Microbiología. Curso 2023.

Unidad temática 3

Prof. Adj. María Eugenia Torres.

METODOS DE ESTUDIO en MICROBIOLOGÍA

 Diagnóstico Microbiológico:
 Métodos directos,
 Métodos indirectos
 Medidas de desempeño de los test diagnósticos

El Laboratorio de Microbiología Clínica tiene como objetivos:

 Realizar el diagnostico etiológico o sea, establecer la causa de la enfermedad infecciosa.
 Estudiar la sensibilidad a antimicrobianos.
 Integrar el equipo de salud que atiende al paciente
 Trabajar en Control de Infecciones
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO:
 Para cada enfermedad se debe elegir el mejor método.
 Dependerá del tipo de agente, la necesidad de un diagnostico inmediato o no, el desempeño de la técnica
empleada.
 Las características de la población con la que se trabaje.
 Costos y efectividad.

Los métodos de diagnóstico de Microbiología se clasifican en métodos directos e indirectos.

DIRECTOS: Ponen en evidencia el agente causal o sus productos.

 Observación microscópica.
 Cultivo e identificación del agente.
 Detección de antígenos microbianos.
 Detección de ácidos nucleicos.
 Detección de proteínas u otras sustancias

INDIRECTOS: Ponen en evidencia la respuesta inmunológica del Hospedero frente al agente infeccioso
 Anticuerpos o inmunidad humoral.
 Inmunidad celular

Patrón de oro (o Gold estándar)

 Es la mejor técnica disponible, contra la cual se comparan las otras.
 En general se usa para comparar nuevas técnica.
 Las nuevas técnicas pueden superar el desempeño del patrón de oro o no.

a) METODOS DIRECTOS
 DETECTAN AL MICROORGANISMO O PARTES DEL MISMO
 mediante Microscopia
 mediante el Cultivo
 mediante la investigación de antígenos del microbio:
◦ reacciones de Aglutinación
◦ técnica de Inmunofluorescencia
◦ técnica de Elisa o EIA
 detección de Ácidos nucleicos
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 detección de Proteínas
a.1. Microscopia
 Microscopio de campo claro: el más utilizado para ver bacterias y levaduras. Utiliza una fuente de luz para
iluminar el campo de observación.
 Aumentos: de 10 veces en la lente ocular y de 4 a 100 veces en la lente del objetivo ( la que es cercana al
preparado)
 El aumento total surge de multiplicar ambos
 ejemplo 10 de la lente ocular y 100 del objetivo : aumento final :1000 x (mil veces)
 El material a observar se coloca en una lámina de vidrio llamada portaobjeto.

Microscopio óptico
En general se emplea un aumento 1000X para ver bacterias

Aumentos menores se emplean para ver parásitos, levaduras, hongos (p Ej. 400X)
Imagen de Parasitosis intestinales
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Imagen levaduras sin tinción y teñidas con azul de metileno (coloración simple)

Coloraciones
Las bacterias, hongos y levaduras, en general no se diferencian del agua, por lo cual, para facilitar su
observación se emplean coloraciones.

 Tinciones simples p ej. Azul de metileno

 Diferenciales : Gram, Zhiel Neelsen
 Coloraciones especiales (que por ejemplo tiñen la cápsula o los flagelos)
 Coloraciones con fluorescencia: se emplea una sustancia fluorescente y luego se observan con un
microscopio de luz ultravioleta.
Bacterias acido alcohol resistentes (BAAR)
 Mycobacterium tuberculosis
 Mycobacterium leprae
Se emplea coloración de Zhiel Neelsen, que
incluye un paso con aplicación de calor para lograr
que el colorante penetre la pared bacteriana y se
mira al microscopio (¨Baciloscopía¨)
Esta es una técnica sencilla y barata para
diagnóstico de TUBERCULOSIS. También se
emplean tinciones con sustancias fluorescentes
que facilitan la observación, sobre todo cuando se
deben mirar grandes cantidades de muestras
clínicas al día.
La Pared Celular de las Mycobacterias, esta es
similar a la de las Gram positivas, pero muy rica en
lípidos y ceras.

BACILOS ACIDO ALCOHOL RESISTENTES

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 Microscopía de campo oscuro Es un microscopio que tiene un haz de luz muy intensa que ilumina el
objeto, dejando oscuro el fondo. Se emplea para
 Espiroquetas: Leptospiras, Treponemas, Borrellias. Son bacterias espirilares finas y delicadas, que no se
tiñen con colorantes habituales.
 Se emplea por ejemplo para el diagnóstico de sífilis primaria ya que la lesión inicial (llamada chancro de
inoculación, como se ve en la imagen) tiene al agente Treponema pallidum. Se efectúa un raspado de la
lesión y se observa el material en el microscopio de campo oscuro. Las espiroquetas aparecen brillantes
sobre el fondo oscuro e incluso se puede observar su movilidad.

◦
 Microscopio de fluorescencia
◦ Emplean colorantes fluorescentes (unidos o no a anticuerpos -IF directa- o Antígenos- IF indirecta)
◦ ES DECIR: Se emplean como técnica directa , ( para buscar antígenos) o indirecta (anticuerpos)
◦ Luz ultravioleta que excita al colorante y emite coloración fluorescente
◦ Relativamente más fácil de visualizar
Auramina Se emplea para diagnóstico de Tuberculosis No implica uso de anticuerpos.
Inmunofluorescencia directa: P ej. Chlamydia trachomatis, virus respiratorios
Anticuerpos anti antígenos de ese germen unidos a sustancia fluorescente que se fijan a la célula huésped
(TECNICA DIRECTA)
 Chlamydia trachomatis
Inmunoflorescencia para C.trachomatis en Exudado de
cuello uterino. Se observan en color verde fluorescente las
partículas de la bacteria

Inmunofluorescencia Adenovirus Aspirado nasofaríngeo lactante. En

este caso se observan levemente anaranjadas las células de las
secreciones respiratorias del paciente y los antígenos virales de color
verde, dispuestos en los bordes de la célula
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 Microscopio electrónico
◦ Poco empleada para el diagnóstico clínico rutinario.
◦ Requiere equipamiento (ME)
◦ P ej. Rotavirus en materia fecal
◦ Emplea un rayo de electrones en vez de luz
◦ Puede aumentar 2.000.000 veces la imagen.
Útiles para estudio de nuevos agentes o que no han
podido ser cultivados
Microscopía Electrónica: Se observa Rotavirus en el
filtrado de materia fecal de un paciente lactante con
diarrea. Se reconoce la forma de la cápside del virus
similar a una rueda.

a.2) Cultivos
 Tienen como objetivo AISLAR A LA CEPA O GERMEN INVOLUCRADO
 Establecen el diagnostico etiológico
 Permiten identificar y estudiar en profundidad la cepa
 Permiten realizar estudios de sensibilidad a los antibióticos
 Pueden guardarse, compararse (p ej. brotes), tipificarse de diversas maneras
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Cultivos para bacterias:

 Se deben establecer las condiciones de temperatura, humedad, pH, nutrientes, atmósfera para que
crezca cada bacteria en particular
 Para el caso de microorganismos intracelulares obligados
◦ Virus , Chlamydias SE REQUIEREN CULTIVOS CELULARES (CELULAS EUCARIOTAS QUE SE
MANTIENEN VIVAS EN EL LABORATORIO)

.
Tipos de medios de cultivo:
 MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS o CALDOS. Originalmente se preparaban caldos o infusiones con
mezclas de tejidos animales y agregado de sustancias como suero animal o almidón para obtener en
ellos crecimiento bacteriano. Además de agua contienen fuentes de nutrientes como proteínas,
hidratos de carbono, lípidos, vitaminas, factores de crecimiento. Estos caldos son habitualmente
límpidos y cuando las bacterias crecen en ellos se tornan turbios.

 MEDIOS SOLIDOS, A la mezcla de agua y nutrientes se les agrega una sustancia gelificante llamada
agar, que no es atacada por las bacterias. Eso hace que el medio se vuelva sólido y permite entonces
obtener colonias aisladas, visibles a simple vista. Las colonias son conjunto de bacterias derivadas de
una única célula que luego de la incubación adecuada alcanza un número elevado de unidades
 Los medios líquidos y sólidos como se dijo pueden contener factores diversos para el crecimiento y
la diferenciación de las bacterias. Se les agrega a los medios sustancias para enriquecerlos como
Sangre ovina, suero, factores de crecimiento, también antibióticos para inhibir la flora que hay en la
muestra (medios selectivos), indicadores de pH para poner en evidencia alguna reacción química.
 Imagen: medio de cultivo líquido con el agregado de carne picada, empleado para el crecimiento de
bacterias anaerobias como Clostridium.

Los medios de cultivo SOLIDOS representaron un avance en la Microbiología ya que

permitieron obtener colonias aisladas y por lo tanto cultivos ´puros¨ de una determinada
bacteria.

CEPA: hablamos de cepa cuando partimos de una colonia aislada y la propagamos, en ese
caso, su descendencia será igual a la bacteria madre. Por ejemplo una cepa de
Staphylococcus aureus
Cuando nombramos a una bacteria por su nombre científico el primer nombre (con
mayúscula) es el Género y el segundo nombre (con minúscula) la especie.
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Staphylococcus aureus. A su vez esa especie puede tener subespecies, subtipos o subgrupos, etc.

Algunos medios de cultivo más empleados en Bacteriología Clínica:

 Agar sangre: Uso general, permite ver el tipo de hemolisis en aquellas bacterias que la presentan.
Se emplea con 5 a 10% de sangre de oveja

 Agar selectivo y diferencial para bacilos Gram negativos: Agar Mac Conkey Lactosa. En él no crecen
las bacterias Gram positivas ( es selectivo) y las Gram negativas, se pueden diferenciar según utilicen
o no la lactosa (es diferencial)

 Medios selectivos especiales para Salmonella y Shigella que se emplean para cultivo de materia fecal.
 Agar Chocolate con factores de crecimiento para bacterias exigentes
 Agar para antibiogramas Müller Hinton
 Medios para anaerobios : suplementados con factores específicos de crecimiento

PARA CULTIVOS DE MUESTRAS DE SITIOS NO ESTERILES se emplean:

 MEDIOS SELECTIVOS
Inhiben determinadas bacterias para dejar crecer otras, CON SUSTANCIAS INHIBITORIAS O CON ANTIBIOTICOS
 MEDIOS DIFERENCIALES
Muestran características para diferenciar grupos, P ej. Lactosa como vimos.
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INCUBACIÓN
Luego de sembrados los medios se colocarán en una estufa incubadora de Bacteriología, que mantiene
constante la temperatura, habitualmente 35ºC para las bacterias de interés médico que son mesófilas y
también se pueden emplear otras temperaturas.
IDENTIFICACION DE LAS COLONIAS AISLADAS
Para la mayoría de las bacterias comunes, pasadas las 18 a 48 horas de incubación se van a poder observar las
colonias aisladas, luego de lo cual las bacterias deben ser identificadas. Para ello, se investiga el metabolismo
de distintos compuestos, la presencia de enzimas o la presencia de determinados antígenos mediante diversas
pruebas y luego se establece el género y si es posible la especie. Estos test o pruebas bioquímicas se siembran
y se incuban por 18 a 24 horas más.
 EJEMPLO distintos test bioquímicos para identificar Klebsiella pneumoniae. Según como viren de color
los medios de identificación, las reacciones serán positivas o negativas y luego puedo comparar mis
resultados con tablas de identificación que me permiten llegar a establecer de que bacteria se trata.

 Existen además Sistemas automatizados de identificación y sensibilidad cuyo uso está muy extendido
que simplifican la tarea de la identificación bacteriana lo mismo que el antibiograma
 Habitualmente, en el momento de realizar las pruebas de identificación, en el laboratorio se realiza
también el antibiograma. Para ello se emplea el Agar Müller Hinton para Antibiograma y discos de
papel impregnados en antibióticos (antibiograma por disco difusión que veremos más adelante)
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 Cultivos celulares se emplean para gérmenes que son parásitos intracelulares, es decir que
requieren una célula para crecer dentro de ella p. ej. virus y clamidias

 Líneas celulares continuas se inoculan y se observa su efecto

 Virus Sincial Respiratorio

DETECCIÓN DE ANTÍGENOS
 Reacciones basados en la reacción antígeno anticuerpo
 Pueden emplearse para diagnostico directamente de la muestra del paciente
 Pueden emplearse para identificar o caracterizar una cepa aislada
 Antígeno de Streptococcus pneumoniae en Orina
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Se eliminan en la orina del paciente infectado polisacáridos de la capsula de la bacteria que pueden ser
detectados por reacciones de antígeno – anticuerpo.

 Test rápido para Streptococcus grupo A en faringe

 Inmunocromatografía Test rápidos
 Resultado en 15 minutos

 Determinación de serogrupo Streptococcus beta hemolítico

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Copia (elongación, nueva cadena)

Ac. Nucleico original (ADN)

AANN desnaturalizado

Primer o cebadores Primer o cebadores

Nucleótidos A, G, T, C Elongación (crecimiento de cadena

complementaria)
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Primer o cebador

Métodos directos: Detección de Ácidos nucleicos

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

 Técnica de Biología Molecular más empleada

 Primero identificar gen que se quiere detectar. En la muestra del paciente (por ejemplo secreciones,
orina, líquidos biológicos) se realiza la extracción de ácidos nucleicos, estos se copian millones de
veces (amplificación) y el producto amplificado es detectado de distintas maneras.

PCR requiere

 AANN (ácidos nucleicos del agente infeccioso) de la muestra

 PRIMERS o cebadores: Son secuencias de nucleótidos pequeñas y complementarias del gen que se
quiere amplificar que inician la reacción (una para cada extremo)

 ¨MEZCLA DE PCR¨ Con los nucleótidos (Adenina, Guanina, Citosina, Timina), para que se formen las
cadenas de ácido nucleico.

 Taq POLIMERASA : Enzima que sintetiza copias de ADN (polimeriza)

 Ciclos de temperatura altas y bajas que separan y vuelven a unir el ADN (desnaturalización y re
naturalización )

 Tipos de PCR

 ANIDADA o NESTED: Un PCR y luego un segundo PCR dentro del fragmento para aumentar la
precisión del examen.

 MULTIPLE o MULTIPLEX: En una muestra se pueden detectar más de un blanco o microorganismo a

la vez en una muestra. Por ejemplo los distintos agentes de meningitis en el líquido
cefalorraquídeo...

 EN TIEMPO REAL: Se visualiza el producto amplificado a medida que transcurre la reacción, permite
cuantificar Número de copias (Carga viral)

Identificación mediante proteínas microbianas

Proteómica: conocido como técnica de “Malditof”

 ¨desarma¨ al microorganismo en sus componentes y estudia

sus proteínas
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 Cada germen tiene un perfil único de proteínas, que se estudia y se construye una biblioteca o base
de datos con la composición conocida de cada bacteria, hongo, etc.
 Una vez hecho el proceso se compara con la base de datos y se busca la mayor similitud.
 Esta técnica identifica las bacterias y hongos en minutos y en un futuro tendrá más aplicaciones.
Malditof (Imagen de researchgate).

B) METODOS INDIRECTOS
 ANTIGENO : Sustancia que genera una respuesta del sistema inmune ya sea Inmunidad humoral
(ANTICUERPOS) o Inmunidad Celular ( linfocitos T memoria)
 Ejemplos Antígenos Toxinas bacterianas, capsula , proteínas de la superficie del agente infeccioso
 ANTICUERPOS: Proteínas producidas por los linfocitos B que reconocen y pueden bloquear a los
antígenos.
Las reacciones de antígenos con anticuerpos son muy específicas por lo cual pueden usarse para el
diagnóstico.
LAS TÉCNICAS INDIRECTAS Son los que investigan la respuesta del individuo frente a la infección
Esta respuesta puede ser humoral (producción de anticuerpos que se detectan en suero del paciente o en
secreciones) o celular (activación de células del sistema inmune)
Búsqueda de anticuerpos en suero o líquidos biológicos. (o inmunidad HUMORAL)
◦ p Ej. anticuerpos clase IgM anti virus de Hepatitis A
Estudios de la respuesta inmune celular (inmunidad CELULAR)
 P ejemplo PPD para Tuberculosis
Los Método indirectos se basan en la reacción antígeno anticuerpo y la gran especificidad de la
misma.

 Pueden utilizarse anticuerpos monoclonales, que son producidos contra un solo epítope de interés,
lo cual los vuelve muy sensibles y específicos
Test serológicos, son los que detectan anticuerpos en suero del paciente
 Muestra suero (se obtiene sangre en un tubo seco, de manera que coagule y se separa el suero de
los elementos formes como son glóbulos rojos y blancos y factores de coagulación)
 Detecta anticuerpos o inmunoglobulinas de tipo G y M fundamentalmente (IgG/IgM )
 IgM: indican infección en Fase aguda. Son los primeros en aparecer.
 IgG: suele indicar infección pasada o crónica, son anticuerpos muchas veces protectores frente a
una nueva infección, confieren inmunidad a largo plazo.
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– Ejemplos de métodos serológicos Inmunofluorescencia (IF), inmuno análisis enzimático (EIA),

Inmunoblot, etc.
– En ambos (IF, EIA) se ponen en contacto suero del paciente (en el que estarían los anticuerpos si el
paciente está infectado) y el antígeno propio del germen.
– Si los anticuerpos están presentes se produce la unión del anticuerpo al antígeno, esa unión puede
ser detectada mediante otro anticuerpo anti humano, unido a una sustancia que es fluorescente o a
una enzima.
– EN el caso de IF, se observa en un microscopio de fluorescencia.
 En el caso de EIA una enzima que hace cambiar de color a un sustrato

 EIA (ELISA)
Ensayo inmuno enzimático
Actualmente se emplean técnicas automatizadas, que pueden procesar gran número de muestras
Luego de poner en contacto el suero del paciente con el antígeno se agrega un Anticuerpo anti Ig humano
conjugado con una enzima y el Sustrato de la enzima
Una vez que la enzima actúa sobre el sustrato, este se convierte en una sustancia coloreada. Esa Reacción
coloreada es medida luego.
Permiten cuantificar (título de anticuerpos)
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 Inmunoblot
– Electroforesis de los distintos componentes, p ej. de virus VIH, se produce la separación de los mismos
– Suero del paciente
– Lavado
– Sistema revelador
– Bandas
– Muy específico
– Integra el algoritmo de diagnóstico de infección por VIH

Desempeño de los métodos de diagnóstico

 Qué tan bueno es este método respecto a otro?
 ¿Cuál es el mejor?
 NO siempre cuento con el Patrón de Oro
 Para ello se emplean diversos parámetros, como la SENSIBLIDAD y ESPECIFICIDAD y los VALORES
PREDICTIVO POSITIVO Y PREDICTIVO NEGATIVO. (VPP y VPN)
SENSIBILIDAD DE UN TEST DIAGNOSTICO
 Capacidad de la prueba para detectar la enfermedad en sujetos enfermos.
 S = VP / (VP+FN).
ESPECIFICIDAD DE UN TEST DIAGNOSTICO
 Capacidad de la prueba para dar como negativos los casos realmente sanos
 proporción de sanos correctamente identificados.
 E = VN / (FP+VN).
VALORES PREDICTIVOS
 Los parámetros S y E están afectados por la prevalencia de la enfermedad en la población
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 Por ejemplo , no es igual un test Inmuno-cromatográfico para Chlamydia trachomatis en población

general que en trabajadores sexuales
Valor predictivo positivo (VPP)
 Porcentaje de casos clasificados como positivos por el test diagnóstico, respecto al total de casos
positivos según el Patrón de Oro
 VPP = VP / (VP+FP)
Valor predictivo negativo (VPN)
 Porcentaje de casos clasificados como negativos por el test diagnóstico, respecto al total de casos
negativos según el Patrón de Oro
 VPN = VN / (FN+VN)
Algoritmos: en el diagnóstico de diversas infecciones se emplean algoritmos o secuencias de test para
llegar a un diagnóstico preciso. Se definen distintos tipos de test:
 Test de screening o de Tamizaje, a menudo son de alta Sensibilidad
 Test confirmatorios: de alta Especificidad
Ejemplo Serología de Donantes
 Se determina la presencia de anticuerpos para varias enfermedades trasmisibles como por ejemplo
HIV. Se emplean test de tamizaje (muy sensible), cuando uno de estos test es positivo, se debe
emplear un segundo test (test confirmatorio) de alta especificidad.

ARTE EN AGAR
Escherichia coli en medio Mac Conkey lactosa (colonias rosadas =
LACTOSA POSITIVAS)
Tomado de: Petri dish Picasso. Empleando bacterias en placas de Petri con
diversos medios de cultivo se realizan imágenes. Los colores se deben a las
diferentes reacciones de las bacterias en los distintos medios

Este material ha sido elaborado por los docentes del curso, para uso exclusivo de los estudiantes del mismo.
No puede ser reproducido. Las imágenes han sido tomadas de internet solamente con fines docentes