UNIVERSIDAD PRIVADA DEL VALLE

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

BIOQUIMICA Y FARMACIA
MICROBIOLOGÍA GENERAL

PRACTICA # 4

COLORANTES
EMPLEADOS EN
BACTERIOLOGÍA
Estudiantes: Loayza Callisaya Denilson David
Lopez Achocana Violeta Jazmin
Mamani Cruz Luz Neida
Maquera Mendoza Bryan Kevin
Mattaz Huampu Wiñay Berenice
Paredes Velasco Lizeth Nayeli

Docente: Dra. Noemi Huanca Monzon

LA PAZ – MARZO DE 2023

OBJETIVO
Objetivo general
 El objetivo principal de este laboratorio es observar los diferentes tipos de
muestra con los diferentes tipos de colorantes para ver diferentes
microorganismos como ser cocos y bacilos.
Objetivos específicos
 Reconocer las dos tinciones en vivo y en muerto, y realizar un buen uso de
estos.
 Reconocer microorganismos en las distintas tinciones y su estado.
MARCO TEORICO
Tinciones y colorantes principales en microbiología

En este caso, las diferentes técnicas de tinción analizadas se usan para el microscopio
óptico. La mayoría de las muestras se podrán ver en el microscopio con aumentos de
10x y 40x, aunque habrá casos donde será necesario usar el aumento 100x (donde se
añade también el aceite de inmersión a la muestra).

En cuanto al área de microbiología se usas las tinciones Gram y de Ziehl-Neelsen

ambas diferenciales; aunque también hay otras tinciones diferenciales y selectivas.

Tinción de Gram

La tinción de Gram es probablemente la más conocida; es de tipo diferencial y sirve

para distinguir a los microorganismos por morfología y composición.

Hay que tener en cuenta que se debe hacer la tinción cuando el cultivo está en fase
exponencial, ya que en fase estacionaria (“vejez”) se pueden confundir las gram
positivas con las negativas. Esto ocurre debido a la perdida de capas de peptidoglicano
por parte de bacterias gram positivas.

Colorantes

 Cristal violeta. Da color azul o violáceo a las bacterias gram positivas.

 Safranina. Da color rojizo o anaranajado a las bacterias gram negativas.

Aparte de estos colorantes, en la tinción de Gram se usará el lugol como mordiente, y

alcohol 96% para decolorar. Todas las células (sean Gram positivas o negativas) se
teñirán con el cristal violeta.
Ahora bien, el alcohol quita fosfolípidos y cierra los poros de la pared celular, por lo que
el cristal violeta queda atrapado. Las bacterias gram positivas podrán soportar este
proceso gracias a su gran capa de peptidoglicano.

Tinción Ziehl-Neelsen

La tinción de Ziehl-Neelsen es de tipo diferencial, y sirve para detectar bacterias ácido-

alcohol resistentes (BAAR), siendo la más destacada Mycobacterium tuberculosis. Esto
es muy útil, sobre todo teniendo en cuenta que M. tuberculosis no puede ser detectada
correctamente con la tinción de Gram.

Colorantes

 Fucsina fenicada. Da un color rojizo a las bacterias AAR.

 Azul de metileno. Da un color azulado al resto de bacterias que no son AAR.

En la tinción de Ziehl-Neelsen, el alcohol-ácido cumple la una función parecida a la del

alcohol 96% en la tinción de Gram. En este caso, el contraste aparece por los ácidos
micólicos, que hacen que sus bacterias sean impermeables al alcohol-ácido.

Tinción de Wirtz-Conklin

La tinción de Wirtz-Conklin se usa para observar bien las endosporas bacterianas. La

muestra debe ser obtenida de un cultivo en fase estacionaria. En este caso, para su
observación al microscopio hay que usar la lente x100, usando aceite de inmersión.

Entra en el grupo de las tinciones selectivas, aunque al añadir un colorante de contraste

es técnicamente una tinción diferencial.

Colorantes

 Verde malaquita. Tiñe las endosporas de verde.

 Safranina. Es opcional, y sirve para colorear el resto de la célula con un color
anaranjado.

Tinción de Leifson

La tinción de Leifson usa para la observación de flagelos bacterianos; entra dentro de

las tinciones selectivas. Tienen un espesor de 0.01 micrones, por lo que son invisibles
al microscopio óptico; por ello hace falta esta técnica especial. Para su observación en
el microscopio óptico, se debe usar aceite de inmersión y el aumento 100x.
Recalcamos el hecho de esta tinción se usa para ver flagelos bacterianos; los flagelos
de organismos eucariotas son más gruesos y pueden verse con tinciones simples o
incluso con preparaciones al fresco.

Colorantes

 Se usa el colorante de Leifson que está formado por:

 Fucsina básica 95%. Es el colorante en sí mismo.
 Etanol 1.2%.
 Ácido tánico 3%. Tiene función de mordiente.
 Cloruro sódico 1.5%.

Agua destilada. Aparece en unión a ácido tánico y cloruro sódico, formando parte de
sus soluciones.

Tinción negativa

Se usa para detectar las cápsulas que aparecen en algunas bacterias, así que entra en
el grupo de las tinciones selectivas. La tinción negativa se puede usar para el
microscopio óptico o para el microscopio electrónico.

Ahora bien, para el microscopio óptico se contrasta la muestra a los fotones, mientras
que en el microscopio electrónico se constrasta la muestra a los electrones.

Colorantes
 Tinta china.
 Nigrosina.
 MATERIALES:

N° Materiales de Vidrio Insumo y equipos Reactivos

Hisopos Colorante
1. Portaobjetos
Estériles Safranina

Cubreobjeto Colorante Verde

2. Piseta
s Malaquita

Colorante Azul de
3. Gotero
Metileno
   
 Asa
4.  Tinta China
Bacteriológica
   
Mechero
5.
Bunsen
     

6. Microscopio
     
Aceite de
7.
Inmersión
     

PROCEDIMIENTO

1. Preparado en fresco (en estado vivo)

a) Identificar el portaobjetos a utilizar, al extremo con un marcador indeleble.
b) Colocar una gota de agua destilada en el portaobjetos.
c) Colocar parte de la muestra en el portaobjetos. (hisopado nasal, etc.)
d) Colocar un cubreobjetos de la manera correcta.
e) Observar con 4x, 10x y 40x. El condensador debe mantenerse abajo y el
diafragma medio cerrado.
1.1. Variación:

En el paso ¨b¨ se cambia el agua destilada por azul de metileno o tinta china.

2. Preparado coloreado (en estado muerto)

a) Identificar el portaobjetos a utilizar, al extremo con un marcador indeleble.
b) Tomar muestra
c) Impregnar la muestra al portaobjetos.
d) Dejar secar la muestra.
e) Fijar la muestra con un método físico, se debe pasar al fuego aproximadamente
tres veces.
f) Aplicar colorante (safranina, rojo Congo, etc.) Se debe aplicar sobre la
preparación dejando secar aproximadamente 1min.
g) Lavar con agua destilada.
h) Dejar secar la muestra.
i) Observar al microscopio con objetivo de inmersión 100x.
2.2. Variación:
 Se toma la muestra de una población de microorganismos, disuelve la preparación
en portaobjetos y agua destilada.

RESULTADOS
En este practica realizamos dos tipos de métodos para la observación de bacterias la
preparación en fresco y la preparación en muerto, donde recogiendo muestras de
cualquier superficie en este caso mas bacterias presentes en la boca, en las fosas
nasales y de alimentos fermentados, aplicamos principalmente dos colorantes que son
el rojo Congo y el azul de metileno.

MUESTRA EN FRESCO
Muestra plátano con moho
Podemos observar en una muestra, una cantidad de
bacilos, y una agrupación de cocos, en racimo y
también diplococos, y unos cocos en diferentes
lugares de la muestra, donde algunos pudimos
observarlos en movimiento.

Muestra bucal
Aquí observamos un poco cantidad de cocos
agrupados y otros dispersos y una cantidad mínima
de bacilos en la muestra donde no se observo
movimiento de las bacterias, posiblemente por el
tiempo en el que estaban al descubierto.

MUESTRA EN MUERTO
Muestra sarro dental
Aquí observamos una muestra ya con una tinción
simple, utilizando rojo Congo donde observamos
una pequeña cantidad de cocos y bacilos, de una
tonalidad más oscura presente en la muestra y otros
cocos de tonalidad más rosa.

Muestra nasal
Aquí no se observaron muchas bacterias, donde
utilizamos el azul de metileno, realizando una tinción
simple, encontramos una cantidad de células, donde
se pudo observar un posible caso de resfriado en la
muestra y algunos cocos teñidos pero muy
pequeños.
CONCLUSIÓN
Se cumplió con el objetivo de la práctica, donde pudimos observar bacterias, en casi
cada una de las muestras obtenidas tanto en fresco como en muerto, donde realizamos
grupalmente de cuatro a cinco muestras, observamos muy bien dos, y en el resto no se
logró la observación de bacterias, por el mal procedimiento, la mala manipulación de la
muestra, la mala identificación, el tiempo transcurrido, donde cumplimos con la
observación de cocos y bacilos dentro de las diferentes muestras en vivo, tanto también
como las tinciones realizadas, observamos bacterias en movimiento, tanto bacterias
con una tinción muy fuerte de la estructura de la bacteria, cumpliendo con todos los
estándares de seguridad para una buena realización de la práctica.

CUESTIONARIO
1. Investigue la estructura química de la fucsina básica, cristal violeta, azul de
metileno.

Fucsina Básica: Es un colorante básico de trifenilmetano, que disuelto en agua

tiene un color rojo y se utiliza en las técnicas microscópicas convencionales.

 Apariencia color verde oscuro, polvo fino color verde

 Espectrometría de infrarrojo auténtica
 Contenido de tinte > = 83 % (sobre sustancia seca)
 Peso molecular: 337,8555
 Fórmula molecular: C20 H20 ClN3
 Composición: C 71,10 %. H 5,97 %. Cl 10,49 %. N 12,44 %
 Embalaje: 500 g

Cristal Violeta: El cristal violeta se presenta como cristales de color azul verdoso
brillante. Los violeta de metilo son solubles en agua, etanol, dietilenglicol, y
dipropilenglicol. En particular, el violeta de metilo 6B es soluble en agua al 2,93%
y soluble en etanol al 15,21%.

 Formulas químicas:
 Fórmula molecular: C25H30ClN3
 Peso molecular (g/mol): 407.986
 Nombre IUPAC: [4-[bis[4-(dimetilamino) fenil] metilideno]ciclohexa-2,5-
dien-1-ilideno]-dimetilazanio; cloruro.

Azul Metileno: El azul de metileno es un colorante que se usa para tratar una
enfermedad llamada metahemoglobinemia.

 Nombre químico: 3,7-bis (dimetilamino)-Cloruro d fenazationio Cloruro de

tetrametiltionina.
 Apariencia color verde, polvo cristalino fino
 Espectrometría de infrarrojo auténtica
 Ensayo de otros > = 70 % (TiCl3-titulación)
 Pérdida por secado < = 22 %
 Peso molecular: 319,859
 Fórmula molecular: C16 H18 Cl N3 S. x H2 O
 Composición: C 60,08 %. H 5,67 %. Cl 11,08 %. N 13,14 %. S 10,02 %
 Embalaje: 100 g
2. Cite las tinciones más empleadas en Microbiología.
Existe una gran variedad de tinciones que pueden ser aplicadas dentro del campo
de la microbiología. Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a
células, tejidos, fibras, etcétera.

Las tinciones principales son la de Gram y de Ziehl-Neelsen, ambas diferenciales;

aunque también hay otras tinciones diferenciales y selectivas de interés para la
microbiología.

Tinción De Gram

Esta tinción es un procedimiento de gran utilidad empleado en los laboratorios

donde se manejan pruebas microbiológicas. Es definida como una tinción
diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes
grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas.

Tinción Ziehl-Neelsen

La tinción de Ziehl-Neelsen es de tipo diferencial, y sirve para detectar bacterias

ácido-alcohol resistentes (BAAR), siendo la más destacada Mycobacterium
tuberculosis. Esto es muy útil, sobre todo teniendo en cuenta que M. tuberculosis no
puede ser detectada correctamente con la tinción de Gram.

BIBLIOGRAFIA:

Haley, D. L. (2023). Tinciones y colorantes principales en microbiología. Obtenido

de Microbiologia:
https://microbiologia.net/microbiologia/tinciones-colorantes/#Tincion-de-Gram
Luis Esaú López-Jácome, *. M.-D.-C. (13 de junio de 2013). Las tinciones básicas
en el laboratorio. Obtenido de
https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf

Berríos, C. S., & Ilabaca, R. G. (2018). Manual de microbiología. Ediciones UC.