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TESIS DOCTORAL
2015
OLIGOESCUARAMIDAS CÍCLICAS: SÍNTESIS Y

ACTIVIDAD BIOLÓGICA
Ángel Sampedro Palerm

TESIS DOCTORAL
2015
Programa de Doctorado en Ciencia y Tecnología

Química
OLIGOESCUARAMIDAS CÍCLICAS: SÍNTESIS Y

ACTIVIDAD BIOLÓGICA
Ángel Sampedro Palerm
Director/a: Antonio Costa Torres

Director/a: Mª del Carmen Rotger Pons
Doctor/a por la Universitat de les Illes Balears

A mi familia y amigos,
no toda la “química” es mala.
V
PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS
1. Villalonga, P.; Fernández de Mattos, S.; Ramis, G.; Obrador-Hevia, A.; Sampedro, A.;
Rotger, C.; Costa, A.; Cycloesquaramides as Kinase Inhibitors with Anticancer
Activity. ChemMedChem, 2012, 7, 1472-1480.
DOI: 10.1002/cmdc.201200157
2. Sampedro, A.; Villalonga-Planells, R.; Vega, M.; Ramis, G.; Fernández de Mattos, S.;
Villalonga, P.; Costa, A.; Rotger, C.; Cell Uptake and Localization Studies of
Squaramide Based Fluorescent Probes. Bioconjugate Chem., 2014, 25, 1537-1546.
DOI: 10.1021/bc500258b
VII
ABREVIATURAS
°C grado centígrado
µl microlitro
µM micromolar
13
C-RMN resonancia magnética nuclear de carbono
1
H-RMN resonancia magnética nuclear de protón
2D (RMN) experimento bidimensional
Å angstrom
AcOEt acetato de etilo
AcOH ácido acético
AcONH4 acetato amónico
ADN ácido desoxirribonucleico
AMP adenosin monofosfato
ARN ácido ribonucleico
ATP adenosin trifosfato
Boc tert-butiloxicarbonilo
BODIPY boron-dipyrromethene
cm centímetro
COSY COrrelation SpectroscopY
CPP péptido de penetración celular
DCC N,N’-diciclohexilcarbodiimida
DDQ 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona
DiMAP 4-dimetilaminopiridina
DiPEA N,N’-diisopropiletilamina
DMF N,N’-dimetilformamida
DMSO dimetilsulfoxido
DSC calorimetría diferencial de barrido
DSS ácido 4,4-dimetil-4-silapentanosulfónico
ESI (MS) ionización por electroespray
Et2O éter dietílico
Et3N trietilamina
EtOH etanol
FBP fructosa 1,6-bisfosfato
FBS suero fetal bovino
FITC fluoresceína 5-isotiocianato
FRET transferencia de energía por resonancia de Förster
g gramo
GSH glutatión
HMBC Heteronuclear Multiple-Bond Correlation spectroscopy
HPLC cromatografía líquida de alto rendimiento
HRMS espectrometría de masas de alta resolución
HSQC Heteronuclear Single-Quantum Correlation spectroscopy
Hz hercio
ITC calorimetría de valoración isotérmica
IUPAC Unión Internacional de Química Pura y Aplicada
K grado Kelvin
Kas constante de asociación
Kcal kilocaloría
Ki constante de ionización
kJ kilojulio
IX
Oligoescuaramidas cíclicas: síntesis y actividad biológica
M molar
M1 coeficiente de solapamiento de Mander del canal 1 sobre el 2
M2 coeficiente de solapamiento de Mander del canal 2 sobre el 1
M6P manosa 6-fosfato
MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization – Time Of Flight
mbar milibar
MeOH metanol
mg miligramo
MHz megahercio
min minuto
ml mililitro
mm milímetro
mmol milimol
mM milimolar
MΩ megaohmio
NIH3T3 fibroblastos embrionarios de ratón
nM nanomolar
nm nanómetro
NMP N-metilpirrolidona
OG Oregon Green 488
P coeficiente de correlación de Pearson
PBS tampon salino de fosfato
PCh fosfocolina
PET transferencia electronica fotoinducida
PGA penicilina G amidasa
pH acidez del medio
pKa constante de acidez
QS sulfato de quinina
Rdto rendimiento
RFP proteína roja fluorescente
RMN resonancia magnética nuclear
ROE Rotating-frame Overhauser Enhacement
ROS especies reactivas de oxígeno
TBA tetrabutilamonio
TBP tributilfosfina
tBuOH tert-butanol
TCEP tris(2-carboxietil)fosfina
TFA ácido trifluoroacético
THF tetrahidrofurano
TMSE trimetilsilil etanol
TSTU tetrafluoroborato de N,N,N’,N’-tetrametil-O-(N-succinimidil)uronio
U87MG células de glioma humano
UIB Universitat de les Illes Balears
UV-Vis ultravioleta-visible
VIH virus de inmunodeficiencia humana
β constante global de estabilidad
ΔH entalpía de formación
ΔS entropía
ε coeficiente de extinción molar
λ longitud de onda
Φ rendimiento cuántico
X
RESUMEN
En esta Tesis Doctoral, titulada “Oligoescuaramidas cíclicas: síntesis y actividad

biológica”, se recoge la síntesis de diferentes derivados escuaramídicos con
aplicaciones biológicas. La Tesis se divide en cuatro capítulos. El primer capítulo es una
introducción y los tres capítulos restantes recogen los resultados obtenidos siguiendo
el flujo de trabajo temporal, ya que los objetivos de cada capítulo derivan de los
resultados del capítulo anterior.
El primer capítulo es una introducción donde se describe la unidad escuaramida y las

aplicaciones biológicas de algunos compuestos que incluyen esta estructura.
En el segundo capítulo se presenta la síntesis de oligoescuaramidas cíclicas con

diferentes modificaciones estructurales. Una vez resuelta la síntesis y elucidación
estructural, se ha estudiado su actividad antitumoral comparando los resultados con
los obtenidos en un estudio previo. En este capítulo se detallan además las diferentes
alternativas sintéticas que se han seguido para hacer frente a los inconvenientes que
se han ido presentando durante las etapas de elongación y macrociclación.
En el tercer capítulo se describe la síntesis de tres sondas fluorescentes con la finalidad

de seguir la evolución temporal y la localización intracelular de las oligoescuaramidas
una vez realizado el tratamiento. El estudio se ha realizado utilizando la
oligoescuaramida cíclica de menor tamaño debido a su baja citotoxicidad.
En total se han preparado tres sondas que se diferencian en el fluoróforo utilizado y en

el método de conjugación. Los mejores resultados se han obtenido con una sonda que
incluye un derivado de BODIPY como marcador fluorescente. Esta sonda se internaliza
mediante transporte activo y es fotoestable.
La facilidad de internalización celular se ha explicado en base a la afinidad observada

entre la oligoescuaramida cíclica y moléculas fosforiladas presentes en la membrana
celular y en el citoplasma. Para apoyar esta hipótesis, se describen los estudios
realizados mediante ITC para determinar la afinidad entre una oligoescuaramida cíclica
cuaternizada y modelos de algunas biomoléculas relevantes tales como: manosa 6-
fosfato, fosfocolina, etc.
Los conjugados covalentes de oligoescuaramidas cíclicas pueden facilitar el transporte

de fármacos. Por esto y contando con las evidencias de la internalización celular, se ha
planteado su utilización futura como transportadores autoinmolativos. Así pues, el
cuarto capítulo se ha dedicado al diseño, síntesis y evaluación de un sistema
autoinmolativo compuesto por una unidad escuaramida y un modelo de "carga", en
este caso un fluoróforo. Después de diversos intentos se ha conseguido optimizar un
sistema basado en el uso de grupos disulfuro como gatillo. El sistema desarrollado
XI
libera la totalidad de la “carga” en condiciones fisiológicas propias de un entorno

intracelular en un periodo de dos horas. De este modo se abre la posibilidad de
funcionalizar uno de sus extremos con oligoescuaramidas cíclicas u otros
transportadores, activando la liberación de la “carga” únicamente en el interior celular
y separando de esta manera el transportador de la "carga".
XII
RESUM
A aquesta Tesi Doctoral, titulada “Oligoesquaramides cícliques: síntesis i activitat

biològica”, es recull la síntesis de diferents derivats esquaramídics amb aplicacions
biològiques. La Tesi es divideix en quatre capítols. El primer capítol és una introducció i
els tres capítols restants recullen els resultats obtinguts seguint un flux de treball
temporal, ja que els objectius de cada capítol deriven dels resultats del capítol
anterior.
El primer capítol és una introducció on es descriu la unitat esquaramida i les

aplicacions biològiques d’alguns composts que inclouen aquesta estructura.
Al segon capítol es presenta la síntesis d’oligoesquaramides cícliques amb diferents

modificacions estructurals. Una vegada resolta la síntesis i elucidació estructural, s’ha
estudiat la seva activitat antitumoral comparant els resultats amb els obtinguts a un
estudi previ. En aquest capítol es detallen a més les diferents alternatives sintètiques
que s’han seguit per fer front als inconvenients que s’han anat presentant durant les
etapes d’elongació i macrociclación.
Al tercer capítol es descriu la síntesis de sondes fluorescent amb la finalitat de seguir

l’evolució temporal i la localització intracel·lular de les oligoesquaramides una vegada
realitzat el tractament. L’estudi s’ha realitzat emprant l’oligoesquaramida cíclica més
petita degut a la seva baixa citotoxicitat.
En total s’han preparat tres sondes fluorescent que es diferencien al fluoròfor emprat i
al mètode de conjugació. Els millors resultats s’han obtingut amb una sonda que inclou
un derivat de BODIPY com a marcador fluorescent. Aquesta sonda s’internalitza
mitjançant transport actiu i es fotoestable.
La facilitat d’internalització cel·lular s’ha explicat en base a l’afinitat observada entre

l’oligoesquaramida cíclica i molècules fosforilades presents a la membrana cel·lular i al
citoplasma. Per suportar aquesta hipòtesis, es descriuen els estudis realitzats amb ITC
per determinar l’afinitat entre una oligoesquaramida cíclica quaternitzada i models
d’algunes biomolècules rellevants tals com: manosa 6-fosfat, fosfocolina, etc.
Els conjugats covalents d’oligoesquaramides cícliques poden facilitar el transport de

fàrmacs. Per aquest motiu i amb les evidències de la internalització cel·lular, s’ha
plantejat la seva utilització futura com a transportadors autoimmolatius. Així doncs, el
quart capítol s’ha dedicat al disseny, síntesis i avaluació d’un sistema autoimmolatiu
format per una unitat esquaramida i un model de “càrrega”, en aquest cas un
fluoròfor. Després de diversos intents s’ha aconseguit optimitzar un sistema basat en
l’ús de grups disulfur com a gallet. El sistema desenvolupat allibera la totalitat de la
“càrrega” en condicions fisiològiques pròpies d’un entorn intracel·lular en un període
XIII
de dues hores. D’aquesta forma s’obre la possibilitat de funcionalizar un dels seus

extrems amb oligoesquaramides cícliques o altres transportadors, activant l’alliberació
de la “càrrega” únicament a l’interior cel·lular i separant d’aquesta forma el
transportador de la “càrrega”.
XIV
SUMMARY
This Doctoral thesis, entitled “Cyclic oligosquaramides: synthesis and biological

activity”, put together the synthesis of different squaramidic derivatives with
biological applications. The Thesis is divided in four chapters. The first one is an
introduction and the remaining three chapters compile the results obtained following
a temporal workflow. This evolution is because of the objectives of every chapter
come from the results of the previous one.
In the first chapter are described an introduction of the squaramide unit and the
biological applications of some compounds with this structure.
The second chapter presents the synthesis of cyclic oligosquaramides with different
structural modifications. Once solved the synthesis and structural elucidation, their
antitumor activity has been evaluated, comparing the results with those obtained in a
previous assay. In this chapter are also included the different synthetic strategies
followed in order to overcome the drawbacks arisen during the elongation and
macrocyclization stages.
The third chapter reports the synthesis of fluorescent probes with the aim of following
the temporary evolution and the inner cell localization of the oligosquaramides once
the treatment is done. The study has been done with the smallest cyclic
oligosquaramide due to its low cytotoxicity.
Altogether, three fluorescent probes have been prepared, differing in the fluorophore
used and the conjugation procedure. Best results have been achieved with a probe
containing a BODIPY derivative as a fluorescent marker. This probe is internalized by
active transport and has a great photostability.
The easily achieved cell internalization has been explained with the affinity observed
between the cyclic oligosquaramide and phosphorylated molecules found in cell
membranes and in the cytoplasm. To support this hypothesis, this chapter includes the
experiments done with ITC in order to determine the affinity between a cyclic
quaternized oligosquaramide and models from some relevant biomolecules as:
mannose 6-phosphate, phosphocholine, etc.
The covalent conjugates with cyclic oligosquaramides are able to facilitate drugs
transportation. Because of this, and with the evidence of the observed cell
internalization, its utilization as autoimmolative carriers has been proposed. So, fourth
chapter has been dedicated to the design, synthesis and evaluation of an
autoimmolative system consisting in a squaramide unit and a load, in this case a
fluorophore. After some attempts, the system has been optimized using a disulfide
bond as the trigger. The developed autoimmolative system releases the entire load in
XV
physiological conditions after two hours. In this way, it is possible to functionalize one
of the ends of the disulfide with cyclic oligosquaramides and other transporters,
triggering the release of the load only in the inner cell, dividing with this methodology
the load from the carrier.
XVI
ÍNDICE
CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN
1.1 La química supramolecular y la biología 3
1.1.1 Interacciones intermoleculares 3
1.2 El ácido escuárico y sus derivados 5
1.2.1 Propiedades conformacionales 7
1.2.2 Interacción mediante enlace de hidrógeno 11
1.2.3 Carácter bioisóstero de las escuaramidas 14
1.2.4 Antecedentes de actividad biológica de escuaramidas 16
1.2.4.1 Escuaramidas con propiedades anticancerígenas 17
CAPÍTULO 2. DISEÑO, SÍNTESIS Y EVALUACIÓN BIOLÓGICA DE

OLIGOESCUARAMIDAS CÍCLICAS
2.1 Introducción 23
2.2 Oligoescuaramidas cíclicas: principios de diseño 26
2.2.1 Síntesis de oligoescuaramidas cíclicas 26
2.2.2 Evaluación biológica de las oligoescuaramidas cíclicas C2-C6:
descripción y resultados previos 28
2.2.2.1 Ensayos de viabilidad 28
2.2.2.2 Estudios iniciales: actividad antitumoral de las oligoescuaramidas
cíclicas C2-C6 28
2.3 Cinasas 31
2.4 Objetivos 37
2.5 Resultados y discusión 39
2.5.1 Modificaciones estructurales 39
2.5.2 Metodología general para la síntesis de oligoescuaramidas cíclicas 41
2.5.2.1 Protección de grupos amino 43
2.5.2.2 Síntesis del módulo de crecimiento 6 43
2.5.2.3 Síntesis del módulo central 5 44
2.5.2.4 Elongación de oligómeros 45
2.5.2.5 Macrociclación 46
2.5.2.6 Síntesis de la oligoescuaramida cíclica C7 18 47
2.5.3 Síntesis de oligoescuaramidas cíclicas con el sustituyente del
nitrógeno terciario modificado 49
2.5.3.1 Síntesis de la oligoescuaramida cíclica C5(N-Bencilo) 25 50
2.5.3.2 Síntesis de la oligoescuaramida cíclica C5(N-Leucina) 31 52
2.5.4 Síntesis de oligoescuaramidas cíclicas con uno de los espaciadores
modificado 57
2.5.4.1 Síntesis de la oligoescuaramida cíclica C5(c7) 41 58
XVII
2.5.4.2 Síntesis de las oligoescuaramidas cíclicas C5(Met-c3) 50 y

C6(Met-c3) 51 60
2.5.6 Bioensayos 64
2.5.6.1 Ensayos de viabilidad celular 65
2.5.6.2 Resultados de los ensayos 67
2.5.6.3 Análisis de resultados de los IC50 obtenidos 69
2.6 Conclusiones 71
2.7 Métodos experimentales 73
2.7.1 Síntesis 74
2.7.2 Tests de viabilidad 87
2.7.3 Ensayos de IC50 88
2.8 Colección de espectros de RMN de los productos relevantes 89
CAPÍTULO 3. SONDAS MOLECULARES FLUORESCENTES

3.2 Marcadores celulares 107
3.3 Fluorescencia 110
3.3.1 Quenching 111
3.3.2 Rendimiento cuántico 114
3.3.3 Ventajas y aplicaciones de la fluorescencia en sistemas biológicos 115
3.4 Sondas moleculares fluorescentes 116
3.4.1 Clasificación de fluoróforos 116
3.4.2 Derivatización de fluoróforos 118
3.4.2.1 Fluoresceína 118
3.4.2.2 BODIPY 122
3.5 Transporte trans-membrana 127
3.5.1 Internalización selectiva 130
3.6 Objetivos 135
3.7.1 Síntesis de las sondas fluorescentes 137
3.7.1.1 Síntesis de la oligoescuaramida cíclica apta para la conjugación
con fluoróforos 137
3.7.1.2 Elección y síntesis de los fluoróforos 139
3.7.1.3 Síntesis de la sonda fluorescente C2-BDP 69 143
3.7.1.4 Síntesis de la sonda fluorescente C2-FITC 70 144
3.7.1.5 Síntesis de la sonda fluorescente C2-Pyr 72 145
3.7.2 Caracterización fotofísica de las sondas fluorescentes 146
3.7.2.1 Espectros de absorción-emisión 146
3.7.2.2 Variación de la fluorescencia en función del pH 149
3.7.2.3 Cálculo de los rendimientos cuánticos 150
3.7.3 Evaluación biológica de las sondas fluorescentes 155
XVIII
3.7.3.1 Estudios de colocalización celular con la sonda C2-BDP 69 156
3.7.3.2 Experimentos de inhibición del transporte activo 159
3.7.4 Interacción de la oligoescuaramida cíclica 74 con grupos fosfato
como modelos de componentes de membranas biológicas 161
3.8 Conclusiones 177
3.9.1 Síntesis 180
3.9.2 Obtención de espectros de absorción-emisión 191
3.9.3 Variación de la fluorescencia en función del pH 192
3.9.4 Cálculo de los rendimientos cuánticos 192
3.9.5 Fotoestabilidad de la sonda C2-BDP 69 en PBS 194
3.9.6 Obtención de las constantes termodinámicas de los compuestos
fosforilados 194
3.9.7 Obtención de las constantes termodinámicas de los complejos
74·Fosfato 195
CAPÍTULO 4. ESPACIADORES AUTOINMOLATIVOS
4.1 Motivación del capítulo 215

4.3 Sistemas autoinmolativos 218
4.3.1 Transportadores 219
4.3.1.1 Transportadores no específicos o funcionalizables:
nanomateriales 219
4.3.1.2 Transportadores específicos 221
4.3.2 Gatillos 224
4.3.2.1 Gatillos enzimáticos 224
4.3.2.2 Gatillos no enzimáticos 227
4.3.3 Espaciadores autoinmolativos 232
4.4 Módulos autoinmolativos escuaramídicos 238
4.5 Objetivos 239
4.6.1 Diseño de un sistema autoinmolativo de base escuaramida 241
4.6.1.1 Elección de la carga 241
4.6.1.2 Diseño del espaciador autoinmolativo 242
4.6.2 Síntesis y evaluación de diferentes grupos funcionales como
activadores del proceso autoinmolativo 243
4.6.2.1 Síntesis de derivados escuaramido-cumarínicos 244
4.6.2.2 Evaluación inicial de los derivados escuaramido-cumarínicos 244
4.6.3 Sistemas autoinmolativos derivados de escuaramido-cumarinas con
grupos tiol 246
XIX
4.6.3.1 Ventajas del grupo tiol frente al grupo amino 246

4.6.3.2 Elección del disulfuro 247
4.6.3.3 Síntesis del producto de ciclación C1NS 83 248
4.6.3.4 Síntesis del sistema autoinmolativo 86 como modelo de trabajo 249
4.6.3.5 Agentes reductores de disulfuros 250
4.6.3.6 Evaluación del modelo de sistema autoinmolativo 86 252
4.6.3.7 Síntesis del sistema autoinmolativo 96 257
4.6.3.8 Evaluación del modelo de sistema autoinmolativo 96 259
4.6.4 Sistemas autoinmolativos derivados de escuarato-cumarinas con
grupos tiol 262
4.6.4.1 Síntesis y evaluación del sistema autoinmolativo 97 262
4.6.4.2 Síntesis del sistema autoinmolativo 104 266
4.6.4.3 Evaluación del sistema autoinmolativo 104 mediante RMN 270
4.6.4.4 Evaluación del sistema autoinmolativo 104 mediante UV-Vis
y fluorimetría 272
4.6.4.5 Fotoestabilidad del sistema autoinmolativo 104 en disolución 275
4.6.4.6 Estabilidad cinética del sistema autoinmolativo 104 frente
a nucleófilos 277
4.6.4.7 Autoinmolación en presencia de GSH como reductor 278
4.6.4.8 Dependencia del proceso autoinmolativo en función del pH del
medio 279
4.6.5 Perspectivas de aplicabilidad en sistemas biológicos 281
4.7 Conclusiones 283
4.8.1 Síntesis 286
4.8.2 Procedimiento general para la realización de los estudios de
evolución temporal mediante espectrometría UV-Vis y fluorimetría 296
4.8.3 Procedimiento general para la realización de los estudios de
evolución temporal mediante RMN 297
4.8.4 Procedimiento general para la obtención de los coeficientes de
extinción molar 297
4.8.5 Procedimiento general para el cálculo de las velocidades iniciales
de aparición/desaparición 297
4.8.6 Variación de la fluorescencia de la cumarina 106 en función del pH 298
4.8.7 Estabilidad y evolución temporal del producto 104 en función del pH 299
4.8.8 Estabilidad y evolución temporal del producto 104 frente a
nucleófilos 299
XX
CAPÍTULO 1
INTRODUCCIÓN
2
1. Introducción
1.1 La química supramolecular y la biología

Los procesos biológicos que regulan la existencia de los seres vivos comprenden una
multitud de reacciones e interacciones entre sistemas muy diversos. La química
supramolecular permite identificar y categorizar las interacciones moleculares que
ocurren en el mundo biológico de forma que ayudan a comprender mejor mecanismos
de procesos cuya naturaleza es intrínsecamente compleja. Las interacciones receptor-
substrato, claves para cualquier proceso biológico, son las responsables de la gran
especificidad observada en los seres vivos. La replicación y transcripción del ADN, la
síntesis de nuevas proteínas a partir de ARN, la degradación y posterior asimilación de
proteínas externas y aminoácidos, el sistema inmunológico, la sinapsis nerviosa, la
actividad enzimática, etc. Son tan solos unos pocos ejemplos de procesos claramente
biológicos que ponen de manifiesto la importancia de las interacciones no covalentes
en los seres vivos.
Habitualmente las interacciones no covalentes se dan entre un receptor proteínico

muy específico, encargado del reconocimiento, y un substrato que puede variar tanto
en composición como estructura. Éstas interacciones abarcan macromoléculas como
son las proteínas y ácidos nucleicos, que presentan una gran variabilidad
conformacional, hasta moléculas discretas tales como aminoácidos, acetilcolina, etc.
Este principio referido a la especificidad de las interacciones moleculares es el que

describió Emil Fischer mediante el modelo llave-cerradura,1 modificado con
posterioridad por la hipótesis de la adaptación inducida de Daniel E. Koshland.2 En el
modelo llave-cerradura tanto la conformación del receptor proteínico como la del
substrato son fijas, mientras que en la hipótesis de la adaptación inducida las
conformaciones de ambos se adaptan mutuamente para conseguir una
complementariedad estructural y funcional entre el centro activo y el sustrato,
dándose un reconocimiento entre ambas estructuras mediante interacciones
intermoleculares.3
1.1.1 Interacciones intermoleculares
Las interacciones no covalentes que se establecen entre diferentes moléculas

presentan unas energías de disociación más bajas que los enlaces covalentes. Es por
este motivo que se suelen catalogar como fuerzas débiles. Este tipo de fuerzas pueden
ser ión-ión, ión-dipolo, dipolo-dipolo, enlace de hidrógeno o fuerzas de Van der Waals
1
Fischer, E.; Einfluss der Configuration auf die Wirkung der Enzyme. Ber. Dtsch. Chem. Ges., 1894, 27,
2985-2993.
2
Koshland Jr., D. E.; Application of a Theory of Enzyme Specificity to Protein Synthesis. Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A., 1958, 44, 98–104.
3
Cram, D. J.; Preorganization – From Solvents to Spherands. Angew. Chem. Int. Ed., 1986, 25, 1039-
1057.
3
entre otras. Las energías de disociación de los principales tipos de interacciones están
representadas en la tabla 1.4
4
Tabla 1 – Intervalos energéticos de las principales interacciones no covalentes.
Interacción Energía (kJ/mol)

Ión – ión 50 – 300
Metal – ligando 50 – 300
Ión – dipolo 50 – 200
Dipolo – dipolo 5 – 50
Enlace de hidrógeno 4 – 120
Catión – π 5 – 80
π–π 0 – 50
Van der Waals <10
El enlace de hidrógeno es unas de las interacciones más relevantes a nivel biológico. Se

establece entre un átomo de hidrógeno unido covalentemente a un heteroátomo
electronegativo, como el oxígeno o el nitrógeno, llamado donador, y un átomo
electronegativo con pares de electrones disponibles que actúa como aceptor. El
hidrógeno que participa en un enlace de hidrógeno tiene una densidad de carga
positiva que interacciona electrostáticamente con el par de electrones del aceptor de
forma direccional. Como se ha indicado en la figura anterior, los valores energéticos de
este tipo de interacciones oscilan entre 4 y 120 kJ/mol y presentan una distancia
internuclear de unos 3 Å.
En la bibliografía se pueden encontrar multitud de ejemplos de compuestos que

presentan este tipo de interacciones intermoleculares con otras especies, en muchos
casos mediante la formación de enlaces de hidrógeno. Grupos hidroxilo, amidas, ureas,
carboxilatos, aminas o guanidinios son algunos ejemplos de los grupos que se pueden
encontrar en la mayoría de receptores naturales.
Un compuesto que presenta grupos capaces de formar enlaces hidrógeno es el ácido

escuárico y sus derivados, ácidos escuarámicos y escuaramidas.
4
Stedd, J. W.; Atwood, J. L.; Supramolecular Chemistry, pp. 20-30, John Wiley, New York, 2000.
4
1. Introducción
1.2 El ácido escuárico y sus derivados

El ácido escuárico y sus derivados, ácidos escuarámicos y escuaramidas, son
compuestos no naturales con una masa molecular baja, comparable a la de los
aminoácidos, y con una notable capacidad de formación de enlaces hidrógeno (Fig. 1).
Figura 1 – Estructura química del ácido escuárico, el ácido escuarámico y la escuaramida.
El ácido escuárico, cuya nomenclatura IUPAC es 3,4-dihidroxi-3-ciclobuten-1,2-diona,

consiste en un anillo ciclobuténico con dos grupos carbonilo opuestos al doble enlace y
dos grupos hidroxilo directamente enlazados al anillo, resultando en su estado
dianiónico a pH neutro una estructura aromática con un eje de simetría c 4. Los pKa de
este diácido son de 1,5 y 3,4 respectivamente (Fig. 2).
Figura 2 – Estructura del ácido escuárico, equilibrios ácido-base donde se indican los valores de pKa
correspondientes y formas resonantes de la forma dianiónica.
El ácido escuárico presenta alguna similitud con ácidos carboxílicos convencionales.

Como tal diácido, el ácido escuárico forma diésteres, comerciales en algunos casos,
que son los productos de partida habituales en la preparación de otros derivados. Los
ésteres del ácido escuárico son compuestos relativamente reactivos capaces de dar
reacciones de adición-eliminación frente a nucleófilos sin necesidad de ningún tipo de
activación. Así la reacción con aminas primarias y secundarias conduce a la formación
de escuaramidas secundarias y terciarias, respectivamente.
La reactividad de los ésteres del ácido escuárico puede modularse en función del
medio de reacción. Así, si se utilizan disolventes apolares o ligeramente polares como
el Et2O se obtienen monoescuaramidas (escuaramida-éster), mientras que con
disolventes más polares como el etanol conducen a diescuaramidas (Esquema 1).
5
Esquema 1 –Obtención de mono y diescuaramidas mediante la funcionalización de ésteres del ácido escuárico con
aminas. R’: alquil (escuaramidas terciarias), H (escuaramidas secundarias).
Este procedimiento es viable cuando la nucleofília de las aminas es suficientemente

elevada. Sin embargo, cuando ésta no lo es, es necesario el uso de alternativas. La
primera alternativa es el uso de derivados 3,4-dicloro a modo de cloruros de acilo. Para
la obtención de este derivado, una de las alternativas más eficientes es la de hacer
reaccionar ácido escuárico con dos equivalentes de cloruro de oxalilo, obteniendo
rendimientos casi cuantitativos.5 En la bibliografía se encuentran multitud de ejemplos
de la aplicación del dicloruro del ácido escuárico para la obtención de escuaramidas a
partir de aminas poco nucleófilas o incluso para la obtención de ésteres del ácido
escuárico como por ejemplo el escuarato de difenilo.6 Un ejemplo concreto de esta
alternativa es el representado en el esquema que se muestra a continuación, donde se
obtiene la escuaramida derivada de la p-trifluorometilanilina (Esquema 2).7
Esquema 2 – Síntesis de escuaramidas derivadas de aminas poco nucleófilas mediante el uso del dicloruro del ácido
7
escuárico como intermedio.
Otra alternativa para la obtención de escuaramidas es el uso de microondas,

utilizando ácido escuárico y aminas especialmente básicas como por ejemplo anilinas.
El ejemplo representado a continuación se encuentra descrito en la bibliografía,
obteniendo con tiempos de reacción cortos unos buenos rendimientos, variables no
obstante en función de la amina utilizada (Esquema 3).8
5
Lunelli, B.; New, optimized preparation of 1,2-dichlorocyclobuten-3,4-dione (C4O2Cl2) from squaric
acid and oxalyl chloride. Tetrahedron Lett., 2007, 48, 3595-3597.
6
Prashar, D.; Cui, D.; Bandyopadhyay, D.; Luk, Y. Y.; Modification of Proteins with Cyclodextrins Prevents
Aggregation and Surface Adsorption and Increases Thermal Stability. Langmuir, 2011, 27, 13091-13096.
7
Amendola, V.; Fabbrizzi, L.; Mosca, L.; Schmidtchen, F. P.; Urea-, Squaramide-, and Sulfonamide-Based
Anion Receptors: A Thermodynamic Study. Chem. Eur. J., 2011, 17, 5972-5981.
8
López, C.; Vega, M.; Sanna, E.; Rotger, C.; Costa, A.; Efficient microwave-assited preparation of squaric
acid monoamides in water. RSC Advances, 2013, 3, 7249-7253.
6
1. Introducción
Esquema 3 – Síntesis de ácidos escuarámicos mediante microondas a partir del ácido escuárico y aminas
8
especialmente básicas.
Un método reciente, muy efectivo para escuaramidas derivadas de aminas aromáticas

consiste en el uso de ácidos de Lewis a modo de catalizadores, como el triflato de zinc.
De esta forma se incrementa la electrofilia de los ésteres, favoreciendo la sustitución
por parte de aminas menos nucleófilas (Esquema 4).9
Esquema 4 – Síntesis de escuaramidas a partir de escuarato de dietilo y aminas poco nucleófilas mediante catálisis
9
con un ácido de Lewis.
1.2.1 Propiedades conformacionales
En las escuaramidas secundarias el par electrónico del nitrógeno entra en conjugación

con los carbonilos del extremo contrario del anillo, dando lugar a una serie de
estructuras resonantes al igual que ocurre con el ácido escuárico (Esquema 5).
Esquema 5 – Formas resonantes de las escuaramidas secundarias.
9
Rostami, A.; Colin, A.; Li, X. Y.; Chudzinski, M. G.; Lough, A. J.; Taylor, M. S.; N-N’-Diarylsquaramides:
General, High-Yielding Synthesis and Applications in Colorimetric Anion Sensing. J. Org. Chem., 2010, 75,
3983-3992.
7
Como consecuencia el enlace C-N escuaramídico es más corto (1,32 Å) de lo que cabría
esperar para un enlace simple C-N (1,46 Å) o incluso un enlace C-N de una amida (1,37
Å). Además de la distancia de enlace más corta, la resonancia observada provoca que
exista una rotación restringida alrededor de este enlace.
La energía de la barrera de rotación de este enlace es de unos 63 kJ/mol,10 menor que

la de las amidas secundarias que es de unos 80 kJ/mol, pero suficientemente elevada
para que potencialmente puedan existir hasta tres confórmeros en equilibrio, si bien,
hasta la fecha, no se ha descrito la presencia de estructuras de tipo E-E en disolución
(Esquema 6).
Esquema 6 – Conformaciones existentes en una bis-escuaramida en función de la rotación del enlace C-N.
Los confórmeros designados como Z,Z y Z,E de bis-escuaramidas y de escuaramida-

ésteres son reconocibles mediante RMN de protón (1H-RMN) (Fig. 3).
1
Figura 3 – Espectro de H-RMN y asignación de las señales en α a una semiescuaramida-éster.
En disolución, la diferencia de energía entre ambos rotámeros es de alrededor de 1,5

kJ/mol en favor del confórmero E,Z (Z,E). En condiciones normales ambos confórmeros
se encuentran en equilibrio y la proporción relativa de cada uno de ellos depende de la
naturaleza las cadenas laterales, la temperatura, el disolvente, o la presencia de
sustratos que interaccionan con la unidad escuaramida.
10
Rotger, M. C.; Piña, M. N.; Frontera, A.; Martorell, G.; Ballester, P.; Deyà, P. M.; Costa, A.;
Conformational Preferences and Self-Template Macrocyclization of Squaramide-Based Foldable
Modules. J. Org. Chem., 2004, 69, 2302-2308.
8
1. Introducción
La formación de enlaces hidrógeno intramoleculares permite modificar selectivamente

la proporción de los confórmeros presentes en disolución. Así por ejemplo, se ha
descrito un módulo inductor de giro-β basado en la unidad escuaramida mediante la
formación de un enlace de hidrógeno entre el NH escuaramídico y el nitrógeno
terciario de la cadena alquílica adyacente. Esta estructura mimetiza los giros generados
por aminoácidos como la prolina en las cadenas peptídicas (Esquema 7).10
Esquema 7 – Estructura escuaramídica capaz de formar un enlace de hidrógeno intramolecular mimética de giros-β
10
en dos de las conformaciones posibles.
Los giros-β se establecen de forma natural en las proteínas mediante la formación de

enlaces de hidrógeno entre los grupos NH del enlace peptídico, que actúan como
donadores, y los carbonilos, que actúan como aceptores, separados por tres
aminoácidos, formando de esta manera estructuras cíclicas intramoleculares de diez
miembros. Siguiendo este principio se ha estudiado la idoneidad de la formación de un
giro-β intramolecular mediante la formación de un enlace de hidrógeno entre el
hidrógeno de un grupo NH escuaramídico y un carbonilo amídico en función de la
longitud de la cadena que contiene el grupo carbonilo. Los estudios realizados
utilizando compuestos escuaramídicos como los de la figura 4 indican que el modelo
permite la formación de un ciclo intramolecular de diez miembros, obteniendo
estructuras miméticas de giros-β. Sin embargo, la inducción del giro en los sistemas
estudiados que podrían formar ciclos de 8 o 9 miembros no pudo observarse. De esta
forma, utilizando la unidad de giro escuaramídica caracterizada se obtuvo un
polipéptido plegado, con un tamaño del ciclo similar al que se da de forma natural (Fig.
4).11
11
Martínez, L.; Sampedro, A.; Sanna, E.; Costa, A.; Rotger, C.; Synthesis and conformational studies of
péptido-squaramide foldable modules: a new class of turn-mimetic compounds. Biomol. Chem., 2012,
10, 1914-1921.
9
Figura 4 – Giro-β en una estructura peptídica convencional (izquierda), estructura escuaramídica inductora de giro-β
formando in ciclo intramolecular de 10 miembros (centro) y una de las estructuras del polipéptido obtenido
11
identificada mediante estudios de RMN (derecha).
Se ha observado también que oligómeros formados por unidades escuaramida unidas

entre sí por cadenas alifáticas conteniendo un átomo donador de enlace de hidrógeno
(N u O) en la posición γ de la cadena alquílica, forman estructuras monoméricas
estables tipo “hairpin” inducidas por la formación de una serie de enlaces de
hidrogeno intramoleculares, mostrando estas estructuras plegadas un patrón similar al
giro observado en el esquema 7 (Esquema 8).10
Esquema 8 – Estructura general de los oligómeros y equilibrio del patrón de enlaces de hidrógeno intramoleculares
en la estructura plegada propuesta para el oligómero de dos unidades escuaramida (i = 2).
Estos giros se dan en la conformación Z-E de la escuaramida y están inducidos por la

formación de un enlace de hidrógeno intramolecular entre los grupos NH
escuaramídicos y los nitrógenos terciarios, formando un ciclo de nueve miembros que
se mantiene incluso en presencia de disolventes polares competitivos.
10
1. Introducción
Se pueden preparar oligómeros de diferente longitud (i = 1-5) con lo que se

incrementa la estabilidad de la estructura plegada a medida que se aumenta el
número de unidades escuaramida. Ello es debido al mayor número de interacciones de
enlace de hidrógeno que se pueden establecer y que se traduce en un aumento de la
temperatura de fusión del oligómero medida por DSC. Estos oligómeros se han
utilizado en reacciones de macrociclación, donde la efectividad de preorganizar los
precursores lineales ha quedado patente. Este apartado se discute en mayor
profundidad en el capítulo 2 de esta Tesis.
1.2.2 Interacción mediante enlace de hidrógeno
Hasta este punto se ha puesto en evidencia la capacidad de la unidad escuaramida

para formar enlaces de hidrógeno. Debido a su estructura, es capaz de actuar tanto
como donador, mediante los grupos amino secundarios, o bien como aceptor de
enlace de hidrógeno, utilizando para ello los carbonilos (Fig. 5).
Figura 5 – Estructura de una diescuaramida secundaria donde se han indicado las posiciones susceptibles de actuar
como aceptores de enlace de hidrógeno (rojo) o como donadores (azul).
Este comportamiento convierte a la unidad escuaramida en una estructura ideal como

unidad de reconocimiento. No obstante, esta misma capacidad para actuar como
donador y aceptor al mismo tiempo es la causante, muchas veces, de la baja
solubilidad en disolventes orgánicos de muchos compuestos escuaramídicos. Esto se
debe a la posibilidad de establecer interacciones intermoleculares entre ellos mismos
formando agregados del tipo cabeza-cola (Fig. 6).
11
Figura 6 – Estructura cristalina de la Bis[2-(2-piridil)etilamino] escuaramida donde se forman agregados cabeza-cola

16
mediante enlaces de hidrógeno.
Además de formar estos agregados, se ha descrito en multitud de ocasiones la

capacidad de los compuestos escuaramídicos para formar complejos con oxoaniones
incluso en disolventes altamente competitivos como por ejemplo DMSO o disoluciones
acuosas (Fig. 7).12-18
12
Prohens, R.: Rotger, M. C.; Piña, M. N.; Deyà, P. M.; Morey, J.; Ballester, P.; Costa, A.; Thermodynamic
characterization of the squaramide-caboxylate interaction in squaramide receptors. Tetrahedron Lett.
2001, 42, 4933-4936.
13
Piña, M. N.; Rotger, C.; Costa, A.; Ballester, P.; Deyà, P. M.; Evaluation of anion selectivity in protic
media by squaramide-Cresol Red ensembles. Tetrahedron Lett. 2004, 45, 3749-3752.
14
Piña, M. N.; Rotger, C.; Soberats, B.; Ballester, P.; Deyà, P. M.; Costa, A.; Evidence of anion-induced
dimerization of a squaramide-based host in protic solvents. Chem. Commun. 2007, 963-965.
15
Piña, M. N.; Soberats, B.; Rotger, C.; Ballester, P.; Deyà, P. M.; Costa, A.; Selective sensing of
competitive anions by non-selective hosts: the case of sulfate and phosphate in water. New J. Chem.
2008, 32, 1919-1923.
16
Rotger, C.; Soberats, B.; Quiñonero, D.; Frontera, A.; Ballester, P.; Buchholz, J. B.; Deyà, P.; Costa, A.;
Crystallographic and Theoretical Evidence of Anion-π and Hydrogen-Bonding Interactions in a
Squaramide-Nitrate Salt. Eur. J. Org. Chem. 2008, 11, 1864-1868.
17
Sun, C. G.; Lin, Q.; Fu, N. Y.; A novel squaraine dye with squaramide as a scaffold and the colorimetric
detection of amine. Chin. Chem. Lett., 2012, 23, 217-220.
18
Jin, C.; Zhang, M.; Deng, C.; Guan, Y.; Gong, J.; Zhu, D.; Pan, Y.; Jiang, J.; Wang, L.; Novel calix[4]arene-
based receptors with bis-squaramide moieties for colorimetric sensing of anions via two different
interaction modes. Tetrahedron Lett., 2013, 54, 796-801.
12
1. Introducción
Figura 7 – Modelo de la interacción entre una escuaramida y un grupo fosfato mediante la formación de enlaces de
hidrógeno entre los grupos escuaramídicos (donadores) y los oxígenos del anión fosfato (aceptores).
Una de las aplicaciones que han permitido este tipo de interacciones supramoleculares
es la detección colorimétrica de oxodianiones como sulfato o hidrógeno fosfato
mediante desplazamiento competitivo de un indicador (Fig. 8).
13
Figura 8 – Mecanismo de acción de la sonda colorimétrica de oxoaniones. Se observa el desplazamiento que sufre
el indicador mediante la adición de sulfato a la disolución.
En la figura anterior se ejemplifica el mecanismo de acción de esta sonda colorimétrica

mediante el uso del indicador Rojo de Cresol. Una vez complejado el indicador,
presenta una coloración distinta a la del indicador libre en disolución. La constante de
asociación receptor-indicador es de 9,5x103 M-1 y la adición de un sustrato competitivo
incrementa la concentración del indicador en disolución produciendo un cambio en la
coloración global de la disolución. Al realizar una valoración competitiva mediante la
adición del oxoanión se produce un intercambio con el indicador, observando de esta
forma una variación en el espectro ultravioleta-visible de la disolución.
En otro ejemplo descrito por C. Jin y colaboradores,18 una estructura de calix[4]areno

se utiliza para la detección de aniones fosfato, fluoruro y acetato mediante dos
mecanismos diferentes en función del receptor utilizado (Fig. 9).
13
Figura 9 – Estructura del receptor diescuaramídico propuesto por C. Jin y colaboradores y respuesta observada en
18
función de la sustitución del anillo aromático.
Según el ejemplo anterior, en el caso de escuaramidas conjugadas con sustituyentes

aromáticos electroatrayentes, como son grupos nitro en posición para, la interacción
anión-receptor provoca la desprotonación de la escuaramida, dando una coloración
morada y obteniendo de esta forma un sensor colorimétrico. Por otra parte, en
ausencia de estos grupos atrayentes, la interacción se produce mediante enlace de
hidrógeno con las escuaramidas, pudiendo ser detectado mediante RMN. En este
último caso las constantes de asociación entre el receptor y los aniones oscilan entre
2,2x104 y 5,2x104 M-1. El sensor colorimétrico ha demostrado ser específico
principalmente para fluoruro y acetato, no mostrando ninguna señal para otros
haluros, nitrato o sulfato.
1.2.3 Carácter bioisóstero de las escuaramidas
Los grupos bioisósteros son aquellos grupos o sustituyentes con propiedades químicas
y físicas similares que otorgan a un compuesto propiedades biológicas semejantes. Un
ejemplo de grupos bioisósteros es un átomo de cloro, que se puede sustituir en una
estructura por un grupo trifluorometilo. El volumen que ocupan ambos grupos es muy
similar, por tanto, la interacción con un posible centro activo no se vería demasiado
afectada. No obstante, las propiedades fisico-químicas podrían verse alteradas por
esta sustitución provocando una respuesta biológica diferente.
En el diseño de nuevos fármacos, el hecho de intercambiar un grupo funcional por un

bioisóstero pretende mejorar determinadas propiedades, como por ejemplo su
resistencia a la hidrólisis, sin modificar en exceso la estructura química. Esta estrategia
se utiliza también para atenuar la toxicidad, modular la actividad o alterar el
metabolismo de un fármaco.
14
1. Introducción
En el caso concreto de las escuaramidas, la particular distribución de los grupos

donadores y aceptores convierte a su estructura análoga a la de las amidas, tal y como
se ha comentado al principio de este capítulo. De esta forma se pueden definir las
escuaramidas como bioisósteras de este grupo funcional (Fig. 10).
Figura 10 – Comparación de las similitudes estructurales entre una escuaramida secundaria y un grupo amida típico
de un enlace peptídico.
Además se encuentran en la bibliografía referencias donde se describen los derivados

del ácido escuárico como bioisósteros de diferentes grupos funcionales, tales como
aminoácidos,19 ácidos carboxílicos20,21 o fosfatos22 entre otros (Fig. 11).
20,21
Figura 11 – Compuestos derivados del ácido escuárico que actúan como bioisósteros de carboxilatos (arriba),
19 22
aminoácidos (centro) o fosfatos (abajo).
19
Kinney, W. A.; Lee, N. E.; Garrison, D. T.; Podlesny Jr., E. J.; Simmonds, J. T.; Bramlett, D.; Notvest, R.
R.; Kowal, D. M.; Tasse, R. P.; Bioisosteric replacement of the .alpha.-amino carboxylic acid functionality
in 3-amino-5-phosphonopentanoic acid yields unique 3,4-diamino-3-cyclobuten-1,2-dione containing
NMDA antagonists. J. Med. Chem., 1992, 35, 4720-4726.
20
Chan, P. C. M.; Roon, R. J.; Koerner, J. F.; Taylor, N. J.; Honek, J. F.; A 3-amino-4-hydroxy-3-
cyclobutene-1,2-dione-Containing Glutamate Analogue Exhibiting High Affinity to Excitatory Amino Acid
Receptors. J. Med. Chem., 1995, 38, 4433-4438.
21
Soll, R. M.; Kinney, W. A.; Primeau, J.; Garrick, L.; McCaully, R. J.; Colatsky, T.; Oshiro, G.; Park, C. H.;
Hartupee, D.; White, V.; McCallum, J.; Russo, A.; Dinish, J.; Wojdan, A.; 3-hydroxy-3-cyclobutene-1,2-
dione: Application of novel carboxylic acid bioisostere to an in-vivo active non-tetrazole angiotensin-II
antangonist. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1993, 3, 757-760.
22
Seio, K.; Miyashita, T.; Sato, K.; Sekine, M.; Synthesis and Properties of New Nucleotide Analogues
Possessing Squaramide Moieties as New Phosphate Isosters. Eur. J. Org. Chem., 2005, 5163-5170.
15
En estos trabajos, el anillo ciclobuténico aporta unas propiedades similares a los

grupos funcionales originales, permitiendo además el reconocimiento por parte de las
proteínas. Sin embargo, al poseer una estructura y reactividad diferente, estos
compuestos se comportan como antagonistas, permitiendo el bloqueo de la proteína y
ejerciendo una actividad terapéutica para el tratamiento del Parkinson, el Alzheimer o
la hipertensión arterial.
1.2.4 Antecedentes de actividad biológica de escuaramidas
El incremento de popularidad de los derivados del ácido escuárico como bioisósteros

ha permitido explotar esta característica terapéuticamente. Se han desarrollado
multitud de compuestos escuaramídicos donde se describe la actividad en sistemas
vivos con diferentes finalidades. Además de los ejemplos comentados, se puede
destacar el tratamiento de enfermedades relacionadas con la señalización
intercelular,23,24 tales como el cáncer, inflamaciones crónicas o fibrosis quística, el
tratamiento de desórdenes relacionados con los canales de potasio,25 como
incontinencia urinaria, disfunción eréctil, epilepsia, o más recientemente como
antiparasitarios,26,27 para el tratamiento de la malaria o la enfermedad de Chagas (Fig.
12).
25
Figura 12 – Compuestos escuaramídicos con actividad relacionada con la apertura de los canales de potasio (A),
23 24 27,26
inhibición de quimioquinas CXC (B), inhibición de cinasas (C), y antiparasitaria (D y E).
23
Chao, J.; Czarmiecki, M. F.; He, Z.; Lai, G.; Merritt, J. R.; 3,4-di-substituted cyclobutene-1,2-diones as
cxc-chemokine receptor ligands. WO 2008/005570 A1.
24
Lovering, F. E.; Kirincich, S. J.; Wang, W.; Telliez, J. B.; Resnick, L.; Sabalski, J. E.; Banker, A. L.; Butera,
J.; McFadyen, I.; Squrate kinase inhibitors. WO 2009/012375 A2.
25
Lanter, J. C.; Sui, Z.; Derives de 3,4-diamino-3-cyclobutene-1,2-dione en tant qu’agents d’ouverture du
canal potassique. WO 2007/115071 A1.
26
Kumar, S. P.; Glória, P. M. C.; Gonçalves, L. M.; Gut, J.; Rosenthal, P. J.; Moreira, R.; Santos, M. M. M.;
Squartic acid: a valuable scaffold for developing antimalarials?. Med. Chem. Commun., 2012, 3, 489-493.
27
Olmo, F.; Rotger, C.; Ramírez-Macías, I.; Martínez, L.; Marín, C.; Carreras, L.; Urbanová, K.; Vega, M.;
Chaves-Lemaur, G.; Sampedro, A.; Rosales, M. J.; Sánchez-Moreno, M.; Costa, A.; Synthesis and
Biological Evaluation of N,N’-Squaramides with High in Vivo Efficacy and Low Toxicity: Toward a Low-
Cost Drug against Chagas Disease. J. Med. Chem., 2014, 57, 987-999.
16
1. Introducción
Muchos de estos compuestos están bajo la protección de patentes, poniendo de

manifiesto su potencial terapéutico. Estas estructuras, basadas en la unidad
escuaramida, tienen una alta especificidad, comportándose en algunos casos como
inhibidores de proteínas concretas con un papel importante en el desarrollo o
evolución de diferentes enfermedades, como la ya comentada, el cáncer.
1.2.4.1 Escuaramidas con propiedades anticancerígenas
El cáncer es un término que se usa para definir un grupo de enfermedades en las que
células anormales se dividen sin control. Hay más de cien tipos diferentes de cáncer en
función del tipo de células que lo originan, como por ejemplo osteosarcoma (hueso),
glioma (células gliales del sistema nervioso), melanoma cutáneo (melanocitos de la
piel), adenocarcinoma (colon), etc.
Los tratamientos más comunes para esta enfermedad son la cirugía, la radioterapia y la
quimioterapia.
La quimioterapia consiste en el uso de fármacos o sustancias químicas con actividad

antitumoral. Se pueden diferenciar diferentes tipos de fármacos utilizados en la
quimioterapia en función de su modo de actuación sobre el organismo, diferenciando
a grandes rasgos aquellos que son inespecíficos, que son la mayoría, o los específicos.
Los fármacos inespecíficos se caracterizan por afectar tanto a células tumorales como
a células sanas. Éstas últimas conservan las capacidades de reparación intactas y por
tanto pueden reparar aquellos errores provocados por los fármacos antitumorales. A
menudo afectan bien al ADN o a determinados procesos relacionados con la división
celular, generando errores que al no ser reparados acaban provocando la muerte de la
célula. Ejemplos de este tipo de fármacos inespecíficos son los agentes alquilantes, que
provocan la alquilación de la posición 7 de la guanina en el ADN, como por ejemplo los
derivados del gas mostaza (Fig. 13-a) o los complejos de cis-platino (Fig. 13-b). Otros
ejemplos de fármacos inespecíficos son determinados alcaloides, como el paclitaxel,
que actúa sobre los microtúbulos, importantes durante la fase de división; antibióticos
con actividad antitumoral, como la doxorubicina (Fig. 13-c); antimetabolitos, como el
metotrexato, antimetabolito del ácido fólico (Fig. 13-e), que sustituyen a sus
correspondientes homólogos impidiendo la normal evolución del sistema, o
inhibidores de las topoisomerasas, impidiendo los cambios conformacionales en el
ADN provocados por estas proteínas, como por ejemplo la amsacrina (Fig. 13-d).28
28
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17
Figura 13 – Estructuras de diferentes fármacos antitumorales inespecíficos. De izquierda a derecha y de arriba a

abajo: clorambucilo (a), cisplatino (b), doxorubicina (c), amsacrina (d) y metotrexato (e).
Como se ha dicho, estos fármacos inespecíficos actúan tanto sobre células tumorales,
como sobre células sanas, especialmente sobre aquellas de rápida división como las
células hematopoyética, siendo esta la causa principal por la que provocan diferentes
efectos secundarios tales como pérdida de apetito, caída del pelo, dolor, náuseas o
desórdenes sanguíneos entre otros.
Las características que diferencian a las células tumorales de las células sanas se
encuentran descritas en la bibliografía de forma muy detallada.29 Existen también
multitud de trabajos que relacionan la presencia de determinadas proteínas,
metabolitos o condiciones físicas con el cáncer. Con la finalidad de evitar o minimizar
los efectos secundarios se han desarrollado lo que se denominan fármacos específicos
o terapia dirigida cuya actividad se orienta en función de las características específicas
de las células a tratar.
Basados en este principio, existen diversos ejemplos descritos en la bibliografía donde

el uso de derivados del ácido escuárico, especialmente escuaramidas, se han utilizado
para la obtención de fármacos específicos que demuestran una predilección por
determinadas características de las células tumorales. Un ejemplo de esto son la serie
de compuestos patentados por A. Crew y colaboradores, que se comportan como
inhibidores del protooncogén c-Kit, relacionado con la embriogénesis, melanogénesis,
tumores gastrointestinales y otros tumores sólidos, además de ciertas leucemias (Fig.
14).30
29
Hanahan, D.; Weinberg, R. A.; Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell, 2011, 144, 646-674.
30
Crew, A.; Li, A. H.; Qiu, L.; Castelhano, A. L.; Dong, H.; Smith, A.; Tardibono, L.; Zhang, T.;
(arylamidoaryl)squaramide compounds. WO 2006/034111 A1.
18
1. Introducción
Figura 14 – Estructuras de dos de los compuestos derivados del ácido escuárico patentados como inhibidores del
30
protooncogén c-Kit.
Se ha descrito también el uso de estos derivados como fármacos específicos para el

cáncer como inhibidores de cinasas, encontrando hasta seis patentes de aplicación
desarrolladas por Merck Patent GmbH desde 2006. Los compuestos presentados
contienen, de forma general, un grupo arilo como el primer sustituyente y un grupo 3-
hidroxi o 3-metoxibencilo como segundo sustituyente del anillo ciclobuténico. Se
comportan como inhibidores de las cinasas Chk1, Chk2 y SGK, responsables de
procesos de transducción de señales. Su actividad difiere en función de la estructura,
obteniendo para algunos casos, como por ejemplo el del compuesto de la figura 15,
valores de IC50 enzimáticas muy bajas (10 nM) para la inhibición de la cinasa SGK.31
Figura 15 – Estructura de la escuaramida inhibidora de la enzima SGK, con una concentración IC 50 enzimática de 10
31
nM.
Otro ejemplo más reciente de estructuras escuaramídicas con actividad antitumoral

son los descritos en la patente de M. D. Alexander y colaboradores, en este caso como
inhibidores de la cinasa MK2, un importante regulador de la producción de citoquinas
(Fig. 16).32
Figura 16 – Una de las estructuras escuaramídicas con actividad inhibitoria de MK2 patentada por M. D.
32
Alexander.
Considerando el conjunto de trabajos publicados en este campo, el uso de derivados

del ácido escuárico como una aproximación a la terapia dirigida ha experimentado un
gran desarrollo en los últimos años, lo que ejemplifica el gran potencial de estas
estructuras como una nueva alternativa a la quimioterapia tradicional.
31
Janetka, J. W.; Ashwell, S.; Checkpoint kinase inhibitors: a review of the patent literature. Expert Opin.
Ther. Pat., 2009, 19, 165-197.
32
Alexander, M. D.; McDonald, J. J.; Ni, Y.; Niu, D.; Petter, R. C.; Qiao, L.; Singh, J.; Wang, T.; Zhu, Z.; Mk2
inhibitors and uses thereof. WO2014/149164 A1
19
20
CAPÍTULO 2
DISEÑO, SÍNTESIS Y EVALUACIÓN BIOLÓGICA
DE OLIGOESCUARAMIDAS CÍCLICAS
22
2. Diseño, síntesis y evaluación biológica de oligoescuaramidas cíclicas
2.1 Introducción
Existe una necesidad creciente de nuevos agentes terapéuticos con mayor efectividad,
que provoquen menos efectos secundarios y para los cuales no se haya desarrollado
resistencia. Un grupo importante de compuestos farmacológicamente activos son las
estructuras macrocíclicas de masa inferior a 2000 daltons, que es el límite de masa
superior para que un compuesto pueda atravesar la membrana celular (Fig.
17).33,34,35,36
Figura 17 – Diferentes ejemplos de estructuras macrocíclicas naturales. Izquierda: Clorofila B, con una
35
anillo de porfirina. Centro: Diterpenoide aislado de la planta Euphorbia pithyusa subsp. cupanii.
36
Derecha: Citocalasina aislada del hongo Pseudeurotium zonatum. Abajo: Scitonemida A, un
34
ciclopéptido aislado de la cianobacteria Scytonema hofmanii.
Actualmente, los compuestos macrocíclicos son uno de los grupos más numerosos de
agentes terapéuticos que se encuentran en fase pre-clínica y clínica de investigación,
abarcando un amplio rango de enfermedades como el cáncer, enfermedades
coronarias y vasculares, demencia, infecciones bacterianas, epilepsia, síndrome del X
frágil, degeneración muscular, hepatitis C, VIH, obesidad, Parkinson, artritis, etc. A
pesar de todo esto, muy pocos de estos compuestos llegan al mercado. 36
33
Wessjohann, L. A.; Ruijter, E.; García-Rivera, D.; Brandt, W.; What can a chemist learn from nature’s
macrocycles? – A brief, conceptual view. Mol. Divers., 2005, 9, 171-186.
34
Krunic, A.; Vallat, A.; Mo, S.; Lantvit, D. D.; Swanson, S. M.; Orjala, J.; Scytonemides A and B, Cyclic
Peptides with 20S Proteasome Inhibitory Activity from the Cultured Cyanobacterium Scytonema
hofmannii. J. Nat. Prod., 2010, 73, 1927-1932.
35
Appendino, G.; Belloro, E.; Tron, G. C.; Jakupovic, J.; Ballero, M.; Diterpenoids from Euphorbia pithyusa
subsp. cupanii. J. Nat. Prod., 1999, 62, 1399-1404.
36
Feng, Y.; Blunt, J. W.; Cole, A. L. J.; Munro, M. H. G.; Three Novel Cytochalasins X, Y, and Z from
Pseudeurotium zonatum. J. Nat. Prod., 2002, 65, 1274-1277.
23
Paradójicamente, y a pesar de que encontramos muchos macrociclos en la naturaleza,

la estructura del anillo, responsable de sus interesantes propiedades, es la causante de
que sean unos compuestos difíciles de obtener en el laboratorio y por tanto su
fabricación es muy costosa. De hecho, la gran mayoría de fármacos macrocíclicos
actuales son productos naturales o bien sus derivados directos.
Entre éstos macrociclos los ciclopéptidos naturales son particularmente importantes,

como por ejemplo la ciclosporina o la bacitracina entre otros muchos. (Fig. 18).
Figura 18 – Estructuras de los ciclopéptidos naturales ciclosporina (izquierda) y bacitracina (derecha).
De forma general, los macrociclos son anillos compuestos por uniones de doce o más
átomos, formados principalmente por átomos de carbono, nitrógeno y oxígeno. Como
consecuencia de su estructura y una cierta preorganización, las estructuras
macrocíclicas pueden interaccionar con los centros activos de las proteínas en la forma
biológicamente activa sin un coste entrópico importante. Esta preorganización, no
obstante, en ocasiones puede otorgar a la molécula una elevada rigidez. Idealmente se
debe conseguir un equilibrio entre la preorganización y la flexibilidad necesaria para
amoldarse a un receptor y maximizar el número de interacciones. En este punto, la
optimización de la estructura permite adaptarse a estas necesidades.37 Una de las
principales características de los macrociclos es su elevada resistencia frente al arsenal
degradativo de los sistemas vivos y por tanto, una elevada biodisponibilidad.
Las estructuras macrocíclicas son, a priori, muy adecuadas para el desarrollo de nuevos
fármacos, y durante los últimos 50 años han sido una gran fuente de inspiración para
la industria farmacéutica que ha utilizado estructuras derivadas de productos naturales
activos con la finalidad de maximizar su eficacia. La vancomicina y la eritromicina como
antibióticos, el paclitaxel (Taxol™) como antitumoral, la ciclosporina como un
inmunosupresor o la amfotericina como antifúngico son ejemplos de macrociclos
naturales que o bien se utilizan como fármacos o bien han servido de base para
sintetizar derivados más específicos y/o efectivos (Fig. 19).
37
Driggers, E. M.; Hale, S. P.; Lee, J.; Terrett, N. K.; The exploration of macrocycles for drug discovery –
an underexploited structural class. Nat. Rev. Drug Discov., 2008, 7, 608-624.
24
Figura 19 – Estructuras macrocíclicas utilizadas actualmente como fármacos. De arriba abajo y de

izquierda a derecha: paclitaxel, amfotericina, eritromicina y vancomicina.
La mayor resistencia que presentan los macrociclos respecto a la degradación permite,

por ejemplo, reducir significativamente la dosis necesaria para alcanzar la dosis
efectiva. Su resistencia se puede ver incrementada además introduciendo grupos
bioisósteros y/o estructuras miméticas naturales en la propia estructura macrocíclica.
Las escuaramidas, como bioisósteras del enlace peptídico, resultan interesantes para la
obtención de estructuras macrocíclicas, aprovechando de este modo la capacidad de
reconocimiento propia de estas unidades, además de la resistencia que aporta la
estructura macrocíclica.
25
2.2 Oligoescuaramidas cíclicas: principios de diseño

Los oligómeros amino-escuaramídicos pueden establecer enlaces hidrógeno
intramoleculares entre los NH escuaramídicos y los nitrógenos terciarios, formando
estructuras miméticas de giros-β que "pliegan" el esqueleto lineal de los oligómeros y
dirigen la macrociclación, permitiendo la conjugación de los dos grupos amino
terminales sobre una misma unidad de escuarato de dietilo. A nivel preparativo la
reacción de macrociclación se puede llevar a cabo en disolventes polares como el EtOH
y sin requerir condiciones de alta dilución, obteniendo rendimientos alrededor del 85%
sin que el tamaño del oligómero, y por tanto del macrociclo resultante, afecte a este
rendimiento significativamente (Esquema 9).38
Esquema 9 – Reacción de macrociclación favorecida por la formación de enlaces de hidrógeno

38
intramoleculares, evitando de esta forma la formación de polímeros.
Este resultado supone uno de los pocos casos descritos de oligómeros no naturales,
diseñados para tener una estructura plegada mediante enlaces de hidrogeno
intramoleculares, y su aplicación para la obtención de grandes estructuras
macrocíclicas.
La estructura final de los oligómeros cíclicos contiene un número concreto de unidades

escuaramida secundarias, constituyendo éstas una plantilla ideal para el desarrollo de
nuevos compuestos con actividad biológica. Estos macrociclos reúnen las propiedades
biológicamente relevantes de las escuaramidas, capacidad de formación de enlaces
hidrógeno y resistencia a la biodegradación, junto a las que confiere la estructura
macrocíclica en sí misma.
2.2.1 Síntesis de oligoescuaramidas cíclicas
Habitualmente la síntesis de las oligoescuaramidas cíclicas se lleva a cabo mediante

una metodología modular y por pasos donde se combinan diferentes módulos
estructurales (Fig. 20).
38
Rotger, C.; Piña, M. N.; Vega, M.; Ballester, P.; Deyà, P. M.; Costa, A.; Efficient Macrocyclization of
Preorganized Palindromic Oligosquaramides. Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 6844-6848.
26
Figura 20 – Módulos estructurales utilizados para la obtención de las oligoescuaramidas cíclicas.
Estos módulos se preparan a escala multigramo, en pocos pasos sintéticos y a partir de

productos comerciales. La combinación de estos módulos permite construir las
cadenas oligoescuaramídicas paso a paso, obteniendo un crecimiento controlado del
precursor lineal por los dos extremos (Esquema 10).38
Esquema 10 – Reacción general para la elongación de los oligómeros de i unidades escuaramida

38
mediante un módulo común de crecimiento.
Los oligómeros resultantes, a diferencia de la mayoría de compuestos escuaramídicos,

son solubles en cloroformo y disolventes poco polares. Ello se debe a su capacidad de
formar enlaces de hidrogeno intramoleculares, que evita la formación de agregados
supramoleculares insolubles como los de tipo cabeza-cola descritos en el capítulo
anterior. A partir de los oligómeros lineales desprotegidos, con “i” unidades
escuaramida, la condensación con un escuarato de etilo, en EtOH y sin necesidad de
utilizar condiciones de alta dilución como es habitual en este tipo de reacciones,
permite aislar los respectivos macrociclos, denominados Cn, donde “n” representa el
número de unidades escuaramida totales (Esquema 11).
27
Esquema 11 – Reacción general de obtención oligoescuaramidas cíclicas (C2-C6) a partir de los

38
oligómeros correspondientes (i = 1-5).
Las características estructurales de preorganización observadas en los macrociclos

obtenidos junto con los antecedentes de actividad biológica descritos para las
escuaramidas, convierten a los nuevos compuestos oligoescuaramídicos en unos
buenos candidatos para ser evaluados como agentes antitumorales.
2.2.2 Evaluación biológica de las oligoescuaramidas cíclicas C2-C6: descripción y

resultados previos
La evaluación de las oligoescuaramidas cíclicas como agentes antitumorales se ha

realizado sobre diferentes cultivos celulares, como resultado de la colaboración de
nuestro grupo de trabajo con el grupo de Biología Celular del Cáncer de la UIB.
2.2.2.1 Ensayos de viabilidad
Los ensayos de viabilidad permiten conocer la cantidad de células viables que hay en
un determinado volumen de cultivo después de incubarlo durante un tiempo definido
junto con una concentración conocida del compuesto a ensayar. La cantidad de células
viables se cuantifica midiendo la cantidad de ATP intracelular presente, ya que una vez
que la célula deja de ser viable, el ATP se degrada rápidamente.
2.2.2.2 Estudios iniciales: actividad antitumoral de las oligoescuaramidas cíclicas C2-C6
En primer lugar, se determinó la actividad biológica de las oligoescuaramidas cíclicas

con 2, 3, 4, 5 y 6 unidades escuaramida, de sus respectivos oligómeros precursores y
de otros productos escuaramídicos sintetizados previamente en el grupo de Química
Supramolecular, frente a dos líneas tumorales humanas, ambas de linfoma B, Jeko-1 y
Granta-519.
28
Para esta determinación se utilizaron los valores de viabilidad, que representan el

porcentaje de células viables de la muestra respecto a una muestra mantenida en las
mismas condiciones pero sin tratamiento con el macrociclo, obteniendo valores más
bajos mientras más efectivo es el tratamiento antitumoral.
Los primeros resultados evidenciaron que los oligómeros y otras estructuras más
pequeñas, no presentaban ningún tipo de actividad antitumoral. No obstante, las
oligoescuaramidas cíclicas más grandes demostraron unos resultados muy
satisfactorios, observando una clara actividad antiproliferativa de las líneas celulares
con tiempos de incubación de 48 horas (Fig. 21). Se observó también cierta
selectividad ya que la citotoxicidad varía en función de la línea celular utilizada.
100
Jeko-1
80 Z-138
Viabilidad (%)
60
40
20
0
2 3 4 5 6
Número de escuaramidas
Figura 21 – Viabilidad observada para las oligoescuaramidas cíclicas C2-C6, a una concentración 10 µM
durante 48 horas en dos líneas celulares, Jeko-1 (rojo) y Z-138 (verde).
La actividad antitumoral máxima se observó para la oligoescuaramida C5, que posee

un gran número de centros donadores y aceptores de enlaces de hidrógeno. La “regla
del 5”, originalmente propuesta por C. A. Lipinski,39 no predice una buena absorción o
permeabilidad para compuestos con un peso molecular mayor de 500 g/mol, y con un
número no superior a cinco donadores o diez aceptores de enlace de hidrógeno. El
macrociclo C6, con una masa molecular de 1339,63 g/mol y una elevada actividad
antitumoral, presenta doce donadores y dieciocho grupos aceptores, unos valores muy
superiores a los sugeridos por la regla de Lipinski. Además, a pH fisiológico, los grupos
amino terciario se protonan convirtiendo la oligoescuaramida en una molécula
catiónica, reduciendo su carácter hidrofóbico. Sin embargo, los macrociclos no suelen
39
Lipinski, C. A.; Lombardo, F.; Dominy, B. W.; Feeney, P. J.; Experimental and computational
approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settins. Adv.
Drug Deliver. Rev., 2001, 46, 3-26.
29
ajustarse a estas reglas tan ampliamente establecidas para el diseño de nuevos

fármacos, tal y como ocurre por ejemplo en el ciclopéptido natural ciclosporina.
Debido a su mayor actividad en estudios posteriores se utilizó siempre la

oligoescuaramida C5.
En la tabla 2 se muestran los resultados de viabilidad obtenidos frente a un panel de

líneas celulares diversas con el macrociclo C5 a una concentración 10 µM durante el
tiempo indicado.
Tabla 2 – Valores de viabilidad obtenidos después del tratamiento de las diferentes líneas celulares con
la oligoescuaramida C5 a una concentración 10 µM durante el tiempo indicado.
Línea celular Viabilidad (%)

Glioblastoma U87MG 25
(72 h) U251 85
Linfoma T Hut 60
(72 h) Karpas-45 13
Jeko-1 46
Linfoma B JVM-2 24
(48 h) Rec-1 44
Granta-519 58
La actividad antitumoral de la oligoescuaramida C5 se evaluó adicionalmente frente al

panel NCI-60. Este panel es un estándar desde 1992 y está formado por 60 líneas
celulares tumorales humanas de diferentes tejidos que representan los tipos de cáncer
con más incidencia en humanos. Los valores de IC50 obtenidos con este panel se
encuentran en el orden de magnitud de 10-6 M para todas las líneas celulares a
excepción de nueve de ellas, para las cuales los valores fueron superiores a 10-5 M.
Dada la actividad antiproliferativa observada, se procedió a estudiar los efectos de la

oligoescuaramida sobre la evolución del ciclo celular mediante la técnica de citometría
de flujo. Se observó que para aquellas células tratadas con el macrociclo C5, su ciclo se
veía arrestado en la fase G1, la cual corresponde a una fase de alta actividad
enzimática donde se dan multitud de procesos de señalización celular y duplicación de
los componentes del citoplasma (Fig. 22).
30
Figura 22 – Fases del ciclo de división celular en organismos eucariotas.
Estas señales de transducción en las células eucariotas se encuentran reguladas por un

conjunto de proteínas llamadas cinasas.
2.3 Cinasas
Las cinasas son la familia más numerosa de proteínas de señalización celular. La
función de éstas es la de catalizar la transferencia de grupos fosfato como el ATP a
otras proteínas, proceso conocido como fosforilación, y hecho por el cual también son
llamadas fosfotransferasas (Fig. 23).
Figura 23 – Representación esquemática de la transducción de una señal binaria mediante activación de

una proteína. Esta activación se produce mediante el proceso de fosforilación que consiste en la
transferencia de un grupo fosfato, llevada a cabo por una cinasa.
Se han contabilizado más de 500 cinasas en el genoma humano y la gran mayoría son
del tipo serina/treonina cinasas. Este tipo de cinasas fosforilan el grupo alcohol de los
residuos de los aminoácidos serina o treonina respectivamente. Otro grupo principal
de cinasas son las tirosina cinasas, que realizan la misma función sobre residuos de
este aminoácido (Esquema 12).
31
Esquema 12 – Fosforilación de un residuo de serina (arriba), treonina (centro) o tirosina (abajo)

mediante la acción de la cinasa correspondiente sobre un supuesto polipéptido conteniendo estos tres
aminoácidos.
El centro activo de las cinasas presenta una secuencia de aminoácidos y una estructura
proteínica muy conservada en todo el cinoma humano, siendo en la regulación de la
actividad donde las cinasas se han diferenciado a lo largo de la evolución.40 La
regulación de la actividad tan específica que demuestran las cinasas se explica
añadiendo al sistema cinasa-sustrato (ATP) las interacciones entre este complejo y
otros ligandos secundarios que se unen al dominio de la cinasa. Estas interacciones
provocan cambios conformacionales que modifican la especificidad de la cinasa,
regulando de esta forma su actividad. Estos procesos se denominan procesos
alostéricos (Fig. 24).
Figura 24 – Representación de los cambios conformacionales de una cinasa mediante los procesos
alostéricos.
40
Noble, M. E. M.; Endicott, J. A.; Johnson, L. N.; Protein Kinase Inhibitors: Insights into Drug Design
from Structure. Science, 2004, 303, 1800-1805.
32
La desregulación de la actividad de las cinasas mediante mutaciones ha demostrado

estar relacionada principalmente con desórdenes metabólicos y del desarrollo, además
de ciertos tipos de cáncer.41
Mediante ensayos de inhibición enzimática se confirmó que una mayor actividad

antiproliferativa representa una mayor inhibición in vitro. A partir de un ensayo de
inhibición de un panel de 210 cinasas representativas del cinoma humano y el
macrociclo C5, se pudo comprobar que esta oligoescuaramida cíclica reducía en más
de un 80% la actividad enzimática de una veintena de las 210 cinasas evaluadas.
Además se observó también la activación de determinadas cinasas. Adicionalmente,
ensayos realizados con una selección de cinasas más reducida demostró que otros
productos sin actividad celular no demostraron capacidad inhibitoria enzimática in
vitro (Fig. 25).42
Por último, con la intención de obtener más información acerca de la interacción entre
la oligoescuaramida C5 y las cinasas, ya que todas ellas tienen un centro activo muy
conservado, se realizó un estudio competitivo con ATP. De este modo, la proteína
tirosina cinasa ABL1 se trató con una concentración fija del macrociclo a cuatro
concentraciones diferentes de ATP, obteniendo valores similares de IC50 enzimáticas
en todos los casos. De esta forma queda demostrado que la oligoescuaramida C5 no se
comporta como un antagonista de ATP para esta enzima.
41
Lahiry, P.; Torkamani, A.; Schork, N. J.; Hegele, R. A.; Kinase mutations in human disease: interpreting
genotype-phenotype relationships. Nat. Rev. Genet., 2010, 11, 60-74.
42
Costa, A.; Rotger, M. C.; Fernández, S.; Villalonga, P.; Use of cyclosquaramide compounds as
antitumour agents. WO 2010/066933 A1.
33
Figura 25 – Mapa del cinoma humano donde se ha indicado la actividad, inhibidora (rojo) o activadora
(verde), de la oligoescuaramida C5 sobre las cinasas analizadas. El tamaño de los círculos representa la
intensidad de la inhibición/activación.
34
Debido a que la regulación anormal de cinasas y fosfatasas parece contribuir

directamente al desarrollo de un gran número de tipos de cáncer, existe un gran
interés en la búsqueda de inhibidores selectivos de cinasas con la finalidad de bloquear
el ciclo celular, evitando de esta forma la proliferación descontrolada. Otra alternativa
al bloqueo del ciclo celular es la inhibición de los puntos de control del ciclo, llamados
“checkpoints”, evitando de esta forma la reparación del daño en el ADN provocado por
los antitumorales clásicos. La combinación de agentes antitumorales clásicos con estos
nuevos inhibidores selectivos de cinasas permitiría reducir la dosis de citotóxicos sin
perder eficacia en el tratamiento y reduciendo de esta forma los efectos secundarios.
El ejemplo más representativo de este tipo de inhibidores de cinasas es el Imatinib

(Fig. 26), un medicamento comercializado con el nombre de Glivec® por la
farmacéutica Novartis. Fue el primero de los fármacos contra el cáncer en utilizar la
inhibición selectiva de cinasas. Se sabe que en la leucemia mielógena crónica, la cinasa
ABL se bloquea en su forma activa, provocando la multiplicación masiva de las células.
El Imatinib es un inhibidor específico de determinadas tirosina cinasas. Su interacción
con la enzima se produce en un lugar cercano al centro activo del ATP, provocando un
cambio conformacional en la enzima que queda bloqueada en su conformación
inactiva, siendo por tanto una inhibición semicompetitiva.43
Figura 26 – Estructura del inhibidor selectivo de tirosina cinasas Imatinib (Glivec®).
Los macrociclos C5 y C6 han demostrado tener una interesante actividad antitumoral

frente a diferentes líneas celulares, mostrando cierta selectividad. Además, la actividad
obtenida con cultivos celulares y posteriormente en los ensayos de inhibición de
cinasas es del mismo orden de magnitud, demostrando la buena penetrabilidad de
estos compuestos.
43
Takimoto, C. H.; Calvo, E.; Principles of oncologic pharmacotherapy. Oncology J., 2005.
35
36
2.4 Objetivos
Una vez establecido que los compuestos oligoescuaramídicos cíclicos con cinco
unidades escuaramida, C5, y seis unidades escuaramida, C6, presentan actividad
antitumoral moderada e inhibitoria de cinasas, el objetivo de este este capítulo es la
de realizar modificaciones estructurales en las oligoescuaramidas cíclicas, intentando
conseguir una mayor actividad antitumoral. De esta forma, los objetivos de este
capítulo son los de:
 Sintetizar nuevos derivados oligoescuaramídicos cíclicos introduciendo

modificaciones estructurales.
 Evaluar si las modificaciones estructurales introducidas afectan la reacción de
macrociclación.
 Evaluar si estas modificaciones alteran la actividad antitumoral mediante la
obtención y posterior comparación de los valores de IC50 celulares.
 Establecer una relación estructura-actividad que permita optimizar las
estructuras macrocíclicas.
37
38
2.5 Resultados y discusión

Dada la actividad antitumoral descrita para las oligoescuaramidas cíclicas Cn, se han
realizado modificaciones estructurales sobre su estructura aprovechando la síntesis
modular desarrollada anteriormente en el grupo de Química Supramolecular. Estas
modificaciones permitirán establecer una relación entre estructura y actividad además
de permitir evaluar qué consecuencias tendrán sobre la capacidad de plegamiento y
macrociclación de las oligoescuaramidas.
2.5.1 Modificaciones estructurales
Las modificaciones que se pueden realizar sobre la estructura macrocíclica son

numerosas, cambiando su polaridad, tamaño, hidrofobicidad, etc. En este trabajo se ha
optado por modificar tan solo uno de los espaciadores alifáticos que unen las unidades
escuaramida, permitiendo de esta forma mantener la metodología sintética
establecida, las propiedades de preorganización de los oligómeros escuaramídicos y
esperando mantener también la actividad antitumoral (Fig. 27).
Figura 27 – Representación de la oligoescuaramida C5 donde se ha señalado el espaciador sobre el cual

se han realizado las modificaciones, manteniendo el resto de la estructura invariable.
Las modificaciones planteadas se pueden clasificar en función del tipo de sustitución

realizada:
 Se ha observado en los estudios realizados con las oligoescuaramidas, que son

los antecedentes directos de este trabajo, que la actividad antitumoral e
inhibitoria de cinasas es mucho más acusada para los macrociclos C5 y C6, es
decir, para los que poseen estructuras de mayor tamaño. Ante este resultado
se plantea la síntesis de un macrociclo mayor, con siete unidades escuaramida,
pudiendo comprobar de esta forma si se mantiene la relación entre la actividad
antitumoral y el tamaño del macrociclo (Fig. 28).
39
Figura 28 – Aumento del tamaño relativo en las estructuras oligoescuaramídicas cíclicas al

añadir una unidad escuaramida mediante el uso de los espaciadores habituales.
 Sustitución del grupo metilo enlazado al nitrógeno terciario de la cadena
alifática por un sustituyente más voluminoso. Se han elegido dos casos, la
introducción de un grupo bencilo o del aminoácido leucina. Este tipo de
modificación no elimina la capacidad donadora del enlace de hidrógeno del
espaciador por lo que no cabría esperar una disminución en el grado de
preorganización y por tanto en el proceso de macrociclación. Sin embargo
introduce dos nuevos grupos funcionales que modifican especialmente las
interacciones con otras moléculas o proteínas mediante la introducción de
grupos funcionales diferentes. (Fig. 29).
Figura 29 – Estructuras del módulo espaciador original (arriba) y de los nuevos grupos
funcionales introducidos sobre el nitrógeno central del espaciador.
 Alterar la estructura de la cadena espaciadora mediante la modificación de los
grupos donadores o aceptores de enlace de hidrógeno. Concretamente,
eliminar un átomo de nitrógeno terciario de la cadena alifática, con capacidad
donadora de enlace de hidrógeno, y sustituirlo por un grupo metileno CH2. Con
esta modificación se elimina la posibilidad de establecer una interacción de
enlace de hidrogeno a lo largo de todo el espaciador, pudiendo afectar a la
reacción de macrociclación. Por otra parte, la introducción de un aminoácido
en la secuencia del espaciador, la metionina, añade un grupo amida al
espaciador alifático, además de la cadena lateral del propio aminoácido,
aumentando el número de interacciones de enlace de hidrógeno que se
pueden establecer con el espaciador. Este aminoácido incrementa el grado de
40
mimetismo del macrociclo respecto a los ciclopéptidos naturales, pudiendo

incrementar de esta manera su biocompatibilidad (Fig. 30).
Figura 30 – Estructuras del módulo espaciador original (arriba) y de las nuevas estructuras del
espaciador mediante la eliminación o adición de donadores/aceptores de enlace de hidrógeno.
El doble objetivo de evaluar la actividad biológica de los nuevos macrociclos diseñados

y su potencial uso como fármacos implica que estos compuestos se deben obtener en
buenos rendimientos.
2.5.2 Metodología general para la síntesis de oligoescuaramidas cíclicas
Tal y como se ha descrito en la introducción del capítulo, la obtención de la

oligoescuaramidas cíclicas se realiza mediante una metodología de síntesis por pasos,
combinando diferentes módulos estructurales, y siguiendo una estrategia de
protección/desprotección de los grupos funcionales amino.
Esta metodología general es ideal para introducir las modificaciones estructurales

objetivo de este capítulo, ya que tan solo es necesario preparar nuevos módulos, con
una reactividad equivalente a la de los originales y con los nuevos grupos funcionales a
introducir, e incorporarlos en la ruta sintética en el momento oportuno.
Los módulos utilizados en la metodología original, y que se muestran a continuación,

se obtienen a partir de productos comerciales, con pocos pasos sintéticos y en una
escala multigramo (Esquema 13).
41
Esquema 13 – Síntesis de los módulos sintéticos originales para la obtención de las oligoescuaramidas
cíclicas.
La preparación de los módulos de partida se realiza, de forma general, por

condensación de diaminas con escuarato de dietilo. Para controlar la reactividad de las
diaminas, éstas se utilizan monoprotegidas cuando es necesario, evitando que
reaccionen por los dos extremos al mismo tiempo. En cuanto a la reactividad del
escuarato de dietilo, ésta se puede modular en función de la polaridad del disolvente
controlando que se produzcan una o dos condensaciones con la amina. En el caso de
usar disolventes polares como el EtOH se obtiene una doble condensación. Sin
embargo, al utilizar disolventes menos polares como el Et2O, se permite la primera
entrada sobre el escuarato de dietilo pero se ralentiza la velocidad de la segunda.
Además la baja solubilidad de la escuaramida-éster resultante en Et2O favorece su
precipitación, dificultando aún más la segunda reacción. Esta estrategia permite
obtener productos asimétricamente sustituidos con elevados rendimientos.
Los módulos utilizados corresponden a una unidad central, que bien puede ser el
compuesto 1, 2, o 5, a partir de la cual se incrementa la longitud de la cadena
oligomérica mediante el módulo de crecimiento 6.
Los oligómeros deben presentar en sus extremos terminales dos grupos amino
protegidos con Boc. Por este motivo, el uso de los módulos centrales 1 o 5 implica que
en primer lugar deben reaccionar con la diamina monoprotegida 4.
42
2.5.2.1 Protección de grupos amino
El grupo protector Boc se utiliza tradicionalmente en la síntesis peptídica al permitir el

uso de otros grupos protectores ortogonales. Se puede eliminar fácilmente en medio
ácido liberando el grupo amino, unas condiciones que no interfieren con la estabilidad
del resto de grupos funcionales con los que se trabaja. La monoprotección de diaminas
con el grupo Boc se puede obtener mediante la reacción de éstas con Boc-ON (2-([tert-
butoxicarbonil]-oxiimino)-2-fenilacetonitrilo) en dioxano durante 12 horas a
temperatura ambiente y 3 horas más a 90 °C, obteniendo un rendimiento del 74%.
Otra alternativa para la protección de estos grupos amino es mediante la adaptación
del procedimiento descrito por G. Cravotto y colaboradores,44 usando el anhídrido del
grupo protector Boc 3 y ácido sulfámico como catalizador, en CH2Cl2 a 0 °C y en tan
solo 15 minutos de tiempo de reacción, obteniendo un rendimiento similar al caso
anterior (Esquema 14). Ambas alternativas requieren del uso de cinco equivalentes de
la amina con la intención de reducir la probabilidad de una doble protección de los
grupos amino.
Esquema 14 – Procedimiento sintético para la monoprotección con el grupo Boc de la diamina 2

mediante catálisis con ácido sulfámico.
Esta metodología se ha aplicado a la protección con el grupo tert-butoxicarbonil de los

grupos amino que se describen en este trabajo.
2.5.2.2 Síntesis del módulo de crecimiento 6
La unidad de crecimiento básica, la escuaramida-éster 6, se obtiene por reacción entre

un equivalente de escuarato de dietilo con un equivalente de la diamina 3,3’-diamino-
N-metildipropilamina monoprotegida por el grupo tert-butoxi carbonil (Boc) 4 en Et2O,
aislando el producto con un 95% de rendimiento (Esquema 15).
Esquema 15 – Síntesis del módulo de crecimiento 6 a partir del escuarato de dietilo 1 y la diamina
monoprotegida 4.
44
Upadhyaya, D. J.; Barge, A.; Stefania, R.; Cravotto, G.; Efficient, solventless N-Boc protection of amines
carried out at room temperature using sulfamic acid as recyclable catalyst. Tetrahedron Lett., 2007, 48,
8318-8322.
43
2.5.2.3 Síntesis del módulo central 5
Se denomina módulo central a la unidad estructural a partir de la cual se hace crecer la

cadena oligomérica de forma simétrica. En la metodología utilizada se utilizan hasta
tres módulos centrales diferentes, el primero de ellos corresponde al escuarato de
dietilo 1, el segundo a la diamina 2 y el tercero al doble semiéster 5 (Fig. 31).
Figura 31 – Estructuras de los módulos centrales para la obtención de los oligómeros.
En el caso de comenzar la síntesis con escuarato de dietilo 1 se debe realizar una

condensación con dos equivalentes de la diamina monoprotegida 4, obteniendo de
esta forma el oligómero con una unidad escuaramida 7. En el caso de comenzar por
una diamina como es el caso de 2, por ejemplo, la conjugación con dos equivalentes
del módulo de crecimiento 6 da lugar al oligómero 8, con dos unidades escuaramida, el
mismo producto que se obtiene en el caso de realizar una doble conjugación entre el
módulo 5 y dos equivalentes de la diamina monoprotegida 4 (Esquema 16).
Esquema 16 – Síntesis de los primeros oligómeros, 7 y 8, con una y dos unidades escuaramida, a partir
de los diferentes módulos centrales propuestos en la figura anterior.
44
Para la obtención de este módulo inicial 5 se utilizan dos equivalentes de escuarato de

dietilo 1 por cada mol de la diamina 3,3’-diamino-N-metildipropilamina 2 en Et2O,
obteniendo el producto 5 con un 94% de rendimiento (Esquema 17).
Esquema 17 – Síntesis del módulo central con dos unidades escuaramida 5 a partir del escuarato de
dietilo 1 y la diamina 2.
La elección del módulo inicial determina si el número de escuaramidas de los

oligómeros lineales será par o impar ya que cada elongación incrementa en dos el
número de unidades escuaramida.
2.5.2.4 Elongación de oligómeros
De forma general, la obtención de los oligómeros se realiza mediante la desprotección

cuantitativa de los grupos amino terminales tratándolos con H2O/HCl a 50 °C durante
un mínimo de 4 horas. A continuación se realiza la condensación entre estos
oligómeros desprotegidos y dos equivalentes del módulo de crecimiento 6, en medio
EtOH, obteniendo oligómeros con dos unidades escuaramida más que los oligómeros
de partida (Esquema 18).
Esquema 18 – Procedimiento general para la elongación de los oligómeros independiente del número
de escuaramidas.
45
2.5.2.5 Macrociclación
En todos los casos, la última etapa para la obtención de oligoescuaramidas cíclicas es la

reacción de macrociclación a partir del oligómero lineal preorganizado. Como se ha
indicado en la introducción de este capítulo, la preorganización inducida por la
formación de una serie de enlaces intramoleculares deja los dos grupos amino de los
extremos de la molécula en una disposición adecuada para que, una vez
desprotegidos, reaccionen con la misma unidad de escuarato de dietilo cerrando la
estructura. Así por ejemplo, para la obtención de los macrociclos con cinco unidades
escuaramida, se prepara en primer lugar un oligómero lineal con cuatro unidades
escuaramida. A partir de éste, una vez desprotegidos los grupos amino, se hace
reaccionar con un equivalente de escuarato de dietilo en EtOH para obtener el
macrociclo con cinco unidades escuaramida (Esquema 19). Para la obtención de
macrociclos con tres o siete unidades escuaramida se sigue el mismo procedimiento.
Siguiendo un razonamiento análogo al anterior, la síntesis de macrociclos con número

par de unidades escuaramida debe comenzar por un módulo central con una unidad
escuaramida.
Esquema 19 – Procedimiento de síntesis general para la macrociclación de los oligómeros con “i”
unidades escuaramida, obteniendo macrociclos con un número impar de escuaramidas correspondiente
a n = i+1.
46
Las oligoescuaramidas cíclicas son insolubles en la mayoría de disolventes orgánicos,

especialmente en disolventes apolares, pero son solubles en medios acuosos
ligeramente ácidos. Esto es debido a que los nitrógenos terciarios de las cadenas
alifáticas tienen un pKa que oscila entre valores de 6 y 9, por tanto, en función del pH
del medio, los centros nitrogenados se encuentran protonados formando un policatión
amonio soluble en medios acuosos. La diferente solubilidad en función del pH se ha
aprovechado para la purificación de las oligoescuaramidas. El método general de
purificación consiste en una primera etapa donde el crudo de la reacción de
macrociclación se suspende con un disolvente orgánico como el Et2O, eliminando de
esta forma trazas de escuarato de etilo o de oligómero sin reaccionar. Seguidamente,
el residuo sólido se disuelve en la mínima cantidad de agua a pH 2 y se filtra,
eliminando los productos que no son solubles en medio ácido. Por último, la disolución
se basifica lentamente hasta pH 9-10 con una disolución de NaOH 1M. El macrociclo
precipita en estas condiciones aislándose por filtración.
Siguiendo la metodología general descrita para la obtención de las oligoescuaramidas

cíclicas, se ha procedido a la síntesis de un nuevo macrociclo, de mayor tamaño,
sirviendo éste de ejemplo concreto de la aplicación de las reacciones de elongación y
macrociclación descritas.
2.5.2.6 Síntesis de la oligoescuaramida cíclica C7 18
Figura 32 – Estructura de la oligoescuaramida C7 18.
El esquema que sigue a continuación describe la síntesis completa del macrociclo 18,
denominado C7 por contener siete unidades escuaramida. Éste se ha sintetizado
utilizando la metodología descrita previamente a partir del oligómero que contiene
seis unidades escuaramida 12 y llevando a cabo la reacción de macrociclación con
escuarato de dietilo 1. De esta manera se incorpora a la estructura la séptima unidad
escuaramida. Para obtenerlo se han utilizado únicamente los módulos descritos hasta
el momento ya que no se introduce ningún grupo funcional diferente (Esquema 20).
47
Esquema 20 – Síntesis del macrociclo C7 18 partiendo del módulo central 5, utilizando el módulo de
crecimiento 6 y realizando la reacción de macrociclación con escuarato de dietilo 1.
El primer paso consiste en la incorporación de una cadena espaciadora en cada

extremo del módulo central 5 para la obtención de un oligómero con número par de
escuaramidas. Para esta reacción se ha utilizado la diamina monoprotegida 4,
48
aislándose el oligómero 8 que contiene dos unidades escuaramida y tres cadenas

espaciadoras en su estructura. Esta molécula presenta dos grupos amino protegidos en
los extremos de la molécula. La reacción de desprotección transcurre con
rendimientos casi cuantitativos cuando se utiliza una mezcla EtOH:H 2O como
disolvente y once equivalentes de HCl. La diamina obtenida puede reaccionar con dos
equivalentes del módulo de crecimiento 6, en EtOH. De esta forma se aísla el
oligómero formado por cuatro unidades escuaramida 10 que también tiene los dos
grupos amino terminales Boc-protegidos. La repetición de los dos últimos pasos
sintéticos permite aislar el oligómero formado por seis unidades escuaramida 12.
Para obtener el macrociclo con siete unidades escuaramida se ha seguido el

procedimiento de macrociclación habitual, ligeramente modificado para la obtención
de los macrociclos más grandes. En estos casos la macrociclación se realiza en MeOH
en lugar de EtOH. Este cambio de disolvente se debe a dos motivos. En primer lugar
por la mayor solubilidad que presentan estos oligómeros de mayor tamaño en dicho
disolvente, y en segundo lugar por el intercambio que se produce con el escuarato de
etilo, obteniendo derivados metil-éster, más reactivos. Además, como paso previo, el
oligómero desprotegido 12 debe mantenerse bajo agitación con el medio y en caliente
con el fin de facilitar su disolución. Una vez enfriado el conjunto a temperatura
ambiente, se adiciona el escuarato de dietilo 1. De esta forma el macrociclo C7 18 se
obtiene con un rendimiento del 77%.
2.5.3 Síntesis de oligoescuaramidas cíclicas con el sustituyente del nitrógeno

terciario modificado
Dada la orientación de los macrociclos escuaramídicos como moléculas bioactivas se

consideró necesario estudiar cómo afectaba a sus propiedades biológicas y a la síntesis
la introducción de grupos laterales. Puesto que el macrociclo C5 16 se ha utilizado
como referencia en la mayoría de pruebas biológicas realizadas previamente, resulta
interesante comparar la actividad de los nuevos macrociclos con la del macrociclo C5.
Para ello la estrategia que se ha seguido ha sido la de introducir nuevos sustituyentes
en el nitrógeno de una de las cadenas espaciadoras, preparando nuevas diaminas que
contienen los sustituyentes elegidos y la misma longitud que la 3,3’-diamino-N-
metildipropilamina utilizada como espaciador.
49
2.5.3.1 Síntesis de la oligoescuaramida cíclica C5(N-Bencilo) 25
Figura 33 – Estructura de la oligoescuaramida C5(N-Bencilo) 25.
En primer lugar es necesario preparar la diamina que contiene en el nitrógeno terciario

un grupo bencilo. Esta amina, la 3,3’-diamino-N-benzildipropilamina 22 se ha obtenido
siguiendo el procedimiento descrito en la bibliografía.45 De forma resumida, el nuevo
espaciador se obtiene a partir de la reacción de la bencilamina 19 con dos equivalentes
de acrilonitrilo 20 y posterior hidrogenación del dinitrilo 21 utilizando Ni-Raney como
catalizador (Esquema 21).
Esquema 21 – Síntesis de la diamina espaciadora conteniendo el grupo bencilo.
El oligómero 23, con dos unidades escuaramida, se ha preparado a partir de la diamina

22 con dos equivalentes del módulo de crecimiento 6 en EtOH. A partir de este punto
se ha seguido el procedimiento habitual para la elongación de los oligómeros. Es decir,
desprotección de 23 y condensación con el módulo de crecimiento 6 para dar el
oligómero 24. En este caso el oligómero desprotegido 24 es insoluble y la
condensación con escuarato de dietilo se realiza en DMSO-MeOH durante 72 horas
para obtener el macrociclo C5(N-bencilo) 25 con un rendimiento del 70% (Esquema
22).
45
Bergeron, R. J.; Garlich, J. R.; Amines and Polyamines from Nitriles. Synthesis, 1984, 9, 782-784.
50
Esquema 22 – Síntesis del macrociclo C5(N-bencilo) 25 partiendo de la amina debidamente

funcionalizada 22, y utilizando el módulo de crecimiento 6.
El resultado práctico a nivel de síntesis indica que la presencia del grupo bencilo no
afecta significativamente ni a la obtención de los oligómeros ni a la etapa de
macrociclación. Esta última etapa es la más sensible ya que requiere un alto grado de
preorganización de la estructura lineal impidiendo de esta manera la formación
competitiva de polímeros lineales que conlleva una reducción en el rendimiento del
macrociclo.
51
2.5.3.2 Síntesis de la oligoescuaramida cíclica C5(N-Leucina) 31
Figura 34 – Estructura de la oligoescuaramida C5(N-Leucina) 31.
La leucina es un aminoácido con una cadena de iso-butilo. Se ha decidido utilizar su

grupo amino como punto de enlace para introducirlo en la estructura en lugar del
nitrógeno terciario de la posición gamma de la cadena alifática, intercambiando uno de
los grupos metilo presentes en los espaciadores habituales por el iso-butilo y el
carboxilato del aminoácido. Esta modificación es significativa, ya que introduce en la
estructura del macrociclo un grupo carboxilo que además de ser ionizable con la
consiguiente posible modificación de la penetrabilidad celular, ofrece un centro de
reacción útil para posteriores modificaciones y/o para la conjugación con otras
moléculas.
Para la síntesis del nuevo macrociclo es necesario, al igual que en el caso anterior,
preparar la correspondiente diamina 28, siguiendo para ello el procedimiento descrito
en la bibliografía,46 y que es análogo al realizado para obtener la 3,3’-diamino-N-
benzildipropilamina 22 descrita en el apartado anterior. La reacción con acrilonitrilo de
la leucina 26 y la posterior reducción del producto de reacción 27 resulta en la diamina
28 con un 45% de rendimiento global (Esquema 23).
Esquema 23 – Síntesis de la diamina espaciadora conteniendo el aminoácido leucina.
Al igual que en el caso anterior de la bencilamina, para la obtención del oligómero con
dos unidades escuaramida 29, se ha conjugado directamente la diamina 28 con dos
equivalentes del semiéster 6 en EtOH. A partir de este oligómero se ha seguido la
metodología habitual, según la cual se obtiene primero el oligómero con cuatro
unidades escuaramida 30. Para la etapa de macrociclación, el planteamiento es el
habitual, desproteger en primer lugar el oligómero 30 en disolución ácida acuosa y
46
Kim, Y.; Zeng, F.; Zimmerman, S. C.; Peptide Dendrimers from Natural Amino Acids. Chem. Eur. J.,
1999, 5, 2133-2138.
52
posterior reacción con un equivalente de escuarato de dietilo 1 para obtener el

macrociclo C5(N-Leucina) 31 (Esquema 24).
Esquema 24 – Síntesis del macrociclo C5(N-Leucina) 31 partiendo de la amina debidamente

53
La modificación estructural introducida afecta sutilmente al rendimiento de las etapas

de elongación de la cadena oligomérica en comparación con el uso de espaciadores sin
modificaciones, ya que se obtienen rendimientos del 50 y 70% respectivamente. Por
otra parte, la macrociclación no se produce, sino que se obtienen productos
poliméricos. Ello ocurre probablemente debido a que la ya conocida interacción del
grupo carboxilato con escuaramidas destruye la preorganización de los oligómeros
requerida para la macrociclación.47
Con el fin de superar esta dificultad el grupo carboxílico se ha protegido como éster
con trimetilsilil etanol (TMSE) 32. La protección del ácido carboxílico se ha realizado
sobre el derivado de leucina funcionalizado con los nitrilos 27, mediante la formación
de un éster con DCC en medio CH2Cl2, y realizando posteriormente la reducción de los
nitrilos en condiciones similares a las anteriores (Esquema 25).
Esquema 25 – Protección del ácido carboxílico del dinitrilo 21 y posterior reducción, obteniendo la
diamina espaciadora 34 que contiene el aminoácido leucina con el carboxilato protegido.
Una vez obtenida la diamina 34 se ha obtenido el oligómero con dos unidades

escuaramida 35 de la misma forma que en el caso anterior, mediante conjugación con
dos equivalentes del módulo de crecimiento 6. Con la intención de comprobar en este
punto si el grupo protector resuelve el problema, se ha realizado una reacción de
macrociclación para obtener el macrociclo con tres unidades escuaramida 37,
mediante la desprotección primero de los grupos amino en medio ácido acuoso y
posterior condensación con escuarato de dietilo 1 (Esquema 26).
47
Prohens, R.; Tomàs, S.; Morey, J.; Deyà, P. M.; Ballester, P.; Costa, A.; Squaramido-Based Receptors:
Molecular Recognition of Carboxylate Anions in Highly Competitive Media. Tetrahedron Lett., 1998, 39,
1063-1066.
54
Esquema 26 – Síntesis del macrociclo C3(N-Leucina-TMSE) 37 partiendo de la amina debidamente

El macrociclo C3 14 se puede obtener siguiendo la misma metodología general descrita

anteriormente para el macrociclo C7 18, mediante la reacción de macrociclación del
oligómero con dos unidades escuaramida 8 y escuarato de dietilo 1, obteniendo un
rendimiento similar a los que se obtienen con los macrociclos más grandes. Sin
embargo, para el caso del oligómero que contiene la leucina 35, al analizar el crudo de
la reacción de macrociclación entre el oligómero y escuarato de dietilo 1 mediante
espectrometría de masas (ESI-MS), se observan señales que corresponden a una
mezcla de productos. Por una parte, se puede identificar la señal correspondiente al
macrociclo de tres unidades escuaramida ([MH+]: 870,4), sin embargo, también se
observa otro grupo de señales de un producto desconocido ([MH+]: 1040,7), que
podrían pertenecer a la estructura propuesta en la figura 35.
55
Figura 35 – Estructura propuesta para la señal observada mediante espectrometría de masas del crudo
+
de la reacción de macrociclación del oligómero 35. C52H86N8O12Si, MH : 1040,6 m/z.
Este segundo producto, que corresponde a una doble entrada del escuarato de dietilo
sobre las aminas terminales, indica que la preorganización que se da en el oligómero
no es la óptima para obtener el macrociclo correspondiente.
Por otra parte, siguiendo la metodología habitual, y a partir del oligómero 35, se ha
preparado el oligómero con cuatro unidades escuaramida 36 con la intención de
obtener el macrociclo 38 con cinco unidades escuaramida, esperando que la mayor
longitud del oligómero permita una mejor preorganización previa a la etapa de
macrociclación (Esquema 27).
Esquema 27 – Síntesis del macrociclo C5(N-Leucina-TMSE) 38 partiendo del oligómero con dos unidades
escuaramida 35, y utilizando el módulo de crecimiento 6 y escuarato de dietilo 1 para la reacción de
macrociclación.
56
El oligómero 36 se obtiene con bajo rendimiento. Además, se observa que el grupo

protector TMSE resulta ser lábil en las condiciones acuosas utilizadas para desproteger
el grupo protector Boc de las diaminas, liberando parcialmente el carboxilato. Ésta
podría ser la causa del bajo rendimiento de las reacciones posteriores. De hecho, al
intentar llevar a cabo la reacción de macrociclación con un equivalente de escuarato
de dietilo 1, no se ha podido aislar el macrociclo deseado.
Con estos resultados, se descarta la introducción de cualquier aminoácido utilizando el

grupo amino del aminoácido como punto de unión al macrociclo, dejando de esta
forma un carboxilato libre, ya que esta alternativa inhibe la macrociclación del
oligómero.
2.5.4 Síntesis de oligoescuaramidas cíclicas con uno de los espaciadores modificado
En este grupo de modificaciones estructurales se modifica la capacidad de establecer

interacciones mediante enlace de hidrógeno en uno de los espaciadores de la
estructura, que se hace coincidir con la diamina central. Por una parte, la eliminación
de uno de los nitrógenos terciarios de uno de los espaciadores reduce esta capacidad,
mientras que por otra parte, el uso de un nuevo espaciador que contiene dentro de su
estructura un enlace amida modifica esta capacidad, intercambiando el centro aceptor
e incorporando un donador, modificando además la disposición de estos grupos en la
estructura del espaciador (Fig. 36).
Figura 36 – Estructura del espaciador original (izquierda) y las modificaciones propuestas en este
apartado (centro y derecha), señalando las posiciones aceptoras (rojo) o donadoras (azul) de enlace de
hidrógeno.
La introducción del grupo amida se ha realizado aprovechando la estructura de un

aminoácido, permitiendo también introducir los grupos funcionales propios de su
cadena lateral. En concreto se ha utilizado la metionina como representante de este
grupo de compuestos.
57
2.5.4.1 Síntesis de la oligoescuaramida cíclica C5(c7) 41
Figura 37 – Estructura de la oligoescuaramida C5(c7) 41.
Este macrociclo difiere de la estructura original del macrociclo C5 16 en que se ha

cambiado uno de los espaciadores por la heptildiamina 39. Como fruto de la
experiencia previa del grupo de Química Supramolecular, se sabe que la eliminación
del nitrógeno central, centro aceptor de enlace de hidrógeno, impide la obtención del
menor de los macrociclos, de dos unidades escuaramida, C2, y conduce a la formación
de polímeros insolubles, indudablemente debido a la ausencia total de preorganización
del correspondiente oligómero.48 Dado este precedente y con el objetivo de poder
evaluar esta modificación sobre el efecto antitumoral del macrociclo, resulta
aconsejable plantear una ruta sintética alternativa. Para ello se ha diseñado un módulo
central con tres unidades escuaramida para, posteriormente, realizar la macrociclación
con el doble semiéster obtenido con la heptildiamina 40 según se indica en el esquema
29. Ello permite obtener oligómeros cíclicos con cinco unidades escuaramida, sin que
la falta del átomo aceptor influya en el plegamiento del oligómero precursor. La
preparación del oligómero con número impar de escuaramidas se realiza según el
procedimiento descrito previamente,38 mediante la condensación en EtOH de
escuarato de dietilo 1 y dos equivalentes de la diamina monoprotegida 4, obteniendo
un oligómero con una unidad escuaramida central 7. Posteriormente, el procedimiento
habitual de elongación de los oligómeros da lugar al oligómero con tres unidades
escuaramida 9 (Esquema 28).
48
Conformational Preferences and Sellf-Template Macrocyclization of Squaramide-Based Foldable
58
Esquema 28 – Síntesis del oligómero con tres unidades escuaramida 9 sintetizado según el
procedimiento general descrito.
El doble semiéster necesario para la macrociclación se prepara por condensación en

Et2O de dos equivalentes de escuarato de dietilo 1 por cada equivalente de
heptildiamina 39, favoreciendo con este disolvente la entrada de cada uno de los
grupos amino sobre la primera de las posiciones del escuarato de etilo (Esquema 29).
Esquema 29 – Síntesis del módulo de macrociclación 40 con dos unidades escuaramida.
A partir de los dos módulos ya descritos, 9 y 40, se realiza la reacción de

macrociclación según los procedimientos habituales, en EtOH durante 16 horas. El
resultado ha sido el esperado y se ha aislado el macrociclo C5(c7) 41 con un
rendimiento del 30%, inferior a los rendimientos habituales pero suficiente para
realizar los ensayos de viabilidad (Esquema 30).
59
Esquema 30 – Síntesis del macrociclo C5(c7) 41 a partir del oligómero con tres unidades escuaramida 9 y
el diéster derivado de la heptildiamina 40.
De esta manera se valida la metodología alternativa utilizada para la obtención de

oligoescuaramidas macrocíclicas con modificaciones estructurales que pueden afectar
al plegamiento de los oligómeros, aun reduciendo el rendimiento del proceso de
macrociclación.
2.5.4.2 Síntesis de las oligoescuaramidas cíclicas C5(Met-c3) 50 y C6(Met-c3) 51
Figura 38 – Estructura de las oligoescuaramidas C5(Met-c3) 50 y C6(Met-c3) 51.
La última modificación planteada es la de incrementar las posibilidades de establecer

un mayor número de interacciones mediante enlace de hidrógeno añadiendo en este
caso un centro donador y modificando la posición de estos centros en el espaciador.
Para ello se ha introducido un aminoácido en la estructura del espaciador como si de
un polipéptido se tratara, la metionina. Este aminoácido contiene un grupo tioéter en
la cadena lateral. Como consecuencia de la estructura de la metionina, la longitud de la
cadena de diamina modificada se reduce en un átomo de carbono, un hecho que no se
espera tenga mucha relevancia en las interacciones intramoleculares y por tanto en la
elongación o ciclación de los oligómeros.
60
La síntesis de esta diamina se ha realizado por condensación entre el grupo amino de

la 1,3-propandiamina monoprotegida con el grupo Boc 43 y el grupo carboxilo del
aminoácido metionina con su resto amino también protegido con Boc 45. La
protección de la 1,3-propandiamina se ha realizado según el procedimiento optimizado
anteriormente, usando ácido sulfámico como catalizador en CH2Cl2, obteniendo un
rendimiento del 90%. Para la protección del aminoácido se ha seguido una
metodología descrita en la bibliografía, usando una mezcla de disolventes compuesta
por dioxano y NaOH 1M en H2O, obteniendo un rendimiento del 90%.49 La reacción de
condensación entre ambos fragmentos se ha realizado utilizando DCC como agente de
acoplamiento, obteniendo la diamina protegida con un rendimiento del 70% (Esquema
31).
Esquema 31 – Síntesis del nuevo espaciador conteniendo la cadena lateral de la metionina.
La disposición de los centros donadores y aceptores de este nuevo espaciador permite

establecer interacciones intramoleculares similares a las que dan lugar a la
preorganización en los oligómeros originales, resultando en ciclos de 8 y 11 miembros
(Fig. 39).
49
Maity, P.; Zabel, M.; König, B.; Tetrahydrofuran Cα-Tetrasubstituted Amino Acids: Two Consecutive β-
Turns in a Crystalline Linear Tripeptide. J. Org. Chem., 2007, 72, 8046-8053.
61
Figura 39 – Estructuras plegadas originales comparadas con las que resultarían utilizando aminoácidos
modificados.
A partir de la diamina protegida 46, se ha procedido a la obtención de los oligómeros

habituales de dos 48 y cuatro unidades escuaramida 49, realizando primero la
desprotección de los grupos terminales en H2O/HCl seguida de la elongación mediante
condensación con el módulo de crecimiento 6. Los rendimientos obtenidos en el
proceso de elongación han sido del 84% y del 50%, respectivamente. Aprovechando la
nueva metodología de macrociclación diseñada para la obtención del macrociclo C5(c 7)
41, se han realizado dos reacciones de macrociclación diferentes utilizando escuarato
de dietilo 1 y el doble semiéster con el espaciador habitual 5, obteniendo de esta
forma los macrociclos modificados de cinco y seis unidades escuaramida 50 y 51
respectivamente.
Así, la oligoescuaramida C5(Met-c3) 50 se obtiene a partir de la condensación del

oligómero 49 desprotegido con escuarato de dietilo 1 en MeOH con un rendimiento
del 35%. Por otra parte, la desprotección del oligómero 49 y condensación con el doble
semiéster 5 también en MeOH da lugar a la oligoescuaramida C6(Met-c3) 51, con un
rendimiento del 41% (Esquema 32).
62
Esquema 32 – Procedimiento sintético para la obtención de los macrociclos C5(Met-c3) 50 y C6(Met-c3)

51 a partir del nuevo espaciador sintetizado conteniendo el aminoácido metionina 46.
Esta nueva modificación en la estructura ha permitido obtener los macrociclos

derivados de metionina 50 y 51, análogos al C5 16 y C6 17 respectivamente. Los
rendimientos de las reacciones de macrociclación, algo inferiores a los obtenidos en las
síntesis de los macrociclos sin modificaciones, sugieren que la preorganización es
suficiente para que se dé la macrociclación pero no tan eficiente, provocando la
disminución del rendimiento. Las oligoescuaramidas cíclicas derivadas de la metionina
63
se han purificado mediante la misma técnica de precipitación selectiva utilizada con

anterioridad.
Así pues, se han podido obtener tres nuevos macrociclos con cinco unidades
escuaramida que presentan diferencias estructurales significativas en uno de sus
espaciadores respecto al macrociclo C5 original. Además se ha obtenido un derivado
de la oligoescuaramida C6 mediante una nueva estrategia para la obtención de
macrociclos con número par de escuaramidas, permitiendo de esta forma usar el
mismo oligómero precursor que el utilizado para el macrociclo de cinco miembros. Por
último se ha sintetizado también un macrociclo mayor, con siete unidades
escuaramida. Estos cinco macrociclos se han evaluado como agentes antitumorales en
comparación con los macrociclos originales.
2.5.6 Bioensayos
Los experimentos descritos en este apartado se han realizado en los laboratorios del
grupo de Biología Celular del Cáncer de la UIB, que viene colaborando con el grupo de
Química Supramolecular desde el año 2007. Esta colaboración ha permitido, además
de proporcionar el material, los cultivos celulares y su mantenimiento, recibir la
formación necesaria para manipular cultivos celulares y realizar los ensayos de
viabilidad celular.
Los resultados de la actividad antitumoral de la oligoescuaramida C5, obtenidos

previamente, se han utilizado como punto de comparación. Además se ha incluido la
oligoescuaramida cíclica de mayor tamaño C6, como punto de comparación para los
macrociclos que contienen seis y siete unidades escuaramida.
La evaluación de la actividad biológica se ha realizado a partir de ensayos de viabilidad

celular mediante el cálculo de los índices IC50 celulares para cada uno de los
compuestos estudiados. La línea celular utilizada para realizar los ensayos ha sido la
llamada Jeko-1, una línea de linfoma no-Hodgkin de tipo B humano. Este tipo de
linfoma representa a nivel comparativo aproximadamente un 3,5% de los casos de
cáncer, suponiendo unos 250.000 nuevos casos solo en 2008. La incidencia ha
aumentado en las últimas décadas y es mayor en países desarrollados, sin embargo
estos datos pueden atribuirse a una mejora en los diagnósticos.50 Se ha elegido esta
línea celular por dos motivos. Por una parte, son células en suspensión y por tanto son
más sencillas de manipular que las líneas adherentes. Por otra parte, las células Jeko-1
han resultado ser una línea muy sensible al tratamiento con la oligoescuaramida C5 16,
con una viabilidad del 46% después de un tratamiento con C5 a una concentración 10
µM durante 48 horas. De esta forma, la influencia de las modificaciones realizadas se
debería apreciar más fácilmente que en el caso de líneas celulares donde la acción del
C5 es mucho más agresiva, o por el contrario, en líneas inmunes a su acción.
50
Boffetta, P.; Epidemiology of adult non-Hodgkin lymphoma. Ann. Oncol., 2011, 22, iv27-iv31.
64
2.5.6.1 Ensayos de viabilidad celular
Los ensayos de viabilidad se realizan mediante la determinación de la cantidad de ATP

intracelular. Esta determinación se realiza mediante un kit comercial de detección por
luminiscencia (CellTiter-Glo® de Promega). Este kit proporciona una alta velocidad,
sensibilidad y reproducibilidad en las lecturas. El procedimiento que utiliza este kit
para la determinación de ATP se basa en una reacción quimioluminiscente, que
proporciona una señal proporcional a la concentración de ATP. Para ello, los reactivos
incluidos en el kit provocan la lisis de las células y la generación de una señal
luminiscente estable gracias a una luciferasa termoestable (Luciferasa Recombinante
Ultra-GloTM), un enzima oxidativo muy utilizado en bioluminiscencia.
La reacción de oxidación no catalizada de la luciferina es muy lenta, pero en presencia

del enzima luciferasa, y Mg2+, ATP y oxígeno como cofactores, obteniéndola oxidación
se acelera produciendo oxiluciferina en estado excitado, que mediante relajación
interna da lugar a la luminiscencia observada (Esquema 33).
Esquema 33 – Mecanismo de actuación de la enzima Luciferasa sobre la luciferina, y evolución de la

oxiluciferina para obtener la señal luminiscente.
Esta luminiscencia tiene una vida media de más de cinco horas, lo que permite realizar
la adición del reactivo y la lectura de toda una serie de muestras al mismo tiempo,
consiguiendo de esta forma una alta reproducibilidad.
En función de las condiciones de incubación, las células contienen una cantidad de ATP
variable y por esta razón la señal luminiscente siempre se referencia respecto a la
señal de un cultivo control, el cual no se ha tratado con el producto pero se ha
incubado durante el mismo tiempo y en las mismas condiciones que las células
tratadas. Estos cultivos deben provenir del mismo cultivo madre, obteniendo de esta
forma cultivos iniciales con el mismo número de células.
De forma general, se preparan disoluciones madre de la oligoescuaramida cíclica

correspondiente a una concentración 100 mM en DMSO, utilizando posteriormente
diluciones de esta disolución para tratar los cultivos celulares durante el tiempo
previsto. Una vez finalizado el periodo de incubación se determina la cantidad de
células viables mediante el kit CellTiter-Glo®.
65
La determinación de los valores de IC50 para todos los productos se realiza siguiendo el
mismo procedimiento, realizando ensayos a diferentes concentraciones. Para ello, a
partir de la disolución madre se han obtenido disoluciones en DMSO de
concentraciones 10, 2, 0,2 y 0,02 mM, a partir de las cuales se han obtenido cultivos
celulares con concentraciones de oligoescuaramida de 200, 50, 20, 8, 3, 1, 0,3, 0,1,
0,05 y 0,01 µM (Fig. 40).
Figura 40 – Diluciones realizadas para obtener las concentraciones deseadas en los cultivos celulares
para la obtención de los valores de IC50.
Para asegurar la reproducibilidad del tratamiento, los tratamientos se realizan por

triplicado, con un cultivo control común para todos ellos. Transcurridas 48 horas desde
la administración de la oligoescuaramida se determina la viabilidad celular.
Para cada compuesto analizado se obtienen un total de 96 lecturas, que se analizan

mediante el software Prism5 de GraphPad, utilizando un modelo de inhibición
sigmoidal de pendiente variable para obtener el valor de IC50 como la concentración a
la cual la viabilidad celular se ha reducido en un 50%. El programa ajusta los datos a la
ecuación 1.
( ) (Ec. 1)
Siendo “y” la respuesta observada (viabilidad), “x” la concentración del compuesto a

ensayar y “n” el coeficiente de Hill.
Asimismo se obtienen los valores de IC50 para los macrociclos C2, C5 y C6 (compuestos
13, 16 y 17) con fines comparativos. El análisis de este valor para la oligoescuaramida
C2 permite evaluar el método. Al no haber demostrado una actividad antitumoral
significativa en las pruebas anteriores se debería obtener un valor de IC50 mucho más
elevado.
66
2.5.6.2 Resultados de los ensayos
Los resultados obtenidos para los macrociclos C2, C5 y C6 (compuestos 13, 16 y 17)
concuerdan con los obtenidos de las pruebas de viabilidad previas a una concentración
fija (10 µM). Como era de esperar, el macrociclo C2 no ha mostrado actividad en el
intervalo de concentración estudiado, descartando su toxicidad. Para las
oligoescuaramidas cíclicas más grandes se observa el incremento de la actividad
esperada y en función del tamaño de éstas (Fig. 41). Las curvas obtenidas en los
ensayos del cálculo de la IC50 son de tipo sigmoidal y la pendiente de esta curva a un
50% de viabilidad representa la pendiente de Hill o factor de Hill.51
Figura 41 – Representación porcentual de los valores de viabilidad obtenidos en función de la

concentración para las oligoescuaramidas cíclicas de referencia C5 16 (izquierda) y C6 17 (derecha). Los
valores obtenidos para la oligoescuaramida C5 corresponden a ensayos en el intervalo de
concentraciones entre 0,5 y 50 µM.
De modo similar se han determinado los valores de IC50 para las oligoescuaramidas
cíclicas modificadas (Fig. 42).
51
La pendiente de Hill es un valor referente a ensayos de activación-inhibición entre un sustrato y una
enzima, pudiendo obtener valores mayores que 1, que corresponde a una interacción cooperativa
positiva, valores cercanos a 1, indicando que no existe cooperatividad, o bien valores menores que 1,
existiendo en este caso una cooperatividad negativa.
67
Figura 42 – Representación porcentual de los valores de viabilidad obtenidos en función del logaritmo
de la concentración para las oligoescuaramidas (de arriba abajo y de izquierda a derecha) C7 18, C5(N-
Bencilo) 25, C5(c7) 41, C5(Met-c3) 50 y C6(Met-c3) 51.
A modo de resumen se representan a continuación los valores obtenidos (Tabla 3) y la

representación gráfica los valores de IC50 de todas las oligoescuaramidas evaluadas
(Fig. 43).
Tabla 3 – Resumen de los valores obtenidos del Log de IC50, el valor de la pendiente de Hill.
Valor ± 
IC50 (M)
Log IC50 Pendiente
C5 -4,51 ± 0,01 -5,4 ± 0,9 30,7
C5(N-Bencilo) -4,56 ± 0,09 -6,6 ± 4,3 27,6
C5(c7) -4,34 ± 0,02 -3,0 ± 0,6 45,3
C5(Met-c3) -4,47 ± 0,04 -5,1 ± 1,2 34,2
C6 -5,03 ± 0,05 -2,2 ± 0,5 9,4
C6(Met-c3) -4,61 ± 0,04 -4,3 ± 1,6 24,4
C7 -5,00 ± 0,04 -5,5 ± 2,2 10,0
68
50
40
IC50 (µM)
30
20
10
Figura 43 – Representación gráfica de los valores de IC50 para las diferentes oligoescuaramidas cíclicas.
2.5.6.3 Análisis de resultados de los IC50 obtenidos
A la vista de los resultados obtenidos se puede indicar que la oligoescuaramida C7 18,

que es el macrociclo más grande de la serie oligoescuaramídica sin modificaciones,
presenta un valor IC50 de 10 µM, similar a la del macrociclo C6 17, y en ambos casos
inferior a la obtenida para el compuesto C5 16. Se puede afirmar, por tanto, que el
hecho de aumentar el tamaño del macrociclo de seis a siete unidades de escuaramida
no incrementa significativamente la actividad antitumoral, descartando la posibilidad
de seguir incrementando el número de escuaramidas con el fin de obtener una mayor
actividad antitumoral.
Para la oligoescuaramida C5(Met-c3) 50 se ha obtenido un valor de IC50 de 34 µM,

similar al observado para su homólogo, el macrociclo C5 16, con un valor de 30,7 µM,
pudiendo descartar cualquier influencia del cambio de la estructura del espaciador o
del resto de la metionina en la actividad antitumoral. Para las dos oligoescuaramidas
cíclicas con seis unidades escuaramida, se observa una pequeña diferencia en los
valores de IC50, 24,4 µM para el compuesto modificado 51 frente a un valor de 9,4 µM
de la oligoescuaramida cíclica original 17, sin embargo, esta diferencia no es
significativa, pudiendo descartar igualmente la influencia del residuo de metionina.
Comparando los valores obtenidos entre los dos derivados de la metionina se confirma
la tendencia observada en los respectivos macrociclos sin modificaciones, el tamaño
de la oligoescuaramida afecta a la actividad, incrementándose en los compuestos con
seis escuaramidas.
El macrociclo C5(c7) 41 ha mostrado el valor más elevado de IC50, con un valor de 45,3
µM. En una hipótesis inicial, se puede relacionar este resultado con la reducción en el
número de nitrógenos terciarios, que reduce el número de interacciones por enlace de
hidrógeno, o por la reducción de los centros básicos, sin embargo para poder explicar
69
este resultado sería necesario conocer el mecanismo por el cual actúan estos
macrociclos.
El último caso, el C5(N-Bencilo) 25 ha demostrado unos resultados poco satisfactorios

en cuanto a la precisión de los experimentos llevados a cabo, obteniendo valores de
desviación estándar muy superiores a los observados para los otros compuestos. Al
haber realizado todos los experimentos en paralelo se elimina la posibilidad de un
error experimental en cuanto al tratamiento, pudiendo deberse a la limitada
solubilidad del macrociclo y la posible precipitación en el medio de cultivo. Aun así, la
IC50 obtenida se encuentra dentro del mismo orden de magnitud de los otros
macrociclos con cinco unidades escuaramida, con un valor de 27,9 µM.
Respecto a los valores obtenidos para la pendiente de Hill, éstos no se deben tomar
como un resultado definitivo ya que no son experimentos directos de inhibición
enzimática, sin embargo, las conclusiones obtenidas concuerdan con los experimentos
realizados sobre la inhibición de cinasas in vitro y los estudios de inhibición
competitiva con ATP con el macrociclo C5. Los valores negativos obtenidos indican que
los macrociclos actúan mediante un mecanismo de inhibición, donde, a medida que se
incrementa la concentración del sustrato, disminuye la viabilidad celular. El valor
absoluto de esos valores es mayor que 1, indicando de esta forma que existe una
cooperatividad positiva.
En general estos datos parecen indicar que nos encontramos frente a un tipo de
inhibidor alostérico donde los macrociclos interaccionan con las cinasas mediante las
interacciones tipo “docking” comentadas en la introducción.
En cuanto a los valores de IC50 obtenidos en general, son del orden de magnitud de los
obtenidos de los ensayos de IC50 de inhibición enzimática con la oligoescuaramida C5
16 y el panel de 210 cinasas in vitro. Esto pone de manifiesto que estos compuestos se
internalizan rápida y eficazmente en la célula.
Los resultados obtenidos en este capítulo, a pesar de no haber mejorado la actividad

antitumoral mediante las modificaciones estructurales realizadas, han demostrado la
solidez de la estructura del macrociclo C5 desde el punto de vista que, manteniendo
aproximadamente un 85% de la molécula invariable, la actividad se mantiene
prácticamente constante. Además, desde el punto de vista sintético, la
oligoescuaramida C5 es la más sencilla de obtener, siendo por tanto una buena
candidata para proseguir con los estudios del uso de las oligoescuaramidas cíclicas
como agentes antitumorales.
70
2.6 Conclusiones
1. Se han sintetizado una serie de derivados oligoescuaramídicos cíclicos,
introduciendo variaciones estructurales de diferente naturaleza en su estructura.
2. La incorporación de aminoácidos en la estructura macrocíclica utilizando el grupo

amino como centro de unión no resulta ser una buena estrategia a seguir, ya que la
preorganización de los productos precursores de los macrociclos se ve suficientemente
alterada como para no dar lugar a los respectivos macrociclos. Por otra parte, la
introducción de aminoácidos formando un nuevo espaciador mediante un enlace
amida ha resultado ser un buen método para obtener los macrociclos derivados,
pudiendo obtener de esta forma macrociclos funcionalizados en su superficie con
cadenas laterales de aminoácidos.
3. Se ha introducido satisfactoriamente en la estructura del macrociclo un grupo

bencilo, sin suponer un inconveniente para la macrociclación.
4. Se ha desarrollado una ruta alternativa de macrociclación en la cual se introducen

dos unidades escuaramida en la reacción final, resultando efectiva en aquellos casos
donde la preorganización de los precursores lineales se puede ver alterada por las
modificaciones estructurales introducidas.
5. El estudio de la viabilidad celular y el cálculo de los índices de IC50 realizados con

cultivos celulares de linfoma humano de tipo B han demostrado que las modificaciones
realizadas en la estructura macrocíclica no han supuesto unos cambios significativos en
su actividad antitumoral respecto a los macrociclos originales, aunque se ha detectado
la menor actividad para el C5(c7) 41 donde se ha reducido el número de centros
básicos.
71
72
2.7 Métodos experimentales

Todos los disolventes utilizados han sido adquiridos a Scharlau y Sigma-Aldrich.
Cuando ha sido necesario, estos disolventes se han secado y destilado según los
procedimientos indicados en la bibliografía.52 El agua utilizada en los procesos de
síntesis, elaboración o preparación de muestras se ha purificado por electroósmosis
con un equipo ELIX10 (Millipore) y, posteriormente, por tratamiento a través de un
equipo MilliQ (Millipore) consiguiendo una resistividad máxima de 18,2 MΩ. El DMSO
utilizado para realizar las disoluciones y diluciones destinadas a la realización de
ensayos biológicos se ha adquirido a través de la casa comercial Sigma-Aldrich con
calidad BioReagent, y se ha usado siempre en condiciones estériles.
Los disolventes deuterados utilizados en los experimentos de RMN se han adquirido

con calidad espectroscópica para RMN con una riqueza del 99,98% siendo utilizados
sin tratamiento previo.
Todos los reactivos y sales utilizados han sido adquiridos a través de las casas
comerciales Sigma-Aldrich, Panreac o TCI Chemicals. Se han utilizado sin purificación
previa a no ser que se indique lo contrario.
Los espectros de RMN (1H y 13C) se han registrado en un instrumento Bruker AVANCE-
300. Los desplazamientos químicos indicados están referenciados a la señal residual
del disolvente utilizado en el caso de DMSO y CDCl3. En el caso de los espectros
realizados en D2O, se ha utilizado la sal sódica del ácido 3-(trimetilsilil)-1-
propanosulfónico como patrón interno. Los espectros de masas se han registrado con
un espectrómetro de masas de alta resolución (HRMS) Micromass AutoSpec 3000,
provisto de un sistema de entrada de la muestra mediante electroespray (ESI). El lector
de placas utilizado para las medidas de luminiscencia ha sido un Hidex Plate
Chameleon 425-104 multilabel counter, utilizando placas ELISA opacas, adecuadas
para el instrumento y el método, de 96 pozos de 250 µl de capacidad cada uno.
52 th
Armarego, W. L. F.; Chai, C.; Purification of Laboratory Chemicals, 6 Ed., 2009, Butterworth
Heinemann, Elsevier. Oxford, UK.
73
2.7.1 Síntesis
3-amino(N-terc-butoxicarbonil)-3’-amino-N-metildipropilamina 4:
4,214 g de 3,3’-diamino-N-metildipropilamina (2) (29,01 mmol) se disuelven en 30 ml

de CH2Cl2. Se añaden 0,028 g de ácido sulfámico (0,29 mmol) que se dejan en
suspensión y agitación. La suspensión resultante se deja con agitación unos minutos y
en un baño de agua-hielo. Por otra parte 1,266 g de dicarbonato de di-terc-butilo
(anhídrido Boc) (3) (5,80 mmol) se disuelven en 10 ml de CH2Cl2 y se añaden sobre la
suspensión de la amina gota a gota. El conjunto de reacción se mantiene con una
atmósfera inerte de argón durante la adición.
Finalizada la adición se retira el baño de agua-hielo y se deja agitando 15 minutos

adicionales. Se lava la disolución resultante con 3 x 20 ml de H2O, secando la fase
orgánica con Na2SO4 anhidro y evaporando el disolvente a baja presión.
Una vez concentrada la disolución se diluye con 10 ml de H2O y se acidifica hasta pH 3

con HCl concentrado. Ésta se lava con 3 x 10 ml de Et2O y la fase acuosa se basifica
hasta pH 10 con una disolución concentrada de NaOH. El producto se extrae de esta
disolución acuosa con 3 x 20 ml de CH2Cl2, se seca con Na2SO4 anhidro y se elimina el
disolvente, obteniendo 1,032 g (4,21 mmol) de 4 como un aceite incoloro. Rdto: 70%
1
H-RMN (300 MHz, CDCl3): δ = 1,2 (s, 2H, NH2), 1,44 (s, 9H, C(CH3)3), 1,61 (m, 4H,
CH2CH2CH2), 2,18 (s, 3H, NCH3), 2,40 (m, 4H, CH2NCH2), 2,74 (t, 2H, CH2NH2), 3,17 (q,
2H, CH2NH), 5,39 (s, 1H, NHCOO). 13C-RMN (75 MHz, CDCl3): δ = 28,9, 30,4, 32,8, 41,7,
42,4, 43,9, 57,5, 58,2, 80,7, 158,1. HRMS (ESI) calc. para 246,2182 (M+H+; C12H28N3O2+)
encontrado: 246,2182.
Diéster 5:
Sintetizado tal y como se describe en la bibliografía.48
74
Semiéster 6, Oligoescuaramidas 7-11 y Oligoescuaramidas cíclicas 13-17:
Sintetizados tal y como se describe en la bibliografía.38
Oligoescuaramida 12:
El procedimiento descrito para la síntesis de este oligómero es el descrito en la bibliografía

para los oligómeros 9, 10 y 11, sin embargo el oligómero con seis unidades escuaramida no se
ha descrito anteriormente.
1,0 g del oligómero con cuatro unidades escuaramida 10 (0,8 mmol) se disuelve en 10
ml de H2O con la adición de 0,4 ml de HCl al 37% (4,8 mmol). La disolución se mantiene
a 50 °C durante 4 horas.
Posteriormente se deja enfriar a temperatura ambiente y se basifica lentamente con

Na2CO3 hasta un pH de 10. La disolución se concentra a sequedad obteniendo un
aceite denso, que se disuelve en 10 ml de EtOH y se filtra. Esta disolución se añade
sobre otra que contiene 0,626 g del módulo de crecimiento 6 (1,7 mmol) disueltos en
10 ml de EtOH. La reacción se mantiene con agitación durante 12 horas, concentrando
posteriormente el disolvente a sequedad para obtener un sólido que se disuelve en 10
ml de CH2Cl2, se filtra y se precipita con la adición de 20 ml de Et 2O. Se obtiene el
producto 12 como un sólido de color amarillo pálido (0,741 g, 0,44 mmol). Rdto: 55%
75
C7 18:
El procedimiento descrito para la síntesis de esta oligoescuaramida cíclica es el

descrito en la bibliografía para los macrociclos 13, 14, 15, 16 y 17, con las pequeñas
modificaciones pertinentes para la obtención de los macrociclos más grandes.
La desprotección de los grupos amino del oligómero con seis unidades escuaramida
(12) se lleva a cabo siguiendo el mismo descrito para la obtención de este mismo
oligómero, incrementando el número de equivalentes de HCl en 2 unidades.
Para ello, 0,35 g del oligómero 12 (0,24 mmol) se tratan con 1,2 ml de HCl 3M (3,6
mmol) en H2O (10 ml). La solución se calienta a 50 °C durante 6 horas. La mezcla se
enfría a temperatura ambiente y se lleva a pH 9-10 con la adición de Na2CO3 sólido. El
disolvente se evapora a sequedad.
El residuo se redisuelve en MeOH (14 ml) y se filtra. Se mantiene después a una

temperatura de 70 °C durante 30 minutos. Posteriormente se deja enfriar y se añade
Na2CO3 (106 mg) y una disolución de escuarato de dietilo 1 (41 mg, 0,24 mmol) en
MeOH (6 ml). La disolución se mantiene en agitación durante 16 horas a temperatura
ambiente.
El disolvente se evapora entonces a sequedad obteniendo un residuo que se disuelve

en una disolución acuosa a pH 2 (1,5 ml). Esta disolución se filtra y se basifica con una
disolución de NaOH 1M a pH 9, obteniendo un precipitado que se aísla por filtración.
Este residuo sólido se trata con 3 x 20 ml de THF y 3 x 20 ml de acetona, la suspensión
formada se lleva a ebullición durante 20 minutos y se filtra obteniéndose 18 como un
sólido amarillo pálido (288 mg, 0,18 mmol). Rdto: 77%
1
H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1,65 (m, 28H, CH2CH2CH2), 2,1 (s, 21H, NCH3), 2,3
(m, 28H, CH2NCH2), 3,5 (m, 28H, CH2NH(sq)), 7,43 (s, 14H, NH). 13C-RMN (75 MHz,
D2O+HCl): δ = 28,0, 42,7, 43,8, 55,9, 170,7, 184,3. HRMS (ESI) calc. para 1584,9138
(M+Na+; C77H119N21NaO14+) encontrado: 1584,9156.
76
[N-N’-Bis-(2-aminopropil)]-bencilamina 22:
Este producto se ha sintetizado según el procedimiento descrito en la bibliografía.53,45
Oligoescuaramida-2(N-bencilo) 23:
Se obtiene del mismo modo que la oligoescuaramida 8, utilizando como reactivos de

partida 445 mg de la diamina derivada de la bencilamina 22 (2,01 mmol), y 1,78 g del
semiéster 6 (4,82 mmol) como módulo de crecimiento, obteniendo la
oligoescuaramida 23 como un sólido amarillo pálido (1,32 g, 1,49 mmol). Rdto: 74%
1
H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1,36 (s, 18H, CH3a), 1,49 (m, 4H, CH2b), 1,66 (m, 8H,
CH2c), 2,10 (s, 6H, CH3d), 2,27(m, 8H, CH2e), 2,42 (m, 4H, CH2f), 2,91 (m, 4H, CH2g), 3,52
(m, 10H, CH2h), 6,76 (m, 2H, NHi), 7,1-7,6 (m, 5+4H, CHj). 13C-RMN (75 MHz, D2O+HCl):
δ = 27,7, 29,0, 39,0, 42,3, 42,4, 50,9, 55,0, 55,3, 58,4, 78,1, 127,5, 128,8, 128,4, 140,1,
156,4, 168,7, 183,1. HRMS (ESI) calc. para 890,5471 (M+Na+; C45H73N9NaO8+)
Oligoescuaramida-4(N-bencilo) 24:
Se sintetiza siguiendo el procedimiento habitual de elongación de oligoescuaramidas

utilizando como reactivo de partida 486 mg de la oligoescuaramida 23 (0,60 mmol) y
454 mg del módulo de crecimiento 6 (1,23 mmol). El producto 24 se obtiene como un
sólido blanco (477 mg, 0,36 mmol). Rdto: 60%
53
Bergeron, R. J.; Burton, P. S.; Mcgovern, K. A.; Kline, S. J.; Reagents for the Selective Acylation of
Spermidine, Homospermidine, and Bis[3-aminopropyl]-amine. Synthesis, 1981, 9, 732-733.
77
1
H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1.35 (s, 18H, C(CH3)3), 1.48 (m, 4H, NCH2CH2CH2N),
1.64 (m, 16H, NCH2CH2CH2N), 2.10 (s, 12H, CH3), 2,24 (br, 16H, NCH2CH2CH2N), 2.40
(m, 4H, NCH2CH2CH2N), 2.90 (m, 4H, CH2NHCOO), 3.49 (br, 2H, NCH2Ar + 16H,
CH2NH(sq)), 6.76 (br, 2H, CH2NHCOO), 7.0–7.8 ppm (br, 5H Ar + 8H, NH). 13C-RMN (75
MHz, D2O+HCl): δ = 27,2, 28,7, 37,9, 42,0, 42,1, 50,4, 54,5, 54,9, 58,0, 78,2, 78,5, 127,2,
128,5, 129,2, 139,5, 156,3, 168,1, 182,5. HRMS (ESI) calc. para 1336,8116 (M+Na+;
C67H107N15NaO12+) encontrado: 1336,8148.
C5(N-bencilo) 25:
El procedimiento seguido para la síntesis de esta oligoescuaramida cíclica es similar al

habitual, a partir de 477 mg de la oligoescuaramida 24 (0,36 mmol) y 54 µl de
escuarato de dietilo 1 (0,36 mmol).
La oligoescuaramida 24 se disuelve en H2O (15 ml) y HCl 3M (1,1 ml, 3,3 mmol) y se
agita a 50 °C durante 5 horas. La solución resultante se deja enfriar y se añade
lentamente Na2CO3 hasta conseguir un pH de 9. El disolvente se evapora y el crudo se
disuelve en DMSO (2 ml) y MeOH (40 ml). La disolución se filtra y posteriormente se
añade el escuarato de dietilo 1 disuelto en MeOH (10 ml). La mezcla de reacción se
mantiene en agitación durante 72 horas.
El MeOH se concentra hasta obtener un residuo con DMSO, que se diluye añadiendo
una disolución acuosa del 5% de Na2CO3 (20 ml). Esta disolución se extrae con CHCl3 (4
x 15 ml) y CHCl3/tBuOH (50:50) (2 x 15 ml). Los extractos orgánicos se secan sobre
Na2SO4 y se evapora el disolvente. El sólido resultante se cristaliza con una mezcla de
CH2Cl2:Et2O (30:70) para obtener la oligoescuaramida cíclica 25 como un sólido
amarillo pálido (303 mg, 0,25 mmol). Rdto: 70%
1
H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1,67 (m, 20H, CH2CH2CH2), 2,14 (m, 12H, NCH3), 2,38
(m, 20H, NCH2CH2CH2NH), 3,03 (m, 2H, NCH2(C6H5)), 3,50 (m, 20H, NCH2CH2CH2NH),
7,2-8,2 (m, 10 + 5H, CH2NH(sq) + CH2(C6H5)). 13C-RMN (75 MHz, DMSO-d6): δ = 27,8,
42,7, 44,0, 52,5, 55,9, 131,4, 131,9, 132,6, 133,4, 170,3, 182,9. HRMS (ESI) calc. para
1192,6990 (M+H+; C61H90N15O10+) encontrado: 1192,6969.
78
[N-N’-Bis-(2-cianoetil)]-Leucina 27:
Sintetizado según se describe en la bibliografía.46 Rdto: 45%
[N-N’-Bis-(2-aminopropil)]-Leucina 28:
Sintetizado según el método de reducción descrito en la bibliografía ligeramente

modificado, añadiendo a 0,5 g de 27 (2,1 mmol), 0,6 ml de KOH 10,8 M (6,5 mmol) y
0,8 g de Ni-Raney.54
La elaboración del producto se lleva a cabo evaporando el disolvente y solubilizando el

crudo en t-BuOH. La fase orgánica se lava con NaOH 1M (3 x 15 ml) y se elimina el
disolvente, obteniendo la diamina 28 como un aceite. Rdto: 98%
1
H-RMN (300 MHz, D2O): δ = 0,79 (d, 6H, CH(CH3)2), 1,29 (m, 4H, CH2CH2CH2),
1,45 (m, 3H, CH2CH(CH3)2), 2,38 (m, 4H, CH2N), 2,55 (t, 4H, CH2NH2), 2,97 (s, 1H,
NCHCOOH).
Oligoescuaramida-2(N-Leucina) 29:
Se obtiene del mismo modo que la oligoescuaramida 8, utilizando como reactivos de

partida la diamina derivada de la leucina 28, y el semiéster 6 como módulo de
crecimiento. Rdto: 50%
54
Burk, M. J.; de Koning, P. D.; Grote, T. M.; Hoekstra, M. S.; Hoge, G.; Jennings, R. A.; Kissel, W. S.; Le, T.
V.; Lennon, I. C.; Mulhern, T. A.; Ramsden, J. A.; Wade, R. A.; An Enantioselective Synthesis of (S)-(+)-3-
Aminomethyl-5-methylhexanoic Acid via Assymmetric Hydrogenation. J. Org. Chem., 2003, 68, 5731-
5734.
79
Oligoescuaramida-4(N-Leucina) 30:

utilizando como reactivo de partida la oligoescuaramida 29. Rdto: 70%
(S)-2-([N,N-Bis-(2-cianoetil)]amino)-4-metilpentanoato de 2-(trimetilsilil)etil 33:
La reacción de condensación se lleva a cabo según el procedimiento descrito en la

bibliografía con algunas modificaciones.55
Una mezcla de 1,0 g de 27 (4,2 mmol), 0,747 g de trimetilsilil etanol (TMSE) 32 (6,3
mmol) y 51 mg de DiMAP (0,4 mmol) disueltos en 30 ml de CH2Cl2 anhidro, se añaden
gota a gota y en atmósfera de argón sobre otra disolución de 1,303 g de DCC (6,3
mmol) en 15 ml de CH2Cl2 anhidro, en un baño de agua-hielo y con agitación
constante. Acabada la agitación se retira el baño y se deja a temperatura ambiente
durante la noche.
El crudo de reacción, en forma de suspensión, se filtra y concentra, obteniendo un

crudo que se purifica mediante cromatografía en columna de sílica utilizando como
fase móvil un 100% inicial de hexano y variando esta proporción hasta un 70% de
hexano en AcOEt.
El producto obtenido se disuelve en EtOH y se concentra a 60 °C y 400 mbar de

presión. Se obtiene de esta forma el nitrilo 33 (1,287 g, 3,81 mmol). Rdto: 90%
1
H-RMN (300 MHz, CDCl3): δ = 0,05 (s, 9H, Si(CH3)3), 0,95 (dd, 6H, (CH3)2CH), 1,00 (dd,
2H, CH2Si), 1,58 (m, 2H, CHCH2CH), 1,78 (m, 1H, (CH3)2CH), 2,48 (t, 4H, (CH2CH2)2N),
3,02 (m, 4H, NCCH2CH2), 3,37 (dd, 1H, NCHCOO), 4,19 (dd, 2H, COOCH2CH2). 13C-RMN
(75 MHz, CDCl3): δ = -1,53, 17,9, 18,6, 22,1, 23,1, 24,8, 39,4, 47,9, 62,2, 63,3, 118,5,
173,4. HRMS (ESI) calc. para 360,2078 (M+Na+; C17H31N3NaO2Si+) encontrado:
360,2083.
55
Kai, T.; Sun, X. L.; Faucher, K. M.; Apkarian, R. P.; Chaikof, E. L.; Design and Synthesis of Asymmetric
Acyclic Phospholipid Bolaamphiphiles. J. Org. Chem., 2005, 70, 2606-2615.
80
(S)-2-([N,N-Bis-(2-aminopropil)]amino)-4-metilpentanoato de 2-(trimetilsilil)etil 34:
Se utilizan las mismas condiciones que las usadas para la obtención de la amina 28,
utilizando como producto de partida 0,7 g del nitrilo 33 (2,07 mmol), KOH (0,42 ml 10,8
M, 4,6 mmol) y Ni-Raney (1,1 g). El crudo de la reducción se filtra y el filtrado se lava
con H2O y EtOH. Se elimina el etanol de la disolución a presión reducida y la disolución
acuosa resultante se lava CH2Cl2 (3 x 15 ml). Los extractos orgánicos se lavan
posteriormente con una disolución de HCl a pH 3 (3 x 15 ml). Se secan con Na2SO4 y al
añadir Et2O precipita el producto. Se aísla el producto 34 por filtración (0,32 g, 0,93
mmol). Rdto: 45%
1
H-RMN (300 MHz, CDCl3): δ = 0,04 (s, 9H, Si(CH3)3), 0,90 (dd, 6H, (CH3)2CH), 0,99 (dd,
2H, CH2Si), 1,47 (m, 2H, CHCH2CH), 1,58 (m, 4H, CH2CH2CH2), 1,65 (m, 1H, (CH3)2CH),
2,50 (t, 4H, (CH2CH2)2N), 2,71 (m, 4H, NH2CH2), 3,38 (t, 1H, NCHCOO), 4,16 (dd, 2H,
COOCH2CH2).
Oligoescuaramida-2(N-Leucina-TMSE) 35:
Este producto se obtiene del mismo modo que la oligoescuaramida 8, utilizando como
productos de partida la diamina derivada de la leucina protegida 34 (0,2 g, 0,7 mmol),
y el semiéster 6 como unidad de crecimiento (0,59 g, 1,5 mmol). Rdto: 15%
1
H-RMN (300 MHz, CDCl3): δ = 0,04 (2H, CH3a), 0,88 (6H, CH3c), 1,43 (18H, CH3b), 1,6-2,0
(13H, CH2g, CH2h, CH2i, CHo), 2,2 (6H, CH3d), 2,4 (8H, CH2j), 2,5 (4H, CH2k), 2,8 (2H, CH2p),
3,2 (4H, CH2l), 3,35 (1H, CHn), 3,8 (8H, CH2m), 4,1 (2H, CH2e).
81
Oligoescuaramida-4(N-Leucina-TMSE) 36:

utilizando como reactivo de partida la oligoescuaramida 35 (43 mg, 43 µmol), HCl 5%
(0,43 ml, 0,26 mmol) y el módulo de crecimiento 6 (39 mg, 0,1 mmol). Rdto: 33%
3,3’-(1,7-heptandiildiimino)bis[4-etoxi-3-ciclobuten-1,2-diona] (40):
Se obtiene según el procedimiento descrito en la bibliografía.48
C5(c7) 41:
Se sintetiza siguiendo el procedimiento descrito para la oligoescuaramida cíclica 16,

utilizando como productos de partida la oligoescuaramida 9 (0,4 g, x 0,4 mmol) y el
diéster 40 (0,15 g, 0,4 mmol). Rdto: 30%
1
H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1,27 (m, 6H, NHCH2CH2(CH2)3), 1,48 (m, 4H,
NHCH2CH2(CH2)3), 1,64 (m, 16H, NCH2CH2CH2N), 2,09 (s, 12H, NCH3), 2,29 (m, 16H,
CH2NCH2), 3,48 (m, 20H, CH2NH(sq)), 7,47 (s, 10H, NH). 13C-RMN (75 MHz, D2O-HCl): δ
= 27,9, 32,6, 42,8, 43,9, 47,1, 55,9, 170,4, 170,7, 183,4, 184,1. HRMS (ESI) calc. para
1101,6568 (M+H+; C55H85N14O10+) encontrado: 1101,6580.
82
N-terc-butoxicarbonil-1,3-diaminopropano 43:
Se sintetiza según el procedimiento catalítico descrito para la obtención de la diamina

monoprotegida con el grupo Boc 4, utilizando como producto de partida la 1,3-
propandiamina 42 (9,1 g, 122 mmol), anhídrido Boc 3 (5,4 g, 24,4 mmol) y ácido
sulfámico (0,24 g, 2,4 mmol). Rdto: 90%
1
H-RMN (300 MHz, CDCl3): δ = 1,31 (br, 2H, NH2), 1,44 (s, 9H, C(CH3)3), 1,61 (m, 2H,
CH2CH2CH2), 2,76 (t, 2H, NH2CH2), 3,21 (q, 2H, CH2NHBoc), 4,87 (br, 1H, NHBoc). 13C-
RMN (75 MHz, CDCl3): δ = 28,6, 33,4, 38,6, 39,8, 79,3, 156,3.
N-terc-butoxicarbonilmetionina 45:
Sintetizado según el procedimiento descrito en la bibliografía.49
2-([N-terc-butoxicarbonil]amino)-N-(3-[N-terc-butoxicarbonil]aminopropil)-4-
(metiltio)-butanamida 46:
La condensación se ha realizado siguiendo las condiciones descritas para el producto

33, utilizando como productos de partida el ácido 45 y la amina 43.
Una disolución de 1,0 g de metionina protegida 45 (4,01 mmol), 0,7 g de diamina

monoprotegida 43 (4,02 mmol) y 50 mg de DiMAP (0,41 mmol) disueltos en CH2Cl2
anhidro (30 ml) se añade gota a gota sobre otra disolución de 1,076 g de DCC (5,2
mmol) en CH2Cl2 anhidro (10 ml) a 0 °C en atmósfera de argón. La mezcla se mantiene
a esa temperatura durante 2 horas y posteriormente 12 horas a temperatura
ambiente. La solución se filtra y se evapora el disolvente a sequedad. El residuo se
suspende en Et2O (10 ml) y se filtra. La adición de hexano a la disolución de Et2O
resulta en la precipitación de 46 como un sólido blanco (1,138 g, 2,81 mmol). Rdto:
70%
1
H-RMN (300 MHz, CDCl3): δ = 1,44 (s, 18H, C(CH3)3), 1,62 (m, 2H, NHCH2CH2CH2), 1,92
(m, 1H, CHCH2CH2S), 2,11 (m, 1H, CHCH2CH2S), 2,11 (s, 3H, SCH3), 2,55 (m, 2H,
CH2CH2NHCOO), 3,15 (m, 2H, CH2CH2S), 3,31 (m, 2H, CONHCH2CH2), 4,20 (m, 1H,
NHCHCONH), 4,9 (s, 1H, NHCOO), 5,2 (s, 1H, NHCOO), 6,7 (s, 1H, CONH). 13C-RMN (75
83
MHz, CDCl3): δ = 15,4, 15,5, 28,5, 28,6, 30,4, 36,1, 37,1, 66,0, 77,4, 156,6, 157,2, 171,9.
HRMS (ESI) calc. para 428,2195 (M+Na+; C18H35N3NaO5S+) encontrado: 428,2198.
Oligoescuaramida-2(Met-c3) 48:
Se obtiene del mismo modo que el oligómero 8, utilizando como productos de partida
la diamina derivada de la metionina 46, y el semiéster 6 como unidad de crecimiento.
En primer lugar se desprotege la diamina 46. Para ello, 1,117 g del compuesto 46 (2,05
mmol) se suspenden en una mezcla de H2O (30 ml) y MeOH (20 ml). Se añade 6,6 ml
de HCl 3M hasta la completa disolución del producto (19,8 mmol). La disolución se
mantiene a 50 °C durante 2 horas y otras 12 a 40 °C. Una vez alcanzada la temperatura
ambiente se lleva lentamente a pH 9-10 mediante la adición de Na2CO3 sólido. El
disolvente se concentra a sequedad y el residuo obtenido se disuelve en EtOH (10 ml) y
se filtra. Esta disolución se adiciona gota a gota sobre una disolución del módulo de
crecimiento 6 (1,59 g, 4,3 mmol) con Na2CO3 (2,12 g, 20 mmol) en EtOH (20 ml). La
reacción se mantiene en agitación durante 16 horas y posteriormente se concentra el
disolvente y el residuo se disuelve en CH2Cl2 (20 ml). Esta disolución se lava con H2O (2
x 10 ml), una disolución acuosa saturada en NaCl (10 ml), y se seca sobre Na2SO4. El
disolvente se concentra y el sólido resultante se suspende en Et2O (3 x 20 ml) y se filtra
obteniendo una vez acabado el proceso de purificación el oligómero 48 como un sólido
amarillo pálido (1,473 g, 1,72 mmol). Rdto: 84%
1
H-RMN (300 MHz, CDCl3): δ = 1,42 (s, 18H, C(CH3)3), 1,64 (br, 4H, NCH2CH2CH2N), 1,83
(br, 6H, NCH2CH2CH2N), 2,08 (br, 5H, CH2CH2SMe + SCH3), (m, 1H, CHCH2CH2S), 2,20 (s,
6H, NCH3), 2,40-2,56 (br, 8H, CH2NCH3, CHCONHCH2), 3,15 (br, 8H, CH2NHCO,
CH2CH2S), 3,71 (br, 6H, CH2NHCOO), 4,70 (br, 1H, NHCHCONH), 4,9-5,4 (br, 3H,
NHCOO), 7,9 (br, 4H, NHCO). 13C-RMN (75 MHz, CDCl3): δ = 15,7, 27,3, 28,6, 30,1, 39,2,
41,9, 43,3, 55,2, 77,3, 156,5, 167,6, 182,6. HRMS (ESI) calc. para 852,5017 (M+H+;
C40H70N9O9S+) encontrado: 852,5017.
84
Oligoescuaramida-4(Met-c3) 49:
Se sintetiza del mismo modo que el oligómero 48 utilizando como reactivo de partida
1,0 g de la oligoescuaramida 48 (1,17 mmol) y 0,91 g del módulo de crecimiento 6
(2,46 mmol), usando 3,1 ml de HCl 3M (9,4 mmol) para la desprotección de los grupos
amino. El producto 49 se obtiene como un sólido blanco (0,758 g, 0,59 mmol). Rdto:
50%
1
H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1,33 (s, 18H, C(CH3)3), 1,46 (br, 2H, CH2CH2S), 1,63
(br, 18H, NCH2CH2CH2N), 2,00 (s, 3H, SCH3), 2,08 (s, 6H, NCH3), 2,08 (s, 6H, NCH3), 2,2-
2,3 (br, 20H, (CH2)2NCH3, CH2NHCOCH, CH2S), 2,89 (m, 4H, CH2NHCOO), 3,47 (br, 14H,
CH2NH(sq)), 4,63 (br, 1H, NHCHCONH), 6,76 (br, 3H, CHCONHCH2 + NHCO), 7,50 (br,
8H, NH(sq)). 13C-RMN (75 MHz, DMSO-d6): δ = 14,6, 27,0, 28,2, 28,5, 38,2, 41,6, 54,1,
54,1, 54,2, 54,2, 54,6, 77,3, 155,5, 167,8, 182,3. HRMS (ESI) calc. para 1320,747
(M+Na+; C62H103N15NaO13S+) encontrado: 1320,8105.
C5(Met-c3) 50:
Se obtiene siguiendo el procedimiento descrito para la oligoescuaramida cíclica 16,

utilizando como productos de partida la oligoescuaramida 49 y escuarato de dietilo 1.
0,314 g del oligómero 49 (0,24 mmol) se disuelve en H2O (15 ml) con la ayuda de 1,0
ml de HCl 3M (3 mmol). La disolución se mantiene a 50 °C durante 12 horas.
Posteriormente se enfría a temperatura ambiente y se lleva a pH 9-10 añadiendo
Na2CO3 sólido. El disolvente se concentra a sequedad y el residuo se disuelve en EtOH
(10 ml) y se filtra. A la disolución se le añaden 106 mg de Na2CO3 (1,0 mmol) y 45 mg
de escuarato de dietilo 1 (0,26 mmol) disuelto en EtOH (1 ml). La reacción se agita a
temperatura ambiente durante 16 horas y posteriormente el disolvente se evapora a
sequedad. El crudo se disuelve en HCl 3M (2 ml) y se añade a la disolución NaOH 1M
hasta conseguir un pH 9. El precipitado obtenido se centrifuga, se seca y se lava con
85
CH2Cl2 (5 ml), obteniendo la oligoescuaramida 50 como un sólido de color amarillo

pálido (0,1 g, 0,08 mmol). Rdto: 35%
1
H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1,62 (m, 18+1H, CH2CH2CH2 + CHCHaHbCH2S), 2,00
(m, 3+1H, SCH3 + CHCHaHbCH2S), 2,07 (s, 12H, NCH3), 2,30 (m, 16, CH2N), 3,11 (m, 2H,
CH2CH2S), 3,48 (m, 18+2H, CH2NH(sq) + CH2NHCO), 4,60 (m, 1H, NHCHCONH), 8,12 (m,
6H, NH). 13C-RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 17,7, 31,6, 32,0, 33,9, 39,0, 44,6, 57,2,
58,0, 171,0, 185,3. HRMS (ESI) calc. para 1198,6166 (M+Na+; C56H85N15NaO11S+)
C6(met-c3) 51:
Se obtiene siguiendo el procedimiento descrito para la oligoescuaramida cíclica 50,

utilizando como productos de partida 0,4 g de la oligoescuaramida 49 (0,31 mmol)
disuelta en MeOH, y 133 mg del diéster 5 (0,34 mmol). La purificación del sólido
resultante se realiza lavandolo con THF (2 x 5 ml) y acetona (2 x 5 ml), obteniendo la
oligoescuaramida 51 como un sólido amarillo pálido (0,176 g, 0,13 mmol). Rdto: 41%
1
H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1,63 (m, 22+1H, CH2CH2CH2 + CHCHaHbCH2S), 1,99
(m, 3+1H, SCH3 + CHCHaHbCH2S), 2,09 (s, 15H, NCH3), 2,29 (m, 20H, CH2N), 3,12 (m, 2H,
CH2CH2S), 3,48 (m, 22+2H, CH2NH(sq) + CH2NHCO), 4,61 (m, 1H, NHCHCONH), 7,42 (m,
13H, NH). 13C-RMN (300 MHz, D2O+HCl): δ = 16,9, 28,0, 31,8, 39,2, 42,7, 43,8, 55,9,
170,7, 175,3, 184,3. HRMS (ESI) calc. para 1399,7667 (M+H+; C67H103N18O13S+)
86
2.7.2 Tests de viabilidad
Los cultivos celulares de la línea Jeko-1 utilizados se mantienen en medio RPMI 1640,
suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor y 100
unidades/ml de penicilina/estreptomicina. La suspensión celular al principio de los
experimentos contiene aproximadamente 4x105 células/ml, realizando las diluciones
oportunas cuando es necesario. Las condiciones estándar de incubación de las células
son de una temperatura de 37 °C y un 5% de CO2, utilizando para mantener estas
condiciones un incubador automatizado.
Las pruebas de viabilidad se han realizado con las oligoescuaramidas cíclicas derivadas
de la unidad escuaramida. Para todas ellas se prepararon disoluciones no inferiores a
100 mM en DMSO a las que se adicionó el mismo número de equivalentes de HCl
como nitrógenos terciarios contiene la estructura. De esta forma se prepararon in situ
las correspondientes sales amónicas de las oligoescuaramidas, lo que permite
aumentar su solubilidad en medios acuosos. A partir de estas disoluciones se han
realizado diluciones 1:10 en DMSO, obteniendo disoluciones a una concentración 10
mM. A partir de éstas, se ha tratado 1 ml de células en suspensión a una concentración
10 µM de oligoescuaramida cíclica (1 µl de disolución 10 mM). Todos los ensayos se
han realizado por triplicado. Las células se incubaron con el compuesto evaluado
durante 48 o 72 horas según el ensayo realizado. Una vez finalizado el periodo de
incubación, la viabilidad celular de cada muestra se ha obtenido mediante ensayos de
cuantificación de ATP, utilizando el kit kuminiscente Cell Titer-Glo (Promega, Madison,
WI, USA), siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. Para ello se
traspasan 100 µl de cada cultivo a una placa ELISA de 96 pozos por triplicado. En cada
muestra se añaden 100 µl de la disolución de Promega y se realizan a continuación las
medidas de luminiscencia por triplicado, asegurando de esta manera la estabilidad de
la señal. Esta lectura se realiza mediante un lector de placas “Plate ChameleonTM 425-
104 Multilabel Counter” de Hidex. Los valores de luminiscencia son referenciados
respecto a las muestras sin tratar, obteniendo de esta forma un tanto por ciento que
corresponde a la viabilidad.
En todos los ensayos realizados se ha introducido la menor cantidad de DMSO posible

en los cultivos celulares, oscilando ésta entre un 0,05 y un 0,2%. Se ha comprobado
que la incorporación de DMSO al medio celular no tiene ningún efecto tóxico para las
células hasta una concentración superior al 1%, proporción que resulta dependiente de
la línea celular utilizada. Para corroborar la ausencia de toxicidad de la matriz, se
realizó un control donde se añadió al cultivo celular 1 µl de una disolución de DMSO
(0,1% v/v) con una concentración de HCl 10 µM, resultando inocua para las células
incubadas durante las 48 horas de realización de los ensayos de toxicidad.
87
2.7.3 Ensayos de IC50
A partir de las disoluciones madre obtenidas para realizar los tests de viabilidad se han
realizado diluciones en DMSO para obtener disoluciones con concentración 10 mM, 2
mM, 0,2 mM y 0,02 mM.
A partir de estas disoluciones se han tratado los cultivos celulares (1 ml, 4x105
células/ml) con las cantidades necesarias para obtener hasta diez condiciones
diferentes en un rango de concentraciones comprendido entre 0,01 y 200 µM de la
oligoescuaramida correspondiente.
Después de una incubación durante 48 horas se ha procedido a la determinación de la

viabilidad mediante el kit de cuantificación luminiscente Cell Titer-Glo según el
procedimiento descrito para realizar los tests de viabilidad. El tratamiento de los datos
se ha realizado con el software GraphPad Prism v.5 (GraphPad Software Inc., La Jolla,
CA, USA) utilizando un modelo de inhibición sigmoidal de pendiente variable.
88
2.8 Colección de espectros de RMN de los productos relevantes

1
H-RMN 18 (DMSO-d6)
13
C-RMN 18 (D2O-HCl + DSS •)
89
1
H-RMN 25 (DMSO-d6)
13
90
1
H-RMN 41 (DMSO-d6)
13
91
1
H-RMN 50 (DMSO-d6)
13
C-RMN 50 (DMSO-d6)
1
H-RMN 51 (DMSO-d6)
92
13
93
94
Publicación derivada de este capítulo:
“Cyclosquaramides as Kinase Inhibitors with Anticancer Activity”

Priam Villalonga, Silvia Fernández de Mattos, Guillem Ramis, Antònia Obrador-Hevia,
Angel Sampedro, Carmen Rotger, and Antoni Costa.
ChemMedChem 2007, 7, 1472-1480.
Abstract
We report the synthesis and biological evaluation of a new series of oligosquaramide-based
macrocycles as anticancer agents. Compound 7, considered as representative of this series,
exhibited significant antiproliferative activity against the NCI-60 human tumor cell line panel,
with IC50values ranging from 1 to 10 μM. The
results show that sensitivity to cyclosquaramides
is clearly dependent on cell type, underscoring a
degree of biological selectivity. The observed
antiproliferative effects appear to be related to
deregulation of protein phosphorylation, as
compounds 7 and 8are effective inhibitors of
several important kinases such as ABL1, CDK4,
CHK1, PKC, c-MET, and FGFR, among others. The
corresponding acyclic oligosquaramides and
smaller cyclosquaramides did not show
antitumor activity, suggesting that a macrocyclic
structure with minimal molecular size plays a key
role in the observed antitumor activity.
95
104
CAPÍTULO 3
SONDAS MOLECULARES FLUORESCENTES
106
3. Sondas moleculares fluorescentes
3.1 Introducción
La elucidación de los diferentes procesos metabólicos y cambios estructurales que
tienen lugar en las células ha sido objeto de investigación durante las últimas décadas.
El conocimiento que aportan estos estudios permite, por ejemplo, el diseño de
fármacos más específicos o la detección de desórdenes en el metabolismo.
Para llevar a cabo este tipo de estudios es necesario la localización espacial de

determinados compuestos como pueden ser metabolitos, iones, proteínas o
secuencias de nucleótidos. No menos importante es su cuantificación, estudio de su
transporte o su evolución a lo largo del tiempo. Para ello, se recurre al uso de los
llamados marcadores celulares o sondas. Generalmente, se trata de compuestos
capaces de unirse de forma específica covalentemente o mediante interacciones
supramoleculares a los compuestos objetivo y de emitir una señal para su detección,
cuantificación y seguimiento. Dicha señal puede seguirse mediante diferentes técnicas
instrumentales como la microscopía de fluorescencia o la autoradiografía,
dependiendo del tipo de marcadores utilizados. En general podemos agrupar los
marcadores más utilizados en dos categorías: luminiscentes y radioactivos.
3.2 Marcadores celulares

Los marcadores radioactivos se basan en el uso de radioisótopos como el 3H (tritio)56 o
el 32P. Esta técnica, desarrollada en la década de 1930 y que le valió el premio Nobel de
Química a George de Hevesy en 1943, proporciona métodos robustos y reproducibles
en aplicaciones que requieren mucha sensibilidad y/o resolución. La técnica aplicada a
los estudios biológicos consiste primero en el dopaje con los marcadores radioactivos,
como pueden ser el nucleósido 3H-timidina o nucleótidos marcados con 32P en el caso
de marcadores de ADN/ARN. Posteriormente a su administración, las sondas se
incorporan al metabolismo de la célula, pudiendo realizar una exposición de la señal
sobre un film sensible a la señal radioactiva o bien sobre pantallas de fósforo,
obteniendo la distribución del marcador en la célula. Sin embargo, a pesar de sus
ventajas, su aplicación se está limitando, debido principalmente a las medidas de
seguridad y el coste necesarios para su manipulación, así como para el deshecho de los
residuos. Otro inconveniente a tener en cuenta es el breve tiempo de vida media de
estos marcajes.57
El segundo tipo de marcadores son los luminiscentes. La luminiscencia se consigue

mediante la excitación electrónica a un estado excitado de un compuesto y su
posterior relajación al estado fundamental, liberando en este proceso fotones. Se
56
Koehler, J. K.; Mühlethaler, K.; Freywyssling, A.; An Improved Technique for Producing Thin Films and
3
Its Application to H-Thymidine-Labeled Maize Nuclei. J. Cell Biol., 1963, 16, 73-80.
57
Osborn, J.; A review of radioactive and non-radioactive-based techniques used in life science
applications – Part I: Blotting techniques. Life Science News, 2000, 6, Amersham Biosciences, 1-4.
107
puede subclasificar la luminiscencia en función de la naturaleza de la energía que

provoca la excitación, como la quimioluminiscencia58 o la fotoluminiscencia entre
muchas otras opciones.
La quimioluminiscencia consiste en una emisión de fotones generados a partir de una

reacción química, donde uno de los productos se obtiene en un estado excitado que al
relajarse provoca la emisión. Su principal ventaja es que presenta una muy buena
sensibilidad. Habitualmente requiere de un catalizador o activador, dando una
respuesta muy rápida y breve en el tiempo. Estas características hacen que la técnica
sea muy adecuada para aplicaciones rápidas que requieren una alta sensibilidad, como
por ejemplo los ensayos de viabilidad llevados a cabo en el capítulo anterior. Sin
embargo, son totalmente desaconsejadas para aquellas donde se requiere
precisamente que la respuesta sea estable en el tiempo, como por ejemplo la
microscopía.59
La fotoluminiscencia engloba aquellos procesos por los cuales la emisión de fotones se

genera a partir de una excitación anterior, provocada también por fotones, pudiendo
diferenciar la fluorescencia y la fosforescencia en función de la duración de la emisión.
De estas, la técnica fotoluminiscente que más está evolucionando en los últimos años
para el marcaje en sistemas biológicos es la fluorescencia. El mayor avance en este
campo ha sido, principalmente, la mejora en la calidad de la instrumentación, con más
resolución espacial y mayor capacidad de manipulación y análisis.60 Un ejemplo de este
hecho es la concesión del premio Nobel de Química en el año 2014 a los investigadores
E. Betzig, S. W. Hell y W. E. Moerner, por sus avances en el campo de la microscopía de
fluorescencia. Esto ha permitido desarrollar aplicaciones como la detección de la
interacción entre proteínas, acumulación de metabolitos específicos en determinados
órganos o la localización espacial de diferentes orgánulos celulares mediante
anticuerpos específicos.57,61 Además, nuevos procesos sintéticos, así como el uso de
nuevos núcleos fluorescentes, permiten la modulación de las propiedades
espectroscópicas de éstos para adaptarse a las condiciones particulares de cada
aplicación.62
Un último tipo de marcadores, aunque menos utilizados, son las sondas colorimétricas.
Éstas acostumbran a aprovechar determinadas cualidades de las células para provocar
cambios en el espectro de absorción de las sustancias, permitiendo cuantificar la
58
CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay – Technical Bulletin. Promega Corporation.
59
Dodeigne, C.; Thunus, L.; Lejeune, R.; Chemiluminiscence as diagnostic tool. A review. Talanta, 2000,
51, 415-439.
60
Lukinavičius G.; Johnsson, K.; Fluorescence microscopy: Strategic blinking. Nature Chem., 2014, 6, 663-
664.
61
Loudet, A.; Burgess, K.; BODIPY Dyes and Their Derivatives: Syntheses and Spectroscopic Properties.
Chem. Rev., 2007, 107, 4891-4932.
62
Lavis, L. D.; Raines, R. T.; Bright Ideas for Chemical Biology. ACS Chem. Biol., 2008, 3, 142-155.
108
sustancia que provoca la señal. Un ejemplo de este tipo de sondas es la publicada por
W. Lu y colaboradores (Fig. 44).63
Figura 44 – Representación gráfica de las nanopartículas funcionalizadas con anticuerpos específicos. La

63
interacción resultante provoca un cambio en la coloración de la disolución de violeta a azulado.
En este caso nanopartículas funcionalizadas con anticuerpos sobreexpresados en una

línea tumoral específica permite detectar un cambio de intensidad del color al
interaccionar la nanopartícula con el receptor de membrana.
Esquema 34 – Funcionamiento del kit de ensayo de proteínas BCA, mediante la adición de una
2+ 64
disolución básica de Cu y ácido bicinconínico.
Otra alternativa a este tipo de ensayos colorimétricos es la que proporciona el kit de

ensayo de proteínas BCA (Ácido Bicinconínico) (Esquema 34).64 En este caso una
disolución básica de Cu2+ es internalizada en la célula formándose un complejo entre el
Cu2+ y las proteínas, seguido de una reducción de este Cu2+ a Cu+ por parte de
determinados residuos de aminoácidos como cisteína, cistina, triptófano o tirosina. En
estas condiciones el BCA forma un complejo de color morado con el Cu +, pudiendo
detectar mediante colorimetría la cantidad de proteína presente en función de la
intensidad de la señal.
Los ejemplos mencionados permiten detectar y, en ocasiones, cuantificar una

determinada variable, células tumorales en un caso o proteína total en el segundo, sin
embargo esta técnica no permite obtener una distribución espacial del analito
marcado en la célula, por lo que no se pueden catalogar como sondas.
63
Lu, W.; Arumugam, S. R.; Senapati, D.; Singh, A. K.; Arbneshi, T.; Afrin, S.; Yu, K. H.; Ray, P. C.;
Multifunctional Oval Shape Gold Nanoparticle Based Selective Detection of Breast Cancer Cells Using
Simple Colorimetric and Highly Sensitive Two-Photon Scattering Assay. ACS Nano, 2010, 4, 1739-1749.
64
B9643 Technical Bulletin. Sigma-Aldrich. St. Louis, MO, USA.
109
3.3 Fluorescencia
Como se ha comentado anteriormente, la fluorescencia consiste en una emisión de
fotones, del orden de milisegundos, provenientes de la energía desprendida por la
transición de electrones de un estado excitado a un estado fundamental, consiguiendo
este estado excitado mediante la absorción de fotones.
Desde un punto de vista electrónico la fluorescencia se representan en un diagrama de

Jablonski (Fig. 45).
Figura 45 – Diagrama de Jablonski donde se representan las principales transiciones energéticas que dan
lugar a la fluorescencia y fosforescencia.
Partiendo del estado fundamental singlete S0, y mediante la absorción de energía

electromagnética, un electrón es excitado a un estado energético singlete, S1.
En casos favorables, el espín del electrón excitado es de sentido contrario al situado en

el orbital S0. De este modo, la relajación del electrón se puede producir en cuestión de
nanosegundos, liberando en este proceso un fotón de longitud de onda de energía
igual a la diferencia energética entre ambos orbitales.
Un proceso relacionado con la fluorescencia es el proceso de fosforescencia.

Comparten el principio físico y en muchas ocasiones coexisten. En este caso, el
electrón excitado en S1 sufre un proceso de conversión interna a un estado triplete T1,
con la misma orientación de espín que S0. De esta forma la relajación rápida no está
permitida, dando lugar a un proceso lento, que abarca desde milisegundos a varios
segundos de duración, y liberando igualmente fotones en este proceso, de una
longitud de onda aún menor que en el caso de la fluorescencia.
Como se puede observar en el diagrama anterior, la energía del proceso de excitación

será mayor o en su caso extremo igual, a la del proceso de relajación, lo que se traduce
110
en una longitud de onda mayor para la emisión. Esta diferencia energética es lo que
define el desplazamiento de Stokes, característico de cada fluoróforo y
correspondiente a la diferencia entre los máximos de las bandas de absorción y
emisión.
Existen procesos competitivos que pueden disminuir la población del nivel excitado,
tales como “quenching”,65 el efecto FRET (Förster Resonance Energy Transfer), o la
fosforescencia sin ir más lejos, los cuales disminuyen o inhiben totalmente la
fluorescencia.
3.3.1 Quenching
El término “quenching” define cualquier proceso que disminuye la intensidad de

fluorescencia de una muestra. Se pueden diferenciar entre procesos dinámicos y
estáticos (Fig. 46).
Figura 46 – Representación esquemática de los procesos de “quenching”dinámico y ecuación de Stem-

Volmer (arriba) y “quenching” estático (abajo).
Los procesos dinámicos corresponden al “quenching” por colisión. Esto ocurre cuando
un fluoróforo excitado colisiona contra un átomo o molécula que puede facilitar la
transición al estado fundamental de una forma no radiante. Este efecto es
proporcional a la concentración de “quencher” según la ecuación de Stem-Volmer, que
relaciona el cociente entre la intensidad de fluorescencia en presencia (I) o ausencia
(I0) de “quencher”, el tiempo de vida de la emisión (τ0), y el coeficiente de actividad (kq)
65
El término quenching, de origen inglés, se puede traducir al español como extinción o apagamiento.
Sin embargo, con el fin de preservar el significado que ya tiene esta palabra en nuestro idioma y evitar
confusión, se usará en su forma inglesa.
111
y concentración ([Q]) del “quencher”. Algunos ejemplos de sustancias que pueden

provocar este efecto son el oxígeno (O2), el ion yoduro (I-) o la acrilamida.
Cuando en lugar de una colisión se establece un complejo entre dos moléculas en el

cual el estado fundamental no es fluorescente se está hablando de “quenching”
estático. La magnitud del efecto responde a la constante de asociación del complejo y
lo que se produce es una disminución en el número de moléculas disponibles para el
proceso de fluorescencia.
Además de estos procesos, existen otros factores que pueden derivar en un

“quenching” aparente, denominados efectos de filtro interno y esquematizados en las
figuras 47 y 48. 66
Figura 47 - Efectos de filtro interno debidos a la concentración de la muestra.
Los efectos de filtro interno pueden deberse a la concentración de forma que a medida
que la radiación de excitación (señalada en rojo en la figura anterior) atraviesa una
muestra concentrada, ésta va perdiendo intensidad debido a la absorción del propio
fluoróforo, observándose una menor emisión en el punto más alejado de la fuente. Al
utilizar disoluciones diluidas, esta disminución de la fluorescencia en función de la
distancia a la fuente es mucho menor, observándose una respuesta prácticamente
lineal.
Figura 48 – Representación del efecto que produce un desplazamiento de Stokes muy pequeño.
66
Parker, C. A.; Rees, W. T.; Correction of fluorescence spectra and measurement of fluorescence
quantum efficiency. Analyst, 1960, 85, 587-600.
112
Cuando se utilizan fluoróforos con un desplazamiento de Stokes muy pequeño puede

darse otro efecto de filtro interno. En este caso, como se muestra en la figura 48, la
excitación de la muestra a una longitud de onda 1 (rojo), y que se corresponde con el
máximo de absorción, provoca la emisión de fotones con la particularidad de que en la
banda de emisión está incluida la longitud de onda de excitación 1, debido al
solapamiento de las bandas de excitación y emisión (zona rayada del espectro). En este
caso la respuesta observada es, en la mayoría de los casos, menor a la esperada. Sin
embargo, al excitar a una longitud de onda de excitación 2, de mayor energía que 1, y
fuera de la zona de solapamiento, los fotones emitidos no corresponden a esta
longitud de onda de excitación, provocando la señal esperada.
Los procesos de “quenching” implican una reducción de la intensidad de fluorescencia

observada, sin embargo este efecto puede ser beneficioso. Las aplicaciones que ha
tenido el proceso de transferencia de energía por resonancia de Förster, FRET (Förster
Resonance Energy Transfer), es un ejemplo de ello (Fig. 49), permitiendo el estudio de
interacciones supramoleculares temporal y espacialmente mediante el uso de un
fluoróforo y un “quencher” estático o bien de dos fluoróforos.67, 68, 69
Figura 49 – Proceso FRET entre dos fluoróforos diferentes.
En el caso del proceso FRET entre dos fluoróforos, existe una transferencia de energía
del estado excitado del fluoróforo 1 al fluoróforo 2, al coincidir la energía de la emisión
del fluoróforo 1 con la de absorción del fluoróforo 2, provocando por tanto una
emisión de este segundo fluoróforo. Este efecto depende en gran medida de la
distancia entre los fluoróforos, que debe ser entre 2 y 9 nanómetros, por lo que deben
estar unidos covalentemente o interaccionando con un mismo sustrato.
Un último tipo de “quenching” es la transferencia electrónica fotoinducida, PET (de sus

siglas en inglés, Photoinduced Electron Transfer). En este proceso existe una
67
Lakowicz, J. R.; Principles of Fluorescence Spectroscopy. Second Edition. Kluwer Academic/Plenum
Publishers, 1999.
68
Berney, C.; Danuser, G.; FRET or No FRET: A Quantitative Comparison. Biophys. J., 2003, 84, 3992-
4010.
69
Hildebrandt, L. L.; Preus, S.; Zhang, Z.; Voigt, N. V.; Gothelf, K. V.; Birkedal, V.; Single Molecule FRET
Analysis of the 11 Discrete Steps of a DNA Actuator. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136, 8957-8962.
113
transferencia de electrones de un donador a un aceptor, afectando a los niveles

energéticos encargados de la fluorescencia. Este efecto es sensible a la distancia y es el
que se puede observar en las escuaramidas. El anillo escuaramídico se comporta como
donador, sobrepoblando los niveles energéticos del fluoróforo.70
3.3.2 Rendimiento cuántico
Un parámetro importante de la fluorescencia es la efectividad del proceso, lo que se

denomina rendimiento cuántico. Se representa por la letra griega phi mayúscula (Φ) y
se define como la proporción entre el número de moléculas que emiten un fotón
después de ser excitadas directamente por la fuente.71
Este parámetro, característico de cada fluoróforo en unas condiciones determinadas,

puede utilizarse para la determinación de la sensibilidad de métodos de análisis
fluorimétricos o la determinación de la pureza de una muestra entre otras
aplicaciones.71 Actualmente, el rendimiento cuántico se usa como una medida de la
eficiencia de procesos luminiscentes, bien sea en sondas fluorescentes, láseres, 72
células fotovoltaicas73 o puntos cuánticos.74
El rendimiento cuántico abarca valores entre 0 y 1, asignándose el valor 0 cuando no

se observa fluorescencia y 1 cuando cada fotón absorbido por una molécula se
convierte en otro fotón.
El cálculo de este valor no es algo trivial y debido a las limitaciones técnicas de la

instrumentación común, tales como la ausencia de una señal de referencia constante,
se suele recurrir al cálculo mediante comparación con otra sustancia de rendimiento
cuántico conocido, llamada estándar (Fig. 50).66
70
Prohens, R.; Martorell, G.; Ballester, P.; Costa, A.; A squaramide fluorescent ensemble for monitoring
sulfate in wáter. Chem. Commun., 2001, 1456-1457.
71
Demas, J. N., Crosby, G. A.; The measurement of Photoluminiscence Quantum Yields. A review. J.
Phys. Chem., 1971, 75, 991-1024.
72
Kumari, S.; Sahare, P. D.; Photoluminiscence studies of stilbene laser dye incorporated mesoporous
silica nanoparticle (MSN) with sulphur dioxide. J. Porous Mater., 2014, 21, 45-52.
73
Park, S. H.; Roy, A.; Beaupré, S.; Cho, S.; Coates, N.; Moon, J. S.; Moses, D.; Leclerc, M.; Lee, K.; Heeger,
A. J.; Bulk heterojunction solar cells with internal quantum efficiency approaching 100%. Nature
Photonics, 2009, 3, 297-302.
74
Michalet, X.; Pinaud, F. F.; Bentolila, L. A.; Tsay, J. M.; Doose, S.; Li, J. J.; Sundaresan, G.; Wu, A. M.;
Gambhir, S. S.; Weiss, S.; Quantum Dots for Live Cells, in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science, 2005,
307, 538-544.
114
Figura 50 - Obtención del rendimiento cuántico por comparación con un estándar de valor conocido.
Para ello, el estándar, con un rendimiento cuántico conocido en unas condiciones

determinadas, y la muestra, se excitan a una longitud de onda determinada,
obteniendo los espectros de emisión. Al relacionar la energía absorbida por ambas
sustancias y la energía emitida se puede obtener el rendimiento cuántico de la
muestra.
El proceso de fluorescencia depende en gran medida de variables como el disolvente,

la concentración o la temperatura, además de la longitud de onda de excitación, por
tanto, para definir correctamente un rendimiento cuántico, esta información adicional
debe estar indicada para poder caracterizar la sustancia.
3.3.3 Ventajas y aplicaciones de la fluorescencia en sistemas biológicos
Al haber descartado las técnicas radiológicas por motivos de coste y seguridad, se

puede plantear la comparación entre la fluorescencia y la absorción de luz. La principal
ventaja que presenta la primera sobre la segunda radica en la propia técnica. Mientras
que la espectrometría de absorción mide la disminución en la intensidad de un haz de
luz respecto a una referencia, la fluorescencia detecta la luz respecto a un fondo
ausente de ésta, consiguiendo de esta forma un aumento notable en el límite de
detección, pudiendo llegar en condiciones favorables de fluorescencia a
concentraciones entre 10-8 y 10-10 M.67
La cuantificación de la fluorescencia se debe realizar mediante la realización de rectas

de calibrado ya que al contrario que la absorbancia, el valor absoluto obtenido
depende únicamente del instrumento y de la lámpara utilizadas. De este modo, no se
pueden fijar unos valores de fluorescencia específicos para una determinada sustancia
a una concentración dada, haciendo necesario el término de rendimiento cuántico
explicado anteriormente.
La fluorescencia ha ido ganando importancia en aplicaciones clínicas, biológicas o

ambientales gracias a su capacidad para aportar protocolos rápidos y de bajo coste.
Gracias a la fluorescencia, en la segunda mitad de la década de los 80 se desarrollaron
115
aplicaciones tan importantes en la biología como la secuenciación de ADN,75 el marcaje

de geles de electroforesis o inmunoensayos fluorescentes, también denominada
inmunofluorescencia.76
La combinación de técnicas de señalización específicas en sistemas biológicos y el

aumento de sensibilidad que se puede conseguir con la fluorescencia, han impulsado
el uso de técnicas como la microscopía confocal de fluorescencia. Esta técnica óptica
es apropiada para incrementar la nitidez y contraste de una micrografía mediante el
uso de un sistema de lentes y filtros que elimina de la imagen proyectada la zona fuera
de foco. Si bien la técnica no es aplicable únicamente a fluorescencia, es con ésta con
quien ha obtenido su mayor aplicación en el ámbito de la investigación.77
3.4 Sondas moleculares fluorescentes

El término sonda fluorescente se refiere a una molécula que absorbe luz de una
longitud de onda específica y que emite luz, típicamente a mayor longitud de onda, y
que se utiliza para estudiar muestras biológicas. Los fluoróforos pueden enlazarse o
conjugarse a otra molécula o resto molecular no fluorescente cuya misión es la de
dirigir al fluoróforo hacia su destino en el caso de sondas biológicas, o bien la
encargada del reconocimiento en el caso de sondas puramente analíticas.
Las sondas fluorescentes se pueden clasificar en función del núcleo fluorescente que
contienen.
3.4.1 Clasificación de fluoróforos
Desde el punto de vista bioquímico, se puede establecer una primera clasificación

general en fluoróforos intrínsecos y extrínsecos.
Los fluoróforos intrínsecos son aquellos que se encuentran naturalmente en los

sistemas vivos, tales como cadenas laterales de aminoácidos (por ejemplo triptófano o
fenilalanina), cofactores enzimáticos (flavinas o NADH), o las clorofilas entre otros (Fig.
51).
75
Smith, L. M.; Sanders, J. Z.; Kaiser, R. J.; Hughes, P.; Dodd, C.; Connell, C. R.; Heiner, C.; Kent, S. B. H.;
Hood, L. E.; Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature, 1986, 321, 674-679.
76
Hicks, J. M.; Fluorescence immunoassay. Hum. Pathol., 1984, 15, 112-116.
77
Boyde, A.; Bibliography on Confocal Microscopy and Its Applications. Scanning, 1994, 16, 33-56.
116
Figura 51 - Fluoróforos intrínsecos.
Los residuos de los aminoácidos de triptófano y tirosina son los principales

responsables de la fluorescencia en las proteínas. Sin embargo, ésta se ve disminuida
debido a la interacción con otras cadenas peptídicas. En cuanto a sus aplicaciones, la
fluorescencia del triptófano se ha utilizado para identificar cambios conformacionales
en proteínas78 o la interacción con ligandos debido a la dependencia de ésta en
función del medio en el que se encuentra.79
El grupo de fluoróforos con más interés químico es el de los fluoróforos extrínsecos,

aquellos que no están presentes de forma natural en los organismos, tales como
fluoresceínas o BODIPYs entre otros. Estos permiten estudiar procesos o estructuras
que no presentan fluorescencia intrínseca, como lípidos, o bien aquellos en los cuales
la fluorescencia intrínseca no es adecuada, como el ADN, con un rendimiento cuántico
extremadamente bajo.80
La elección del núcleo fluorescente depende de las propiedades que se quieran

observar, como por ejemplo la variación del pH, la longitud de onda de excitación-
emisión, o las posibilidades de derivatización.
Para dar una idea de la diversidad existente en este aspecto, Molecular Probes ofrece
un amplio catálogo con más de 3000 referencias de marcaje celular, donde se alternan
tanto los fluoróforos como las diferentes estrategias de marcaje específicas para
grupos funcionales, moléculas, proteínas u orgánulos celulares entre otros.81
78
Hansen, S. B.; Radic, Z.; Talley, T. T.; Molles, B. E.; Deerinck, T.; Tsigelny, I.; Taylor, P.; Tryptophan
Fluorescence Reveals Conformational Changes in the Acetylcholine Binding Protein. J. Biol. Chem., 2002,
277, 41299-41302.
79
Bian, Q.; Liu, J.; Tian, J.; Hu, Z.; Binding of genistein to human serum albumin demonstrated using
tryptophan fluorescence quenching. Int. J. Biol. Macromol., 2004, 35, 333-337.
80
Markovitsi, D.; Gustavsson, T.; Talbot, F.; Excited states and energy transfer among DNA bases in
double helices. Photochem. Photobiol. Sci., 2007, 6, 717-724.
81
Johnson, I.; Spence, M. T. Z.; The Molecular Probes® Handbook – A Guide to Fluorescent Probes and
th
Labeling Technologies. 11 Ed. Molecular Probes Inc., Eugene, OR. 2010.
117
3.4.2 Derivatización de fluoróforos
Un fluoróforo requiere de ciertos grupos funcionales que le permitan unirse

covalentemente a la molécula que se desea marcar de forma fluorescente. Por ello es
necesario obtener derivados funcionalizados de los núcleos fluorescentes. Este
proceso se denomina derivatización. La derivatización también permite modular sus
propiedades para hacerlo más adecuado a la aplicación deseada. A continuación se
describen, a modo de ejemplo, dos fluoróforos muy comunes y diferentes estrategias
que se han seguido para obtener derivados.
3.4.2.1 Fluoresceína
El grupo de las fluoresceínas abarca multitud de compuestos que se caracterizan por

poseer una estructura tipo xanteno, sustituida en las posiciones 3’ y 6’ por dos
alcoholes y en la posición 9’ por un grupo fenilo sustituido a su vez en la posición 3 por
un ácido carboxílico capaz de formar una lactona con la posición 9’ del xanteno. La
fluoresceína presenta tres pKa, 2,08, 4,31 y 6,43, que corresponden a cuatro estados
de ionización diferentes, desde la forma dianiónica a la forma catiónica en función del
pH del medio. El estado de ionización más importante desde el punto de vista
fotoquímico es una estructura doblemente aniónica responsable de la fluorescencia
característica (Esquema 35). En este estado, en medio NaOH 0,1 M, el coeficiente de
extinción molar (ε) a 492 nm es de 76900 M-1cm-1, y el rendimiento cuántico de 0,93.82
Esquema 35 - Equilibrios ácido-base de la fluoresceína en función del pH y numeración de su estructura.
La fluoresceína presenta un máximo de absorción a 492 nm y su rendimiento cuántico

es próximo a 1 a pH superiores a 8. El máximo de emisión se sitúa en los 517 nm y
dado que el máximo de excitación/absorción está a 492 nm, el desplazamiento de
Stokes es de 25 nm.
82
Sjöback, R.; Nygren, J.; Kubista, M.; Absorption and fluorescence properties of fluorescein.
Spectrochim Acta A, 1995, 51, 7-21.
118
A pesar de sus cualidades fluorescentes la fluoresceína, presenta tres inconvenientes.

(1) Experimenta una fotodegradación muy acusada; (2) es un fluoróforo cuyas
propiedades espectroscópicas dependen del pH de la disolución. Con un pKa de 6,4, a
pH fisiológico existe una gran proporción de fluoresceína que se encuentra en su forma
monoaniónica, con una fluorescencia mucho menor (Φ = 0,37), restando sensibilidad a
los ensayos. Por último (3), la conjugación del fluoróforo con proteínas conlleva un
“quenching” notable respecto al fluoróforo libre, que se incrementa a medida que la
relación proteína-fluoróforo aumenta.83
A pesar de los inconvenientes mencionados, algunos derivados de la fluoresceína

siguen siendo muy usados como reactivos de derivatización en citología e
inmunofluorescencia. Desde un punto de vista químico la fluoresceína es
particularmente apropiada para formar conjugados con péptidos, proteínas,
nucleótidos, oligonucleótidos, drogas, hormonas, lípidos, y otras biomoléculas.84,81
Las modificaciones más habituales que se suelen realizar en el anillo de fluoresceína se

introducen ya en los reactivos previos a la obtención del anillo de xanteno. De esta
forma, se obtienen principalmente derivados sustituidos en las posiciones 2’, 7’, 5 y 6.
Las sustituciones en el anillo de xanteno acostumbran a modificar las propiedades
espectroscópicas (Fig. 52), mientras que las realizadas en el anillo de benceno suelen
deberse a fines de derivatización, usualmente obteniendo en esas posiciones un grupo
carboxílico o su versión activada en forma de éster de succinimida, lo que da lugar a la
5(6)-carboxifluoresceína, o un residuo de isotiocianato, lo que generará la
correspondiente tiourea al reaccionar con aminas libres.
Figura 52 – Izquierda: BCECF. La longitud de onda de emisión de este fluoróforo depende del pH de la
disolución, sin disminuir notablemente la fluorescencia en medios ácidos. La comparación con patrones
externos permite obtener un valor de pH en función de su espectro de emisión. Derecha: Oregon Green
488. Presenta un pKa de 4,8 para el grupo fenólico, lo que hace su fluorescencia insensible a los cambios
de pH fisiológicos habituales. Presenta una gran resistencia a la fotodegradación.
En la bibliografía se pueden encontrar multitud de ejemplos del uso de sondas

moleculares con núcleos de fluoresceína y sus derivados para muy diversas
aplicaciones.84
83
Sun, W. C.; Gee, K. R.; Klaubert, D. H.; Haugland, R. P.; Synthesis of Fluorinated Fluoresceins. J. Org.
Chem., 1997, 62, 6469-6475.
84 th
Haugland, R. P.; Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. 6 Ed. Molecular Probes
Inc., Eugene, OR. 1996.
119
El primer ejemplo que se detalla es la monitorización de la dinámica del calcio

citoplasmático.85 Para ello un derivado de la fluoresceína, en concreto el fluoróforo 2-
metil TokyoMagenta, se conjuga con un quelante específico de Ca 2+, BAPTA,
obteniendo un conjugado fluorescente en presencia de Ca2+, con una ratio de
activación de 16:1. Esta sonda se ha utilizado para obtener un mapa del citoplasma
celular donde queda reflejada la concentración de Ca2+ en función de la intensidad de
fluorescencia (Fig. 53).
85
Figura 53 – Estructura de la sonda de Ca2+ obtenida por T. Egawa y colaboradores.
Otro ejemplo de aplicación de sondas fluorescentes en sistemas biológicos con núcleos

de fluoresceína es el presentado por Nishijima y colaboradores al estudiar la
permeabilización celular de poliamidas en función de su tamaño.86 En este caso, a
partir de la FITC (fluoresceína 5-isotiocianato), mediante el acoplamiento del grupo
isotiocianato con un grupo amino de la poliamida se obtiene el polímero marcado. La
intensidad de la fluorescencia intracelular medida mediante citometría de flujo
permite valorar la efectividad de la internalización (Fig. 54).
86
Figura 54 – Estructura modelo de las poliaminas utilizadas por S. Nishijima y colaboradores. X: CH, NH.
85
Egawa, T.; Hirabayashi, K.; Koide, Y.; Kobayashi, C.; Takahashi, N.; Mineno, T.; Terai, T.; Ueno, T.;
Komatsu, T.; Ikegaya, Y.; Matsuki, N.; Nagano, T.; Hanaoka, K.; Red Fluorescent Probe for Monitoring the
Dynamics of Cytoplasmic Calcium Ions. Angew. Chem. Int. Ed., 2013, 52, 1-5.
86
Nishijima, S.; Shinohara, K.; Bando, T.; Minoshima, M.; Kashiwazaki, G.; Sugiyama, H.; Cell permeability
of Py-Im polyamide-fluorescein conjugates: Influence of molecular size and Py/Im content. Bioorg. Med.
Chem., 2010, 18, 978-983.
120
Por último se presenta un conjugado de fluoresceína y un compuesto antitumoral, la

camptotecina.87 La camptotecina es un fármaco que se enlaza específicamente al
complejo formado por la topoisomerasa I y el ADN, induciendo un proceso apoptótico.
La unión entre el fármaco y el fluoróforo aporta la ventaja de disponer de una sonda
que permite seguir in vivo la localización del fármaco. Al ser éste específico se obtiene
una representación de la distribución del receptor y por tanto de la acción localizada
del fármaco (Fig. 55).
87
Figura 55 – Estructura del conjugado fármaco-fluoróforo obtenido por A. Chevalier y colaboradores.
Cabe destacar en este punto, un grupo de fluoróforos muy habituales derivados de la

estructura de xanteno. Es el caso de las rodaminas, con aminas diferentemente
sustituidas en las posiciones 3’ y 6’. Esta familia de fluoróforos tiene unas propiedades
fotofísicas y una fotoestabilidad excelentes, lo que las hace muy recomendables para
su aplicación en láseres, estándares de fluorescencia, así como cualquier ensayo con
cultivos celulares. A pesar de sus propiedades, el principal inconveniente que
presentan es el alto coste de los isómeros puros, o la necesidad de llevar a cabo
reacciones de derivatización sobre los núcleos más económicos para permitir la
conjugación con otras moléculas, aumentando de esta forma el número de pasos
sintéticos a considerar a la hora de utilizarlos en sondas fluorescentes.88
A modo de ejemplo, la sonda sintetizada por X. Zhang y colaboradores se sirve de dos

fluoróforos, rodamina y BODIPY, para, mediante la excitación a una longitud de onda
fija, provocar un efecto FRET en presencia de Hg2+ en células vivas (Esquema 36).89
87
Chevalier, A.; Dubois, M.; Le Joncour, V.; Dautrey, S.; Lecointre, C.; Romieu, A.; Renard, P. Y.; Castel,
H.; Sabot, C.; Synthesis, Biological Evaluation, and in Vivo Imaging of the first Camptothecin-Fluorescein
Conjugate. Bioconjugate Chem., 2013, 24, 1119-1133.
88
Beija, M.; Afonso, C. A. M.; Martinho, J. M. G.; Synthesis and applications of Rhodamine derivatives as
fluorescent probes. Chem. Soc. Rev., 2009, 38, 2410-2433.
89 2+
Zhang, X.; Xiao, Y.; Qian, X.; A Ratiometric Fluorescent Probe Based on FRET for Imaging Hg Ions in
Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed., 2008, 47, 8025-8029.
121
Esquema 36 – Estructura de la sonda fluorescente rodamina-BODIPY que experimenta una apertura y

2+ 89
reorganización del anillo lactámico en presencia de Hg .
3.4.2.2 BODIPY
Este fluoróforo fue descrito por primera vez en 1968 por Treibs y Kreuzer.90 El nombre
de BODIPY proviene de la abreviación de su nombre común, boro dipirrometeno,
diferente a su nomenclatura IUPAC, 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno.
En cuanto a la numeración empleada en su anillo, según la IUPAC, esta difiere de la del

anillo de dipirrometeno, lo que ha llevado a confusiones. Sin embargo, se pueden
definir las posiciones alfa (3, 5), beta (1, 2, 6, 7) y meso (8) del anillo, equivalentes en
ambas estructuras (Fig. 56).
Figura 56 - Núcleo y nomenclatura del BODIPY.
La síntesis del núcleo sin sustituyentes no fue descrita hasta 2009, curiosamente de
forma simultánea, por tres grupos independientes91, 92, 93 debido a la inestabilidad del
predecesor de dipirrometeno.
90
Treibs, A.; Kreuzer, F. H.; Difluorboryl-Komplexe von Di- und Tripyrrylmethenen. Justus Liebigs Ann.
Chem., 1968, 718, 208-223.
122
Las propiedades generales que presentan los fluoróforos derivados de la estructura de

BODIPY son: elevados coeficientes de extinción molar, bandas de emisión muy
estrechas y con gran intensidad, con una presencia insignificante del proceso de
fosforescencia, lo que se traduce todo junto en rendimientos cuánticos muy elevados.
Los fluoróforos derivados de BODIPY acostumbran a ser insensibles al pH o la polaridad
del medio y son estables en condiciones fisiológicas, sin embargo presentan una
limitada solubilidad en medios acuosos. Por el contrario son perfectamente solubles en
la mayoría de disolventes orgánicos. La modulación de su fluorescencia se logra
mediante funcionalización de los sustituyentes de las posiciones alfa y beta
preferentemente, obteniendo una banda de emisión en el visible entre 500 y 700 nm
con una gran fotoestabilidad y resistencia a la autoagregación.61,94
Todos estos factores han popularizado el uso de este núcleo fluorescente en los
últimos quince años en aplicaciones tan diversas como marcadores biológicos,84
dispositivos electroluminiscentes,95 láseres,96 interruptores fluorescentes,97 sensores,98
células fotovoltaicas,99 y un largo etcétera.
La síntesis del fluoróforo se suele realizar a partir de anillos pirrólicos con la sustitución
deseada. Además también es posible derivatizarlos posteriormente en posiciones
específicas, especialmente las posiciones 2 y 6 mediante sustitución electrofílica.
Este tipo de sustituciones permiten modular las frecuencias de emisión de modo que
se obtiene una familia de fluoróforos con distintas propiedades y con emisiones que
91
Schmitt, A.; Hinkeldey, B.; Wild, M.; Jung, G.; Synthesis of the Core Compound of the BODIPY Dye
Class: 4,4’-Difluoro-4-bora-(3a,4a)-diaza-s-indacene. J. Fluoresc., 2009 (Published Online 7-Dec-2008),
19, 755-758.
92
Tram, K.; Yan, H.; Jenkins, H. A.; Vassiliev, S.; Bruce, D.; The synthesis and cristal structure of
unsubstituted 4,4.difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY). Dyes pigments, 2009 (Published
Online 10-Mar-2009), 82, 392-395.
93
Arroyo, I. J.; Hu, R.; Merino, G.; Tang, B. Z.; Peña-Cabrera, E.; The smallest and One of the Brightest.
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2009 (Published Online 2-Jul-2009), 74, 5719-5722.
94
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95
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96
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97
Golovkova, T. A.; Kozlov, D. V.; Neckers, D. C.; Synthesis and Properties of Novel Fluorescent Switches.
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98
Niu, L. Y.; Guan, Y. S.; Chen, Y. Z.; Wu, L. Z.; Tung, C. H.; Yang, Q. Z.; BODIPY-Based Ratiometric
Fluorescent Sensor for Highly Selective Detection of Glutathione over Cysteine and Homocysteine. J.
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99
Hayashi, Y.; Obata, N.; Tamaru, M.; Yamaguchi, S.; Matsuo, Y.; Saeki, A.; Seki, S.; Kureishi, Y.; Saito, S.;
Yamaguchi, S.; Shinokubo, H.; Facile Synthesis of Biphenyl-Fused BODIPY and Its Property. Org. Lett.,
2012, 14, 866-869.
123
abarcan desde los 500 a los 700 nm e incluso sondas con frecuencias de emisión en el
infrarrojo cercano (Fig. 57).100
Figura 57 – Colección de estructuras BODIPY sustituidas en diferentes posiciones para modular la

emisión de fluorescencia, y sus espectros de emisión correspondientes.
Una de las variantes más sencillas de obtener y con mejor rendimiento cuántico (0,97,
CH2Cl2) es el 1,3,5,7-tetrametil BODIPY derivado con un metilo en la posición meso.
Este compuesto se sintetiza siguiendo un protocolo rápido y efectivo con un 70% de
rendimiento a partir de la condensación de 2,4-dimetilpirrol y cloruro de acetilo y
posterior coordinación con el complejo de BF3 (Esquema 37 a).101
Sin embargo, es mucho más sencillo derivatizar el núcleo de BODIPY mediante la

introducción de sustituyentes en la posición meso, lo que habilita la síntesis mediante
el uso de aldehídos aromáticos funcionalizados y el uso de catalizadores ácidos. El
inconveniente de esta metodología es la necesidad de utilizar reactivos de oxidación
posteriores a la condensación, lo que provoca una disminución considerable del
100
Ni, Y.; Wu, J.; Far-red and near infrared BODIPY dyes: synthesis and applications for fluorescent pH
probes and bio-imaging. Org. Biomol. Chem., 2014, 12, 3774-3791.
101
Nepomnyashchii, A. B.; Bröring, M.; Ahrens, J.; Bard, A. J.; Synthesis, Photophysical, Electrochemical,
and Electrogenerated Chemiluminescence Studies. Multiple Sequential Electron Transfers in BODIPY
Monomers, Dimers, Trimers, and Polymer. J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, 8633-8645.
124
rendimiento (40%) debido a la formación de productos secundarios (Esquema 37 b).102

Los sustituyentes en la posición meso no modifican en exceso las bandas de absorción-
emisión, pero para aquellos casos en los que se introducen sustituyentes aromáticos sí
que se puede observar una disminución en el rendimiento cuántico. Este efecto, se
reduce al bloquear la rotación libre del anillo aromático introduciendo sustituyentes
voluminosos en las posiciones orto y meta preferentemente, evitando de esta forma la
conjugación de los sistemas pi del fenilo y el BODIPY.
En los métodos de síntesis descritos anteriormente se obtienen núcleos de BODIPY

simétricos en cuanto a la sustitución del anillo pirrólico. Una alternativa para obtener
núcleos asimétricos es la de emplear cetopirroles, para posteriormente realizar una
condensación catalizada por ácidos de Lewis con otros pirroles (Esquema 37 c).103
Esquema 37 – Estrategias de síntesis para núcleos de BODIPY simétricos mediante el uso de cloruros de
acilo (a) y aldehídos aromáticos (b), y para la obtención de núcleos asimétricos mediante el uso de
cetopirroles (c).
A continuación se han seleccionado algunas aplicaciones recientes que utilizan

derivados de BODIPY en el campo de la señalización molecular.
El primer ejemplo consiste en un conjugado con capacidad para detectar la presencia

de dienófilos tensionados en entornos fisiológicos.104 Para ello se ha aprovechado la
102
Li, J. S.; Wang, H.; Cao, L. W.; Zhang, H. S.; 8-Phenyl-(4-oxy-acetic acid N.hydroxysuccinimidyl ester)-
4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene as a new highly fluorescent-derivatizing
reagent for aliphatic amines in disease-related samples with high-performance liquid chromatography.
Talanta, 2006, 69, 1190-1199.
103
Jiao, L.; Yu, C.; Liu, M.; Wu, Y.; Cong, K.; Meng, T.; Wang, Y.; Hao, E.; Synthesis and Functionalization
of Asymmetrical Benzo-Fused BODIPY Dyes. J. Org. Chem., 2010, 75, 6035-6038.
104
Devaraj, N. K.; Hilderbrand, S.; Upadhyay, R.; Mazitschek, R.; Weissleder, R.; Bioorthogonal Turn-On
Probes for Imaging Small Molecules inside Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed., 2010, 49, 2869-2872.
125
capacidad de los derivados de tetrazinas para provocar procesos FRET no radiantes con
el BODIPY. Las tetrazinas reaccionan rápidamente con los dienófilos tensionados
mediante cicloadiciones Diels-Alder modificando la estructura de la tetrazina y de este
modo revirtiendo el proceso FRET. El aumento del rendimiento cuántico del BODIPY
después de la reacción permite señalizar la presencia de estos compuestos en el
interior de las células vivas (Esquema 38).
Esquema 38 – Estructura y funcionamiento de la sonda específica para dienos obtenida por N. K.

104
Devaraj.
En el siguiente ejemplo, un núcleo de BODIPY se conjuga a través de un espaciador a

un sustrato específico de una ß-glucosidasa (GBA1), asociada con diversas
enfermedades, utilizando una metodología tipo “click chemistry”.105 En este caso, la
fluorescencia del BODIPY permanece siempre activa y permite detectar los lugares
donde existe una mayor acumulación/deficiencia de esta enzima (Fig. 58).
105
Figura 58 – Estructura de la sonda específica para GBA1 obtenida por W. W. Kallemeijn.
En un último ejemplo, el núcleo de BODIPY se ha usado para medir el pH intracelular a

pesar de ser un fluoróforo insensible a los cambios de pH.106 En este caso el núcleo de
BODIPY se encuentra conjugado por la posición meso a un calix[4]areno. De esta
forma, el conjugado experimenta una buena permeabilidad celular, buena retención y
105
Kallemeijn, W. W.; Li, K. Y.; Witte, M. D.; Marques, A. R. A.; Aten, J.; Scheij, S.; Jiang, J.; Willems, L. I.;
Voorn-Brouwer, T. M.; van Roomen, C. P. A. A.; Ottenhoff, R.; Boot, R. G.; van der Elst, H.; Walvoort, M.
T. C.; Florea, B. I.; Codée, J. D. C.; van der Marel, G. A.; Aerts, J. M. F. G.; Overkleeft, H. S.; Novel Activity-
Based Probes for Broad-Spectrum Profiling of Retaining ß-Exoglucosidases In Situ and In Vivo. Angew.
Chem. Int. Ed., 2012, 51, 12529-12533.
106
Han, F.; Xu, Y.; Jiang, D.; Qin, Y.; Chen, H.; A BODIPY-derived fluorescent probe for celular pH
measurements. Anal. Biochem., 2013, 435, 106-113.
126
escasa citotoxicidad. El hecho de que sea permeable a la membrana celular permite

una homogénea distribución del compuesto por toda la célula, pudiendo establecer
una relación entre el pH del medio y la fluorescencia observada. Puesto que el núcleo
de BODIPY no responde a los cambios de pH, la desprotonación de los fenoles y
consiguiente deslocalización del par de electrones resultante es la responsable de esta
variación de la fluorescencia, disminuyendo ésta a medida que se incrementa la carga
electrónica sobre el sistema (Esquema 39).
106
Esquema 39 – Estructura y funcionamiento de la sonda sensible al pH diseñada por F. Han.
Ninguna de estas sondas fluorescentes resulta de utilidad si no se internaliza de forma

efectiva en la célula para poder interaccionar con su receptor. Por este motivo
adquiere una vital importancia el hecho del transporte a través de la membrana.
3.5 Transporte trans-membrana

Una de las funciones de la membrana celular es controlar qué sustancias acceden
desde el exterior al interior de la celular y viceversa. Existen diferentes mecanismos de
transporte dependiendo de las características de los compuestos transportados y de la
dirección del transporte.
El transporte pasivo es aquel que no depende de fuentes energéticas externas y

obedece únicamente al gradiente osmótico. Este tipo de transporte se da de tres
modos diferentes. El primero, mediante proteínas que forman canales en la
membrana, estrechos y altamente selectivos para iones como Na+, K+ o Cl-. En segundo
lugar, mediante la difusión a través de la membrana. Esta forma de transporte es
utilizado por moléculas pequeñas y apolares, como el O2 o el CO2, o altamente
hidrofóbicas, como son determinados esteroides. Por último, la difusión facilitada
permite el paso de moléculas polares pequeñas tales como azúcares o aminoácidos
mediante su reconocimiento.107
El transporte activo requiere la intervención de proteínas transportadoras y una fuente

de energía como el ATP. Un ejemplo de transporte activo primario es el que realiza la
bomba de protones. El transporte activo puede ser secundario cuando se cotransporta
107 th
Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter, P.; Molecular Biology of the Cell. 5
Ed. Garland Science. 2007.
127
una molécula a favor del gradiente, generando energía que se aprovecha para
transportar en contra del gradiente otro compuesto.
Mediante transporte activo también se transportan macromoléculas (endocitosis),

fluidos extracelulares (macropinocitosis) o incluso partículas sólidas de mayor tamaño
(fagocitosis). Todos estos procesos se caracterizan por poseer diferentes receptores
que los estimulan, dando lugar a vesículas intracelulares (Fig. 59):108
 Fagocitosis: Especialidad de determinados tipos de células como macrófagos o

neutrófilos.
 Endocitosis mediada por clatrina: Es el tipo más conocido de endocitosis y
depende de la activación de unos receptores de membrana, las clatrinas, que
provocan toda una cascada de eventos que invaginan la membrana hasta
formar la prevesícula, que mediante unas GTPasas específicas, dinaminas,
cierran completamente las vesículas. Éstas maduran en el citosol fundiéndose
con endosomas tardíos y posteriormente, tras el proceso de maduración se
transforman en lisosomas.
 Endocitosis mediante caveola: Se da en localizaciones específicas de la
membrana con alta densidad de colesterol y esfingolípidos. En estos lugares
existe una invaginación preexistente, donde se localizan las caveolinas. El
proceso de formación de la vesícula es similar al explicado en el caso de las
clatrinas. En cuanto a la evolución, actualmente existe un amplio debate al
respecto de si evolucionan hacia lisosomas o no.109, 110
 Macropinocitosis: Se considera un mecanismo por el que se incorpora gran
cantidad de fluido y la activación del proceso se asocia más a señales
secundarias que al propio cuerpo fagocitado.
108
Xiang, S.; Tong, H.; Shi, Q.; Fernandes, J. C.; Jin, T.; Dai, K.; Zhang, X.; Uptake mechanisms of non-viral
gene delivery. J. Control. Release, 2012, 158, 371-378.
109
Bengali, Z.; Rea, J. C.; Shea, L. D.; Gene expression and internalization following vector adsorption to
immobilized proteins: dependence on protein identity and density. J. Gene Med., 2007, 9, 668-678.
110
Kiss, A. L.; Botos, E.; Endocytosis via caveolae: alternative pathway with distinct cellular
compartments to avoid lysosomal degradation?. J. Cell. Mol. Med., 2009, 13, 1228-1237.
128
Figura 59 – Mecanismos de internalización mediante receptores de membrana.
Cuando de administra un compuesto exógeno a un cultivo celular, el primer paso para

actuar sobre su diana es el reconocimiento por parte de los receptores implicados en
conseguir que el fármaco llegue a la diana. Este primer reconocimiento puede darse
extracelularmente o intracelularmente, pudiendo ser este primer reconocimiento el
responsable de su actividad farmacológica (Fig. 60).
129
Figura 60 – Representación esquemática donde se representan los mecanismos de entrada básicos así
como el reconocimiento intracelular (amarillo) o sobre membrana (verde). Otros analitos no pueden
difundir a través de la membrana ni disponen de receptores específicos (rojo).
Tanto el transporte activo como el pasivo han evolucionado durante millones de años
para incorporar a la célula compuestos naturales. Sin embargo, la mayoría de
moléculas bioactivas usados en la actualidad son sintéticos o derivados de productos
naturales que no se internalizan de forma eficaz mediante los mecanismos expuestos.
La modificación de sus propiedades estructurales para facilitar la internalización a
menudo conlleva una disminución del efecto biológico, por lo que se hace necesaria la
planificación de estrategias adicionales para la internalización de los compuestos
manteniendo su actividad.
3.5.1 Internalización selectiva
Para introducir compuestos no naturales en las células se utilizan técnicas invasivas,

como microinyección,111 permeabilización o electroporación.112 Estos métodos sin
embargo conllevan una complicada optimización, además de provocar una reducción
significativa de la viabilidad celular.
Existen alternativas que imitan estrategias de internalización naturales, consiguiendo

de esta forma que estos procesos sean biocompatibles. Un ejemplo es el uso de los
péptidos de penetración celular o CPPs (de sus siglas en inglés, Cell Penetrating
Peptide). Se trata de cadenas peptídicas presentes en ciertas proteínas, habitualmente
factores de transcripción, que se encargan de facilitar el transporte de estos factores
por el interior celular así como entre células.
111
Zhang, Y.; Yu, L. C.; Microinjection as a tool of mechanical delivery. Curr. Opin. Biotechnol., 2008, 19,
506-510.
112
Cadossi, R.; Ronchetti, M.; Cadossi, M.; Locally enhanced chemotherapy by electroporation: clinical
experiences and perspective of use of electrochemotherapy. Future Oncol., 2014, 10, 877-890.
130
El estudio de estos CPPs naturales ha llevado a identificar secuencias de no más de 30

aminoácidos y aprovechar sus propiedades como transportadores moleculares.
Actualmente estas secuencias pueden derivar de secuencias naturales o
completamente artificiales, buscando aumentar la estabilidad y eficiencia del
transportador (Fig. 61).113
Figura 61 – Estructura del CPP Tat, obtenido de la proteína Tat del VIH. Este CPP permite la
internalización de proteínas, péptidos, siRNA, liposomas o nanopartículas. Hay que destacar la
proporción de aminoácidos básicos que presenta respecto a otros aminoácidos.
Los CPPs se han utilizado como vectores de transporte trans-membrana para “cargas”
de diferente tamaño y naturaleza como plásmidos, péptidos, proteínas, liposomas,
nanopartículas, puntos cuánticos, etc., mejorando el transporte transmembrana y el
tráfico interno, facilitando de esta forma las interacciones con objetivo biológico.114
Existen multitud de referencias que asocian la entrada de estos transportadores vía

endocitosis,115 así como otras tantas que indican lo contrario.116
Independientemente del proceso de internalización, su efectividad se ha atribuido a la

presencia de numerosos residuos básicos, principalmente argininas y lisinas. Se piensa
que los grupos guanidinio de las argininas interaccionan electrostáticamente con
grupos negativos presentes en la superficie de la membrana celular, activando de este
modo las rutas de internalización.117, 118 Sin embargo, los CPPs, al tratarse de péptidos
naturales, se degradan fácilmente en medios fiosiológicos.119
113
Heitz, F.; Morris, M. C.; Divita, G.; Twenty years of cell-penetrating peptides: from molecular
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114
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115
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116
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117
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synthesis, and evaluation of molecules that enable of enhance cellular uptake: Peptoid molecular
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131
A pesar de la polémica en torno al método de internalización de los CPPs, es evidente

que existe una activación de determinados mecanismos de internalización mediante
interacción electrostática con oxoaniones de la membrana, tales como fosfatos y
sulfatos, además de enlaces de hidrógeno.
Además de los CPPs existen alternativas que dan lugar a una internalización. Dos de los
agentes de internalización más habituales son la biotina y el ácido fólico, cuyos
receptores están dispuestos sobre la membrana celular, y cuyas aplicaciones se
describen en el siguiente capítulo.
En la bibliografía no existen antecedentes del estudio de la internalización de

escuaramidas a excepción de los realizados con las oligoescuaramidas cíclicas sobre
membranas artificiales, indicando una mayor penetrabilidad del compuesto C5. 120
Los estudios realizados sobre la inhibición de cinasas han demostrado que las
oligoescuaramidas cíclicas presentan una buena internalización.121 En este sentido el
comportamiento de las oligoescuaramidas se asemeja al de los CPPs. Las
oligoescuaramidas cíclicas, al igual que los CPPs, se encuentran parcialmente
protonadas a pH fisiológico (7,4) ya que los valores de pKa para la oligoescuaramida C2
son de 7,9 y 8,6 (Fig. 62).
1
Fracción molar
0
6,25 6,75 7,25 7,75 8,25 8,75 9,25 9,75 10,25
pH
Figura 62 – Equilibrios de protonación de la oligoescuaramida C2 con sus respectivos pKa y especiación
simulada en función del pH.
118
Futaki, S.; Suzuki, T.; Ohashi, W.; Yagami, T.; Tanaka, S.; Ueda, Kunihiro, Sugiura, Y.; Arginine-rich
Peptides: An abundant source of membrane-permeable peptides having potential as carriers for
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119
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120
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121
Villalonga, P.; Fernández de Mattos, S.; Ramis, G.; Obrador-Hevia, A.; Sampedro, A.; Rotger, C.; Costa,
A.; Cyclosquaramides as Kinase Inhibitors with Anticancer Activity. ChemMedChem, 2012, 7, 1472-1480.
132
Debido a esta similitud entre las oligoescuaramidas y los CPPs, junto con los
antecedentes de escuaramidas como receptores de aniones en medio acuoso tales
como sulfato y fosfato,122,123,124 es interesante conocer las interacciones que puede
establecer la oligoescuaramida cíclica con modelos de fosfatos de membrana (Fig. 63).
Figura 63 – Optimización computacional de la interacción entre la oligoescuaramida C2 y un grupo

fosfato. La interacción se produce mediante enlaces de hidrógeno entre los NH escuaramídicos y los
oxígenos del fosfato.
122
Piña, M. N.; Soberats, B.; Rotger, C.; Ballester, P.; Deyà, P. M.; Costa, A.; Selective sensing of
competitive anions by non-selective host: The case of sulfate and phosphate in water. New J. Chem.,
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123
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124
Jin, C.; Zhang, M.; Wu, L.; Guan, Y.; Pan, Y.; Jiang, J.; Lin, C.; Wang, L.; Squaramide-based tripodal
receptors for selective recognition of sulfate anion. Chem. Commun., 2013, 49, 2025-2027.
133
134
3.6 Objetivos
Los resultados obtenidos en el capítulo anterior sobre la actividad antitumoral de los
compuestos oligoescuaramídicos cíclicos y los indicios de un posible reconocimiento
sobre la membrana incitan a profundizar en el estudio de la internalización de estos
compuestos. La fluorescencia ha sido la técnica seleccionada en este capítulo para
realizar los estudios de distribución celular de las oligoescuaramidas, utilizando para
ello un conjugado oligoescuaramida cíclica-fluoróforo. Este conjugado permitirá el
estudio de la permeabilidad celular y el tráfico intracelular de las oligoescuaramidas
mediante microscopía de fluorescencia y microscopía confocal.
Se fijan por tanto los siguientes objetivos para este capítulo:
 Sintetizar y caracterizar un conjugado oligoescuaramida cíclica-fluoróforo,

estable en medio fisiológico.
 Determinar la capacidad de los conjugados oligoescuaramida cíclica-fluoróforo
para atravesar la membrana celular y la evolución que experimentan mediante
microscopía confocal de fluorescencia.
 Estudiar la interacción de las oligoescuaramidas cíclicas con modelos de
fosfatos presentes en la membrana, permitiendo establecer una relación
directa entre un posible reconocimiento y la interacción con compuestos
fosforilados presentes sobre la membrana celular.
135
136

Para la obtención del conjugado oligoescuaramida cíclica-fluoróforo se eligió el
compuesto C2 13. Esta elección se debe, en primer lugar, a la facilidad de síntesis. En
este caso las modificaciones estructurales necesarias para la derivatización del
macrociclo no implican una elongación de los oligómeros, lo que incrementaría los
pasos de síntesis y por tanto un menor rendimiento general. El segundo motivo, más
importante para lograr el objetivo propuesto, es la despreciable citotoxicidad que
presenta esta oligoescuaramida cíclica (Fig. 64).
Figura 64 – Representación esquemática de las unidades que constituyen la sonda fluorescente

oligoescuaramídica diseñada a partir de la oligoescuaramida cíclica C2.
No se puede confirmar que el mecanismo de acción de la oligoescuaramida C2 sea

exactamente el mismo que el que presenta mayor citotoxicidad, C5 16. Sin embargo, la
naturaleza oligomérica de estos compuestos hace prever una gran similitud ya que el
tipo de interacciones supramoleculares que puedan darse son similares. En ambos
casos se trata de interacciones que se originan en los nitrógenos terciarios
parcialmente protonados y en las unidades escuaramídicas vía enlaces de hidrógeno.
3.7.1 Síntesis de las sondas fluorescentes
3.7.1.1 Síntesis de la oligoescuaramida cíclica apta para la conjugación con fluoróforos
Aprovechando la síntesis modular de las oligoescuaramidas se diseñó un módulo con

una cadena adicional. Este nuevo módulo se ha incorporado a la estructura de la
oligoescuaramida C2 obteniendo un macrociclo funcionalizable, común para diferentes
sondas fluorescentes (Esquema 40).
137
Esquema 40 – Síntesis de la oligoescuaramida 54, seleccionada para la preparación de las sondas

fluorescentes.
Tal y como se muestra en el esquema 40, uno de los dos grupos amino de la 1,3-
propildiamina 42 se ha protegido con el grupo terc-butoxicarbonil (Boc). Seguidamente
una doble adición tipo Michael de la diamina monoprotegida sobre el acrilonitrilo 20,
proporciona el intermedio 52 susceptible de ser reducido mediante hidrogenación
catalítica con Ni-Raney en medio básico para obtener la triamina monoprotegida 53.
Esta triamina presenta la distancia adecuada y la misma capacidad de formar enlaces
de hidrógeno que la amina utilizada como espaciador en el capítulo 2 para la síntesis
de oligoescuaramidas cíclicas.
La metodología de síntesis desarrollada aquí resulta más eficaz que la estrategia lógica
de realizar una monoprotección sobre la triamina tris(3-aminopropil)amina. Además
de ser un producto costoso, la monoprotección de esta triamina está descrita en la
bibliografía realizando primero una doble protección con bencilcarbamatos,
monoprotección de la amina restante con el grupo Boc y posterior hidrogenación
catalítica para eliminar los bencilcarbamatos, obteniendo un rendimiento global del
41% (Esquema 41).125 El procedimiento descrito en esta Tesis permite obtener la
triamina monoprotegida 53 con un rendimiento global del 88%, usando además para
ello productos comerciales asequibles.
125
Raymond, K. N.; Xu, J.; Pham, T. A.; Macrocycles, WO2013187971 A3.
138
Esquema 41 – Síntesis propuesta por K. N. Raymond para la obtención de la triamina monoprotegida

125
con el grupo Boc 53.
La oligoescuaramida 54 se obtiene finalmente mediante la condensación del diéster 5

con la diamina 53. Esta nueva oligoescuaramida cíclicas está funcionalizada en uno de
los nitrógenos terciarios con un espaciador y un grupo amino protegido con Boc. La
desprotección de este grupo siguiendo el procedimiento general descrito (HCl/H2O, 50
°C, 4h) permite obtener una amina primaria capaz de reaccionar con diferentes grupos
funcionales, simplificando de este modo la conjugación de la oligoescuaramida con
diferentes fluoróforos.
3.7.1.2 Elección y síntesis de los fluoróforos
Tal y como se ha comentado anteriormente, la sonda fluorescente que se pretende

obtener consiste en una unidad de transporte, en este caso el derivado de la
oligoescuaramida C2, y una unidad de señalización fluorescente. Para la señalización se
ha planteado la utilización de tres fluoróforos diferentes como son: un derivado del
BODIPY, una fluoresceína y el pireno (Fig. 65).
Figura 65 – Estructura de los fluoróforos BODIPY (izquierda), fluoresceína (centro) y pireno (derecha).
Cada uno de estos fluoróforos presenta unas propiedades fotofísicas particulares pero
la principal razón para la elección de esta tríada ha sido su diferente carga eléctrica en
medios acuosos. Así, el BODIPY es zwitteriónico, la fluoresceína aniónica a pH
fisiológico, y el pireno neutro y totalmente apolar. La carga eléctrica del conjunto
139
transportador-fluoróforo es importante por cuanto afecta a su solubilidad en medios

acuosos y modifica su capacidad de penetración celular. Mediante la comparación de
las tres sondas fluorescentes se evaluará la capacidad de transporte de la unidad C2 y
la capacidad de interacción con el entorno.
Las estructuras de los fluoróforos deben presentar un grupo funcional susceptible de

conjugarse con una amina. La fluoresceína en su forma 5-isotiocianato (FITC) 56 es un
reactivo muy habitual para el marcaje de proteínas, ya que reacciona con aminas
primarias para dar tioureas. Para introducir el anillo de pireno se optó por utilizar el
compuesto 1-pirenometilamina 57, sin embargo, al contener éste un grupo amino, se
planteó utilizar una unidad escuaramida a modo de puente entre los dos grupos amino
(Fig. 66).
Figura 66 – Estructura de la fluoresceína-5-isotiocinato (FITC) 56 (izquierda) y propuesta para la

condensación de dos grupos amino mediante una unidad escuaramida (derecha).
En cuanto al BODIPY, se ha obtenido un derivado del 8-fenil-1,3,5,7-tetrametil BODIPY,

descrito en la bibliografía.102 La elección de los sustituyentes del BODIPY se ha
realizado buscando un elevado rendimiento tanto de síntesis como cuántico. Tal y
como se ha descrito en la introducción, el derivado 1,3,5,7-tetrametilo es uno de los
que proporciona un mayor rendimiento de síntesis al bloquear las posiciones del pirrol
susceptibles de dar reacciones secundarias. En cuanto al uso del aldehído aromático,
éste permite la funcionalización previa del anillo aromático, hecho que ayuda a reducir
el número de reacciones posteriores a la obtención del fluoróforo.
Con la finalidad de incrementar la eficacia de la síntesis se han realizado una serie de

modificaciones en el protocolo descrito, consiguiendo incrementar el rendimiento
desde un 21% descrito en la bibliografía hasta un 41% (Esquema 42).
140
Esquema 42 – Síntesis de BODIPY 65 y desprotección del grupo carboxilato para reaccionar

posteriormente con aminas mediante agentes de acoplamiento.
La síntesis comienza con una condensación Williamson entre el p-hidroxibenzaldehido

59 y el bromoacetato de etilo 60 obteniendo el benzaldehído funcionalizado 61 con un
rendimiento del 92%. A continuación la condensación con 2,4-dimetilpirrol 62, en
presencia de TFA como catalizador seguida de oxidación con DDQ conduce al
dipirrometeno pentasustituido 63. Cabe resaltar que antes de iniciar la condensación
del benzaldehído funcionalizado y el 2,4-dimetilpirrol, se añadió una pequeña cantidad
de anhídrido acético al medio de reacción. Esta adición previa elimina cualquier traza
de agua en el medio produciendo ácido acético que, junto con el TFA, actúa como
catalizador ácido. El crudo de reacción resultante se ha disuelto en CH2Cl2 y se ha
filtrado rápidamente sobre Florisil®, un silicato magnésico que permite eliminar gran
parte de los polímeros presentes en el crudo de reacción antes de purificarlo mediante
cromatografía en columna. A continuación, el crudo obtenido se trata con un exceso
de trifluoruro de boro 64, para obtener el derivado BODIPY 65. En cuanto a la
elaboración, se ha comprobado que el rendimiento mejora realizando un lavado del
crudo con agua, y posteriormente un tratamiento con un equivalente de K2CO3 en
MeOH, con lo que se elimina cualquier resto del trifluoruro de boro restante.
Finalmente una cromatografía en columna de sílica y recristalización en CH2Cl2:hexano
permite obtener el núcleo fluorescente de BODIPY 65 en forma de cristales naranjas
con un rendimiento del 41%, que duplica el rendimiento del 21% descrito para este
compuesto.102 El producto obtenido de este modo parece no degradarse con el tiempo
ya que su espectro de RMN permanece invariable durante un período superior a los
dos años almacenado en condiciones anhidras, protegido de la luz y a una temperatura
entre 2 y 8 °C. La hidrólisis básica del éster con K2CO3 en exceso y en MeOH durante 60
141
horas a temperatura ambiente, conduce al correspondiente ácido 66 apto para su

condensación con aminas.
Una vez obtenida la estructura macrocíclica 54, su conjugación con los diferentes
fluoróforos seleccionados para la obtención de las sondas fluorescentes se plantea en
un único paso (Esquema 43).126
Esquema 43 – Obtención de las tres sondas fluorescentes oligoescuaramídicas 69, 70 y 72 a partir de la

oligoescuaramida cíclica ramificada 55.
126
De aquí en adelante se utilizará la nomenclatura C2-X para denominar a las tres sondas fluorescentes
preparadas, donde C2, de acuerdo con lo indicado en el capítulo 2, se refiere a una estructura
oligoescuaramídica cíclica formada por dos unidades escuaramida, y X a las siglas asignadas para
denominar a la unidad fluorescente conjugada, BDP para el 1,3,5,7-tetrametil BODIPY, FITC para la
fluoresceína 5-isotiocianato y Pyr para la 1-pirenometilamina. De esta forma se obtienen los acrónimos
C2-BDP para la sonda 69, C2-FITC para la 70, y C2-Pyr para la 72.
142
3.7.1.3 Síntesis de la sonda fluorescente C2-BDP 69
Para la preparación de C2-BDP 69 es necesario realizar una condensación entre el

grupo amino de la oligoescuaramida 55 y el ácido carboxílico del BODIPY 66 (Esquema
44).
Esquema 44 – Diversas rutas de síntesis utilizadas para la obtención de la sonda fluorescente C2-BDP 69.
Esta reacción se abordó en primer lugar mediante la activación del grupo ácido con N-
hidroxisuccinimida para formar el correspondiente éster activado, utilizando como
agente de acoplamiento DCC en DMF según el procedimiento descrito en la
bibliografía.102 Estas condiciones de síntesis no dieron buenos resultados,
observándose una alta tasa de degradación durante la purificación del producto. Como
alternativa se realizó una condensación entre la triamina diprotegida 67, obtenida
según el procedimiento descrito en la bibliografía,127 y el ácido carboxílico 66, en
condiciones anhidras y utilizando igualmente el agente de acoplamiento DCC. En este
caso el producto deseado 68 se obtuvo con apenas un rendimiento del 7%. A pesar del
bajo rendimiento, se intentaron desproteger los grupos amino para conseguir de este
127
Malabarba, A.; Ciabatti, R.; Kettenring, J.; Scotti, R.; Candiani, G.; Pallanza, R.; Berti, M.; Goldstein, B.
P.; Synthesis and Antibacterial Activity of a Series of Basic Amides of Teicoplanin and Deglucoteicoplanin
with Polyamines. J. Med. Chem., 1992, 35, 4054-4060.
143
modo una diamina capaz de reaccionar con el diéster 5 para dar la reacción de
macrociclación, sin embargo, las condiciones habituales de desprotección de los
grupos amino en medio ácido provocó la degradación de la molécula, haciendo
inviable esta ruta sintética. Puesto que la solubilidad de la oligoescuaramida 54 es muy
limitada en las condiciones anhidras habituales para la formación de amidas, como
última alternativa se ha activado el BODIPY 66 con TSTU (tetrafluoroborato de
N,N,N’,N’-tetrametil-O-(N-succinimidil)uronio) y DiPEA (diisopropiletilamina) en NMP
(N-metil-2-pirrolidona), para posteriormente adicionar la oligoescuaramida cíclica
desprotegida 55, obteniendo de este modo unos resultados satisfactorios. El uso de
NMP incrementa la solubilidad de los reactivos mientras que la efectividad de la
activación con TSTU ha permitido poder realizar la reacción sin aislar el producto
intermedio en una estrategia “one-pot”. El crudo de reacción se ha purificado
mediante HPLC de fase reversa, aislando una fracción del producto 69 con una pureza
superior al 95% aunque con un rendimiento de solo el 16%.
3.7.1.4 Síntesis de la sonda fluorescente C2-FITC 70
Esquema 45 – Síntesis de la sonda fluorescente C2-FITC 70.
La obtención de la sonda C2-FITC 70 se ha llevado a cabo mediante la reacción directa

de la oligoescuaramida cíclica desprotegida 55, en presencia de DMSO y DiPEA, y la
fluoresceína isotiocianato 56 en DMSO. En este caso la reacción progresa muy
lentamente, por lo que se ha mantenido la reacción durante cinco días. La purificación
del crudo se ha llevado a cabo igualmente mediante HPLC de fase reversa. En este caso
se ha podido aislar una fracción del producto 70 con una pureza comprobada
mediante inyección analítica de prácticamente el 100%, con un rendimiento final del
20% (Esquema 45).
144
3.7.1.5 Síntesis de la sonda fluorescente C2-Pyr 72
La última de las sondas previstas, C2-Pyr 72, se ha obtenido sin la necesidad del uso de
agentes de acoplamiento ni activadores debido a la introducción de un espaciador
escuaramídico en la estructura de la sonda. Como se ha comentado anteriormente, los
ésteres escuaramídicos condensan directamente con aminas. La unidad escuaramida
permite establecer dos alternativas para la síntesis de esta sonda fluorescente, bien
sea realizando la condensación del escuarato de etilo 1 sobre la oligoescuaramida 55, y
posteriormente sobre el fluoróforo 57, o a la inversa (Esquema 46).
Esquema 46 – Rutas de síntesis utilizadas para la obtención de la sonda fluorescente C2-Pyr 72.
La primera de las alternativas, realizando en primer lugar una condensación entre la

oligoescuaramida desprotegida 55 y el escuarato de dietilo 1, permitió obtener una
oligoescuaramida cíclica con un derivado éster funcionalizable 71. Sin embargo la
reacción posterior con la 1-pirenometilamina 57 no tiene lugar.128 La ausencia del
producto de reacción se asoció a la necesidad de tener un pH básico cercano a 9,
condiciones en las que la oligoescuaramida cíclica 71 precipita impidiendo la entrada
de la amina 57 sobre la semiescuaramida. Por este motivo, la síntesis de la sonda 72 se
ha llevado a cabo a partir del derivado 58. En este caso el semiéster se ha podido
128
Wurm, F.; Steinbach, T.; Klok, H. A.; One-pot squaric acid diester mediated aqueous protein
conjugation. Chem. Commun., 2013, 49, 7815-7817.
145
conjugar en unas condiciones similares a las anteriores con la oligoescuaramida

desprotegida 55. La sonda derivada del pireno 72 se ha purificado mediante HPLC. El
rendimiento global de la reacción de condensación es del 78%, demostrando la
versatilidad que aporta la unidad escuaramida mediante la posibilidad de establecer
dos rutas sintéticas alternativas.
3.7.2 Caracterización fotofísica de las sondas fluorescentes
Los espectros de RMN y la espectrometría de masas han confirmado las estructuras de

las tres sondas por lo cual se ha procedido a su caracterización fotofísica en medio PBS
(pH 7,4).
Para la caracterización fotofísica se ha trabajado con concentraciones en el intervalo

comprendido entre 5,0x10-5 M y 1x0x10-7 M en función del experimento. Debido a la
moderada solubilidad de las sondas C2-BDP 69 y C2-FITC 70 en tampones acuosos,
éstas requieren la adición de un 1% de DMSO, mientras que la sonda C2-Pyr 72
requiere un 5%. Este límite impuesto del 5% de DMSO responde a la intención de
simular un entorno fisiológico, por tanto, aunque un 10% de DMSO permite
incrementar la solubilidad del compuesto, estas condiciones no son biocompatibles,
por lo que los resultados obtenidos no serían extrapolables al medio fisiológico.
3.7.2.1 Espectros de absorción-emisión
La sonda C2-BDP 69 presenta dos máximos de absorción a 288 y 500 nm (ε = 4,6x105

M-1cm-1), correspondientes a la unidad escuaramida y el fluoróforo respectivamente, y
uno de emisión a 508 nm (λexc = 465 nm), lo que significa un desplazamiento de Stokes
de tan solo 8 nm. Para evitar los posibles efectos de filtro interno debidos a este
pequeño desplazamiento de Stokes en experimentos posteriores se ha utilizado una
longitud de onda de excitación de 460 nm, inferior al máximo situado en 500 nm, lo
cual implicará una pérdida de sensibilidad (Fig. 67).
146
Intensidad
0
240 340 440 540 640
Longitud de onda (nm)
Figura 67 – Espectros normalizados de absorción (violeta) y emisión (naranja) del compuesto 69 C2-BDP.
λexc = 465 nm.
El compuesto C2-FITC 70 presenta dos máximos de absorción, uno a 278 nm,

correspondiente a la banda escuaramídica, y otra de menor intensidad,
correspondiente a la absorción de la fluoresceína a 485 nm (ε = 4,8x105 M-1cm-1). La
banda de emisión presenta el máximo a 520 nm (λexc = 470 nm), mostrando en este
caso un mayor desplazamiento de Stokes (Fig. 68).
1
Intensidad
0
240 340 440 540 640
Figura 68 – Espectros normalizados de absorción (violeta) y emisión (verde) del compuesto 70 C2-FITC.
λexc = 470 nm.
Por el mismo motivo que en el caso de la sonda C2-BDP 69, la excitación en este caso
se ha realizado por debajo del máximo de absorción.
147
La última de las sondas analizadas es la C2-Pyr 72. En este caso el espectro ultravioleta-
visible es más complejo, observándose el patrón correspondiente a las bandas
vibrónicas del pireno que solapan con el cromóforo escuaramídico. El máximo absoluto
situado a 275 nm corresponde a la absorción de la escuaramida. Por otra parte se
pueden observar dos máximos relativos a 324 y 346 nm y dos hombros de mucha
menor intensidad entre 380 y 395 nm. En cuanto a la banda de emisión situada a 470
nm, se consigue obtener una emisión fluorescente con una relación señal-ruido
aceptable realizando la excitación a 370 nm, lejos de cualquier de los máximos de
absorción del pireno. Cabe decir que la sonda con pireno presenta a igualdad de
concentración la menor intensidad de fluorescencia de entre las tres consideradas (Fig.
69).
1 0,02
Intensidad
Intensidad
0
360 400 440 480
0
240 340 440 540 640
Figura 69 – Espectros normalizados de absorción (violeta) y emisión (azul) del compuesto 72 C2-Pyr. λexc
= 370 nm. El recorte de la esquina superior derecha muestra los hombros de la banda del pireno a 380 y
395 nm.
Las escuaramidas poseen una capacidad de "quenching" o atenuación de la
fluorescencia probablemente debido a la transferencia fotoelectrónica (PET) ligada a la
existencia de nitrógenos con pares de electrones sin compartir. Debido a ello, cabe
esperar que la fluorescencia de los fluoróforos conjugados con oligoescuaramidas
cíclicas presenten intensidades de emisión inferiores a la de los correspondientes
fluoróforos independientes. Además, los dos grupos amina terciaria presentes en la
sonda, se comportan del mismo modo, obteniendo un segundo grupo funcional capaz
de provocar un “quenching” tipo PET, en este caso únicamente en medio básico. Este
efecto provocado por las aminas es fácilmente reversible en medio ácido, eliminando
de esta forma el par de electrones libre de las aminas, lo que se traducirá en un
incremento en la fluorescencia.
148
3.7.2.2 Variación de la fluorescencia en función del pH
En el caso de las sondas fluorescentes con aplicacion biológica, resulta de gran

importancia conocer el comportamiento de la emisión fluorescente en función del pH.
Ello se debe a la existencia de diversos entornos intracelulares con valores de pH que
oscilan entre 4,7 en los lisosomas hasta 7,2, el pH propio del citoplasma.129
Con la finalidad de determinar el efecto provocado por el estado de protonación de las

aminas terciarias de la oligoescuaramida cíclica, la intensidad de fluorescencia de las
sondas C2-BDP 69 y C2-FITC 70 se ha determinado en función del pH de la disolución.
Se ha omitido de este estudio la sonda C2-Pyr 72 por presentar una fluorescencia muy
baja y especialmente por la insolubilidad del conjugado C2-Pyr 72, especialmente en
medios acuosos neutros en los que las aminas están desprotonadas.
Para realizar este estudio las sondas se han disuelto en DMSO y se han diluido en agua
a una concentración final de 5,0x10-6 M en H2O con una concentración final de DMSO
del 1%. Para cada una de las sondas se han preparado disoluciones cuyo pH oscila
entre 3 y 11. La intensidad de fluorescencia se representa como la integral de la curva
de emisión entre dos longitudes de onda determinadas (λ0 y λf) según la ecuación 2.
∑ [ ] ( ) (Ec. 2)
La representación de las integrales de las curvas de emisión en función del pH

proporciona los resultados de la figura 70.
1
C2-BDP
C2-FITC
Intensidad
0
3 4 5 6 7 8 9 10 11
pH
Figura 70 – Intensidad de fluorescencia normalizada en función del pH de la disolución para las sondas
-6
C2-BDP 69 y C2-FITC 70, a una concentración 5,0x10 M en medio H2O/1% DMSO a 37 °C.
129
Casey, J. R.; Grinstein, S.; Orlowski, J.; Sensors and regulators of intracellular pH. Nat. Rev. Mol. Cell
Bio., 2010, 11, 50-61.
149
Analizando las curvas se puede observar que en medios básicos ambas experimentan
una reducción de la fluorescencia debido a la desprotonación de las aminas terciarias
de la oligoescuaramida cíclica (pKa1 = 7,9; pKa2 = 8,6). Por otra parte, la mayor
disminución de la fluorescencia en medio ácido de la sonda C2-FITC 70 se explica por la
protonación de la fluoresceína y la pérdida habitual de fluorescencia que experimenta
ésta en medio ácido. Dado que la sonda C2-BDP 69 no tiene otros grupos ionizables en
medio ácido, su intensidad se mantiene estable en el intervalo de pH entre 3 y 6, lo
que la hace muy adecuada para su utilización como marcador celular.
3.7.2.3 Cálculo de los rendimientos cuánticos
Para la completa caracterización de las sondas se ha procedido a calcular el

rendimiento cuántico en condiciones fisiológicas, obtenido mediante comparación con
un estándar por los motivos descritos en la introducción del capítulo. Para ello se hace
uso de la ecuación 3.66
(Ec. 3)
Donde Φ es el rendimiento cuántico de la muestra (M) o del estándar (E). “Abs” es la

absorbancia a una longitud de onda determinada (λ) y “Fl” el área integrada de la
curva de fluorescencia excitando a esa longitud de onda (λ).
Uno de los factores más importantes a la hora de elegir un estándar es el grado de

solapamiento de las bandas de absorción de ambos fluoróforos. Los rendimientos
cuánticos de los estándares no varían apenas con la longitud de onda de excitación, sin
embargo, es recomendable realizar las lecturas en los alrededores del máximo de
absorción, obteniendo de esta forma mayor sensibilidad. Un factor más importante si
cabe es que, al comparar estándar y muestra, la longitud de onda de absorción-
excitación sea la misma, evitando de este modo tener que realizar las correcciones
debidas a la diferente intensidad de la lámpara de fluorescencia a diferentes
longitudes de onda. Esta última consideración pone de manifiesto la necesidad de usar
estándares con perfiles similares de absorción-emisión que los de las muestras a
analizar. El último factor a tener en cuenta es el índice de refracción del disolvente, un
dato que en este caso se considera constante, y por tanto despreciable, al utilizar
disoluciones acuosas con porcentajes de DMSO inferiores al 5%.130
Teniendo en cuenta las consideraciones anteriores, los estándares seleccionados para

las sondas han sido Oregon Green 488 (OG), con un rendimiento cuántico de 0,97 en
tampón borato 0,1 M a pH 9, para las sondas C2-BDP 69 y C2-FITC 70 y sulfato de
quinina (QS) con un rendimiento cuántico de 0,60 en disolución de HClO4 0,1 M para la
sonda C2-Pyr 72.
130
LeBel, R. G.; Goring, D. A. I.; Density, Viscosity, Refractive Index, and Hygroscopicity of Mixtures of
Water and Dimethyl Sulfoxide. J. Chem. Eng. Data, 1962, 7, 100-101.
150
Los rendimientos cuánticos se han calculado a pH 7,4 y 5,5, utilizando para ello
muestras de las sondas disueltas en tampón de PBS (pH 7,4) y cacodilato a una
concentración 0,01 M (pH 5,5).
Los resultados obtenidos se muestran a continuación para las sondas C2-BDP 69 (Fig.
71), C2-FITC 70 (Fig. 72) y C2-Pyr 72 (Fig. 73).
0,2
1
0,8 0,15
Rendimiento cuántico
Abs. Norm. OG
0,6
Intensidad
Abs. Norm. C2-BDP (PBS)

0,1
Abs. Norm. C2-BDP (Cac)
0,4
Int. Norm. OG
0,05 Int. Norm. C2-BDP (PBS)
0,2
Int. Norm. C2-BDP (Cac)
QY C2-BDP (PBS)
0 0
445 465 485 505 525 QY C2-BDP (Cac)
Figura 71 – Trazado continuo: Espectros de absorción UV-Vis normalizados de la sonda C2-BDP 69 en

PBS (pH = 7,4) (azul) y tampón cacodilato (pH = 5,5) (rojo) y del estándar Oregon Green 488 (verde).
Trazado discontinuo: Integrales normalizadas de los espectros de emisión en función de la longitud de
onda de excitación para las mismas muestras. Puntos: Rendimiento cuántico en función de la longitud
de onda (puntos azules para PBS y rojos para cacodilato) y desviación estándar.
La sonda C2-BDP 69 presenta una mayor intensidad de fluorescencia a pH ácido (Fig.
70) que no se traduce en una variación significativa del rendimiento cuántico, de 0,14 ±
0,01 en PBS y 0,15 ± 0,01 en tampón cacodilato a 490 nm.
151
0,3
1
0,25
0,8
0,2
Intensidad
0,6 Abs. Norm. OG

0,15
Abs. Norm. C2-FITC (PBS)
0,4 Abs. Norm. C2-FITC (Cac)
0,1
Int. Norm. OG
0,2 0,05 Int. Norm. C2-FITC (PBS)
Int. Norm. C2-FITC (Cac)
0 0 QY C2-FITC (PBS)
445 465 485 505 525
QY C2-FITC (Cac)
Figura 72 – Trazado continuo: Espectros de absorción UV-Vis normalizados de la sonda C2-FITC 70 en
PBS (pH = 7,4) (azul) y tampón cacodilato (pH = 5,5) (rojo) y del estándar Oregon Green 488 (verde).
Trazado discontinuo: Integrales normalizadas de los espectros de emisión en función de la longitud de
onda de excitación para las mismas muestras. Puntos: Rendimiento cuántico en función de la longitud
de onda (puntos azules para PBS y rojos para cacodilato) y desviación estándar.
En el caso de la sonda C2-FITC 70 se observa una disminución del rendimiento cuántico
notable a pH ácido provocada por la propia naturaleza del fluoróforo. Dicha
disminución es más acusada a longitudes de onda de excitación menores. Los valores
exactos a 490 nm son de 0,25 ± 0,01 en PBS y 0,142 ± 0,009 en cacodilato.
0,02
1
0,8 0,015
0,6
Intensidad
Abs. Norm. QSO4

0,01
Abs. Norm. C2-Pyr (Cac)
0,4 Int. Norm. QSO4
0,005 Int. Norm. C2-Pyr (Cac)

0,2 QY C2-Pyr (Cac)
0 0
340 350 360 370 380
Figura 73 – Trazado continuo: Espectros de absorción UV-Vis normalizados de la sonda C2-Pyr 72 en PBS
(pH = 7,4) (azul) y tampón cacodilato (pH = 5,5) (rojo) y del estándar Oregon Green 488 (verde). Trazado
discontinuo: Integrales normalizadas de los espectros de emisión en función de la longitud de onda de
excitación para las mismas muestras. Puntos: Rendimiento cuántico en función de la longitud de onda
(puntos azules para PBS y rojos para cacodilato) y desviación estándar.
En el caso de la sonda C2-Pyr 72, debido a su naturaleza apolar, no ha sido posible
disolver completamente la muestra en PBS, impidiendo unas lecturas adecuadas de
absorción y fluorescencia. En medio cacodilato la concentración máxima ha sido de
152
5,0x10-5 M, observándose la aparición de turbidez a concentraciones mayores. La

elección del estándar permite cierto solapamiento entre las bandas de absorción, sin
embargo este solapamiento no es tan óptimo para el C2-Pyr 72 y la quinina como el
observado en el caso del Oregon Green 488 y las sondas C2-BDP 69 y C2-FITC 70. Por
este motivo se ha reducido el intervalo de longitudes de onda del estudio entre 345 y
370 nm. El valor del rendimiento cuántico obtenido a 360 nm es de 0,006 ± 0,001. Se
puede observar en la figura 73 como a medida que aumenta la longitud de onda
aumenta el valor del rendimiento cuántico hasta 0,014 a 370 nm. En cualquier caso, a
nivel práctico, la fluorescencia observada a esas longitudes de onda de excitación es
muy débil.
A excepción de la sonda C2-Pyr 72 los valores del rendimiento cuántico obtenidos son
comparables a los publicados para sondas moleculares referibles. A menudo éstas
experimentan una disminución del rendimiento cuántico, comparado al de los
fluoróforos en estado libre, debido a la conjugación con otras moléculas encargadas de
aportar la especificidad en la localización. En este caso debido principalmente al
“quenching” provocado por la escuaramida, efecto particularmente notable en el caso
de la sonda con pireno.
En la bibliografía se pueden encontrar diferentes ejemplos de moléculas fluorescentes

que presentan unos rendimientos cuánticos discretos. Este es el caso por ejemplo de
los fluoróforos derivados del BODIPY utilizados por S. Zhu y colaboradores con
rendimientos cuánticos en PBS que oscilan entre 0,01 y 0,68.131 Lo mismo ocurre con
una sonda celular de zinc obtenida por G. K. Walkup, con un rendimiento cuántico de
0,39 en ausencia de zinc que se incrementa a 0,87 en presencia de este catión
metálico.132 Un último ejemplo es el de la sonda fluorescente BODIPY FL GTP
comercializada por Life Technologies (Ref. G12411).133 En este caso la conjugación con
el nucleótido provoca que el rendimiento cuántico se reduzca hasta un 10% del valor
que presenta el fluoróforo libre (Fig. 74).
131
Zhu, S.; Zhang, J.; Vegesna, G.; Luo, F.-T.; Green, S. A.; Liu, H.; Highly Water-Soluble Neutral BODIPY
Dyes with Controllable Fluorescence Quantum Yields. Org. Lett., 2011, 13, 438-441.
132
Walkup, G. K.; Burdette, S. C.; Lippard, S. J.; Tsien, R. Y.; A New Cell-Permeable Fluorescent Probe for
2+
Zn . J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 5644-5645.
133
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/G12411
153
Figura 74 – Sondas moleculares fluorescentes derivadas de BODIPY y fluoresceína con rendimientos

cuánticos en PBS de: A) 0,68, el derivado con el rendimiento cuántico en PBS más elevado de los
131
presentados en el trabado de S. Zhu. Y B) 0,39 en PBS, que se incrementa hasta 0,87 en presencia de
2+ 132
Zn (G. K. Walkup). C) Para la sonda fluorescentes de Life Technologies no se indica un valor concreto
133
del rendimiento cuántico, si bien no es superior a 0,1.
154
3.7.3 Evaluación biológica de las sondas fluorescentes
La evaluación biológica de las tres sondas se ha realizado frente a dos líneas celulares
diferentes, U87MG (células de glioma humano) y NIH3T3 (fibroblastos embrionarios de
ratón), mediante citometría de flujo y microscopía confocal de fluorescencia.134
Los estudios realizados han demostrado la efectividad en la internalización de las

oligoescuaramidas cíclicas, ya que las tres sondas atraviesan la membrana celular de
forma efectiva y en un breve período de tiempo. Por el contrario cuando las células se
han tratado con los fluoróforos sin conjugar (etil éster 65, FITC 56 y 1-
pirenometilamina 57) no se ha observado fluorescencia en el interior celular.
En cuanto a la localización espacial de las sondas C2-BDP 69 y C2-FITC 70, estas se

acumulan en regiones muy definidas del citoplasma celular dando un patrón punteado
y muy definido, lo cual indica que las sondas se almacenan en orgánulos específicos
(Fig. 75).
Figura 75 – Micrografías de microscopía confocal después del tratamiento de las líneas celulares U87MG
(arriba) y NIH3T3 (abajo) con las tres sondas fluorescentes a una concentración 10 µM durante 1 hora a
37 °C.
La sonda C2-FITC 70 sufre una rápida fotodegradación, ya que la intensidad de

fluorescencia disminuye progresivamente a medida que se realizan observaciones
sucesivas excitando a 488 nm mediante microscopía confocal. Este hecho está de
acuerdo con la menor fotoestabilidad descrita para la fluoresceína,83 lo que hace que
el producto C2-FITC 72 no sea una sonda óptima. Por el contrario, en las mismas
condiciones, la sonda C2-BDP 69 no muestra esta disminución de la fluorescencia. La
fotoestabilidad de la sonda C2-BDP 69 se ha comprobado mediante fluorimetría,
realizando “n” adquisiciones del espectro de emisión en intervalos de cinco minutos de
una muestra a una concentración 5,0x10-6 M en PBS/1% DMSO. La disminución
máxima observada es aproximadamente de un 10%, confirmando su fotoestabilidad
134
La evaluación se ha realizado en colaboración con el grupo de Biología Molecular del Cáncer. Los
experimentos con cultivos celulares descritos en este capítulo han sido llevados a cabo por la Dra. Ruth
Villalonga, miembro del grupo de Química Supramolecular.
155
(Fig. 76-A). Adicionalmente se ha comprobado mediante citometría de flujo que la

intensidad de fluorescencia de C2-BDP 69 disminuye en función del tiempo de forma
inversamente proporcional a la división celular, indicando con ello que la sonda no se
degrada ni es metabolizada (Fig. 76-B).
A B
1 1
0,8 0,8
Intensidad
0,6
Intensidad
0,6
0,4 0,4
0,2 0,2
0 0
0 20 40 60 0 12 24 36 48
Nº de adquisiciones Tiempo (h)
Figura 76 – A (Izquierda): Intensidad de fluorescencia normalizada obtenida mediante fluorimetría

-6
convencional de una muestra de C2-BDP 69 en PBS/1% DMSO a una concentración 5,0x10 M
realizando n adquisiciones del espectro de emisión en intervalos de 5 minutos. λexc = 465 nm. B
(Derecha): Intensidad de fluorescencia obtenida mediante citometría de flujo en células U87MG (azul) y
NIH3T3 (rojo) tratadas durante 1 hora con C2-BDP 69 a una concentración 10 µM. La disminución de
fluorescencia observada se asocia a la división celular y dilución correspondiente.
En cuanto a la distribución de la sonda C2-Pyr 72, ésta muestra un patrón más difuso
que el de las otras dos. Ello se debe por una parte a la baja fluorescencia que presenta
y al consiguiente incremento necesario en la potencia del láser de excitación, lo cual
incrementa mucho la relación señal-ruido. Por otra parte, el carácter hidrofóbico del
pireno podría facilitar una internalización por difusión a través de la membrana celular
o bien desde los propios orgánulos que provocan la internalización, dando este patrón
de fluorescencia más disperso.
Así pues, debido al comportamiento de la sonda C2-Pyr 72 y a la poca fotoestabilidad

del compuesto C2-FITC 70, los estudios se prosiguieron con la sonda C2-BDP 69.
3.7.3.1 Estudios de colocalización celular con la sonda C2-BDP 69
Para determinar qué tipo de orgánulo está provocando esta acumulación observada
por microscopia, se han realizado experimentos de colocalización con la sonda C2-BDP
69. Esta sonda presenta un máximo de emisión a 508 nm, por lo que puede detectarse
utilizando un filtro de adquisición verde (500-550 nm).
La colocalización en un cultivo celular se refiere a la presencia de dos o más sondas

fluorescentes diferentes en una misma localización espacial. A nivel celular la
156
colocalización puede indicar que ambas moléculas ocupan el mismo entorno o

receptor, mientras que en un contexto de imagen digital el término se refiere a que el
color emitido por las dos sondas comparte el mismo pixel en esta imagen. Para llevar a
cabo los estudios de colocalización se utilizan sondas fluorescentes cuya localización
está bien establecida y que presentan una longitud de onda de excitación y de emisión
bien diferenciada a la de la sonda que se pretende estudiar. Tratando los cultivos
celulares con las dos sondas a la vez, ambas pueden localizarse utilizando dos láseres
distintos para la excitación sobre el mismo cultivo celular. Concretamente, en estos
experimentos se han utilizado como sondas de localización conocidas las denominadas
sondas BacMam-RFP® (Life Technologies). Este tipo de sondas usan baculovirus como
vehículo transportador de genes capaces de expresarse en forma de anticuerpos
fluorescentes (Red Fluorescent Protein) específicos para los orgánulos en cuestión. En
este caso se han utilizado sondas BacMan para endosomas tempranos, endosomas
tardíos, lisosomas y para el complejo de Golgi, todos ellos con una emisión visible roja
alrededor de los 650 nm. Una vez tratados los cultivos celulares con las sondas y
fijados para microscopía confocal las imágenes se adquieren registrando
consecutivamente la emisión obtenida con dos frecuencias de excitación distintas, 488
nm para la sonda C2-BDP 69 y 532 nm para las sondas BacMam. Después las imágenes
obtenidas se visualizan, primero por separado, y después conjuntamente para analizar
el grado de superposición o colocalización como medida de la coexistencia de ambas
sondas en una misma zona.
Los resultados obtenidos han demostrado que existe una colocalización muy elevada
en los endosomas tardíos como se puede observar al superponer las imágenes de los
dos canales adquiridos, en verde para el C2-BDP 69 y en rojo para las sondas BacMam-
RFP, obteniendo las áreas de solapamiento de color amarillo-naranja. La cuantificación
de la colocalización se ha realizado mediante la determinación de los coeficientes de
correlación de Pearson (P) y de solapamiento de Mander (M1 y M2) mediante el plugin
Coloc2 de Fiji (Fig. 77).135
135
Schindelin, J.; Arganda-Carreras, L.; Frise, E.; Kaynig, V.; Longair, M.; Pietzsch, T.; Preibisch, S.;
Rueden, C.; Saalfeld, S.; Schmid, B.; Tinevez, J. Y.; White, D. J.; Hartenstein, V.; Eliceiri, K.; Tomancak, P.;
Cardona, A.; Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods, 2012, 9, 676-682.
157
Endosomas
tempranos
P=0.52 M1=0.82 M2=0.98 P=0.85 M1=0.92 M2=0.98
NIH3T3
Endosomas
tardíos
Endosomas tardíos
U87MG
P=0.82 M1=1.00 M2=0.98 P=0.92 M1=0.95 M2=0.97

Lisosomas
U87MG
P=0.26 M1=0.39 M2=0.40 P=0.83 M1=0.99 M2=0.98
Complejo de Golgi
P=0.42 M1=0.27 M2=1.00 P=0.91 M1=1.00 M2=0.90

Figura 77 – Izquierda: Internalización de C2-BDP 69 (verde) y sondas BacMan-RFP® para diferentes
orgánulos celulares (rojo) en la línea celular U87MG. Derecha: Internalización de C2-BDP 69 (verde) y la
sonda BacMan-RFP® específica para endosomas tardíos (rojo) en líneas celulares NIH3T3 y U87MG.
La superposición de ambos canales se representa por el color amarillo.
Tabla 4 – Coeficientes de correlación entre la sonda C2-BDP 69 y las sondas BacMam-RFP para
diferentes orgánulos en la línea celular U87MG.
Orgánulo P M1 M2
End. tempranos 0,52 0,82 0,98
End. tardíos 0,82 1,00 0,98
Lisosomas 0,26 0,39 0,40
Complejo de Golgi 0,42 0,27 1,00
Tabla 5 – Coeficientes de correlación entre la sonda C2-BDP 69 y las sondas BacMam-RFP para los
endosomas tardíos en dos líneas celulares diferentes, NIH3T3 y U87MG.
Línea celular P M1 M2
NIH3T3 0,85 0,92 0,98
NIH3T3 0,92 0,95 0,97
U87MG 0,83 0,99 0,98
U87MG 0,91 1,00 0,90
158
En las tablas 4 y 5 se muestran los coeficientes de correlación entre ambas sondas para
diferentes orgánulos celulares y diferentes líneas celulares. El coeficiente de
correlación de Pearson (P), mide la similitud entre ambos canales, mientras que los
coeficientes de solapamiento de Mander (M1 y M2) cuantifican el solapamiento
mutuo entre los dos canales (M1 sobre M2 y viceversa). Así se obtiene, por ejemplo,
que al usar la sonda BacMam específica para Golgi existe un solapamiento del canal 2
con el canal 1 total (1,0), sin embargo el canal 1 no se encuentra totalmente solapado
(0,27), dando un coeficiente de correlación bajo, 0,42. Para los lisosomas, se puede
observar directamente en las imágenes que no hay grandes áreas de solapamiento,
obteniendo zonas verdes y rojas claramente diferenciadas, hecho representado por los
bajos coeficientes de Mander M1 y M2 (0,39 y 0,40 respectivamente). Además se ha
comprobado que a tiempos de incubación mayores no se observa una evolución
natural de los endosomas tardíos marcados a lisosomas, indicando que la presencia de
la sonda inhibe la evolución natural. Para los endosomas tempranos parece existir un
gran solapamiento entre ambos canales, tal y como indican los coeficientes de
Mander, sin embargo el coeficiente de correlación es de tan solo 0,52. Diferente de
todos los casos anteriores es el de los endosomas tardíos. En todos los casos donde se
ha usado la sonda específica para estos orgánulos, existe una correlación superior a 0,8
y coeficientes de solapamiento mayores de 0,9, indicando una gran colocalización.
Estos datos indican que la sonda C2-BDP 69 se acumula en los endosomas tardíos y
sugiere que se incorpora al interior celular mediante un proceso endocitótico ya que
también se ha detectado su presencia parcial en los endosomas tempranos. Como se
ha indicado en la introducción de este capítulo, la endocitosis comprende un conjunto
de procesos de transporte activo en la célula y son energéticamente dependientes.
Estos mecanismos endocitóticos se activan mediante una interacción a nivel de
membrana con receptores específicos, por lo que resulta interesante conocer si la
sonda C2-BDP 69 establece algún tipo de interacción supramolecular a nivel de
receptores de membrana. Para estudiar el mecanismo de entrada de la sonda y con el
objetivo de estudiar las interacciones supramoleculares de la sonda con la membrana
se han realizado los experimentos detallados a continuación.
3.7.3.2 Experimentos de inhibición del transporte activo
Para determinar si la internalización tiene lugar mediante un transporte activo se han

llevado a cabo dos tipos de experimentos. En un primer experimento más inespecífico,
las líneas celulares se enfrían a 4 °C antes de tratarlas con la sonda C2-BDP 69. A dicha
temperatura la célula no puede obtener la energía necesaria para el proceso ya que se
ralentizan las reacciones metabólicas, con lo cual se inhibe la internalización. En
segundo lugar se han inhibido diversos procesos de internalización celular activos
mediante el pretratamiento de las células con inhibidores específicos. En este caso se
ha utilizado cloropromacina como inhibidor de endocitosis mediada por clatrina,
159
nistatina como inhibidor de endocitosis mediada por caveolina, y dinasore como

inhibidor de la dinamina, una proteína implicada en la formación de vesículas de
internalización (Fig. 78).
Figura 78 – Estructuras de cloropromacina (izquierda), nistatina (centro) y dinasore (derecha).
En los tres tipos de experimentos la entrada de la sonda fluorescente se evalúa

cuantificando la intensidad de fluorescencia mediante citometría de flujo (Fig. 79).
100 120
Intensidad de fluorescencia (%)
Intensidad de fluorescencia (%)
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0 0
NIH3T3 U87MG NIH3T3 U87MG
Línea celular Línea celular
Figura 79 – Izquierda: Inhibición del transporte activo tratando las líneas celulares con una
concentración 10 µM de C2-BDP 69 durante 1 hora a 4 °C (azul) en comparación con el tratamiento
estándar a 37°C (rojo). Derecha: Inhibición de la endocitosis pretratando los cultivos celulares con
cloropromacina (magenta), nistatina (verde) o dinasore (morado) en las condiciones de inhibición
específicas para cada uno y posteriormente con C2-BDP 69 10 µM durante 1 hora a 37 °C. Los resultados
se expresan como un porcentaje en relación al tratamiento con C2-BDP 69 10 µM durante 1 hora a 37 °C
(amarillo).
En todos los casos se detecta una reducción de la internalización de C2-BDP 69. La

inhibición selectiva demuestra que la sonda C2-BDP 69 se internaliza tanto por
mecanismos dependientes de clatrina como de caveolina. Además se observa que la
inhibición de los procesos específicos depende de la línea celular, obteniendo una
inhibición mayor cuando se administra el inhibidor de ambos mecanismos. Estos
resultados indican que existe un reconocimiento en la membrana de la sonda
fluorescente C2-BDP 69 que activa un mecanismo de internalización de transporte
activo, en concreto mediante endocitosis.
160
Para comprobar que la unidad oligoescuaramida es la responsable del reconocimiento

molecular sobre la membrana celular se ha diseñado un experimento competitivo
entre la sonda marcada C2-BDP 69 y la oligoescuaramida C2 13. Para ello las células se
han incubado previamente con una alta concentración de la oligoescuaramida cíclica
no marcada C2 13 (50 µM) antes del tratamiento con C2-BDP 69. La figura 80
demuestra que el pretratamiento con C2 13 inhibe parcialmente la internalización de
la sonda C2-BDP 69, indicando que consigue saturar parcialmente los receptores de
membrana implicados en el reconocimiento de las oligoescuaramidas cíclicas. Esta
saturación de los receptores se representa en la figura como una disminución de la
fluorescencia, respecto al mismo tratamiento de la sonda fluorescente sin el
tratamiento previo con C2 13, en ambas líneas celulares.
100
Intensidad de fluorescencia(%)
80
60
40
20
0
NIH3T3 U87MG
Línea celular
Figura 80 – Inhibición de la internalización mediante saturación de los receptores de membrana por

pretratamiento con la oligoescuaramida C2 13 (50 µM, 1 hora a 37 °C), seguido del tratamiento habitual
con la sonda C2-BDP 69 (10 µM, 1 hora a 37 °C) (azul). Los resultados se referencian al tratamiento de
C2-BDP 69 en las mismas condiciones sin realizar el tratamiento previo (verde).
3.7.4 Interacción de la oligoescuaramida cíclica 74 con grupos fosfato como modelos

de componentes de membranas biológicas
La constatación experimental de la capacidad de las oligoescuaramidas cíclicas para

interaccionar con componentes de membranas a nivel biológico debe basarse en
interacciones moleculares discretas. Dado que las membranas celulares externas e
internas son ricas en fosfolípidos y otros componentes fosforilados, el estudio de la
interacción de oligoescuaramidas cíclicas con moléculas fosforiladas constituye una
hipótesis de partida atractiva para explicar la interacción oligoescuaramida cíclica-
receptores de membrana.
En una primera aproximación para investigar el grado de interacción existente entre

las oligoescuaramidas y receptores de membrana en medio acuoso, se han
determinado las constantes de asociación de la oligoescuaramida cíclica y diferentes
161
modelos de fosfatos de membrana aniónicos en agua mediante valoración

calorimétrica isotérma, ITC (“Isothermal Titration Calorimetry”). Los modelos de
fosfatos seleccionados han sido la adenosina-5’-monofosfato (AMP), la D-manosa-6-
fosfato (M6P), la D-fructosa-1,6-bifosfato (FBP) y el cloruro de fosfocolina (PCh) (Fig.
81).
Figura 81 – Estructuras de los diferentes modelos de fosfato de membrana seleccionados para llevar a
cabo los estudios de interacción oligoescuaramida cíclica-fosfato mediante ITC.
Para simplificar el análisis de los datos se ha decidido utilizar un modelo de

oligoescuaramida cíclica simple donde las aminas terciarias se han cuaternizado por
metilación exhaustiva con yoduro de metilo y posterior intercambio del contra-ión
ioduro por cloruro (Esquema 47). Esta nueva oligoescuaramida 74 presenta los
nitrógenos alifáticos cuaternizados, de forma que se mantiene la carga positiva neta
independientemente del pH. La segunda ionización de la oligoescuaramida C2 ocurre a
un pKa de 7,9. Según este dato, a pH fisiológico 7,4 la proporción de oligoescuaramida
doblemente protonada es aproximadamente del 90%, justificando la simplificación
realizada.
Esquema 47 – Síntesis de la oligoescuaramida cíclica 74.

Para evaluar la afinidad entre el receptor oligoescuaramídico y sustratos fosforilados
en disoluciones acuosas debe considerarse que los fosfatos son moléculas ionizables
que entrarán en equilibrio con el receptor. Por esta razón resulta imprescindible
determinar las constantes de ionización de los fosfatos en las mismas condiciones
experimentales previamente a los experimentos de complejación.
Las constantes de ionización de todos los fosfatos se han obtenido por valoración
ácido-base mediante ITC. Los datos experimentales obtenidos se han ajustado a un
modelo de doble o triple ionización, según el caso, mediante el software HypΔH 1.1.0
162
de Protonic Software,136 obteniendo, una vez alcanzado un conjunto de valores

químicamente significativos, las constantes globales de estabilidad (β) y las entalpías
de formación (ΔH) de las diferentes especies en disolución. Las constantes, de
ionización o de asociación en función del caso (K) y entropías (ΔS) se han obtenido
posteriormente según las ecuaciones 4, 5 y 6.
( ( ) ( )
(Ec. 4)
( ) (Ec. 5)
(Ec. 6)
En la figura 82 y la tabla 6, mostradas a continuación, se representan los datos

experimentales obtenidos para el AMP junto con los valores calculados para un
equilibrio ácido-base con dos constantes de ionización.
100 0,500
80 0,000
Especiación (%)
60 -0,500
Calor (mJ)
AMP
AMP·H₂
40 -1,000 AMP·H
Observado
Calculado
20 -1,500
0 -2,000
6,6 6,1 5,6 5,1 4,6 4,1 3,6 3,1 2,6 2,1
pH
Figura 82 – Datos experimentales normalizados de la valoración ácido-base de AMP con HCl. Valores
calculados, especiación y equilibrios químicos considerados.
Tabla 6 – Constantes termodinámicas obtenidas para los equilibrios de protonación del AMP.
K ΔH ΔS
Complejo Equilibrio Log β -1
(M ) (kJ/mol) (kJ/mol)
5
AMP·H 5,95 8,9x10 -2,70±0,2 0,105
3
AMP·H2 9,46 3,2x10 16,37±0,03 0,122
136
Gans, P.; Sabatini, A.; Vacca, A.; Simultaneous Calculation of Equilibrium Constants and Estándar
Formation Enthalpies from Calorimetric Data for Systems with Multiple Equilibria in Solution. J. Solution
Chem., 2008, 37, 467-476.
163
A partir de las constantes globales (β) se obtienen los valores pKa1 = 3,51 y pKa2 = 5,95
para la primera y segunda ionización del AMP respectivamente, en las condiciones
experimentales utilizadas. Estos valores resultan algo inferiores, aunque comparables,
a los que aparecen en la bibliografia (3,99 y 6,74) para el AMP aunque en este caso
obtenidos en condiciones diferentes.137
De forma similar, se han obtenido los valores de las constantes de ionización para la
manosa 6-fosfato (M6P), la fructosa-2,6-bifosfato (FBP) y la fosfocolina (PCh). Los
valores obtenidos se muestran a continuación en las figuras 83-85 y las tablas 7-9.
100 0,040
0,035
80 0,030
Especiación (%)
0,025
60
Calor (mJ)
0,020 M6P
M6P·H
0,015 M6P·H₂
40
0,010 Observado
Calculado
20 0,005
0,000
0 -0,005
7 6,5 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3
pH
Figura 83 – Datos experimentales normalizados de la valoración de M6P con HCl. Valores calculados,
especiación y equilibrios químicos considerados.
Tabla 7 – Constantes termodinámicas calculadas para los equilibrios de la M6P.
K ΔH ΔS
Complejo Equilibrio Logβ -1
5
M6P·H 5,33 2,1x10 -2,71±0,03 0,093
1
M6P·H2 7,2 7,4x10 -1,5±0,4 0,031
137
Ould-Moulaye, C. B.; Dussap, C. G.; Gros, J. B.; A consistent set of formation properties of nucleic acid
compounds: Nucleosides, nucleotides and nucleotide-phosphates in aqueous solution. Thermochim.
Acta, 2002, 387, 1-15.
164
100 0,100
90 0,090
80 0,080
70 0,070
Especiación (%)
60 0,060 FBP
Calor (mJ)
FBP·H
50 0,050
FBP·H₂
40 0,040 FBP·H₃
30 0,030 Observado
20 0,020 Calculado
10 0,010
0 0,000
6,2 5,7 5,2 4,7 4,2 3,7 3,2 2,7
pH
Figura 84 – Datos experimentales normalizados de la valoración de FBP con HCl. Valores calculados,
Tabla 8 – Constantes termodinámicas obtenidas para los equilibrios de la FBP.
K ΔH ΔS
6
FBP·H 6,6 4,0x10 -5,08±0,03 0,109
6
FBP·H2 12,96 2,3x10 -8,52±0,02 0,093
1
FBP·H3 14,89 8,5x10 -17,47±0,05 -0,022
165
100 0,070
90
0,060
80
70 0,050
Especiación (%)
60 PCh
Calor (mJ)
0,040
PCh·H
50
0,030
(PCh·H)₂
40 PCh·H₂
30 0,020 Observado
20
Calculado
0,010
10
0 0,000
7 6,5 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3
pH
Figura 85 – Datos experimentales normalizados de la valoración de PCh con HCl. Valores calculados,
Tabla 9 – Constantes termodinámicas obtenidas para los equilibrios del PCh.
K ΔH ΔS
5
PCh·H 5,33 2,1x10 -2,1±0.1 0,095
3
(PCh·H)2 ( ) 13,99 2,1x10 -10,6±0.1 0,028
2
PCh·H2 7,71 2,4x10 -6±2 0,025
166
Los valores de las constantes de ionización y de las entalpías de formación para los
equilibrios de ionización de los diferentes fosfatos utilizados se han introducido como
constantes al plantear un modelo completo de equilibrio frente a la oligoescuaramida
74. En todos los casos, los modelos de equilibrio planteados requieren evaluar entre 5
y 7 equilibrios y el hecho de fijar 2 o 3 de éstos según el caso, disminuye la complejidad
del sistema y permite alcanzar resultados con sentido químico. Para realizar estos
experimentos en presencia de la oligoescuaramida, se ha obtenido en primer lugar una
disolución de la sal básica del fosfato y la oligoescuaramida cíclica, para
posteriormente realizar una valoración ácido-base mediante la adición de HCl,
protonando así los fosfatos y permitiendo la disociación de los complejos, lo que
permite calcular los valores termodinámicos.
La figura 86 y la tabla 10, muestran el análisis de los datos experimentales en el

intervalo de pH estudiado mediante un modelo en el que la oligoescuaramida 74
forma complejos 1:1 con el AMP monobásico y dibásico, y un complejo 1:2 con la
forma monobásica.
167
100 0,200
90
0,150
80
70 0,100 AMP
Especiación (%)
AMP·H
60
Calor (mJ)
0,050 AMP·H₂
50 74·AMP
40 0,000
74·(AMP·H)
30 -0,050 74·(AMP·H)₂
20 Observado
-0,100 Calculado
10
0 -0,150
5,7 5,2 4,7 4,2 3,7 3,2
pH
Figura 86 – Datos experimentales y calculados normalizados de la valoración de 74 + AMP con HCl.
Tabla 10 – Constantes termodinámicas obtenidas para los equilibrios de AMP y los complejos formados
a b
con 74. Equilibrios cuyas constantes se mantienes como variables. Equilibrios de ionización cuyas
constantes se mantienen invariables.
K ΔH ΔS
b 5
AMP·H 5,95 8,9x10 -2,7±0,2 0,105
b 3
AMP·H2 9,46 3,2x10 16,37±0,03 0,122
a 5
74·AMP 5,32 2,1x10 16,4±0,6 0,157
4
74·[AMP·H] 9,42 1,3x10 -41,8±0,6 -0,062
[ ]a
[ ] 3
74·[AMP·H]2 19,05 4,8x10 -54,0±0,2 -0,111
[ ] a
168
Esquema 47 – Equilibrios de asociación calculados para la valoración ácido-base de la mezcla 74 + AMP.
El sistema de equilibrios permite evaluar las constantes de asociación para los

complejos 1:1, siendo 2,1x105 M-1 y 1,3x104 M-1 para los complejos [74·AMP] y
[74·AMPH], respectivamente. Estos valores son lógicos ya que la afinidad de la
oligoescuaramida cíclica 74, con dos cargas positivas netas, frente al AMP dibásico, con
dos cargas negativas netas, es diez veces superior a la correspondiente al AMP
monobásico. Además la especiación muestra que, para valores de pH superiores a 5, el
complejo [74·AMP] es la especie predominante (>90%). Estos valores son muy notables
ya que se han obtenido en disolución por lo que cabe esperar que el reconocimiento
169
de componentes fosfatos sobre membranas celulares ocurra con mucha mayor

afinidad.138
Los resultados obtenidos con el resto de los fosfatos se muestran en las figuras 87 a 89
y las tablas 11 a 13.
100 0,070
0,060
80
0,050 M6P
M6P·H
60
Calor (mJ)
0,040 M6P·H₂
%
74·M6P
40 0,030 74·M6P₂
74·(M6P·H)
0,020 74·(M6P·H)₂
20 Observado
0,010 Calculado
0 0,000
6,5 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3
pH
Figura 87 – Datos experimentales y calculados normalizados de la valoración de 74 + M6P con HCl.
Tabla 11 – Constantes termodinámicas obtenidas para los equilibrios de M6P y los complejos formados
a b
K ΔH ΔS
b 5
M6P·H 5,33 2,1x10 -2,7±0,3 0,093
b 1
M6P·H2 7,2 7,4x10 -1,5±0,4 0,031
a 3
74·M6P 3,64 4,4x10 17±6 0,127
a 3
74·M6P2 6,95 2,0x10 41±11 0,201
74·[M6P·H] [ ]a 8,68 1,1x10
5
16±6 0,150
[ ] 2
74·[M6P·H]2 16,81 6,3x10 7±10 0,077
[ ] a
138
Ma, M.; Paredes, A.; Bong, D.; Intra- and Intermembrane Pairwise Molecular Recognition between
Synthetic Hydrogen-Bonding Phospholipids. J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 14456-14458.
170
Esquema 48 – Equilibrios de asociación calculados para la valoración ácido-base de la mezcla 74 + M6P.
171
100 0,090
0,080
80 0,070 FBP
FBP·H
Especiación (%)
0,060
60 FBP·H₂
Calor (mJ)
0,050 FBP·H₃
0,040 74₂·FBP
40 74·FBP
0,030 74·(FBP·H)
0,020 74·(FBP·H₂)
20
Observado
0,010
Calculado
0 0,000
4,2 3,7 3,2 2,7
pH
Figura 88 – Datos experimentales y calculados normalizados de la valoración de 74 + FBP con HCl.
Tabla 12 – Constantes termodinámicas obtenidas para los equilibrios de FBP y los complejos formados
a b
K ΔH ΔS
b 6
FBP·H 6,6 4,0x10 -5,08±0,03 0,109
b 6
FBP·H2 12,96 2,3x10 -8,52±0,02 0,093
b 1
FBP·H3 14,89 8,5x10 -17,47±0,05 -0,022
a 6
74·FBP 6,4 2,5x10 -10,1±0,8 0,089
a 1
742·FBP 8,05 4,5x10 -8±5 0,005
74·[FBP·H] [ ]a 10,46 1,1x10
4
41,4±0,1 0,217
[ ] 4
74·[FBP·H2] 15,16 5,0x10 -17,5±0,3 0,031
[ ]a
172
Esquema 49 – Equilibrios de asociación calculados para la valoración ácido-base de la mezcla 74 + FBP.
173
100 0,070
90
0,060
80
70 0,050 PCh
PCh·H
Calor (mJ)
60 0,040 (PCh·H)₂
50
%
PCh·H₂
40 0,030 74·PCh
74·PCh₂
30 0,020 74·(PCh·H)
20 Observado
0,010 Calculado
10
0 0,000
6 5,5 5 4,5 4 3,5 3
pH
Figura 89 – Datos experimentales y calculados normalizados de la valoración de 74 + PCh con HCl.
Tabla 13 – Constantes termodinámicas obtenidas para los equilibrios de PCh y los complejos formados
a b
K ΔH ΔS
b 5
PCh·H 5,33 2,1x10 -2,1±0,1 0,095
b 2
PCh·H2 12,96 2,4x10 -6±2 0,025
[PCh·H]2 [ ] b
14,89 2,1x10
3
-10,6±0,1 0,028
a 1
74·PCh 1,03 1,1x10 -10±4 -0,014
a 5
74·PCh2 6,56 3,4x10 3,1±0,1 0,116
74·[PCh·H] [ ]a 7,75 2,6x10
2
-1,6±0,2 0,041
174
Esquema 50 – Equilibrios de asociación calculados para la valoración ácido-base de la mezcla 74 + PCh.
Es destacable la presencia de complejos [74·RPO42-] a valores de pH superior a 6 en el

caso de AMP (>95%) y M6P (>80%). En el caso de la fructosa se observa ya a pH 4,5
complejo [74·FBP] en un 40%, con una tendencia ascendente para valores de pH más
básicos, a la vez que disminuye la proporción de [FBP·H2] y [74·FBP·H2]. Esta diferencia
en el comportamiento es debida a los dos grupos fosfato presentes en la FBP.
El caso de la fosfocolina es especial al presentar ésta un grupo tetraalquilamonio

catiónico, hecho que hace que el complejo 1:1 no esté favorecido electrostáticamente.
En este caso existe una mayor proporción de complejo [74·PCh2], un complejo neutro,
a pH 6,5 (>70%), con una presencia de [74·PCh] (complejo catiónico) prácticamente
nula.
175
Tabla 14 – Resumen de las constantes de asociación de los complejos supuestamente predominantes a

pH fisiológico.
K
Complejo Equilibrio -1
(M )
5
74·AMP 2,1x10
3
74·M6P 4,4x10
6
74·FBP 2,5x10
5
74·PCh2 3,4x10
A modo de resumen, en la tabla 14 se muestran las constantes de asociación para los

complejos que resultan ser los predominantes a pH fisiológico (7,4). Los complejos
formados en los tres primeros casos presentan constantes de asociación de diversa
magnitud. La afinidad menor se obtiene para la M6P y se puede explicar por la
presencia de complejos 2:1 con los fosfatos dianiónicos, con constantes de asociación
similares, que compiten con el complejo 1:1. En el caso de la FBP la presencia de dos
grupos fosfato permite explicar la elevada afinidad del complejo.
Los estudios realizados por ITC han permitido establecer que existe una gran afinidad
entre la oligoescuaramida cíclica y diversos compuestos fosforilados como modelos de
fosfatos de membrana, hecho que podría relacionarse a nivel químico con la
internalización observada en la sonda C2-BDP 69 al activarse mediante este
reconocimiento los mecanismos de endocitosis propuestos.
176
3.8 Conclusiones
1. Se ha obtenido un derivado de la oligoescuaramida cíclica C2 con un grupo amino
capaz de reaccionar con otros grupos funcionales, permitiendo la obtención de
conjugados de esta oligoescuaramida cíclica en un solo paso sintético.
2. Mediante el uso de la oligoescuaramida cíclica derivatizable 54 se han obtenido tres

sondas fluorescentes con diferentes propiedades fotofísicas, de las cuales una de ellas
ha permitido la visualización de la interacción entre las líneas celulares NIH3T3 y
U87MG, y la oligoescuaramida C2.
3. La sonda fluorescente C2-BDP 69 ha permitido elucidar los procesos que se dan

durante la interacción con las células, estableciendo que existe una internalización
mediante un transporte activo, en concreto la endocitosis, gracias a un reconocimiento
de la oligoescuaramida sobre la membrana. Posteriormente la sonda fluorescente
permanece sin ser degradada en los endosomas tardíos, impidiendo la evolución de
éstos a lisosomas.
4. Los estudios llevados a cabo mediante ITC con la oligoescuaramida cíclica

cuaternizada y los diferentes fosfatos, como modelos de compuestos fosforilados de la
membrana celular, han permitido confirmar que existe una gran afinidad de la
oligoescuaramida cíclica por los grupos fosfato dianiónicos, estableciendo mayormente
complejos 1:1 en disolución acuosa.
177
178

equipo MilliQ (Millipore) consiguiendo una resistividad máxima de 18,2 MΩ.

El sistema RF-HPLC utilizado para la purificación de los productos ha sido un sistema

Gilson, equipado con bombas modelo 321 y un módulo detector UV-Vis-152.
300 o bien mediante un instrumento Bruker AVANCE 600 MHz. Los desplazamientos
químicos indicados en ppm están referenciados a la señal residual del disolvente
utilizado en el caso de DMSO y CDCl3. En el caso de los espectros realizados en D2O, se
ha utilizado la sal sódica del ácido 3-(trimetilsilil)-1-propanosulfónico como patrón
interno. Los espectros de masas se han registrado con un espectrómetro de masas de
alta resolución (HRMS) Micromass AutoSpec 3000, provisto de un sistema de entrada
de la muestra mediante electroespray (ESI) o bien mediante un sistema Bruker
Autoflex MALDI-TOF.
La obtención de los espectros UV-Vis se ha realizado mediante un espectrómetro UV-

Vis modelo Varian Cary 300 Bio de doble haz. Para los espectros de emisión de
fluorescencia se ha utilizado un espectrofotómetro Varian Cary Eclipse.
Para la cuantificación de la fluorescencia celular se ha utilizado un citómetro de flujo

modelo Beckman Coulter Epics XL-MLC. El microscopio confocal utilizado para la
visualización y obtención de microfotografías ha sido el modelo Confocal Scanner TCS
SP2 Leica, de Leica Microsystem, Heidelberg.
Los experimentos de ITC se han llevado a cabo en un NanoITC III de TA Instruments.
139 th
179
3.9.1 Síntesis
N-terc-butoxicarbonil-1,3-diaminopropano 43:
Su síntesis se ha descrito en el capítulo 2.
Terc-butil (3-(bis(2-cianoetil)amino)propil)carbamato 52:
La diamina monoprotegida 43 (1,57 g, 9,0 mmol) disuelta en acrilonitrilo (45 ml) y

ácido acético (1,03 ml, 18 mmol) se lleva a reflujo durante 16 horas. Posteriormente el
disolvente se concentra a presión reducida, el residuo se disuelve en CHCl3 (30 ml) y se
vierte sobre NH3 concentrado (10 ml). La fase orgánica se lava con H2O (3 x 30 ml), se
seca sobre Na2SO4 y se concentra a sequedad obteniendo un líquido incoloro que se
purifica mediante cromatografía en columna (Al2O3, CHCl3:MeOH (2%)) para obtener el
producto 52 en forma de aceite incoloro (2,48 g, 8,86 mmol). Rdto: 99%
1
H RMN (300 MHz, CDCl3): δ = 1,44 (s, 9H, C(CH3)3), 1,67 (m, 3J(H,H) = 6,9 Hz, 2H,
CH2CH2CH2), 2,49 (t, 3J(H,H) = 6,6 Hz, 4H, CH2CH2CN), 2,59 (t, 3J(H,H) = 6,9 Hz, 2H,
NCH2), 2,86 (t, 3J(H,H) = 6,6 Hz, 4H, CH2CN), 3,20 (q, 3J(H,H) = 6,9 Hz, 2H, CH2NHBoc),
4,73 (br, 1H, NHBoc). 13C RMN (75 MHz, CDCl3): δ = 17,1, 28,1, 28,5, 38,6, 49,8, 51,1,
79,4, 118,7, 156,2. HRMS (ESI) calc. para 303,1797 (M+Na+; C14H24N4NaO2+)
Terc-butil (3-(bis(2-aminopropil)amino)propil)carbamato 53:
El dinitrilo 52 preparado anteriormente (2,48 g, 8,86 mmol) se disuelve en NaOH:EtOH

(50 ml, 1.4 M) y se introduce en un frasco hidrogenador que contiene el catalizador Ni-
Raney (0,94 g). La mezcla se purga con hidrógeno y se hidrogena a 45 psi durante 16
horas. Se filtra el catalizador a través de Celita® 521 y se lava con suficiente EtOH
acuoso al 95%. El filtrado se diluye con H2O (5 ml) y se elimina a presión reducida el
EtOH. El resto acuoso se lava con CH2Cl2 (3 x 30 ml) extrayendo el producto en las fases
orgánicas, que se secan sobre Na2SO4 y se concentran obteniendo la diamina 53 como
un líquido incoloro (2,53 g, 8,75 mmol). Rdto: 99%
1
H RMN (300 MHz, CDCl3): δ = 1,44 (s, 9H, C(CH3)3), 1,59 (m, 3J(H,H) = 6,9 Hz, 6H,
CH2CH2CH2), 2,44 (m, 6H, NCH2), 2,72 (t, 3J(H,H) = 6,9 Hz, 4H, CH2NH2), 3,17 (br, 2H,
180
CH2NHBoc), 4,47 (br, 1H, NHBoc). 13C RMN (75 MHz, CDCl3): δ = 27,0, 28,6 ,30,9, 39,9,
40,7, 51,9, 52,7, 78,9, 156,2. HRMS (ESI) calc. para 289,2604 (M+H+; C14H33N4O2+)
C2-Boc 54:
El diéster 5 (1,8 g, 4,58 mmol) se calienta en EtOH a 50 °C hasta su completa

disolución. Sobre esta se añade gota a gota una disolución de la triamina
monoprotegida 53 (1,32 g, 4,58 mmol) disuelta en EtOH (20 ml). La mezcla se agita
durante 16 horas a temperatura ambiente y en atmósfera de argón. El precipitado
formado se filtra y se lava con EtOH (4 x 10 ml) y Et2O (2 x 10 ml) obteniendo un sólido
amarillo. Éste se lava con acetona a reflujo (3 x 20 ml) y se seca a vacío obteniendo un
sólido amarillo pálido (1,82 g, 3,09 mmol). Rdto: 67%
1
H RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1,37 (s, 9H, C(CH3)3), 1,47 (br, 2H, CH2CH2NHBoc),
1,64 (br, 8H, CH2CH2CH2), 2,11 (s, 3H, NCH3), 2,33 (br, 10H, NCH2), 2,91 (br, 2H,
CH2NHBoc), 3,50 (br, 8H, CH2NH(Sq)), 6,75 (br, 1H, NHBoc), 7,40 (br, 4H, NH(Sq)). 13C
RMN (75 MHz, DMSO-d6): δ = 26,7, 28,0, 28,2, 38,0, 41,7, 50,4, 54,2, 77,3, 155,6,
167,8, 182,3. HRMS (ESI) calc. para 612,3486 (M+Na+; C29H47N7NaO6+) encontrado:
612,3480.
3-etoxi-4-((pirenilmetil)amino)-3-ciclobuten-1,2-diona 58:
1-pirenometilamina 57 (0,207 g, 0,77 mmol) y DiPEA (269 µl, 1,55 mmol) se suspenden
en una mezcla compuesta por DMF (1 ml), Et2O (2 ml) y acetonitrilo (8 ml). A esta
suspensión se añade escuarato de dietilo 1 (229 µl, 1,55 mmol) disuelto en Et2O (1 ml),
y se agita la mezcla resultante durante 16 horas a temperatura ambiente.
Posteriormente se eliminan los disolventes y se disuelve el residuo en CHCl3 (25 ml). La
disolución se lava con H2O (2 x 20 ml), una disolución saturada de NaCl (20 ml) y se
seca sobre Na2SO4. El disolvente se evapora obteniendo un sólido blanco. Éste se
recristaliza en mezclas CH2Cl2:hexano obteniendo el producto 58 (125 mg, 0,352 mmol)
como un sólido blanco. Rdto: 45%
181
1
H RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1,34 (m, 3H, CH2CH3), 4,67 (m, 2H, CH2CH3), 5,25 (d,
3
J(H,H) = 5,7 Hz, 1H, NHCH2a(pyr)), 5,46 (d, 3J(H,H) = 5,7 Hz, 1H, NHCH2b(pyr)), 8,0-8,4
(m, 9H, pyr), 9,31 (br, 0,5H, NHa), 9,54 (br, 0,5H, NHb).140 13C RMN (75 MHz, CDCl3): δ =
16,0, 46,8, 70,0, 122,0, 124,8, 125,1, 125,2, 125,8, 126,0, 126,5, 127,4, 128,2, 128,9,
130,7, 131,4, 131,8, 172,4, 177,7, 183,5, 188,9. HRMS (ESI) calc. para 711,2495
(2M+H+; C46H35N2O6+) encontrado: 711,2472.
2-(4-formilfenoxi) acetato de etilo 61:
4-hidroxibenzaldehido 59 (5,62 g, 46 mmol) y K2CO3 (14,65 g, 106 mmol) disueltos en

acetona (70 ml) se agitan durante 15 minutos en atmósfera de argón. Posteriormente
se añade bromoacetato de etilo 60 (5,10 ml, 46 mmol) a la mezcla y se agita a reflujo
durante 2 horas. La disolución se vierte sobre H2O fría (160 ml) y se extrae con CH2Cl2
(2 x 65 ml). Los extractos orgánicos se combinan y se lavan con una disolución
concentrada de NaCl (30 ml). La disolución se seca sobre Na2SO4 y se concentra el
disolvente a presión reducida obteniendo el producto como un líquido denso amarillo
(8,48 g, 40,7 mmol). Rdto: 92%
1
H RMN (300 MHz, CDCl3): δ = 1,30 (t, 3J(H,H) = 6,9 Hz, 3H, CH2CH3), 4,28 (q, 3J(H,H) =
6,9 Hz, 2H, CH2CH3), 4,70 (s, 2H, CH2OAr), 7,01 (d, 3J(H,H) = 8,7 Hz, 2H, Ar), 7,85 (d,
3
J(H,H) = 8,7 Hz, 2H, Ar), 9,90 (s, 1H, CHO). 13C RMN (75 MHz, CDCl3): δ = 14,2, 61,7,
65,3, 115,0, 130,9, 132,0, 162,7, 168,1, 190,8.
8-(4-(2-etoxi-2-oxoetoxi)fenil)-1,3,5,7-tetrametil BODIPY 65:
El aldehído 61 (1,55 g, 7,43 mmol) y 2,4-dimetilpirrol 62 (1,53 ml, 14,87 mmol) se

disuelven en CH2Cl2 anhidro (1000 ml) mientras el recipiente es purgado con argón. A
continuación, se añade anhídrido acético (0,6 ml, 6,5 mmol) y TFA (15 µl). La mezcla de
reacción se cubre con papel de aluminio y se mantiene en agitación con atmósfera de
argón durante 80 minutos a temperatura ambiente. Después, 2,3-dicloro-5,6-diciano-
p-benzoquinona (2,03 g, 8,92 mmol) disuelta en una mezcla de CH2Cl2 anhidro (20 ml)
140 a b
Los superíndices y hacen referencia a las dos conformaciones diferenciables en el espectro.
182
y THF anhidro (5 ml) se añade al crudo de reacción y se agita durante 15 minutos

adicionales. La disolución se lava con H2O (3 x 250 ml), una disolución concentrada de
NaCl (250 ml), se seca sobre Na2SO4 y se concentra a sequedad manteniendo el baño
del rotavapor a temperatura inferior a 34 °C. El polvo rojo-verde obtenido corresponde
al producto 63. Se elabora brevemente mediante disolución en CH2Cl2 (40 ml) y
filtración a través de Florisil® (20 g). Posteriormente la disolución se diluye hasta los
190 ml en un matraz de fondo redondo cubierto con papel de aluminio, y se añade
Et3N (14,3 ml, 103 mmol). Se agita durante 10 minutos y se añade BF 3·OEt2 64 (17,5 ml,
142 mmol) para posteriormente agitar durante otros 45 minutos. Transcurrido el
tiempo, la disolución se lava con H2O (3 x 70 ml) y una disolución concentrada de NaCl
(50 ml). El disolvente se elimina a presión reducida y el residuo obtenido se disuelve en
MeOH (60 ml) con K2CO3 (2,49 g, 18 mmol). La solución se agita durante 40 minutos y
entonces se concentra a un volumen final de aproximadamente 5 ml. Se diluye con
H2O (150 ml) y se extrae el producto con CHCl3 (3 x 50 ml). Los extractos orgánicos se
secan sobre Na2SO4 y el disolvente se concentra obteniendo un sólido que se purifica
mediante cromatografía en columna (SiO2, CH2Cl2:hexano, de 3:1 a 9:1). El producto se
recristaliza con CH2Cl2 y hexano para obtener cristales de color naranja (1,297 g, 3,04
mmol). Rdto: 41%
1
H RMN (300 MHz, CDCl3): δ = 1,29 (t, 3J(H,H) = 7,2 Hz, 3H; CH2CH3), 1,33 (s, 6H, 1,7-
CH3(BDP)), 2,34 (s, 6H, 3,5-CH3(BDP)), 4,28 (q, 3J(H,H) = 7,2 Hz, 2H, CH2CH3), 4,68 (s, 2H,
CH2O(Ar)), 5,88 (s, 2H, 2,6-H(BDP)), 6,97 (d, 3J(H,H) = 8,7 Hz, 2H, m-H(Ar)), 7,21 (d,
3
J(H,H) = 8,7 Hz, 2H, o-H(Ar)). 13C RMN (75 MHz, CDCl3): δ = 14,3, 14,7, 61,6, 65,6,
115,5, 121,3, 128,3, 129,5, 131,9, 141,5, 143,2, 155,6, 158,5, 168,7. HRMS (MALDI-
TOF) calc. para 407,1942 (M-F-; C23H25BFN2O3-) encontrado: 407,1940.
8-(4-(carboximetoxi)fenil)-1,3,5,7-tetrametil BODIPY 66:
La hidrólisis del éster 65 se realiza mediante la disolución de éste (98 mg, 0,23 mmol)
en MeOH (20 ml) junto con K2CO3 (249 mg, 1,8 mmol), con agitación en un matraz
protegido de la luz y con atmósfera de argón durante 60 horas.
Posteriormente se elimina el disolvente a presión reducida obteniendo un resto que se

diluye con H2O (50 ml). La disolución básica obtenida se lava con CHCl3 (3 x 30 ml) y se
acidifica con HCl 1N hasta obtener un pH 3. Entonces se extrae el producto con CH 2Cl2
(3 x 30 ml), se secan las fases orgánicas sobre Na2SO4 y se evapora el disolvente para
183
obtener un sólido naranja de producto (91 mg, 0,23 mmol) que se usa inmediatamente
sin más purificación. Rdto: 99%
1
H RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1,39 (s, 6H, 1,7-CH3(BDP)), 2,44 (s, 6H, 3,5-
CH3(BDP)), 4,75 (s, 2H, CH2O(Ar)), 6,17 (s, 2H, 2,6-H(BDP)), 7,08 (d, 3J(H,H) = 8,7 Hz, 2H,
m-H(Ar)), 7,25 (d, 3J(H,H) = 8,7 Hz, 2H, o-H(Ar)), 13,04 (br, 1H, COOH). 13C RMN (75
MHz, DMSO-d6): δ = 14,1, 14,2, 64,6, 115,3, 121,3, 126,4, 129,1, 131,1, 142,0, 142,8,
154,7, 158,4, 169,9. HRMS (ESI) calc. para 795,3148 (2M-H+; C42H41B2F4N4O6-)
N3,N3-Di-[3-[(terc-butiloxicarbonil)amino]propyl]-1,3-di-aminopropano 67:
Sintetizada según el procedimiento descrito en la bibliografía.127
BODIPY-Diamina(Boc)2 68:
Una disolución del ácido de BODIPY 66 (0,175 g, 0,44 mmol), la amina 67 (0,171 g, 0,44
mmol) y DiMAP (5 mg, 0,04 mmol) en CH2Cl2 anhidro (13 ml) se añade gota a gota
sobre otra disolución de DCC (0,118 g, 0,57 mmol) en CH2Cl2 (2 ml) a 0 °C. La reacción
se mantiene a dicha temperatura durante 2 horas y a temperatura ambiente durante
12 horas adicionales.
Se elimina el disolvente y el residuo obtenido se lava con Et2O. El sólido naranja

resultante se purifica mediante HPLC de fase reversa, utilizando una columna
XBridgeTM Prep C18 OBDTM 5µm, 19x150 mm, de Waters. La fase móvil utilizada ha sido
acetonitrilo y H2O, con una proporción inicial 80:20 y final a los 8 minutos de 95:5. Los
extractos se concentran parcialmente a 40 °C y 100 mbar de presión y se liofilizan
obteniendo el producto 68 como un sólido naranja (25 mg, 0,03 mmol). Rdto: 7%
1
H RMN (300 MHz, CDCl3): δ = 1,41 (s, 6H, 1,7-CH3(BDP)), 1,43 (s, 18H, C(CH3)3), 1,68 (t,
3
J(H,H) = 6,8 Hz, 4H, CH2CH2NHCOO), 1,71 (t, 3J(H,H) = 6,8 Hz, 4H, CH2CH2NHCO), 2,44
(t, 3J(H,H) = 6,3 Hz, 6H (NCH2), 2,55 (s, 6H, 3,5-CH3(BDP)), 3,17 (q, 3J(H,H) = 6,3 Hz, 4H,
CH2NHCOO), 3,43 (q, 3J(H,H) = 6,3 Hz, 2H, CH2NHCO), 4,54 (s, 2H, CH2O(Ar)), 5,08 (br,
2H, NHCOO), 5,98 (s, 2H, 2,6-H(BDP)), 7,05 (d, 3J(H,H) = 8,7 Hz, 2H, m-H(Ar)), 7,15 (br,
184
1H, CH2CONH), 7,22 (d, 3J(H,H) = 8,7 Hz, 2H, o-H(Ar)). 13C RMN (75 MHz, CDCl3): δ =
14,7, 27,1, 28,6, 29,9, 37,8, 39,3, 51,7, 51,9, 67,5, 79,3, 115,5, 121,4, 128,7, 129,8,
131,8, 141,2, 143,1, 155,7, 156,2, 157,9, 167,8. HRMS (ESI) calc. para 769,4635 (M+H+;
C40H60BF2N6O6-) encontrado: 769,4636.
C2-BDP 69:
La oligoescuaramida cíclica 54 (0,32 g, 0,55 mmol) se trata con 10 ml de HCl 3M (4,4

mmol) y se agita durante 16 horas a 50 °C. Después la solución se basifica con una
disolución saturada de Na2CO3 hasta pH 9 y se elimina el disolvente, obteniendo la
correspondiente amina como un sólido amarillo, que se usa sin más purificación en el
siguiente paso. La desprotección total del grupo Boc se verifica mediante 1H-RMN.
La amina obtenida se disuelve en NMP (1-metil-2-pirrolidona) (2 ml) con 193 µl de

DiPEA (1,11 mmol), y se filtra la solución para eliminar sales inorgánicas. Por otro lado,
el ácido del BODIPY 66 (121 mg, 0,3 mmol) y DiPEA (71,4 µl, 0,41 mmol) se disuelven
en NMP (4 ml). Sobre esta última disolución se añade una disolución de TSTU
(tetrafluoroborato de N,N,N’,N’-Tetrametil-O-(N-succinimidil)uronio) (92 mg, 0,3
mmol) en NMP (2 ml) y se mantiene la mezcla a temperatura ambiente, en atmósfera
de argón y protegida de la luz durante 90 minutos. Después se añade la disolución de
la amina desprotegida y se agita durante 16 horas en las mismas condiciones. La
disolución naranja se filtra y se añade Et2O frío (15 ml), separándose un líquido oscuro
que se decanta y lava con Et2O (15 ml) y pentano (10 ml), obteniendo un sólido
naranja. Este crudo se purifica mediante HPLC de fase reversa obteniendo el producto
69 como un sólido naranja (42 mg, 0,048 mmol). Pureza determinada por HPLC: 95%
Rdto: 16%
Procedimiento para la purificación mediante HPLC:
Columna: Atlantis® Prep T3 OBDTM 5 μm, 19 x 150 mm, de Waters.

Fase móvil: Eluyente A (H2O, 10 mM AcONH4, pH 4,5). Eluyente B (Acetonitrilo).
Perfil de elución preparativo: 0’-2’ (25% B); 2’-40’ (25-60% B); 40’-43’ (60% B); 43’-54’
(60-25%); 54’-59’ (25% B). 17 ml/min.
Tiempo de elución: 16,6’.
Longitud de onda de detección: 495 nm.
185
Procedimiento para la determinación de la pureza mediante HPLC:
Columna: Atlantis® T3 5 μm, 4,6 x 150 mm, de Waters.

Perfil de elución: 0’-0.5’ (25% B); 0.5’-55’ (25-60% B); 55’-60’ (60% B); 60’-72’ (60-
25%); 72’-75’ (25% B). 1,0 ml/min.
100
Intensidad normalizada (%)
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (min)
Figura 90 – Traza de HPLC de la sonda C2-BDP 69 purificada mediante HPLC. Área de la señal
principal: 95%.
1
H RMN (600 MHz, DMSO-d6): δ = 1,38 (s, 6H, CH3(py)), 1,57 (m, 3J(H,H) = 6,9 Hz, 2H,
NCH2CH2CH2NHCO), 1,62 (br, 8H, NCH2CH2CH2NH(Sq)), 2,08 (s, 3H, CH3N), 2,3-2,5 (br,
10H, CH2N), 2,44 (s, 6H, CH3(py)), 3,17 (q, 3J(H,H) = 6,4 Hz, 2H, CH2NHCO), 3,50 (br, 8H,
CH2NH(Sq)), 4,53 (s, 2H, CH2OAr), 6,16 (s, 2H, CH(py)), 7,13 (d, 3J(H,H) = 8,6 Hz, 2H, Ar),
7,28 (d, 3J(H,H) = 8,6 Hz, 2H, Ar), 7,4-8,0 (br, 4H, NH(Sq)), 8,22 (br, 1H, NHCO). 13C RMN
(75 MHz, DMSO-d6) δ = 13,9, 14,2, 21,7, 25,2, 33,5, 49,7, 52,7, 67,0, 79,2, 115,5, 121,3,
126,6, 129,2, 131,0, 141,9, 142,7, 154,7, 158,2, 167,5, 167,9, 172,8, 182,4. HRMS (ESI)
calc. para 892,4469 (M+Na+; C45H58BF2N9NaO6+) encontrado: 892,4452.
186
C2-FITC 70:
La desprotección del grupo amino de la oligoescuaramida 54 (400 mg, 0,68 mmol) se

prepara como se describe para el compuesto 69. Después se disuelve en DMSO (1 ml)
junto con 240 µl de DiPEA (1,38 mmol). A esta disolución se le añade otra disolución de
FITC (Fluoresceína 5-isotiocianato) 56 (266 mg, 0,68 mmol) y se mantiene la mezcla
con agitación durante 120 horas bajo una atmósfera de argón y protegido de la luz. La
disolución se filtra y se purifica mediante HPLC de fase reversa, obteniendo el producto
70 como un sólido naranja (118 mg, 0,13 mmol). Pureza determinada por HPLC: 99%
Rdto: 20%
Columna: XBridgeTM Prep C18 OBDTM 5 μm, 19 x 150 mm, de Waters.

Perfil de elución preparativo: 0’-2,5’ (5% B); 2,5’-17,5’ (5-37% B); 17,5’-19,5’ (37% B);
19,5’-22,5’ (37-5%); 22,5’-24,5’ (5% B). 17 ml/min.
Columna: XBridgeTM C18 5 μm, 4,6 x 150 mm, de Waters.

Perfil de elución: 0’-2,5’ (5% B); 2,5’-17,5’ (5-37% B); 17,5’-19,5’ (37% B); 19,5’-22,5’
(37-5%); 22,5’-24,5’ (5% B). 1,0 ml/min.
187
100
Intensidad normalizada (%) 80
60
40
20
0
0 5 10 15 20 25
Tiempo (min)
Figura 91 – Traza de HPLC de la sonda C2-FITC 70 purificada mediante HPLC. Área de la señal
principal: 99%.
1
H RMN (600 MHz, DMSO-d6): δ = 1,67-1,74 (br, 10H, CH2CH2CH2), 2,16 (br, 3H, NCH3),
2,39-2,50 (br, 10H, NCH2), 3,54 (br, 10H, CH2NH(Sq)+CH2NHCS), 6,57-6,68 (m, 7H,
FITC), 7,18 (d, 3J(H,H) = 8,2 Hz, 1H, FITC), 7,52-7,76 (br, 2H, NH), 8,15-8,24 (br, 2H, NH),
9,97 (br, 1H, NH), 10,13 (br, 2H, OH). 13C RMN (75 MHz, DMSO-d6) δ = 25,5, 27,3, 27,7,
49,9, 50,3, 53,6, 83,4, 102,4, 110,2, 110,4, 113,1, 113,8, 117,0, 118,4, 124,9, 128,8,
129,4, 136,7, 141,1, 141,3, 152,5, 160,3, 161,1, 167,9, 168,8, 173,0, 80,3, 182,2. HRMS
(ESI) calc. para 879,3500 (M+H+; C45H51N8O9S+) encontrado: 879,3503.
C2-c3-Sq 71:
La oligoescuaramida 54 (202 mg, 0,34 mmol) se desprotege tal y como se describe

para el compuesto 69. Una vez finalizada la reacción de desprotección se basifica
igualmente con Na2CO3 sólido hasta pH 8, para diluir posteriormente la disolución con
EtOH (10 ml). A esta disolución se añaden 51 µl de escuarato de dietilo 1 (0,34 mmol) y
se mantiene en agitación durante 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente se
reduce el volumen de la disolución a 40 °C y 90 mbar hasta obtener un volumen
aproximado de 5 ml. La disolución se diluye con H2O (10 ml) y se enfría en un baño de
agua-hielo, separando el precipitado resultante por centrifugación. El sólido se lava
después con EtOH (2 x 10 ml) y se seca, obteniendo el producto 71 como un sólido
amarillo pálido (112 mg, 0,18 mmol). Rdto: 54%
188
1
H RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1,36 (t, 3J(H,H) = 6,3 Hz, 3H, CH2CH3), 1,64 (br, 10H,
NCH2CH2CH2NH), 2,11 (s, 3H, NCH3), 2,34-2,45 (br, 10H, NCH2CH2CH2NH), 3,50 (br, 10H,
NCH2CH2CH2NH), 4,63 (q, 3J(H,H) = 6,3 Hz, 2H, CH2CH3), 7,38 (br, 4H, NHCCNH), 8,59
(br, 0,5H, NHaCCO), 8,79 (br, 0,5H, NHbCCO). 13C RMN (75 MHz, DMSO-d6-HCl) δ = 15,9,
24,4, 24,8, 25,1, 25,5, 40,9, 49,7, 50,1, 52,7, 69,2, 168,1, 174,0, 182,5, 184,4, 184,8.
HRMS (MALDI-TOF) calc. para 614,3297 (M+H+; C30H44N7O7+) encontrado: 614,3320.
C2-Pyr 72:
La obtención de la amina libre a partir de la oligoescuaramida cíclica 54 (50 mg, 0,085

mmol) se realiza del mismo modo que se ha descrito para el producto 69. Al crudo de
reacción de la desprotección se añade EtOH (1,9 ml) y se basifica con una disolución de
Na2CO3 saturada hasta pH 8,4. A esta disolución se añade después DiPEA (44 µl, 0,25
mmol) y se mantiene en agitación durante unos minutos. Posteriormente se añade el
éster derivado del pireno 58 (33 mg, 0,093 mmol) disuelto en una mezcla EtOH:DMF
(1,8 ml y 0,5 ml respectivamente). Esta mezcla de reacción se agita a 40 °C durante 2
horas y posteriormente 60 horas a temperatura ambiente. El precipitado se filtra y se
lava con EtOH (7 ml), una mezcla EtOH:H2O (1:1, 7 ml) y acetona (7 ml). El crudo se
purifica mediante HPLC de fase reversa, obteniendo el producto 72 como un sólido
blanco (53 mg, 0,066 mmol). Pureza determinada por HPLC: 65% Rdto: 78%
Columna: XBridgeTM Prep C18 OBDTM 5 μm, 19 x 150 mm, de Waters.

Perfil de elución preparativo: 0’ (10% B); 0’-20’ (10-50% B); 20’-22’ (50% B); 22’-24’
(50-10%); 24’-27’ (10% B). 17 ml/min.
Columna: XBridgeTM C18 5 μm, 4,6 x 150 mm, de Waters.

Perfil de elución: 0’ (10% B); 0’-20’ (10-50% B); 20’-22’ (50% B); 22’-24’ (50-10%); 24’-
27’ (10% B). 1,0 ml/min.
189
100
Intensidad normalizada (%)
80
60
40
20
0
0 5 10 15 20 25
Tiempo (min)
Figura 92 – Traza de HPLC de la sonda C2-Pyr 72 purificada mediante HPLC. Área de la señal principal:
65%.
1
H RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1,60 (br, 10H, CH2CH2CH2), 2,09 (br, 3H, NCH3), 2,34
(br, 10H, NCH2), 3,47 (br, 10H, CH2NH(Sq)), 5,50 (br, 2H, NHCH2(pyr)), 7,33 (br, 3H, NH),
8,0-8,5 (m, 10H, pyr+NH). 13C RMN (75 MHz, DMSO-d6 + HCl) δ = 25,0, 25,4, 40,8, 44,9,
49,7, 52,6, 123,0, 124,0, 124,2, 125,2, 125,4, 125,6, 126,5, 126,7, 127,5, 128,1, 130,4,
130,6, 130,9, 132,3, 167,8, 168,0, 182,4, 182,6. HRMS (MALDI-TOF) calc. para 799,3926
(M+H+; C45H51N8O6+) encontrado: 799,3900.
[C2-Me2]·[I2] 73:
Sintetizado según se describe en la bibliografía.70
190
[C2-Me2]·[Cl2] 74:
La sal de yodo 73 (204 mg, 0,28 mmol) se disuelve en H2O (15 ml) y la solución se filtra
para eliminar restos insolubles. Se añade una disolución acuosa de NH4PF6 (0,4 ml,
1,2M) obteniendo un precipitado amarillo que se filtra y lava con H2O (5 ml). El
precipitado se suspende en agua destilada (10 ml) y se añade una resina de
intercambio iónico en su forma cloruro (Amberlite® IRA-400, 0,5 g). La mezcla se agita
suavemente durante 24 horas, se filtra y la disolución acuosa se liofiliza para obtener el
producto 74 como un sólido blanco (120 mg, 0,22 mmol). Rdto: 78%
3.9.2 Obtención de espectros de absorción-emisión
Para la caracterización y evaluación de las sondas fluorescentes sintetizadas se utilizan

las alícuotas purificadas mediante HPLC según los procedimientos descritos.
Los compuestos C2-BDP 69, C2-FITC 70 y C2-Pyr 72 se disuelven en DMSO para obtener
disoluciones a una concentración 1,0x10-3 M. Las disoluciones de las sondas C2-BDP 69
y C2-FITC 70 se diluyen posteriormente hasta una concentración de 1,0x10-5 M y
5,0x10-6 M en PBS a pH 7,4, añadiendo DMSO si es necesario para mantener su
proporción en un 1%. En el caso de la sonda C2-Pyr 72 se diluye la disolución inicial a
una única concentración 5x10-5 M en PBS a pH 7,4 manteniendo en este caso la
proporción de DMSO al 5%.
De la muestra más concentrada de cada producto se obtiene su espectro ultravioleta-

visible en el intervalo entre 240 y 750 nm, determinando los máximos de absorción
absolutos y relativos.
Con las muestras más diluidas se obtienen los espectros de emisión fluorescente,
adquiriendo dichos espectros en el intervalo comprendido entre 20 nm menos que la
longitud de onda de excitación y 750 nm. Las longitudes de onda de excitación
utilizadas para cada sonda han sido de 465 nm para la sonda C2-BDP 69, 470 nm para
la sonda C2-FITC 70 y 370 nm para la sonda C2-Pyr 72.
191
3.9.3 Variación de la fluorescencia en función del pH
Se disuelven los compuestos C2-BDP 69 y C2-FITC 70 en DMSO para obtener

disoluciones 1,0x10-3 M. Éstas se diluyen en DMSO hasta una concentración 5,0x10-4
M.
Por otra parte se preparan disoluciones acuosas en el intervalo de pH entre 3 y 11.

Para ello se diferencian tres condiciones en función del pH deseado. Para obtener
disoluciones con un pH inferior a 4 se adicionan, a 20 ml de una disolución acuosa 0,1
M de NaCl, 500 µl de AcOH glacial. Posteriormente se ajusta el pH mediante la adición
de alícuotas de HCl 0,1 M. Para las disoluciones con un pH comprendido entre 4 y 10,
se adicionan 500 µl de AcOH glacial o de una disolución de NH3 al 32% en función del
pH deseado y se ajusta finalmente con la adición de alícuotas de NH3 o AcOH según
corresponda. Finalmente para las disoluciones con pH mayor a 10, se adicionan 500 µl
de una disolución de NH3 al 32% y se ajusta el pH con la adición de una disolución de
NaOH 0,1 M.
Posteriormente se trasvasan 3960 µl de las disoluciones preparadas junto con 40 µl de

la disolución de la sonda fluorescente en DMSO, obteniendo una concentración final
de 5,0x10-6 M, con un 1% de DMSO.
Las muestras recién preparadas se mantienen durante 5 minutos a una temperatura

de 37 °C protegidas de la luz. Los espectros correspondientes se registran por
triplicado para asegurar la fiabilidad de la lectura. La excitación se realiza a 465 nm en
el caso de la sonda C2-BDP 69 y a 470 nm para la sonda C2-FITC 70.
La intensidad de fluorescencia se calcula como la integral de la curva de emisión en el

intervalo de longitudes de onda de dicha curva según la fórmula:
∑ [ ] ( ) (Ec. 2)
3.9.4 Cálculo de los rendimientos cuánticos
El cálculo del rendimiento cuántico se lleva a cabo obteniendo en primer lugar

espectros absorción mediante espectrometría UV-Vis y espectros de emisión mediante
fluorimetría. Las disoluciones utilizadas en ambas técnicas son las mismas.
La ecuación para calcular el rendimiento cuántico (Φ) mediante comparación con un

estándar es la siguiente:
(Ec. 7)
Siendo Flλ el área integrada de la banda de emisión de la muestra (M) y el estándar (E),
a una longitud de onda λ determinada. Absλ corresponde a la absorbancia a esa
192
longitud de onda, λex se refiere a la intensidad de la lámpara de excitación, y η es el

índice de refracción del disolvente.
Sin embargo, los términos que hacen referencia a la intensidad de la lámpara y el

índice de refracción son fácilmente despreciables al comparar valores obtenidos a la
misma longitud de onda de excitación y utilizar disoluciones acuosas, como en este
caso. Por lo que se obtiene la ecuación 3.
(Ec. 3)
La determinación del rendimiento cuántico se ha llevado a cabo en dos condiciones

diferentes de pH, por una parte a 7,4 utilizando PBS, y por otra parte a pH 5,5
utilizando un tampón de cacodilato sódico a una concentración 0,01 M.
Las disoluciones de los estándares se preparan según las condiciones específicas para
cada fluoróforo, ajustando las concentraciones de muestreo experimentalmente para
obtener lecturas de absorbancia inferiores a 0,1 en el intervalo de longitudes de onda
estudiadas, evitando de este modo los efectos de filtro interno debidos a la
concentración. Las sondas fluorescentes sintetizadas se diluyen igualmente en las dos
condiciones propuestas, a una concentración a la cual su absorbancia en el intervalo
de longitudes de onda de interés para el cálculo del rendimiento cuántico sea inferior a
0,1. En el caso de las sondas C2-BDP 69 y C2-FITC 70 se utiliza un 1% de DMSO,
mientras que para la sonda C2-Pyr 72 se incrementa hasta el 5%. Para todos los
productos se obtienen tres concentraciones diferentes excepto para las muestras C2-
FITC y C2-Pyr en el tampón cacodilato, donde se obtienen únicamente dos.
En la tabla 15 se resumen las concentraciones usadas para obtener los espectros de

absorción y emisión.
Tabla 15 – Concentraciones de los estándares y las sondas sintetizadas utilizadas para la obtención
de los rendimientos cuánticos.
Fluoróforo Disolvente Conc. 1 (M) Conc. 2 (M) Conc. 3 (M)
-7 -7
Oregon Green 488 0,1 M T. borato, pH 9 3,0x10 7,0x10 1,0x10-6
C2-BDP 69 PBS, pH 7,4 3,0x10-7 7,0x10-7 1,0x10-6
C2-BDP 69 T. cacodilato, pH 5,5 3,0x10-7 7,0x10-7 1,0x10-6
C2-FITC 70 PBS, pH 7,4 3,0x10-7 7,0x10-7 1,0x10-6
C2-FITC 70 T. cacodilato, pH 5,5 1,0x10-6 1,4x10-5 -
Sulfato de quinina HClO4, 0,1 M 1,0x10-6 5,0x10-6 1,0x10-5
C2-Pyr 72 T. cacodilato, pH 5,5 3,0x10-5 5,0x10-5 -
Los espectros de emisión de los estándares y las muestras se obtienen con longitudes
de excitación cercanas a los máximos de absorción de los productos a intervalos de 5
nm, obteniendo en el caso de la sonda C2-BDP 69 lecturas entre 450 y 520 nm, el
193
mismo intervalo que en el caso de la sonda C2-FITC 70, y entre 345 y 370 nm en el caso
de la sonda C2-Pyr 72.
Una vez registrados los espectros de emisión se obtiene la intensidad de fluorescencia

calculando la integral de la banda de emisión según la ecuación 3 descrita
anteriormente y se comparan los pares de valores de la muestra y el estándar
correspondiente a una longitud de onda determinada.
Las múltiples concentraciones obtenidas permiten asegurar la exactitud de los valores

obteniendo de este modo hasta nueve valores del rendimiento cuántico para cada
longitud de onda, para cada muestra y cada condición.
3.9.5 Fotoestabilidad de la sonda C2-BDP 69 en PBS
Para comprobar la fotoestabilidad de la sonda C2-BDP 69, se adquiere el espectro de

emisión de la sonda a una concentración 5,0x10-6 M en PBS/1% DMSO a 25 °C. El
registro del espectro se realiza en intervalos de 1 nm con un tiempo de lectura de 0,2
segundos/nm. La longitud de onda de excitación es de 460 nm y el voltaje del
fotomultiplicador (PMT) se fija a 600 V. Se realizan adquisiciones sucesivas cada cinco
minutos hasta obtener un tiempo acumulado de 6 horas.
3.9.6 Obtención de las constantes termodinámicas de los compuestos fosforilados
Las constantes termodinámicas por ITC de los fosfatos modelo se obtienen, a una
temperatura de 298 K, mediante la adición de una disolución de HCl a una disolución
acuosa del fosfato estudiado. Las disoluciones de fosfatos se obtienen a partir de las
diferentes sales sódicas de los fosfatos, disódicas en el caso de AMP y M6P, y trisódica
en el caso de la FBP, mediante disolución en agua recién destilada. La fosfocolina se
usa como sal de calcio. Las condiciones definitivas utilizadas se resumen en la tabla 16.
Tabla 16 – Concentraciones de fosfato y de HCl utilizadas para las valoraciones mediante ITC.
Fosfato [Fosfato] mM [HCl] mM
AMP 6,6 69,3
M6P 1,82 9,0
FBP 2,0 15,0
PCh 1,84 9,0
Previo al inicio de la valoración, las muestras se desgasifican durante cinco minutos al

vacío.
194
3.9.7 Obtención de las constantes termodinámicas de los complejos 74·Fosfato
Del mismo modo se realiza la valoración de una mezcla de la oligoescuaramida 74 y los

fosfatos en diferente proporción en disolución acuosa, a 298 K, y utilizando las
concentraciones que se indican en la tabla 17.
Tabla 17 – Concentraciones de oligoescuaramida cíclica (receptor), fosfato (huésped) y HCl utilizadas

para realizar las valoraciones mediante ITC.
Receptor [Receptor] mM Huésped [Huésped] mM [74]:[PO42-] [HCl] mM
74 6,0 AMP 2,0 3:1 9,0
74 6,0 M6P 1,8 3,3:1 9,0
74 6,0 FBP 2,0 3:1 15,0
74 6,0 PCh 1,8 3,3:1 9,0
195
196

1
H-RMN 69 (DMSO-d6)
13
C-RMN 69 (DMSO-d6)
197
1
H-1H TOCSY 2D RMN (DMSO-d6)
1
H-1H NOESY 2D RMN (DMSO-d6)
198
1
H-13C HSQC 2D RMN (DMSO-d6)
1
H-13C HMBC 2D RMN (DMSO-d6)
199
1
H-RMN 70 (DMSO-d6)
13
C-RMN 70 (DMSO-d6)
200
1
H-RMN 72 (DMSO-d6)
13
C-RMN 72 (DMSO-d6)
201
202
Publicación derivada de este capítulo:
“Cell Uptake and Localization Studies of Squaramide Based Fluorescent

Probes”
Angel Sampedro, Ruth Villalonga-Planells, Manuel Vega, Guillem Ramis, Silvia
Fernández de Mattos, Priam Villalonga, Antoni Costa and Carmen Rotger
Bioconjugate Chem. 2014, 25, 1537-1546.
Abstract
Cell internalization is a major issue in drug design. Although squaramide-based
compounds are receiving much attention because of their interesting bioactivity, cell
uptake and trafficking within cells of this type of compounds are still unknown. In
order to monitor the cell internalization process of cyclosquaramide compounds we
have prepared two fluorescent probes by covalently linking a fluorescent dye (BODIPY
derivative or fluorescein) to a
noncytotoxic cyclosquaramide
framework. These two probes (C2-
BDP and C2-FITC) rapidly internalize
across live cell membranes through
endocytic receptor-mediated
mechanisms. Due to its higher
fluorescence and photochemical
stability, C2-BDP is a superior dye
than C2-FITC. C2-BDP remains
sequestered in late endosomes
allowing their fast and selective
imaging in various live cell types.
Cyclosquaramide–cell membrane
interactions facilitate cell uptake and
have been investigated by binding
studies in solution as well as in live
cells. Cyclosquaramide 1 (C2-BDP)
can be used as a highly fluorescent
probe for the rapid and selective
imaging of late endosomes in live
cells.
203
212
CAPÍTULO 4
ESPACIADORES AUTOINMOLATIVOS
214
4. Espaciadores autoinmolativos
4.1 Motivación del capítulo

En el capítulo anterior se ha demostrado que la oligoescuaramida cíclica marcada C2-
BDP 69 se internaliza en las células atravesando de forma rápida la membrana
citoplasmática y se acumula en los endosomas tardíos con un bajo nivel de toxicidad
(Fig. 93).141
Figura 93 – Internalización de la oligoescuaramida cíclica C2-BDP (verde).
La oligoescuaramida cíclica, por tanto, realiza una función transportadora de los

grupos fluoróforos conjugados, similar a la que realizan otros sistemas como son por
ejemplo los péptidos de penetración celular (CPPs), las nanopartículas o los liposomas,
con capacidad para la internalización de fármacos. En muchas ocasiones, cuando se
utilizan sistemas de transporte para la administración y distribución de fármacos, es
necesario liberar el fármaco de su unión con el transportador, ya que ligado, su
actividad se ve inhibida o reducida en gran medida. Debido a ello, es necesario que se
produzca la rotura selectiva de la unión entre el transportador y el fármaco una vez
alcanzada la diana terapéutica. Para alcanzar este objetivo, se pueden seguir diversas
estrategias, pero el uso de espaciadores autoinmolativos constituye una alternativa
muy efectiva a la hora de desarrollar sistemas con enlaces lábiles que permitan la
liberación de moléculas de forma controlada.
En esta introducción se describen inicialmente las estrategias seguidas para la

internalización de fármacos evitando diversos inconvenientes como degradación
prematura, baja internalización, o la búsqueda de mayor especificidad mediante el uso
de receptores específicos de membrana. A continuación, la introducción se orienta
hacia los sistemas autoinmolativos, responsables de la liberación, bajo estímulos
selectivos, de las cargas, describiendo las diferentes estructuras que componen estos
sistemas, incluyendo en este caso los transportadores.
141
Sampedro, A.; Villalonga-Planells, R.; Vega, M.; Ramis, G.; Fernández de Mattos, S.; Villalonga, P.;
Costa, A.; Rotger, C.; Cell Uptake and Localization Studies of Squaramide Based Fluorescent Probes.
Bioconjugate Chem., 2014, 25, 1537-1546.
215
Posteriormente, ya en la discusión de resultados, se describe el diseño, síntesis y

optimización de un nuevo sistema autoinmolativo basado en la unidad escuaramida.
Además se evalúa la eficacia del nuevo espaciador en diferentes condiciones, teniendo
siempre presente la aplicabilidad del sistema en entornos biológicos (Fig. 94).
Figura 94 – Diseño general de un sistema autoinmolativo escuaramídico. La escuaramida se encuentra

unida por una parte a la carga y por la otra a un sensor capaz de detectar unas determinadas
condiciones propias de un entorno intracelular. De esta forma, al detectar esta activación, se libera la
carga mediante un proceso autoinmolativo.
Tal y como se ejemplifica en la figura anterior, este sistema debe ser estable en unas
condiciones similares a las que se encuentran en un medio extracelular, mientras que
las condiciones intracelulares deben provocar la liberación y activación de la carga.
4.2 Introducción
Muchos fármacos presentan problemas relacionados con su administración tales como
limitada solubilidad, la imposibilidad de atravesar la membrana celular, poca
especificidad o la acción de determinados enzimas que pueden inutilizar el fármaco y
reducir su biodisponibilidad, es decir, una farmacocinética inadecuada.142,143
Para evitar estos inconvenientes los fármacos se administran como derivados o

conjugados, que presentan unas propiedades metabólicas, farmacológicas, o
farmacocinéticas diferentes a las del fármaco en sí mismo. Cuando estas estructuras
alcanzan su diana terapéutica sufren una transformación, bien sea mediante enzimas
específicas o mediante estímulos concretos, como por ejemplo un pH determinado o el
potencial redox, transformando el compuesto administrado en el fármaco con
actividad terapéutica. Al fármaco modificado estructuralmente y que no presenta las
mismas propiedades que éste, capaz además de generar in situ el fármaco en cuestión,
se le denomina profármaco (Esquema 51).
142
Wong, A. D.; DeWit, M. A.; Gillies, E. R.; Amplified release through the stimulus triggered degradation
of self-immolative oligomers, dendrimers, and linear polymers. Adv. Drug Deliver. Rev., 2012, 64, 1031-
1045.
143
Stella, V. J.; Charman, W. N. A.; Naringrekar, V. H.; Prodrugs: Do they have Advantages in Clinical
Practice?. Drugs, 1985, 29, 455-473.
216
Esquema 51 – Estrategia seguida para aumentar la biodisponibilidad de la ampicilina mediante su

administración como profármaco. Una vez en el organismo las esterasas del organismo provocan una
degradación de la estructura adquiriendo su actividad terapéutica.
Por ejemplo, la bacampicilina mostrada en la figura anterior es un profármaco de la

ampicilina, un antibiótico betalactámico derivado de la penicilina. El profármaco
administrado oralmente experimenta una mayor tasa de absorción que el propio
fármaco, hidrolizándose posteriormente por la acción de esterasas y aumentando por
tanto su acción antibiótica.144
En ocasiones, para modificar las propiedades del fármaco, éste se combina con una
molécula con capacidad para atravesar las barreras biológicas y a la que se denomina
transportador. La unión de ambas estructuras se realiza con el objetivo de que el
conjugado fármaco-transportador atraviese la membrana citoplasmática sin dificultad
mediante un proceso de transporte transmembrana facilitado. Al igual que en el caso
general, la actividad del fármaco puede verse anulada por el transportador,
considerándose también en este caso un profármaco (Fig. 95).
144
Bodin, N. O.; Ekström, B.; Forsgren, U.; Jalar, L. P.; Magni, L.; Ramsay, C. H.; Sjöberg, B.; Bacampicillin,
a New Orally Well-Absorbed Derivative of Ampicillin. Antimicrob. Agents Chemother., 1975, 8, 518-525.
217
Figura 95 – Representación de un fármaco y los beneficios que aporta la estructura del profármaco. En
el caso que la barrera terapéutica corresponda a la membrana celular se habla de transporte facilitado,
pudiendo ser también un profármaco o no en función del transportador.
En cualquiera de los casos estos sistemas permiten superar las limitaciones

farmacológicas o farmacocinéticas que experimentan los fármacos por sí solos, y
mencionados anteriormente.
Los fármacos administrados como profármacos, requieren de la acción de un estímulo

específico para presentar su actividad. En el caso de la bacampicilina, mostrada
anteriormente, el éster carbónico se encuentra cerca del núcleo β-lactámico. Si bien en
este caso concreto esto no supone un problema para la acción de las esterasas
implicadas en su hidrólisis. Sin embargo, en otros casos es necesaria la inclusión de un
espaciador entre el grupo funcional susceptible de sufrir el estímulo y la carga
proactiva. Una vez activado el sistema, estos espaciadores evolucionan de forma
autónoma liberando al fármaco. Estos espaciadores se denominan autoinmolativos.
4.3 Sistemas autoinmolativos

Un sistema autoinmolativo es aquel que, después de ser activado por un estímulo
externo, desencadena una cascada de reacciones intramoleculares que provocan la
liberación de una carga. El grupo sensible de sufrir la activación del sistema es lo que
se denomina gatillo (Fig. 96).
Figura 96 – Representación de un sistema autoinmolativo activado mediante un estímulo externo, que

activa el gatillo, y éste a su vez la liberación de la carga.
218
La presencia de un transportador no es un componente intrínseco de un sistema

autoinmolativo, sin embargo, los transportadores permiten facilitar la internalización
de los fármacos.
A continuación se describen las características y se exponen ejemplos bibliográficos de

las diferentes secciones que componen un sistema compuesto por un transportador y
un espaciador autoinmolativo.
4.3.1 Transportadores
En un sistema transportador-espaciador-carga, el transportador es la porción

molecular responsable de la internalización celular, aportando también en muchos
casos la especificidad hacia la diana terapéutica. Se pueden clasificar los
transportadores en función de si presentan una especificidad hacia determinados
receptores o bien si únicamente facilitan la internalización ya sea por sus propias
características estructurales o por las posibilidades de funcionalización que presentan,
como ocurre por ejemplo con determinados nanomateriales como los nanotubos o las
nanopartículas metálicas.
4.3.1.1 Transportadores no específicos o funcionalizables: nanomateriales
Los dendrímeros, nanotubos, liposomas, nanopartículas metálicas o incluso las

proteínas pueden considerarse nanomateriales. Estos sistemas, en función de sus
propiedades superficiales y tamaño pueden activar mecanismos de internalización no
selectivos o simplemente actuar como transportadores de la carga, acumulándose en
determinados lugares.
Este tipo de estructuras han demostrado que pueden solventar los problemas
asociados a los fármacos habituales, tales como mejorar su solubilidad, prolongar el
tiempo de permanencia en el organismo, mejorar su biodistribución y evitar
respuestas inmunes por parte del receptor. Estas propiedades son fruto de la
posibilidad de funcionalizar su superficie con diferentes sustancias tales como
pequeñas moléculas orgánicas, péptidos, anticuerpos, ácidos nucleicos, etc. que
estimulan el reconocimiento por parte de receptores específicos. Por otra parte
también pueden funcionalizarse con diferentes fármacos o agentes de diagnóstico,
tales como agentes de contraste, lo que habilita la terapia de combinación, útil para
evitar la resistencia a determinados fármacos, o la evaluación a tiempo real de la
eficacia del tratamiento (Fig. 97).145
145
Sun, T.; Zhang, Y. S.; Pang, B.; Hyun, D. C.; Yang, M.; Xia, Y.; Engineered Nanoparticles for Drug
Delivery in Cancer Therapy. Angew. Chem. Int. Ed.; 2014, 53, 12320-12364.
219
Figura 97 – Representación esquemática de diferentes nanoestructuras con aplicaciones terapéuticas.

Imagen reproducida de J. Control. Release, Vol. 200, Nanomedicine in cancer therapy: Challenges,
opportunities, and clinical applications, Pag. 138-157, Copyright 2015, con permiso de Elsevier.
Las propiedades de funcionalización de las nanopartículas permiten establecer un nexo

de unión entre la unidad encargada del reconocimiento, y el sistema autoinmolativo,
lo que en la práctica lleva, por ejemplo, a la internalización efectiva de múltiples
drogas para un tratamiento más eficaz de enfermedades como el cáncer, VIH o
infecciones bacterianas.146
Un ejemplo de un sistema de transporte inespecífico, capaz de provocar una liberación

controlada y de forma prolongada es el descrito por K. Cheng y colaboradores. En este
caso usan una nanopartícula inorgánica hueca, con poros de entre 2 y 4 nm de
diámetro. El fármaco utilizado es el cisplatino, un antitumoral inespecífico de células
tumorales. La carga de la nanopartícula se realiza mediante su dispersión en una
disolución concentrada de cisplatino, favoreciendo de esta forma la incorporación del
fármaco a la nanopartícula por difusión. Una vez se administra la nanopartícula a un
146
Wang, A. Z.; Gu, F.; Zhang, L.; Chan, J. M.; Radovic-Moreno, A.; Shaikh, M. R.; Farokhzad, O. C.;
Biofunctionalized targeted nanoparticles for therapeutic applications. Expert Opin. Biol. Ther., 2008, 8,
1063-1070.
220
organismo, el cisplatino fluye a través de los poros lentamente con un tiempo medio
de difusión de 16 horas en medios básicos o neutros, acelerando el proceso en medios
ácidos. Aprovechando la capacidad de funcionalización de estas nanopartículas, se han
conjugado con Herceptina, un anticuerpo específico de HER2, un receptor
sobreexpresado en la superficie de algunas líneas tumorales. De esta forma se
consigue un reconocimiento de la nanopartícula por un receptor específico
sobreexpresado en una línea tumoral, liberando el fármaco de forma prolongada en
ese lugar concreto (Fig. 98).147
Figura 98 – Representación de la nanopartícula porosa de acción prolongada para el tratamiento

147
selectivo con cisplatino.
Los niveles de toxicidad de los nanomateriales, en especial de las nanopartículas

metálicas, además de su dificultad y elevado coste de síntesis, son los principales
inconvenientes a los que se enfrentan estos compuestos y lo que ha motivado la
búsqueda de otras alternativas.148, 149
4.3.1.2 Transportadores específicos
En los últimos años la terapia contra el cáncer se orienta hacia la dotación de una
selectividad específica hacia determinados receptores de membrana sobreexpresados
en las células tumorales, como método para evitar la falta de especificidad de la
quimioterapia tradicional. Ésta parte del principio general según el cual es más
147
Cheng, K.; Peng, S.; Xu, C.; Sun, S.; Porous Hollow Fe3O4 Nanoparticles for Targeted Delivery and
Controlled Release of Cisplatin. J. Am. Chem. Soc., 2009, 131, 10637-10644.
148
Buzea, C.; Pacheco Blandino, I. I.; Robbie, K.; Nanomaterials and nanoparticles: Sources and toxicity.
Biointerphases, 2007, 2, MR17-MR172.
149
Yah, C. S.; Simate, G. S.; Iyuke, S. E.; Nanoparticles toxicity and their routes of exposures. Pak. J.
Pharm. Sci., 2012, 25, 477-491.
221
probable eliminar células cancerígenas, que proliferan más rápidamente y carecen de

los sistemas de control oportunos, que las células sanas. De este modo, los agentes
citotóxicos clásicos carecen de especificidad y causan importantes efectos secundarios
como resultado de la acción sobre células sanas, especialmente sobre aquellas que se
dividen rápidamente como células hematopoyéticas, epiteliales e intestinales.
Para dotar de selectividad a los agentes terapéuticos se recurre en muchos casos al

uso de ligandos naturales cuyos receptores se hallan sobreexpresados en las
membranas de las células tumorales. Dos de los ejemplos más representativos son el
ácido fólico150,151,152 y la biotina (Fig. 99).153,154,155 En el primer caso el receptor folato
se encuentra sobreexpresado en una mayoría de tejidos cancerosos mientras que su
expresión es más limitada en células de tejidos sanos,156 de forma que, la interacción
ácido fólico-receptor folato puede utilizarse para el reconocimiento selectivo de
células cancerosas.
Figura 99 – Estructuras del ácido fólico (izquierda) y la biotina (derecha).
En un ejemplo concreto, de R. I. Pinhassi y colaboradores, se ha conjugado un

polisacárido, que actúa como transportador, con ácido fólico y metotrexato, un
inhibidor competitivo de ácido fólico. Además se ha incluido en la estructura un
compuesto citotóxico para poder cuantificar la internalización del conjugado. Para el
estudio se ha utilizado una línea celular que no sobreexpresa el receptor de folato por
sí misma, junto con la misma línea celular a la que le ha sido transfectado la
información genética para expresar dicho receptor. De esta forma, el tratamiento de
ambas versiones de la línea celular con el conjugado sintetizado ha demostrado un
incremento en la actividad antiproliferativa de más de seis veces en el caso de la línea
150
Henne, W. A.; Doorneweerd, D. D.; Hilgenbrink, A. R.; Kularatne, S. A.; Low, P. S.; Synthesis and
activity of a folate peptide camptothecin prodrug. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2006, 5350-5355.
151
Liang, X. H.; Sun, Y.; Liu, L. S.; Zha, Y. Y.; Hu, X. Y.; Fan, J.; Regioselective synthesis and initial
evaluation of a folate receptor targeted rhaponticin prodrug. Chin. Chem. Lett., 2012, 1133-1136.
152
Yang, J. J.; Kularatne, S. A.; Chen, X.; Low, P. S.; Wang, E.; Characterization of in Vivo Disulfide-
Reduction Mediated Drug Release in Mouse Kidneys. Mol. Pharmaceutics, 2012, 9, 310-317.
153
Marchand-Brynaert, J.; Bouchet, M.; Touillaux, R.; Beauve, C.; Fastrez, J.; Design and Synthesis of a
Bifunctional Label for Selection of ß-Lactamase displayed on Filamentous Bacteriophage by Catalytic
Activity. Tetrahedron, 1996, 52, 5591-5606.
154
Ojima, I.; Guided Molecular Missiles for Tumor-Trageting Chemotherapy-Case Studies Using the
Second-Generation Taxoids as Warheads. Accounts Chem. Res., 2008, 41, 108-119.
155
Yang, W.; Cheng, Y.; Xu, T.; Wang, X.; Wen, L.; Targeting cancer cells with biotin-dendrimer
conjugates. Eur. J. Med. Chem., 2009, 44, 862-868.
156
Yoo, H. S.; Park, T. G.; Folate-receptor-targeted delivery of doxorubicin nano-aggregates stabilized by
doxorubicin-PEG-folate conjugate. J. Control. Release, 2004, 100, 247-256.
222
celular que expresa el receptor de folato respecto a la línea sin el receptor,

demostrando así el beneficio de la internalización selectiva mediante receptores de
membrana (Fig. 100).157
Figura 100 – Estructura del conjugado de metotrexato y ácido fólico donde se indican los valores de IC 50
obtenidos en presencia o ausencia del receptor de folato. Se ha omitido en la representación la
157
estructura del compuesto citotóxico y del sistema de liberación por claridad.
Un ejemplo del uso de la biotina como ligando específico es el del conjugado

sintetizado por I. Ojima,154 formado por una unidad de biotina unida a un grupo
fluoróforo, la fluoresceína, mediante un espaciador. Este compuesto es capaz de
reconocer específicamente una línea celular con una sobreexpresión de los receptores
para la biotina. La internalización del conjugado se detecta mediante la observación de
su señal de fluorescencia. La internalización de este conjugado se inhibe mediante el
tratamiento a 4 °C o bien mediante la saturación previa con biotina, como ligando
competitivo. En dichas condiciones se observa una clara disminución de la señal de
fluorescencia en el interior celular (Fig. 101)
Figura 101 – Estructura del conjugado biotina-fluoresceína, internalizado mediante un proceso

154
endocitótico en líneas celulares que presentan una sobreexpresión de los receptores de bitoina.
157
Pinhassi, R. I.; Assaraf, Y. G.; Farber, S.; Stark, M.; Ickowicz, D.; Drori, S.; Domb, A. J.; Livney, Y. D.;
Arabinogalactan-Folic Acid-Drug Conjugate for Targeted Delivery and Target-Activated Release of
Anticancer Drugs to Folate Receptor-Overexpressing Cells. Biomacromolecules, 2010, 11, 294-303.
223
Además del ácido fólico y la biotina se han utilizado otros ligandos con capacidades
para interaccionar con receptores de membrana específicos como deteminados
azúcares, 158 anticuerpos 159 o péptidos como las secuencias RGD (arginina-glicina-
aspartato),160 o los CPPs ya mencionados en el capítulo anterior.
En general, la idoneidad de un determinado sustrato de reconocimiento para diseñar

un sistema específico viene determinada por la propia línea celular donde ha de actuar
ya que los receptores sobreexpresados dependen de las características de la propia
línea celular. Por ejemplo, los receptores de ácido fólico están sobreexpresados
principalmente en células epiteliales de ovario, tejido nervioso, riñón, mama, colon y
pulmón.157
4.3.2 Gatillos
En un conjunto gatillo-espaciador autoinmolativo-carga, el gatillo es la parte de la

estructura susceptible de experimentar una transformación causada por un estímulo
externo (cambio de pH, enzima, etc.). Un gatillo debe aportar al conjunto del sistema
autoinmolativo estabilidad química en medios fisiológicos y una respuesta selectiva
frente a un determinado estímulo.
Se pueden diferenciar dos grupos principales de gatillos, aquellos que responden a

estímulos enzimáticos, que denominaremos gatillos enzimáticos, y los que responden
a condiciones del medio o determinadas moléculas pequeñas, denominados gatillos no
enzimáticos.
4.3.2.1 Gatillos enzimáticos
La variabilidad en esta categoría podría ser tan amplia como enzimas hay en un
organismo. A modo de ejemplo, el anticuerpo catalítico 38C2 actúa sobre un derivado
de doxorubicina conteniendo el residuo aldólico específico para este anticuerpo, que
interacciona con éste para dar, mediante reacciones de tipo retro-aldólica y retro-
Michael la molécula de doxorubicina libre y productos de degradación que no
presentan toxicidad significativa (Esquema 52).161,162
158
Bhadram D.; Yadav, A. K.; Bhadra, S.; Jain, N. K.; Glycodendrimeric nanoparticulate carriers of
primaquine phosphate for liver targeting. Int. J. Pharm., 2005, 295, 221-233.
159
Shukla, R.; Thomas, T. P.; Peters, J. L.; Desai, A. M.; Kukowska-Latallo, J.; Patri, A. K.; Kotlyar, A.;
Baker, J. R., Jr.; HER2 Specific Tumor Targeting with Dendrimer Conjugated Anti-HER2 mAb.
Bioconjugate Chem., 2006, 17, 1109-1115.
160
Schraa, A. J.; Kok, R. J.; Berendsen, A. D.; Moorlag, H. E.; Bos, E. J.; Meijer, D. K. F.; de Leij, L. F. M. H.;
Molema, G.; Endothelial cells internalize and degrade RGD-modified proteins developed for tumor
vasculature targeting. J. Control. Release, 2002, 83, 241-251.
161
Córdova, A.; Janda, K. D.; Synthesis and Catalytic Antibody Functionalization of Dendrimers. J. Am.
Chem. Soc., 2001, 123, 8248-8259.
162
Amir, R. J.; Popkov, M.; Lerner, R. A.; Barbas III, C. F.; Shabat, D.; Prodrug Activation Gated by a
Molecular “OR” Logic Trigger. Angew. Chem. Int. Ed., 2005, 44, 4378-4381.
224
Esquema 52 – Activación de un sistema autoinmolativo de tipo retroaldólico mediante la acción del

anticuerpo 38C2, liberando el fármaco antitumoral doxorubicina.
Para que este sistema resulte efectivo, en la práctica se administra tanto el sistema
autoinmolativo como el anticuerpo catalítico, que no se produce de forma natural por
el organismo.163 Con el uso de anticuerpos se consigue una inmejorable selectividad ya
que únicamente se obtiene la respuesta del gatillo ante la presencia de este estímulo.
Además, debido a la naturaleza proteica del anticuerpo, su biocompatibilidad está
asegurada.164 El principal inconveniente al que se enfrenta esta metodología es la
obtención de los anticuerpos humanizados, un proceso costoso que en el caso del
38C2 se realiza mediante inmunización reactiva en ratones.
Una segunda aproximación al uso de activadores enzimáticos para la activación del

gatillo más extendida es el uso de derivados del ácido fenilacético como sustratos de la
penicilina-G-amidasa (PGA) (Esquema 53).
Esquema 53 – Sustrato natural de la penicilina-G-amidasa y productos derivados de su acción.
Esta enzima proviene de Escherichia coli y por tanto no se encuentra naturalmente en

mamíferos por lo que su uso se limita al estudio de modelos de actividad
autoinmolativa. En este caso la cinética de liberación del fármaco no depende de la
163
Shabat, D.; Lode, H. N.; Pertl, U.; Reisfeld, R. A.; Rader, C.; Lerner, R. A.; Barbas III, C. F.; In vivo activity
in a catalytic antibody-prodrug system: Antibody catalyzed etoposide prodrug activation for selective
chemotherapy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2001, 98, 7528-7533.
164
Sinha, S. C.; Li, L. S.; Miller, G. P.; Dutta, S.; Rader, C.; Lerner, R. A.; Prodrugs of dynemicin analogs for
selective chemotherapy mediated by an aldolase catalytic Ab. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2004, 101,
3095-3099.
225
actividad enzimática en si misma si no que puede relacionarse con la cascada de

reacciones que siguen a la activación.165,166,167
Un ejemplo del uso de este gatillo es el desarrollado por A. Gopin y colaboradores,168

donde, mediante el uso del ácido fenilacético y la enzima PGA, se libera camptotecina
de un copolímero sintético, demostrando de este modo la aplicabilidad del sistema
autoinmolativo y su posible aplicación a una variedad de fármacos o sistemas de
marcaje específicos (Esquema 54).
Esquema 54 – Estructura y mecanismo de liberación del fármaco mediante la acción de la enzima

168
PGA.
En otros casos se utilizan restos de aminoácidos; por ej. leucina para la activación
específica mediante una leucil peptidasa,169 secuencias específicas de aminoácidos
para aumentar la selectividad,170 o grupos amida y/o ésteres susceptibles de ser
hidrolizados mediante enzimas endógenas inespecíficas, obteniendo de esta forma
una liberación localizada en función de la distribución natural de la enzima.
165
Weinstain, R.; Sagi, A.; Karton, N.; Shabat, D.; Self-Immolative Comb-Polymers: Multiple-Release of
Side-Reporters by a Single Stimulus Event. Chem. Eur. J., 2008, 14, 6857-6861.
166
Jin, H.; Lu, J.; Wu, X.; Development of a new enzyme-responsive self-immolative spacer conjugate
applicable to the controlled drug release. Bioorg. Med. Chem., 2012, 20, 3465-3469.
167
Redy, O.; Shabat, D.; Modular theranostic prodrug based on a FRET-activated self-immolative linker.
J. Control. Release, 2012, 164, 276-282.
168
Gopin, A.; Rader, C.; Shabat, D.; New chemical adaptor unit designed to release a drug from a tumor
targeting device by enzymatic triggering. Bioorg. Med. Chem., 2004, 12, 1853-1858.
169
Zhang, X.; Waibel, M.; Hasserodt, J.; An Autoimmolative Spacer Allows First.Time Incorporation of a
Unique Solid-State Fluorophore into a Detection Probe for Acyl Hydrolases. Chem. Eur. J., 2010, 16, 792-
795.
170
Richard, J. A.; Meyer, Y.; Jolivel, V.; Massonneau, M.; Dumeunier, R.; Vaudry, D.; Vaudry, H.; Renard,
P. Y.; Romieu, A.; Latent Fluorophores Based on a Self-Immolative Linker Strategy And Suitable for
Protease Sensing. Bioconjugate Chem., 2008, 19, 1707-1718.
226
4.3.2.2 Gatillos no enzimáticos
En cuanto a los activadores no enzimáticos, hay multitud de estímulos que pueden

provocar la activación del gatillo, siendo los más típicos los cambios de pH, de
potencial redox o de temperatura, o la radiación ultravioleta, entre otros.171
Un sistema autoinmolativo ideal provoca la liberación del fármaco mediante un

estímulo interno al organismo y localizado, consiguiendo una respuesta autónoma y
específica. Dadas estas limitaciones no son muchas las estrategias que se usan con
finalidades terapéuticas. Los grupos funcionales sensibles al pH, tales como iminas,
hidracinas o acetales entre otros, provocan una activación del gatillo en función del
valor del pH del medio. Sin embargo los sistemas biológicos se caracterizan por un
control exhaustivo de la acidez del medio, necesitando cambios bruscos de este valor
para observar una respuesta localizada y significativa. (Esquema 55).
Esquema 55 – Grupos funcionales aptos para formar "gatillos" sensibles al pH y mecanismos de

hidrólisis. Los valores de pH indican a partir de qué valor se produce la hidrólisis.
Por ejemplo, Y. Jin y colaboradores han descrito un sistema autoinmolativo con gatillo
de tipo oxima, formado por terminales hidrofílicos de unidades polietilenglicol (PEG)
unidos por un centro hidrofóbico de policaprolactonas (PCL) y unidas a su vez
mediante oximas.172 Esta molécula se agrega espontáneamente en medios acuosos
formando micelas capaces de almacenar moléculas de doxorubicina. En estado
agregado el conjunto se internaliza mediante endocitosis hasta que la disminución del
171
Fleige, E.; Quadir, M. A.; Haag, R.; Stimuli-responsive polymeric nanocarriers for the controlled
transport of active compounds: Concepts and applications. Adv. Drug Deliver. Rev., 2012, 64, 866-884.
172
Jin, Y.; Song, L.; Su, Y.; Zhu, L.; Pang, Y.; Qiu, F.; Tong, G.; Yan, D.; Zhu, B.; Zhu, X.; Oxime Linkage: A
Robust Tool for the Design of pH-Sensitive Polymeric Drug Carriers. Biomacromolecules, 2011, 12, 3460-
3468.
227
pH medio en los lisosomas (pH ≈ 5) y la consiguiente hidrólisis de los grupos oxima

liberan el fármaco de forma controlada. Los estudios realizados a diferentes valores de
pH muestran que a pH 7,4 se produce una liberación de la carga correspondiente al
20% del total durante las primeras 24 horas, mientras que a pH 5,0 la liberación
aumenta hasta casi un 60% en 24 horas, y a un 80% en 96 horas (Fig. 102).
Figura 102 – Estructura del copolímero y el fármaco, y representación de la formación de la micela,

172
conteniendo la doxorubicina en su interior.
Una alternativa al uso de gatillos sensibles al pH son los puentes de disulfuro. En la

bibliografía se han descrito numerosos ejemplos en los que se utiliza este grupo
funcional como gatillos en sistemas autoinmolativos.
La energía de los enlaces S–S en cadenas alquílicas es del orden de las 70 kcal/mol.173
Se trata de enlaces fuertes, aunque más débiles que los enlaces C–C (83 kcal/mol) o C–
H (99 kcal/mol). Los disulfuros son relativamente estables en condiciones habituales de
sistemas biológicos.
Los puentes disulfuro se usan con frecuencia en sistemas autoinmolativos debido a su

reactividad frente a nucleófilos y en especial frente a otros tioles, como la glutationa
(GSH). La glutationa es un tripéptido natural compuesto por ácido glutámico, cisteína y
glicina (Fig. 103) abundante en el citoplasma (1-10mM) y que tiene un importante
papel como antioxidante natural frente a especies reactivas de oxígeno (ROS) entre
otras funciones.174
173
Oae, S. (Ed); Organic chemistry of sulfur. Springer-Verlag US, 1977.
174
Balendiran, G. K.; Dabur, R.; Fraser, D.; The role of glutathione in cancer. Cell Biochem Funct., 2004,
22, 343-352.
228
Figura 103 – Reactividad de disulfuros frente a nucleófilos (arriba) y estructura del tripéptido glutationa
(abajo).
La alta concentración celular de GSH facilita su uso como estímulo en sistemas

autoinmolativos actuando como nucleófilo frente a "gatillos" disulfuro. En este caso la
ventaja de los gatillos formados por puentes de disulfuro radica en la gran diferencia
que existe en la concentración de GSH entre el citoplasma y el medio extracelular ya
que la concentración extracelular de GSH está entre 1 y 2 µM. Además el medio
extracelular es ligeramente oxidante, lo que se traduce en una gran bioestabilidad de
los puentes disulfuro en medios extracelulares. 175 En la bibliografía se describen
multitud de ejemplos de sistemas autoinmolativos que se activan mediante la rotura
de un enlace disulfuro.176,177 Adicionalmente al GSH, la rotura de enlaces disulfuro en
sistemas biológicos puede originarse por oxidoreductasas como la tioredoxina, por la
proteína disulfuro-isomerasa (PDI) o por otros mecanismos (Fig. 104).178
Figura 104 – Comparación entre un sistema de escisión de enlaces disulfuro mediante nucleófilos, como
por ejemplo GSH (arriba) o un sistema redox (abajo). R corresponde a un sistema transportador.
175
Yuan, L.; Chen, W.; Hu, J.; Zhang, J. Z.; Yang, D.; Mechanistic Study of the Covalent Loading of
Paclitaxel via Disulfide Linkers for Controlled Drug Release. Langmuir, 2013, 29, 734-743.
176
Vlahov, I. R.; Santhapuram, H. K. R.; Kleindl, P. J.; Howard, S. J.; Stanford, K. M.; Leamon, C. P.; Design
and regioselective synthesis of a new generation of targeted chemotherapeutics. Part 1: EC145, a folic
acid conjugate of desacetylvinblastine monohydrazide. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2006, 16, 5093-5096.
177
Santra, S.; Kaittanis, C.; Santiesteban, O. J.; Perez, J. M.; Cell-Specific, Activatable, and Theranostic
Prodrug for Dual-Targeted Cancer Imaging and Therapy. J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, 16680-16688.
178
Yang, J.; Chen, H.; Vlahov, I. R.; Cheng, J. X.; Low, P. S.; Evaluation of disulfide reduction during
receptor-mediated endocytosis by using FRET imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2006, 103, 13872-
13877.
229
En un sistema autoinmolativo transportador de profármacos, la escisión de un enlace

disulfuro, que actúa como gatillo, por medio de un mecanismo redox permite obtener
de forma directa el resto que contiene el tiol libre. Dicha forma es la diseñada para que
mediante la cascada de reacciones prevista el espaciador autoinmolativo evolucione y
libere el fármaco en su forma activa. Por el contrario, cuando se lleva a cabo un ataque
nucleófilo con un tiol sobre el enlace de disulfuro existen dos alternativas de ataque. El
intercambio de tioles que se produce da lugar únicamente en una de las alternativas a
la formación del resto que contiene el profármaco como tiol libre. Esto da lugar a la
liberación parcial del fármaco según el proceso autoinmolativo. El resto del
profármaco se halla aun en forma de enlace de disulfuro y se mantiene en equilibrio
dinámico con otros tioles, lo que permite obtener también el profármaco en su forma
de tiol libre y al final, la liberación total del fármaco (figura 104). De este modo,
mediante el uso de tioles se consigue una liberación más lenta del fármaco que
mediante un sistema reductor pero igualmente eficaz a largo plazo. Debido a la
necesidad de un entorno reductor para la existencia de tioles en un medio fisiológico,
el uso de disulfuros como gatillo permite la identificación de estos entornos, no
observando la evolución del proceso autoinmolativo en medios oxidantes donde los
tioles que actuarían como activadores también se encuentran como disulfuros.
Un último ejemplo de gatillos no enzimáticos es el uso de azidas como sondas de

sulfuro de hidrógeno a nivel celular,179 o de ésteres de ácidos arilborónicos para la
detección de peróxidos (Esquema 56).180,181
179
Esquema 56 – Gatillos no enzimáticos específicos para la detección de ácido sulfhídrico (arriba) y
180
peróxido de hidrógeno (abajo).
179
Chen, B.; Wang, P.; Jin, Q.; Tang, X.; Chemoselective reduction and self-immolation based FRET
probes for detecting hydrogen sulfide in solution and in cells. Org. Biomol. Chem., 2014, 12, 5629-5633.
180
Lo, L. C.; Chu, C. Y.; Development of highly selective and sensitive probes for hydrogen peroxide.
Chem. Commun., 2003, 2728-2729.
181
Sun, X.; Xu, Q.; Kim, G.; Flower, S. E.; Lowe, J. P.; Yoon, J.; Fossey, J. S.; Qian, X.; Bull, S. D.; James, T.
D.; A water-soluble boronate-based fluorescent probe for the selective detection of peroxynitrite and
imaging in live cells. Chem. Sci., 2014, 5, 3368-3373.
230
En los ejemplos propuestos en el esquema anterior, la activación de ambas sondas

moleculares da lugar a especies que evolucionan de manera espontánea provocando
en última instancia una señal cuantificable, como por ejemplo la fluorescencia.
En ocasiones la combinación de un profármaco y un profluoróforo en un mismo

sistema autoinmolativo permite obtener información acerca del lugar de acción del
fármaco mediante la emisión de fluorescencia, ya que ambos se liberan a partir del
mismo estímulo. Esto es lo que se denomina un tratamiento teranóstico.167,177 Un
ejemplo de esta estrategia es el publicado por R. Kumar y colaboradores. 182 En este
caso el sistema consiste en una unidad de reconocimiento como la biotina, un gatillo
derivado del ácido arilborónico, un profármaco como la 5’-desoxi-5-fluorouridina, y un
fluoróforo intercalante como el etidio. Este sistema resulta sensible en un medio rico
en ROS como el existente en las mitocondrias de células tumorales.
Al internalizarse el conjugado gracias a los receptores de biotina, se activa el gatillo

mediante las especies ROS del medio y se libera in situ la 5’-desoxi-5-fluorouridina, que
mediante la acción de la timidina fosforilasa, un enzima presente en una alta
concentración en las células tumorales, convierte este profármaco a 5-fluorouracilo,
un potente agente citotóxico. Por otra parte, los espaciadores autoinmolativos del
conjugado evolucionan liberando el etidio que incrementa su intensidad de
fluorescencia al intercalarse en el ADN de la célula. En conjunto se consigue, además
de un tratamiento selectivo de las células tumorales que sobreexpresan el receptor de
biotina, una señalización in situ del lugar de acción del fármaco (Fig. 105).
182
Kumar, R.; Han, J.; Lim, H. J.; Ren, W. X.; Lim, J. Y.; Kim, J. H.; Kim, J. S.; Mitochondrial Induced and
Self-Monitored Intrinsic Apoptosis by Antitumor Theranostic Prodrug: In Vivo Imaging and Precise
Cancer Treatment. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136, 17836-17843.
231
Figura 105 – Estructura del sistema teranóstico y productos activos liberados como resultado de la
autoinmolación. La fotografía reproducida muestra en la parte superior la imagen de fluorescencia in
vivo de un ratón xenógrafo con un tumor inoculado 4 semanas antes. La fluorescencia observada
corresponde al etidio intercalado 4,5 horas después de la inyección del teranóstico por vía intravenosa.
En la parte inferior se muestran dos ratones, el derecho tratado con el teranóstico y el izquierdo como
control, donde se observa la disminución del tamaño del tumor después de nueve semanas de
182
tratamiento.
4.3.3 Espaciadores autoinmolativos
Los espaciadores autoinmolativos son la parte de la molécula responsable de la

liberación de la carga y por ello son sensibles a la activación del gatillo. El uso de
espaciadores autoinmolativos se ha introducido mayoritariamente y con éxito en
conjugados con gatillos activados por enzimas, incrementando notablemente la
eficacia de éstos gracias a la mayor distancia que existe entre la estructura que
mimetiza el sustrato natural de la enzima y el profármaco, habitualmente de mayor
tamaño y que puede ocasionar un mal reconocimiento por parte de la enzima.183 Otro
183
Dubowchik, G. M.; Firestone, R. A.; Padilla, L.; Willner, D.; Hofstead, S. J.; Mosure, K.; Knipe, J. O.;
Lasch, S. J.; Trail, P. A.; Cathepsin B-Labile Dipeptide Linkers for Lysosomal Release of Doxorubicin from
232
beneficio que aportan los espaciadores autoinmolativos es la posibilidad de actuar

como estructuras adecuadas para la derivatización de estos sistemas permitiendo
aumentar sus funciones; como por ejemplo dotarlo con propiedades teranósticas o
múltiples cargas y conseguir una respuesta amplificada. Más adelante se detalla la
estructura y la actuación de uno de estos sistemas de amplificación.
De forma simplificada, y sin pretender ofrecer una lista exhaustiva de los espaciadores
autoinmolativos descritos en la bibliografía, se puede establecer una clasificación de
los espaciadores autoinmolativos en función de si su mecanismo de evolución es de
eliminación o de ciclación, sin que aparentemente existan beneficios de unos frente a
los otros en cuanto a sus aplicaciones.
En el caso de los espaciadores que evolucionan mediante eliminación, estos lo hacen

de forma espontánea e irreversible mediante una cascada de procesos electrónicos.
Este proceso se caracteriza por un incremento en la entropía del sistema así como por
la formación de productos termodinámicamente estables, como por ejemplo dióxido
de carbono. Habitualmente estos están formados por especies aromáticas
polisustituidas ricas en electrones gracias a un sustituyente donador, como un grupo
amino o hidroxilo, conjugado con un grupo saliente en posición bencílica. Estos
sistemas son inestables en condiciones fisiológicas, lo que asegura una rápida
liberación después de la activación del gatillo (Fig. 106).184,185
Internalizing Immunoconjugates: Model Studies of Enzymatic Drug Release and Antigen-Specific In Vitro
Anticancer Activity. Bioconjugate Chem., 2002, 13, 855-869.
184
Blencowe, C. A.; Russell, A. T.; Greco, F.; Hayes, W.; Thornthwaite, D. W.; Self-inmolative linkers in
polymeric delivery systems. Polym. Chem., 2011, 2, 773-790.
185
Kratz, F.; Müller, I. A.; Ryppa, C.; Warnecke, A.; Prodrug Strategies in Anticancer Chemotherapy.
ChemMedChem, 2008, 3, 20-53.
233
Figura 106 - Espaciadores autoinmolativos que evolucionan mediante eliminación (izquierda),

mecanismo de evolución (centro) y productos resultantes del proceso (derecha). Z, X: N, O.
Los sistemas de amplificación habitualmente utilizan esta estrategia de eliminación,

como se puede comprobar en el ejemplo expuesto más adelante, mediante la adición
de múltiples sustituyentes en las posiciones orto y para del sistema aromático.
En el caso de los sistemas de ciclación, de forma general se caracterizan por la

liberación, resultado de la activación del gatillo, de un nucleófilo latente que actúa
sobre un grupo éster, amida o carbamato, el cual contiene el profármaco enlazado. De
un modo similar al anterior, este proceso de ciclación implica la formación de
fragmentos termodinámicamente estables junto con un incremento de la entropía.
Adicionalmente, los procesos de ciclación implican transferencias de protones, por lo
cual se ven fuertemente influenciados por el pH del medio. Los fragmentos más
habituales para la liberación mediante ciclación son derivados de ésteres de 4-
aminobutanoil o etilendiaminas, debido a la mayor nucleofília del nitrógeno, sin
embargo es común en la bibliografía el uso de los correspondientes alcoholes o tioles
(Fig. 107).184,185
234
Figura 107 - Espaciadores autoinmolativos que evolucionan mediante ciclación (izquierda), mecanismo
de evolución (centro) y productos resultantes del proceso (derecha). X: N, O. Y: C, H.
La combinación de diferentes espaciadores permite obtener sistemas más largos o con

diferentes posibilidades de funcionalización. A modo de ejemplo, el policarbamato
publicado por K. Haba,186 presenta una combinación de cuatro espaciadores, unidos
consecutivamente con la intención de facilitar la acción del anticuerpo 38C2. Además,
el fragmento final de la secuencia de espaciadores permite la amplificación de la señal.
Esto se ha conseguido situando en el extremo del espaciador autoinmolativo una
unidad de 2,4,6-tris(hidroximetil)fenol al que se han unido tres fármacos distintos
(Esquema 57).
186
Haba, K.; Popkov, M.; Shamis, M.; Lerner, R. A.; Barbas III, C. F.; Shabat, D.; Single-Triggered Trimeric
Prodrugs. Angew. Chem. Int. Ed., 2005, 44, 716-720.
235
Esquema 57 - Sistema autoinmolativo activado mediante un anticuerpo catalítico y diseñado para dar
186
lugar a una amplificación de la señal.
En este caso, una vez activado el gatillo por parte del anticuerpo catalítico 38C2, se
degrada el fragmento aldólico, como ya se ha explicado anteriormente, y se libera un
residuo de etilendiamina, responsable del inicio de la cascada de reacciones de
autoinmolación (Esquema 57-A) . En primer lugar se da una reacción de ciclación entre
236
el grupo amino liberado y un grupo carbamato, obteniendo un derivado de

imidazolidinona (Esquema 57-B). De esta forma se elimina el primer espaciador
autoinmolativo, que deja a su vez un grupo p-hidroxibenciloxicarbonilo que conduce a
un proceso espontaneo de eliminación de tipo 1,6-bencilo (Esquema 57-C). La
degradación del segundo espaciador permite la activación del tercero de los
espaciadores del sistema, el cual descarboxila en primera instancia, para liberar a
continuación una unidad de etilendiamina, que cicla del mismo modo que el anterior
(Esquema 57-D). De esta forma se llega a la unidad de amplificación, que mediante los
procesos de eliminación descritos para los sistemas aromáticos conjugados evoluciona
de forma consecutiva en medio acuoso, consiguiendo así, a partir de la activación de
un único gatillo, la liberación de tres fármacos diferentes.
En el siguiente ejemplo, publicado por L. Yuan y colaboradores,175 se combinan las

propiedades de las nanopartículas inorgánicas de sílica, tales como una elevada
resistencia mecánica, alta estabilidad química, resistencia a agentes microbianos,
elevada superficie específica, tamaño de partícula, biocompatibilidad, etc. con su fácil
funcionalización, para desarrollar un sistema transportador de un agente citotóxico, el
paclitaxel, el cual se libera de forma controlada mediante un sistema autoinmolativo
de ciclación. Los grupos silanol presentes en la superficie de las nanopartículas de sílice
permiten enlazar covalentemente el sistema autoinmolativo conteniendo el gatillo, el
espaciador y el profármaco, junto con una unidad de fluoresceína que posibilita el
seguimiento y visualización de las nanopartículas. En este caso el gatillo utilizado es un
puente disulfuro, sensible a tioles libres y entornos reductores, unido a un espaciador
autoinmolativo de ciclación que permite, gracias a la nucleofília del tiol resultante de la
reducción del disulfuro, la liberación de paclitaxel en su forma activa en el interior
celular (Esquema 58).
Esquema 58 - Sistema autoinmolativo transportado mediante nanopartículas de sílica y activado

175
mediante GSH para liberar in situ Paclitaxel y benzotiofenona como subproducto.
237
4.4 Módulos autoinmolativos escuaramídicos

A pesar de que se han desarrollado sistemas autoinmolativos efectivos como son los ya
descritos, éstos resultan estructuras complejas, sintéticamente costosas y en ocasiones
difíciles para su aplicación en clínica, por lo que existe una necesidad de diseñar y
obtener nuevos sistemas autoinmolativos que puedan conjugarse fácilmente con los
sistemas de transporte y las moléculas a liberar.
En este sentido la unidad escuaramida ha demostrado ser apta para su utilización en

entornos biológicos, por su resistencia a la degradación, capacidad de interacción con
otras moléculas, facilidad de combinación con diversas aminas, etc., tal y como se ha
demostrado en los capítulos anteriores. Su aplicación en el campo de los sistemas
autoinmolativos aportaría un sistema totalmente nuevo y versátil gracias a la facilidad
de conjugación con aminas.
El uso de escuaramidas con fines autoinmolativos no se ha descrito en la bibliografía,

sin embargo, en el grupo de Química Supramolecular se han obtenido resultados que
indican que es posible aprovechar sus cualidades para obtener espaciadores
autoinmolativos escuaramídicos.
En concreto, se ha observado que durante la preparación de γ-

metilaminoescuaramidas, en disolventes polares o a pH básico, se obtiene un
subproducto cíclico mediante reacción intramolecular (Esquema 59).187
Esquema 59 – Autociclación de un derivado escuaramídico.
La reacción intramolecular está muy favorecida ya que la escuaramida adopta una

conformación E,Z. Esta conformación está favorecida por la presencia del metilo
situado en el nitrógeno de la escuaramida respecto al derivado no metilado. De esta
forma el sistema queda preorganizado, dejando el par de electrones de la amina
secundaria en una buena posición para realizar un ataque nucleófilo intramolecular.
187
Resultados no publicados obtenidos por el Sr. Luís Martínez y que forman parte de su tesis doctoral.
238
4.5 Objetivos
Estos antecedentes nos han impulsado a diseñar un sistema autoinmolativo basado en
la unidad escuaramida y a plantear los siguientes objetivos:
 Diseñar y optimizar un sistema de liberación de fármacos escuaramídico que se

active espontáneamente tras un determinado estímulo intracelular, un
autoinmolativo con base escuaramídica (Esquema 60).
Esquema 60 – Sistema autoinmolativo basado en la unidad escuaramida.
 Evaluar la evolución temporal y estabilidad del sistema en medio acuoso y a pH

fisiológico.
239
240

4.6.1 Diseño de un sistema autoinmolativo de base escuaramida
A continuación se describen las características que tendrán dos de las partes más
relevantes que componen el sistema autoinmolativo: el espaciador autoinmolativo y la
carga. La elección del gatillo se realiza en función de los resultados obtenidos,
tomando como punto de partida un grupo amino, resultante de la activación de un
supuesto gatillo, pendiente de definir.
4.6.1.1 Elección de la carga
Para estudiar la viabilidad del espaciador autoinmolativo se ha optado por usar una
estrategia off-on utilizando un fluoróforo a modo de carga. Esta estrategia radica en el
hecho de que un fluoróforo no presenta fluorescencia significativa cuando se
encuentra en unas condiciones determinadas mientras que al cesar esas condiciones
recupera su fluorescencia. Una de estas condiciones se debe a los diferentes tipos de
“quenching” propios de cada fluoróforo. En este caso, la escuaramida por si sola ya
presenta unas propiedades adecuadas para provocar un “quenching” tipo PET por
proximidad espacial. Por otra parte, los fluoróforos ven disminuida su fluorescencia
cuando se bloquean pares de electrones libres de heteroátomos situados en el
esqueleto molecular impidiendo su deslocalización en el sistema.
En cuanto al fluoróforo elegido, se ha decidido trabajar con derivados de cumarina

(2H-benzopiran-2-ona) Este fluoróforo es poco fluorescente cuando el heteroátomo
(O, N) en la posición 7 tiene bloqueado su par de electrones (Esquema 61).
Esquema 61 – Estructura del núcleo de cumarina y propiedades fluorescentes según la funcionalización

de la posición siete.
Al combinar la conjugación del fluoróforo con la proximidad a la escuaramida se espera

conseguir un conjugado con poca fluorescencia, que se incrementará al cesar ambas
condiciones.
La intensidad de fluorescencia observada para derivados de cumarina en disolución es

función del pH. En los derivados fenólicos (7-hidroxicumarinas), la fluorescencia se
reduce notablemente a valores de pH ácidos en función de la longitud de onda de
excitación. Excitando a 370 nm se observa una disminución de la fluorescencia hasta
intensidades casi nulas en el intervalo de pH entre 6 y 8, mientras que cuando la
excitación se produce a 330 nm la intensidad de fluorescencia es prácticamente
241
constante hasta valores de pH cercanos a 4, a partir del cual sí que se reduce

notablemente la fluorescencia.188 En el caso de derivados nitrogenados (7-
aminocumarinas) la fluorescencia no se ve prácticamente alterada a pH fisiológico.189
Para evitar los posibles problemas derivados de variaciones en el pH de las

disoluciones y por tanto de la intensidad de fluorescencia observada, los ensayos
iniciales se han orientado a la conjugación de escuarato de dietilo con 7-
aminocumarinas. De esta forma se aprovecha por una parte el “quenching” producido
por el bloqueo del par de electrones del grupo amino de la cumarina, y por otra, la
experiencia adquirida hasta el momento en la funcionalización de escuaratos de dietilo
con aminas.
4.6.1.2 Diseño del espaciador autoinmolativo
En cuanto al diseño del espaciador autoinmolativo se ha optado por una escuaramida

aminoalquilsustituida capaz de evolucionar mediante ciclación intramolecular
adaptada al uso de cumarinas. En este sistema el grupo amino primario desplazaría el
nitrógeno aromático de la cumarina según se muestra en el esquema 62.
Esquema 62 – Evolución del espaciador autoinmolativo mediante la acción de aminas primarias sobre
escuaramidas derivadas de anilinas.
El ataque nucleófilo intramolecular permitirá la eliminación del grupo saliente con

mayor a menor dificultad, estableciendo de este modo la siguiente escala donde se
representa la estabilidad de diferentes derivados escuaramídicos frente a ataques
nucleófilos (Fig. 108).
Figura 108 – Estabilidad de diferentes derivados escuaramídicos frente a ataques nucleófilos.
188
Fink, D. W.; Koehler, W. R.; pH Effects on Fluorescence of Umbelliferone. Anal. Chem., 1970, 42, 990-
993.
189
Jin, X.; Uttamapinant, C.; Ting, A. Y.; Synthesis of 7-Aminocoumarin by Buchwald-Hartwig Cross
Coupling for Specific Protein Labeling in Living Cells. ChemBioChem, 2011, 12, 65-70.
242
A igual que en los derivados de ácidos carboxílicos, si se asume que tiene lugar un
ataque nucleófilo de tipo adición-eliminación sobre el carbono que soporta el grupo
saliente, cabe esperar que el orden de reactividad coincida con el menor pKa del ácido
conjugado del grupo saliente. Por esta razón cabe pensar que los ésteres fenólicos
(grupo saliente fenol, pKa ≈ 10), reaccionarán mejor que ésteres alifáticos (grupo
saliente alcoholes, pKa ≈ 16-18), escuaramidas aromáticas (grupo saliente anilinas, pKa
≈ 30) o escuaramidas alifáticas (grupo saliente aminas, pKa ≈ 36-38).
La elección de la longitud de la cadena (n) se ha realizado teniendo en cuenta que los

estudios realizados hasta el momento, han demostrado que tres carbonos es una
longitud de cadena óptima para poder establecer interacciones intramoleculares entre
el nitrógeno aceptor y el grupo NH escuaramídico donador, permitiendo de la misma
forma un ataque nucleófilo.
4.6.2 Síntesis y evaluación de diferentes grupos funcionales como activadores del

proceso autoinmolativo
En primer lugar y para evaluar la reactividad del espaciador autoinmolativo propuesto

se han preparado una serie de compuestos modelo que presentan una estructura
común, la unidad escuaramido-cumarina, diferenciándose en el segundo sustituyente
de la escuaramida. Inicialmente no se ha considerado la presencia de un posible
gatillo, observando únicamente la evolución del espaciador.
Esquema 63 – Síntesis de los diferentes derivados escuaramido-cumarina.
En esta primera aproximación se han utilizado como segundo sustituyente

alquilaminas con la finalidad de valorar la estabilidad en medio acuoso de la unión
escuaramido-cumarina en presencia de diferentes grupos funcionales. Los derivados
243
78 (grupo amino) y 80 (grupo hidroxilo) se han elegido en función de su diferente

nucleofília con el objetivo de evaluar su capacidad para reaccionar formando el
compuesto cíclico y desplazando la cumarina, mientras que los compuestos 76 y 77
permiten descartar falsos positivos debidos a una posible hidrólisis. Según la figura
108, solo se espera observar la eliminación de cumarina en el caso de la amina 78, ya
que el alcohol alifático no debería desplazar la cumarina, debido principalmente a la
diferencia de los valores de pKa (Esquema 63).
4.6.2.1 Síntesis de derivados escuaramido-cumarínicos
El monoescuarato de etilo de la aminocumarina 76 se ha preparado por condensación

entre 7-amino-4-metilcumarina 75 y escuarato de dietilo 1, usando como catalizador
triflato de zinc. A partir de este compuesto se ha obtenido el derivado 80 por
condensación con 2-(2-aminoetoxi)etanol 79, y el derivado 77, por condensación con
N-Boc-1,3-propandiamina 43. A partir de éste último se obtuvo la escuaramida 78
mediante desprotección selectiva del grupo Boc en disolución acuosa ácida según el
procedimiento general descrito para la preparación de los oligómeros escuaramídicos.
4.6.2.2 Evaluación inicial de los derivados escuaramido-cumarínicos
En primer lugar se ha analizado la evolución espontánea que pueden sufrir los

compuestos 76, 77, 78 y 80 en medio acuoso neutro (pH 6,5-7,0) mediante UV-Vis y
fluorimetría.
A una temperatura de 37 °C la intensidad de fluorescencia de los cuatro derivados bajo

estudio no se incrementa significativamente. Tampoco se observa una variación del
espectro ultravioleta en ninguno de los conjugados durante las primeras 24 horas. Este
hecho demuestra que a pH neutro el agua no es capaz de hidrolizar los enlaces
escuaramídicos y que tampoco ocurre un ataque intramolecular por parte de ninguno
de los grupos funcionales estudiados.
Por otra parte, al basificar el medio in situ hasta alcanzar un pH aproximado de 9,5 se
observa que la intensidad de fluorescencia del conjugado 78, que tiene el grupo amino
en su estructura, se incremente rápidamente. Este incremento es mucho menor en los
otros casos (Fig. 109). Este resultado parece indicar que el proceso autoinmolativo
responde al pKa del grupo amino, y por tanto a la protonación de éste, indicando
además que el derivado con el grupo amino es el único capaz de evolucionar liberando
la cumarina.
244
10
76
9
77
8
78
Intensidad (u. a.)

7
80
6
NaOH
5
4
3
2
1
0
0 300 600 900 1200 1500
Tiempo (min)
Figura 109 – Intensidad de fluorescencia (λexc = 332 nm. λem = 443 nm) en función del tiempo para los
-5
compuestos 76, 77, 78 y 80, 1x10 M en agua, con un 4% de DMSO, a 37 °C durante 24 horas. La línea
vertical indica el momento de la basificación in situ del medio.
A partir de lo observado anteriormente se ha evaluado la influencia del pH del medio

en el proceso de autoinmolación del producto 78. Los experimentos se han realizado
en un intervalo de valores de pH comprendido entre 6,6 y 9,1, utilizando para ello
diferentes tampones (Fig. 110).
20
18
16
Sin tampón (6,60)
14
Intensidad (u. a.)
Fosfato (7,05)
12
Fosfato (7,61)
10
8 TRIS (7,69)
6 Fosfato (7,70)
4 Borax (8,11)
2 Borax (9,12)
0
0 120 240 360 480 600 720 840 960
Tiempo (min)
Figura 110 – Intensidad de fluorescencia (λexc = 332 nm. λem = 443 nm) en función del tiempo para el
-5
compuesto 78, 1,0x10 M, 4% DMSO. El pH del medio se ha mantenido utilizando tampones fosfato,
TRIS y borato a una concentración 1 mM con fuerza iónica constante (NaCl) 100 mM. Los valores entre
paréntesis indican el pH de la disolución.
Los resultados revelan que únicamente se produce un incremento de la fluorescencia

de la disolución a un pH básico (9,1)). En estas condiciones de pH el par electrónico del
grupo amino se encuentra libre (pKa = 9,5 - 10,5), observando a partir de este valor una
respuesta autoinmolativa.
La representación de la intensidad de fluorescencia respecto al tiempo permite

calcular la velocidad inicial de aparición de cumarina libre. El valor calculado a un pH
245
de 9,1 ha sido de 1,74x10-11 Ms-1. En ausencia de otros procesos competitivos y/o de

hidrólisis inespecífica, ésta sería una medida de la velocidad de autoinmolación. Este
valor es muy bajo, a nivel práctico se traduce en un 9% de cumarina liberada al cabo de
16 horas.
En consecuencia, debido al pH básico necesario para que se dé el proceso y a la baja

velocidad a la que tiene lugar, el uso de un grupo amino como nucleófilo sobre un NH
de una escuaramida, donde el grupo saliente es una anilina, no resulta apropiado para
un proceso autoinmolativo aceptable.
Ante estos resultados ha sido imprescindible la elección de otro grupo funcional con
mejores propiedades nucleófilas a pH fisiológico, como por ejemplo el grupo tiol.
4.6.3 Sistemas autoinmolativos derivados de escuaramido-cumarinas con grupos tiol
4.6.3.1 Ventajas del grupo tiol frente al grupo amino
La utilización de tioles para efectuar desplazamientos nucleofílicos sobre derivados del

ácido escuárico resulta una alternativa atractiva.190 Un tiol alifático presenta un pKa de
alrededor de 10, lo cual no supone una mejora importante frente a un grupo amino,
sin embargo este valor se ve disminuido por efecto inductivo ante la presencia de
nitrógenos en posición β, como en el caso de la cisteamina (pKa = 8,6), o más acusado
aún en el caso del aminoácido cisteína (pKa = 8,3), debido a la presencia además del
carboxilato (Fig. 111).191
Figura 111 – Equilibrios ácido-base de la cisteamina y el aminoácido cisteína. Se han señalado en negrita
191
los valores de pKa correspondientes a la desprotonación del grupo tiol.
La elección del tiol como la parte fundamental del espaciador autoinmolativo permite
además el uso de disulfuros como gatillos. Como se ha indicado en la introducción,
éstos son grupos funcionales presentes de forma natural en los sistemas vivos, y
estables además en medio acuoso siempre que no exista un entorno reductor o grupos
nucleófilos con los que pueda interaccionar. Estas condiciones se cumplen por ejemplo
en el medio extracelular. El enlace disulfuro se rompe en el momento de internalizarse
en la célula debido a la presencia de un entorno reductor y una alta concentración de
190
Sejwal, P.; Han, Y.; Shah, A.; Luk, Y.; Water-Driven Chemoselective Reaction of Squarate Derivatives
with Amino Acids and Peptides. Org. Lett., 2007, 9, 4897-4900.
191
Edsall, J. T.; Wyman and Jeffries, Biophysical Chemistry, 1958, Academic Press, Inc., New York.
246
GSH, unas condiciones que se pueden reproducir fácilmente para estudiar el proceso
in vitro mediante la adición de reductores o incluso GSH.
De esta forma, introduciendo un enlace de disulfuro en nuestro sistema, se obtiene de

forma directa el espaciador y el gatillo, una estructura de la cual se prescindió en la
primera aproximación al utilizar el grupo amino.
4.6.3.2 Elección del disulfuro
Considerando este nuevo grupo funcional se ha procedido al rediseño del sistema

autoinmolativo utilizando la cisteamina 82 como tiol, que en su forma oxidada se
denomina cistamina 81 e incorpora el puente disulfuro que actuará a modo de gatillo
(Esquema 64).
Esquema 64 – Equilibrio oxidación-reducción del aminoetanotiol (cisteamina) 82.
El uso de disulfuros implica un intercambio entre tioles ante la presencia de trazas de

reductor, por este motivo, trabajando con disulfuros simétricos se simplifica tanto la
síntesis de los diferentes derivados como los análisis de la evolución temporal.
La cisteamina y la cistamina permiten la funcionalización directa con escuarato de

etilo. Además, la distancia de dos carbonos entre heteroátomos, aun siendo menor
que en el caso de la amina 78, resulta adecuada para formar el compuesto cíclico,
característico de la inmolación. Por último, la cistamina 81 es un producto
comercialmente disponible, tanto en su forma oxidada como reducida, con un coste
asequible.
247
4.6.3.3 Síntesis del producto de ciclación C1NS 83
La evolución esperada del proceso autoinmolativo de estos compuestos resulta en el

producto de ciclación 83 según se muestra en el esquema 65.
Esquema 65 – Mecanismo esperado para la autoinmolación mediante disulfuros.
Por este motivo, para comprobar la viabilidad de la propuesta, y con el fin de

identificar inequívocamente la formación del compuesto cíclico C1NS 83, éste se ha
obtenido a partir de cisteamina 82 y escuarato de dietilo 1, en medio etanol:agua
(1:0.7) (Esquema 66).
Esquema 66 – Síntesis del compuesto cíclico C1NS 83 en presencia de escuarato de dietilo 1 y

cisteamina 82.
El espectro 1H-RMN (D2O/10% DMSO-d6) presenta dos multipletes a 3,2 y 3,8 ppm
mientras que el espectro 13C-RMN muestra seis picos, dos a campo alto (27,0 y 42,1
ppm), y cuatro a campo bajo (161,2, 178,4, 186,2 y 187,0 ppm), correspondientes al
anillo escuaramídico. Los espectros 2D HSQC y HMBC permiten la asignación
inequívoca de todas las señales. El espectro HMBC muestra picos de cruzamiento
característicos (marcados como c, d y e) que confirman la estructura cíclica de 83 (Fig.
112). Adicionalmente, el espectro MALDI-TOF (83+CsCl) indica la presencia de un
compuesto con una relación m/z de 287,882, que concuerda con la masa calculada
para el ión [83+Cs]+ ([C6H5NO2S+Cs]+) de 287,910 g/mol.
248
Figura 112 – Elucidación de la estructura cíclica del producto C1NS 83 (10 mM, D2O / 20% DMSO-d6)
1 13
mediante experimentos 2D H– C HMBC y HSQC.
4.6.3.4 Síntesis del sistema autoinmolativo 86 como modelo de trabajo
Para avanzar en el diseño de un espaciador autoinmolativo de base escuaramida y gatillo de

disulfuro, se ha diseñado el disulfuro simétrico 86 utilizando p-nitroanilina 84 como carga
en lugar del fluoróforo. De este modo es posible estudiar la evolución mediante
espectrometría UV-Vis. La síntesis del disulfuro se ha realizado mediante la
introducción secuencial sobre escuarato de dietilo 1, primero de la p-nitroanilina 84 y
posteriormente de la cistamina 81, obteniendo el producto simétrico 86 con un
rendimiento del 21% (Esquema 67).
249
Esquema 67 – Síntesis del modelo autoinmolativo no fluorescente 86.
El compuesto 87 se ha sintetizado de un modo similar, a partir de la condensación de

la semiescuaramida 85 con 1,7-heptildiamina 39. Este compuesto sin capacidad
autoinmolativa se ha preparado para evaluar la estabilidad de la estructura
escuaramídica ante la presencia del reductor o la posible hidrólisis (Esquema 68).
Esquema 68 – Síntesis del conjugado sin capacidad autoinmolativa 87.
4.6.3.5 Agentes reductores de disulfuros
Previamente al estudio del sistema autoinmolativo se han valorado diversos agentes

reductores responsables de la activación del gatillo. Habitualmente se utilizan tioles,
que actúan mediante intercambio tiol-disulfuro, o bien fosfinas, que actúan mediante
mecanismo redox. En la figura 113 y el esquema 69 se presentan algunos agentes
habituales y los mecanismos propuestos para cada tipo de agente reductor.192,193
192
Burns, J. A.; Butler, J. C.; Moran, J.; Whitesides, G. M.; Selective Reduction of Disulfides by Tris(2-
carboxyethyl)phosphine. J. Org. Chem., 1991, 56, 2648-2650.
193
Dmitrenko, O.; Thorpe, C.; Bach, R. D.; Mechanism of SN2 Disulfide Bond Cleavage by Phosphorus
Nucleophiles. Implications for Biochemical Disulfide Reducing Agents. J. Org. Chem., 2007, 72, 8298-
8307.
250
Figura 113 – (Izquierda) Fosfinas que actúan mediante reacciones redox. (Derecha) Tioles que actúan
mediante un mecanismo de intercambio.
Esquema 69 – (Arriba) Mecanismo de reducción de disulfuros mediante intercambio con tioles. (Abajo)
192
Mecanismo de reducción de disulfuros mediante fosfinas en disolución acuosa.
Entre los tioles utilizados se encuentran el BME (β-mercaptoetanol) y el DTT

(ditiotreitol) pero se descartó su uso en esta Tesis por sus principales inconvenientes,
es decir, su inestabilidad y tendencia a oxidarse en presencia de aire. Además la banda
a 260 nm del DTT de su forma oxidada solaparía con la banda escuaramídica alrededor
de 280 nm. Por otra parte, el tripéptido glutatión (GSH) es el reductor más utilizado
para el estudio de compuestos con actividad biológica, debido a que se encuentra de
forma natural en todas las células. Sin embargo, el GSH tiende a formar aductos mixtos
(R-SS-R1 en el esquema 69), ralentizando el proceso de autoinmolación.
Alternativamente, las fosfinas presentan una importante capacidad de reducción

superior y no forman aductos mixtos. Los estudios realizados de forma preliminar con
la TBP (tributilfosfina) muestran que es un compuesto que reacciona lentamente con
el oxígeno y de forma más rápida con otros agentes oxidantes, como por ejemplo el
DMSO, necesario para poder trabajar en disolución acuosa. Por otra parte, la
tris(carboxietil)fosfina (TCEP) tiene características ideales para la realización de los
estudios de evolución propuestos. Se trata de un sólido estable en disolución acuosa,
mantiene su poder reductor a pH fisiológico y es selectivo para disulfuros. Además no
presenta bandas de absorción por encima de 220 nm y solo presenta dos señales en el
251
espectro de 1H-RMN, fácilmente identificables tanto en su forma reducida como

oxidada, entre 1,8 y 2,4 ppm.
4.6.3.6 Evaluación del modelo de sistema autoinmolativo 86
En el esquema 70 se representa el proceso esperado para la autoinmolación del

producto 86 al añadir el reductor TCEP.
Esquema 70 – Evolución esperada para el sistema autoinmolativo 86 después de la adición del reductor
TCEP. Se han indicado los máximos de absorbancia para el residuo de p-nitroanilina.
La p-nitroanilina 84 presenta un máximo de absorción a 380 nm (ε84 = 1,33 x 105

M-1cm-1), sufriendo un efecto hipsocrómico hasta 361 nm (ε86 = 1,62 x 105 M-1cm-1)
cuando está conjugada a la escuaramida. En cuanto a las bandas de la escuaramida, en
los conjugados 86 y 87 se observa un máximo a 296 nm (ε86 = 1,87 x 105 M-1cm-1),
mientras que en el ciclo 83 existen dos máximos a 274 y 306 nm (ε83274nm = 1,41 x 105
M-1cm-1; ε83306nm = 1,30 x 105M-1cm-1) (Fig. 114).
252
0,3
0,25 pNA 84
Autoinmolativo 86
C1NS 83
Absorbancia 0,2
Conjugado 87
0,15
0,1
0,05
0
240 340 440 540 640
-5
Figura 114 –Espectros de absorción UV-Vis de los compuestos 86 y 87 (1,0x10 M, PBS/1% DMSO), y de
-5
los productos esperados finales, p-nitroanilina 84 y el ciclo C1NS 83 (2,0x10 M, PBS/1% DMSO).
De esta forma, el cambio en la longitud de onda del máximo de la p-nitroanilina (de

360 a 380 nm) permite evaluar el proceso.
Los estudios de evolución temporal mediante espectrometría UV-Vis se han llevado a

cabo con el conjugado 87 y el sistema autoinmolativo 86 a una concentración
1,0x10-5M en PBS/1% DMSO, adquiriendo espectros en intervalos de 1-2 minutos.
En la figura 115 se puede observar como el tratamiento de 87, que carece del grupo
disulfuro, con un equivalente de TCEP no provoca ningún cambio significativo en el
espectro UV-Vis, descartando procesos de degradación alternativos a los propuestos.
Sin embargo, se observa una pequeña disminución de la intensidad de absorción
atribuible a una precipitación parcial debido a la baja solubilidad del compuesto.
0,25 0,25
0,2
Absorbancia
0,2 0,15
0,1
Absorbancia
0,15 0,05
0
0,1 0 50 100 150
Tiempo (min)
0,05
0
240 340 440 540 640
-5
Figura 115 – Evolución temporal del espectro UV-Vis del compuesto 87 (1,0x10 M) tratado con un
-5
equivalente de TCEP (1,0x10 M). El inserto de la esquina superior derecha muestra la evolución de la
señal en función del tiempo a tres longitudes de onda, 285 (azul), 300 (amarillo) y 380 nm (rojo).
253
Por su parte, la evolución del compuesto autoinmolativo 86 resulta en una variación

mucho más evidente (Fig. 116).
0,25 0,25
0,2
Absorbancia
0,2 0,15
0,1
Absorbancia
0,15
0,05
0
0,1 0 50 100 150
Tiempo (min)
0,05
0
240 340 440 540 640
-6
Figura 116 – Evolución temporal del espectro UV-Vis del compuesto 86 (9,95x10 M) tratado con un
-6
equivalente de TCEP (9,95x10 M). El inserto de la esquina superior derecha muestra la evolución de la
señal en función del tiempo a tres longitudes de onda, 290 (azul), 379 (amarillo) y 500 nm (rojo).
En el gráfico se observa un incremento de la banda situada alrededor de los 290 nm.

Además se observa el desplazamiento del máximo de la banda del residuo de p-
nitroanilina hacia 380 nm, y la disminución de la cola de dicha banda sobre los 500 nm,
hechos que parecen indicar la formación de p-nitroanilina libre. Sin embargo no se
llegan a diferenciar las dos bandas a 274 y 312 nm correspondientes al ciclo C1NS 83.
A partir de los espectros UV-Vis es posible calcular la velocidad de aparición de la p-

nitroanilina. Para ello se debe hacer uso de la ley de Lambert-Beer. Puesto que no hay
ninguna longitud de onda donde la absorción de los diferentes compuestos no solapen
hay que utilizar sistemas de ecuaciones y considerar aditiva la absorción de los
diferentes compuestos implicados en la reacción.
Según la ley de Lambert-Beer:
[ ] (Ec. 8)
para una mezcla de tres productos en disolución, A, B y C, con una reacción del tipo:
→ (Ec. 9)
donde, A = 86, B = p-nitroanilina 84 y C = C1NS 83, la absorbancia total a una longitud

de onda determinada es:
(Ec. 10)
254
[ ] [ ] [ ] (Ec. 11)
Donde ε corresponde al coeficiente de extinción molar, l al paso óptico, que será 1 cm

por defecto, y [ ] a la concentración de cada uno de los productos.
Si el producto 86, tiene una concentración inicial [A]0, en el punto final existe una
concentración de producto final igual a:
[ ] [ ] [ ] (Ec. 12)
y en un punto intermedio cualquiera:
[ ] ([ ] [ ]) [ ] (Ec. 13)
Por tanto:
[ ] ([ ] [ ]) ([ ] [ ]) (Ec. 14)
Despejando [A] obtenemos:
[ ] ( )
[ ] (Ec. 15)
( )
De esta forma, dado que se conocen los coeficientes de absorción molar de todos los
productos que intervienen, es posible calcular las concentraciones de ambas especies
con las ecuaciones 13 y 15, y representar la disminución de las concentraciones del
compuesto autoinmolativo 86 y del incremento de concentración de la p-nitroanilina
84 (Fig. 117). Esta representación se ha realizado teniendo en cuenta los datos de
absorbancia a 381 nm.
1,4E-05
1,2E-05
Concentración (M)
1,0E-05
8,0E-06
6,0E-06
4,0E-06
2,0E-06
0,0E+00
0 30 60 90 120 150
Tiempo (min)
Figura 117 – Representación de las concentraciones de 86 (rojo) y p-nitroanilina 84 (azul) en función del
tiempo transcurrido a 381 nm, calculadas a partir de las ecuaciones 13 y 15.
En este caso la velocidad inicial de desaparición de 86 a pH fisiológico es de 1,9x10-9

Ms-1 y de 3,8x10-9 Ms-1 si se calcula a partir de la aparición de la p-nitroanilina. Este
255
dato resulta ser dos órdenes de magnitud superior al observado para el compuesto 78
utilizando el grupo amino como parte del espaciador a pH 9.
La ausencia en los espectros UV-Vis de las dos bandas correspondientes al ciclo C1NS
83 ha motivado el estudio de la evolución del modelo autoinmolativo 86 mediante
RMN con el objetivo de intentar detectar la formación del compuesto cíclico C1NS 83.
Desafortunadamente, a una concentración 1 mM, el compuesto 86 resulta insoluble

incluso en disoluciones con un 50% de DMSO (Fig. 118-centro). Al añadir la TCEP, la
reducción de 86 incrementa la concentración del tiol, sin embargo no hay ninguna
evidencia que indique la formación del compuesto cíclico ni tampoco de la presencia
de p-nitroanilina 84, hecho que contradice los resultados preliminares obtenidos
mediante espectrometría UV-Vis a pesar de las diferentes condiciones de trabajo (Fig.
118).194
Figura 118 – Señales aromáticas correspondientes al residuo de p-nitroanilina de 86 en DMSO-d6

(abajo), PBS:DMSO-d6 (50%) (centro) y PBS:DMSO-d6 (50%) + un equivalente de TCEP (arriba).
194
Los desplazamientos del anillo aromático son prácticamente idénticos en las formas oxidada y
reducida, sin embargo los desplazamientos de la cadena alifática permiten identificar cada uno de los
productos.
256
4.6.3.7 Síntesis del sistema autoinmolativo 96
Con el fin de mejorar la solubilidad en agua del modelo autoinmolativo se decidió

obtener un modelo cumarínico sustituido en la posición cuatro con un grupo sulfonato,
esperando que éste aportase la solubilidad necesaria al conjunto, gracias a la
particularidad de encontrarse ionizado independientemente del pH de la disolución.
Los derivados de cumarina se obtienen de forma general mediante condensación de

Pechmann, que utiliza fenoles y β-ceto ésteres diferentemente funcionalizados según
la reacción del esquema 71.
Esquema 71 – Síntesis de Pechmann para la obtención de cumarinas.
La síntesis se ha llevado a cabo a partir del aminofenol 88, previa protección del grupo
amino con cloroformato de etilo, obteniendo el fenol 90. A continuación la
condensación de Pechmann en medio ácido con 4-cloroacetoacetato de etilo conduce
a la cumarina clorometilada 92. Posteriormente la adición nucleófila de sulfito sódico y
la desprotección del grupo amino proporciona la aminocumarina 94 con un
rendimiento global en cuatro pasos del 34% (Esquema 72).
Esquema 72 – Síntesis de 4-(sulfonatometil)-7-aminocumarina, 94.
La semiescuaramida 95 se ha obtenido por conjugación del escuarato de dietilo con la

cumarina 94 según el procedimiento general descrito para anilinas. Ésta se acopla a
cistamina en presencia de base para dar el disulfuro 96 con un rendimiento del 57%
(Esquema 73).
257
Esquema 73 – Síntesis del modelo autoinmolativo soluble en agua 96.
En este caso, y a pesar de realizar varios intentos, no se ha obtenido el producto de

doble entrada simétrico, lo que hace pensar que se puede establecer una interacción
entre la amina y el sulfonato impidiendo que ésta reaccione con otro equivalente de
semiescuaramida 95 en las condiciones indicadas.
El espectro 1H-RMN del conjugado 96 indica la presencia de dos confórmeros

diferenciables gracias al desdoblamiento de las señales l, k y i (correspondientes a las
posiciones 3, 4’ y 6) de la cumarina y del NH escuaramídico (Fig. 119).
1
Figura 119 – Espectro de H-RMN del compuesto 96 en DMSO-d6. Las señales se han asignado mediante
un código de letras. Las flechas de un mismo color (azul o verde) indican el conjunto de señales asignado
a cada una de las conformaciones minoritarias observadas.
258
4.6.3.8 Evaluación del modelo de sistema autoinmolativo 96
En el esquema 74 se representa la evolución esperada del sistema autoinmolativo 96 al

añadir el reductor TCEP.
Esquema 74 – Evolución esperada para el sistema autoinmolativo 96 después de la adición del reductor
TCEP.
Los estudios de la evolución temporal del sistema autoinmolativo 96 se han llevado a

cabo mediante RMN, en disolución de PBS/25% DMSO-d6. Los espectros de 1H-RMN se
han adquirido en intervalos de tiempo variables, indicados en la figura 120. En esta
figura se han incluido además los espectros del compuesto 96 y de la cumarina 94,
como producto esperado del proceso de autoinmolación, en las mismas condiciones
que las utilizadas para estudiar la evolución del compuesto 96.
259
1
Figura 120 – Evolución temporal mediante H-RMN del compuesto 96 (0,83 mM, PBS/25% DMSO) al
adicionar un equivalente de TCEP. Se incluyen el espectro del compuesto 96 (abajo) y de la cumarina 94,
registrados en las mismas condiciones del experimento con fines comparativos.
260
A la vista de los espectros presentados en la figura 120 se puede afirmar que existe
una reducción inmediata del producto 96 mediante la acción de la TCEP, observándose
la desaparición de las señales contiguas al puente disulfuro (2,9 y 3,1 ppm) y la
aparición de las señales correspondientes a la oxifosfina (1,8 y 2,2 ppm).
A partir de 60 minutos se empieza a observar la reoxidación del tiol, detectándose de

nuevo las señales correspondientes al disulfuro. Sin embargo, el anillo de cumarina se
va degradando y muestra señales en la zona aromática del espectro que no
corresponden a ninguna de las estructuras propuestas en el diseño original (entre 6,8 y
7,1 ppm y a 8,3 ppm). A partir de estos resultados puede afirmarse que no hay
liberación del fluoróforo, ya que no se observan los picos característicos del fluoróforo
libre a 6,5 y 6,6 ppm respectivamente.
Los estudios realizados mediante fluorimetría con el producto 96, realizados a una
concentración 2,5x10-6 M en medio PBS/1% DMSO, muy inferior a la concentración
utilizada para RMN, muestran un incremento de la fluorescencia después de la adición
del reductor, sin embargo esta evolución apenas alcanza un 12% del total después de
10 horas (Fig. 121).
45 3000
Área de emisión (u. a.)
40 2500
35 2000
1500
Intensidad (u. a.)
30
1000
25
500
20
0
15 0 200 400 600
10 Tiempo (min)
0
380 430 480 530 580 630
Figura 121 – Evolución temporal del espectro de emisión del compuesto 96 al ser tratado a una
-6 -6
concentración 2,5x10 M con tres equivalentes de TCEP (7,5x10 M). El inserto de la esquina superior
derecha representa el área correspondiente de cada curva de emisión en función del tiempo.
En consecuencia, debido a la degradación del sistema, la combinación de un grupo

tiol/tiolato como nucleófilo sobre un NH de una escuaramida, que tiene un grupo
anilina como grupo saliente, no resulta apropiada para un proceso de autoinmolación
aceptable.
261
En este punto es evidente que ninguno de los dos sistemas estudiados (86 y 96) ha
cumplido la función para la cual han sido diseñados, haciendo necesario el diseño de
una estructura alternativa que permita obtener el espaciador autoinmolativo.
4.6.4 Sistemas autoinmolativos derivados de escuarato-cumarinas con grupos tiol
Ante la poca reactividad de los sistemas de escuaramido-cumarinas estudiados hasta el

momento se planteó la síntesis de sistemas más lábiles. Para ello se optó por utilizar
derivados de escuarato-cumarinas ya que los ésteres derivados del ácido escuárico,
que tendrían un alcohol como grupo saliente, serán mucho más lábiles que las
escuaramidas anteriores (Fig. 122).
Figura 122 – Representación esquemática de las bis-escuaramidas utilizadas hasta el momento en

comparación con los ésteres del ácido escuárico planteados como alternativa.
4.6.4.1 Síntesis y evaluación del sistema autoinmolativo 97
Las primeras pruebas se realizaron sobre el modelo más simplificado posible pero que
contiene los elementos necesarios para ser considerado un sistema autoinmolativo. El
disulfuro 97 se ha obtenido mediante una condensación entre cistamina 81 y
escuarato de dietilo 1 en un 76% de rendimiento (Esquema 75).
Esquema 75 – Síntesis del modelo autoinmolativo 97 a partir de escuarato de dietilo y cistamina.
En este sistema el grupo disulfuro será el “gatillo” mientras que el tiol actuará como
nucleófilo para desplazar al etanol. La evolución se ha seguido mediante RMN y
espectrometría UV-Vis. El compuesto 97 resulta ser totalmente soluble a una
concentración 1 mM en PBS con un 10% de DMSO-d6, al contrario de lo que ocurría
con los derivados diescuaramídicos. Los experimentos de RMN se han llevado a cabo a
esta concentración añadiendo un equivalente de TCEP y registrando espectros de 1H-
RMN sucesivos. El mecanismo esperado, los espectros de 1H-RMN obtenidos durante
los primeros 90 minutos desde la adición del reductor TCEP, así como la asignación de
las diferentes señales observadas se muestran en la figura 123.
262
Figura 123 – Mecanismo propuesto de autoinmolación del compuesto 97 (1 mM) mediante reducción
1
con TCEP, asignación de las señales características, y espectros de H-RMN donde se ha señalado la
evolución de las señales de los productos.
La representación de la integral de las señales referenciadas a la señal residual de

DMSO, permite calcular la concentración de cada especie en función del tiempo.
Dividiendo el valor de la integral de cada señal por el número de protones que integra
esa señal se obtiene la relación molar de los diferentes productos implicados (Fig. 124).
263
2
1,8
Concentración (mM) 1,6

1,4
CH₂S C1NS (3.0 ppm)
1,2
CH₃ (1.2 ppm)
1
CH₃ EtOH (1.0 ppm)
0,8
CH₂S (2.6 ppm)
0,6
CH₂S 97 (2.8 ppm)
0,4
0,2
0
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (min)
Figura 124 – Evolución de la concentración de los diferentes productos derivados del proceso de
autoinmolación del producto 97 tratado con TCEP en función del tiempo.
La desaparición de la señal del CH2S del disulfuro inicial 97 a 2,8 ppm y su sustitución
por otra señal a 2,6 ppm correspondiente al CH2S del tiol, muestran que el enlace
disulfuro se rompe completamente en los primeros veinte minutos. La concentración
de tiol resultante duplica a la del producto de partida 97 debido a la estequiometría de
la reacción. Además de la reducción del disulfuro, se observa desde el primer minuto
un incremento de la señal del CH3 correspondiente al etanol (1,0 ppm) así como la
correspondiente al ciclo C1NS 83 a 3,0 ppm. Se observa también que la concentración
del producto C1NS 83 prácticamente duplica la del disulfuro inicial, indicando una
autoinmolación total. Sin embargo, la señal correspondiente al etanol no responde
totalmente a esta relación, hecho que se puede explicar por diferencias en la
integración debidas a causas instrumentales o por la evaporación del etanol.
La RMN permite confirmar la evolución de la reacción de reducción del disulfuro y

permite evaluar la velocidad de reacción global medida a partir de la señal del
producto final C1NS 83. De este modo, la velocidad estimada de aparición de C1NS es
de 1,0x10-6 Ms-1, muy superior a las observadas para los compuestos derivados de
anilinas.
Los experimentos adicionales realizados mediante espectrometría UV-Vis confirman la

viabilidad del proceso de autoinmolación, en este caso trabajando en un rango de
concentraciones mucho menor (Fig. 125).
264
0,3 0,3
Absorbancia
0,25 0,2
0,2 0,1
Absorbancia
0,15
0
0 30 60 90 120 150 180
0,1
Tiempo (min)
0,05
0
230 280 330 380 430 480 530
-6
Figura 125 – Evolución del espectro UV-Vis del compuesto 97 (5,0x10 M, en PBS/1% DMSO) después de
-6
ser tratado con un equivalente de TCEP (5,0x10 M). El inserto de la esquina superior derecha muestra
la evolución de la señal en función del tiempo a longitudes de onda de 260 (azul), 275 (amarillo) y 310
nm (rojo). El punto isosbéstico se sitúa sobre los 292 nm.
En la figura anterior, el espectro inicial (azul oscuro) muestra dos bandas parcialmente
solapadas correspondientes al disulfuro y la escuaramida, con un máximo absoluto a
272 nm. La adición del reductor produce la disminución de la intensidad de esta banda,
desapareciendo principalmente la subestructura de la banda a más baja longitud de
onda, pero manteniendo el máximo de absorción a 272 nm. Al mismo tiempo se
observa la aparición de una nueva banda sobre 312 nm, asignable, junto con la banda
a 272 nm, al ciclo C1NS 83, con máximo a 274 y 306 nm (Fig. 126).
0,3
97
0,25 97 + TCEP (20')

97 + TCEP (180')
0,2 83
Absorbancia
0,15
0,1
0,05
0
240 260 280 300 320 340 360 380 400
-6
Figura 126 – Superposición de espectros UV-Vis del modelo autoinmolativo 97 (5,0x10 M, PBS/1%
DMSO), 97 + TCEP después de 20 minutos de evolución, 97 + TCEP después de 180 minutos, y del ciclo
-5
C1NS 83 (1,0x10 M, PBS/1% DMSO).
265
En la representación de la absorbancia en función del tiempo a diferentes longitudes

de onda de la figura 125 se puede observar la disminución de las intensidades a 260 y
275 nm, el incremento de la banda a 310 nm y un punto isosbéstico que indica la
formación de un cromóforo distinto, C1NS 83.
4.6.4.2 Síntesis del sistema autoinmolativo 104
Los experimentos de RMN y UV-Vis descritos en el apartado anterior confirman la

viabilidad del proceso de autoinmolación usando el disulfuro como gatillo sobre
ésteres del ácido escuárico, por lo que se decidió introducir cargas más representativas
que el etanol. La cumarina ha seguido siendo el núcleo fluorescente elegido para
actuar como modelo de carga. No obstante la funcionalización de la escuaramida a
través del grupo fenólico en posición 7 conduciría a ésteres fenólicos que son muy
reactivos frente a ataques nucleófilos.190 Por este motivo se ha utilizado una cumarina
con un grupo hidroximetileno en la posición 4 para formar un éster alifático con la
escuaramida (Fig. 127).
Figura 127 – Representación de la funcionalización de escuaramidas con cumarinas a través del fenol de
la posición 7 para formar un éster fenólico o de un grupo hidroxilo en la posición 4, obteniendo un éster
alifático, menos reactivo.
Para la síntesis del éster es necesario utilizar una metodología alternativa a la habitual.
En este caso, primero se ha hidrolizado el diéster 97, obteniendo un diácido que se
aísla como sal de TBA 99. Seguidamente, la reacción entre esta sal y el haluro primario
de la cumarina 103 permite obtener el modelo autoinmolativo 104 con una carga pro-
fluorescente. La 4-bromo-7-hidroxicumarina 103 se obtuvo siguiendo un
procedimiento similar a los publicados (Esquema 76).195,196,197,198
195
Zhou, Z.; Fahrni, C. J.; A Fluorogenic Probe for the Copper(I)-Catalyzed Azide-Alkyne Ligation
Reaction: Modulation of the Fluorescence Emission via 3(n, π*)- 1(π, π*). J. Am. Chem. Soc., 2004, 126,
8862-8863.
196
Woo, H.; You, Y.; Kim, T.; Jhon, G.J.; Nam, W.; Fluorescence ratiometric zinc sensors based on
controlled energy transfer. J. Mater. Chem., 2012, 22, 17100-17112.
197
Sun, H.; Peng, X.; Template-Directed Fluorogenic Oligonucleotide Ligation Using “Click” Chemistry:
Detection of Single Nucleotide Polymorphism in the Human p53 Tumor Suppressor Gene. Bioconjugate
Chem., 2013, 24, 1226-1234.
266
Esquema 76 – Síntesis del sistema autoinmolativo 104.
El espectro 1H-RMN del producto 104 presenta señales anchas, un hecho que no se
había observado en los diferentes derivados de cumarina obtenidos hasta el momento.
Por su parte, el espectro de 13C-RMN presenta picos desdoblados correspondientes
tanto al anillo de escuaramida como de la cumarina (Fig. 128).
13
Figura 128 – Espectro de C-RMN del producto 104 en DMSO-d6 donde se han marcado (*) las señales
desdobladas.
198
Karthik, S.; Puvvada, N.; Kumar, B. N. P.; Rajput, S.; Pathak, A.; Mandal, M.; Singh, N. D. P.;
Photoresponsive Coumarin-Tethered Multifunctional Magnetic Nanoparticles for Release of Anticancer
Drug. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2013, 5, 5232-5238.
267
Los experimentos bidimensionales confirman que el compuesto 104 presenta un

equilibrio conformacional que resulta característico en compuestos de tipo
escuaramida-escuarato (Fig. 129).
Figura 129 – Superposición de espectros bidimensionales homonucleares de RMN del producto 104. En
1 1
color verde se pueden observar los contactos H- H COSY. En azul y rojo los correspondientes al
programa de pulsos ROESY, donde se han diferenciado los contactos ROE, negativos (en rojo), y los
correspondientes a la diagonal principal junto con los de intercambio químico y conformacional, de
signo contrario a los anteriores (en azul).
Es interesante destacar de la figura anterior los contactos ROE observados para el

protón f (posición 3 del anillo de cumarina) con prácticamente todos los protones de la
cadena alifática debido al intercambio conformacional Z/E observable en las parejas de
señales a/b y h/i. Además también se puede observar con menor intensidad, el cambio
268
conformacional Z/E que experimentan los ésteres de ácidos escuarámicos. 199 Este
cambio conformacional se observa con la señal de cruzamiento del protón g
(sustitución 4 del anillo de cumarina) a 6,1 y 6,9 ppm.
El espectro UV-Vis del compuesto 104 presenta una banda con un máximo a 270 nm,
con un coeficiente de extinción molar de 4,06x105 M-1cm-1, correspondiente a la
escuaramida, y una banda del fluoróforo con un máximo relativo a 325 nm y
coeficiente de extinción molar 1,75x105 M-1cm-1. Por su parte el máximo de la banda
de emisión de fluorescencia se sitúa a 472 nm (λexc = 325 nm). La intensidad de
fluorescencia del conjugado es hasta 25 veces menor al compararla con la cumarina
libre debido al “quenching” provocado por la escuaramida. Por otra parte, el
rendimiento cuántico a 325 nm es de 0,01 unidades utilizando sulfato de quinina como
estándar (Fig. 130).200
Absorción
Intensidad
Emisión
0
240 340 440 540 640 740
Figura 130 – Espectros de absorción-emisión normalizados del sistema autoinmolativo 104.
Para estudiar el proceso de autoinmolación con la nueva carga y a efectos de

comparación con el compuesto 104, se ha preparado la cumarina 106 como el
producto esperado de la liberación de la carga, mediante una condensación de
Pechman, como en los casos anteriores, entre el cloroacetoacetato de etilo 91 y el
resorcinol 102. La cumarina 106 se ha obtenido en un 29% de rendimiento global
según el esquema 77, pudiendo obtener así sus propiedades espectroscópicas,
necesarias para poder estudiar el proceso autoinmolativo.
199
Conformational Preferences and Self-Template Macrocyclization of Squaramide-Based Foldable
200 -5
Se ha usado sulfato de quinina como estándar (Ref. Aldrich 22640), a una concentración 1x10 M en
una disolución de HClO4 0.1 M, considerando un rendimiento cuántico de 0,60 según la referencia
bibliográfica: Velapoldi, R. A.; Tonnesen, H. H.; Corrected Emission Spectra and Quantum Yields for a
Series of Fluorescent Compounds in the Visible Spectral Region. J. Fluoresc., 2004, 14, 465-472.
269
Esquema 77 – Síntesis de la cumarina 106.
Esta cumarina presenta dos bandas de absorción de intensidad variable en función del
pH de la disolución. En PBS/1% DMSO, el máximo de absorción se encuentra a 325 nm
y el de emisión a 470 nm. El coeficiente de extinción molar a 325 nm es de 1,05x10 5 M-
1
cm-1 (Fig. 131). La fluorescencia responde linealmente a la concentración hasta
valores de 5,0x10-6 M con un rendimiento cuántico en estas condiciones de 0,67 a 325
nm utilizando sulfato de quinina, 1x10-5 M en medio HClO4 0,1 M, como estándar.
Absorción
Emisión
Intensidad normalizada
0
240 340 440 540 640 740
Figura 131 – Espectros de absorción-emisión normalizados de la cumarina 106.
4.6.4.3 Evaluación del sistema autoinmolativo 104 mediante RMN
La evolución temporal del sistema autoinmolativo 104 se ha investigado mediante

experimentos de RMN en las condiciones habituales, 104 (1 mM) en PBS/10% DMSO-
d6 y adición de un equivalente de TCEP. De nuevo el sistema autoinmolativo no es
demasiado soluble a esta concentración, sin embargo, en esta ocasión la reacción
transcurre liberando el fluoróforo 106, aunque a una velocidad menor de lo observado
en el caso del modelo simple 97 (Fig. 132). Esta reducción de la velocidad del proceso
resulta evidente al observar señales residuales de TCEP en su forma reducida durante
más de dos horas después de la adición.
270
Figura 132 – Mecanismo propuesto de autoinmolación del compuesto 104 (1 mM) mediante reducción
1
con TCEP, asignación de las señales características, y espectros de H-RMN donde se ha señalado la
evolución de las señales de la cumarina 106, el ciclo C1NS 83 y la TCEP en su forma oxidada.
Los espectros obtenidos permiten asegurar que el proceso transcurre tal como se ha
diseñado. Se identifican claramente las señales propias de la 7-hidroxi-4-
(hidroximetil)cumarina 106. No obstante, la limitada solubilidad del modelo
autoinmolativo 104 no ha permitido obtener unos valores de velocidad de aparición
del producto que representen correctamente el proceso.
Se ha comprobado que a una concentración 1 mM es necesario no menos de un 40%

de DMSO para que el disulfuro de partida se mantenga en disolución. Al analizar la
evolución en estas condiciones se observa que transcurridos tres minutos después de
la adición de la TCEP ya se observan los picos correspondientes a los productos finales
C1NS 83 y la cumarina 106, indicando con ello que tanto la reducción como la
271
autoinmolación tienen lugar de forma muy rápida. Puesto que se quiere estudiar el
proceso de autoinmolación en un medio biocompatible, los resultados obtenidos con
un 40% de DMSO no son biológicamente relevantes, aunque sí indicativos de un
proceso autoinmolativo efectivo.
4.6.4.4 Evaluación del sistema autoinmolativo 104 mediante UV-Vis y fluorimetría
El espectro UV-Vis del compuesto 104 tratado con un equivalente de TCEP en las
condiciones estándar (5,0x10-6 M, PBS/1% DMSO) muestra la disminución de la banda
de la escuaramida a 270 nm, acompañada de un incremento de la bandas
correspondiente a la cumarina libre 106 (325 nm) y el ciclo C1NS 83 (306 nm) (Fig.
133).
0,25 0,25
0,2
Absorbancia
0,2
0,15
Absorbancia
0,1
0,15
0,05
0,1 0
0 60 120 180
Tiempo (min)
0,05
0
240 340 440 540 640
-6
Figura 133 – Evolución temporal del espectro UV-Vis del compuesto 104 (5,0x10 M, PBS/1% DMSO) al
-6
de ser tratado con un equivalente de TCEP (5,0x10 M). El inserto de la esquina superior derecha
muestra la evolución la absorbancia en función del tiempo transcurrido a 260 nm (azul), 320 nm
(amarillo) y 400 nm (rojo).
La disminución observada a 400 nm es consistente con la desaparición del conjugado

escuarato-cumarina (Fig. 134).
272
0,25
104
0,2 104 + TCEP (180')
106
83
Absorbancia
0,15
0,1
0,05
0
240 290 340 390 440
-6
Figura 134 – Superposición de espectros UV-Vis del modelo autoinmolativo 104 (5,0x10 M, PBS/1%
-5
DMSO), 104 + TCEP después de 180 minutos de evolución, del ciclo C1NS 83 (1,0x10 M, PBS/1%
-5
DMSO), y de la cumarina 106 (1,0x10 M, PBS/1% DMSO).
El mismo experimento realizado mediante fluorimetría (2,5x10-6 M, PBS/1% DMSO)

muestra un incremento de la intensidad de fluorescencia de más de 16 veces la inicial
como resultado de la eliminación de cumarina 106 (Fig. 135).
25 1600
Área de emisión (u. a.)
Intensidad de fluorescencia (u. a.)
1200
20
800
15
400
10 0
0 30 60 90 120
5 Tiempo (min)
0
380 430 480 530 580 630
-6
Figura 135 – Evolución del espectro de emisión del compuesto 104 (2,5x10 M) (λexc = 325 nm) al ser
-6
tratado con un equivalente de TCEP (2,5x10 M). El inserto de la esquina superior derecha muestra la
evolución del área de la curva de emisión en función del tiempo.
La velocidad inicial de aparición/desaparación se ha calculado a partir del espectro UV-

Vis a 320 nm para los diferentes tiempos utilizando las ecuaciones 13 y 15. La
velocidad de aparición de la cumarina libre 106 es de 1,2x10-9 Ms-1. A nivel práctico, se
273
observa una liberación del 42% del fluoróforo a las dos horas de iniciado el proceso
(Fig. 136).
1,0E-05
8,0E-06
Concentración (M)
6,0E-06
4,0E-06
2,0E-06
0,0E+00
0 1200 2400 3600 4800 6000 7200 8400
Tiempo (seg)
Figura 136 – Representación de las concentraciones del sistema autoinmolativo 104 (rojo) y la cumarina
106 (azul) en función del tiempo transcurrido a 320 nm, calculadas a partir de las ecuaciones 13 y 15.
Para calcular la velocidad de aparición mediante fluorimetría, se debe tomar la

precaución de restar al área de la curva de emisión, la correspondiente al conjugado
104, obteniendo de esta forma la fluorescencia correspondiente a la formación de
cumarina 106 mediante el proceso autoinmolativo inducido. Si bien se debería
considerar la evolución de la concentración de 104 en función del tiempo, la
fluorescencia de este compuesto es muy reducida, por lo cual a medida que se
incrementa la concentración de 106, esta corrección es despreciable. De esta forma se
puede calcular la concentración de fluoróforo en función del tiempo y la velocidad de
aparición inicial (Fig. 137).
5,0E-06
4,0E-06
Concentración de 106 (M)
3,0E-06
2,0E-06
1,0E-06
0,0E+00
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (min)
Figura 137 – Evolución de la concentración de la cumarina 106 mediante fluorimetría (λexc = 325 nm).
274
En estas condiciones la velocidad inicial de aparición de la cumarina libre 106 es de

0,8x10-9 Ms-1, con una liberación a las dos horas del 34% del fluoróforo, unos
resultados ligeramente inferiores aunque del mismo orden de magnitud que los
obtenidos mediante espectrometría UV-Vis.
La liberación parcial del fluoróforo observada con ambas técnicas plantea algunos
interrogantes. Es posible que la cantidad de reductor no sea suficiente o que la fosfina
utilizada se degrade en el medio de reacción. Por ello se han realizado una serie de
experimentos utilizando distintas concentraciones y proporciones entre sustrato y
reductor (Tabla 18).
Tabla 18 – Resumen de velocidades iniciales de aparición y tanto por ciento de liberación de fluoróforo
106 en función de la concentración de TCEP. Todos los experimentos se han realizado en PBS/1% DMSO.
Técnica [104] [TCEP] Eq. TCEP V0106 (Ms-1) % 106 en 2h.

-6 -6 -9
Fluo. 2,5x10 2,5x10 1 0,8x10 34%
Fluo. 2,5x10-6 5,0x10-6 2 1,2x10-9 50%
UV-Vis 5,0x10-6 5,0x10-6 1 2,5x10-9 43%
UV-Vis 5,0x10-6 1,0x10-5 2 3,5x10-9 63%
UV-Vis 5,0x10-6 2,0x10-5 4 4,5x10-9 73%
De la tabla anterior se puede extraer que a medida que se incrementa la concentración

de reductor se incrementa la velocidad de formación de la cumarina 106 como
corresponde a una reacción de segundo orden. Sin embargo, un aumento de la
concentración del producto de partida 104 incrementa la velocidad inicial pero no
provoca una mayor liberación de la cumarina.
4.6.4.5 Fotoestabilidad del sistema autoinmolativo 104 en disolución
La fotoestabilidad del sistema autoinmolativo 104 se ha estudiado en medio PBS/1%

DMSO a pH 7,4 mediante espectrometría UV-Vis, realizando hasta 55 adquisiciones
sucesivas del espectro entre 220 y 700 nm, con un tiempo de adquisición de
aproximadamente dos minutos (Fig. 138).
275
0,25
0,25
0,2
Absorbancia
0,15
0,2
Absorbancia 0,1
0,15 0,05
0
0,1 0 20 40 60
Nº de adquisiciones
0,05
0
240 340 440 540 640
-6
Figura 138 – Evolución del espectro ultravioleta-visible del compuesto 104 (5,0x10 M, PBS/1% DMSO).
El inserto de la esquina superior derecha muestra la evolución de la señal en función del número de
espectros de absorción adquiridos a longitudes de onda de 270 (azul), 329 (amarillo) y 370 nm (rojo).
Como se puede observar, la degradación fotoquímica del sistema es prácticamente

nula en un período superior a las dos horas, lo que indica que el conjugado es química
y fotoquímicamente estable en estas condiciones. Para comprobar si este equilibrio se
conserva a diferentes valores de pH, se han realizado estudios de evolución temporal
mediante fluorimetría a pH 6,28, 7,67 y 8,83, valores obtenidos mediante la adición de
HCl 3M o NaOH 1M a una disolución de PBS. Para la obtención de estos datos se han
realizado hasta 60 adquisiciones del espectro de emisión (λexc = 325 nm) en intervalos
de dos minutos. Los valores obtenidos se han comparado con los obtenidos mediante
fluorimetría a la misma concentración mediante la adición de un equivalente del
reductor (Fig. 139).
276
1600
Área de emisión (u. a.) 1200
800
400
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Nº de adquisiciones
Figura 139 – Evolución del valor de la integral de la banda de emisión del sistema autoinmolativo 104
-6
(2,5x10 M, 1% DMSO) a pH 6,28 (rojo), 7,67 (azul) y 8,83 (verde). Se han incluido en la comparación los
valores de obtenidos del tratamiento del sistema autoinmolativo 104 en presencia del reductor TCEP en
PBS/1% DMSO (amarillo).
En este caso no hay adición de ningún reductor, por tanto, la pequeña evolución
observada puede deberse a una autoinmolación residual, que no representa un
porcentaje global significativo al cabo de dos horas.
4.6.4.6 Estabilidad cinética del sistema autoinmolativo 104 frente a nucleófilos
Otro factor a tener en cuenta con miras a una aplicación en sistemas biológicos es su
estabilidad frente a otros nucleófilos presentes en el medio, principalmente aminas
primarias. Las aminas reaccionan con los ésteres de ácido escuárico y podrían provocar
la liberación del fluoróforo sin haberse activado el gatillo de disulfuro.
Por este motivo se ha estudiado la estabilidad del conjugado en presencia de tres

aminoácidos, leucina, lisina y arginina, que ofrecen diversas posibilidades de
interacción con el sistema autoinmolativo 104. Los experimentos se han llevado a cabo
mediante fluorimetría en medio PBS/1% DMSO añadiendo a una disolución de 104
(2,5x10-6 M) y el aminoácido correspondiente (5,0x10-6 M). En los tres casos
estudiados, la evolución de la fluorescencia observada es similar a la obtenida en el
experimento anterior a pH 7,67, indicando que la presencia del aminoácido no influye
en la estabilidad del sistema autoinmolativo.
De esta forma se puede asegurar que el sistema autoinmolativo 104 es cinéticamente

estable en disolución a valores de pH entre 6,3 y 8,8, según se ha demostrado en el
apartado anterior, y además en presencia de otros nucleófilos como aminoácidos a pH
fisiológico.
277
4.6.4.7 Autoinmolación en presencia de GSH como reductor
Los experimentos descritos hasta ahora se han realizado utilizando un reductor muy
efectivo como la TCEP pero que no es natural. A nivel biológico el reductor natural más
importante es el glutatión (GSH). Tal y como se ha descrito anteriormente, la acción
reductora del GSH se debe a la presencia de un grupo tiol, lo que implica una
complicación adicional debido a la posibilidad de reacciones de intercambio disulfuro-
tiol, esperando la evolución descrita a continuación (Esquema 78).
Esquema 78 – Evolución esperada para el sistema autoinmolativo 104 en una disolución de PBS con una
concentración 1 mM de GSH.
Con la finalidad de investigar la viabilidad biológica, el modelo autoinmolativo 104 se

ha tratado con GSH a una concentración típica de un entorno intracelular, 1 mM,
manteniendo la concentración de 104 constante en función de la técnica utilizada
(5,0x10-6 M para UV-Vis y 2,5x10-6 para fluorimetría) (Fig. 140).
278
1,0E-05
8,0E-06
Concentración (M)
6,0E-06
4,0E-06
2,0E-06
0,0E+00
0 1200 2400 3600 4800 6000 7200
Tiempo (seg)
Figura 140 – Representación de las concentraciones del sistema autoinmolativo 104 (rojo) y la cumarina
106 (azul) en función del tiempo transcurrido a 320 nm, calculadas a partir de las ecuaciones 13 y 15.
Las velocidades iniciales de aparición de la cumarina 106 en presencia de GSH (1 mM)

son de 5,0x10-9 Ms-1 en UV-Vis, con un 95% de liberación del fluoróforo a las dos horas,
y de 3,1x10-9 Ms-1 mediante fluorimetría, con un 75% de liberación en el mismo
tiempo.
Al comparar los valores obtenidos se observa que la velocidad inicial de aparición de

fluoróforo libre 106 usando una disolución 1 mM de GSH es muy similar a la obtenida
al usar cuatro equivalentes de TCEP (0,02 mM en UV-Vis). Sin embargo, por la propia
naturaleza de la reducción de disulfuros mediante el intercambio con otros tioles, GSH
en este caso, la velocidad inicial de aparición de cumarina es más lenta. Sin embargo,
se alcanzan finalmente valores cercanos al 100% de liberación de la carga del sistema
autoinmolativo.
4.6.4.8 Dependencia del proceso autoinmolativo en función del pH del medio
Se ha comprobado anteriormente que un valor de pH comprendido entre 6,3 y 8,8 no

afecta a la estabilidad del sistema autoinmolativo 104 (Fig. 140). Sin embargo, es
interesante estudiar la dependencia del proceso de autoinmolación en presencia de
activadores del gatillo en función del pH, debido a los diferentes valores de pH que
existen en los distintos compartimentos intracelulares.
El hecho de usar hidroxicumarinas implica que la fluorescencia de éstas es

dependiente del pH de la disolución. Por este motivo es necesario realizar las
correcciones oportunas a la hora de calcular las concentraciones liberadas de
fluoróforo calculando previamente la intensidad de fluorescencia de 106 en función
del pH (Fig. 141).
279
5000
4500
4000
Área de emisión (u. a.) 3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
5 6 7 8 9 10
pH
-6
Figura 141 – Área de la curva de emisión de fluorescencia de 106 (2,5x10 M, 1% DMSO) en función del
pH de la disolución (λexc = 325 nm).
Mediante fluorimetría se han realizado estudios de evolución del conjugado
autoinmolativo 104 en presencia de un equivalente de TCEP utilizando disoluciones de
PBS con el pH ajustado a valores de 6,28, 7,67 y 8,83 (Fig. 142).
2,0E-06
1,5E-06
Concentración 106 (M)
1,0E-06
5,0E-07
0,0E+00
0 1200 2400 3600 4800 6000 7200
Tiempo (seg)
-6
Figura 142 – Evolución del valor de la integral de la banda de emisión de 104 (2,5x10 M, 1% DMSO, λexc
= 325 nm) después del tratamiento con un equivalente de TCEP a valores de pH de 6,28 (rojo), 7,67
(azul) y 8,83 (verde).
La tabla 19 presenta los valores de la velocidad de aparición de 106 calculados a partir

de los datos de la figura 142.
Tabla 19 – Velocidades iniciales y tantos por ciento de liberación de fluoróforo en función del pH de la
disolución.
pH Cte. Fl. vs [106] (M-1) V0 (Ms-1) % 106 en 2h.
8 -10
6,28 8,4x10 0,5x10 5,7%
7,67 6,8x108 9,2x10-10 37%
8,83 5,0x108 6,7x10-10 38%
280
La baja velocidad inicial y avance de la reacción en medio ácido podría deberse a la

alteración del equilibrio tiol/tiolato en favor del tiol, que es menos nucleófilo que el
tiolato y reduciría la velocidad del proceso de autoinmolación. En cuanto al
experimento a pH básico, la menor velocidad inicial observada se puede atribuir a la
autooxidación parcial de la TCEP a pH básico.192 Sin embargo, la velocidad posterior
parece no decaer al mismo ritmo que lo hace en la disolución a pH 7,67, un hecho que
puede ser debido a la mayor proporción de tiolato, favoreciendo el proceso de
ciclación.
4.6.5 Perspectivas de aplicabilidad en sistemas biológicos
Como se ha presentado en el capítulo anterior, las oligoescuaramidas cíclicas se

internalizan de forma rápida y específica mediante endocitosis quedando secuestradas
principalmente en los endosomas tardíos. De esta forma, la unión de un sistema de
transporte como es la oligoescuaramida cíclica, internalizada por endocitosis, con un
gatillo especialmente lábil, como son los puentes de disulfuro, podría ser una
combinación idónea, dejando el extremo opuesto del disulfuro para la funcionalización
mediante espaciadores autoinmolativos y profármacos. Con los resultados obtenidos
en este capítulo acerca de la posibilidad de utilizar espaciadores autoinmolativos de
ciclación de base escuaramida-éster, la internalización de este conjugado
autoinmolativo se daría muy probablemente del mismo modo que la sonda
fluorescente C2-BDP 69, mediante endocitosis. Una vez en el endosoma, un entorno
ácido, se reduciría el disulfuro mediante mecanismos redox,178 para finalmente, una
vez recuperado el pH fisiológico, dar lugar al proceso de ciclación autoinmolativo
liberando la carga (Fig. 143).
Figura 143 – Representación esquemática de la posible aplicabilidad del sistema autoinmolativo

sintetizado.
281
282
4.7 Conclusiones
1. Se han sintetizado una serie de compuestos diseñados para evaluar la posibilidad de
utilizar escuaramidas como pieza clave de un nuevo sistema autoinmolativo.
2. Se ha determinado que el grupo amino no es capaz de provocar un ataque

nucleófilo intramolecular significativo a pH fisiológico sobre derivados de escuaramidas
N,N’-sustituidas.
3. Se ha probado que la utilización de tioles como nucleófilos sobre escuaramidas N,O

sustituidas resulta ser adecuada. El sistema autoinmolativo evoluciona a pH fisiológico,
obteniendo velocidades de aparición de la carga del orden de 10-9 Ms-1. A nivel
práctico, y en función del sistema utilizado, implica la liberación de entre un 30% y un
100% de la carga a las dos horas.
4. La mayor velocidad de liberación de la carga, 5,0x10-9 Ms-1, se ha conseguido

mediante el uso de GSH a una concentración típica de un entorno intracelular, 1 mM,
consiguiendo en este caso una liberación superior al 95% en dos horas.
5. Se ha comprobado tanto la estabilidad cinética como la fotoestabilidad del

conjugado en disolución acuosa a diferentes valores de pH y en presencia de
diferentes aminoácidos. Sin embargo, el pH de la disolución sí que parece influenciar
en la evolución del proceso autoinmolativo, reduciendo la velocidad de éste a pH
ácido.
6. El sistema desarrollado permite plantear la posibilidad de aplicarlo, en estudios

posteriores, a una finalidad terapéutica, mediante el uso de la oligoescuaramida C2
como transportador y un profármaco como carga.
283
284

equipo MilliQ (Millipore) consiguiendo una resistividad máxima de 18,2 MΩ.

El sistema RF-HPLC utilizado para la purificación de los productos ha sido un sistema

Gilson, equipado con bombas modelo 321 y un módulo detector UV-Vis-152.
300 o bien mediante un instrumento Bruker AVANCE 600 MHz. Los desplazamientos
químicos indicados en ppm están referenciados a la señal residual del disolvente
utilizado en el caso de DMSO y CDCl3. En el caso de los espectros realizados
exclusivamente en D2O, se ha utilizado la sal sódica del ácido 3-(trimetilsilil)-1-
propanosulfónico como patrón interno. Los espectros de masas se han registrado con
un espectrómetro de masas de alta resolución (HRMS) Micromass AutoSpec 3000,
provisto de un sistema de entrada de la muestra mediante electroespray (ESI) o bien
mediante un sistema Bruker Autoflex MALDI-TOF.
La obtención de los espectros UV-Vis se ha realizado mediante un espectrómetro UV-

Vis modelo Varian Cary 300 Bio de doble haz. Para los espectros de emisión de
fluorescencia se ha utilizado un espectrofotómetro Varian Cary Eclipse.
El tampón PBS se prepara mediante la disolución de un preparado salino (Ref. P5368

Sigma-Aldrich) en un litro de agua, obteniendo una concentración final de fosfato 0,01
M, NaCl 0,138 M y KCl 0,0027 M, con un pH 7,4.
201 th
285
4.8.1 Síntesis
Éster escuaramídico 76:
Una suspensión de 4-metil-7-aminocumarina 75 (0,5 g, 2,85 mmol), triflato de zinc

(104 mg, 0,285 mmol), Et3N (438 µl, 3,14 mmol) y escuarato de dietilo 1 (0,971 g, 5,71
mmol) en EtOH (23 ml) se mantiene durante 16 horas a reflujo en atmósfera de argón.
La disolución resultante se concentra. El residuo se lava con acetonitrilo (15 ml). La
mezcla resultante se enfría, se filtra y se lava con acetonitrilo frío (2 x 5 ml),
obteniendo 76 como un sólido amarillo (0,759 g, 2,57 mmol). Rdto: 90%
1
H RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1,44 (t, 3J(H,H) = 7,1 Hz, 3H, CH2CH3), 2,38 (d, 4J(H,H)
= 1,1 Hz, 3H, CCH3(4)), 4,80 (q, 3J(H,H) = 7,1 Hz, 2H, CH2CH3), 6,25 (d, 4J(H,H) = 1,2 Hz,
1H, CH(3)CCH3), 7,37 (dd, 3J(H,H) = 8,6 Hz, 4J(H,H) = 2,2 Hz, 1H, CH(6)CH), 7,42 (d, 4J(H,H)
= 1,9 Hz, 1H, CH(8)C), 7,71 (d, 3J(H,H) = 8,6 Hz, 1H, CH(5)CH), 11,04 (br, 1H, NHC). 13C
NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ = 15,6, 18,0, 70,0, 105,8, 112,4, 115,2, 126,4, 141,7, 153,1,
C16H13NNaO5+) encontrado: 322,0679.
Diescuaramida 77:
El semiéster 76 (0,124 g, 0,41 mmol) se suspende en una disolución de la amina 43 (88

mg, 0,46 mmol) en EtOH (21 ml). La reacción se mantiene a reflujo durante 16 horas.
Posteriormente se concentra y se lava con Et2O frío (2 x 15 ml) y acetonitrilo (2 x 10
ml), obteniendo el producto 77 como un sólido amarillo (0,129 g, 0,30 mmol). Rdto:
73%
1
H RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1,38 (s, 9H, C(CH3)3), 1,69 (t, 3J(H,H) = 6,6 Hz, 2H,
CH2CH2CH2), 2,40 (s, 3H, CCH3(4)), 3,02 (q, 3J(H,H) = 6,0 Hz, 2H, CH2NHCOO), 3,62 (q,
3
J(H,H) = 5,7 Hz, 2H, CH2NHCCO), 6,24 (s, 1H, CH(3)CCH3), 6,89 (br, 1H, NHCOO), 7,31
(dd, 3J(H,H) = 8,7 Hz, 4J(H,H) = 2,2 Hz, 1H, CH(6)CH), 7,60 (s, 1H, CH(8)C), 7,73 (d, 3J(H,H) =
8,7 Hz, 1H, CH(5)CH), 7,74 (br, 1H, NHCCO), 10,05 (br, 1H, NHC). 13C NMR (75 MHz,
DMSO-d6): δ = 18,0, 28,2, 31,0, 36,9, 41,5, 77,6, 104,6, 111,7, 114,2, 126,6, 142,5,
153,1, 154,3, 155,7, 160,0, 162,6, 169,8, 180,2, 184,7. HRMS (ESI) calc. para 450,1641
286
Diescuaramida 78:
El producto 78 (19 mg, 0,044 mmol) se disuelve en una disolución acuosa (6 ml) de HCl
(30 µl 3M, 0,089 mmol). Ésta se lleva a 100 °C durante 5 horas y posteriormente se
evapora el disolvente a sequedad, aislándose el clorhidrato 78 como un sólido amarillo
(15 mg, 0,041 mmol), que se usa en los estudios de autoinmolación sin realizar ninguna
etapa de purificación posterior. Rdto: 93%
Diescuaramida 80:
El semiéster 76 (0,1 g, 0,334 mmol) se suspende en EtOH (17 ml). A esta disolución se
adiciona 2-(2-aminoetoxi)etanol 79 (47 µl, 0,47 mmol) y la disolución se deja a reflujo
durante 16 horas. Seguidamente el crudo se lleva a sequedad obteniendo un sólido
naranja que se lava con acetonitrilo (2 x 10 ml) para obtener el producto 80 como un
sólido de color amarillo (96 mg, 0,27 mmol). Rdto: 80%
1
H RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 2,39 (s, 3H, CCH3(4)), 3,51 (m, 4H, CH2O), 3,60 (t,
3
J(H,H) = 4,9 Hz, 2H, CH2OH), 3,78 (br, 2H, CH2NH), 4,64 (br, 1H, CH2OH), 6,23 (d,
4
J(H,H) = 0,8 Hz, 1H, CH(3)CCH3), 7,29 (dd, 3J(H,H) = 8,6 Hz, 4J(H,H) = 2,2 Hz, 1H, CH(6)CH),
7,61 (s, 1H, CH(8)C), 7,71 (d, 3J(H,H) = 8,6 Hz, 1H, CH(5)CH), 7,91 (br, 1H, NHCH2), 10,09
(br, 1H, NHC). 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ = 18,0, 43,8, 60,1, 69,8, 72,2, 104,6,
111,7, 114,2, 126,6, 142,6, 153,2, 154,3, 160,0, 162,6, 169,7, 180,2, 184,7. HRMS (ESI)
calc. para 381,1063 (M+Na+; C18H18N2NaO6+) encontrado: 381,1068.
Ciclo C1NS 83:
Una disolución de escuarato de dietilo 1 (1,0 g, 5,88 mmol) en EtOH (30 ml) se adiciona
gota a gota sobre otra de cistamina 81 (453 mg, 5,88 mmol) en H2O (21 ml)
previamente desoxigenada mediante una corriente de argón. La mezcla se mantiene
con agitación durante 1 hora. Durante este tiempo se forma un precipitado que se
filtra y se lava con H2O (15 ml) y Et2O (15 ml), obteniendo el producto 83 (411 mg, 2,65
mmol) como un sólido amarillo pálido. Rdto: 45%
287
1
H RMN (300 MHz, D2O:20% DMSO-d6): δ = 3,22 (m, J(H,H) = 4,8 Hz, 2H, NHCH2CH2S),
3,81 (m, J(H,H) = 4,8 Hz, 2H, NHCH2CH2S). 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ = 25,2, 46,2,
161,2, 178,4, 186,2, 187,0.
Sintetizado según el procedimiento descrito en la bibliografía con algunas

modificaciones.202
Una disolución de escuarato de dietilo 1 (530 mg, 3,11 mmol), p-nitroanilina 84 (359
mg, 2,60 mmol) y triflato de zinc (189 mg, 0,52 mmol) en EtOH (26 ml) se mantiene en
agitación durante 1 hora. Posteriormente se concentra, el residuo se suspende en H2O
(15 ml) y se añade HCl 3M (50 µl). El sólido resultante se centrifuga y se disuelve en
CH2Cl2 (20 ml) y se separa la fracción insoluble mediante filtración. El CH2Cl2 se evapora
y el sólido obtenido se lava con NH4Cl 1M (10 ml) y H2O (10 ml), aislándose un sólido
naranja. Este sólido se recristaliza en AcOEt (25 ml), obteniendo agujas de color
naranja que corresponden al producto 85 (442 mg, 1,69 mmol). Rdto: 65%
1
7,1 Hz, 2H, CH2CH3), 7,47 (dd, 3J(H,H) = 7,2 Hz, 4J(H,H) = 2,1 Hz, 2H, CHCNH), 8,26 (dd,
3
J(H,H) = 7,2 Hz, 4J(H,H) = 2,1 Hz, 2H, CHCNO2), 8,45 (br, 1H, NH). 13C NMR (75 MHz,
DMSO-d6): δ = 15,5, 70,1, 118,9, 125,2, 142,3, 144,3, 169,2, 179,8, 184,7, 187,2.
Bis-(diescuaramida) 86:
El semiéster 85 (0,2 g, 0,76 mmol) se adiciona sobre una disolución del diclorhidrato de
cisteamina (86 mg, 0,38 mmol) y DiPEA (139 µl, 0,80 mmol) en EtOH (15 ml)
formándose una suspensión. La suspensión se agita en atmósfera de argón a 70 °C
durante 30 minutos y luego se deja enfriar progresivamente hasta alcanzar la
temperatura ambiente manteniendo la agitación un total de 16 horas. Transcurrido
este período se observa la formación de un precipitado. El sólido se filtra y se lava con
EtOH (10 ml). La purificación se lleva a cabo disolviendo el producto en DMF (20 ml) y
añadiendo H2O (40 ml), con lo que se obtiene un precipitado que se aísla por
202
Rostami, A.; Colin, A.; Li, X. Y.; Chudzinski, M. G.; Lough, A. J.; Taylor, M. S.; N,N’-Diarylsquaramides:
General, High-Yielding Synthesis and Applications in Colorimetric Anion Sensing. J. Org. Chem., 2010, 75,
3983-3992.
288
centrifugación. Una vez lavado con H2O (10 ml) se obtiene el compuesto 86 como un
sólido naranja (46 mg, 0,079 mmol). Rdto: 21%
1
H RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 3,03 (br, 4H, CH2S), 3,94 (br, 4H, CH2NH), 7,59 (d,
3
J(H,H) = 8,4 Hz, 4H, CHCNH), 7,96 (br, 2H, NHCH2), 8,20 (d, 3J(H,H) = 9 Hz, 4H,
CHCNO2), 10,28 (br, 2H, NHC). 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ = 38,3, 42,6, 117,7,
125,6, 141,4, 145,2, 162,3, 170,1, 180,3, 185,2. HRMS (ESI) calc. para 753,1737
Bis-(diescuaramida) 87:
Una suspensión del semiéster 85 (0,1 g, 0,38 mmol) y heptildiamina 39 (25 mg, 0,19
mmol) en EtOH (15 ml) se mantiene en agitación durante 16 horas. Posteriormente se
concentra la disolución y se disuelve en DMF (20 ml). La adición de Et2O (30 ml)
provoca la aparición de un precipitado, el cual se filtra y lava con H2O (20 ml) y EtOH
(10 ml) aislándose un sólido de color rojo oscuro que corresponde al producto 87 (51
mg, 0,091 mmol). Rdto: 47%
1
H RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1,34 (br, 6H, CH2(CH2)3CH2), 1,57 (br, 4H,
CH2(CH2)3CH2), 3,60 (t, 3J(H,H) = 6,6 Hz, 4H, CH2NH), 7,24 (br, 0,4H, NH), 7,55 (d, 3J(H,H)
= 8,6 Hz, 4H, CHCNH), 7,83 (br, 1,3H, NH), 8,16 (d, 3J(H,H) = 8,6 Hz, 4H, CHCNO2), 10,02
(br, 0,6H, NH). 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ = 25,7, 28,1, 30,5, 43,7, 118,1, 125,5,
C33H40N8NaO10+) encontrado: 731,2768.
Etil (3-hidroxifenil)carbamato 90:
El producto se obtiene según el procedimiento descrito en la bibliografía modificando

el procedimiento de elaboración.203
El aminofenol 88 (25 g, 229 mmol) se disuelve en AcOEt (115 ml) a 80 °C durante 30

minutos. Posteriormente se añade gota a gota durante un período de 90 minutos una
disolución de cloroformato de etilo 89 (12,4 g, 115 mmol) en AcOEt (5 ml). Pasadas las
2 horas totales de reacción, se elimina el disolvente obteniendo un líquido viscoso
203
Maly, D. J.; Leonetti, F.; Backes, B. J.; Dauber, D. S.; Harris, J. L.; Craik, C. S.; Ellman, J. A.; Expedient
Solid-Phase Synthesis of Fluorogenic Protease Substrates Using the 7-Amino-4-
carbamoylmethylcoumarin (ACC) Fluorophore. J. Org. Chem., 2002, 67, 910-915.
289
marrón oscuro. Éste se diluye con Et2O (150 ml) y se lava con HCl 1M (2 x 50 ml), una
disolución saturada de NaHCO3 (2 x 50 ml), H2O (50 ml) y una disolución saturada de
NaCl (50 ml). La disolución orgánica se seca sobre Na2SO4 y se concentra obteniendo
un sólido de color marrón claro que corresponde al producto 90 (19,59 g, 108 mmol).
Rdto: 94%
1
7,1 Hz, 2H, CH2CH3), 6,26 (br, 1H, COH), 6,55-6,65 (br, 3H, CHCHCHC(OH)CH), 7,13 (t,
3
J(H,H) = 8,1 Hz, 1H, CHCHCH), 7,35 (br, 1H, NHCOO). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ =
14,6, 61,7, 106,0, 110,6, 110,8, 130,1, 139,1, 154,0, 157,0.
4-sulfonatometil-7-(etoxicarbonil)amino cumarina 93:
El producto se obtiene según el procedimiento descrito en la bibliografía a partir del

fenol 90 y 4-cloroacetoacetato de etilo 91.204
4-sulfonatometil-7-amino cumarina 94:
La cumarina 93 (2,0 g, 5,10 mmol) se disuelve en una mezcla de AcOH (4,25 ml) y
H2SO4 (4,25 ml) y se agita durante 2 horas a 125 °C. La disolución se deja enfriar a
temperatura ambiente y se vierte sobre EtOH (100 ml) enfriado a -10 °C, observándose
la formación de un precipitado. La mezcla se agita a dicha temperatura durante 30
minutos y posteriormente se filtra y lava con EtOH (150 ml). El precipitado, de color
marrón claro, corresponde a la sal amónica del producto 94 (1,674 g, 4,46 mmol).
Rdto: 88%
1
H RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 3,88 (s, 2H, CH2(4)SO3-), 5,95 (s, 1H, CH(3)CO), 6,42 (d,
4
J(H,H) = 2,1 Hz, 1H, CH(8)C), 6,54 (dd, 3J(H,H) = 8,7 Hz, 4J(H,H) = 2,1 Hz, 1H, CH(6)CH),
5,57 (d, 3J(H,H) = 8,7 Hz, 1H, CH(5)CH). 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ = 53,3, 100,3,
110,2, 110,5, 112,1, 128,1, 149,9, 150,3, 155,4, 160,8.
204
Woronoff, G.; El Harrak, A.; Mayot, E.; Schicke, O.; Miller, O. J.; Soumillion, P.; Griffiths, A. D.;
Ryckelynck, M.; New Generation of Amino Coumarin Methyl Sulfonate-Based Fluorogenic Substrates for
Amidase Assays in Droplet-Based Microfluidic Applications. Anal. Chem., 2011, 83, 2852-2857.
290
La cumarina 94 (266 mg, 0,71 mmol), triflato de zinc (39 mg, 0,11 mmol) y Et3N (317 µl,
2,27 mmol) se disuelven en EtOH (8,8 ml) y se mantienen en agitación durante 30
minutos. Posteriormente se añade una disolución de escuarato de dietilo 1 (320 µl,
2,16 mmol) en EtOH (2 ml) y se mantiene la disolución a reflujo 16 horas. El sólido
resultante se filtra y se purifica mediante HPLC de fase reversa, aislándose la sal de
amino del producto 95 como un sólido amarillo (93 mg, 0,23 mmol). Pureza
determinada por HPLC: > 95% Rdto: 33%
Procedimiento seguido para la purificación mediante HPLC:
Columna: XBridgeTM Prep C18 OBDTM 5 μm, 19x150 mm, de Waters.

Perfil de elución: 0’-1’ (10% B); 1’-9,5’ (10-30% B); 9,5’-11,5’ (30% B); 11,5’-13,5’ (30-
10%); 13,5’-15,5’ (10% B). 17 ml/min.
Columna: XBridgeTM C18 5 μm, 4,6x150 mm, de Waters.

Perfil de elución: 0’-1’ (10% B); 1’-9,5’ (10-30% B); 9,5’-11,5’ (30% B); 11,5’-13,5’ (30-
10%); 13,5’-15,5’ (10% B). 1,0 ml/min.
Longitud de onda de detección: 290-350-380 nm.
Figura 144 – Traza de HPLC del éster escuaramídico 95 purificado mediante HPLC. Área de la señal
principal: 98%.
291
1
H RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1,45 (t, 3J(H,H) = 7,1 Hz, 3H, CH2CH3), 4,01 (s, 2H,
CH2(4)SO3-), 4,81 (q, 3J(H,H) = 7,2 Hz, 2H, CH2CH3), 6,27 (s, 1H, CH(3)CO), 7,34 (dd, 3J(H,H)
= 8,9 Hz, 4J(H,H) = 2,2 Hz, 1H, CH(6)CH), 7,43 (d, 4J(H,H) = 7,2 Hz, 1H, CH(8)C), 7,91 (d,
3
J(H,H) = 8,7 Hz, 1H, CH(5)CH). 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6, sal de Et3N): δ = 8,7, 15,7,
45,8, 53,3, 70,0, 105,7, 114,4, 114,9, 114,9, 128,3, 141,1, 150,0, 154,1, 160,1, 169,4,
179,3, 184,3, 187,4. HRMS (ESI-) calc. para 378,0284 (M-; C16H12NO8S-) encontrado:
378,0298.
Diescuaramida 96 :
Una disolución del diclorhidrato de cisteamina 82 (41 mg 0,18 mmol) y Et3N (50 µl,
0,36 mmol) en EtOH (5 ml) se mantiene en agitación durante 30 minutos.
Posteriormente, se añade una suspensión del semiéster 95 (142 mg, 0,36 mmol) en
EtOH (7 ml). La mezcla se mantiene a reflujo durante 16 horas en atmósfera de argón.
Después se elimina el disolvente y el residuo se lava con CH2Cl2 (20 ml) y Et2O (10 ml),
obteniéndose un sólido amarillo que corresponde al producto 96 (50 mg, 0,10 mmol).
Rdto: 57%
El análisis de los extractos disueltos en CH2Cl2 mediante espectrometría MALDI-TOF

indica que contienen el producto de doble adición, junto con el producto 96, pero en
muy poca proporción e insuficiente para su aislamiento.
1
H RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 2,94 (t, 3J(H,H) = 7,2, 2,2H, CH2S), 3,03 (t, 3J(H,H) =
6,3, 1,9H, CH2S), 3,12 (br, 1,9H, CH2NH3+), 3,91 (q, 3J(H,H) = 6,3, 2,0H, CH2NH), 4,03 (s,
0,4H, CH2b(4)SO3-), 4,08 (s, 1,6H, CH2a(4)SO3-), 6,23 (s, 0,15H, CHb(3)CO), 6,25 (s, 0,8H,
CHa(3)CO), 7,07 (dd, 3J(H,H) = 8,6 Hz, 4J(H,H) = 1,7 Hz, 0,7H, CHa(6)CH),7,13 (dd, 3J(H,H) =
8,6 Hz, 4J(H,H) = 2,2 Hz, 0,2H CHb(6)CH), 7,58 (br, 1,0H, CH(8)), 7,81-7,86 (br, 3,5H,
CH2NH3+ + CH(5)CH), 8,00 (br, 1,0H, NHCH2), 9,87 (br, 0,8H, NHa(7)C), 9,94 (br, 0,1H,
NHb(7)C). 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ = 34,3, 37,8, 38,0, 42,9, 53,0, 104,6, 113,7,
113,8, 114,3, 127,8, 142,0, 149,3, 154,4, 160,1, 162,5, 169,3, 180,2, 184,5. HRMS (ESI-)
calc. para 484,0307 (M-; C18H18N3O7S3-) encontrado: 484,0314.
292
Bis-(éster escuaramídico) 97:
La cisteamina diclorhidrato 82 (0,3 g, 1,34 mmol) se suspende en una mezcla de Et2O,

acetonitrilo y EtOH (10 ml, 5 ml, 5 ml) y Et3N (0,56 ml, 4 mmol). A esta suspensión se le
adiciona una disolución de escuarato de dietilo 1 (0,5 g, 2,94 mmol) en Et2O (5 ml) y la
mezcla se agita durante 16 horas a temperatura ambiente en atmósfera de argón. El
crudo de reacción se filtra y el residuo sólido se lava con Et2O (2 x 5 ml). Los extractos
orgánicos se combinan y concentran al vacío para obtener un líquido amarillo que se
disuelve en CH2Cl2 (30 ml). La fase orgánica se lava con HCl 0,1N (2 x 15 ml) y una
disolución saturada de NaCl (15 ml) y se seca sobre Na2SO4. El disolvente se elimina
bajo presión reducida y el residuo se lava con Et2O frío obteniendo el diéster 97 como
sólido blanco (0,41 g, 1,02 mmol). Rdto: 76%
1
H RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1,37 (t, 3J(H,H) = 6,9 Hz, 6H, CH2CH3), 2,90 (br, 4H,
CH2S), 3,59 (br q, 2,3H, CH2aNH), 3,76 (br q, 1,8H, CH2bNH), 4,65 (q, 3J(H,H) = 6,9 Hz, 4H,
CH2CH3), 8,69 (br t, 0,9H; NHa), 8,88 (br t, 1,1H; NHb). 13C RMN (75 MHz, DMSO-d6): δ =
15,6, 37,7, 38,2, 42,5, 42,9, 68,9, 172,4, 172,7, 176,8, 177,1, 182,1, 182,3, 189,0, 189,2.
HRMS (ESI) calc. para 423,0660 (M+Na+; C16H20N2NaO6S2+) encontrado: 423,0663.
Sal de tetrabutil amonio del bis-(ácido escuarámico) 99:
El diéster 97 (0,252 g, 0,63 mmol) se suspende en H2O (15 ml) y se calienta a reflujo
durante 16 horas. La disolución de color amarillo pálido se basifica con hidróxido de
tetrabutilamonio 1M en MeOH hasta un pH aparente de 7. El disolvente se elimina a
presión reducida para obtener un líquido de color marrón que se disuelve en CH2Cl2
(10 ml). La adición de hexano provoca la decantación del producto 99 como un aceite
denso de color amarillo que contiene trazas de hidróxido de amonio (0,278 g, 0,34
mmol). El producto se emplea en el siguiente paso sin purificar. Rdto: 53%
1
H RMN (300 MHz, CDCl3): δ = 0,99 (t, 3J(H,H) = 7,2 Hz, 35H, NCH2CH2CH2CH3), 1,42 (m,
3
J(H,H) = 7,2 Hz, 23H, NCH2CH2CH2CH3), 1,67 (m, 23H, NCH2CH2CH2CH3), 2,93 (t, 3J(H,H)
= 6,6 Hz, 4H, CH2S), 3,32 (m, 23H, NCH2CH2CH2CH3), 3,90 (q, 3J(H,H) = 6,6 Hz, 4H,
CH2NH), 6,34 (br, 1.4H, NH). HRMS (ESI-) calcd para 343,0059 (M-TBA+H+;
C12H11N2O6S2-) encontrado 343,0066.
293
4-Bromoacetoacetato de etilo 101:
Sintetizado según se describe en la bibliografía con pequeñas modificaciones en el

procedimiento.205 El acetoacetato de etilo 100 (19,4 ml, 153 mmol) se disuelve en
ácido acético (75 ml) y se le añade gota a gota una disolución de bromo (25 g, 156
mmol) disuelto en ácido acético (75 ml). La mezcla se agita durante 24 horas a
temperatura ambiente. Después, la mayor parte del ácido acético se elimina a presión
reducida obteniendo un líquido de color marrón que se diluye con H2O (250 ml). Esta
disolución se extrae con CH2Cl2 (2 x 100 ml). Los extractos orgánicos se combinan y se
lavan con una disolución saturada de Na2CO3 (100 ml), H2O (100 ml) y finalmente una
disolución saturada de NaCl (100 ml). La disolución se seca entonces con Na2SO4 y se
elimina el disolvente obteniendo un aceite espeso de color marrón, que se purifica
mediante cromatografía en columna (SiO2, hexano:AcOEt, de 9:1 a 8:2) para obtener
un aceite amarillo-verdoso como el producto 101 (9,418 g, 45,1 mmol). Rdto: 29%
1
H RMN (300 MHz, CDCl3): δ = (forma ceto) 1,29 (t, 3J(H,H) = 7,2 Hz, 3H*, CH2CH3), 3,70
(s, 1,4H, BrCH2), 4,05 (s, 1,2H, COCH2CO), 4,22 (q, 3J(H,H) = 7,2 Hz, 1.8H*, CH2CH3);
(forma enol) 1,30 (t, 3J(H,H) = 7,2 Hz, 3H*, CH2CH3), 3,85 (s, 0,4H, BrCH2), 4,23 (q,
3
J(H,H) = 7,2 Hz, 1.8H*, CH2CH3), 5,28 (s, 0,2H, COCHCOH), 12,00 (s, 0.2H, COH). *: Las
señales de las formas ceto y enol están solapadas. 13C RMN (75 MHz, CDCl3): δ = (forma
ceto) 14,2, 34,0, 46,2, 61,9, 166,7, 194,7; (forma enol) 14,3, 28,8, 60,8, 91,9, 170,6,
172,2.
4-bromometil-7-hidroxicumarina 103:
El resorcinol 102 (0,985 g, 8,95 mmol) finamente pulverizado se mezcla con el 4-

bromoacetoacetato de etilo 101 (1,87 g, 8,95 mmol) y se enfría a 0 °C. Seguidamente,
se adiciona lentamente una disolución acuosa al 80% de H2SO4 (18 ml). La reacción se
mantiene en agitación mientras la temperatura se va incrementando lentamente hasta
temperatura ambiente y durante 16 horas adicionales. Después la disolución se vierte
sobre H2O (200 ml) a 0 °C y se deja agitando durante 1 hora. El producto se extrae con
AcOEt (3 x 70 ml) y los extractos combinados se lavan con una disolución saturada de
NaCl (80 ml). La disolución se seca sobre Na2SO4 y se elimina el disolvente a presión
reducida obteniendo un aceite marrón que se purifica mediante cromatografía en
205
Choi, H. Y.; Chi, D. Y.; Nonselective Bromination-Selective Debromination Strategy: Selective
Bromination of Unsymmetrical Ketones on Singly Activated Carbon against Doubly Activated Carbon.
Org. Lett., 2003, 5, 411-414.
294
columna (SiO2, AcOEt:hexano, 1:1) y se recristaliza con AcOEt y hexano para obtener
cristales de color marrón claro del producto 103 (0,457 g, 1,79 mmol). Rdto: 20%
1
H RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 4,81 (s, 2H, CH2(4)Br), 6,46 (s, 1H, CH(3)COO), 6,75 (d,
4
J(H,H) = 2,4 Hz, 1H, CH(8)COH), 6,85 (dd, 3J(H,H) = 8,7 Hz, 4J(H,H) = 2,4 Hz, 1H,
CHCH(6)COH), 7,71 (d, 3J(H,H) = 8,7 Hz, 1H, CH(5)CHCOH), 10,65 (s, 1H; COH(7)). 13C RMN
(75 MHz, DMSO-d6): δ = 28,1, 102,5, 109,3, 111,4, 113,0, 126,7, 151,5, 155,4, 160,1,
161,5.
Bis-(éster escuaramídico) 104:
El compuesto 99 (190 mg, 0,23 mmol) y la cumarina 103 (143 mg, 0,56 mmol) se
disuelven en acetona anhidra (20 ml) y se agita durante 2 horas a temperatura
ambiente. Posteriormente, la temperatura se incrementa lentamente durante un
período de 2 horas hasta alcanzar los 70 °C. Después de 30 minutos a dicha
temperatura, la solución se filtra y el disolvente se elimina a presión reducida. El
residuo se disuelve en DMSO (1 ml) y se adiciona H2O (10 ml) para obtener un
precipitado blanco que corresponde al producto 104 (115 mg, 0,17 mmol). Rdto: 72%
1
H RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 2,92 (m, 4H, CH2S), 3,62 (br, 2,2H, CH2aNH), 3,79 (br,
1,8H, CH2bNH), 5,88 (m, 4H, CH2(4)O), 6,32 (m, 2H, CH(3)COO), 6,71-6,85 (m, 4H, CH(6)-
(8)
COH), 7,52 (m, 2H, CH(5)CHCOH), 8,91 (br, 1H, NHa), 9,09 (br, 1H, NHb), 10,66 (m, 2H,
COH(7)). 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ = 37,2, 38,1, 42,6, 43,2, 68,8, 69,2, 102,5,
108,2, 108,7, 113,2, 125,8, 149,9, 155,1, 160,1, 161,5, 172,2, 172,4, 175,4, 175,7,
181,7, 181,9, 189,0, 189,3. HRMS (MALDI-TOF) calc. para 691,0698 (M-H-;
C32H23N2O12S2-) encontrado: 691,0680.
4-clorometil-7-hidroxicumarina 105:
Sintetizado según se describe en la bibliografía a partir de resorcinol 102 y 4-

cloroacetoacetato de etilo 91.206 Rdto: 79%
206
Lin, W.; Long, L.; Feng, J.; Wang, B.; Guo, C.; Synthesis of meso-Coumarin-Conjugated Porphyrins and
Investigation of Their Luminescence Properties. Eur. J. Org. Chem., 2007, 4301-4304.
295
4-hidroximetil-7-hidroxicumarina 106:
Sintetizado según se describe en la bibliografía modificando la elaboración

posterior.206
La cumarina 105 (1,0 g 4,79 mmol) se suspende en H2O (150 ml) y se lleva a reflujo
durante 16 horas, obteniendo una disolución de color amarillo pálido. La disolución se
concentra a sequedad y el residuo se disuelve en AcOEt (80 ml). Esta solución se filtra y
se añade Et2O (100 ml). El producto 106 precipita como un sólido blanco (344 mg, 1,79
mmol). Rdto: 37%
1
H RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ = 4,69 (d, 3J(H,H) = 1,4Hz, 2H, CH2(4)OH), 5,49 (br, 0,4H,
CH2OH), 6,23 (t, 4J(H,H) = 1,25Hz, 1H, CH(3)CO), 6,72 (d, 4J(H,H) = 2,3 Hz, 1H, CH(8)COH),
6,77 (dd, 3J(H,H) = 8,7 Hz, 4J(H,H) = 2,3 Hz, 1H, CH(6)CH), 7,52 (d, 3J(H,H) = 8,7 Hz, 1H,
CHCH(5)), 10,53 (br, 1H, COH(7)). 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ = 59,1, 102,3, 106,5,
109,6, 112,9, 125,5, 154,9, 156,9, 160,7, 161,0.
4.8.2 Procedimiento general para la realización de los estudios de evolución

temporal mediante espectrometría UV-Vis y fluorimetría
En un procedimiento típico, el compuesto a estudiar se disuelve en DMSO a una

concentración 1 mM. Por otra parte se obtiene una disolución de TCEP en 10x PBS a
una concentración 1 mM.
En un estudio mediante espectrometría UV-Vis típico, 20 µl de la disolución del

producto se diluyen en 3,94 ml de PBS. A esta disolución se añaden 20 µl de DMSO y
20 µl de la disolución 1 mM del reductor (1 equivalente), obteniendo una
concentración final 5,0x10-6 M de producto en PBS/1% DMSO. El momento en el cual
se adiciona el reductor se considera t = 0 y se adquieren espectros UV-Vis en intervalos
regulares de dos minutos durante los primeros treinta minutos y posteriormente cada
cinco minutos.
Para el estudio mediante fluorimetría, se diluyen 10 µl de la disolución del producto en

3,95 ml de PBS. A esta disolución se añaden posteriormente 30 µl de DMSO y 10 µl del
reductor 1 mM, consiguiendo una concentración final de producto 2,5x10 -6 M en
PBS/1% DMSO. Se considera t = 0 en el momento de la adición del reductor, a partir
del cual se comienzan a adquirir espectros de emisión en intervalos regulares de dos
minutos.
296
4.8.3 Procedimiento general para la realización de los estudios de evolución

temporal mediante RMN
Los productos se disuelven en DMSO-d6 a una concentración 10 mM y el reductor en

10 x PBS para obtener una disolución 50 mM.
Para un estudio típico, en un tubo de resonancia se introducen 528 µl de PBS y 60 µl de

la disolución del producto. Se adquiere un espectro de referencia de 1H-RMN con un
programa de supresión de agua mediante “excitation sculpting”.207 Posteriormente se
adiciona al tubo de RMN 12 µl de la disolución 50 mM del reductor, momento en el
cual se considera t = 0, se agita rápidamente y se adquieren espectros de 1H-RMN cada
dos minutos durante dos horas.
4.8.4 Procedimiento general para la obtención de los coeficientes de extinción molar
A modo de ejemplo, y como procedimiento general, se preparan por dilución en PBS

un total de doce disoluciones en el intervalo de concentración comprendido entre
1,0x10-5 y 2,0x10-7 M. En todas las disoluciones preparadas se adiciona el volumen
necesario de DMSO para que la disolución final contenga un 1% de DMSO en volumen.
Se registran los espectros UV-Vis de las doce muestras preparadas y se representa la
absorbancia a una longitud de onda determinada en función de la concentración. El
coeficiente de extinción molar se determina como el valor de la pendiente de la recta
resultante.
De forma similar y para poder cuantificar la evolución temporal por fluorimetría, se

realizan las lecturas de la banda de emisión de las muestras más diluidas,
generalmente aquellas con una concentración inferior a 5,0x10 -6 M. La pendiente de la
recta que resulta al representar la integral de la banda de fluorescencia, calculada
mediante la ecuación 2, y la concentración permite obtener un valor que representa la
intensidad de fluorescencia en función de la concentración de fluoróforo.
∑ [ ] ( ) (Ec. 2)
4.8.5 Procedimiento general para el cálculo de las velocidades iniciales de

aparición/desaparición
Para el cálculo de la progresión de la reacción se deben calcular en primer lugar las

diferentes concentraciones de los productos en disolución. Este procedimiento difiere
en función de la técnica utilizada.
207
Hwang, T. L.; Shaka, A. J.; Water Suppression That Works. Excitation Sculpting Using Arbitrary Wave-
Forms and Pulsed-Field Gradients. J. Magn. Reson. Ser. A, 1995, 112, 275-279.
297
Mediante RMN, la integral de cada señal de intensidad variable se referencia respecto

a una señal de intensidad constante. A partir de estos valores se divide el valor de la
integral entre el número de protones que integran dicha señal, obteniendo una
relación molar entre las diferentes señales. De esta forma, a partir de la concentración
inicial conocida del producto se representan las concentraciones de los diferentes
productos en función del tiempo.
En espectrometría UV-Vis, debido al solapamiento de bandas entre los productos

iniciales y los finales, la concentración de cada uno se puede calcular a partir del valor
de la absorbancia total y los coeficientes de extinción molar de cada producto
implicado, a una longitud de onda y tiempo determinados, mediante las ecuaciones 15
y 13.
[ ] ( )
[ ] (Ec. 15)
( )
[ ] ([ ] [ ]) [ ] (Ec. 13)
Por último, en fluorimetría, la detección de la señal del fluoróforo libre permite,

mediante la relación calculada anteriormente entre la concentración y la intensidad de
fluorescencia, calcular directamente la concentración de fluoróforo.
A partir de las representaciones de la concentración de los productos en función del

tiempo, el valor de la pendiente de la recta obtenida utilizando los valores de los
primeros cinco minutos del estudio se corresponde con la velocidad inicial de aparición
o desaparición de los compuestos.
4.8.6 Variación de la fluorescencia de la cumarina 106 en función del pH
A una disolución de H2O a pH 5,24 se añaden 50 µl de una disolución de 106 2 mM en

DMSO, obteniendo una disolución 5,0x10-6 M de 106 con un porcentaje inferior al 1%
de DMSO.
A esta disolución se adicionan de forma sucesiva alícuotas de una disolución de NaOH

1M. Cada variación de 0,4 unidades de pH se extrae una muestra y se registra su
espectro de emisión (λexc = 325 nm) hasta alcanzar un pH de 9,58.
Los valores de la intensidad de fluorescencia obtenidos se corrigen en función de la

dilución realizada a lo largo del experimento. La representación del área de emisión en
función del pH proporciona una relación entre la intensidad de fluorescencia y la
concentración para un valor de pH determinado.
298
4.8.7 Estabilidad y evolución temporal del producto 104 en función del pH
El estudio de estabilidad del compuesto 104 en función del pH se realiza mediante

espectrometría UV-Vis y fluorimetría.
Se preparan tres disoluciones de PBS a pH 6,28, 7,67 y 8,83 respectivamente.
Por otra parte se prepara una disolución del compuesto 104 en DMSO y otra de TCEP
en 10x PBS, ambas a una concentración 1 mM.
La evaluación de la estabilidad del compuesto 104 frente a la hidrólisis en función del

pH mediante fluorimetría se realiza a partir de una disolución del producto 104 en
PBS/1% DMSO a una concentración 2,5x10-6 M. La evolución de la muestra se
determina registrando los espectros de emisión de las muestras a intervalos de dos
minutos.
El mismo estudio se realiza de forma análoga por UV-Vis utilizando una muestra de 104
a una concentración 5,0x10-6 M en PBS/1% DMSO a pH 7,4.
4.8.8 Estabilidad y evolución temporal del producto 104 frente a nucleófilos
Para evaluar la influencia de los aminoácidos en la estabilidad del producto

autoinmolativo 104, se preparan disoluciones de lisina, leucina y arginina, 2 mM en
PBS a pH 7,4. En un procedimiento típico se toman las alícuotas necesarias de la
disolución del compuesto 104 (1 mM en DMSO) y de la del aminoácido para preparar
una disolución que contenga una concentración 2,5x10-6 M del compuesto 104 y 5x10-6
M del aminoácido. La adición del aminoácido se considera como t = 0 a partir del cual
se adquieren espectros de emisión en intervalos de tiempo regulares de dos minutos,
prolongando los experimentos un mínimo de dos horas.
299
300

1
H-RMN 76 (DMSO-d6)
13
C-RMN 76 (DMSO-d6)
301
1
H-RMN 77 (DMSO-d6)
13
C-RMN 77 (DMSO-d6)
302
1
H-RMN 80 (DMSO-d6)
13
C-RMN 80 (DMSO-d6)
303
1
H-RMN 83 (D2O-20% DMSO-d6)
13
C-RMN 83 (D2O-20% DMSO-d6)
304
1
H-RMN 86 (DMSO-d6)
13
C-RMN 86 (DMSO-d6)
305
1
H-RMN 87 (DMSO-d6)
13
C-RMN 87 (DMSO-d6)
306
1
H-RMN 96 (DMSO-d6)
13
C-RMN 96 (DMSO-d6)
307
1
H-RMN 97 (DMSO-d6)
13
C-RMN 97 (DMSO-d6)
308
1
H-RMN 104 (DMSO-d6)
13
C-RMN 104 (DMSO-d6)
309
1
H-RMN 106 (DMSO-d6)
13
C-RMN 106 (DMSO-d6)
310
311
312

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TESIS DOCTORAL

OLIGOESCUARAMIDAS CÍCLICAS: SÍNTESIS Y

Ángel Sampedro Palerm

Programa de Doctorado en Ciencia y Tecnología

OLIGOESCUARAMIDAS CÍCLICAS: SÍNTESIS Y

Ángel Sampedro Palerm

Director/a: Antonio Costa Torres

Doctor/a por la Universitat de les Illes Balears

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