Cromatografía USP-NF 〈621〉
Cromatografía USP-NF 〈621〉
Cromatografía USP-NF 〈621〉
AVISO:
Disponible en inglés próximamente.
〈 621 〉 CROMATOGRAFÍA
(Las secciones System Sensitivity y Peak Symmetry se harán oficiales el 1 de diciembre de 2023 como se indica).
INTRODUCCIÓN
Las técnicas de separación cromatográficas son procedimientos de separación de varias etapas en los que los componentes de una muestra
se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un
líquido soportado sobre un sólido o un gel. La fase estacionaria puede estar empaquetada en una columna, esparcida como una capa o
distribuida como una película, etc. La fase móvil puede ser gaseosa o líquida o un fluido supercrítico. La separación puede basarse en
adsorción, distribución de masa (partición), intercambio iónico, etc., o puede basarse en diferencias en las propiedades fisicoquímicas de las
moléculas, como tamaño, masa, volumen, etc.
Las partes del texto del presente capítulo general que son texto nacional USP–NF y, por lo tanto, no forman parte del texto armonizado, están
marcadas con símbolos (♦♦) para especificar este hecho.
Los tipos de cromatografía útiles en el análisis cualitativo y cuantitativo empleados en los procedimientos de la USP son columna, gas, papel,
capa fina (incluida la cromatografía de capa fina de alto rendimiento) y cromatografía líquida presurizada (comúnmente llamada cromatografía
líquida de alta presión o de alto rendimiento). cromatografía).
CI
PROCEDIMIENTOS GENERALES
Esta sección describe los procedimientos básicos que se utilizan cuando se describe un método cromatográfico en una monografía. Se
siguen los siguientes procedimientos a menos que se indique lo contrario en la monografía individual.
Cromatografía en papel
FI
fase estacionaria
La fase estacionaria es una hoja de papel de textura y espesor adecuados. El desarrollo puede ser ascendente, en el cual el solvente es
transportado por el papel por fuerzas capilares, o descendente, en el cual el flujo del solvente también es asistido por la fuerza gravitacional.
O
La orientación del grano de papel con respecto al flujo de solvente debe mantenerse constante en una serie de cromatogramas. (La dirección
de la máquina generalmente la designa el fabricante).
aparato
El equipo esencial para la cromatografía en papel consta de una cámara hermética al vapor con entradas para la adición de disolvente y una
gradilla de material resistente a la corrosión unos 5 cm más corta que la altura interior de la cámara. La gradilla sirve de soporte para las
cubetas de disolvente y para las varillas antisifón que, a su vez, sostienen las láminas cromatográficas. El fondo de la cámara se cubre con el
sistema solvente prescrito o fase móvil. La saturación de la cámara con vapor de solvente se facilita revistiendo las paredes internas con
papel humedecido con el sistema de solvente prescrito.
punteo
La sustancia o sustancias analizadas se disuelven en un disolvente adecuado. Se colocan volúmenes convenientes de la solución
resultante con micropipetas adecuadas, que normalmente contienen de 1 a 20 µg del compuesto, en puntos de 6 a 10 mm separados por no
menos de 3 cm.
fase estacionaria
La fase estacionaria es una capa relativamente delgada y uniforme de material seco, finamente pulverizado, que se aplica a una lámina o
placa de vidrio, plástico o metal (normalmente llamada placa). La fase estacionaria de las placas de cromatografía en capa fina (TLC) tiene un
tamaño de partícula promedio de 10 a 15 µm, y la de las placas de TLC de alto rendimiento (HPTLC) tiene un tamaño de partícula promedio de
AL
5 µm. Se pueden usar placas comerciales con una zona preadsorbente si se especifican en una monografía. La muestra aplicada a la región
preadsorbente se convierte en bandas estrechas y nítidas en la interfase preadsorbente-adsorbente. Las separaciones logradas pueden estar
basadas en adsorción, partición o una combinación de ambos efectos, dependiendo del tipo particular de fase estacionaria.
aparato
CI
Se utiliza una cámara cromatográfica hecha de material inerte, transparente y que tiene las siguientes especificaciones: una cubeta de
fondo plano o doble, una tapa bien ajustada y un tamaño adecuado para las placas. La cámara está revestida en al menos una pared con
papel de filtro. Se añade a la cámara suficiente fase móvil o disolvente de revelado para que, tras la impregnación del papel de filtro, se
disponga de una profundidad adecuada a las dimensiones de la placa utilizada. La cámara cromatográfica se cierra y se deja equilibrar. [ Nota
—A menos que se indique lo contrario, las separaciones cromatográficas se realizan en una cámara saturada. ]
FI
detección/visualización
A menudo se utiliza una fuente de luz ultravioleta (UV) adecuada para observaciones bajo luz UV de longitud de onda corta (254 nm) y larga
(365 nm) y una variedad de reactivos de pulverización para hacer visibles las manchas.
O
punteo
Las soluciones se colocan en la superficie de la fase estacionaria (placa) en el volumen prescrito en porciones suficientemente pequeñas
para obtener puntos circulares de 2 a 5 mm de diámetro (1 a 2 mm en placas de HPTLC) o bandas de 10 a 20 mm × 1 –2 mm (5–10 mm ×
0,5–1 mm en placas de HPTLC) a una distancia adecuada del borde inferior y los lados de la placa. [ Nota : durante el desarrollo, la posición de
la aplicación debe estar al menos 5 mm (TLC) o 3 mm (HPTLC) por encima del nivel de la fase móvil. ]Las soluciones se aplican en una línea
paralela al borde inferior de la placa con un intervalo de al menos 10 mm (5 mm en placas HPTLC) entre los centros de los puntos, o 4 mm (2
mm en placas HPTLC) entre los bordes de bandas, luego se deja secar.
procedimiento
1. Coloque la placa en la cámara, asegurándose de que los puntos o bandas estén por encima de la superficie de la fase móvil.
2. Cierra la cámara.
3. Permita que la fase móvil ascienda por la placa hasta que el frente del solvente haya recorrido las tres cuartas partes de la longitud de
la placa, o la distancia prescrita en la monografía.
4. Retire la placa, marque el frente del solvente con un lápiz y deje secar.
5. Visualice los cromatogramas según lo prescrito.
6. Determinar los valores del factor de retardo cromatográfico ( R ) para los puntos o zonas principales.
F
igual magnitud obtenidos, respectivamente, con una cromatografía desconocida y estándar en la misma placa. Una comparación visual
del tamaño o la intensidad de las manchas o zonas puede servir para una estimación semicuantitativa. Las mediciones cuantitativas
son posibles mediante densitometría (mediciones de absorbancia o fluorescencia).
Cromatografía de columna
apoyo solido
La tierra silícea purificada se utiliza para la separación de fases normales. La tierra silícea cromatográfica silanizada se utiliza para la
cromatografía de partición de fase inversa.
fase estacionaria
El soporte sólido se modifica mediante la adición de una fase estacionaria especificada en la monografía individual. Si se utiliza una mezcla
de líquidos como fase estacionaria, mezclar los líquidos antes de la introducción del soporte sólido.
fase móvil
La fase móvil se especifica en la monografía individual. Si la fase estacionaria es una solución acuosa, equilibre con agua. Si la fase
estacionaria es un fluido orgánico polar, equilibre con ese fluido.
aparato
A menos que se especifique lo contrario en la monografía individual, el tubo cromatográfico tiene un diámetro interior de unos 22 mm y una
longitud de 200 a 300 mm. Unido a él hay un tubo de suministro, sin llave de paso, de unos 4 mm de diámetro interior y unos 50 mm de
longitud.
Preparación del aparato: Coloque una torunda de lana de vidrio fina en la base del tubo. Combine el volumen especificado de fase
estacionaria y la cantidad especificada de soporte sólido para producir una mezcla homogénea y esponjosa. Transferir esta mezcla al tubo
cromatográfico y apisonar ejerciendo una presión suave para obtener una masa uniforme. Si la cantidad especificada de soporte sólido es
AL
superior a 3 g, transfiera la mezcla a la columna en porciones de aproximadamente 2 g y apisone cada porción. Si el ensayo o prueba requiere
una columna multisegmento con una fase estacionaria diferente especificada para cada segmento, apisone después de agregar cada
segmento, y agregue cada segmento subsiguiente directamente al anterior. Empaque una torunda de lana de vidrio fina sobre el relleno de la
columna completa.[ Nota : la fase móvil debe fluir a través de una columna correctamente empaquetada como una corriente moderada o, si se
aplica cromatografía de fase inversa, como un goteo lento. ]
CI
Si se incorpora una solución del analito a la fase estacionaria, completar la transferencia cuantitativa al tubo cromatográfico lavando el vaso
de precipitados utilizado para la preparación de la mezcla de prueba con una mezcla de aproximadamente 1 g de soporte sólido y varias gotas
del disolvente utilizado. para preparar la solución de muestra antes de agregar la porción final de lana de vidrio.
procedimiento
FI
1. Transfiera la fase móvil al espacio de la columna por encima del relleno de la columna y permita que fluya a través de la columna bajo
la influencia de la gravedad.
2. Enjuague la punta de la columna cromatográfica con aproximadamente 1 ml de fase móvil antes de cada cambio en la composición de
la fase móvil y después de completar la elución.
O
3. Si el analito se introduce en la columna como una solución en la fase móvil, permita que pase completamente al relleno de la columna,
luego agregue la fase móvil en varias porciones pequeñas, dejando que cada una se drene por completo, antes de agregar la mayor
parte de la fase móvil.
4. Cuando el procedimiento indique el uso de múltiples columnas cromatográficas montadas en serie y se especifique la adición de fase
móvil en porciones divididas, permita que cada porción se drene completamente a través de cada columna y enjuague la punta de cada
una con fase móvil antes de agregar cada una de las siguientes. parte.
columna empacada GC
La fase estacionaria líquida se deposita sobre un soporte sólido inerte finamente dividido, como tierra de diatomeas, polímero poroso o
carbón grafitado, que se empaqueta en una columna que suele tener entre 2 y 4 mm de diámetro interno y entre 1 y 3 m de longitud. .
columna capilar GC
En las columnas capilares, que no contienen un soporte sólido empaquetado, la fase estacionaria líquida se deposita en la superficie interna
de la columna y puede unirse químicamente a ella.
aparato
Un cromatógrafo de gases consta de una fuente de gas portador, un puerto de inyección, una columna, un detector y un dispositivo de
registro. El puerto de inyección, la columna y el detector tienen temperatura controlada y se pueden variar como parte del análisis. El gas
portador típico es helio, nitrógeno o hidrógeno, según la columna y el detector en uso. El tipo de detector utilizado depende de la naturaleza de
los compuestos analizados y se especifica en la monografía individual. La salida del detector se registra en función del tiempo, y la respuesta
del instrumento, medida como área de pico o altura de pico, es función de la cantidad presente.
programa de temperatura
La duración y la calidad de una separación de GC se pueden controlar alterando la temperatura de la columna cromatográfica. Cuando es
necesario un programa de temperatura, la monografía individual indica las condiciones en formato de tabla. La tabla indica la temperatura
inicial, la tasa de cambio de temperatura (rampa), la temperatura final y el tiempo de permanencia en la temperatura final.
procedimiento
1. Equilibre la columna, el inyector y el detector con un flujo de gas portador hasta que se reciba una señal constante.
2. Inyecte una muestra a través del tabique del inyector o utilice un inyector automático.
3. Comience el programa de temperatura.
4. Registre el cromatograma.
5. Analizar como se indica en la monografía.
AL Cromatografía líquida
El término "cromatografía líquida" (LC), como se usa en los compendios, es sinónimo de cromatografía líquida de alta presión y
cromatografía líquida de alta resolución. LC es una técnica de separación basada en una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida.
fase estacionaria
CI
Las separaciones se logran mediante procesos de partición, adsorción o intercambio iónico, según el tipo de fase estacionaria utilizada. Las
fases estacionarias más utilizadas son sílice modificada o perlas poliméricas. Las perlas se modifican mediante la adición de hidrocarburos
de cadena larga. El tipo específico de relleno necesario para completar un análisis se indica mediante la designación "L" en la monografía
individual (consulte también la sección Columnas cromatográficas ). El tamaño de las cuentas también se describe a menudo en la
FI
monografía. Los cambios en el tipo y tamaño del empaque se tratan en la sección Idoneidad del sistema de este capítulo.
columna cromatográfica
El término "columna" incluye acero inoxidable, acero inoxidable revestido y columnas poliméricas, rellenas con una fase estacionaria. La
longitud y el diámetro interior de la columna afectan la separación y, por lo tanto, las dimensiones típicas de la columna se incluyen en la
O
monografía individual. Los cambios en las dimensiones de las columnas se analizan en la sección Idoneidad del sistema de este capítulo. Las
monografías complementarias no incluyen el nombre de las columnas apropiadas; esta omisión evita la apariencia de aprobación del
producto de un proveedor y los cambios naturales en el mercado. Consulte la sección Columnas cromatográficas para obtener más
información.
En los procedimientos de CL, se puede usar una precolumna con los siguientes requisitos, a menos que se indique lo contrario en la
monografía individual: (a) la longitud de la precolumna debe ser no más del 15 % de la longitud de la columna analítica, (b) la el diámetro
interior debe ser igual o menor que el de la columna analítica, y (c) el material de relleno debe ser el mismo que el de la columna analítica (p.
ej., sílice) y contener la misma fase ligada (p. ej., C18). En cualquier caso, con la precolumna instalada se deberán cumplir todos los requisitos
de idoneidad del sistema especificados en el procedimiento oficial.
fase móvil
La fase móvil es un solvente o una mezcla de solventes, tal como se define en la monografía individual.
aparato
Un cromatógrafo de líquidos consta de un depósito que contiene la fase móvil, una bomba para forzar la fase móvil a través del sistema a
alta presión, un inyector para introducir la muestra en la fase móvil, una columna cromatográfica, un detector y un dispositivo de recopilación
de datos.
elución en gradiente
La técnica de cambiar continuamente la composición del solvente durante la ejecución cromatográfica se denomina elución en gradiente o
programación de solventes. El perfil de elución del gradiente se presenta en la monografía individual como una tabla de gradientes, que
enumera el tiempo y la composición proporcional de la fase móvil en el tiempo indicado.
procedimiento
1. Equilibre la columna y el detector con fase móvil al caudal especificado hasta que se reciba una señal constante.
2. Inyecte una muestra a través del inyector o utilice un inyector automático.
3. Comience el programa de gradiente.
4. Registre el cromatograma.
5. Analice como se indica en la monografía.
COLUMNAS CROMATOGRAFICAS
En USP–NF , Reactivos, indicadores y soluciones — Columnas cromatográficas , se encuentra una lista completa de los rellenos (L), las fases
(G) y los soportes (S) utilizados en las pruebas y ensayos USP–NF . Esta lista pretende ser una referencia conveniente para el cromatógrafo en
la identificación de la columna cromatográfica pertinente especificada en la monografía individual.♦
DEFINICIONES
Los criterios de idoneidad y aceptación del sistema en las monografías se han establecido utilizando los parámetros que se definen a
continuación. Con algunos equipos, ciertos parámetros, como la relación señal-ruido y la resolución, se pueden calcular mediante el software
proporcionado por el fabricante. Es responsabilidad del usuario asegurarse de que los métodos de cálculo utilizados en el software sean
equivalentes a los requisitos de la Farmacopea de EE. UU. y realizar las correcciones necesarias si este no es el caso.
Cromatograma: Una representación gráfica o de otro tipo de la respuesta del detector, la concentración del efluente u otra cantidad utilizada
AL
como medida de la concentración del efluente en función del tiempo o el volumen. Los cromatogramas idealizados se representan como una
secuencia de picos gaussianos en una línea base (Figura 1).
CI
FI
O
Figura 1.
VM = volumen de retención
_
t = tiempo de espera
M
Constante de distribución ( K ): En la cromatografía de exclusión por tamaño, las características de elución de un componente en una
0
columna en particular pueden estar dadas por la constante de distribución (también conocida como coeficiente de distribución), que se calcula
mediante la siguiente ecuación:
tR− t0
k 0 =
tt −t0
t = tiempo de retención
R
Volumen de permanencia ( D ) (también conocido como V ): El volumen de permanencia (también conocido como volumen de retardo
D
de gradiente) es el volumen entre el punto en el que se encuentran los eluyentes y la entrada de la columna. Se puede determinar mediante el
siguiente procedimiento.
columna: Reemplace la columna cromatográfica por un tubo capilar adecuado (p. ej., 1 m × 0,12 mm).
Tiempo
AL tabla 1
20–30 0 100
tasa de flujo: Configure para obtener una contrapresión suficiente (p. ej., 2 ml/min).
FI
re = t ×F
re
F = caudal (mL/min)
Figura 2.
[ Nota : cuando corresponda, esta medición se realiza con el muestreador automático en la posición de "inyección" para incluir el volumen
del circuito de inyección en el volumen de permanencia. ]
Tiempo de espera ( t ): Tiempo requerido para la elución de un componente no retenido (consulte la Figura 1, la escala de referencia está en
M
minutos o segundos).
En la cromatografía de exclusión por tamaño, se utiliza el término tiempo de retención de un compuesto no retenido ( t
0 ).
retención ( VM ): Volumen de la fase móvil requerida para la elución de un componente no retenido. Puede calcularse a partir del
Volumen de
Cima: Porción de un cromatograma que registra la respuesta del detector cuando se eluye de la columna un solo componente (o dos o más
componentes sin resolver).
CI
La respuesta del pico puede estar representada por el área del pico o la altura del pico ( h ).
Relación pico-valle ( p / v ): La relación pico a valle se puede emplear como criterio de idoneidad del sistema cuando no se logra la
separación de la línea de base entre dos picos (consulte la Figura 3).
FI
O
Figura 3.
Hv = altura por encima de la línea base extrapolada en el punto más bajo de la curva que separa los picos mayor y menor
_
Altura de placa ( H ) (altura equivalente a una placa teórica [HETP]): Relación entre la longitud de la columna ( L ), en micrómetros, y el
número de placa ( N ):
L
H =
norte
Número de placa ( N ) (número de placas teóricas): Un número indicativo del rendimiento de la columna (eficiencia de la columna) solo se
puede calcular a partir de los datos obtenidos en condiciones isotérmicas, isocráticas o isodensas, según la técnica, como el número de placa,
utilizando la siguiente ecuación, los valores de t y W Expresándose en las mismas unidades:
R h
2
tR
norte = 5,54 ( )
Wh
El número de platos varía con el componente así como con la columna, la temperatura de la columna, la fase móvil y el tiempo de retención.
Altura placa reducida ( h ): Relación entre la altura de la placa ( H ), en micrómetros, y el diámetro de la partícula ( d ) en micrómetros:
p
H
h =
Retardo relativo ( R
rel
AL d pag
): El retardo relativo, utilizado en la cromatografía de capa fina, se calcula como la relación de las distancias recorridas
Figura 4.
Rr miyo
= segundo/ c
Retención relativa ( r ): La retención relativa se calcula como una estimación utilizando la siguiente ecuación:
tRi −tMETRO
r =
tRst −tMETRO
primero = tiempo de retención del pico de referencia (generalmente el pico correspondiente a la sustancia a examinar)
_
t = tiempo de espera
M
tRi
rGRAMO
=
tRst
A menos que se indique lo contrario, los valores de retención relativa establecidos en las monografías corresponden a la retención relativa no
ajustada.
tR 2 > tR 1
AL
En la cromatografía cuantitativa en capa fina, utilizando densitometría, se utilizan las distancias de migración en lugar de los tiempos de
retención y la resolución entre picos de dos componentes puede calcularse mediante la siguiente ecuación:
RS =
1.18 a (RF 2 −RF 1 )
W hora
+1 W hora 2
RF 2 > RF 1
CI
RF , RF = factores de retardo de los picos
1 2__
Factor de retardo ( R ): El factor de retardo, utilizado en la cromatografía de capa fina, es la relación entre la distancia desde el punto de
F
aplicación hasta el centro de la mancha y la distancia recorrida simultáneamente por el frente del disolvente desde el punto de aplicación (Figura
O
4).
b
RF =
a
Factor de retención ( k ): El factor de retención (también conocido como relación de distribución de masa ( D ) o factor de capacidad ( k′ ))
m
se define como:
El factor de retención de un componente puede determinarse a partir del cromatograma utilizando la siguiente ecuación:
t = tiempo de retención
R
t = tiempo de espera
M
Tiempo de retención ( t ): Tiempo transcurrido entre la inyección de la muestra y la aparición de la respuesta del pico máximo de la zona de
R
retención ( VR ):
Volumen de
Volumen de la fase móvil necesaria para la elución de un componente. Puede calcularse a partir del tiempo de retención y el caudal ( F ), en
mililitros por minuto, mediante la siguiente ecuación:
V R = tR × F
Tiempo de retención de un compuesto no retenido ( t ): En cromatografía de exclusión por tamaño, tiempo de retención de un
0
componente cuyas moléculas son más grandes que los poros más grandes del gel (Figura 5).
AL
CI
FI
O
Figura 5.
Volumen de retención de un compuesto no retenido ( V ): En cromatografía de exclusión por tamaño, volumen de retención de un
0
componente cuyas moléculas son más grandes que los poros más grandes del gel. Puede calcularse a partir del tiempo de retención de un
compuesto no retenido y el caudal ( F ), en mililitros por minuto, utilizando la siguiente ecuación:
V 0 = t0 × F
Factor de separación ( α ): Retención relativa calculada para dos picos adyacentes (por convención, el valor del factor de separación siempre
es >1):
α = k 2 /k 1
Relación señal/ruido ( S/N ): El ruido a corto plazo influye en la precisión y exactitud de la cuantificación. La relación señal-ruido se calcula
utilizando la siguiente ecuación:
H = altura del pico (Figura 6) correspondiente al componente en cuestión, en el cromatograma obtenido con la solución de referencia pres-
crita, medida desde el máximo del pico hasta la línea base extrapolada de la señal observada sobre una distancia ▲ de al menos 5
▲
( RB
veces el ancho a media altura
1-abr-2023)
h = rango del ruido en un cromatograma obtenido después de la inyección de un blanco (Figura 7), observado en una distancia ▲
de al me-
nos 5 veces el ancho a la mitad de la altura del pico en el cromatograma obtenido con la solución de referencia prescrita
▲ (RB 1-Abr-2023)
y, si es posible, situado igualmente alrededor del lugar donde se encontraría este pico
AL
Figura 6. Cromatograma de la solución de referencia
CI
FI
O
Figura 7.
▲ (BR 1-abr-2023)
Factor de simetría ( A ): El factor de simetría de un pico (también conocido como factor de asimetría o factor de cola) (Figura 8) se calcula
S
W 0.05
As =
2 días
d = distancia entre la perpendicular caída desde el máximo del pico y el borde de ataque del pico a una vigésima parte de la altura del
pico
Un valor de A de 1.0 significa simetría. Cuando A > 1.0, el pico se está desviando. Cuando A < 1.0, el pico está al frente.
s s s
Figura 8.
Repetibilidad del sistema: La repetibilidad de la respuesta se expresa como una desviación estándar relativa porcentual estimada (% RSD) de
una serie consecutiva de mediciones para no menos de tres inyecciones o aplicaciones de una solución de referencia, y se calcula usando la
siguiente ecuación.
−−−−−−
2
100 Σ (yi −ȳ )
% RSD = √
ȳ norte - 1
y = valores individuales expresados como área del pico, altura del pico o relación de áreas por el método de estandarización interna
yo
¯
y = media de valores individuales
Tiempo total de fase móvil ( t ): En cromatografía de exclusión por tamaño, tiempo de retención de un componente cuyas moléculas son
t
AL
más pequeñas que los poros más pequeños del gel (Figura 5).
Volumen total de la fase móvil ( V ): En cromatografía de exclusión por tamaño, volumen de retención de un componente cuyas moléculas
t
son más pequeñas que los poros más pequeños del gel. Puede calcularse a partir del tiempo total de la fase móvil y el caudal ( F ), en
mililitros/minuto, mediante la siguiente ecuación:
CI
V t = tt × F
garantizar el rendimiento adecuado del sistema cromatográfico. El número de platos de la columna, el factor de retención (relación de
distribución de masa), la repetibilidad del sistema, la relación señal/ruido, el factor de simetría y la relación de resolución/pico a valle son los
parámetros que se pueden emplear para evaluar el rendimiento del sistema cromatográfico. Cuando así se indique en la monografía individual,
en el caso de perfiles cromatográficos complejos (p. ej., para productos biotecnológicos y biológicos), la comparación visual de los perfiles
puede utilizarse como prueba de idoneidad del sistema. Los factores que pueden afectar el comportamiento cromatográfico incluyen:
Composición y temperatura de la fase móvil
Fuerza iónica y pH del componente acuoso, de la fase móvil
Caudal, dimensiones de la columna, temperatura de la columna y presión
Características de la fase estacionaria, incluido el tipo de soporte cromatográfico (basado en partículas o monolítico), tamaño de
partículas o poros, porosidad y área de superficie específica
La fase inversa y otras modificaciones superficiales de las fases estacionarias, el alcance de la modificación química (expresada por la
protección de los extremos, la carga de carbono, etc.)
Los tiempos de retención y las retenciones relativas se pueden proporcionar en las monografías solo con fines informativos, a menos que se
indique lo contrario en la monografía. No se aplican criterios de aceptación a las retenciones relativas.
Se requiere el cumplimiento de los criterios de idoneidad del sistema durante todo el procedimiento cromatográfico. Ningún análisis de
muestra es aceptable a menos que se haya demostrado la idoneidad del sistema.
Se deben cumplir los siguientes requisitos, además de cualquier otro criterio de idoneidad del sistema establecido en la monografía. Cuando
se establecen requisitos específicos en la monografía, reemplazan los requisitos mencionados en este capítulo.
♦ Cuando se especifica un requisito de desviación estándar relativa en una monografía individual, si el requisito es 2,0 o menos, el cálculo se
basa en datos de cinco inyecciones repetidas del analito, si el requisito es superior al 2,0 %, se utilizan datos de seis inyecciones repetidas. .♦
En un ensayo de una sustancia activa o un excipiente, donde el valor objetivo es 100 % para una sustancia pura y no se especifica un
requisito de repetibilidad del sistema, se calcula la desviación estándar relativa máxima permitida (% RSD max ) para los límites definidos
para
una serie ( n = 3 a 6) de inyecciones de la solución de referencia. La desviación estándar relativa máxima permitida de la respuesta pico no
excede el valor apropiado dado en la Tabla 2.
k B√norte
% RSD =
má ximo
t90 % , norte - 1
t n
= t de Student al nivel de probabilidad del 90% (doble cara) con n −1 grados de libertad
90%,
–1
b (%)
2.0
AL3
0.41
4
0.59
5
0.73
6
0.85
CI
2.5 0.52 0.74 0.92 1.06
▲
Sensibilidad del sistema
La relación señal-ruido se utiliza para definir la sensibilidad del sistema. El límite de cuantificación (que corresponde a una relación
O
Simetría máxima
A menos que se indique lo contrario, en una prueba o ensayo, el factor de simetría (factor de cola) del pico utilizado para la cuantificación es
de 0,8 a 1,8.
▲ (RB 1-dic-2023)
Composición de la fase móvil : la cantidad de los componentes menores del solvente se puede ajustar en ±30 % relativo o ±2 % absoluto, lo
que sea mayor; ningún otro componente se altera en más del 10% absoluto. Un componente minoritario comprende menos o igual al (100/ n
)%, nsiendo el número total de componentes de la fase móvil. Para un componente menor al 10 % de la fase móvil, un ajuste relativo del 30 %
permite un rango de 7 % a 13 %, mientras que un ajuste absoluto del 2 % permite un rango de 8 % a 12 %, por lo que el valor relativo es mayor;
para un componente menor al 5 % de la fase móvil, un ajuste relativo del 30 % permite un rango de 3,5 %–6,5 %, mientras que un ajuste absoluto
del 2 % permite un rango de 3 %–7 %, siendo el valor absoluto el mayor en este caso.
pH del componente acuoso de la fase móvil : ±0,2 unidades de pH, a menos que se indique lo contrario
Concentración de sales en el componente tampón de una fase móvil : ± 10%
Volumen de aplicación : 10 %–20 % del volumen prescrito si se utilizan placas de partículas finas (2–10 µm)
AL
(SPP) siempre que se cumplan los requisitos mencionados anteriormente.
Dimensiones de la columna (tamaño de partícula, longitud) : El tamaño de partícula y/o la longitud de la columna pueden modificarse,
siempre que la relación entre la longitud de la columna ( L ) y el tamaño de partícula ( dp ) permanezca constante o en el rango entre −25 % a
+50% de la relación L/dp prescrita .
Ajustes de partículas totalmente porosas a partículas superficialmente porosas : Para la aplicación del ajuste del tamaño de partículas de
CI
partículas totalmente porosas a partículas superficialmente porosas, se pueden usar otras combinaciones de L y dp , siempre que el número
de placa ( N ) esté entre -25 % y + 50%, relativo a la columna prescrita. Estos cambios son aceptables, siempre que se cumplan los criterios de
idoneidad del sistema y se demuestre que la selectividad y el orden de elución de las impurezas especificadas a controlar son equivalentes.
Diámetro interno : en ausencia de un cambio en el tamaño y/o la longitud de las partículas, se puede ajustar el diámetro interno de la
columna.
FI
Es necesario tener precaución cuando el ajuste da como resultado volúmenes pico más pequeños debido a un tamaño de partícula más
pequeño o a un diámetro de columna interno más pequeño, una situación que puede requerir ajustes para minimizar el ensanchamiento de la
banda extracolumna por factores como las conexiones del instrumento, el volumen de la celda del detector y la frecuencia de muestreo. y
volumen de inyección.
O
Cuando se cambia el tamaño de las partículas, la tasa de flujo requiere un ajuste, porque las columnas de partículas más pequeñas
requerirán velocidades lineales más altas para el mismo rendimiento (medido por la reducción de la altura de la placa). El caudal se ajusta
tanto para el cambio en el diámetro de la columna como para el tamaño de las partículas utilizando la siguiente ecuación:
2 2
F2 = F1 × [ (d C
2
× d pag
1
) / (d C × d pag
1 2
) ]
fase móvil
Composición : La cantidad de los componentes minoritarios de la fase móvil se puede ajustar en un ±30 % relativo. Sin embargo, el cambio
en cualquier componente no puede exceder el ±10% absoluto. Un componente menor comprende menos o igual al (100/n) %, siendo n el
número total de componentes de la fase móvil:
♦ A continuación se dan ejemplos de ajustes para mezclas binarias y ternarias.
mezclas binarias
Proporción especificada de 50:50: 30% de 50 es 15% absoluto, pero esto excede el cambio máximo permitido de ±10% absoluto en
cualquiera de los componentes. Por lo tanto, la relación de fase móvil puede ajustarse solo dentro del rango de 40:60–60:40.
Proporción especificada de 2:98: 30 % de 2 es 0,6 % absoluto. Por lo tanto, el ajuste máximo permitido está dentro del rango de 1,4: 98,6–2,6:
97,4.
mezclas ternarias
Proporción especificada de 70:25:5 : Para el segundo componente, 30% de 25 es 7,5% absoluto. Por lo tanto, el segundo componente puede
ajustarse dentro del rango de 32,5% a 17,5% absoluto. Para el tercer componente, 30% de 5 es 1,5% absoluto. En todos los casos, se utiliza
una cantidad suficiente del primer componente para dar un total del 100%. Por lo tanto, los rangos de mezcla de 62,5: 32,5: 5 a 77,5: 17,5: 5 o
AL
68,5: 25: 6,5 a 71,5: 25: 3,5 cumplirían con el requisito.♦
pH del componente acuoso de la fase móvil : ±0,2 unidades de pH, a menos que se indique lo contrario
Concentración de sales en el componente tampón de una fase móvil : ±10%
Tasa de flujo : en ausencia de un cambio en las dimensiones de la columna, se permite un ajuste de la tasa de flujo en ± 50%
volumen de inyección
Cuando se cambian las dimensiones de la columna, se puede usar la siguiente ecuación para ajustar el volumen de inyección:
FI
2 2
Vi n j2 = Vi n j 1 (L 2 dC 2 ) / (L 1 dC 1 )
inyección
V = volumen de inyección indicado en la monografía (µL)
1
Esta ecuación puede no ser aplicable a cambios de columnas TPP a columnas SPP.
Incluso en ausencia de cambios en las dimensiones de la columna, el volumen de inyección puede variar siempre que los criterios de
idoneidad del sistema permanezcan dentro de los límites de aceptabilidad establecidos. Cuando se reduce el volumen de inyección, se presta
especial atención a (límite de) detección y repetibilidad de la(s) respuesta(s) máxima(s) a determinar. Se permite un aumento siempre que, en
particular, la linealidad y la resolución de los picos a determinar sigan siendo satisfactorias.
de −25% a +50%, en relación con la columna prescrita ♦para todos los picos utilizados para determinar los parámetros de idoneidad del
sistema♦. Estos cambios son aceptables siempre que se cumplan los criterios de idoneidad del sistema y se demuestre que la selectividad y
el orden de elución de las impurezas especificadas a controlar son equivalentes.
Diámetro interno : en ausencia de un cambio en el tamaño y/o la longitud de las partículas, se puede ajustar el diámetro interno de la
columna.
Es necesario tener cuidado cuando el ajuste da como resultado un volumen de pico más pequeño debido a un tamaño de partícula más
pequeño o a un diámetro de columna interno más pequeño, una situación que puede requerir ajustes para minimizar la ampliación de la banda
extracolumna por factores como las conexiones del instrumento, el volumen de la celda del detector y la tasa de muestreo, y volumen de
inyeccion
Cuando se cambia el tamaño de las partículas, la tasa de flujo requiere un ajuste, porque las columnas de partículas más pequeñas
requerirán velocidades lineales más altas para el mismo rendimiento (medido por la reducción de la altura de la placa). El caudal se ajusta
tanto para el cambio en el diámetro de la columna como para el tamaño de las partículas utilizando la siguiente ecuación:
2 2
F2 = F1 × [ (d C2 × d pag
) / (d C1 × d pag
) ]
1 2
F
1
2
AL
= caudal indicado en la monografía (mL/min)
Un cambio en las dimensiones de la columna y, por lo tanto, en el volumen de la columna, afecta el volumen del gradiente que controla la
selectividad. Los gradientes se ajustan al volumen de la columna cambiando el volumen del gradiente en proporción al volumen de la
O
columna. Esto se aplica a cada volumen de segmento de gradiente. Dado que el volumen de gradiente es el tiempo de gradiente, t ,
G
multiplicado por el caudal, F , el tiempo de gradiente para cada segmento de gradiente debe ajustarse para mantener una relación constante
entre el volumen de gradiente y el volumen de la columna (expresado como L × dc 2 ). Así, el nuevo tiempo de gradiente, t G se puede calcular
2
a partir del tiempo de gradiente original, t G , la(s) tasa(s) de flujo y las dimensiones de la columna de la siguiente manera:
1
2 2
t GRAMO
= t2 × (
GRAMO 1F1 /F2 ) [ (L 2 × d C2 ) / (L 1 × d C1 ) ]
Por lo tanto, el cambio de condiciones para la elución del gradiente requiere tres pasos:
1. Ajuste la longitud de la columna y el tamaño de las partículas según L/dp .
2. Ajuste la tasa de flujo para los cambios en el tamaño de las partículas y el diámetro de la columna.
3. Ajuste el tiempo de gradiente de cada segmento para los cambios en la longitud, el diámetro y el caudal de la columna. El siguiente ejemplo
ilustra este proceso.
Tabla 3
Condiciones de gradiente — — —
Tiempo Tiempo
B (%) (min) (min)
30 0 0 —
30
70
AL 3
13
(3 × 0,4) = 1,2
Temperatura de la columna : ±5° C, donde se especifica la temperatura de funcionamiento, a menos que se indique lo contrario
Es posible que se requieran ajustes adicionales en las condiciones del procedimiento (fase móvil, temperatura, pH, etc.), dentro de los
rangos permitidos descritos en Idoneidad del sistema y ajuste de las condiciones cromatográficas en este capítulo.
fase móvil
O
Composición/gradiente : Los ajustes de la composición de la fase móvil y el gradiente son aceptables siempre que:
Se cumplen los criterios de idoneidad del sistema.
Los picos principales eluyen dentro de ±15 % del tiempo de retención obtenido con las condiciones originales; este requisito no se
aplica cuando se cambian las dimensiones de la columna.
La composición de la fase móvil y el gradiente son tales que los primeros picos se retienen suficientemente y los últimos picos se
eluyen.
pH del componente acuoso de la fase móvil : ±0,2 unidades de pH, a menos que se indique lo contrario
Concentración de sales en el componente tampón de una fase móvil : ±10%
Cuando no se puede lograr el cumplimiento de los criterios de idoneidad del sistema, a menudo es preferible considerar el volumen de
permanencia o cambiar la columna.
volumen de permanencia
La configuración del equipo empleado puede alterar significativamente la resolución, el tiempo de retención y las retenciones relativas
descritas. Si esto ocurre, puede deberse a un cambio en el volumen de permanencia. Las monografías incluyen preferiblemente un paso
isocrático antes del inicio del programa de gradiente para que se pueda hacer una adaptación a los puntos de tiempo del gradiente para tener
en cuenta las diferencias en el volumen de permanencia entre el sistema utilizado para el desarrollo del procedimiento analítico y el realmente
utilizado. Es responsabilidad del usuario adaptar la duración del paso isocrático al equipo analítico utilizado. Si el volumen de permanencia
( D−D0 )
tC = t −
F
F = caudal (mL/min)
El paso isocrático introducido para este fin puede omitirse si se dispone de datos de validación para la aplicación del procedimiento
analítico sin este paso.
Longitud de onda del detector: No se permite ningún ajuste
Volumen de inyección: cuando se cambian las dimensiones de la columna, se puede usar la siguiente ecuación para ajustar el volumen de
inyección:
2 2
Vi n j2 = Vi n j 1 (L 2 d C2
) / (L 1 d C )
1
inyección
V = volumen de inyección indicado en la monografía (µL)
1
CC
cc 2
1_
_
AL
= diámetro interno de la columna indicado en la monografía (mm)
Esta ecuación puede no ser aplicable a cambios de columnas TPP a columnas SPP.
Incluso en ausencia de cualquier cambio en las dimensiones de la columna, el volumen de inyección puede variar siempre que los criterios
CI
de idoneidad del sistema permanezcan dentro de los límites de aceptabilidad establecidos. Cuando se reduce el volumen de inyección, se
presta especial atención a (límite de) detección y repetibilidad de la(s) respuesta(s) máxima(s) a determinar. Se permite un aumento siempre
que, en particular, la linealidad y la resolución de los picos a determinar sigan siendo satisfactorias.
Cromatografía de gases
FI
parámetros de columna
Fase estacionaria
Tamaño de partícula : Reducción máxima del 50%; no se permite aumento (columnas empaquetadas)
O
CUANTIFICACIÓN
Los siguientes enfoques de cuantificación pueden usarse en textos generales o monografías.
AL
compuesto que se va a analizar y la del patrón interno, y la cantidad del compuesto se lee o calcula a partir de la función de calibración.
Usando la calibración de un punto: En una monografía individual, generalmente una de las soluciones estándar con una concentración dentro
del rango lineal de la función de calibración y una solución de muestra con una concentración cercana a la de la solución estándar, ambas
conteniendo una cantidad fija de la se prepara el patrón interno y se realiza la cromatografía en condiciones fijas para determinar la cantidad
del compuesto a analizar comparando las proporciones obtenidas.
CI
Procedimiento de normalización : Siempre que se haya demostrado la linealidad de los picos, las monografías individuales pueden prescribir
que el contenido porcentual de un componente de la sustancia que se va a examinar se calcule determinando el área del pico correspondiente
como porcentaje del área total de todos los picos. , excluyendo los debidos a solventes o reactivos o que surjan de la fase móvil o la matriz de
la muestra, y aquellos en o por debajo del límite de desconocimiento o umbral de reporte.
FI
OTRAS CONSIDERACIONES
Respuesta del detector: ♦La sensibilidad del detector es la señal de salida por unidad de concentración o unidad de masa de una sustancia
(también conocida como factor de respuesta) en la fase móvil que ingresa al detector. El factor de respuesta relativo del detector, comúnmente
denominado factor de respuesta relativo, expresa la sensibilidad de un detector para una sustancia determinada en relación con una sustancia
O
estándar.
En las pruebas para sustancias relacionadas, se aplican los factores de corrección indicados en la monografía.♦
Picos que interfieren: Los picos debidos a disolventes y reactivos o que surgen de la fase móvil o la matriz de la muestra no se tienen en
cuenta.
Medida de picos: La integración del área del pico de cualquier impureza que no esté completamente separada del pico principal se realiza
preferentemente por desnatado tangencial (Figura 9).
Figura 9.
umbral de notificación
Cuando la prueba de sustancias relacionadas prescribe un límite para el total de impurezas o una determinación cuantitativa de una
impureza, es importante elegir un umbral de notificación apropiado y condiciones apropiadas para la integración de las áreas de los picos.
En dichas pruebas, el umbral de informe, es decir, el límite por encima del cual se informa un pico, se define generalmente en 0,05%.
Información de la página:
USP43-NF38-6853
USP42-NF37-6781
USP41-NF36-6363