafinide cono soluto por volunen de adsorbente) y H es el flujo de solvente (tomado como constante). Suponienéo que las concentraciones de soluto en el solvente y el adsorbente estan en equilibrio: ae = Kyn qa No todas las isotermas son lineales, sin enbargo para las concentraciones diluidas que se manejan en la CEM este tipo de aproximaciones puede ser adecuada. combinando las ecs. (11) y (12) se obtiene: [e+ (ae) K pve] = (yet = ye) (22) La ‘cantidad entre corchetes tiene un significado fisico. Es 1 volunen de solvente hipotetico donde se acumula el soluto en cada etapa, tanto en el solvente como en el adsorbents La ecuacién (12) es 1a base del anélisis para 1a columna cronatografica y puede ser resuelta para todas las etapas de la columna. Originalmente ninguna de las etapas contiene soluto. t er! (59) ae ae Combinando 1a ec. (54) y (61) 1a pureza puede ser obtenida con Ja siguiente ecuacién: Yo (i) Rendimiento (1) Pureza del solute ¢ = ———————__ (60) T,¥o()) Rendimiento (3) Donde 1a sumatoria es para todos los solutos del sistema, El significade fisico de estos resultados os facilmente comprendide, viendo el caso especial de la ec. (58). Sit yt’ son iguales, no hay rendimiento. si t’= 0, la funcién error conteniendo t’ daré (-1), y el redimiento es:68 tytn) - Ae) Ce cuando t = ts, 1a mitad del pulso ha sido elufda, y el Rendimiento = 1/2 [2 + eet ( rendimiento es 50%. 8. Resolucién. La recolucién (B+) de una colunna oc una medida de le zona encinada de 2 susancias separadas, ésta medida indica 1a eficiencia de 1a colunna. Para la separacién de cantidades iguales de 2 componentes Re es dada por 1a siguiente ecuacién: Vez = Vex Ree ~ (62) 0.5(W2 + Wi) donde W es definida como 1a amplitud de 1a curva Gaissiana y los niimeros 1 y 2 representan los dos componentes. En la ec. (65) 1a diferencia (Ve2-Ve) es la distancia entre el maximo de los dos picos de elucién y 0.5 (Watt) es 1a media aritmetica de 1a amplitud de los picos de elucién en 1a base de 1a curva Gaussiana; W se define cono la distancia entre las intersecciones con 1a abscisa de las dos tangentes a traves del punto de inflexién de la curva Gaussiana. £n la Fig. 10 aparece la representacién grafica de éstos parémetros (Brier y Gunzer, 1987).w ——_- Absorcién Fig. 10. Paraémetros que describen 1a separacién y resolucién. Fuente: Dechow, (1989)70 En términos de el nimero de platos teéricos N se tiene’ eat -A) we (62) 6 bien: ak wat) or (say donde a = Kd2/Kéi, es 1a selectividad o retencién relativa y K’= (KG) (Vi/Vo) = (VerVo) /Vo, es e1 coeficiente de capacidad de 1a colunna. R= 1, significa que la distancia néxima de dos curvas de elucién Gaussiana es 4o para el caso de 2 conponentes de idéntica concentracién. La anplitud W de los picos,de elucién es también 4c. Esto significa el 98% de separacién y como un 2% de el area del pico sobrepuesta. Si R= 1.5 la‘soparacién es casi completa (99.8%). La distancia de los picos es entonces 60 y la anplitud se nantiene cono 4c. (Briiner y Gunzer, 1987).n J. Electroforesis ‘ Una vez obtenide el producto final, probablenente no exista una prueba que por #i sola garantice que se trata de una proteina.” Una de las pruebas que so usa con mayor srecuencia es 1a electroforesis de zona, gue se basa en que las proteinas tienen diferencias entre si en 1a carga neta por nolécula, 10 que da diferencias de migracién entre tae bandas ontenidas con suficiente separacién para observar 1 presencia de mezclas, sobre todo si se repite a distintos pi. para derostrar 1a presencia de actividad enzinstica en 1é banda de proteina, se puede preparar un gel con dos nitades iaénticas, tuna de las cuales se tefira con reveladores Ge proteinas, en general azul de coomassie y en 1a otra porcién se probaria actividad enzinética en 1a banda con idéntica posicién nos probaria 1a presencia de 1a enzina en ésta y de existir otras bandas sin actividad, indicaria claranente 1a presencia de proteines contaninantes (Giral, 1987). El nétodo de elecroforesis es capaz de resolver una nezcla de proteinas en base © pequeas diferencias de sus pesos noleculares, de su novilidad electroforética 0 por una combinacién de estas propiedades. En el Laboratorio, 1a electroforesis constituye una de las técnicas nis poderosas para 1a purificacion de noléculas biologicanente activas (1voty, 1990).1. Principio de Electroforesis EI proceso de electroforesis puede definirse cono 1a migracién de particulas cargadas, bajo la influencia de un campo eléctrico, hacia ‘el 4nodo 0 hacia el c&todo dependiendo del signo de su carga neta. Las nacronoléculas biolégicas cono las proteinas en solucién, se comportan cono particulas Alspersas de tanaflo coloidal, con cierta carga debido a los grupos de su superficie capaces de disociarse electroliticanente. En 1a electroforesis el comportaniento de 1a nacronolécula en en canpo eléctrico es funcién de 1a movilided 1a cual a su vez depende de los parénetros cono 1a carga eléctrica, tanafio de 1a nolécula y el coeficiente de friccién. Las diferencias en novilidad electroforética son 1a base para 1a separacién de sustancias a partir de nezclas (Garcilaso, 1983). ’ La movilidad u expresada en cm?/ Volts de una molécula fen un canpo eléctrico, viene dada por 1a velocidad de enigracion V expresada en cn/s respecto de 1a fuerza del campo eléctrico E, expresada en vYolts/en. une Para una particula esférica no sometida a ninguna interaccién electrostética fuerte de iones del entorno, cabe denostrar que3 donde: Q = carga neta de la molécula r= radio de la molécula en cn 11 = viscosidad del medio 1iquide donde ocurre 1a migracién V = voltaje aplicado De esta manera, en un medio de viscosidad constante y aplicando un voltaje constante, 1a migracién de una particula cargada esta controlada por la relacién entre carga-tamafio. Es decir, 2 carga 4 = > tanake A medida que esta relacién aunenta, también lo hace 1a movilidad. Considerando una nezcla de varias moléqulas cargadas, en el caso de que, adenés, los conponentes de la mezcla no difieren apreciablenente en su tanafio molecular, 1a ecuacién se reduce a una relacién directa: = Q (Para notecuiae det atone ‘anane on 1 slane medio) A mayor carga mayor migracién (Bohinski, 1987)."4 2. Tipos de electroforesis Hay varias formas diferentes de electroforesis, dtiles para,el andlisis y la separacién de proteinas. £1 prototipe de todos los métodos modernos es la electroforesis libre o de frente mévil. Cono en otras formas de separacién el método se divide en tres etapa: (2) Separacién de 1a muestra, (2) Detecotén del material separade, y Cuando es conveniente, (3) Recuperacién del producto separado Sin enbargo, el principio de separacién es el nisno para todas las formas de electroforesis, el principio gobernante es 1a deteccién y 1a recuperacién difiere gon la ‘técnica empleada. Electroforesis libre o de frente movil: En este tipo de electroforesis una disolucién tanponada de 1a medcla de proteinas se coloca en una celda en forna de U, le celda se mantiene sunergida en un bafo a temperatura constante, aislada de vibraciones, y se establece un canpo eléctrico entre los electrodos; las proteinas cargadas negativanente se desplazan hacia el anodo y las que poseen carga positive hacia e1 cétodo. Con el objeto de obtener una imagen completa de todas las proteinas existentes en una nezcla, se escoye por 10 General un valor de pH en el que 1a mayor parte © todas las proteinas posean la misma carga, pero su movilided se1 Gigerente. A medida que las roléculas de proteina cargadas negativanente se desplazan hacia el énodo, emigran desde 1a @isolucién de proteina a 1a zona de aisolucién tanpén exenta de proteina, formando un frente © linde Electroforesis de zona: La electroferesis libre ha sido sustituida en gran medida por diversas formas de electroforesis de zona, las cuales son mucho mAs sencillas, poseen mayor capacidad de resolucién y requieren muestras menores. En la electroforesis de zona, la Aisolucién acuosa de proteinas se innoviliza en una matriz sé1ida 0 soporte, un material poroso hidratado que posea rigidez mecénica y elimine las alteraciones debidas-a la conveccién y a la vibracién. Los soportes més amplianente utilizados son el papel de filtro, © las tiras de acetato de celulosa, materiales que son relativanente inertes y que no interactian con las proteinas que emigran, ni las retardan en su movimiento. 1 proceso electroforético se deja proseguir hasta que los principales componentes proteicos se separan en zonas distintas; de agui el nombre de electroforesis de zona. La posicién y 1a cantidad de proteina existente en cada una de las zonas separadas se determinan por aplicacién de un colorante que tife a las proteinas; la densidad de 1a coloracién retenida es proporcional a/ la cantidad de proteina y puede valorarse mediante un densiténetro. La electroforesis de zona tiene un poder de resolucién claramente superior a la electroforesis libre.76 Se consiguen resoluciones electroforéticas muchos’ mas’ elevadas cuando el material que acta cono matriz o soporte puede retardar o excluir moléculas de proteina basindose en: su tamafio molecular, tal como ocurre con los materiales utilizados en la cronatografia de exclusién molecular. Esta forna de electroforesis de zona puede separdr una mezcla de proteinas basndose en la carga eléctrica y en el tamafio molecular. Electroforesis de Disco: Es otra variante de la electroforesis de zona, aqui 1a mezcla de proteinas que se va a analizar, se sonete a un campo eléctrico en un gel soporte retardador separado en dos secciones, que difieren en su porosidad y que estan tamponadas a valores de pHi distintos. La mezcla de proteinas emigra desde el gel ms poroso al menos poroso, proceso que va acompafiado de un cambio de pil. Como resultado, cada especie Proteica ss concentra on una banda muy estrecha y definida, produciendose una resolucién mucho mayor que la que se consigue en un tanpén continuo. Enfoque Isceléctrico 0 Electroenfoque: La mezcla de proteinas se sonete a la accién de un canpo eléctrico en un soporte gelificado, que tiene establecido un gradiente de pl. Cada proteina migra y queda enfocada, en aquella porcién de gradiente de pH cuyo valor es igual al de” su punto isdeléctrico y forma alli una banda estacionaria bién definida (Lehninger, 1970). Les principales medios de soporte que se han usado en electroforecie cont ol papel filtro, las manbranae de acetate de celulosa, el almidén granulado, y los geles de agar, agarosa, almidén hidrolizado y poliacrildmida. Las ventajas de utilizar estos soportes son : a) Se puede utilizar equipo sencillo y barato. b) Se pueden analizar simultaneanente diferentes muestras. ©) ta visualizacién de las zonas y el aislaniento de las fracciones es sencillo. @) Tienen mucho poder de resolucién. (Garcilaso, 1983). 3. Blecroforesis en Geles de Poliacrilamida Raymond y Weintraub en 1959 fueron los primeros en utilizar ©2 gel de Poliacrilamida cono soporte para la electroforesis de macromoléculas. Pero no fué sino en 1964, debido a las publicaciones de Oreinstein y Davis, cuando la metodologia se populariz6 hasta llegar a hacerse uno de los nétodos més ampliamente enpleados en Bioquimica. Las aplicaciones y las variaciones a los métodos originales han dado a esta metodologia una versatilidad extraordinaria. La raz6n principal de su aceptacién es el alto poder de resolucién que tiene, debido al cual se han podido separar y7 caracterizar noléculas en gran escala. Se puede decir que actuaimente no hay leboratoric de Bioguinica que no use, en tuna u otra etapa de sus investigaciones el gel de poliacrilanida en alguna o varias de sus fornas. Los conponentes del sistena son: el monénero acrilanida; el elenento entrecruzante, que es el N.n/-metitbisscrilemida (1lanado simplemente Bis); un catalizador de sistena redox, para proporcionar radicales Libres, 1 née enpleado es e1 N,N,N’ N/-tetrametilendianina (21anado sinplenente TENED); y un iniciador, que puede ser el persulfato de Anonio, 1a Riboflavina o 1a Luz. La proporeién de agente entrecruzante a monémero de acrilanida es muy inportante puesto que esa proporcién va a ineluir en lea propiedades ffeicas y mecénicas ae gel. Mientras mayor es 1a concentracién de acrilanida, menor seré 1a concentracién de Bis necesaria para obtener geles apropiados para electroforesis. , Mientras mayor es el la concentracién de del monémero de acrilanida 1 tanafo de poro en el gel va a ser menor, haciendo entonces que el gel participe activanente en el proceso de separacisn por el llamado efecto cedazo, teniendo asi dos elenentos de separacién, 1a electroforesis y 1a ultrafiltracién.19 Electroforesis en gel de policrilaniaa dodecilsulfato de sodio. El anélisis de protetnas por electroforesis en gel, con Eespecto a su pureza y peso molecular, es un procediniento comin en 1a mayoria de los laboratorios biotecnolégicos. Algunas adaptaciones recientes de 1a técnica de electroforesis en gel de policrilamida-dodecilsulfate de sodio (SDS-PAGE) permiten el estudic de proteinas de una manexa répida y eficiente. La porosidad de un gel fornado como resultado de 1a copolimerizacién de acrilamida con bisacrilamida actéa cono una malla molecular en la cual pueden separarse macronoléculas de diferentes tanafos y cargas. En presencia del detergente 505 (cargado negativanente) y un agente reductor (generalnente a-mercaptoetanol), los puentes disulfuro dentro y entre los polipéptides son rotos; 1as subunidades protetcas resultantes se unen en forma de micelas debido al sps, suninistrando a todas las moléculas unidas de carga neta negativa. Esto permite que las cargas variables de residuos de aninoscidos especificos de polipéptidos diferentes se eliminen an 1a separacién electoforética de estas noléculac, lo que resulta en un medio de diferenciacién basado en el peso molecular. Por lo tanto al aplicar un campo eléctrico a través del gel de separacién SoS conteniendo proteinas, 1a migracién de pequefios polipéptidos, de bajo peso molecular,80 grandes, de alto peso molecular. Dependiendo del tamaito aé las noléculas a separar y las cantidades relativas de proteinas 0 4cides nuciéicos que serén analizados, puede requerirse cambiar 1a concentracién por ciento de acrilamida para obtener resultados éptinos (becker y Col., 1990). En la Fig. (11) aparece un esquena en el que se nuestra el efecto Gel detergente SDS y el agente reductor 2-Nercaptostanol sobre las proteinas. 5. Tincién de las proteinas depués de la Electroforesis. Es muy f4cil tefir las proteinas separadas en el gel de poliacrilamida. Existen muchos tipos de tinciones, unos generales y otros especificcs para algiin tipo de proteinas. La més importante y 1a mis universalmente empleada es 1a tincién Coomassie Blue, es muy especifica para proteinas, detecta niveles tan bajos de proteinas cono 0.5 ug de proteina pér centinetro cuadrade y los agentes afiadidos al sistena nv influyen en la tincién, de ahi que su uso sea tan universal. (Garcilaso, 1983) Actualmente se esta universalizando la tincién de * Plata, tanto para proteinas cono para 4cidos nucléicos debido a que es 100 veces mas sensitiva que la de Coomassie, aparentenente tiene habilidad para detectar 0.38 ng/mn® de albumina de suero de bovino, La densidad relativa de la ‘tincién de plata es aproximadanente lineal con laa1 Proteina con 2 8 c dos subunidades Ay B, unidas = proteina de Por un enlace una sola disulfuro subunidad Calentamiento con sps Y Mercaptostanol Moléculas de SDS cargadas negativamente Gel de poliacritanida v vine 3) emma | c | . lo Fig. 11. Gel de electroforesis poliacrilanida dodesilsulfato de sodio (SDS PAGE). Las cadenas de polipeptidos forman un complejo con las moléculas de sbs y por le tanto migran cono un complejo proteina-sps a través del gel poroso de poliacrilamida, partiendo de que la velocidad de migracién es més grande para ol ‘ polipeptido més pequefio, esta técnica puede ser usada para medir el peso molecular aproximado a si cono las subunidades que componen a 1a proteina. Fuente: Alberts y col., (1989). 82 concentracién para algunas proteinas por ejemplo para 1a Fosforilasa, pero marcadamenta no lineal para otras cono Albunina de suero de bovino, para el misno rango (Hanes, 1986).