Merged

Departamento de Estomatología
Facultad de Odontología
Universidad de Sevilla
Tesis Doctoral
Implicación de la mitocondria y del

complejo NLRP3-inflamasoma en la
fisiopatología de la fibromialgia
Mario David Cordero Morales

Sevilla, 2015
Departamento de Estomatología
Facultad de Odontología
Implicación de la mitocondria y del complejo

NLRP3-inflamasoma en la fisiopatología de la
fibromialgia
Memoria de tesis presentada por Mario David Cordero Morales, Graduado

en Nutrición Humana y Dietética por la Universidad Pablo de Olavide de
Sevilla, para optar al GRADO DE DOCTOR
Los directores
Pedro Bullón Fernández José Antonio Sánchez Alcázar
Sevilla, a 26 de Octubre de 2015

D. PEDRO BULLÓN FERNÁNDEZ, DOCTOR EN MEDICINA POR LA
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID Y CATEDRÁTICO DE MEDICINA
ORAL DEL DEPARTAMENTO DE ESTOMATOLOGÍA DE LA FACULTAD DE
ODONTOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA.
D. JOSÉ ANTONIO SÁNCHEZ ALCÁZAR, DOCTOR EN MEDICINA POR LA

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID Y PROFESOR TITULAR DEL
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA, ANATOMÍA Y BIOLOGÍA CELULAR DE LA
UNIVERSIDAD PABLO DE OLAVIDE
INFORMAN
que Don Mario David Cordero Morales, graduado en Nutrición Humana y Dietética
por la Universidad Pablo de Olavide, ha realizado bajo su dirección el trabajo titulado
“Implicación de la mitocondria y del complejo NLRP3-inflamasoma en la fisiopatología
de la fibromialgia” y que a su juicio reúne los méritos suficientes para optar al grado de
Doctor.
Para que conste, firman la presente en Sevilla, a 26 de Octubre de 2015
Dr. Pedro Bullón Fernández Dr. José Antonio Sánchez Alcázar

“Si hay algo en nosotros
verdaderamente divino, es la voluntad.
Por ella afirmamos la personalidad,
templamos el carácter, desafiamos la
adversidad, reconstruimos el cerebro y
nos superamos diariamente”
Santiago Ramón y Cajal
Y al final……lo conseguí
AGRADECIMIENTOS
Dicen que podemos ser y hacer todo aquello que nos propongamos, la cuestión es cómo
y cuándo. El tiempo pasa y la vida nos pone obstáculos que vamos superando con mayor
o menor éxito. Mi padre siempre decía que confiaba en esta cabecita loca y que podría
hacer todo lo que me propusiera, pero tenía que luchar por ello y trabajar con constancia.
Tengo grabado en mi memoria los recuerdos de mi infancia en mi Triana del alma, de

muy pequeño capturando insectos en la vía de mi barriada para mi colección, observando
los pájaros y tomando notas, construyendo un terrario con mi padre para observar las
lagartijas que cogía en los jardines. Aún recuerdo, cuando mi hermana Mari Carmen, me
regaló con uno de sus primeros sueldos un conjunto de pipetas, matraces, probetas y tubos
de ensayo que conseguimos en una farmacia para poder hacer mis “experimentos”, y es
que el Quimicefa se me quedaba pequeño. Y para esto, mi padre nuevamente, me ayudaba
a construir una gradilla con paneles de madera de manualidades. Siempre quise ser
científico, siempre tuve la necesidad de explorar, aprender y descubrir. Y a pesar de que
en vez de dedicarme a estudiar, se me pasaba el tiempo haciendo estas cosas mi padre
confió en mí.
Y ahora, por fin después de muchas cosas en la vida, ha llegado el final, el doctorado. El
final y el principio, por supuesto. Y son muchas las personas que han pasado por este
periodo de mi vida. Mi profesor, Juan Gonzáles, del Instituto Vicente Aleixandre, quién
me dejaba ir al laboratorio de prácticas en el BUP porque supo ver la vocación científica
en mí.
Tras un silencio en mi vida, pasé a estudiar el módulo de técnico de laboratorio, un

periodo de mi vida en el que me comí los libros y resurgió en mi ese afán por comerme
el mundo y ya no pude parar; la prueba de mayores de 25, entrar en medicina, las prácticas
en el Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, el cambio de carrera, el master……….Y
tanta gente que pasó por mi vida!!!! Tengo por ello que agradecer tantas cosas, al grupo
de Plácido Navas, con quién hice las prácticas, y aprendí tanto, conocí a los jóvenes
futuros científicos, Gloria, María, Mariví, José, a los jefes, Guillermo, Carlos, Juan
Carlos, Emilio, Claudio,……. A mis compañeras de armas, Ángela, quién me acompaño
desde el primer día de entrada en el laboratorio, a Mª Ángeles, con quien formé un
estupendo equipo. Ángel Carrión, aún nos queda camino que recorrer en nuestros
proyectos. Y allí conocí a mi maestro y codirector de la tesis, José Antonio, alias el súper.
Tú fuiste primero jefe, después maestro, ahora compañero de armas, pero siempre amigo,
gracias Súper.
Un día apareció en mi vida otra persona, Pedro Bullón, mi otro codirector y también
amigo por siempre. Contigo aprendí que el trabajo no pesa cuando realmente te enamora
y hay pasión, y supiste ver en mí alguien por quien aportar y confiar, y eso llega muy
adentro, créeme.
A mi maestro de artes marciales Kim, quién forjó un luchador incansable por aquello en
lo que creo, por mis ideales de vida y creencias y por inculcarme que, como él decía, un
cinturón negro es un guerrero y puede conseguirlo todo en la vida.
A mis amigos de Triana, de mi infancia, por hacerme pasar una vida llena de diversión,
risas y aventuras y dadme un motivo para estar orgulloso de la amistad, Juanma (con
quién crecí y me dio siempre lo mejor de la amistad), Juaki (mi pareja de hecho, y de
aventuras), Iván (y esa paciencia y lealtad a su grupo), Ale (que no dejaba de bajar de la
academia para estar con su gente), Pichi (quién siempre sabe animarnos), Viejo (nuestro
árbitro), Rafa (el animal que a pesar de ser tan bruto eres un amigo fiel), Camas (siempre
estás presente donde quiera que estés), Casau (que nunca dejó pasar un minuto sin
sentarse con nosotros), Cacereño (siempre tienes una historia para alegrarnos la vida),
Carlitos (mi compi del nocturno), Jorge (siempre te acuerdas de mí, donde quiera que
estemos), Barat (nunca dejé de divertirme a tu lado), Navarro (cada día veo más la gran
persona que eres) y los que se fueron incorporando y aportando esa riqueza que siempre
nos ha caracterizado como Raulito, Isra y Mon que me habéis dado motivos para
alegrarme cada día de conoceros. Y las niñas (Reyes, Mirian, Mª Ángeles, Esther, Vicki)
por supuesto, no os pongáis celosas!!!!!
Aquellos amigos que en un momento dado entraron en mi vida, y vivieron conmigo esta
carrera de fondo: Anabel y Guille (lo hemos pasado bien ehh!!), Maurizio y Pepe Quiles,
gracias a esa comida un día de navidad di el salto de carrera y aquí estamos, gracias por
esa gran idea, y ese apoyo incondicional. A Lucía y su sonrisa y mi equipo, Lourdes,
Fabiola, Diego, Lucho, Rafa, y Ángel, que cada día comparten el amor a la ciencia.
A mi Triana, mi barrio, que siempre te llevo por bandera, vaya donde vaya, esté donde
esté, tú me haces ser lo que soy y sentirme orgulloso.
Y llega el momento, mi familia, mi madre, mis hermanas Mari Carmen y Mari Luz,
siempre me apoyasteis y sentisteis orgullosas de mí, gracias por estar ahí siempre. Mi
cuñado, Juan Carlos, que me vistes crecer y me acompañaste en cada una de las
situaciones por las que esta familia pasó, buenas y malas. Mis niñas, Débora y Ana, jamás
podréis cuantificar cuanto os quiero y significáis para mí. Siempre estaré ahí, para
vosotros, siempre. Mi nuevo cuñado, le diste a mi hermana una ilusión, y ya eres parte de
mi familia. Mi otra familia, Manolo y Ani, mis suegros, José Y Mª José, Paco y Anabel
mis cuñados y mis sobrinos Gabi, Aitor e Izan, por confiar en mí y sentiros orgullosos día
tras día.
Pero, hay alguien importante en mi vida que me ha motivado día a día y merecen una
especial atención: mi padre, que no solo fuiste mi referente como persona, y confiaste en
mi hasta tu marcha, sino que precisamente tu marcha y enfermedad fueron las que me
motivaron a trabajar duramente por la gente que sufre. Cada idea que surge en mí, la
inspiras tú.
Y por último, Ely, mi mujer. Cariño, eres la luz que alumbra mi vida, mi pasión, mi
compañera en la vida y en la ciencia y mi refugio. Todo esto, absolutamente todo, te lo
debo a ti, porque me supiste animar, inspirar, apoyar y querer con todos mis defectos.
Hemos pasado de todo en esta vida, pero nunca hemos dejado de luchar juntos, como un
equipo, sin miedo, y así seguiremos, y lo conseguiremos, cada uno de nuestros proyectos
porque a tu lado me hago el hombre más fuerte y feliz del mundo. Te quiero mi amor.
ÍNDICE
Resumen
Abreviaturas-----------------------------------------------------------------------------------1
1. Introducción-----------------------------------------------------------------------------------7
1.1. La mitocondria-------------------------------------------------------------------------------7
1.2. Mitocondria y estrés oxidativo-----------------------------------------------------------13
1.3. Enfermedades mitocondriales------------------------------------------------------------14
1.4. Inflamación e inflamasoma---------------------------------------------------------------18
1.5. La fibromialgia------------------------------------------------------------------------------22
1.5.1. Disfunción mitocondrial en la fibromialgia----------------------------------------23
2. Objetivos--------------------------------------------------------------------------------------31
3. Material y métodos--------------------------------------------------------------------------35
3.1. Pacientes--------------------------------------------------------------------------------------35
3.2. Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------36
3.3. Cultivos de Fibroblastos-------------------------------------------------------------------37
3.4. Líneas celulares-----------------------------------------------------------------------------37
3.4.1. Líneas de fibroblastos de fibromialgia------------------------------------------------37
3.4.2. Líneas de fibroblastos de enfermedades mitocondriales--------------------------37
3.5. Muestras de sangre-------------------------------------------------------------------------38
3.6. Aislamiento de PBMC mediante Ficoll-PaqueTM PLUS----------------------------38
3.7. Obtención de muestras biológicas-------------------------------------------------------39
3.8. Generación de cíbridos trans-mitocondriales-----------------------------------------40
3.9. Extracción de CoQ de muestras biológicas--------------------------------------------41
3.10. Extracción de ADN------------------------------------------------------------------------42
3.11. Determinación de los niveles de CoQ por HPLC------------------------------------43
3.12. Análisis enzimático de la Cadena respiratoria mitocondrial (CRM)------------43
3.12.1. Preparación de fibroblastos para determinación de la CRM-------------------43
3.12.2. Análisis enzimático de la CRM a partir de homogenados de fibroblastos---44
3.12.3. Citrato sintasa---------------------------------------------------------------------------44
3.12.4. Complejo I: NADH CoQ Oxidorreductasa----------------------------------------45
3.12.5. Complejo II: Succinato deshidrogenasa--------------------------------------------45
3.12.6. Complejo III: DBH2-Citocromo C Oxidorreductasa----------------------------46
3.12.7. Complejo I+III: NADH-Citocromo C reductasa---------------------------------47
3.12.8. Complejo II+III: Succinato-Citocromo C- reductasa---------------------------48
3.12.9. Complejo IV: Citocromo C oxidasa-------------------------------------------------48
3.13. Análisis de proteínas mediante Western Blot----------------------------------------49
3.13.1. Cuantificación de proteínas por el método Bradford----------------------------49
3.13.2. SDS-Page y Western Blot--------------------------------------------------------------49
3.13.3. Inmunodetección con anticuerpos y electrotransferencia-----------------------50
3.14. Amplificación por PCR y secuenciación ---------------------------------------------50
3.15. Niveles de IL-1β e IL-18------------------------------------------------------------------51
3.16. Niveles de ATP-----------------------------------------------------------------------------52
3.17. Cuantificación de ADNmt---------------------------------------------------------------53
3.18. Genotipado de la mutación en pacientes y cíbridos --------------------------------53
3.19. Producción mitocondrial de ROS------------------------------------------------------54
3.20. Determinación de la peroxidación lipídica-------------------------------------------54
3.21. Cuantificación de la tasa de proliferación celular----------------------------------55
3.22. Determinación de los niveles de daño oxidativo del ADN
por 8-hidroxideoxiguanosina-----------------------------------------------------------55
3.23. Tasa de consumo de oxígeno (OCR)---------------------------------------------------56
3.24. Análisis de la estructura y la secuencia de conservación--------------------------57
3.25. Análisis estadístico------------------------------------------------------------------------57
4. Resultados--------------------------------------------------------------------------------------61
LA ACTIVACIÓN DEL COMPLEJO NLRP3-INFLAMASOMA ES INDUCIDA
POR LA DISFUNCIÓN MITOCONDRIAL EN LAS CÉLULAS
MONONUCLEARES DE LOS PACIENTES CON FM.
4.1. Disfunción mitocondrial en PBMC de pacientes con FM---------------------------62
4.2. Estrés oxidativo en PBMC de los pacientes con FM---------------------------------66
4.3. Activación del complejo inflamasoma por el estrés
oxidativo involucrados en el dolor de la FM------------------------------------------------66
4.4. La inducción de deficiencia de CoQ10 produce la activación
del inflamasoma----------------------------------------------------------------------------------74
FISIOPATOLOGÍA DE LA DISFUNCIÓN MITOCONDRIAL EN
FIBROBLASTOS DE FIBROMIALGIA
4.5. Metabolismo mitocondrial en fibroblastos de pacientes con FM------------------77
4.6. Niveles de estrés oxidativo en los fibroblastos de pacientes con FM--------------85
UNA MUTACIÓN EN EL GEN CITOCROMO B DEL ADN MITOCONDRIAL
EN UNA FAMILIA CON FIBROMIALGIA SE ASOCIA CON LA ACTIVACIÓN
NLRP3 – INFLAMASOMA
4.7. Análisis de ADNmt de pacientes con FM-----------------------------------------------91
4.8. Análisis molecular de la mutación encontrada---------------------------------------94
4.9. Análisis de la estructura y secuencia de aminoácidos-------------------------------97
4.10. Estudios fisiopatológicos---------------------------------------------------------------99
4.11. Activación del complejo NLRP3-inflamasoma----------------------------------103
5. Discusión--------------------------------------------------------------------------------------117
6. Conclusiones----------------------------------------------------------------------------------131
7. Bibliografía-----------------------------------------------------------------------------------135
8. Producción------------------------------------------------------------------------------------151
ANEXOS-----------------------------------------------------------------------------------------153
RESUMEN
La fibromialgia (FM) es un síndrome de dolor crónico generalizado de alta prevalencia
mundial que supone un verdadero enigma clínico dado su heterogeneidad y su
desconocida etiología. Su fisiopatología ha sido ampliamente investigada y se han
propuesto varias hipótesis biológicas entre las cuales, la inflamación, la disfunción
mitocondrial y el estrés oxidativo han mostrado una gran implicación. Nuestro estudio ha
profundizado en el papel de la disfunción mitocondrial mediante el uso de un modelo in
vitro utilizado para el estudio de las patologías mitocondriales. Para ello, hemos usado
fibroblastos de piel mediante los cuales, hemos descrito una deficiencia de la actividad
de la cadena respiratoria mitocondrial, una deficiencia de CoQ10, así como un incremento
del daño oxidativo. Además, esta disfunción mitocondrial provocada la activación de un
complejo multiproteico denominado, complejo NLRP3-inflamasoma el cual, es
responsable se la inflamación sistémica.
Por otro lado, muchos de los síntomas asociados con las enfermedades mitocondriales,
como intolerancia al ejercicio, fatiga, miopatía están presentes en muchos pacientes con
FM que presentan disfunción mitocondrial. En este estudio, mostramos una mutación en
el gen citocromo b del ADN mitocondrial (ADNmt) en una familia con FM y la
implicación del complejo NLRP3-inflamasoma en varias mutaciones mitocondriales.
Tras la secuenciación de ADNmt de varios pacientes con FM, encontramos una mutación
mitocondrial homoplásmica m.15804T > C en el gen mtCYB en un paciente transmitida
por vía materna, que aparece en todos miembros de la familia con el diagnóstico de FM.
La mutación estaba presente en varios tejidos de la paciente. Los fibroblastos de piel de
la paciente mostraron disfunción mitocondrial y estrés oxidativo asociado a la activación
del complejo NLRP3-inflamasoma así como una mejora del metabolismo celular tras la
inhibición del complejo inflamasoma o la suplementación con CoQ10. Los cíbridos trans-
mitocondriales que portaban la mutación m.15804T> C mostraron las alteraciones
fisiopatológicas observadas en los fibroblastos de la paciente con FM. Interesantemente,
la activación del complejo NLRP3-inflamasoma también se observó en líneas de
fibroblastos derivados de pacientes con otras enfermedades mitocondriales como
Miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis láctica y accidentes cerebrovasculares
(MELAS), Epilepsia mioclónica con fibras rojas rasgadas (MERRF) y Neuropatía óptica
hereditaria de Leber (LHON). En este trabajo mostramos por primera vez una mutación
en el ADNmt responsable de la disfunción mitocondrial, el estrés oxidativo y la activación
inflamasoma asociado con una familia con diagnóstico de FM. Sobre la base de nuestros
datos, se propone el análisis de secuencias del ADNmt en pacientes con FM con
evidencias de herencia materna como una posible herramienta de diagnóstico. Además,
la activación NLRP3-inflamasoma como consecuencia de la disfunción mitocondrial
podría estar implicada en la fisiopatología de las enfermedades mitocondriales.

Abreviaturas
ABREVIATURAS
16673-34-0: 5-cloro-2-metoxi-N- [2- (4-sulfamoilfenil) etil] benzamida
8-oxo-G: 8-hidroxideoxiguanosina
ACR: Colegio Americano de Reumatología
ADNmt: ADN mitocondrial
ADNn: ADN nuclear
ATP: Adenosín trifosfato
ASC: Proteína adaptadora
BMCs: Células mononucleares de sangre periférica
BMI: Índice de masa corporal
CS: Citrato sintasa
CoQ10: Coenzima Q10
CPEO: Oftalmoplejia externa progresiva crónica
Cu/ZnSOD: Superóxido de cobre/zinc dismutasa
DCPIP: 2,6-Dicloroindofenol sodio hidratado
DTNB: 5,5′-Dithiobis (2-ácido nitrobenzoico)
FBS: Suero fetal bovino
FM: Fibromialgia
FIQ: Cuestionario de Impacto de Fibromialgia
1
GPX: Glutation peroxidasa
H2O2: Peróxido de hidrógeno
HRP: Peroxidasa de rábano picante
IMC: Índice de masa corporal
IOD: Intensidad óptica integrada
LHON: Neuropatía óptica hereditaria de Leber
LPS: Lipopolisacárido
LRR: Leucine rich region
MELAS: Miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis láctica y accidente
cerebrovascular
MERRF: Epilepsia mioclónica con fibras rojas rasgadas
MnSOD: Manganeso superóxido dismutasa
mtNOS: Óxido nítrico sintasa mitocondrial
NARP: Debilidad muscular neurogénica, ataxia y retinitis pigmentosa
NLR: Receptor Nod-like
NO: Óxido nítrico
O2: Oxígeno
OCR: Tasa de consumo de oxígeno
ONOO-: Peroxinitrito
2
Abreviaturas
OXPHOS: Fosforilación oxidativa
PABA: 4-aminobenzoato
PBMC: Células mononucleares de sangre periférica
PCr: Fosfocreatina
PEG: Polietilenglicol
RMN: Resonancia magnética nuclear
ROS: Especies reactivas de Oxígeno
SRC: Capacidad respiratoria de repuesto
VAS: Escala analógica visual
3
4
Introducción
INTRODUCCIÓN
5
6
Introducción
1. INTRODUCCIÓN
1.1. La mitocondria
Las mitocondrias son importantes orgánulos de doble membrana presentes en
prácticamente todas las células eucariotas. Una de las principales funciones de la
mitocondria es la producción de ATP a través del sistema conocido como fosforilación
oxidativa mediante una serie de reacciones mediadas por complejos multiprotéicos
codificadas tanto por el ADN nuclear (ADNn) como el ADN mitocondrial (ADNmt)
(Haas et al., 2008; De Greaves et al., 2012) (Figura 1). Por otra parte, las mitocondrias
juegan un papel crucial en muchos otros procesos metabólicos y regulatorios, y en una
variedad de mecanismos patológicos (Turrens, 2003; Haas et al., 2008). La enorme
actividad bioenergética y respiratoria que tiene lugar en las mitocondrias hacen de esta
un entorno con alta producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) que son
responsables tanto del daño que se produce dentro de la mitocondria como de la
producción de altos niveles de estrés oxidativo y daño en otras partes de la célula
(membranas, orgánulos, ADN, etc) (Turrens, 2003).
7
Figura 1. Estructura de la mitocondria. En la imagen de aprecia la doble membrana, la molécula circular
de ADN así como la localización donde se lleva a cabo la fosforilación oxidativa o cadena respiratoria
mitocondrial a partir de los sustratos derivados del metabolismo del piruvato y los ácidos grasos.
Modificado de Cohen & Gold, 2001.
Una de las principales características de las mitocondrias respecto a otros orgánulos es la
de conservar vestigios de su vida como organismos independientes según la teoría
endosimbiótica. Así, las mitocondrias se reproducen por un proceso de fisión binaria
similar a las bacterias y presentan su propio sistema genético en una molécula circular de
ADN, con todos los genes necesarios para replicar, transcribir y traducir la información
genética que contiene (Wallace, 2005). El resto de material genético de la bacteria original
que no se conservó en el ADNmt fue transferido al ADNn.
8
Introducción
De ese modo, la mayoría de las proteínas mitocondriales son codificadas por genes
nucleares y sintetizadas en los ribosomas citoplasmáticos y desde ahí son importadas a la
mitocondria mediante el reconocimiento de una secuencia peptídica amino terminal
característica (Wallace, 2005). El ADNmt humano, de estructura circular, está compuesto
por 16,569 pares de bases, y contiene información para 37 genes de los cuales 13
corresponden a proteínas de la cadena respiratoria mitocondrial que intervienen en el
sistema de fosforilación oxidativa, 22 de ARN transferente y 2 ARN ribosómico (Figura
2).
16569 pares de
bases
37 genes
Figura 2. Molécula de ADN mitocondrial. Modificado de
http://haygenealogy.com/dankenbring/genome.html.
9
Las 13 proteínas que hemos mencionado son componentes de cuatro de los cinco
complejos de la cadena respiratoria mitocondrial, de los cuales: 7 subunidades (ND1,
ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5 y ND6) de la NADH:ubiquinona oxido-reductasa
(Complejo I); una subunidad (cyt b) del ubiquinol:citocromo c óxido-reductasa
(Complejo III); 3 subunidades (COX I, II y III) del citocromo c oxidasa (Complejo IV);
y 2 subunidades de la ATP sintetasa (Complejo V) (Acín-Pérez y Enríquez, 2014). El
resto de las proteínas de estos complejos y el Complejo II en su totalidad, están
codificados por el ADNn. El ADNmt codifica además 2 ácidos ribonucleicos ribosómicos
(ARN 12S y 16S), componentes de los ribosomas específicos mitocondriales, y 22 ácidos
ribonucleicos de transferencia (ARNt) (Shokolenko y Alexeyev, 2015).
La cadena respiratoria mitocondrial está compuesta, como vemos, de cinco complejos
multienzimáticos. El transporte de electrones entre los complejos I y IV está acoplado a
la extrusión de protones a través de la membrana interna mitocondrial por los
componentes de la bomba de protones de la cadena respiratoria. La cadena respiratoria
transfiere electrones de NADH y FADH2, productos ambos de la degradación de
sustratos orgánicos como el piruvato y los ácidos grasos en la matriz mitocondrial (Figura
3), al oxígeno molecular que actuará como último aceptor de electrones. La energía
procedente de la oxidación de estos sustratos se utiliza para generar un gradiente protón-
motriz a través de la membrana interna mitocondrial. El complejo V utilizará este
gradiente de protones para catalizar la síntesis de ATP a partir de ADP y fosfato
inorgánico. Es precisamente en la cadena respiratoria mitocondrial donde se producen
gran cantidad de estos ROS debido al flujo de electrones entre los complejos y a la
participación de transportadores de electrones como el Coenzima Q (CoQ) (Figura 3)
que pueden verse alterados en determinadas condiciones patológicas (Area-Gómez y
Schon, 2014).
10
Introducción
Figura 3. Cadena respiratoria mitocondrial. Los complejos multiprotéicos se sitúan en la membrana interna
mitocondrial donde se realiza el transporte de electrones que generará un gradiente de protones a lo largo
de la membrana permitiendo la síntesis de ATP. El CoQ actúa como transportador de electrones,
transfiriéndolos de los complejos I y II al complejo III, que a su vez los cede al citocromo c. El complejo
IV cede los electrones del citocromo C al O2 para formar H2O2. Al mismo tiempo se desarrolla un flujo de
protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana que produce un gradiente electroquímico
que permite la síntesis de ATP mediante la formación de un enlace de alta energía entre ADP y fosfato.
El CoQ o ubiquinona (2,3,dimetoxi-5-metil-6-poliprenil-1,4-bezoquinona) es un lípido
isoprenoide constituido por un anillo bencénico hidroxilado que posibilita la función del
CoQ en la cadena respiratoria mitocondrial al poseer la capacidad de captar y ceder
electrones y una cola isoprenoide hidrófoba que le confiere la propiedad de anclarse a la
membrana. La cola isoprenoide está compuesta por una serie de repeticiones de moléculas
de isopreno con 5 átomos de carbono y un doble enlace. El número de unidades de
isopreno es característico de cada especie y, aunque suele haber una forma predominante,
muchas especies tienen distintas isoformas de CoQ. Por tanto, en humanos el CoQ se
denomina CoQ10, donde “10” es el número de unidades isoprenoides que contiene. De
igual forma, los mamíferos de mayor tamaño (caballos, conejos, cerdos) poseen también
11
CoQ10, en el caso de los roedores encontramos que sintetizan CoQ9 y CoQ10 (Turunen et
al., 2002).
El CoQ está presente en todos los tejidos, sin embargo, las cantidades suelen ser variables
con gran dependencia al tipo de tejido. Así, esta concentración de CoQ en un organismo
varía de un órgano a otro y entre las distintas regiones de un mismo órgano o tejido,
aunque hay que tener en cuenta que la dieta influye considerablemente en las
concentraciones de los diferentes tejidos. Igualmente, esta concentración varía en un
mismo individuo a lo largo de su vida siendo muy influenciada por el envejecimiento.
Los tejidos más ricos en CoQ son el tejido cardíaco, hepático, muscular y cerebral. Dentro
de un mismo tejido, las zonas con más abundancia de CoQ son las membranas externa e
interna mitocondrial, los lisosomas y las vesículas de Golgi (Turunen et al., 2004).
Se han descrito diversas funciones sobre el CoQ entre las cuales, la principal es la de
participar en la fosforilación oxidativa transfiriendo electrones desde los complejos I y II
al complejo III mitocondrial, facilitando el paso de protones desde la matriz mitocondrial
al espacio intermembrana (Turunen et al., 2004). Por lo tanto un componente decisivo de
los procesos de fosforilación oxidativa, para producir energía en forma de adenosín
trifosfato (ATP). Este carácter de transportador de electrones le confiere también
capacidad antioxidante actuando como agente protector frente a la peroxidación y
manteniendo en su estado reducido antioxidantes exógenos como el alfa-tocoferol
(vitamina E) y el ascorbato (vitamina C) (Villalba et al., 2000). Dado su importante papel
en la mitocondria, su deficiencia se ha asociado a diversas patologías en las cuales, la
disfunción mitocondrial se ha asociado de forma directa o indirecta a su fisiopatología y
constituye una herramienta diagnóstica en las patologías mitocondriales (Haas et al.,
2008).
12
Introducción
1.2. Mitocondria y estrés oxidativo
Además de energía, la fosforilación oxidativa mitocondrial también genera especies
reactivas de oxígeno (ROS). Cuando la cadena respiratoria mitocondrial se convierte en
altamente reducida, el exceso de electrones de los complejos I y III, pueden pasar
directamente a O2 para generar el anión superóxido (O2-). El superóxido se transforma en
peróxido de hidrógeno (H2O2) por las enzimas de desintoxicación manganeso superóxido
dismutasa (MnSOD) o superóxido de cobre/zinc dismutasa (Cu/ZnSOD), y luego a agua
por la catalasa, glutation peroxidasa (GPX) o peroxidroxin III (IIIPRX). Sin embargo,
cuando estas enzimas no pueden convertir ROS como el radical superóxido a agua lo
suficientemente rápido, el daño oxidativo se produce y se acumula en la mitocondria. Si
el H2O2 se encuentra con un metal de transición reducido, o se mezcla con O2-, el H2O2
puede reducirse aún más a radical hidroxilo (OH•) que es el agente oxidante más potente
entre los ROS. De forma adicional, el óxido nítrico (NO) se produce dentro de las
mitocondrias por la óxido nítrico sintasa mitocondrial (mtNOS) y se difunde libremente
en la mitocondria desde el citosol. NO reacciona con O2- para producir peroxinitrito
(ONOO-). Estos dos radicales junto con otros, pueden ocasionar un gran daño a la
mitocondria y otros componentes celulares (Turrens, 2003).
En condiciones fisiológicas normales, la producción de ROS está bastante regulada. Sin
embargo, si la cadena respiratoria está inhibida, o ciertos componentes claves de la misma
como el CoQ10 son deficientes, los electrones acumulados en los transportadores de la
cadena, aumentan considerablemente el número de electrones desapareados que son
transferidos a O2 para generar O2-. Una producción excesiva de ROS mitocondrial puede
exceder la defensa antioxidante celular y el daño acumulado puede, en última instancia,
destruir la célula por necrosis o por apoptosis.
13
Figura 4. Mecanismo de producción de especies reactivas de oxígeno en la cadena respiratoria
mitocondrial. Fuente: modificado de Turrens JF, 2003. cit c3 -: citocromo c3; CuZnSOD: cobre-zinc
superóxido dismutasa; H2O2: peróxido de hidrógeno; MnSOD: manganeso superóxido dismutasa; O2:
oxígeno; O2-: anión superóxido.
1.3. Enfermedades mitocondriales
En 1962, el Dr. Rolf Luft describe por primera vez una enfermedad asociada a la
mitocondria, concretamente a la transducción de la energía en las mitocondrias (Luft et
al., 1962). Se trató de un paciente de 30 años que presentaba debilidad general,
transpiración excesiva, no incremento de peso a pesar de aumentar la ingesta, y un alto
metabolismo basal. En este caso, el diagnóstico mostró un fallo en el mecanismo de
acoplamiento de la fosforilación oxidativa. A partir de este momento la medicina
mitocondrial comienza a adquirir relevancia, habiéndose descrito hasta la fecha 150
14
Introducción
patologías genéticas asociadas a la mitocondria. Las enfermedades mitocondriales son un
grupo de trastornos producidos por un fallo en el sistema de fosforilación oxidativa, con
la consiguiente deficiencia de ATP. Constituyen un grupo muy heterogéneo de
enfermedades de fenotipo complejo (Rubio Lightowlers et al., 2015). Dada la variedad
de afectaciones que causan, son enfermedades multisistémicas que se originan por
alteraciones en los genes que codifican las reacciones metabólicas que tienen lugar en la
mitocondria. Esto conlleva la aparición de múltiples signos y síntomas por la afectación
de distintos órganos y tejidos, como el músculo, el sistema nervioso, el corazón, el riñón
o las glándulas endocrinas, siendo sobre todo el músculo y el sistema nervioso los más
vulnerables debido a su alta demanda energética, por lo que son los principales tejidos
afectados en estas enfermedades (Taylor et al., 2005). Las manifestaciones clínicas de
estas afecciones son muy variadas, incluyendo deterioro de las funciones mentales,
trastornos motores, intolerancia al ejercicio, epilepsia, retinosis pigmentaria, accidentes
vasculares, oftalmoplejía, cardiomiopatía, sordera, insuficiencia hepática y pancreática
así como acidosis metabólica (Dimauro e Hirano, 2009).
Debemos tener en cuenta que las patologías mitocondriales no solo son aquellas que se
producen por alteraciones en los genes del ADNmt dado que para su función, la
mitocondria cuenta tanto con los genes codificados por su propio ADN, como por genes
codificados a partir de ADNn. Por ello, las enfermedades mitocondriales se clasifican
desde un punto de vista genético en dos grupos:
15
Enfermedades por defectos en el ADN mitocondrial:
En este grupo incluimos mutaciones puntuales (sustituciones de bases) y mutaciones por
reordenamientos simples o complejos de nucleótidos (deleciones, duplicaciones,
inserciones), y pueden afectar a cualquiera de los 37 genes del genoma mitocondrial
(Haas et al., 2008). El grado de afectación en este tipo de alteraciones dependerá del grado
de heteroplasmia, que consiste en el número de copias de ADNmt que presentan la
mutación. En este sentido, es necesario que la mutación afecte a un número mínimo de
copias para que la célula presente el correspondiente defecto bioquímico (Dowling,
2014), por lo que la expresión clínica de una mutación puntual vendrá determinada por la
relación entre copias sanas y mutadas en los diferentes tejidos (Haas et al., 2008; Dowling,
2014).
La mayoría de las mutaciones puntuales en genes que codifican proteínas de la cadena
respiratoria mitocondrial son de herencia materna (Figura 5), ya que se dan en los genes
del ADN mitocondrial, y tienen carácter multistémico. Sin embargo, se presentan también
casos de mutaciones esporádicas y específicas de tejido (Andreu, et al., 2004). Entre estas
patologías destacan: Neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON), Síndrome de Leigh
y Debilidad muscular neurogénica, ataxia y retinitis pigmentosa (NARP), Epilepsia
mioclónica y fibras rojas de aspecto rasgado (MERRF), Encefalomiopatía mitocondrial,
acidosis láctica y episodios que asemejan a la apoplejía (MELAS), Síndrome de Kearns-
Sayre, el Síndrome de Pearson y la Oftalmoplejia externa progresiva crónica (CPEO)
(Chinnery et al., 2014).
16
Introducción
Padre Madre Padre Madre

afectado no afectada no afectado afectada
Hijos no afectados Hijos afectados
Afectados
No afectados
Figura 5. Esquema del perfil de herencia materna característica de las enfermedades mitocondriales
causadas por mutaciones en el ADN mitocondrial. Fuente: modificado de
http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/illustrations.
Enfermedades asociadas a defectos en el ADN nuclear
El ADNn codifica multitud de proteínas (se estima que cerca de 3000 genes) que son
transportadas hasta la mitocondria para desempeñar gran variedad de funciones (Ng y
Turnbull, 2015). Por ello, muchas enfermedades mitocondriales hereditarias están
causadas por mutaciones en genes nucleares en cuyo caso se presentan con herencia de
tipo mendeliana. Estos genes codifican para cada una de las funciones relacionadas con
la mitocondria como:
17
 Subunidades estructurales de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial.
 Ensamblaje de complejos mitocondriales.
 Señalización intergenómica entre DNAn y ADNmt.
 Ensamblaje y estabilidad mitocondrial.
 Replicación mitocondrial y biogénesis.
 Fisión-fusión.
 Vía oxidación de ácidos grasos.
 Proteínas del ciclo de Krebs.
En este sentido, existen patologías asociadas a fallos en cada uno de estos genes y por
tanto rutas metabólicas. Algunos ejemplos importantes en este grupo son las mutaciones
en los genes del complejo I: NDUFV1, NDUFV2, NDUFS1, NDUFS2, NDUFS4,
NDUFS6, NDUFS7, NDUFS8 asociadas a la enfermedad de Leigh, leucodistrofia,
cardiomiopatía y encefalopatías así como epilepsia mioclónica. Asociadas al complejo II:
flavoproteina y SDHD asociadas a la enfermedad de Leigh y paraganglioma hereditario,
o los genes relacionados con la síntesis de CoQ10 que se asocian a fallos en los complejos
I, II y III dando como consecuencias miopatía, ataxia y problemas de desarrollo. Existen
también ejemplos en cuanto al ensamblaje y estabilidad de las mitocondrias como las
mutaciones en los genes: SURF1, SCO1 y SCO2, COS10 asociadas al síndrome de Leigh
y a la encefalopatía infantil (Ng y Turnbull, 2015).
Desde un punto de vista terapéutico, estas patologías no tienen tratamientos eficaces
actualmente dado su complejidad. Sin embargo, actualmente las terapias de este conjunto
de enfermedades están enfocadas a la protección y mejora del metabolismo mitocondrial.
Algunos de los compuestos comúnmente usados son: L-carnitina, necesaria para el
transporte de ácidos grasos de cadena larga a la matriz mitocondrial donde se somete a β
18
Introducción
–oxidación; L-arginina, que aumenta la disponibilidad de óxido nítrico conduciendo a
mejorar la vasodilatación intracerebral y el flujo sanguíneo; creatina, que se almacena
principalmente en el músculo, corazón, y cerebro, es metabolizado en fosfocreatina que
es un fosfato esencial donante para regeneración de ATP en el músculo y el cerebro; y el
CoQ10, cuyas funciones ya hemos mencionado (El-Hattab et al., 2015).
1.4. Inflamación e inflamasoma.
La inflamación es una respuesta del cuerpo a la lesión tisular, y desempeña un papel
esencial en la reparación de tejidos. Sin embargo, la inflamación crónica y fuera de
control supone un evento patológico con graves resultados en el daño tisular. La
inflamación es inducida por diversos estímulos, y es el resultado de un cambio en el
equilibrio entre las citoquinas anti-inflamatorias tales como IL-4, IL-5, IL-10 o TGF-β y
pro-inflamatorias como IL-1β, IL-18 o TNFα entre otras, mediadas en su mayoría por la
activación el factor de trascripción NFκB en respuesta a diferentes patrones moleculares
asociados a patógenos (PAMP) o señales de peligro (DAMP) (Harijith et al., 2014). En
los últimos años, las citoquinas IL-1β, IL-18 han adquirido un papel protagonista en
numerosos procesos patológicos no solo por su papel proinflamatorio, sino por ser las
principales citoquinas activadas por el complejo inflamasoma. El complejo inflamasoma
es un complejo multiproteico que comprende un sensor intracelular, por lo general un
receptor Nod-like (NLR), el precursor de la pro-caspasa-1 y el adaptador de ASC cuya
activación conduce a la maduración de la caspasa-1 y el procesamiento de sus sustratos,
IL-1β e IL-18 (Figura 6). Los NLR son receptores citosólicos que regulan la inflamación
y la apoptosis. Están formados por tres dominios en la región amino-terminal, que se
encargan de mediar la transducción de la señal y/o la activación de caspasas inflamatorias
como la caspasa-1. En la región central presentan un dominio de unión a nucléotidos,
responsable de la oligomerización (NOD) que depende del ATP, y en la región carboxi-
19
terminal contiene una secuencia repetitiva rica en leucinas o LRR (leucine rich region),
con la que se une a ligandos específicos. La familia de NLR está constituida por una gran
variedad de miembros (Figura 7).
A B
NLR ASC Caspasa 1
Figura 6. Estructura del complejo inflamasoma. A. Hélice formada por la unión de una proteína NLR, el
precursor de la pro-caspasa-1 y el adaptador de ASC. Modificado de Elinav et al., 2013. B. Estructura de
la hélice tomada por microscopía electrónica. Modificado de Chai J y Shi, 2014.
20
Introducción
Figura 7. Relación de la familia de NLRs descritos
hasta la fecha. Modificado de Chai J y Shi, 2014.
De todos los NLRs, NLRP3 es el más estudiado y se activa por una amplia gama de
señales de estrés celular, y precisamente se ha demostrado que los ROS y la disfunción
mitocondrial son importantes activadores de la inflamación mediada por inflamasoma
(Zhou et al., 2011; Shimada et al., 2014). A este respecto, el estado del ADNmt adquiere
una gran relevancia puesto que suele estar relacionado con la aparición de alteraciones
moleculares (mutaciones, deleciones, depleciones y polimorfismos) que conllevan un
incremento del estrés oxidativo y una considerable disfunción mitocondrial que dificulta
el correcto funcionamiento de la mitocondria.
21
1.5. La fibromialgia.
La fibromialgia (FM) es un síndrome de dolor crónico generalizado acompañado de otros
síntomas como, disminución del umbral del dolor, fatiga muscular, intolerancia al
ejercicio, dolor de cabeza, trastornos del sueño y la depresión. Es una condición crónica
que se caracteriza por un patrón de síntomas difíciles de diagnosticar y tratar. La FM se
diagnostica de acuerdo con los criterios de clasificación establecidos por el Colegio
Americano de Reumatología (ACR) (Wolfe et al., 1990) e investigaciones de laboratorio
de rutina no suelen ser de utilidad puesto que dan resultados normales (Yunus et al.,
1981). La prevalencia de la FM en los países industrializados oscila entre 0,4% y 4% en
la población (que afecta a por lo menos 5 millones de personas en los Estados Unidos y
800.000 en España) y es 11 veces más frecuente en mujeres que en hombres (Lawrence
et el ., 2008). Su alta prevalencia hace que la FM sea un problema importante en los países
desarrollados en los últimos años. La FM provoca absentismo laboral y se ha asociado
con un alto coste de utilización de servicios médicos así como una alta tasa de invalidez.
Por otra parte, el uso de medicamentos y necesidades médicas aumenta notablemente una
vez confirmado el diagnóstico por lo que se estima que el coste de los servicios anuales
de salud de los pacientes con FM es del doble que la de los pacientes con otras patologías
de dolor crónico y pacientes sin dolor. Además, el hecho de que sus criterios diagnósticos
sean solamente clínicos y altamente subjetivos, y que su etiopatogenia aún no se ha
aclarado hace muy difícil el estudio y el enfoque terapéutico de la enfermedad. Aunque
la etiología de la FM no está clara, las evidencias sugieren que factores biológicos,
genéticos y ambientales están implicados. Se han observado cambios en la actividad
neuronal en el sistema nervioso central, un anormal metabolismo de aminas biogénicas,
trastornos inmunológicos y del estrés oxidativo que pueden, entre otros factores,
contribuir al desarrollo de la enfermedad. La FM se ha relacionado también con
22
Introducción
alteraciones del eje hipotálamo-hipófisis junto con desequilibrio de la neurotransmisión,
que implican aminoácidos excitadores, catecolaminas, sustancia P y serotonina (5-HT)
(Russell et al., 1994; Crofford et al., 1996; Neeck, 2002). Los síntomas del paciente
pueden derivar de una mala modulación del estrés, una sensibilización de las neuronas
nociceptoras específicas y por tanto, disminución del umbral del dolor en respuesta a
múltiples factores ambientales, tales como trauma mecánico o emocional, el estrés
crónico o incluso infecciones. En los últimos años, se ha aportado nueva información a
nuestra comprensión de la fisiopatología de FM. Algunos polimorfismos genéticos así
como incremento de anticuerpos han sido asociados con la FM, como anticuerpos contra
el sistema serotoninérgico de 5-HTT (Bazzichi et al., 2006a;. Tander et al., 2008), el
polimorfismo del gen de la catecol-O-methytransferase (Gursoy et al., 2004),
polimorfismo de repetición del receptor de D4 dopamina exón II (Buskila et al., 2004), y
los anticuerpos contra la serotonina (Klein et al., 1992; Werle et al., 2001). También se
han postulado alteraciones en el metabolismo, transporte y recaptación de la serotonina,
y la sustancia P (Staud y Spaeth, 2008; Alnigenis y Barland, 2001; Schwarz et al., 2002).
Por otra parte, la homeostasis de las citoquinas inflamatorias han sido consideradas en la
patogénesis de FM (Wallace, 2001; Wallace et al., 2006). Por otro lado, varios estudios
han propuesto una participación de la disfunción mitocondrial y altos niveles de estrés
oxidativo en pacientes con FM, lo que sugiere que este proceso puede contribuir a la
fisiopatología de esta enfermedad.
1.5.1. Disfunción mitocondrial en la FM
Debido a que los principales síntomas en la FM (dolor, rigidez y fatiga) se encuentran
asociados a los músculos, se han estudiado las biopsias musculares, sobre todo de trapecio
23
de los pacientes. En la mayoría de los casos, numerosas alteraciones morfológicas
mitocondriales se han encontrado en las biopsias musculares de pacientes con FM. El
análisis histoquímico ha demostrado atrofia en fibras tipo II y el aspecto "apolillado" de
fibras de tipo I. Los hallazgos en microscopía electrónica eran más llamativos, mostrando
una acumulación mitocondrial subsarcolémica (Kalyan-Raman et al., 1984), lisis
miofibrilar con la deposición de glucógeno y mitocondrias anormales (Yunus et al.,
1986), además de bajo número de mitocondrias (Sprott et al., 2004) y falta de membrana
interna mitocondrial (Henriksson et al., 1982), fibras rojas rasgadas (Bengtsson et al.,
1988), y defectos de la citocromo-c-oxidasa, el complejo IV de la cadena respiratoria
mitocondrial (Drewes et al., 1993, Pongratz y Späth, 1998) (Figura 8).
A B
C
D
Figura 8. Histopatología en músculo de pacientes con FM propia de patologías mitocondriales: A. Fibras
rojo rasgadas. B. Fibras Cox negativas. C. Ausencia de mitocondrias en biopsia muscular (imagen derecha)
24
Introducción
comparada con músculo sano (imagen izquierda). D. Acúmulos subsarcolémicos que dan la impresión de
fibras rasgadas. Fuente: Yunus et al., 1986; Pongratz and Späth, 1998; Sprott et al., 2004.
La presencia de fibras apolilladas y rojo rasgadas indican una distribución y proliferación
desigual de las mitocondrias. La tinción de tricrómico de Gomori muestra acumulación
subsarcolémica de mitocondrias que dan la apariencia rasgada. La proliferación
mitocondrial puede ser un fenómeno compensatorio en los trastornos o estados
fisiopatológicos que afectan al metabolismo oxidativo (Bengtsson, 2002). Es interesante
mencionar que las fibras rojo rasgadas, la acumulación mitocondrial subsarcolémica y
alteración en la ultraestructura, número y tamaño de las mitocondrias son defectos típicos
y marcadores encontrados en las enfermedades mitocondriales (MELAS, MERRF, el
síndrome de Kearns-Sayre, síndrome de Pearson, el síndrome de Leigh, etc.) (Haas et al.,
2008).
El análisis mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) con 31P en
músculo ha proporcionado evidencias objetivas sobre anormalidades metabólicas
consistentes con los síntomas clínicos de debilidad y fatiga en pacientes con FM (Park et
al., 1998). Los estudios con RMN mostraron reducidas concentraciones de fosfocreatina
(PCr) y ATP en los músculos de los pacientes con FM de un 15% por debajo de los valores
normales durante el reposo y el ejercicio. Los niveles reducidos de PCr y ATP en los
músculos de los pacientes se correlacionan con las observaciones clínicas con respecto a
debilidad y dolor durante el ejercicio. En este estudio, Park también mostró que el dolor
se correlacionó inversamente con ATP y los niveles de PCr. La reducción de los niveles
de ATP también se han observado en los eritrocitos de los pacientes de FM, lo que sugiere
que esto puede ser un fenómeno más sistémico de lo que se suponía anteriormente
(Russell et al., 1993).
25
Recientemente, también se ha observado una disminución de los niveles de ATP en las
plaquetas de los pacientes con FM (Bazzichi et al., 2008). Las plaquetas representan un
modelo periférico de fácil acceso y fácil de estudiar las alteraciones bioenergéticas en la
FM. Las plaquetas poseen un gran número de mitocondrias así como todo el conjunto de
enzimas o proteínas implicadas en la producción de energía por la fosforilación oxidativa
y, en consecuencia, son muy activas en la producción de ATP (Niu et al., 1996). Por otra
parte, las plaquetas presentan en su membrana plasmática numerosos receptores de
membrana para el dolor, inflamación o receptores neuroquímicos, tales como los
receptores de adenosina/monoamina así como zonas de unión de transportadores
serotoninérgicos (Marazziti et al., 1999; Martini et al., 2004), lo que permite el estudio de
cualquier ruta neuroquímica o el metabolismo de la energía en forma de ATP en la FM.
En los últimos años las investigaciones sobre el estrés oxidativo y la disfunción
mitocondrial se han incrementado considerablemente llegando a formar parte de la
patogénesis de la FM de una forma evidente (Bagis et al., 2005; Ozgocmen et al., 2006;
Cordero et al., 2010). En apoyo de esta hipótesis existen nuevas referencias en pacientes
con FM; en células de pacientes con FM se han observado reducidos niveles de masa
mitocondrial, disminución de la actividad de la cadena respiratoria mitocondrial y la
bioenergética celular (Bazzichi et al., 2008; Cordero et al., 2010; Gerdle et al., 2013;
Miyamae et al., 2013; Cordero et al., 2013a). Además, se ha propuesto que la inflamación
a nivel sistémico también está involucrada en la FM, y así, se han observado altos niveles
de citoquinas, especialmente la IL1β, en el suero de pacientes con FM (Bazzichi et al.,
2007; Ross et al., 2010; Cordero et al., 2013b). Las citoquinas pro-inflamatorias podrían
provocar cambios en la estructura y función cerebral y muscular, provocando el
desarrollo de los cambios comportamentales, cognitivos y de sensibilización de las
terminaciones nerviosas, características propias de la FM. Por tanto, la asociación de
26
Introducción
ambos eventos patológicos involucrados en la fisiopatología de la FM podría suponer un
avance en el conocimiento de las bases moleculares de esta enfermedad y nuevas dianas
terapéuticas.
La disfunción mitocondrial es un evento común en la célula sana para el cual, la célula
tiene un sistema de control de calidad mediante un equilibrio de biogénesis mitocondrial
y la degradación autofágica. Sin embargo, cuando el grado de disfunción mitocondrial
sobrepasa a los mecanismos compensatorios de la célula aparecen consecuencias
patológicas que llevan a un aumento de estrés oxidativo, una masiva degradación
mitocondrial, un daño a otras estructuras celulares y finalmente, la muerte celular. La
disfunción mitocondrial, se ha mostrado estar implicado en numerosas patologías tanto
de una forma directa, como es el caso de las enfermedades mitocondriales ya
mencionadas como de forma indirecta, como en el caso de otras patologías cuyo
mecanismo molecular es otro pero la mitocondria tiene un papel relevante en el
agravamiento de la fisiopatología y/o agravamiento de los síntomas. En este sentido
ciertas patologías como el Parkinson o la diabetes presentan una implicación de la
mitocondria hasta tal punto, que han llegado a generar subgrupos patológicos
caracterizado por las alteraciones de esta organela (Zuo et al., 2013; Choo-Kang et al.,
2002). En estos subgrupos mitocondriales se dan las características comunes a las
patologías mitocondriales, como herencia materna, presencia de mutaciones en el
ADNmt, etc. Además, en todas estas patologías existen nexos de unión con la
inflamación.
Tal y como hemos descrito, la FM es una patología con claros antecedentes de afectación
mitocondrial. Por ello, el presente proyecto pretende evaluar el papel de la disfunción
mitocondrial en un modelo in vitro de fibroblastos aislados de pacientes con diagnóstico
de FM. Además, estudiaremos la relación de este proceso patológico con la activación
27
del complejo inflamasoma, como un mecanismo de inflamación sistémica activo por la
producción de ROS mitocondriales. Por otro lado, evaluaremos el papel del CoQ10 como
posible tratamiento para los pacientes. Finalmente, se estudiara la posibilidad de aparición
de mutaciones en el ADNmt que pudieran explicar la fisiopatología mitocondrial así
como mostrar un papel en la herencia de los síntomas de la enfermedad.
28
Objetivos
OBJETIVOS
29
30
Objetivos
2. OBJETIVOS
Para entender la implicación de la mitocondria y el ADNmt en la fisiopatología de la FM
y su relación con el complejo NLRP3-inflamasoma como sensor del estrés celular, el
presente estudio plantea los siguientes objetivos:
 Caracterizar la implicación de la disfunción mitocondrial así como del complejo
NLRP3-inflamasoma en la fisiopatología de células mononucleares de pacientes
con FM.
 Caracterizar la fisiopatología mitocondrial de la FM en fibroblastos de paciente
como modelo in vitro.
 Determinar la presencia de alteraciones en el ADNmt en pacientes con FM.
 Estudio de la activación del complejo NLRP3-inflamasoma en otros modelos de
patología mitocondrial como la enfermedad de MELAS (miopatía mitocondrial,
encefalopatía, acidosis láctica y accidentes cerebrovasculares) con la mutación
m.3243A> G en el gen tRNALeu (UUR), la enfermedad de MERRF (epilepsia
mioclónica con fibras rojas rasgadas) con la mutación m.8344A> G en el gen MT-
TK, y la neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON) con la mutación
m.11778G> A en el gen MT-ND4.
31
32
Material y Métodos
MATERIAL Y MÉTODOS
33
34
Material y Métodos
3. MATERIAL Y MÉTODOS
El estudio se realizó con la aprobación del comité de ética de la Universidad de Sevilla,
de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki y todas las Conferencias
Internacionales de Armonización y Guías de Buenas Práctica Clínicas. Todos los
participantes dieron su consentimiento informado por escrito antes de comenzar el
estudio.
3.1. Pacientes
Se eligieron pacientes mayores de 18 años de edad que cumplían los criterios de
diagnóstico del American College of Rheumatology 1990 para FM. Estos criterios
incluyen una historia de dolor musculo-esquelético generalizado en los lados derecho e
izquierdo del cuerpo, así como por encima y por debajo de la cintura, con una duración
mínima de 3 meses, y la sensibilidad a la presión a 11 o más de 18 sitios específicos
(puntos dolorosos), con sensibilidad moderada o más grave a la palpación digital. Los
criterios de exclusión fueron las enfermedades infecciosas agudas en las 3 semanas
anteriores; patologías psiquiátricas, metabólicas, autoinmunes, síndrome de fatiga
crónica, enfermedades inflamatorias crónicas o dérmicas; hábitos no deseados (por
ejemplo, el tabaquismo, el alcohol, etc.); enfermedades orales (por ejemplo,
periodontitis); condiciones médicas que requieren tratamiento con glucocorticoides,
estatinas o fármacos antidepresivos; abuso pasado o actual o dependencia de sustancias
estupefacientes, así como embarazo o lactancia actual. Todos los pacientes tenían un
estilo de vida sedentario. Los datos clínicos se obtuvieron a partir de un examen físico, y
se evaluaron utilizando el Cuestionario de Impacto de Fibromialgia (FIQ), incluyendo las
escalas analógicas visuales sobre el dolor general y difuso típico de FM (VAS).
35
3.2. Reactivos.
Los reactivos 2,6-Dicloroindofenol sodio hidratado (DCPIP), 5,5′-Dithiobis (2-ácido
nitrobenzoico) (DTNB), Triton, Acetil CoA, Oxalacetato, BSA-EDTA, CoQ1, Rotenona,
KCN, Succinato, Antimicina A, Citocromo C, tripsina (0,25% Trypsin-EDTA Solution)
y coctel inhibidor de proteasas, junto con el inhibidor de la síntesis de CoQ 4-
aminobenzoato (PABA) y lipopolisacárido de E. coli fueron adquiridos de la casa
comercial Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). El anticuerpo anti- GAPDH anticuerpo
monoclonal de Calbiochem - Merck Chemicals Ltd. (Nottingham, Reino Unido). Los
anticuerpos específicos para los complejos mitocondriales complejo anti- I humano
(subunidad 39 kDa), complejo II (30 kDa subunidad I), Complejo III (subunidad Core 1)
y Complejo IV (COX II), MitosoxTM, PicoGreen, BODIPY 581/591 y Hoechst 3342,
fueron adquiridos de Invitrogen / Molecular Sondas (Eugene, Oregón). Los anticuerpos
complejo I subunidad 8kDa y complejo II subunidad 70 kDa y OGG - 1 fueron de Abcam
(Cambridge, Reino Unido). Los anticuerpos para catalasa y MnSOD fueron adquiridos
en Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). El anticuerpo anti-citocromo c se
adquirió en PharMingen (BD Bioscience, San Jose, California). Los anticuerpos anti-
caspase-1 y anti-caspasa 3 activa fueron adquiridos en Cell Signaling Technology. El
anticuerpo anti - NLRP3 de Adipogen (San Diego, EE.UU.) y anti -IL - 1β (p17) de Santa
Cruz de Biotecnología. Un cóctel de inhibidores de proteasa (cóctel completo) se adquirió
de Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN). El kit de sustrato Immun estrella HRP era
de Bio -Rad Laboratories Inc. (Hercules, CA).
36
Material y Métodos
3.3. Cultivos de fibroblastos
Los fibroblastos derivados de los pacientes y controles se obtuvieron de acuerdo con las
declaraciones de Helsinki de 1964, revisada en 2001 y el consentimiento informado de
los pacientes. Los fibroblastos se cultivaron en un medio D- MEM (4.500 mg / L de
glucosa, L - glutamina, piruvato), (Gibco, Invitrogen, Eugene, OR, EE.UU.)
suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) (Gibco, Invitrogen, Eugene, Oregón,
EE.UU.) y antibióticos (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.). Las células se
incubaron a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5 %.
3.4. Líneas celulares
3.4.1. Líneas de fibroblastos de fibromialgia
En este proyecto hemos trabajado con líneas de fibroblastos de piel aislados de tres
pacientes con diagnóstico de FM mediante biopsia de piel en condiciones de esterilidad
con punch de 4mm. Las pacientes fueron tres mujeres de 40, 42 y 42 años de edad. Los
datos clínicos serán mostrados en el apartado de resultados.
3.4.2. Líneas de fibroblastos de enfermedades mitocondriales
Los fibroblastos MELAS se obtuvieron de un paciente que presentaba una mutación A
por G heteroplásmica en el nucleótido 3243 en el gen tRNALeu (UUR). Clínicamente, el
paciente presentaba encefalomiopatía, episodios tipo ictus, y acidosis láctica, además de
baja estatura, diabetes mellitus, sordera, demencia y ataxia. El nivel de heteroplasmia fue
del 43 % en los fibroblastos. La fisiopatología molecular de estos fibroblastos se
describen en las referencias Cotán et al., 2011. Las células fueron cedidas por la Dra.
Sandra Jackson del Hospital Universitario Carl Gustav Carus, Dresden (Alemania).
37
Los fibroblastos MERRF se obtuvieron de un paciente que presentaba una mutación
m.8344A > G con una heteroplasmia del 57 %. La fisiopatología molecular se describe
en las referencias de la Mata et al., 2012. Las células fueron cedidas por la Dra. Sandra
Jackson del Hospital Universitario Carl Gustav Carus, Dresden (Alemania).
Los fibroblastos LHON se obtuvieron de un paciente que presentaba una mutación
m.11778G >A. Los fibroblastos LHON no habían sido caracterizados antes de este
trabajo. Las células fueron cedidas por la Dra. Sandra Jackson del Hospital Universitario
Carl Gustav Carus, Dresden (Alemania).
3.5. Muestras sangre
La recogida de muestras sanguíneas se hizo de forma ambulatoria mediante punción
venosa con Vacutainer en condiciones de esterilidad, en tubos con anticoagulante EDTA.
Se tomaron 16 ml de sangre a cada paciente.
3.6. Aislamiento de PBMC mediante Ficoll-PaqueTM PLUS.
Para la obtención de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se utilizó el
protocolo basado en la utilización del polisacárido hidrofílico Ficoll-PaqueTM PLUS. Para
este protocolo usamos entre 2,5 - 3 ml de sangre heparinizada y mezclada con 1,5 ml de
solución salina equilibrada (BSS, Balanced Salt Solution), solución salina con glucosa
que mantenía la viabilidad de las células sanguíneas. Para cada 2 ml de sangre con BSS,
se utilizó 1,5 ml de Ficoll-PaqueTM PLUS. El primer paso consistía en introducir el Ficoll-
PaqueTM PLUS dentro de un tubo Corning de 15 o 50 ml, dependiendo del volumen de
sangre obtenido. A continuación, la sangre se introduce lentamente con una pipeta
38
Material y Métodos
Pasteur, evitando que se mezclase con la capa de Ficoll-PaqueTM PLUS. Posteriormente
se centrifuga a 900 g con una centrífuga basculante durante 40 min. Tras la centrifugación
se observaba la separación de los componentes de la sangre, una fase superior amarilla de
plasma, seguida de una interfase que contenía los monocitos y linfocitos (PBMC) situada
encima del Ficoll y, finalmente, un precipitado formado por plaquetas, eritrocitos y demás
fragmentos celulares. Recogimos la interfase formada por monocitos y linfocitos con una
pipeta Pasteur, y se pasaba a un nuevo tubo Corning, donde por cada mililitro de células
recogidas se añadían 3 ml de tampón BSS, se invertía y se centrifugaba a 900 g durante
10 min para eliminar las plaquetas y limpiar las PBMC.
3.7. Obtención de muestras biológicas.
Las muestras de, orina, biopsia de piel y saliva se obtuvieron de la paciente en la que se
observó la mutación. La primera muestra de orina de la mañana de 30-40 ml se recogió
mediante un tubo de centrífuga de 50 ml limpio (producido por Corning) y se centrifugó
a 1000 rpm durante 10 minutos para obtener sedimentos. La saliva no estimulada se
obtuvo por babeo pasivo en tubos de 1,5 ml (Eppendorf, Hamburg, DE).
Aproximadamente 3 ml de toda la saliva se centrifugó a 1500 g a 4 ° C durante 10
minutos. Después de desechar cuidadosamente el sobrenadante, el sedimento celular
insoluble se lavó dos veces usando tampón de PBS enfriado con hielo y se almacenó a -
80 ºC hasta su análisis. La biopsia de piel fue tomada de la misma forma que para obtener
los fibroblastos.
39
3.8. Generación de cíbridos trans-mitocondriales
Los cíbridos trasmitocondriales utilizados fueron generados mediante la fusión de una
célula Rho-0, células que contienen mitocondrias pero que carecen de ADNmt,
concretamente la línea 143-B.TK carente de timidina kinasa y plaquetas obtenidas a partir
de sangre total, mediante centrifugación diferencial de donantes sanos y la paciente
siguiendo el protocolo descrito por Chomyn (Chomyn, 1994).
Se obtuvieron entre 15 y 20 mL de sangre en tubos de heparina de la paciente y control
que son transferidos a tubos de 50 mL. A continuación, se añade una novena parte de
suero fisiológico salino, se mezclan por agitación y centrifugan a 200 g durante 20 min a
12ºC. De este producto final se recogen tres cuartas partes del sobrenadante que contiene
las plaquetas en tubos de 15 mL que se centrifugó a 1500 g durante 20 min, 12ºC. EL
sobrenadante es eliminado y el pellet resuspendido en 11mL de suero salino. De este
producto, se aíslan 7 mL a un tubo de 15 mL y se repite la centrifugación a 1500 g durante
20 min, 12ºC. El sobrenadante es eliminado dejando 100 µL.
En paralelo, obtenemos un pellet de células Rho-0 mediante lavados con PBS,
tripsimización y centrifugación y resuspendiendo el pellet en DMEN sin calcio a una
concentración de 5x105 células/mL. A continuación, 2 mL de estas células son añadidas
al pellet de plaquetas con cuidado de no despegar el pellet. Hacemos una centrifugación
a 180 g durante 10 min y eliminamos sobrenadante. Posteriormente, añadimos con pipeta
Pasteur 0,1 mL de polietilenglicol (PEG, Sigma). Incubamos 1 min a temperatura
ambiente y añadimos 10 mL de medio de cultivo de las células Rho-0 y se resuspenden
durante 30 segundos. A continuación añadimos 10 mL del medio de cultivo y se reparten
en placas de multipocillos de 6 wells para ser incubadas a 37ºC, 5% de CO 2. Tras tres
días del sembrado, el medio se cambia por medio selectivo sin uridina y con BrdU, el
40
Material y Métodos
cual es cambiado cada tres días. A partir de los 12 días, se han formado colonias que
pueden ser sembradas a frascos. El mantenimiento de las células se realiza con medio
DMEN al 10% de suero fetal bovino, 1% de cocktail antibióticos, 1% de piruvato sódico,
1% de L-glutamina y 1% de aminoácidos no esenciales.
3.9. Extracción de CoQ de muestras biológicas.
Las células se recogieron con tripsina (0,25% Trypsin-EDTA Solution, Sigma), para
posteriormente centrifugarlas a 800g durante 5 minutos a 4ºC obteniéndose un pellet que
es resuspendido en 500μl de PBS y trasvasado a un tubo de vidrio de 15ml con tapón de
rosca (Pirex), al que añadimos Q9 como estándar interno de la extracción. La
concentración del estándar se determinó por espectrofotometría, a una longitud de onda
de 275nm (ε CoQ9 = 14,7mM-1). El extracto celular con el estándar interno se mantiene
en hielo 5 minutos para después añadir 500μl de SDS 2% y agitar con un vórtex durante
un minuto a máxima potencia. Posteriormente se añaden 2ml de la mezcla
etanol:isopropanol 95:5 y se mezcla con agitación durante un minuto. A continuación se
añaden a la mezcla 5 ml de hexano y se agita con vórtex, pasando a centrifugar a 1000 g
durante 5 minutos a 4°C para separar la fase orgánica (que contiene los lípidos) de la fase
soluble. Tras la centrifugación, la fase orgánica se transfiere a una ampolla de rotavapor
de 25ml, volviéndose a repetir la extracción con hexano dos veces más. El hexano de las
ampollas es secado por rotavapor (R-3000, B·U·CHI), en condiciones de vacío, a 40ºC y
con un una potencia de rotor del 50%. El residuo seco se reconstituye en 333μl de etanol
(calidad HPLC) y se pasa a un tubo eppendorf limpio, repitiendo el lavado dos veces más.
El etanol se evapora por vacío (SPD121P, Savant SpeedVac) durante 2-3 horas a 50°C.
41
Tras este proceso, El residuo seco es guardado a -20°C, para ser reconstituido finalmente,
en un volumen adecuado de etanol (calidad HPLC) antes de la medida por cromatografía.
3.10. Extracción de ADN
La extracción del ADN total se realizó de diferentes tejidos: biopsia de piel, sangre, saliva,
orina y fibroblastos. Para la extracción del ADN de la biopsia de piel se siguió el método
descrito (Sambrook J & Russell D, 2000), con modificaciones. Se partió de una porción
de tejido congelado triturado previamente en un mortero, evitando la descongelación. El
pulverizado se depositó en tubo de polipropileno de 2 mL, al que se añadieron 180 μL de
tampón TSE (Tris-HCl 100 mM pH=7,4, ClNa 10 mM, EDTA 25 mM) y 20 μL de
solución acuosa de proteinasa K (20 mg/mL). Se centrifugó a 14.000 rpm, mezcló e
incubó 5 minutos a 55 °C. Posteriormente se añadieron 180 μL de tampón TSE, 20 μL de
proteinasa K y 40 μL de SDS. Se mezcló e incubó 1 h a 55 °C. Posteriormente, se añadió
20 μL de proteinasa K y se incubó de nuevo a 55 °C durante 30 minutos. A continuación
se incorporó 50 μL de ClNa 5 M, se mezcló, y se añadió 1 mL de una mezcla 25: 24: 1
fenol: cloroformo: alcohol isoamílico. Se agitó y se centrifugó a 14000 rpm brevemente
para separar las fases. Se recogió el sobrenadante y lavó dos veces con 1 mL de éter
dietílico. Tras evaporarse el éter, se añadieron 1,5 mL de etanol al 98%, que provoca el
precipitado del ADN, el cual se recoge en un eppendorf estéril. El resto de etanol se
eliminó al vacío y el ADN se disolvió en 50-100 μL de Tris-EDTA (TE) 1X estéril (Tris-
HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH=7,4). La solución de ADN se conservó a -20 °C.
Para extraer el ADN de los fibroblastos o cíbridos éstos se tripsinizaron y lavaron 2 veces
con PBS y se procedió a su extracción con el kit QIAamp® DNA Mini siguiendo las
instrucciones del fabricante (QIAGEN GmbH). Para extraer ADN directamente de
42
Material y Métodos
sangre, células de la orina o saliva se siguieron las instrucciones del fabricante del sistema
de extracción nucleon BACC3 (Amersham Pharmacia Biotech), cuyo fundamento es la
precipitación de proteínas con perclorato sódico y su separación del ADN mediante
cloroformo y una resina patentada.
3.11. Determinación de los niveles de CoQ por HPLC
El proceso de separación de los componentes lipídicos de las muestras se lleva a cabo en
un HPLC Shimadzu UFLC, equipado con una columna sílica de fase reversa 15-cm
Kromasil C-18, con un horno a 40ºC, flujo de 1ml/min en una fase móvil compuesta de
metanol:isopropanol (60:40) y 1,42 mM perclorato de litio. Los niveles de CoQ se
analizan por un detector ultravioleta 15 (System Gold 168) y electroquímico (Coulochem
III ESA). Las muestras se reconstituyeron en 200 µL de fase móvil y se carga 20 µL en
el HPLC tras realizar una línea de base de fase móvil, así como los estándares necesarios.
Los datos obtenidos fueron referidos a mg de proteínas.
3.12. Análisis enzimático de la actividad de la Cadena Respiratoria Mitocondrial
3.12.1. Preparación de fibroblastos para la determinación de la Cadena
Respiratoria Mitocondrial
Las células crecidas en monocapa se lavan con PBS 1X pH 7,4, se recogen con tripsina
(0,25% Trypsin-EDTA Solution, Sigma) y se centrifugan a 800g durante10 minutos. El
pellet se lava con PBS 1X pH 7,4, se resuspenden por vórtex y se repiten los lavado 2
veces más. El pellet es resuspendido en 1ml de Tampón A (MOPS 20mM, Sacarosa
0,25M) y transferida la solución a un eppendorf, al que se añaden 500μl de digitonina
43
0,2mg/ml. Tras reposo de 5 minutos en hielo, se centrifuga a 5000g durante 3 minutos en
frío. El pellet se resuspende por agitación con vórtex en 500μl de Tampón B (MOPS
20mM, Sacarosa 0,25M, EDTA 1mM) y se deja reposar de nuevo en hielo durante 5
minutos, tras los cuales se centrifuga a 10000g durante 3 minutos en frío. Desechado el
sobrenadante, se resuspende el pellet en 200μl de Tampón KP 10mM pH 7,4. Para
proceder al análisis de la cadena respiratoria el homogenado es sonicado durante 10
segundos al 30% de potencia (Sonicador Bandelin Sonoplus).
3.12.2. Análisis enzimático de la actividad de la Cadena Respiratoria
Mitocondrial a partir de homogenado de fibroblastos
La actividad enzimática de la cadena respiratoria mitocondrial se determinó por métodos
espectrofotométricos, con un espectofotómetro UniCam UV 500 (Thermo Spectronic)
con célula Peltier acoplada (PCB 150, Water Peltier System, Thermo Spectronic).
3.12.3. Citrato sintasa
Siempre por duplicado, en el siguiente orden añadimos a la cubeta:
- Tris-HCl 0,75M pH8 100 μl 75mM
- DTNB 1mM 100 μl 100 μM
- Triton 1% 100 μl 0,1%
- Acetil CoA (7mg/ml) 50 μl 350μg/ml
- Homogenado 5μl
- Agua destilada 595μl. Agitar e incubar 2 minutos a 30ºC, y añadir:
- Oxalacetato 10mM 50 μl 0,5mM
44
Material y Métodos
Agitar, incubar 30 segundos a 30ºC y leer 2 minutos a una longitud de onda de 412nm a
30ºC.
Cálculos: *ɛ = 13,6 mM-1cm-1 (Abs/min) = Abs / min con Oxalacetato
3.12.4. Complejo I – NADH CoQ Oxidorreductasa
Por orden se añade a la cubeta:
- Tampón KP 40mM pH8 500 μl 20mM
- NADH 1mM 200 μl 0,2mM
- NaN3 50mM 20 μl 1mM
- BSA-EDTA 1% 100 μl
- Homogenado 40μl
- Agua destilada 130μl
Agitar e incubar 8 minutos a 30ºC, para después leer la línea base a λ=340nm a 30ºC. Una
vez leída la LB añadir:
- CoQ1 10mM 10 μl
Agitar, incubar 30 segundos a 30ºC y leer 2 minutos a λ=340nm, y añadir:
- Rotenona 0,25mM 20 μl 5 μl
Leer 2 minutos a λ=340nm.
Cálculos: *ɛ = 6,81 mM-1cm-1 (Abs/min) = Abs / min con CoQ1
3.12.5. Complejo II - Succinato deshidrogenasa
Por orden se añade a la cubeta:
45
- Tampón KP 100mM pH7 500 μl 50mM
- KCN 30mM 50 μl 1,5mM
- DCPIP 1mM 100 μl 0,1mM
- Homogenado 20μl
Agitar e incubar 2 minutos a 30ºC, para después añadir:
- Succinato 320mM 100 μl 32mM
Agitar, incubar 30 segundos a 30ºC y leer 2 minutos a λ=600nm, para luego añadir:
- CoQ1 10mM 5μl 5μM
Cálculos: *ɛ = 19 mM-1cm-1
Actividad SDH: se usa el Δ de la reacción del succinato
Actividad Complejo II: se usa el Δ de la reacción con el CoQ1
3.12.6. Complejo III: DBH2 – Citocromo C Oxidorreductasa
Cada muestra se analizará en paralelo con Antimicina y sin Antimicina.
- Tampón KP 100mM pH7,5 500μl 50mM
- NaN3 50mM 40μl 2mM
- BSA-EDTA 1% 100μl
- ± Antimicina A (1mg/ml EtOH 50%) 10μl
- Agua destilada 285μl en la cubeta con Antimicina
259μl en la cubeta sin Antimicina
46
Material y Métodos
- DBH2 10mM 5μl 50μM
Agitar y leer la línea base durante 2 minutos a 30ºC y λ=550nm:
- Homogenado 10μl
Agitar y leer 2 minutos a 30ºC y λ=550nm:
- CoQ1 10mM 5μl 5μM
Cálculos para actividad sensible a Antimicina:
*ɛ = 21 mM-1cm-1 = Abs / min sin Antimicina - Abs / min con Antimicina
3.12.7. Complejo I + III: NAHD – Citocromo C – Reductasa
En el siguiente orden se añade a la cubeta:
- Tampón KP 100mM pH7,5 550μl
- Citocromo C 1mM 100μl
- KCN 30μl
- Homogenado 10μl
Agitar y leer la línea base durante 2 minutos a 30ºC y λ=550nm, para después añadir
iniciadores de la actividad:
- NADH 1mM 100μl
Agitar y leer 2 minutos a 30ºC y λ=550nm
Cálculos: *ɛ = 21 mM-1cm-1 (Abs/min) = Abs / min con NADH
47
3.12.8. Complejo II + III: Succinato – Citocromo C – Reductasa
- Tampón KP 100mM pH7,5 550μl
- Citocromo C 1mM 100μl
- KCN 30μl
- Homogenado 30μl
Agitar y leer la línea base durante 2 minutos a 30ºC y λ=550nm, para después añadir
iniciadores de la actividad:
- Succinato 30mM 100μl
Agitar y leer 2 minutos a 30ºC y λ=550nm
Cálculos: *ɛ = 21 mM-1cm-1 (Abs/min) = Abs / min con succinato
3.12.9. Complejo IV - Citocromo C Oxidasa
- Tampón KP 100mM pH7 100μl 10mM
- Citocromo C 800μM (1%) Reducido 100μl 80μl
Agitar e incubar 2 minutos a 38ºC y λ=550nm, para después añadir:
- Homogenado 10μl Agitar y leer la durante 2 minutos a 38ºC y λ=550nm.
48
Material y Métodos
Cálculos para actividad COX: *ɛ = 21 mM-1cm-1 = Abs / min de la reacción con
Citocromo C reducido
3.13. Análisis de proteínas mediante Western-Blot.
3.13.1. Cuantificación de proteínas por el método Bradford.
Para determinar la cantidad de proteínas para los ensayos de Western-Blot se usó una
modificación del método colorimétrico de Bradford (Bradford, 1976) ideada para
muestras que contienen membranas (Stoschek, 1990). El ensayo se realizó añadiendo en
una cubeta de espectrofotómetro 50 μl de NaOH 1M, 20 μL de la muestra y 1 ml de
reactivo de Bradford. Tras dejar incubar la mezcla 5 minutos a temperatura ambiente y
protegida de la luz, se midió la absorbancia a 595nm en un espectofotómetro UniCam UV
500 (Thermo Spectronic). La cantidad de proteína fue determinada mediante una recta
patrón realizada con cantidades conocidas de inmunoglobulina G (0-28 μg).
3.13.2. SDS-Page y Western-Blot.
El análisis de las proteínas que estaban presentes en los lisados celulares se llevó a cabo
mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), según el
procedimiento descrito por Laemli (Laemli, 1970), a una intensidad de 35mM/gel en un
sistema MiniProtean III (Bio-Rad) y con tampón de carrera TGS10X (Tris/Glycine/SDS
Buffer 10X, BioRad). Se prepararon geles de diferentes concentraciones de acrilamida de
acuerdo a las necesidades del peso molecular de las proteínas a estudiar y al 4% el gel
condensador. Realizamos la electroforesis a 120 V en tampón de electroforesis TGS
(Tris/Glicina/SDS, Bio-Rad). Tras la electroforesis se procedió a la transferencia (Trans-
Blot, SD, Semi-Dry Transfer Cell con fuente de alimentación Bio-Rad Power Pac 1000)
a 25V y durante 45 minutos en tampón de transferencia TG (Tris/Glycine Buffer 10X,
BioRad). Se usaron membranas de Nitrocelulosa (Hybond-ECL, Amerscham
49
Biosciences). Finalizada la transferencia, para comprobar que la misma se ha realizado
correctamente, la membrana de nitrocelulosa fue teñida con una solución de Rojo
Ponceau al 0.5% en ácido acético al 1%. Después de desteñir el rojo Ponceau con ácido
acético 1%, las membranas fueron bloqueadas con TTBS (Tris 20mM pH 7.6, NaCl 150
mM+Twenn-20 0,05%)+Leche 0,5% a 4ºC durante 16 horas.
3.13.3. Inmunodetección con anticuerpos y electrotransferencia de proteínas
Las membranas, una vez bloqueadas se incubaron con los anticuerpos primarios durante
toda la noches a 4ºC en TTBS (TBS, Tween-20 al 0.05%, agua destilada y leche en polvo).
A continuación, lavamos las membranas tres veces durante 5 minutos cada lavado en
TTBS (TBS, Tween-20 al 0.05%, agua destilada). Posteriormente, las membranas fueron
incubadas con el correspondiente anticuerpo secundario, que está marcado con
peroxidasas de rábano HRP para catalizar la oxidación del luminol en presencia del
peróxido de hidrógeno, durante 2 horas en TTBS (igual que el primario). Realizamos la
detección de la proteína por quimioluminiscencia mediante el kit comercial immun-Star
HRP Chemiliminiscent (BioRad Laboratories) y películas fotográficas CL-
XposureTMFilm (Clear Blue X-Ray Film, Pierce). La imagen de Western blot se
cuantificó utilizando el software ImageJ (ver: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html).
3.14. Amplificación por PCR y secuenciación
El ADNmt completo se amplificó a partir de ADN total en 24 fragmentos superpuestos
de PCR de 800-1.000 pb de largo. Los cebadores fueron cuidadosamente diseñados
utilizando la secuencia Cambridge revisada de referencia para el ADNmt
(www.mitomap.org/mitoseq.html).
50
Material y Métodos
Los fragmentos de PCR se secuenciaron en sistema secuenciador ABI 3730 (Applied
Biosystems; www.appliedbiosystems.com; Foster City, CA) usando un kit de
secuenciación BigDye v3.1 (Applied Biosystems; www.appliedbiosystems.com; Foster
City, CA). El montaje y la identificación de las variaciones en el ADN mitocondrial se
realizó usando el paquete Staden (Bonfield et al., 1995). Para este propósito se utilizó la
secuencia de referencia revisado mitocondrial humano DNA Cambridge
(www.mitomap.org/mitoseq.html). Todo el proceso se llevó a cabo en Secugen (Madrid,
España).
3.15. Niveles IL-1β e IL-18
Los niveles de IL-1β (Genway, San Diego CA, EE.UU.) e IL-18 en suero (Biosensis,
Australia) se analizaron por duplicado por los kits ELISA comerciales. Brevemente, el
procedimiento consistió en pipetear en una placa multipocillos cuyos pocillos estaban
revestidos de un anticuerpo específico para la IL-1β, 100 µl de suero de cada sujeto y se
dejó incubar durante una hora a temperatura ambiente. Tras esta incubación y los lavados
correspondientes, se procedió a la incubación con un segundo anticuerpo biotinilado
durante otra hora. Buscar qué es esto. Durante la primera incubación, el antígeno IL-1β
se une de forma simultánea al anticuerpo inmovilizado en un sitio, y al anticuerpo
biotinilado en un segundo sitio. Después de la eliminación del exceso de este segundo
anticuerpo, se añadió la enzima estreptavidina-peroxidasa. Ésta se une al anticuerpo
biotinilado para completar el sándwich de cuatro miembros. Después de una incubación
y del lavado para eliminar toda la enzima no unida, se añadió una solución de sustrato,
que actúa sobre la enzima unida para producir color. Finalmente las muestras fueron
analizadas en un espectrofotómetro (iMark microplate, Bio-Rad) a una longitud de onda
51
de 450nm. La intensidad de este producto coloreado es directamente proporcional a la
concentración de IL-1β presente en las muestras.
Para la determinación de los niveles de IL-18 presente en el suero de los sujetos, se utilizó
igualmente un Kit de ELISA (Biosensis, Australia), procediendo como indica el
fabricante. Se añadieron 100 µl de cada muestra en una placa que estaba revestida de un
anticuerpo monoclonal específico para IL-18 y se incubaron durante una hora. Durante
esta primera incubación, IL-18 es capturado e inmovilizado sobre la placa. Después del
lavado, un conjugado de peroxidasa de rábano picante (HRP) anti-IL-18 anticuerpo se
pipeteó en los pocillos, y se incubó durante una hora. La unión del anticuerpo conjugado
HRP a los pocillos completa el sándwich de tres miembros. Tras el lavado, la actividad
de HRP se detectó mediante la incubación del reactivo de sustrato TMB durante 30
minutos. La incubación del reactivo de sustrato dentro de los pocillos produce un color
que es proporcional a la cantidad de IL-18 contenida en la muestra. Al final del período
de incubación, la reacción se paró añadiendo a cada pocillo una solución que termina la
reacción catalizada por HRP y estabiliza el color formado. La absorbancia de cada pocillo
se midió a 450 nm utilizando un lector de placa iMark microplate, Bio-Rad.
3.16. Niveles de ATP
Los niveles de ATP se determinaron en homogenados celulares mediante un ensayo de
bioluminiscencia utilizando un kit de determinación de ATP (Molecular Probes) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este kit se basa en el requerimiento de ATP
por parte de la luciferasa para la producción de luz, de manera que a mayor contenido de
ATP de la muestra, mayor emisión de luz. De esta forma, en los ensayos se mezclaron
cantidades proporcionales de una solución de reacción que contenía luciferasa de
52
Material y Métodos
luciérnaga recombinante y su sustrato D- luciferin, con los homogenados de tejido, para
medir posteriormente la luminiscencia emitida con un luminómetro modelo Luminoskan
TL Plus (Thermos Lab Systems) a una longitud de onda de 560nm. Para la cuantificación
final, se realizó una recta de calibrado con muestras de ATP de concentración conocida.
3.17. Cuantificación de ADNmt
El ADN se extrajo por lisis celular estándar. Los cebadores utilizados fueron: para el
ADN mitocondrial, mtF3212 (5'-CACCCAAGAACAGGGTTTGT-3 ') y mtR3319 (5'-
TGGCCATGGGTATGTTGTTAA-3') y para el ADN nuclear para la normalización, 18S
rRNA 18S1546F gen (5'-3-TAGAGGGACAAGTGGCGTTC ') y 18S1650R (5'-
CGCTGAGCCAGTCAGTGT3'). Las unidades arbitrarias se calcularon como la relación
entre la banda de densidad óptica correspondiente a la del ADNmt estudiado en el ciclo
20-30th y la del ADNn en el ciclo de amplificación 15th.
3.18. Genotipado de la mutación en pacientes y cíbridos
Una vez que se extrajo el ADN, la amplificación por PCR del fragmento de mtCYB que
contiene la mutación, desde 15.700 hasta 16.003 nucleótidos de ADNmt, se realizó
usando los siguientes cebadores: 5'-TCCATCAGGGTATCCTCTCC-3 'y 5'-
GGAGGCAAGCATAAGACTGG -3', produciendo un producto final de 300 pb. Los
productos de amplificación fueron digeridos con la enzima de BbvI y se fraccionó en un
gel de agarosa al 2,5%. Después de la electroforesis en gel de ADN no mutante y los
fragmentos de ADN mitocondrial mutantes pueden ser discriminados debido a que en el
53
ensayo de restricción BbvI se generara un patrón de bandas diferencial (no mutante
ADNmt: fragmento de 300 pb, y el ADNmt mutante: 181 y 119 fragmentos bp).
3.19. Producción mitocondrial de ROS
La generación mitocondrial de ROS en PBMCs y fibroblastos fueron determinados
mediante el uso de MitoSOX™, un indicador de la dismutasa mitocondrial en rojo.
Citometría de flujo. Aproximadamente 1-x-106 células se incubaron con 1μM
MitoSOXTM rojo durante 30 min a 37°C, se lavó dos veces con PBS, se resuspendieron
en 500 ml de PBS y se analizaron por citometría de flujo en un citómetro Epics XL,
Beckman Coulter, Brea, California, EE.UU. (excitación a 510 nm y detección de
fluorescencia a 580 nm).
Microscopía de fluorescencia. Los fibroblastos cultivados sobre cubres-objetos estériles
en placas de 6 pocillos de 9,6cm2/pocillo (Nunc Multidishes 6 well, NuncTM), en medio
DMEM-4500mg/L Glucosa más 10% FBS se incubaron con MitoSOX™ Red durante 30
min a 37 ° C, se lavaron dos veces en PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS
durante 0,5-1 h a temperatura ambiente, y se lavaron dos veces con PBS. Después de eso,
las células se incubaron durante 10 min a 37 ° C con anti- citocromo c anticuerpo
(Invitrogen, Barcelona, España) para marcar las mitocondrias. Las muestras se
visualizaron por microscopía de fluorescencia usando un microscopio TCS SL de Leica.
3.20. Determinación de la peroxidación lipídica
Se cultivaron las células sobre cubres-objetos estériles en placas de 6 pocillos de
9,6cm2/pocillo (Nunc Multidishes 6 well, NuncTM), en medio DMEM-4500mg/L
54
Material y Métodos
Glucosa más 10% FBS. Una vez alcanzada la densidad deseada, se añadió al medio C11-
Bodipy 1μM (BODIPY® 581/591 C11, Molecular Probes) y se incubó el cultivo durante
30 minutos a 37ºC. Posteriormente se lavó la monocapa celular con PBS y se montaron
los cubres sobre los portas con Mounting medium for fluorescente (Vector Laboratories,
Burlingame, CA). El colorante fluorescente C11-Bodipy 581/59 se inserta en las
membranas lipídicas y permite la evaluación cuantitativa de lípidos oxidados y no
oxidados, fluorescentes en color verde o rojo respectivamente. Las muestras se
visualizaron por microscopía de fluorescencia usando un microscopio TCS SL de Leica.
3.21. Cuantificación de la tasa de proliferación celular
Se cultivaron 100.000 fibroblastos durante 72 horas. Tras desechar las células muertas
retirando el medio de cultivo y reemplazándolo por medio fresco, las células fueron
contadas usando un microscopio invertido con objetivo 40X (Olympus CK40).
3.22. Determinación de los niveles de daño oxidativo del ADN por 8-
hidroxideoxiguanosina.
Para la determinación de la 8-hidroxideoxiguanosina (8-oxo-G) se utilizó el kit de la 8-
oxo-dGuo-EIA-BIOTECH (OXIS Health Products, Inc. 6040 N Cutter Circle, Suite 317
Portland, OR 97217-3935 U.S.A.), tal como sigue: a una placa en la cual está fijada la 8-
oxo-dGuo se añadió el anticuerpo monoclonal de 8-oxo-G y la muestra o estándar. La 8-
oxo-dGuo en la muestra o estándar compite con el 8-oxo-G unido a la placa por los sitios
de unión del anticuerpo monoclonal de 8-oxo-G. Los anticuerpos que se han unido a la
8-oxo-dGuo de la muestra son lavados, mientras que aquellos que se han unido a la 8-
55
oxo-G de la placa permanecen. Posteriormente, añadimos el anticuerpo secundario
marcado con el enzima, el cual se une al anticuerpo monoclonal que permanece en la
placa. El anticuerpo secundario marcado con enzima que no se ha unido se elimina
mediante un proceso de lavado. Finalmente se le añade un cromógeno, y la intensidad de
coloración es proporcional a la cantidad de anticuerpo unido a la placa.
3.23. Tasa de consumo de oxígeno (OCR)
La tasa de consumo de oxígeno (OCR) se determinó en tiempo real usando el analizador
XF-24 (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo
del fabricante. Las células (5 x104 / pocillo) se sembraron durante 16 horas en la placa de
XF-24 antes del experimento en un medio DMEM al 10% de suero. Para determinar el
número de células, se realizó un recuento de las células mediante el citómetro Tali® base-
Imagen | Life Technologies. Las células se sembraron el día antes del experimento
(aproximadamente 16 horas antes del experimento). Antes del experimento la presencia
de células por cada pocillo fue confirmada por observación directa de cada pocillo
utilizando el microscopio óptico con el fin de verificar la homogeneidad de la monocapa
celular en los pocillos. Debido a que durante los tiempos de incubación, las células
continúan creciendo y por lo tanto su número aumenta, después de la finalización del
experimento, se realizó un segundo recuento de células para cada pocillo. Las células se
trataron con tripsina y se contaron de nuevo usando el citómetro Tali®-Based Image |
Life Technologies en el modo de estandarizar los resultados de acuerdo con el número
final de células. Antes de comenzar las mediciones, las células se colocaron en un medio
DMEM (suplementado con glucosa 25 mM, glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, y
sin suero) y pre-incubaron durante 20 min a 37 ° C en ausencia de CO2 en el Estación XF
56
Material y Métodos
Pre-incubadora (Seahorse Bioscience, Billerica MA, EE.UU.). Las células se transfirieron
al analizador XF-24 y después de una medida de referencia del OCR, la función
mitocondrial se realizó por inyección secuencial de cuatro compuestos que afectan a la
bioenergética, como sigue: 55 µl de oligomicina (concentración final 2,5 mg / ml) a
inyección en el puerto de A, 61 µl de 2,4-dinitrofenol (2,4-DNP) (concentración final 1
mM) en la inyección en el puerto B, y 68 µl de antimicina / rotenona (concentración final
10 mM / 1μM) en la inyección en puerto C. Un mínimo de cinco pozos fueron utilizados
por condición en cualquier experimento. Los datos se expresan como pmol de O2
consumido por minuto normalizada a 1000 células (pMol O2 / 1000 células / min).
3.24. Análisis de la estructura y la secuencia de conservación
Para obtener la estructura tanto para CYB y proteínas COXIII, se utilizó el servidor de
Swiss- Model (Biasini et al., 2014) con los parámetros por defecto y se visualizaron con
el programa RasMol. Logo diagramas fueron creados usando Skylign para mostrar la
conservación de los residuos en los alrededores de la mutación estudiada (Wheeler et al.,
2014).
3.25. Análisis Estadístico
Los datos en cifras se ofrecen como media ± desviación estándar. Los datos entre los
diferentes grupos fueron analizados estadísticamente utilizando ANOVA sobre los rangos
con Sigma Plot y software estadístico Sigma Stat (SPSS para Windows, 19, 2010, SPSS
Inc. Chicago, IL, EE.UU.). Análisis estadístico de correlación entre la IL- 1β e IL – 18
respecto a VAS, CoQ10, y mitocondrial de ROS se efectuó mediante índice de correlacion
57
de Pearson. Para los estudios de cultivo celular, se utilizó la prueba t de Student para
análisis de datos. Un valor de p < 0,05 fue considerado significativo.
58
Resultados
RESULTADOS
59
60
Resultados
4. RESULTADOS
LA ACTIVACIÓN DEL COMPLEJO NLRP3-INFLAMASOMA ES INDUCIDA
POR LA DISFUNCIÓN MITOCONDRIAL EN LAS CÉLULAS
MONONUCLEARES DE LOS PACIENTES CON FM.
Para esta parte del proyecto se seleccionaron un conjunto de pacientes para la obtención
de muestras sanguíneas. Todos los pacientes mostraron síntomas de dolor, así como otros
síntomas propios de la FM como muestra la Tabla 1. Salvo la sintomatología, los demás
parámetros tenidos en cuenta fueron similares entre el grupo control como el grupo FM;
edad, sexo, índice de masa corporal (IMC), etc (Tabla 1).
Tabla 1. Parámetros antropométricos y sintomáticos en voluntarios sanos y pacientes

con FM.
Parámetros Controles Pacientes

Edad (años) 45.5 ± 6.1 46.1 ± 8
Puntos dolorosos ― 14.5 ± 1.8
Duración enfermedad (años) ― 8.1 ± 3.3
Sexo (masculino/femenino) 5\15 5\25
IMC (kg/m2) 23.2 ± 2.5 22.9 ± 1.2
FIQ Puntuación Total, rango 0-80 2.7 ± 1.5 56.6 ± 8.3***
Dolor 0.6 ± 0.2 6.9 ± 2.1**
Fatiga 1.2 ± 0.5 7.1 ± 1.2***
Cansancio
Matutino 1 ± 0.3 5.5 ± 1**
Rigidez 0.4 ± 0.1 6.2 ± 2.2**
Anxidad 1 ± 0.5 5.8 ± 1.2**
Depresion 0.2 ± 0.6 5.6 ± 1.2***
VAS Dolor Puntuación Total 0-10 0.7 ± 0.2 7.5 ± 2.1***
61
IMC, Índice de masa corporal; FIQ, Cuestionario de impacto de la Fibromialgia; VAS, Escala Visual
Analógica. n=20 y 30 para controles y FM respectivamente. * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001.
Por otro lado, una de las principales características de esta enfermedad desde el punto de
vista diagnóstico, es la falta de marcadores alterados en las pruebas diagnósticas
comúnmente usadas en la práctica clínica. En este sentido, nuestros pacientes no
mostraron ninguna alteración relevante en los valores analíticos bioquímicos de rutina
(Tabla 2)
Tabla 2. Parámetros de bioquímica sérica en pacientes con FM. n=20 para controles y
n=30 para pacientes con FM respectivamente.
Parámetros bioquímicos Controles Pacientes

Glucosa (mg/dL) 93.8 ± 15.2 98.1 ± 12.2
Ácido úrico (mg/dL) 3.9 ± 1.5 3.1 ± 1.6
GOT (mU/mL) 21.9 ± 8.8 25.2 ± 7.3
GPT (mU/mL) 23.5 ± 5.1 24.6 ± 6.1
Creatina kinasa (IU/L) 671.1 ± 42.3 623.5 ± 34.4
Colesterol (mg/dL) 179.9 ± 53.4 176.9 ± 59.1
Triglicéridos (mg/dL) 157.5 ± 60.1 144.9 ± 52.3
4.1. Disfunción mitocondrial en PBMC de pacientes con FM
Las alteraciones de la cadena respiratoria mitocondrial son uno de los marcadores más
utilizados para detectar la presencia de disfunción mitocondrial. En este sentido, hemos
observado una importante reducción de la actividad de los complejos de la cadena
62
Resultados
respiratoria mitocondrial, entre el 50-60%, en las PBMC de los pacientes en comparación
con las células control (Figura 9).
Figura 9. Actividades enzimáticas de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial en PBMC de
pacientes con FM. n = 20 y 30 para el grupo control y grupo de FM, respectivamente. Actividades
enzimáticas mitocondriales. La determinación de la actividad enzimática de cada uno de los complejos se
llevó a cabo por análisis espectrofotométrico según se describe en Materiales y Métodos. Los resultados se
expresan en U/CS (unidades por citrato sintasa), y representan la media±DS de tres experimentos
independientes. * P < 0,001 y ** P < 0,01 entre los pacientes de control y FM.
Esta reducción de la actividad en la cadena mitocondrial en PBMC era acompañada de
una importante reducción de los niveles de expresión de las proteínas mitocondriales
63
correspondientes a los complejos I y el complejo III (Figura 10A y 1B) apoyando los
resultados obtenidos en la medida de la actividad enzimática mitocondrial.
Figura 10. Expresión de proteínas de la cadena respiratoria mitocondrial. A. Niveles de expresión de las
proteína de los complejo mitocondriales I (subunidad 39 kDa), complejo III (Subunidad Core I), y
oxoguanina-glicosilasa 8 (OGG - 1, una enzima ADN glicosilasa responsable de la escisión de 7,8 -dihidro-
8 -oxoguanine (8 - oxo G). B. Los niveles de las proteína se determinaron por análisis densitométrico (IOD,
intensidad óptica integrada) de tres Western blots diferentes y normalizados respecto la señal de GADPH,
utilizando PBMC a partir de cuatro pacientes con FM representativos, en comparación con un grupo de 5
saludable sujetos de control por edad y sexo.
El CoQ10 es un componente clave de la cadena respiratoria mitocondrial debido a su
función en la transferencia de electrones de los complejos I y II del complejo III, por lo
que las deficiencias de este transportador de electrones están asociadas con la disfunción
mitocondrial en una variedad de trastornos humanos. De acuerdo con esto, en nuestros
pacientes hemos podido observar una considerable reducción de los niveles de CoQ10
(46%) respecto del valor medio de las células control en las PBMC de los pacientes con
FM (Figura 11A). Por otra parte, para determinar el efecto de la disfunción mitocondrial
64
Resultados
en la bioenergética celular, medimos los niveles de ATP intracelulares en PBMC de los
controles y pacientes con FM. Tras la determinación, pudimos observar que los niveles
de ATP se mostraban reducidos al 76% respecto a los controles (p <0,001) (Figura 11B).
Figura 11. Disfunción bioenergética y estrés oxidativo en PBMC de controles y pacientes con FM. A.
Niveles de CoQ10 en células de control y FM determinadas mediante extracción con hexano y separación
por HPLC como se describe en Material y Métodos. B. Los niveles de ATP en control y FM BMC se
analizaron por bioluminiscencia como se describe en Material y Métodos. C y D. Se analizaron la
producción de ROS mitocondriales y la producción de 8-oxo-G en PBMC de los pacientes de control y FM
por citometría de flujo y el kit de EIA como se describe en Material y Métodos. Los datos representan la
media ± SD de tres experimentos separados. * P < 0,001, ** P < 0,01 entre las células del grupo control y
FM.
65
4.2. Estrés oxidativo en PBMC de los pacientes con FM
Está bien establecido que la disfunción mitocondrial está asociada con la inducción de la
producción de ROS en las mitocondrias. Además, el estrés oxidativo se ha propuesto
como un evento relevante en la patogénesis de FM que muestra una correlación positiva
significativa con los síntomas clínicos. A fin de evaluar el estrés oxidativo en FM, se
determinó la producción de ROS mitocondrial en las PBMC a partir de controles y de
pacientes con FM mediante el uso de MitoSOX, un indicador de superóxido mitocondrial.
La producción de superóxido mitocondrial fue significativamente mayor en PBMC de los
pacientes con FM respecto a los controles (p <0,001) (Figura 11C). Además, como
marcador de estrés oxidativo, se determinaron los niveles de expresión de 8-oxoguanina
glicosilasa (OGG1), una ADN enzima glicosilasa responsable de la escisión de 7,8-
dihidro-8-oxoguanina (8-oxo-G), un subproducto de base mutagénica que se produce
como resultado de la exposición del ADN a los ROS, y los niveles de 8-oxo-G en PBMC
de los pacientes. Como muestra la figura, los pacientes con FM mostraron
significativamente más altos niveles de OGG1 (Figura 10A) y 8-oxo-G en las PBMC de
los pacientes con FM (Figura 11D). Estos datos muestran un intenso daño oxidativo del
ADN como consecuencia del alto nivel de ROS que observamos en las células de los
pacientes respecto a los controles sanos.
4.3. Activación del complejo inflamasoma por el estrés oxidativo involucrados en el
dolor de la FM
Como ya hemos mencionado anteriormente, la mitocondria y el estrés oxidativo
constituyen dos importantes inductores de la activación del complejo inflamasoma. Zhou
y colaboradores mostraron que la inhibición de los complejos I, II o III inducía un
66
Resultados
incremento en la producción de ROS que provocaba la activación del complejo NLRP3-
inflamasoma (Zhou et al., 2011). Dado que nuestros pacientes mostraron una considerable
disfunción mitocondrial marcada por reducida actividad de los complejos I y II con
importante incremento en la producción de ROS mitocondriales, nos propusimos analizar
la activación de las proteínas relacionados con el inflamasoma. Nuestros resultados
mostraron un importante aumento de la expresión génica NLRP3 y de la caspasa-1,
aumento de los niveles de expresión de proteínas NLRP3 y la caspasa-1 escindida que
sugiere la activación del inflamasoma (Figura 12A y 12B). Dado que la activación de la
caspasa-1 está también relacionada con la apoptosis o muerte celular, comparamos esta
activación con la de otra caspasa relacionada con la muerte celular pero no con la
inflamación como la caspasa-3. No observamos activación de la caspasa-3, por lo que la
activación de caspasa-1 no era secundaria a la activación de vía de muerte celular por
apoptosis.
67
Figura 12. Activación del complejo NLRP3-inflamasoma en PBMCs de pacientes con FM respecto a
controles. Los niveles de proteína NLRP3 y de la activación de caspasa 1 se analizaron por Western blot.
Los niveles de proteína se determinaron mediante análisis densitométrico (IOD, intensidad óptica
integrada) de tres Western blots diferentes y normalizadas respecto a GADPH, utilizando PBMC a partir
de cuatro pacientes con FM representativos, en comparación con un conjunto de 5 sujetos control de igual
edad y sexo. PBMC de individuos sanos fueron tratados con lipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli
para ser usados como control positivo de la activación de caspasa-1.
Este incremento en las proteínas era acompañado de un incremento de transcritos tanto
de NLRP3 como de Caspasa-1 (Figura 13).
Figura 13. Activación del complejo NLRP3-inflamasoma en PBMCs de pacientes con FM respecto a
controles determinada por expresión a tiempo real. A. Niveles de expresión de B. Los niveles de las
proteína se determinaron por análisis densitométrico (IOD, intensidad óptica integrada) de tres Western
blots diferentes y normalizados respecto la señal de GADPH, utilizando PBMC a partir de cuatro pacientes
con FM representativos, en comparación con un grupo de 5 saludable sujetos de control por edad y sexo.
de NLRP3 y B. Caspasa 1 determinados por Real time RT-PCR cuantitativa. n = 20 para el control y n =
68
Resultados
30 para el grupo de FM, respectivamente. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos
separados. * P < 0,05 entre los pacientes del grupo control y FM.
La consecuencia final de la activación del complejo inflamasoma es la liberación de la
forma activa de las IL-1β e IL-18 como una forma de inflamación sistémica. En ese
sentido, sería lógica la presencia de incrementaros niveles de estas citoquinas en la sangre
de los pacientes. En nuestro estudio, estas citoquinas implicadas en la activación del
inflamasoma y la inflamación, como la IL-1β e IL-18, se encontraron incrementadas en
suero de pacientes con FM (Figura 14A y 14B).
Figura 14. Niveles de IL-1β (A) e IL-18 (B) en suero de los pacientes con FM en comparación con los
controles sanos. La determinación se hizo mediante ELISA tal y como se describe en el Material y métodos.
n = 20 para el control y n = 30 para el grupo de FM, respectivamente. Los datos representan la media ± SD
de tres experimentos separados. P < 0,001 entre el control y los pacientes con FM.
69
Estos niveles de IL- 1β incrementados en suero de los pacientes se correlacionaban con
los niveles de proteína IL- 1β en su forma activa (p17) en las PBMC (Figura 15A). Dado
que nuestros datos parecen mostrar que la activación del complejo inflamasoma en
nuestros pacientes viene mediada por la disfunción mitocondrial y el consecuente estrés
oxidativo, las PBMC de pacientes con FM fueron aisladas y cultivadas con CoQ10 para
tratar la deficiencia detectada en las células de los pacientes y por su potencial
antioxidante y protector de la mitocondria. Tras el tratamiento en cultivo con CoQ10 30μM
después de 24 h las células mostraron una importante reducción de la caspasa-1 activa así
como de los niveles de proteína IL- 1β (p17) (Figura 15B y 15C).
Figura 15. Efecto del tratamiento con CoQ10 en la activación del complejo inflamasoma en células de
pacientes con FM. A. Niveles de proteína IL-1β en la forma activa p17 en PBMC de varios pacientes
comparados con PBMC de controles sanos y la IL- 1β. B. Efectos del tratamiento con CoQ10 30µM en los
niveles de proteína IL- 1β p17 tras 24h de incubación. C. Niveles proteicos de caspasa-1 activa en PBMC
de los pacientes antes y después del tratamiento CoQ10 30µM. Los datos representan la media ± SD de tres
experimentos separados. * P < 0,001 entre el control y los pacientes con FM.
70
Resultados
Por otro lado, y dado que nuestros resultados mostraron que el tratamiento con un
antioxidante y protector mitocondrial reducían la activación del complejo inflamasoma,
realizamos una correlación mediante Pearson entre los niveles séricos de IL-1β y los
niveles tanto de CoQ10 como marcador de la disfunción mitocondrial de estos pacientes
como los niveles de ROS mitocondriales. Los niveles séricos de IL-1β en pacientes con
FM mostraron una correlación negativa significativa (P<0.05) con los niveles de CoQ10
y una correlación positiva significativa (p<0,001) con los niveles de ROS mitocondriales
(Figura 16A y 16B).
71
Figura 16. Correlación de los niveles de CoQ10 en PBMC (panel A) con los niveles séricos de IL-1β de
los pacientes con FM. Niveles de ROS mitocondriales (Panel B) en PBMC de los pacientes con FM
correlacionados con los niveles de IL-1β séricos. n = 30. La correlación fue establecida mediante el cálculo
de los coeficientes de correlación de Pearson.
72
Resultados
Además, los niveles séricos de IL-1β mostraron una alta correlación positiva con las
puntuaciones de la escala de dolor de los pacientes con FM (Figura 17). Estos datos
sugieren que los altos niveles de IL1-β y los niveles de IL-18 pueden tener un papel en la
fisiopatología de la FM. En esta línea, es interesante destacar que las IL1-β e IL-18 se han
descrito de estar involucrados en el aumento de la sensibilidad de los receptores
sensoriales, lo que significa que causan directamente o al menos modular el dolor (Verri
et al., 2007; Li et al., 2009).
Figura 17. Asociación de niveles séricos de IL-1β y las puntuaciones de dolor en pacientes con FM. n =
30 para los grupos de fibromialgia. La fuerza de la asociación fue establecida mediante el cálculo de
coeficientes de correlación de Pearson.
73
4.4. La inducción de deficiencia de CoQ10 produce la activación del inflamasoma
Para verificar el papel del CoQ10 y la disfunción mitocondrial en el proceso inflamatorio
en la FM, se indujo la deficiencia de CoQ10 en PBMC a partir de 5 controles sanos
mediante la inhibición de la biosíntesis endógena de la CoQ10 con 1 mM p-aminobenzoato
(PABA) durante 24 horas. La inhibición de la CoQ10 (Figura 18A) en PBMC tuvo un
efecto notable sobre la bioenergética celular, induciendo una disminución del 57% de los
niveles de ATP intracelulares, que fueron restaurados después del tratamiento con 10μM
CoQ10 (Figura 18B). Esta deficiencia de CoQ10 en PBMC también indujo un aumento de
la oxidación del ADN (OGG1) y de la activación del inflamasoma demostrado por el
aumento de los niveles de expresión de NLRP3 y la caspasa-1 activa (Figura 18C y 18D),
asociado con un aumento significativo de los niveles de IL-1β y IL-18 en el medio de
cultivo (Figura 18E y 18F). Curiosamente, la suplementación con CoQ10 indujo una
reducción significativa en la oxidación del ADN, la activación inflamasoma, los niveles
de IL-1β y IL-18 en el medio de cultivo de las PBMC deficientes de CoQ10 (Figura 18C
a 18F).
74
Resultados
75
Figura 18. La inducción de la deficiencia de CoQ10 en un modelo in vitro activa el compleja
inflamasoma en PBMC. A y B. La deficiencia de CoQ10 y la disminución de los niveles de ATP inducida
por 1 mM de p- aminobenzoato de tratamiento ( PABA ) durante 24 horas en PBMC a partir de 5 voluntarios
sanos. C. Niveles de expresión de proteínas de OGG -1 y NLRP3 así como la inducción de la activación de
caspasa-1 analizado por Western Blot en una homogenado de células de PBMC de 5 controles. D. Los
niveles de expresión de proteínas se determinaron por análisis densitométrico (IOD, la intensidad óptica
integrada) de tres transferencias de Western diferentes y normalizadas respecto la señal de GADPH. E y F.
Niveles IL- 1β e IL -18 en los medios de cultivo de PBMC incubadas con PABA durante 24 horas y
analizadas por ELISA como se describe en Material y Métodos. Los datos representan la media ± SD de
tres experimentos separados. * P < 0,001 entre el control y PABA, y entre PABA y CoQ 10.
76
Resultados
FISIOPATOLOGÍA DE LA DISFUNCIÓN MITOCONDRIAL EN
FIBROBLASTOS DE FIBROMIALGIA
Dado que existe una clara disfunción mitocondrial en nuestros pacientes, nos propusimos
estudiar el efecto de esta disfunción en el metabolismo celular. Para ello, el modelo más
utilizado son los fibroblastos de piel aislados mediante biopsia dérmica de los pacientes.
Este modelo permite una línea primaria en cultivo con las características moleculares del
paciente (Haas et al., 2008).
4.5. Metabolismo mitocondrial en fibroblastos de pacientes con FM
Para evaluar la el metabolismo mitocondrial en fibroblastos, se obtuvieron biopsias de
piel y se aislaron fibroblastos de tres pacientes y dos sujetos sanos de igual sexo y edad a
los pacientes (Tabla 3).
77
Tabla 3. Características de pacientes y controles.
Control 1 Control 2 FM1 FM2 FM3
Edad (años) 42 41 40 42 42
Puntos dolorosos --- --- 14 13 15
Duración enfermedad --- --- 7 6 8

(años)
Sexo Mujer Mujer Mujer Mujer Mujer
IMC 20.80 21.15 20.14 21.80 20.04
FIQ, range 0-80 --- --- 63 65 61
VAS, range 0-10 --- --- 8 7 8
Glucosa (mg/dL) 93.2 92.4 94.3 93.15 92.2
Ácido Urico(mg/dL) 3.8 3.9 3.2 3.7 3.7
GOT (mU/mL) 25.4 24.3 25.5 23.4 24.1
GPT (mU/mL) 24.5 23.1 25.2 24.9 24.1
Creatina kinasa(IU/L) 650.1 648.3 652.4 649.3 650.1
Colesterol (mg/dL) 178.9 179.4 169.4 178.6 165.2
Triglicerides (mg/dL) 152.6 159.3 155.7 153.3 157.1
IMC: índice de masa corporal; FIQ: Cuestionario de Impacto de Fibromialgia; VAS:
escala analógica visual.
Los fibroblastos de pacientes con FM mostraron una reducción significativa en las
actividades de las enzimas respiratoria mitocondrial en comparación con los fibroblastos
de control (Figura 19).
78
Resultados
Figura 19. La actividad enzimática de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial en los
fibroblastos de la piel de los pacientes con FM. Las actividades enzimáticas mitocondriales se determinaron
como se describe en Materiales y Métodos. Resultados (media ± DE) se expresan en U / CS (unidades por
citrato sintasa). * P < 0,001 ; ** P < 0,01 entre los pacientes de control y FM.
De igual forma que en los resultados observados en las PBMC de los pacientes con FM,
los niveles de expresión de proteínas mitocondriales se correlacionaron con la reducción
de las actividades observadas en las enzimas respiratorias (Figura 20).
79
Figura 20. Los niveles de expresión de las proteínas de las subunidades de los complejos I, II, III y IV
mitocondriales determinados mediante western blot. Los niveles de proteína se determinaron mediante
análisis densitométrico (IOD, la intensidad óptica integrada) de tres transferencias de Western diferentes y
se normalizó con respecto a GADPH, utilizando fibroblastos a partir de tres pacientes con FM, en
comparación con un grupo de fibroblastos de 5 por edad y sexo sano sujetos de control. * P < 0,001; ** P
< 0,01; *** P < 0,05 entre los pacientes de control y FM.
Dado que los fibroblastos mostraron una clara disfunción mitocondrial, cabría esperar un
descenso en el metabolismo bioenergético de las células. Para ello, se investigó la función
mitocondrial mediante la medición de los valores de tasa de consumo de oxígeno (OCR)
en los fibroblastos de control y de FM, expuestos secuencialmente a cada uno de cuatro
80
Resultados
moduladores de la fosforilación oxidativa (OXPHOS): oligomicina (un inhibidor de la
F1Fo-ATPasa o complejo V), 2,4-DNP (desacoplamiento de la cadena de transporte de
electrones de la fosforilación oxidativa) y antimicina / rotenona (inhibidores de los
complejo I y III respectivamente) (Figura 21A). El OCR basal estaba considerablemente
afectado en los fibroblastos de los pacientes de FM en comparación con los controles
(Figura 21B). La capacidad respiratoria de repuesto (SRC) de las células, o capacidad de
las células para aumentar la producción de ATP, se obtuvo mediante el cálculo de la
media de los valores de OCR después de la inyección de 2,4-DNP menos la respiración
basal y podría ser utilizado como un indicador de lo cerca que una célula está funcionando
al máximo límite bioenergético. Los fibroblastos de pacientes con FM mostraron una
disminución significativa de SRC en comparación con las células control (Figura 21C).
81
Figura 21. Tasa de consumo de oxígeno (OCR) en las células de los pacientes del grupo control y FM. A.
El nivel de OCR se determinó usando el Seahorse XF- 24 extracelular Flux Analyzer con la inyección
secuencial de oligomicina (1 mg / mL), 2,4- DNP (100 mM), rotenona (1 M) en el punto de tiempo indicado.
B. El OCR basal se observa marcadamente afectado en las células de FM en comparación con el control.
C. La capacidad respiratoria de repuesto (SRC) de los fibroblastos FM mostró una disminución significativa
con respecto al control fibroblastos. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos separados.
* P < 0,001 entre los pacientes de control y FM.
Esta reducida capacidad respiratoria por parte de las células mostró consecuencias desde
el punto de vista bioenergético en las células de los pacientes, observándose bajos niveles
de ATP (Figura 22).

Niveles de ATP (nMol/mg
9
8
7
proteína)
6
5
**
4
3
* *
2
1
0
Control 1 Control 2 Control 3 FM1 FM2 FM3
Figura 22. Bioenergética de fibroblastos de pacientes con FM determinados por luminiscencia tal y como
se describe en el apartado de material y métodos. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos
separados. * P < 0,001; ** P < 0,01 entre los pacientes de control y FM.
82
Resultados
Además, de forma similar a los resultados observados previamente en PBMC, los
fibroblastos de pacientes con FM también mostraron una disminución de los niveles de
CoQ10 en comparación con los controles (Figura 23A). El contenido de CoQ10 de
fibroblastos del paciente 1 se observó reducido en un 70%, paciente 2 en un 78% y de
paciente 3 en un 82%. Además, los fibroblastos de pacientes también mostraron un menor
número de mitocondrias en cuanto a un reducido contenido de ADN mitocondrial en
comparación con los valores de fibroblastos control. Nuestros resultados mostraron que
el contenido de ADNmt fue 30 a 50% menor en los fibroblastos de FM (Figura 23B).
Este resultado se confirmó además mediante la visualización del número de copias de
ADNmt por célula utilizando la tinción PicoGreen y microscopía de fluorescencia. Las
copias de ADNmt se observaron significativamente reducidas en los fibroblastos de FM
(Figura 23C y 23D).
83
Figura 23. A. Los niveles de CoQ10 en células de control y FM determinados mediante HPLC. B. Número
de copias de ADNmt que se midió mediante RT- PCR como se describe en Material y Métodos. C y D.
Imágenes del ADNmt mediante tinción PicoGreen y cuantificación de puntos de PicoGreen en los
fibroblastos de control y FM. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos separados. Bar =
15 micras * P < 0,001; ** P < 0,01 entre los pacientes de control y FM.
84
Resultados
4.6. Niveles de estrés oxidativo en los fibroblastos de pacientes con FM
Uno de los efectos de la actividad de la cadena respiratoria mitocondrial es la formación
de ROS como el superóxido, el peróxido de hidrógeno y los radicales hidroxílicos. De
hecho, en condiciones normales entre el 2% y el 5% de los electrones transportados en la
cadena respiratoria mitocondrial se pierden en forma de radicales libres. Por tanto, parece
lógico pensar que el trastorno en la actividad de los complejos mitocondriales pueda llevar
aparejada una alteración en la producción de dichas ROS (Cotán et al., 2011). Con el fin
de analizar la generación de ROS en los fibroblastos de pacientes con FM como
consecuencia de la disfunción mitocondrial descrita, cuantificamos los niveles de
producción de ROS mitocondriales mediante citometría de flujo usando MitoSOX. La
producción de superóxido mitocondrial fue significativamente mayor en los fibroblastos
de FM en comparación con los controles (p <0,001) (Figura 24A). Estos ROS producidas
por la mitocondria son compuestos altamente reactivos, que atacan a las proteínas, lípidos
y ácidos nucleicos iniciando reacciones de peroxidación, por lo que causan lesiones en
los tejidos al dañar los componentes estructurales básicos de las células. Para comprobar
si un desequilibrio entre las defensas antioxidantes y la producción de ROS están dañando
componentes celulares, realizamos ensayos de peroxidación lipídica en fibroblastos de
FM usando C11-Bodipy, un análogo de los ácidos grasos de las membranas celulares con
la propiedad de emitir fluorescencia en el espectro visible. Como consecuencia de la
oxidación producida por las ROS, la fluorescencia del C11-Bodipi pasa del rango del rojo
al del verde, mostrando el ratio de oxidación/reducción de las bicapas lipídicas (Drummen
GP, et al, 2001). Nuestros datos confirmaron que los fibroblastos de FM sufrían un alto
grado de peroxidación de sus membranas en comparación con fibroblastos control
(Figura 24B).
85
A
*
120
*
Fluorescence (a.u.)
Producción ROS
100
Mitocondriales
80
60 a
40
20
0
B
80
70 a a a
Arbitrary units (a.u.)
Lipid Peroxidarion
60
50
Reduced
40
Oxidated
30
*
20 * *
10
0
Figura 24. Estrés oxidativo en fibroblastos de pacientes con FM. A. Producción de ROS mitocondrial
analizada en fibroblastos de los pacientes control y FM por citometría de flujo como se describe en Material
y Métodos. B. Cuantificación de la peroxidación lipídica en los fibroblastos de control y FM. Los datos
representan la proporción de lípido reducido /oxidado. Los datos representan la media ± SD de tres
experimentos separados. * P < 0,001, a P < 0,01 entre los pacientes del grupo control y FM.
86
Resultados
Este incremento en la producción de ROS mitocondriales era también observado por
microscopía de fluorescencia mostrando la colocalización de fluorescencia de MitoSOX
con un marcador de mitocondrias (Figura 25A). Además, en la figura 25 se muestran las
imágenes de la peroxidación lipídica (Figura 25B).
Figura 25. Estrés oxidativo en fibroblastos de pacientes con FM por microscopía de fluorescencia. A.
Producción de ROS mitocondriales determinado mediante MitoSOX un indicador de la dismutasa
mitocondrial en rojo B. La peroxidación de las bicapas lipídicas se determinó por microscopía de
fluorescencia mediante C11-Bodipy 581/59 de acuerdo se describe en Materiales y Métodos. El colorante
fluorescente C11-Bodipy 581/59 se inserta en las membranas lipídicas y permite la evaluación cuantitativa
de lípidos oxidados (fluorescentes en color verde) y no oxidados (color rojo).
87
Para confirmar estos resultados, se determinó los niveles de expresión de OGG1, una
ADN enzima glicosilasa responsable de la escisión de 8-oxo G, un subproducto de base
mutagénica que se produce como resultado de la exposición del ADN a los ROS, en las
células de los pacientes. Como muestra la figura, los pacientes con FM mostraron
significativamente más altos niveles de OGG1 (Figura 26A). Estos datos muestran un
intenso daño oxidativo del ADN como consecuencia del alto nivel de ROS que
observamos en las células de los pacientes respecto a los controles sanos.
Figura 26. Expresión de proteínas de oxoguanina-glicosilasa 8 (OGG - 1, una enzima ADN glicosilasa
responsable de la escisión de 7,8 -dihidro- 8 -oxoguanine (8–oxo-G). Los niveles de las proteína se
determinaron por análisis densitométrico (IOD, intensidad óptica integrada) de tres Western blots diferentes
y normalizados respecto la señal de GADPH.
Dentro de un entorno altamente oxidativo, las células tienden a activar todo un sistema
defensivo mediante la producción de antioxidantes. El desequilibrio de este sistema tiene
como consecuencia el agravamiento del estrés oxidativo. Por ello, estudiamos la actividad
de dos importantes antioxidantes en la célula, la MnSOD y la Catalasa. Nuestros datos
mostraron niveles significativamente reducidos en los fibroblastos de los pacientes con
FM (Figura 27A y 27B). Esta reducción de los niveles proteicos de ambos antioxidantes
88
Resultados
eran acompañados de una baja actividad de los mismos (Figura 27C y 27D) demostrando
que efectivamente, existe un entorno oxidativo en los fibroblastos de pacientes con FM
que permite el exceso de ROS y de daño en lípidos y ADN que el sistema antioxidante
no es capaz de controlar.
A B 250000
Unidades Arbitrarias (u.a.)
CTL FM1 FM2 FM3 200000
MnSOD
150000
Catalasa MnSOD
*
100000 Catalasa
GAPDH
50000
0
Control FM1 FM2 FM3
C 25
D
70
20 60
Actividad SOD (U/mg
Actividad CAT (U/mg
50
proteína/min)
15 *
proteína/min)
40
*
* 30
10 * *
* 20
5
10
0 0
Control FM1 FM2 FM3 Control FM1 FM2 FM3
Figura 27. Actividad antioxidante en fibroblastos de pacientes con FM. A. Niveles de expresión de las
proteínas MnSOD y catalasa en fibroblastos de pacientes con FM comparados con FM. Los niveles de
proteína se determinaron mediante análisis densitométrico (IOD, la intensidad óptica integrada) de tres
89
Western diferentes y normalizados a la señal de GADPH. * P < 0,001 entre el control y los pacientes con
FM. B. Actividades de enzimas antioxidantes Superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) en
fibroblastos de pacientes con FM. * P < 0,001 entre pacientes y control.
90
Resultados
UNA MUTACIÓN EN EL GEN CITOCROMO B DEL ADN MITOCONDRIAL
EN UNA FAMILIA CON FIBROMIALGIA SE ASOCIA CON LA ACTIVACIÓN
NLRP3 - INFLAMASOMA
4.7. Análisis de ADNmt de pacientes con FM
Para evaluar si las mutaciones en los genes mitocondriales se asocian con la FM, se
secuenció el ADNmt de cinco pacientes con FM e intolerancia al ejercicio a partir de
muestras sanguíneas. La edad media en el grupo de FM fue 44 ± 2 años. La duración
media de los síntomas fue de 6,2 ± 1,7 años. La media de los puntos de dolor fue 15,1 ±
2,2 puntos, y los pacientes tenían niveles significativamente de dolor (VAS) (6,8 ± 0,8),
y de alto impacto global de FM (FIQ) (60 ± 3,4) así como de las subescalas FIQ de dolor
(6 ± 1,5), fatiga (7,6 ± 1,1), cansancio matutino (6 ± 1,8), rigidez (7,6 ± 1,6), ansiedad
(6,4 ± 2,8) y la depresión (4,8 ± 2,5) (Tabla 4). Acerca de manifestaciones típicas de la
enfermedad mitocondrial como ptosis, pérdida de la audición, síntomas visuales, el
paciente 3 refirió una pérdida auditiva moderada en su historia clínica. El análisis de
secuencia de todo el genoma mitocondrial reveló varias variantes polimórficas conocidas
similares en todos los pacientes en comparación con la Secuencia de Referencia de
Cambridge revisado (Tabla 5), y una mutación en homoplasmia en la paciente 3:
m.15804T> C, en el gen mtCYB, mostrando la sustitución de la valina en el codón 353
con una alanina (p.V353A). A continuación se analizaron las implicaciones patológicas
de esta mutación en la paciente 3 y su familia.
91
Tabla 4. Parámetros sintomáticos de los pacientes con FM. IMC, Índice de masa corporal; FIQ, Cuestionario de impacto de la fibromialgia;
VAS, Escala analógica visual.
Parámetros Paciente 1 Paciente 2 Paciente 3 Paciente 4 Paciente 5

Edad (años) 45 46 43 41 45
Puntos dolorosos 15 14 12 11 13
Duración enfermedad (años) 6 8 5 4 8
Sexo Mujer Mujer Mujer Mujer Mujer
IMC (kg/m2) 23.2 22.9 24.9 22.1 23.8
FIQ, rango 0-80 68 70 66 71 75
Dolor 7 6 8 4 5
Fatiga 8 9 7 8 6
Fatiga matutina 8 8 5 4 5
Rigidez 7 8 9 9 5
Ansiedad 7 10 6 7 2
Depresión 7 6 7 2 2
VAS dolor 0-10 7 6 8 7 6
92
Resultados
Tabla 5. Resumen de los resultados de la secuenciación en sangre de pacientes con FM.
FM1 FM2 FM3 FM4 FM5
MT-RNR1 A750G G709A A750G G709A A750G
A1438G A750G A1438G A750G A1438G
A1438G A1438G
MT-RNR2 G3010A G1888A G1888A
A2706G A2706G
MT-ND1 G3834A G3834A
T4216C T4216C
MT-ND2 A4769G A4769G A4769G A4769G A4769G
A4917G A4917G
T5105C T5105C
MT-TW
MT-CO1 C7028T T6776C C7028T T6776C
MT-CO2 A8014G
MT-ATP6 A8860G G8697A A8860G G8697A A8860G
A8701G A8701G
A8860G A8860G
MT-CO3
MT-ND4 A11251G A11251G
G11719A G11719A
MT-ND5 C12633A C12633A
G13368A G13368A
MT-CYB A15326G C14766T A15326G C14766T A15326G
G14905A T15804C G14905A
A15326G A15326G
C15452A C15452A
A15607G A15607G
93
MT-TT G15928A G15928A
MT-DLOOP T16519C T16126C T16519C T16126C T16519C
A263G A16163G A263G A16163G A263G
302insCC- C16186T T152C C16186T T152C

CCC
T16189C 310insC T16189C 310insC
310insC
C16294T C16294T
514inCA
T16519C T16519C
A73G A73G
A263G A263G
302insCC 302insCC
310insC 310insC
514inCA 514inCA
94
Resultados
4.8. Análisis molecular de la mutación encontrada
La transición T → C en la paciente 3 genera un nuevo sitio de restricción para la enzima
BbvI que nos permitió diseñar un ensayo de PCR para el diagnóstico de la mutación
m.15.804 (Figura 28A). El análisis molecular en la paciente 3, una mujer de 45 años de
edad, mostró que la mutación 15804 fue homoplásmica en las células de sangre, orina y
muestras de saliva (Figura 28B). Además, se evaluaron varios miembros de la familia de
la paciente 3, a partir de tres generaciones (Figura 28C). El pedigrí mostró claramente
un patrón típico de herencia materna e interesantemente, la mutación estuvo presente en
los miembros con manifestación clínica típica de FM cuyo diagnóstico se estableció
según criterios ACR.
Corte Bbvl -: Sin Bbvl

+: Corte con Bbvl
P: Paciente
Piel
Orina
Saliva
Paciente FM Control sano
95
Figura 28. Análisis de genotipado de la mutación mtCYB. A. Ilustración de la mutación encontrada en
la paciente 3 en el gen mtCYB. El m15.804 transición C → T genera un nuevo sitio de restricción (GCAGC)
para la enzima BbvI. La amplificación por PCR de muestras de ADN y la digestión con restricción BbvI
permite identificar los diferentes haplotipos por patrón específico de bandas de ADN en la electroforesis
en gel de agarosa. B. el análisis molecular en la paciente 3 mostró que la mutación estaba en homoplasmia
en las células de la orina, muestras de saliva y biopsia de piel. C. el análisis del pedigrí de la familia de la
paciente 3 a lo largo de tres generaciones. Símbolos blancos y negros denotan las personas con o sin
síntomas de la FM, respectivamente. Formas: hombre, círculos: mujer.
Además de la paciente 3, los pacientes familiares P4, P5 y P6 (ver pedigrí en la figura 9)
con mutación refieren una pérdida auditiva moderada en sus antecedentes clínicos.
Curiosamente, la pérdida de audición se ha descrito y relacionado con FM (Bayazit et al.,
2002; Wolfe et al, 2012). La evaluación de parámetros de laboratorio en la paciente 3 se
mostraban en rangos normales, incluyendo lactato en sangre, electrolitos, la creatina
quinasa, y el perfil lipídico (Tabla 6). La mutación en homosplasmia encontrada fue el
único cambio sospechoso observado en la paciente 3 y la familia que no se observa en
otros pacientes y controles habiéndose estudiado en otros 60 pacientes y en 40 controles,
lo que sugiere que podría estar asociada con la enfermedad en la familia.
96
Resultados
Tabla 6. Parámetros bioquímicos séricos en la paciente 3.
Parámetros bioquímicos Paciente Rango normal

Glucosa (mg/dL) 99 76-110
Urea (mg/dL) 17 10-50
Proteínas totales (g/dL) 6.8 6.6-8.7
Na (mEq/L) 142 135-145
K (mEq/L) 4.2 3.5-5
Ácido úrico (mg/dL) 3.9 2.4-5.7
Creatinina (mg/dL) 0.71 0.5-0.9
Ca (mg/dL) 9.4 8.5-10.5
Fosfato (mg/dL) 3.44 2.7-4.5
Bilirubina (mg/dL) 0.39 0.2-1
Fosfatasa alcalina (U/L) 55 35-104
GOT (mU/mL) 21.9 5-37
GPT (mU/mL) 23.5 5-41
Creatina kinasa (U/L) 73 10-190
Colesterol (mg/dL) 155 80-200
HDL Colesterol (mg/dL) 65 50-100
LDL Colesterol (mg/dL) 69 <120
Triglicéridos (mg/dL) 50 50-150
4.9.Análisis de la estructura y secuencia de aminoácidos
La mutación en la proteína CYB sustituye un residuo de valina parcialmente conservado
en una alanina. Este es un cambio conservador que parece no afectar a la función o
estructura. Sin embargo, este mismo cambio ha sido encontrado previamente en otra
proteína de la cadena respiratoria mitocondrial, COXIII correspondiente al complejo IV,
asociada con el síndrome de Leigh (Mkaouar-Rebai et al., 2011). Tras la comparación de
los residuos del cambio y su conservación, se observa que hay una alta similitud en esa
misma región en ambas proteínas (Figura 29). En ambas proteínas el residuo valina
97
aparece en la posición central de una hélice trans-membrana enriquecida con residuos
hidrofóbicos con características similares. Este análisis nos muestra que ambos cambios
pueden llegar a tener características fisiopatológicas.
Figura 29. Conservación y estructura de similitud de la mutación Val- Ala entre CYB y COXIII. A.
conservación, imagen-muestra de la región circundante (6 residuos en cada lado) para la mutación en las
dos proteínas. La altura de la columna corresponde a la conservación en esa posición (contenido de la
información), y la altura de cada letra se relaciona en la frecuencia de esa letra en esa posición. La ocupación
es la probabilidad de observar una letra en una posición, y la probabilidad de inserción y la longitud
dependen de insertos putativos en la alineación. La mutación aparece en diferentes dominios Pfam de las
dos proteínas: b citocromo C-terminal para CYB, y citocromo c oxidasa subunidad III para COXIII. B.
posición de la mutación ampliada que muestra la probabilidad de residuos. C, estructura de la región de las
dos proteínas, que corresponde a parte de una hélice transmembrana. El residuo valina se resalta en rojo.
98
Resultados
4.10. Estudios fisiopatológicos
En consonancia con el hecho de que la nueva mutación se detectó en una proteína del
complejo III, los fibroblastos de la piel de la paciente 3 e hijo mostraron una reducción
de los niveles de la actividad del complejo III (Figura 30A) asociada con la deficiencia
de CoQ10 (Figura 30B), la reducción de los niveles de ATP, los niveles altos de
mitocondrial de ROS, la reducción de los contenidos de ADNmt (Figura 30C-E) y la
proliferación tasa baja de las células (Figura 31).
99
Figura 30. Fisiopatología de fibroblastos de la paciente 3 e hijo. A, actividad de la cadena respiratoria en
fibroblastos de la paciente 3 y su hijo en comparación con el control. B, niveles de CoQ10. C, niveles de
bioenergética de los fibroblastos por determinación de ATP. D, producción de ROS mitocondriales. E,
100
Resultados
reducido contenido de ADNmt en fibroblastos de los pacientes de FM en comparación con los controles
sanos. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos separados. * P <0,001; ** P <0,005 entre
los controles y los pacientes con FM.
Control
Paciente 3
Hijo
Figura 31. Crecimiento de las células determinadas en fibroblastos de ambos pacientes comparados con
controles.
Similares alteraciones fisiopatológicas se observaron en otras muestras biológicas de la
paciente 3, tales como las células de la sangre, la orina, las muestras de saliva y plaquetas
(Tabla 7).
101
Tabla 7. Datos bioquímicos en diferentes muestras biológicas de la paciente 3. Los
cambios se muestran por porcentaje respecto a controles sanos.
Sangre Células de orina Células de saliva Plaquetas
Complejo III 49% 28% 33% 45%
CoQ10 40% 31% 60% 50%
ATP 42% 36% 36% 70%
mtDNA/nDNA 37% 30% 32% 47%
Para evaluar la disfunción mitocondrial se midió la tasa de OCR en fibroblastos de la
paciente 3 e hijo. Las determinaciones se realizaron mediante la exposición secuencial
de las células a cuatro moduladores de la fosforilación oxidativa (OXPHOS): oligomicina
(un inhibidor de F1Fo-ATPasa o complejo V), 2, 4-DNP (desacoplamiento de la cadena
de transporte de electrones de la fosforilación oxidativa) y antimicina / rotenona
(complejo I e inhibidores III respectivamente). El OCR basal en las células de FM era
notablemente inferior respecto al control, con valores de aproximadamente 2,8 veces
(p<0,05) más bajo que los controles (Figura 32A y B). La SRC de las células se obtuvo
mediante el cálculo de la media de los valores de OCR después de la inyección de 2,4-
DNP menos la respiración basal, y se puede utilizar como un indicador de cómo de cerca
a su límite bioenergético está funcionando una célula. El SRC en las células FM fue
significativamente baja (5 veces, p<0,05) en comparación con las células control (Figure
32C).
102
Resultados
B
A
* *
* *
Figura 32. A. OCR se determinó a través de Seahorse XF-24 extracelular Flux Analyzer con la inyección
secuencial de oligomicina (1 mg / ml), 2,4-DNP (100 mM), antimicina/rotenona (1 µM) en el punto de
tiempo indicado en cada pocillo, después de la medición del nivel basal. B. El OCR basal estaba
considerablemente afectado en las células de los pacientes. C. La capacidad respiratoria de repuesto (SRC)
en fibroblastos de FM mostró una disminución significativa. Los datos representan la media ± SD de tres
experimentos separados. * P <0,001 entre los controles y los pacientes con FM.
4.11. Activación del complejo NLRP3-inflamasoma
En condiciones de estrés oxidativo, las mitocondrias pueden ser dañados y a su vez, dañar
a la propia célula resultando una disfunción celular y un incremento de la inflamación
(Cordero et al., 2013b). De esta forma, la inhibición del complejo I o III de la cadena
respiratoria mitocondrial se ha demostrado que induce un incremento en la producción de
ROS y la activación inflamasoma NLRP3 (Zhou et al., 2011; Shimada et al., 2012; Ding
et al., 2014) En este sentido, hemos analizado la activación de proteínas relacionadas con
el inflamasoma en la paciente 3. Encontramos un aumento en los niveles de expresión de
NLRP3, caspasa 1 p20, e IL-1β (p17) en los fibroblastos de la paciente 3 (Figura 33A)
103
y aumento de los niveles de IL-1β en el suero sugiriendo la activación del inflamasoma
(Figura 33B).
Figura 33. Activación del inflamasoma en los fibroblastos de la paciente y niveles de IL-1β en el suero de
la paciente 3 con FM. A. niveles de proteína NLRP3, caspasa 1 p20 y IL-1β (p17) se analizaron por
Western. Los niveles de proteína se determinaron por análisis densitométrico (IOD, intensidad óptica
integrada) de tres transferencias de Western diferentes y se normalizó a la señal de GADPH en comparación
con un grupo de 5 sujetos control emparejados por sexo y edad. B. niveles en suero de IL-1β de paciente
con FM y control determinados por ELISA. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos
separados. * P <0,001 entre los controles y los pacientes de FM.
Interesantemente, las PBMCs de los miembros de la familia que portaban la mutación
también mostraron un aumento de expresión de la proteína IL-1β (p17), así como un
aumento de los niveles séricos de IL-1β (Figura 34).
104
Resultados
*
* *
**
Figura 34. Los niveles de IL-1β (p17) en BMC se determinaron en varios miembros de tres generaciones
de la familia de la paciente 3. El pedigree muestra a los miembros afectados de la familia con la mutación.
Cuadros: hombre, círculos: mujer. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos separados. *
P <0,001; ** P <0,005 entre los controles y los pacientes de FM.
Para examinar el efecto de la activación inflamasoma en el metabolismo celular, los
fibroblastos de la paciente 3 fueron tratados con 16673-34-0 (5-cloro-2-metoxi-N- [2- (4-
sulfamoilfenil) etil] benzamida, un nuevo inhibidor específico de NLRP3 (Marchetti et
al., 2014), mediante la evaluación del crecimiento celular. La inhibición de la NLRP3
indujo un aumento del crecimiento celular en fibroblastos del paciente (Figura 35), lo
que podría interpretarse como una mejora en el metabolismo de la célula lo que indicaría
que los altos niveles de inflamasoma en la célula estarían contribuyendo al agravamiento
de su fisiopatología.
105
Figura 34. Evaluación del efecto de la inhibición de NLRP3 en el crecimiento celular mediante co-
incubación con 16673-34-0 determinado en fibroblastos sanos y FM.
Las enfermedades mitocondriales constituyen un grupo enormemente heterogéneo, ya no
solo por sus diferentes manifestaciones clínicas, sino también por su origen diverso
puesto que cada diagnóstico genético es establecido por la presencia de una mutación
conocida e incluso por la aparición de nuevas mutaciones. En este sentido, nos
propusimos evaluar si la activación del complejo inflamasoma es un evento propio de
nuestra nueva mutación o existente en otras patologías mitocondriales. Para ello, se
analizó la activación de NLRP3-inflamasoma en fibroblastos de otras enfermedades
mitocondriales como MELAS, MERRF y LHON. Nuestros datos muestran un aumentó
en los niveles de expresión de proteínas de NLRP3 e IL-1β (p17) en los fibroblastos de
estas enfermedades (Figura 35).
106
Resultados
Figura 35. Niveles de expresión proteica de NLRP3 y IL-1β (p17) analizados en fibroblastos de MELAS,
MERRF y LHON por Western Blot. Los niveles de proteína se determinaron por análisis densitométrico
(IOD, intensidad óptica integrada) de tres transferencias de Western diferentes y se normalizó a la señal de
GADPH en comparación con un grupo de 5 sujetos control emparejados por sexo y edad. Los datos
representan la media ± SD de tres experimentos separados. * P <0,001; ** P <0,005 entre los controles y
los pacientes de FM.
Para confirmar la condición patológica de la mutación descrita independiente al fondo
nuclear, se generaron líneas celulares transmitocondriales (híbridos citoplasmáticos o
cíbridos) utilizando la línea de osteosarcoma 143B206 rho0 celular (King y Attardi, 1989)
y las mitocondrias de las plaquetas de la paciente 3. Los cíbridos control también se

107
generaron mediante el uso de las mitocondrias de las plaquetas de individuos sanos.
Mediante genotipado, confirmamos que los cíbridos control y mutantes albergaban el
ADNmt de las plaquetas de los donantes correspondientes (Figura 36).
Figura 36. Genotipado de cíbridos. Análisis molecular de cíbridos generados a partir de osteosarcoma
143B206 línea celular rho0 (C), con el fondo nuclear común, y las plaquetas de la paciente 3 (cy 1 y 2). La
mutación m15.804 no se introdujo en células Cy2. Por tanto se usó el clon Cy1.
Los cíbridos seleccionados como portadores de la mutación mostraron una considerable
reducción en la actividad del complejo III (Figura 37). Además, los niveles de ATP en
los cíbridos mutantes fueron menores que en los cíbridos control (Figura 38A). Los
niveles de ROS mitocondrial en los cíbridos mutantes también fueron significativamente
más altos que en los cíbridos control (Figura 38B). Interesantemente, los niveles de
expresión de proteínas IL- 1β (p17) se mostraban incrementados en los cíbridos mutantes
(Figura 38C). Estos resultados sugieren fuertemente que el ADNmt mutado es, de hecho,
108
Resultados
responsable de las alteraciones bioquímicas que ocurren en las células del paciente así
como que se muestra asociado a la activación del inflamasoma.
Figura 37. Actividad mitocondrial del complejo III. Los datos representan la media±SD de tres
experimentos separados. * p < 0.001 entre los controles y los pacientes con FM.
109
Figura 38. A. Niveles bioenergéticos de cíbridos mutantes evaluados mediante la determinación de ATP.
B. la producción de ROS mitocondriales fue analizado en cíbridos por citometría de flujo. C. Caspasa 1p20
y IL- 1β (p17) se analizaron mediante inmunotransferencia de tipo Western.. Los datos representan la media
± SD de tres experimentos separados. * p < 0.001 entre los controles y los pacientes con FM.
La evaluación del efecto del cambio de aminoácido en la estructura de la proteína mostró
que la mutación (rojo) se localizó en una zona opuesta del sitio de unión ubiquinona
(verde) (Figura 39). Por tanto, se prevé una buena respuesta de las células al tratamiento
con CoQ10.
Figura 39. Estructura tridimensional del mtCYB mostrando la mutación (rojo) localizada en la zona
opuesta al sitio de unión ubiquinona (verde).
110
Resultados
De acuerdo a esto, los fibroblastos de la paciente con la mutación fueron suplementados
con CoQ10 30 µM. Tras 24 h de tratamiento, se observó una significativa mejora de la
tasa OCR así como de la capacidad respiratoria de repuesto lo que demostró una
restauración metabólica en los fibroblastos tratados a pesar de la presencia de la mutación
(Figura 40).
Figura 40. Fisiopatología de fibroblastos mutantes de paciente con mutación después del tratamiento
con CoQ10 30 µM. La OCR se controló a través Seahorse XF-24 extracelular Flux Analyzer con la
inyección secuencial de oligomicina (1 mg / mL), 2,4-DNP (100 mM), rotenona (1 M) en el punto de tiempo
indicado en cada pocillo, después de la medición del ritmo basal. La OCR basal fue marcadamente afectada
en las células de paciente, y mejoró con CoQ10. Además, la capacidad respiratoria de repuesto (SRC) en
fibroblastos FM mostró una disminución significativa que fue mejorada por CoQ 10. Los datos representan
la media - SD de tres experimentos separados. * p <0,001; ** p <0,005 entre los controles y los pacientes
de FM. p <0,001 entre los pacientes con FM y el tratamiento con CoQ10.
111
La deficiencia de CoQ10 se ha asociado comúnmente con enfermedades mitocondriales,
y su suplementación se ha documentado como un tratamiento efectivo (Roos et al., 2014;
Quinzii et al., 2010; Hargreaves, 2014; Chen et al., 2015). Teniendo en cuenta que
previamente se ha demostrado que el tratamiento con CoQ10 induce una significativa
mejora clínica en pacientes con FM (Cordero et al., 2012, 2013a), todos los pacientes con
mutación comenzaron el tratamiento oral con CoQ10 (5 mg/Kg/día). Después de 7 meses,
los pacientes mostraron una mejora significativa en los síntomas clínicos asociados con
la restauración a niveles normales de los parámetros bioquímicos alterados (Tabla 8).
112
Resultados
Tabla 8. Cambios clínicos y bioquímicos en la paciente 3 (probando) y los miembros de la familia portadores de la mutación (identificados según
el pedigree de la figura 9) tras 7 meses de tratamiento oral con CoQ10.
Probando Paciente 2 Paciente 3 Paciente 4 Paciente 5 Paciente 6
Parámetros Pre Post Pre Post Pre Post Pre Post Pre Post Pre Post
Puntos dolorosos 12 6 14 7 11 7 13 5 11 4 13 3
FIQ, rango 0-80 66 21 69 20 64 22 67 20 57 18 51 16
Dolor 8 3 8 4 8 2 9 4 7 2 7 2
Fatiga 7 3 8 2 8 4 8 1 8 1 8 3
Fatiga matutina 5 2 5 2 6 2 6 1 6 1 5 2
Rigidez 9 2 7 3 8 2 7 2 6 3 4 2
Ansiedad 6 3 7 3 7 2 8 3 7 2 5 1
Depresion 7 2 6 3 8 2 8 4 5 2 4 1
VAS dolor, rango 0-10 8 3 9 3 7 3 9 4 7 3 8 1
VAS Fatiga, rango 0-10 7 3 7 3 8 2 8 2 8 1 7 2
Citrate sintasa (Actividad específica) 4.7 18.3 3.7 15.6 4.1 15.9 3.8 16.6 8.1 21.3 6.3 19.1
Niveles deATP (nMol/mgProteína) 5.2 20.4 4.1 19.4 5.8 17.4 3.9 22.1 5.4 26.4 3.7 23.4
IL-1β (pg/ml) 24.3 5.4 26.1 6.1 21.3 7.1 26.3 4.8 25.2 4.4 27.1 3.4
mtDNA copy number(nDNA/mtDNA) 0.4 0.9 0.5 0.8 0.6 0.9 0.3 0.7 0.3 1 0.3 0.9
113
114
Discusión
DISCUSIÓN
115
116
Discusión
5. DISCUSIÓN
La presente tesis doctoral ha estudiado el papel de la disfunción mitocondrial como un
importante agente relacionado con la fisiopatología de la FM, así como su implicación en
el estrés oxidativo descrito en estos pacientes y su relación con un nuevo mecanismo
inflamatorio como es el complejo NLRP3-inflamasoma. Dado que se trata de una
patología de enorme complejidad tanto clínica como científica por su gran
heterogeneidad, nuestro estudio pretende aportar una caracterización de los mecanismos
moleculares que competen a una población de pacientes de esta patología, o más bien, lo
que podríamos definir como un subgrupo. Para definir este conjunto de pacientes, hemos
estudiado tres importantes bloques. Por un lado la inflamación, donde se han realizado
numerosas contribuciones que sugieren que las citoquinas pueden desempeñar un papel
importante en la FM (Salemi et al., 2003; Ross et al., 2010; Wang et al., 2008; Bazzichi
et al., 2007; Nakamura et al., 2010; Togo et al., 2009) e incluso se ha observado una
correlación entre citoquinas y varios síntomas comunes en FM (Bazzichi et al., 2007;
Maes et al., 1999). Sin embargo, hay resultados discrepantes en cuanto a la implicación
de la inflamación en la FM (Menzies et al., 2010). Nuestro estudio ha mostrado un
incremento de las dos citoquinas implicadas con el complejo inflamasoma. Además, estos
pacientes mostraron una importante disfunción mitocondrial en las células
mononucleares. La inhibición del complejo I o III de la cadena respiratoria mitocondrial
ha demostrado que induce la producción de ROS y una consecuente activación del
complejo NLRP3-inflamasoma (Zhou et al., 2009). En este sentido, nuestros datos en las
PBMC de pacientes con FM indican una deficiencia en la actividad de la cadena
respiratoria mitocondrial, acompañada de una deficiencia de CoQ10 y aumento de la
producción de ROS mitocondrial, así como un aumento en los niveles de expresión de
117
marcadores de daño oxidativo en el ADN, ambos activadores del inflamasoma y la
inflamación (Mabley et al., 2005; Zhou et al., 2009).
El inflamasoma ha surgido en los últimos años como un sensor del estrés metabólico y
oxidativo. De hecho, se ha implicado en el desarrollo de las principales enfermedades
metabólicas como la gota, la diabetes tipo 2 y la resistencia a la insulina inducida por la
obesidad. Por otra parte, la NLRP3-inflamasoma se ha implicado en otras patologías
humanas tales como el cáncer, la asbestosis y la enfermedad de Alzheimer (Menu y
Vince, 2011). Es por ello que en los últimos años las investigaciones se han centrado que
la identificación de nuevas patologías en las que este complejo tenga una implicación
directa o indirecta. En nuestros pacientes, hemos observado su implicación por el
aumento de la activación de proteínas propias del inflamasoma como NLRP3, caspasa 1
e IL-1β en las PBMC y el aumento de los niveles séricos de citoquinas como IL-1β e IL-
18. En respuesta a la disfunción mitocondrial, y dado que la inflamación puede ser
activada por el estrés oxidativo, las células activan sus mecanismos de defensa
antioxidante (Pagano et al., 2014). Sin embargo, se ha descrito que los mecanismos de
compensación antioxidante en los pacientes con FM se encuentran reducidos en los
pacientes de FM, lo que conduce a un continuo incremento del estrés oxidativo que
mantiene el daño oxidativo en las mitocondrias y otros orgánulos celulares y ADN
(Altindag et al., 2006; Bagis et al., 2005; Ozgocmen et al., 2006) y, por tanto, una
predisposición al daño inflamatorio. En nuestro estudio, la inflamación se ha mostrado
asociada con síntomas de FM con correlaciones significativamente positivas entre IL-1β
y IL-18 niveles de suero y las puntuaciones de dolor lo que sugiere un componente
inflamatorio en la inducción de dolor. Estos resultados muestran consonancia con
publicaciones previas que señalan el papel patológico de los niveles séricos de IL-1β en
la FM (Salemi et al., 2003; Ross et al., 2010). Además, Feng y colaboradores han
118
Discusión
demostrado la implicación del gen MEFV que codifica para la pirina, un importante
regulador del inflamasoma controlando de este modo la activación de la caspasa-1 y por
tanto, la liberación de IL-1β (Feng et al., 2009). Estos datos preliminares de Feng et al.,
están de acuerdo con nuestros resultados. Por otro lado, según nuestros resultados, la
correlación negativa entre los niveles de IL-1β e IL-18 y niveles de CoQ10 y la correlación
positiva con los niveles de ROS mitocondriales y puntuaciones de la escala de dolor son
compatible con la hipótesis de que la inflamación en FM depende de la disfunción
mitocondrial. Para demostrar esto, realizamos un ensayo in vitro de inhibición del CoQ10
en el que reproducimos los mismos resultados de disfunción mitocondrial y activación
del complejo inflamasoma. Estos datos sugieren que en FM, la activación del
inflamasoma es dependiente de una disfunción mitocondrial en la cual, el CoQ10 adquiere
un papel importante. La deficiencia de CoQ10 provoca una reducción de las actividades
del complejo II + III, el complejo III y complejo IV, una reducción de la expresión de las
proteínas mitocondriales implicadas en la fosforilación oxidativa, una disminución de
potencial de membrana mitocondrial, un aumento de la producción de ROS, la activación
del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (MPT), mitofagia de las
mitocondrias disfuncionales, y una reducción del crecimiento celular (Quinzii et al., 2008;
Rodríguez-Hernández et al., 2009). Dado que en las PBMC de pacientes con FM hemos
observado una clara deficiencia de CoQ10 y disfunción mitocondrial, hemos intentado
profundizar en el metabolismo mitocondrial a través de un modelo in vitro comúnmente
usado en el estudio de las enfermedades mitocondriales, como son los fibroblastos de piel.
En nuestros experimentos mostramos definitivamente que existe una disfunción
mitocondrial en los fibroblastos derivados de los pacientes con FM. Alteraciones como
la deficiencia de CoQ10 y de la actividad de la cadena respiratoria mitocondrial,
acompañada de un déficit de las proteínas de los complejos, un descenso de la masa
119
mitocondrial muestran que efectivamente existe afectación de la actividad mitocondrial.
Dado que existe una alteración en la cadena de transportes de electrones y por tanto, un
deterioro de la biosíntesis de ATP, cabe esperar una reducida respiración celular y
reducidos niveles de ATP. Efectivamente, nuestros experimentos mostraron un descenso
de la respiración celular y de la capacidad respiratoria de repuesto mostrando un estado
forzado para producir ATP que efectivamente se encontró reducido.
Otra consecuencia propia de la disfunción mitocondrial es la alta producción de ROS,
como el anión superóxido, el peróxido de hidrógeno o los radicales hidroxílicos. Existe
la idea de que la afectación de la función mitocondrial no llevaba aparejado un aumento
en la generación de ROS (Rustin P, et al, 2004). Sin embargo, nuestros datos demuestran
un claro incremento de los niveles intracelulares de ROS en fibroblastos de FM. La
formación de estas ROS es un efecto secundario normal de la cadena de transporte
electrónico, pero el porcentaje de electrones transportados que se pierden como radicales
libres aumenta de forma considerable cuando la cadena respiratoria sufre algún tipo de
disfunción, generando en el organismo un incremento del estrés oxidativo. En este caso
influyen varios factores. Por un lado, la falta de un transportador de electrones esencial
en la cadena respiratoria como es el CoQ10 estaría alterando el flujo electrónico normal a
lo largo de la cadena, por lo que muchos de estos electrones podrían escapar como
radicales libres. Por tanto nuestros datos concuerdan con los de otros autores en los que
un grado similar de disfunción mitocondrial induce un incremento de la producción de
ROS (Cotán et al., 2011; De la Mata et al., 2012). Por otro lado, la deficiente actividad
de otros antioxidantes como MnSOD y catalasa, conlleva una reducida respuesta
defensiva. En este sentido, nuestros datos concuerdan con datos previos sobre la reducida
actividad de superóxido dismutasa y catalasa en suero de paciente con FM (Altindag et
al., 2006; Bagis et al., 2005; Ozgocmen et al., 2006). La MnSOD es la subunidad de la
120
Discusión
superóxido dismutasa que se encuentra en la matriz mitocondrial (Turrens, 2003) por lo
que el descenso observado por nosotros en fibroblastos podría ser consecuencia de la baja
masa mitocondrial observada. Además, el CoQ10 ha mostrado tener un papel en la
regulación de otros antioxidantes con la SOD, catalasa, o el ascorbato por lo que su
deficiencia podría estar implicada en la baja respuesta de estos antioxidantes (Villalba et
al., 2000; Modi et al., 2006).
Parece clara la implicación de la mitocondria en la fisiopatología de la FM. Además, esta
disfunción observada es muy similar a la producida en los trastornos mitocondriales.
Estos trastornos son un grupo importante de enfermedades genéticas caracterizadas por
la alteración de la fosforilación oxidativa y de la bioenergética y que presentan una gran
variabilidad de los síntomas, con una variada afectación de órganos, y un curso clínico
muy heterogéneo. Muchos de los síntomas asociados con las enfermedades
mitocondriales están comúnmente presentan en pacientes con FM: intolerancia al
ejercicio, fatiga, miopatía y varias alteraciones neurológicas como la pérdida de la
audición (Bayazit et al., 2002; Watson et al., 2009; Wolfe et al., 2012).
Por otro lado, las enfermedades mitocondriales están asociadas con la herencia materna
(Haas et al., 2008). En este mismo sentido, en los pacientes con FM, aunque el factor de
la herencia se ha documentado, la ausencia de mecanismos patogénicos conocidos
complica los estudios familiares y hereditarios. Diversos estudios sobre agregación
familiar revelaron altas posibilidades de factores hereditarios en FM. Arnold y
colaboradores compararon la prevalencia de la FM con otras enfermedades de dolor como
la artritis reumatoide y encontraron un factor más heredado en el grupo de FM (Arnold et
al., 2004). En este sentido, Buskila y colaboradores han observado una alta prevalencia
de la FM en los hijos de madres con FM (Buskila et al., 1996). En base a estas
conclusiones, en nuestro estudio se muestra por primera vez la aparición de una mutación
121
en el ADNmt en una familia con varios miembros diagnosticados de FM. Como era de
esperar, la mutación fue transmitida por vía materna y estuvo presente en todos los
miembros de la familia con manifestación clínica típica de FM como ya hemos
mencionado antes. Estudios fisiopatológicos mostraron pruebas de una disfunción
mitocondrial en las células del paciente. La mutación estuvo ausente en los otros pacientes
y controles sanos incluidos en el estudio por lo que, a pesar de la necesidad de analizar
más individuos para confirmar estos resultados, nuestros datos podrían estar sugiriendo
que la mutación podría estar asociada a la enfermedad en esta familia. La mutación
encontrada en nuestro estudio convierte una valina altamente conservada en la posición
353 a alanina en el dominio transmembrana de la mtCYB, que puede afectar a la
transferencia de electrones desde el ubiquinol (forma reducida del CoQ10) al citocromo c
y que afecte a la utilización de la energía al trasladar protones desde la membrana
mitocondrial interna hacia el exterior, aumentando la producción de ROS (Lanciano et
al., 2013).
Anteriormente, la disfunción mitocondrial en la FM ha sido ampliamente documentada.
Por ejemplo, estudios en biopsias musculares han demostrado la presencia de marcadores
inflamatorios, acumulaciones mitocondriales subsarcolémicas, mitocondrias anormales,
mayor incidencia de fibras rojas rasgadas, y defectos de la citocromo c oxidasa (complejo
IV de la fosforilación oxidativa) (Kalyan-Raman et al., 1984; Yunus et al., 1986; Pongratz
y Späth et al., 1998). A pesar de un deterioro mitocondrial marcado en las células de
pacientes de FM observado en nuestro estudio, el análisis de secuencias de ADN
mitocondrial en otros pacientes no mostró alteraciones importantes, tales como
mutaciones o deleciones que pudieran justificar los defectos mitocondriales. Por lo tanto,
es razonable postular que las alteraciones del ADN mitocondrial sólo pueden ser
detectados en un subgrupo reducido de pacientes diagnosticados de FM.
122
Discusión
Las enfermedades mitocondriales presentan una prevalencia reducida (5,7 por 100.000
en la población mayor de 14 años de edad) (Arpa et al., 2003), y los síntomas pueden ser
confundidos y frecuentemente etiquetados con otras enfermedades como la FM o
síndrome fatiga crónica (van de Glind et al., 2007). En este sentido, Villanova y
colaboradores reportaron en 1999 el caso de una mujer de 45 años de edad con FM y una
deleción en el ADNmt de alrededor de 4 kb y proponen la presencia de pacientes con
enfermedades mitocondriales entre los pacientes diagnosticados con FM (Villanova et al.,
1999). En este sentido, nuestros datos confirman este informe anterior en un nuevo caso
de la familia que presentamos. En nuestros pacientes podría ser interesante estudiar una
biopsia muscular, sin embargo, los pacientes no aceptaron esta intervención por ser muy
invasiva. A pesar de esto, mientras que el músculo esquelético es el tejido más utilizado
para estudios de enfermedades mitocondriales, también tiene limitaciones. Muchos
pacientes han sido reportados con defectos enzimáticos detectables en diferentes tejidos,
pero actividades enzimáticos normales en músculo esquelético (Bagis et al., 2005).
Acerca de esto, cualquiera que sea el órgano afectado, se recomienda realizar una biopsia
de la piel para obtener cultivos de fibroblastos para el estudio de las enfermedades
mitocondriales bajo sospecha según la recomendación del Comité Diagnóstico de la
Sociedad de Medicina mitocondrial (Haas et al., 2008).
En este estudio, también proponemos la implicación del complejo inflamasoma, sensor
para el estrés metabólico, en la fisiopatología de las enfermedades mitocondriales. La
inhibición del complejo I o III de la cadena respiratoria mitocondrial ha demostrado que
induce la producción de ROS y la activación del NLRP3-inflamasoma (Zhou et al., 2011).
Por otro lado, la inflamación se ha propuesto participar en los mecanismos
fisiopatológicos de las enfermedades mitocondriales (Vattemi et al., 2013). Además,
eventos inflamatorios se han observado en pacientes con una mutación 3251A> G
123
apoyando la hipótesis de que las enfermedades mitocondriales inducen una respuesta
inflamatoria patológica (Mancuso et al., 2013). En este sentido, hemos mostrado la
activación del NLRP3-inflamasoma en fibroblastos de tres enfermedades mitocondriales
conocidos con mutaciones en el Complejo I, gen tRNALeu mitocondrial (UUR) y gen
MT-TK así como en nuestra nueva mutación. Por lo tanto, NLRP3-inflamasoma podría
ser inducida por diferentes mutaciones mitocondriales en las que el estrés oxidativo esté
implicado (Haas et al., 2008; Hayashi y Cortopassi, 2015). Otro resultado interesante
mostrado en este estudio es el efecto de la inhibición NLRP3 en los fibroblastos del
paciente. Un crecimiento celular correcto es un importante marcador del estado
metabólico de la célula. Los fibroblastos derivados de pacientes con enfermedades
mitocondriales tienen un crecimiento relativamente reducido (Cotán et al., 2011), por lo
que el incremento del crecimiento celular de los fibroblastos de la paciente 3 indica una
posible mejoría en el metabolismo celular. Además, esta mejora demuestra que la
activación inflamasoma tiene un papel fisiopatológico en el fenotipo de los fibroblastos
de paciente 3. Como la inflamación se ha demostrado que induce la disfunción
mitocondrial (Cherry et al., 2015), una inhibición de varias citoquinas podría prevenir el
daño mitocondrial y la muerte celular. De acuerdo con esto, la inhibición del inflamasoma
podría ser una nueva diana farmacológica en enfermedades mitocondriales.
Tenemos que tener en cuenta, que la mutación encontrada 15804T> C es una rara variante
identificada en 20/29,867 secuencias en el GeneBank de Mitomap (www.mitomap, org).
Sin embargo, comparamos nuestra mutación con otras mutaciones que se han mostrado
causar un cambio patológico en el síndrome de Leigh como el reportado por Mkaouar-
Rebai et al., 2011 y este también es una variante identificada en 13/29 867 secuencias en
el GeneBank de Mitomap. Del mismo modo, otros cambios polimórficos se han
implicado en condiciones patológicas tales como m.15812G>A (211/29867) o
124
Discusión
m.14502T>C (118/29867) en neuropatía óptica hereditaria de Leber demostrando la
posibilidad de que estos cambios identificados como comunes desarrollen fisiopatología.
A este respecto, los estudios epidemiológicos han asociado haplogrupos mitocondriales
a las enfermedades mitocondriales. Por lo tanto, es muy difícil encontrar la etiología de
estas enfermedades debido a su faceta multifactorial en la que nos encontramos con la
combinación de factores genéticos y ambientales (Gómez-Durán et al., 2010). Todos
estos factores contribuyen individualmente sólo en una pequeña parte al desarrollo de la
enfermedad. Por lo tanto, las mutaciones definitorias de haplogrupos podrían comportarse
como factores de susceptibilidad, pero podrían tener también un pequeño efecto sobre la
fisiopatología. Debido a que los efectos de estos cambios serían altamente dependiente
del "contexto" en el que la variante genética está actuando, la activación de eventos
inflamatorios podría ayudar a explicar el contexto patológico inducido por unas
mutaciones definitorias de haplogrupos. A este respecto, un enfoque celular está
disponible para estudiar este contexto, el cual implica el uso de lo que se conoce como
"cíbridos transmitocondriales” (Gómez-Durán et al., 2010). En nuestro estudio, los
cíbridos mostraron los mismos eventos fisiopatológicos de fibroblastos y la activación
inflamasoma.
La implicación más importante de estos datos podría ser el papel potencial de la
activación del complejo inflamasoma y la posterior liberación de IL-1β en los diferentes
tejidos afectados en las enfermedades mitocondriales (cerebro, músculo, riñón, corazón,
ojo) (Benetti et al., 2013). Probablemente, un alto contenido de mitocondrias defectuosas
puede inducir la activación NLRP3-inflamasoma por el aumento de la producción de
ROS. En este sentido, la inhibición del inflamasoma puede representar una nueva opción
terapéutica interesante en enfermedades mitocondriales. Sin embargo, hay que tener en
cuenta que los ROS sirven como importantes inductores de la activación del inflamasoma,
125
por lo que el tratamiento con antioxidantes también podría ser eficaz en estas
enfermedades (Harijith et al., 2014). El actual enfoque farmacológico de las
enfermedades mitocondriales se basa en la eliminación de metabolitos tóxicos, utilizando
eliminadores de ROS y la administración de diferentes compuestos deficientes como
CoQ10. En consecuencia, el complejo inflamasoma que se activa por la producción de
ROS mitocondriales puede ser inhibida selectivamente por los antioxidantes del tipo
lipofílico. Curiosamente, hemos observado que el CoQ10 inhibe la activación de NLRP3-
inflamasoma en PBMC así como una significativa mejora de la respiración celular en los
fibroblastos y una mejora clínica y molecular en los pacientes de la familia tratada con
CoQ10. Además, el compuesto MitoQ, un derivado de CoQ10 dirigido a las mitocondrias,
también se ha observado inhibir al NLRP3-inflamasoma (Dashdorj et al., 2013). Como el
CoQ10 es un tratamiento común para las enfermedades mitocondriales (Montini et al.,
2008; Quinzii et al., 2010; Hargreaves, 2014), aquí mostramos otro posible mecanismo
por el cual el tratamiento CoQ10 puede ser eficaz en estos pacientes.
En resumen, en nuestro estudio proponemos la implicación de la disfunción mitocondrial
en un conjunto de pacientes, así como la implicación del complejo inflamasoma como
una consecuencia de tal disfunción mitocondrial. Además, una disfunción mitocondrial
puede ocurrir por numerosos factores entre los que destacan la aparición de mutaciones
en el ADNmt. En este caso, y dado el grado de similitud en cuanto a sintomatología y
patrón de herencia en muchos casos de fibromialgia con las miopatías mitocondriales, el
análisis de secuencias de ADNmt podría estar indicado en pacientes con FM con una clara
evidencia de herencia materna enmascarando enfermedades mitocondriales entre los
pacientes con FM que podrían beneficiarse de tener un diagnóstico genético por análisis
de secuencias del ADNmt y ser candidatos para el tratamiento con compuestos orientados
a la mitocondria. Por otra parte, la implicación del complejo inflamasoma como un sensor
126
Discusión
de estrés podría ser inductor del daño en los tejidos y agravar los síntomas en estas
enfermedades.
127
128
Conclusiones
CONCLUSIONES
129
130
Conclusiones
6. CONCLUSIONES
Nuestro estudio aporta las siguientes conclusiones en base a los resultados obtenidos en
nuestro proyecto:
1. Los fibroblastos de pacientes con FM presentan una disfunción mitocondrial con
un déficit en la cadena respiratoria mitocondrial, déficit de CoQ10 y altos niveles
de daño oxidativo.
2. Los pacientes con FM que presentan herencia materna así como síntomas tales
como intolerancia al ejercicio, miopatía, etc, son candidatos al diagnóstico
genético mitocondrial.
3. Las mutaciones en el ADNmt podrían encontrarse en pacientes con patologías
mitocondriales que mimetizan el fenotipo clínico de la FM.
4. Las mutaciones en el ADNmt podrían explicar el alto grado de herencia materna
descrito en algunos pacientes diagnosticados de FM.
5. La disfunción mitocondrial induce la activación del complejo inflamasoma en
pacientes con FM.
6. El complejo inflamasoma interviene en la fisiopatología de las enfermedades
mitocondriales mediadas por la disfunción mitocondrial.
7. La inhibición del inflamasoma podría ser una terapia prometedora para los
pacientes con enfermedades mitocondriales.
8. El tratamiento con CoQ10 induce una mejora de la disfunción mitocondrial y de la
activación del complejo inflamasoma reduciendo las manifestaciones patológicas
de la enfermedad.
131
132
Bibliografía
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ANTIOXIDANTS & REDOX SIGNALING
Volume 20, Number 8, 2014
ª Mary Ann Liebert, Inc.
DOI: 10.1089/ars.2013.5198
ORIGINAL RESEARCH COMMUNICATION
NLRP3 Inflammasome Is Activated in Fibromyalgia:

The Effect of Coenzyme Q10
Mario D. Cordero,1,* Elı́sabet Alcocer-Gómez,1,* Ognjen Culic,2 Angel M. Carrión,3

Manuel de Miguel,1 Eduardo Dı́az-Parrado,1 Eva M. Pérez-Villegas,3 Pedro Bullón,4 Maurizio Battino,5
and José Antonio Sánchez-Alcazar 6
Abstract
Aims: Fibromyalgia (FM) is a prevalent chronic pain syndrome characterized by generalized hyperalgesia as-
sociated with a wide spectrum of symptoms such as fatigue and joint stiffness. Diagnosis of FM is difficult due to
the lack of reliable diagnostic biomarkers, while treatment is largely inadequate. We have investigated the role of
coenzyme Q10 (CoQ10) deficiency and mitochondrial dysfunction in inflammasome activation in blood cells from
FM patients, and in vitro and in vivo CoQ10 deficiency models. Results: Mitochondrial dysfunction was ac-
companied by increased protein expression of interleukin (IL)-1b, NLRP3 (NOD-like receptor family, pyrin
domain containing 3) and caspase-1 activation, and an increase of serum levels of proinflammatory cytokines
(IL-1b and IL-18). CoQ10 deficiency induced by p-aminobenzoate treatment in blood mononuclear cells and mice
showed NLRP3 inflammasome activation with marked algesia. A placebo-controlled trial of CoQ10 in FM
patients has shown a reduced NLRP3 inflammasome activation and IL-1b and IL-18 serum levels. Innovation:
These results show an important role for the NLRP3 inflammasome in the pathogenesis of FM, and the capacity
of CoQ10 in the control of inflammasome. Conclusion: These findings provide new insights into the patho-
genesis of FM and suggest that NLRP3 inflammasome inhibition represents a new therapeutic intervention for
the disease. Antioxid. Redox Signal. 20, 1169–1180.
Introduction
Innovation
F ibromyalgia (FM) is a common chronic pain syndrome

accompanied by other symptoms such as fatigue and joint
stiffness, which pathophysiological mechanisms are difficult
In recent years, inflammasome has attracted increasing
interest among basic and clinical researchers. Its implica-
tion in the pathophysiology of several diseases generates
to identify. Despite being a common disorder that affects new therapeutic strategies. Our study reveals that the in-
at least 5 million individuals in the United States (11), routine flammasome complex is implicated in the pathophysi-
laboratory investigations usually yield normal results ology of fibromyalgia (FM) mediated by coenzyme Q10
(Table 2), and the diagnosis is not easy and may be frequently (CoQ10) deficiency. The oral CoQ10 treatment reduced in-
overlooked. Therefore, new diagnostic markers in FM are flammasome activation. These findings provide new in-
needed. Several pathological changes have been well docu- sights into the pathogenesis of FM and indicate new
mented in FM patients. For example, recent studies have potential molecular targets for the therapy of this disease.
implicated oxidative stress in the pathogenesis of FM (1, 2, 7,
1
Dpto. Citologı́a e Histologı́a Normal y Patológica, Facultad de Medicina, Universidad de Sevilla, Sevilla, Spain.
2
Faculty of Pharmacy and Biochemistry, University of Zagreb, Zagreb, Croatia.
3
División de Neurociencias, Universidad Pablo de Olavide de Sevilla, Sevilla, Spain.
4
Dept. de Periodontologı́a, Facultad de Odontologı́a, Universidad de Sevilla, Sevilla, Spain.
5
Dipartimento di Scienze Cliniche Specialistiche ed Odontostomatologiche–Sez. Biochimica, Università Politecnica delle Marche, Ancona,
Italy.
6
Centro Andaluz de Biologı́a del Desarrollo (CABD), Universidad Pablo de Olavide-CSIC-Junta de Andalucı́a and Centro de Investigación
Biomédica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER), ISCIII, Sevilla, Spain.
*These authors contributed equally to this work.
1169
1170 CORDERO ET AL.
9, 18), indicating that mitochondrial dysfunction may be as- Inflammasome activation by oxidative
sociated with this syndrome. Furthermore, there are some stress involved in pain of FM
hypotheses suggesting that cytokines may play a role in FM
The postinflammatory induction of mitochondrial bio-
(4, 22, 24). Indeed, a decrease in mitochondrial mass and co-
genesis supports metabolic function and cell viability while
enzyme Q10 (CoQ10) levels, as well as increased production of
helping to control inflammation (19). Because mitochon-
mitochondrial reactive oxygen species (ROS), have been de-
drial biogenesis genes were downregulated in BMCs from
tected in blood mononuclear cells (BMCs) from FM patients
FM patients, we analyzed the activation of inflammasome-
(7, 9). On the other hand, ROS have also been shown to be an
related proteins. We found increased NLRP3 and caspase-1
important activator of inflammasome-mediated inflamma-
gene expression, increased NLRP3 protein expression lev-
tion (31). The NLRP3 (NOD-like receptor family, pyrin do-
els, and caspase-1 cleavage suggesting inflammosome ac-
main containing 3) inflammasome is a molecular platform
tivation (Fig. 3A, B). We have not found activation of
activated upon signs of cellular danger to trigger innate im-
caspase 3, so caspase-1 activation was not secondary to
mune defenses through the maturation of proinflammatory
activation of cell death pathways in their cell populations.
cytokines such as interleukin (IL)-1b and IL-18 (30). To in-
BMCs treated with lipopolysaccharide (LPS) from Escher-
vestigate a possible implication of mitochondria dysfunction
ichia coli were used as a positive control of caspase-1
in inflammasome activation in FM, we studied both patho-
cleavage. Interestingly, it has been described that oxidized
logical mechanisms in BMCs from FM patients and in two
mitochondrial DNA (mtDNA) is a potent activator of the
models, in vitro and in vivo, of CoQ10 deficiency (20, 21).
NLRP3 inflammasome (25). Furthermore, other proteins
involved in inflammasome and inflammation activation, as
Results IL-1b and IL-18, were increased in serum from FM patients
(Fig. 3D, E). BMCs isolated and cultured from FM patients
Mitochondrial characteristic in BMCs from FM patients
shown increased levels of the IL-1b protein showing that
BMCs from FM patients showed a significant down- these cells are actively producing the cytokines, and inter-
regulation of several genes related to mitochondrial biogen- estingly, BMCs cultured with CoQ10 30 lM showed after
esis (PGC-1a, TFAM, NRF1) (Fig. 1A). In parallel, BMCs 24 h an important reduction of IL-1b and caspase 1 protein
showed a reduction of mitochondrial complex protein ex- levels (Fig. 3F). IL-1b serum levels in FM patients showed a
pression levels (complex I, complex III, and cytochrome c) significant negative correlation ( p < 0.05) with CoQ10 levels
(Fig. 1B, C) accompanied by reduced activities of the mito- and a significant positive correlation ( p < 0.001) with mito-
chondrial chain complex between 50%–60% patients com- chondrial ROS levels (Fig. 4A, B). The incubation of BMCs
pared with control (Fig. 2). CoQ10 is a key component of the isolated from patients with CoQ10 induced a reduction of
mitochondrial respiratory chain transferring reducing equiv- the IL-1b protein. Furthermore, IL-1b serum levels showed
alents from complexes I and II to complex III, and deficiencies a high positive correlation with pain scale scores of FM
of this electron and proton carrier are associated with mito- patients (Fig. 5A). These data suggest that high IL1-b and
chondrial dysfunction in a variety of human disorders (3). IL-18 levels may have a role in the pathophysiology of FM.
According to this, CoQ10 levels were reduced to 46% of Interestingly, IL1-b and IL-18 have been described to be
the average control value in BMCs from FM patients (Fig. involved in the increased sensibility of the sensory recep-
1D). Moreover, to determine the effect of mitochondrial tors, which means they directly cause or at least modulate
dysfunction on cellular bioenergetics, we measured intracel- pain (12, 28).
lular ATP levels in BMCs from control and FM patients.
ATP levels were reduced to 76% respect to controls ( p < 0.001) CoQ10 deficiency induce inflammasome
(Fig. 1E). activation in FM
To verify the role of CoQ10 in the inflammatory process in
Oxidative stress in BMCs from FM patients
FM, we induced CoQ10 deficiency in BMCs from five healthy
It is well established that mitochondrial dysfunction is as- controls by inhibiting endogenous CoQ10 biosynthesis with
sociated with induction of ROS production in mitochondria. 1 mM p-aminobenzoate (PABA) for 24 h. CoQ10 deficiency
Furthermore, oxidative stress has been proposed as a relevant was also induced in mice by the subchronic treatment with
event in the pathogenesis of FM showing a significant positive PABA (twice daily doses of 20 mg/kg/day). The inhibition of
correlation with clinical symptoms (5). To assess oxidative CoQ10 (Fig. 6A) in BMCs had a remarkable effect on cellular
stress in FM, we determined mitochondrial ROS production bioenergetics, inducing a decrease of 57% of intracellular ATP
in BMCs from control and FM patients by using MitoSOX, a levels, which were restored after 10 lM CoQ10 treatment (Fig.
mitochondrial superoxide indicator. Mitochondrial superox- 6B). CoQ10 deficiency in BMCs also induced increased DNA
ide production was significantly increased in BMCs from FM oxidation (OGG1) and inflammasome activation demon-
patients respect to controls ( p < 0.001) (Fig. 1F). Additionally, strated by increased expression levels of NLRP3 and caspase-
as an oxidative stress marker, we determined the expression 1 cleavage (Fig. 6C, D), associated with a significant increase
levels of 8-oxoguanine glycosylase (OGG1), a DNA glycosy- of IL-1b and IL-18 levels in the culture medium (Fig. 6E, F).
lase enzyme responsible for the excision of 7,8-dihydro-8-ox- Interestingly, 10 lM of CoQ10 supplementation induced a
oguanine (8-oxoG), a mutagenic base byproduct that occurs as significant reduction in DNA oxidation, inflammosome acti-
a result of exposure of DNA to ROS, and 8-oxoG levels in vation, and IL-1b and IL-18 levels in the culture medium of
BMCs from patients. On average, FM patients significantly CoQ10-deficient BMCs (Fig. 3C–F).
showed higher levels of OGG1 and 8-oxoG in BMCs from FM In mice, when compared with vehicle-treated controls,
patients (Fig. 1B, G). PABA treatment reduced CoQ9 and CoQ10 levels in BMCs by
NLRP3 INFLAMMASOME ACTIVATION IN FIBROMYALGIA 1171
FIG. 1. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in fibromyalgia blood mononuclear cells (BMCs). n = 20 and 30
for control and fibromyalgia groups, respectively. (A) Relative expression of mitocondrial biogenesis genes (mean – SE)
determined by quantitative PCR in BMCs from fibromyalgia (FM) patients. (B) Protein expression levels of mitochondrial
complex I (39 kDa Subunit), complex III (Core I Subunit), cytochrome c, and 8-oxoguanine glycosylase (OGG-1, a DNA
glycosylase enzyme responsible for the excision of 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG). (C) Protein levels were determined by
densitometric analysis (IOD, integrated optical intensity) of three different western blots and normalized to the GADPH
signal, using BMCs from four representative FM patients, compared with a pool of five healthy age- and sex-matched control
subjects. (D) Coenzyme Q10 (CoQ10) levels in control and FM cells were determined by hexane extraction and high-per-
formance liquid chromatography (HPLC) separation as described in Material and Methods section. (E) ATP levels in control
and FM BMCs were analyzed by bioluminescence as described in Material and Methods section. (F, G) Mitochondrial
reactive oxygen species (ROS) production and 8-oxoG were analyzed in BMCs from control and FM patients by flow
cytometry and EIA kit as described in Material and Methods section. Data represent the mean – SD of three separate
experiments. *p < 0.001, **p < 0.01 between control and FM patients.
30% and 49%, respectively, p < 0.001 (Fig. 7A). This effect was the hot plate test when thermal stimuli were up of 45C (hot
accompanied by increased expression levels of NLRP3, in- plate test: for 50C, latencies were 12.06 – 1.64 and 6.67 – 0.61 s
duction of caspase-1 cleavage in BMCs (Fig. 7B), and in- for vehicle- and PABA-injected mice, respectively [p = 0.013];
creased IL-1b and IL-18 levels in serum (Fig. 7C, D). Single for 52.5C, latencies were 5.2 – 0.88 and 3.03 – 0.23 s for vehi-
injections of PABA in mice did not evoke any differential ef- cle- and PABA-injected mice, respectively [p = 0.041]), and for
fect between vehicle- and drug-injected mice regarding ther- tail flick (latencies were 5.95 – 0.13 and 3.64 – 0.26 s for vehicle-
mal pain (data not shown). However, PABA administration and PABA-injected mice, respectively [p < 0.001]) (Fig. 7E).
during five consecutive days produced a marked algesia in Interestingly, IL-1b serum levels showed high positive
1172 CORDERO ET AL.
FIG. 2. Mitochondrial complexes

enzymatic activities in fibromyalgia
BMCs. n = 20 and 30 for control and
fibromyalgia groups, respectively.
Mitochondrial enzymatic activities
were determined as described in
Material and Methods section. Re-
sults (mean – SD) are expressed in
U/CS (units per citrate synthase).
Data represent the mean – SD of
three separate experiments.
*p < 0.001, **p < 0.01 between control
and FM patients.
correlations with pain scale scores in mice (Fig. 5B), similar to compensatory activation of mitochondrial biogenesis genes
those observed in FM patients. Routine serum biochemical was impaired in BMCs from FM patients. In response to mi-
parameters were not affected by the subchronic administra- tochondrial dysfunction and inflammation, cells remove
tion of PABA in mice (data not shown). damaged mitochondria by autophagy and, as a compensatory
mechanism, induce mitochondrial biogenesis and upregulate
Oral CoQ10 supplementation in FM patients reduces antioxidant and counter-inflammatory defense genes (19).
inflammasome activation Mitophagy in FM patients has been reported (9). However, it
has been described that compensatory mechanisms are im-
A key obstacle to the successful treatment of FM is the
paired in BMCs from FM patients that leads to reduced mi-
limited effectiveness of the currently available pharmacolog-
tochondrial mass, reduced antioxidants levels (1, 2, 18), and
ical therapies. About half of all treated patients experienced
an inflammatory damage predisposition. Inflammation has
only a mild reduction in their symptoms, indicating that
been shown to be associated with FM symptoms by high
many FM patients are in need of alternative therapies (26). In
positive correlations between IL-1b and IL-18 serum levels
several cases, CoQ10 has shown to be effective in the treatment
and pain scores suggesting an inflammatory component in
of FM (6). Identification of pathophysiological mechanisms
the induction of pain. Despite this, there are discrepancies
targeted by CoQ10 treatment in FM is a key research goal. In
regarding the pathological role of IL-1b serum levels in FM (4,
this respect, we conducted a placebo-controlled, double-
22, 24, 29). Feng and coworkers have shown the implication of
blinded trial with 20 patients, to evaluate the effect of CoQ10 in
MEFV, which encodes pyrin, a major regulator of the in-
inflammasome gene expression and inflammasome serum
flammasome platform controlling caspase-1 activation and
markers of FM patients. After CoQ10 supplementation,
IL- 1b (10); so, this preliminary data from Feng et al., are
NLRP3 and IL-1b gene were downregulated. CoQ10 levels
according to our results. Respect to inflammatory cytokine
from BMCs were restored after CoQ10 treatment (data not
involvement in FM pathogenesis, we have recently demon-
shown). According to this, IL-1b and IL-18 serum levels were
strated a mitochondrial dysfunction-dependent increase of
significantly reduced respect to placebo. (Fig. 8A–E).
tumor necrosis factor (TNF)-alpha serum levels in FM pa-
tients, which was reduced by CoQ10 treatment (8).
Discussion
According to our results, the negative correlation between
Inhibition of complex I or III of the mitochondrial respira- IL-1b and IL-18 levels and CoQ10 levels and positive correla-
tory chain has been shown to induce ROS production and tion with mitochondrial ROS levels and pain scale scores
NLRP3 inflammasome activation (31). In BMCs from FM supports the hypothesis that inflammation in FM is depen-
patients, we detected mitochondrial respiratory chain dys- dent on mitochondrial dysfunction. To our knowledge, this is
function, CoQ10 deficiency, and increased mitochondrial ROS the first report describing inflammasome activation and its
production and OGG-1 expression levels (a marker of oxi- association with increased levels of proinflammatory cyto-
dized DNA), both activators of inflammasome and inflam- kines in FM patients. Furthermore, this study has nominated
mation (14, 31). Inflammasome has emerged recently as an several new parameters that could be used as diagnostic
unexpected sensor for metabolic danger and stress. Indeed, it biomarkers in FM. Their further validation (alone or in com-
has been implicated in the development of major diseases bination) could help in creating objective diagnostic testing in
such as gout, type 2 diabetes, and obesity-induced insulin FM. However, despite our results about inflammasome in
resistance. Moreover, the NLRP3 inflammasome is increas- FM, we think that inflammasome contributes in the patho-
ingly suspected of playing a major role in other human pa- physiology of this disease accompanied by other inflamma-
thologies such as cancer, asbestosis, and Alzheimer’s disease some nondependent inflammatory events, such as IL-6, IL-8,
(15). FM patients have shown increased activation of in- or TNF-alpha (4, 22, 24). These inflammatory parameters have
flammasome in BMCs and increased serum levels of proin- been associated through NF-kappaB. Immunohistochemical
flammatory cytokines, such as IL-1b and IL-18. Interestingly, studies in FM tissues revealed a stronger expression of
FIG. 3. Inflammasome activation in BMCs and proinflammatory cytokines in serum from FM patients. (A) NLRP3
protein levels, caspase 1 cleavage, and caspase 3 cleavage were analyzed by western blotting. We include a positive control of
caspase 1 and 3 activation using lipopolysaccharides. Protein levels were determined by densitometric analysis (IOD, inte-
grated optical intensity) of three different western blots and normalized to the GADPH signal, using BMCs from four
representative FM patients, compared with a pool of five healthy age- and sex-matched control subjects. (B, C) NLRP3 and
caspase 1 cleavage transcript expression levels were determined by real-time quantitative RT-PCR. n = 20 for control
and n = 30 for FM groups, respectively. Data represent the mean – SD of three separate experiments.*p < 0.05 between control
and FM patients. (D, E) IL-1b and IL-18 levels in serum from control and FM patients were determined by ELISA as described
in Material and Methods section. n = 20 for control and n = 30 for FM groups, respectively. (F) IL-1b protein levels in several
patients and IL-1b and caspase 1 activation in patients before and after CoQ10 treatment in BMCs isolated from FM patients
and cultured. Data represent the mean – SD of three separate experiments. *p < 0.001 between control and FM patients.
NF-kappaB in muscle, and IL-6, IL-8, and TNF-alpha are cytokines. Since pathological processes can be reversed by
NF-kappaB-dependent proinflammatory cytokines (8). CoQ10 supplementation, we propose that CoQ10 could be a
In summary, we have shown (in vitro and in vivo) the in- suitable therapy for FM patients. Larger controlled clinical tri-
volvement of CoQ10 deficiency in the pathological process of als are needed to provide data on the effectiveness of CoQ10
inflammasome activation and release of proinflammatory in FM.
1174 CORDERO ET AL.
FIG. 5. Association of IL-1b serum levels and pain scores

in FM patients (A) and the mouse model of CoQ10 defi-
ciency (B). n = 30 for fibromyalgia groups and n = 5 for mice.
FIG. 4. Correlation of CoQ10 (A), and mitochondrial ROS The strength of the association was established by calculating
levels (B) in BMCs from FM patients and IL-1b levels. correlation coefficients.
n = 30 for fibromyalgia groups. The correlation was estab-
lished by calculating correlation coefficients.
cal conditions that required glucocorticoid treatment,
analgesics, or antidepressant drugs; past or current substance
Materials and Methods
abuse or dependence; pregnancy or current breastfeeding.
Ethical statements Twenty healthy volunteers (5 males, 15 females) were in-
cluded in the study and matched with the recruited female
Written informed consent and the approval of the ethics
FM patients for age range, gender, ethnicity, and demo-
committee of the University of Seville were obtained, ac-
graphic features (completion of at least 9 years of education
cording to the principles of the Declaration of Helsinki. The
and member of the middle socioeconomic class). Healthy
study was conducted in compliance with the International
controls had no signs or symptoms of FM and had not taken
Conference on Harmonization Good Clinical Practice (ICH-
any medication for at least 3 weeks before commencing the
GCP) guidelines and registered controlled-trials.com
study. None of the patients or controls had taken any drug or
(ISRCTN 21164124).
vitamin/nutritional supplements during the 3 weeks before
Pain studies in mice were performed in accordance with the
blood sample collection. All patients and controls followed a
European Union guidelines (86/609/EU) and Spanish regu-
standard balanced diet (carbohydrate 50%–60%, protein 10%–
lations for the use of laboratory animals in chronic experi-
20%, and fat 20%–30%) for 3 weeks before blood collection, as
ments (BOE 67/8509-12, 1988). All experiments were
established by a diet program. Clinical data were obtained by
approved by the local institutional animal care committee.
physical examination and the subjects were evaluated using
the fibromyalgia impact questionnaire (FIQ) and the visual
Patients
analogues scale (VAS). Tender points were identified by
Briefly, 30 patients from the register of the Andalusian digital pressure at the 18 locations recommended by ACR,
Federation of Fibromyalgia (ALBA ANDALUCÍA) and 20 which included a minimum of 11 out of 18. Heparinized and
healthy matched controls were enrolled on the study, having coagulated blood samples were collected from patients and
previously obtained informed consent and the approval of the controls after 12 h of fasting, centrifuged at 3800 g for 5 min,
local ethics committee. The inclusion criterion was FM, based and the plasma and serum was stored at - 80C until testing.
on current American College of Rheumatology (ACR) diag- Serum biochemical parameters were assayed by routine an-
nostic criteria (29), and diagnosed 2 to 3 years ago. The clinical alytical methods. Routine laboratory tests yielded normal
characteristics of each group are shown in Table 1. Exclusion results for glucose, uric acid, creatine kinase, aspartate ami-
criteria were acute infectious disease within the previous 3 notransferase, alanine aminotransferase, cholesterol, and tri-
weeks; past or present neurological, psychiatric, metabolic, glycerides (Table 2)
autoimmune, allergy-related, dermal, or chronic inflamma- To evaluate the therapeutic role of CoQ10 in inflamma-
tory disease; undesired habits (e.g., smoking, alcohol); medi- some activation in FM, we conducted a placebo-controlled,
FIG. 6. CoQ10 deficiency induction activates inflammasome complex in BMCs. (A, B) CoQ10 deficiency and decreased
ATP levels induced by 1 mM p-aminobenzoate (PABA) treatment for 24 h in BMCs from five healthy volunteers. (C) Protein
expression levels of OGG-1 and NLRP3 and induction of caspase 1 cleavage analyzed by western blotting in a homogenate
cell pool of BMCs from five controls. (D) Protein expression levels were determined by densitometric analysis (IOD, inte-
grated optical intensity) of three different western blots and normalized to the GADPH signal. (E, F) IL-1b and IL-18 levels in
the culture media of BMCs incubated with PABA for 24 h and analyzed by ELISA as described in Material and Methods
section. Data represent the mean – SD of three separate experiments. *p < 0.001 between control and PABA, and between
PABA and CoQ10.
double-blinded trial with 20 patients, to evaluate the effect of national Conference on Harmonisation Good Clinical Prac-
CoQ10 in inflammasome gene expressions of FM patients tice Guidelines.
and inflammasome serum markers. The study protocol was
registered (ISRCTN 21164124) and reviewed and approved
Intervention
by the Ethics Committee of the University of Sevilla. All
study participants provided written informed consent be- Subjects who met the enrolment criteria were randomized in
fore initiation of the study. This study was conducted in a double-blind fashion, according to a 1:1 ratio, to one of the
compliance with the Declaration of Helsinki, and all Inter- two treatment groups (CoQ10 or placebo). All subjects receiving
1176 CORDERO ET AL.
FIG. 7. Inflammasome activation induced by CoQ10 deficiency induction in mice. (A). CoQ levels were measured in
BMCs isolated from mice treated with vehicle or PABA for 15 days (n = 5 per group). *p < 0.05; between vehicle and PABA-
treated mice. (B) NLRP3 protein expression levels and caspase 1 cleavage were analyzed by western blotting. Protein levels
were determined by densitometric analysis (IOD, integrated optical intensity) of three different western blots and nor-
malized to GADPH signal, using BMCs isolated from mice treated with the vehicle or PABA. (C, D) IL-1b and IL-18 in
serum levels from mice treated with the vehicle or PABA-treated were determined by ELISA as described in Material and
Methods section. *p < 0.001 between vehicle and PABA-treated mice. (E) Pain sensitivity in vehicle- and PABA-treated mice
was evaluated in the hot plate test (1) at 45C–52.5C – 0.5C and with the tail flick test (2) at 45C – 0.5C. *p < 0.05;
a
p < 0.001.
CoQ10 (purchased from Pharma Nord) were given, in soft gel A positive control of activated caspase 1 was induced in
capsules for 40 days (300 mg/day CoQ10 divided into three BMC control by LPS 1 lg/ml LPS for 2 h.
doses), and all subjects receiving placebo were given a match- Partial CoQ10 deficiency was induced by inhibiting en-
ing placebo. The duration of the treatment and dose of CoQ10 dogenous biosynthesis in control BMCs by treatment with
were selected accordingly to the preliminary studies (6, 8). PABA (Sigma), a competitive inhibitor of polyprenyl-4-
hydroxybenzoate transferase (27). To achieve this, cells were
cultured for 24 h in the presence of 1 mM PABA and
Isolation of BMCs
PABA + 10 lM CoQ10.
Peripheral BMCs (lymphocytes and monocytes) from all
patients were purified from heparinized blood by isopycnic IL-1b and IL-18 levels
centrifugation using Histopaque-1119 and Histopaque-1077
IL-1b (GenWay) and IL-18 (Biosensis) levels in serum or
(Sigma Chemical Co.). BMCs were cultured at 37C in a 5%
culture media were assayed in duplicates by commercial
CO2 atmosphere in the RPMI-1640 medium supplemented
ELISA kits.
with L-glutamine, an antibiotic/antimycotic solution (Sigma
Chemical Co.), and 10% fetal bovine serum. The number and
Mitochondrial enzyme activities
subgroup distribution of BMCs (monocytes and lymphocytes)
in FM patients were in the normal range (data not shown). We Activities of NADH:coenzyme Q1 oxidoreductase (com-
use in all experiments, BMCs from all patients except in plex I), succinate deshydrogenase (complex II), cytochrome c
western blot where we use BMCs from several representative oxidase (complex IV), ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase
patients. In several experiments, BMCs from FM patients (complex III), succinate:cytochrome c reductase (complex
were cultured with CoQ10 30 lM during 24 h. II + complex III), and citrate synthase (CS) were determined in
FIG. 8. NLRP3 and IL-1b gene

expression and IL-1b and IL-18
levels in FM patients pre- and
post-treatment with oral CoQ10
versus placebo. (A) Relative gene
expressions of NLRP3 and IL-1b
(mean – SE) determined by quanti-
tative PCR in BMCs from FM pa-
tients. (B) Serum IL-1b and IL-18
levels in FM patients were mea-
sured as described in Material and
Methods section. Data represent the
mean – SD of three separate experi-
ments. *p < 0.01 between FM pa-
tients after and before oral
treatment.
homogenate extracts using previously described spectro- Oxidative stress

photometric methods (23). Results are expressed as Units/CS
Mitochondrial ROS generation in BMCs was assessed by
(mean – SD). Proteins of homogenates were analyzed by the
MitoSOX red, a red mitochondrial superoxide indicator. Mi-
Lowry procedure (13).
toSOX Red is a novel fluorogenic dye recently developed and
validated for highly selective detection of superoxide in the
ATP levels mitochondria of live cells (17). The MitoSOX Red reagent is live-
cell permeant and is rapidly and selectively targeted to the mi-
ATP levels were determined by a bioluminescence assay
tochondria. Once in the mitochondria, the MitoSOX Red reagent
using an ATP determination kit from Invitrogen-Molecular
is oxidized by superoxide and exhibits red fluorescence.
Probes according to the instructions of the manufacturer.
DNA repair enzyme 8-oxoguanine DNA glycolase-1
(OGG-1; Novus Biologicals, Inc.) levels were analyzed by
western blotting.
Table 1. Anthropometric and Symptomatic The 8-oxoG levels in BMCs from patients were determined
Parameters in Healthy Volunteers
using a commercial EIA kit from Cayman Chemical.
and Fibromyalgia Patients
Parameter Controls FM Patients Immunoblotting
Age (years) 45.5 – 6.1 46.1 – 8 Western blotting was performed using standard methods.
Tender points — 14.5 – 1.8 After protein transfer, the membrane was incubated with
Disease duration (years) — 8.1 – 3.3
Sex (male/female) 5y15 5y25 Table 2. Serum Biochemical Parameters
BMI (kg/m2) 23.2 – 2.5 22.9 – 1.2 in Fibromyalgia Patients
FIQ total score, range 0–80 2.7 – 1.5 56.6 – 8.3a
Pain 0.6 – 0.2 6.9 – 2.1b Biochemical parameter Control FM patients
Fatigue 1.2 – 0.5 7.1 – 1.2a
Morning tiredness 1 – 0.3 5.5 – 1b Glucose (mg/dL) 93.8 – 15.2 98.1 – 12.2
Stiffness 0.4 – 0.1 6.2 – 2.2b Uric acid (mg/dL) 3.9 – 1.5 3.1 – 1.6
Anxiety 1 – 0.5 5.8 – 1.2b Aspartate aminotransferase 21.9 – 8.8 25.2 – 7.3
Depression 0.2 – 0.6 5.6 – 1.2a (mU/ml)
VAS pain total score 0–10 0.7 – 0.2 7.5 – 2.1a Alanine aminotransferase 23.5 – 5.1 24.6 – 6.1
(mU/ml)
n = 20 and 30 for control and fibromyalgia groups, respectively. Creatine kinase (IU/L) 671.1 – 42.3 623.5 – 34.4
a
p < 0.001. Cholesterol (mg/dl) 179.9 – 53.4 176.9 – 59.1
b
p < 0.01. Triglycerides (mg/dl) 157.5 – 60.1 144.9 – 52.3
BMI, body mass index; FIQ, fibromyalgia impact questionnaire;
VAS, visual analogical scale. n = 20 for controls and n = 30 for FM patients, respectively.
1178 CORDERO ET AL.
various primary antibodies diluted 1:1000, and then with the 48C – 0.5C and the latency of the tail reflex measured, with a
corresponding secondary antibody coupled to horseradish cutoff for responses of 15 s.
peroxidase at a 1:10000 dilution. Specific protein complexes
were identified using the Immun Star HRP substrate kit Serum markers
(Biorad Laboratories, Inc.).
Biochemical parameters were determined in serum (glu-
Quantification of CoQ levels cose, triglyceride, cholesterol, uric acid, aspartate amino-
transferase, alanine aminotransferase, and creatine kinase)
The CoQ content in BMCs was analyzed by high- using commercial kits from Randox Laboratories.
performance liquid chromatography (HPLC) (Beckmann
166–126 HPLC) with ultraviolet detection (275 nm), as de- Lipid peroxidation
scribed previously (15).
Lipid peroxidation in cells was determined by analyzing
Reagents the accumulation of lipoperoxides using a commercial kit
from Cayman Chemical. TBARS are expressed in terms of
PABA and LPS were purchased from Sigma Chemical Co. malondialdehyde (MDA) levels. In these assays, an MDA
Monoclonal antibodies specific for oxidative phosphoryla- standard is used to construct a standard curve against which
tion, complex I (39 kDa subunit), and complex III (core 1 unknown samples can be plotted.
subunit) were purchased from Invitrogen/Molecular Probes.
The anti-GAPDH monoclonal antibody from Calbiochem-
Merck Chemicals Ltd. The anti-NLRP3 antibody from Real-time quantitative PCR
Adipogen. Anti-active caspase-1 was obtained from Cell The expression of NLRP3 and caspase 1 gene was analyzed
Signaling Technology. A cocktail of protease inhibitors by SYBR Green quantitative PCR using mRNA extracts of
(complete cocktail) was purchased from Boehringer Man- BMCs from patients and controls. The thermal cycling condi-
nheim. The Immun Star HRP substrate kit was from Bio-Rad tions used were denaturation at 95C for 20 s, alignment at 54C
Laboratories, Inc. for 20 s, and elongation at 72C for 20 s, for 40 cycles. NLRP3
primers were 5¢- GGAGAGACCTTTATGAGAAAGCAA -3¢
Animals and drug administration (forward) and 5¢- GCTGTCTTCCTGGCATATCACA -3¢ (re-
verse), caspase 1 were 5¢- CCGAAGGTGATCATCATCCA -3¢
Eight-week-old male Swiss mice weighing 25–30 g were
(forward) and 5¢- ATAGCATCATCCTCAAACTCTTCTG -3¢
maintained on a 12-h light/12-h dark cycle. Behavioral stud-
(reverse), and IL-1b were 5¢- TTACAGTGGCAATGAGGA
ies were performed in accordance with the European Union
TGAC -3¢ (forward) and 5¢- GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT-
guidelines (86/609/EU) and Spanish regulations for the use
3¢ (reverse). We used a second pair of beta-actin primers as an
of laboratory animals in chronic experiments (BOE 67/8509-
internal control: forward, 5¢- CCA GAT CAT GTT TGA GAC
12, 1988). All experiments were approved by the local
C-3¢ and reverse, 5¢- ATG TCA CGC ACG ATT TCC C-3¢. All
institutional animal care committee. PABA, a competitive in-
reactions were performed in duplicate. Reaction mixtures,
hibitor of polyprenyl-4-hydroxybenzoate transferase (Coq2p),
without RNA, were used as negative controls in each run.
an essential enzyme in CoQ10 biosynthesis mediating the
conjugation of 4-hydroxybenzoate with the completed poly-
prenyl side chain (26), was dissolved in saline (vehicle) and Statistical analysis
intraperitoneally administered at a dose of 20 mg/Kg/day for Statistical analyses were performed using the SPSS package
15 days. Behavioral tests were performed 5 days after the first for Windows (SPSS). Unless otherwise indicated, data repre-
drug administration. After testing, mice were anesthetized sent the mean – SEM. The unpaired Student’s t test was used
with CO2 and sacrificed by decapitation. Blood samples were to evaluate the significance of differences between groups,
collected for immediate biochemical analysis and BMCs were accepting p < 0.05 as the level of significance. Statistical ana-
isolated. Serum samples were frozen at - 80C for further lyses included Pearson’s correlations between IL-1b and IL-18
analyses. respect to VAS, CoQ10, and mitochondrial ROS. Two-way
analysis of variance was used to compare the behavioral re-
Behavioral assays sults from animals treated with vehicle alone or with PABA.
Behavioral analyses were performed in a testing room with Chi-squared tests were used for statistical analysis in cases in
homogeneous noise and light levels. The testing apparatus which qualitative variables were compared.
was cleaned with 70% ethanol (Panreac Quı́mica S.A.U) be-
tween trials to eliminate any influence of animal odor on the Acknowledgments
exploratory behavior.
This work has been supported by the FIS PI10/00543 grant,
Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER-Unión Eur-
Pain assay
opea), SAS 111242 grant, Servicio Andaluz de Salud-Junta de
For the hot plate test, a glass cylinder (16 cm high, 16 cm in Andalucı́a, Proyecto de Investigación de Excelencia de la
diameter) was used to constrain the mice to the heated surface Junta de Andalucı́a CTS-5725, Federación Andaluza de Fi-
of the plate. The plate surface was maintained at 45C– bromialgia y Fatiga Crónica (ALBA Andalucı́a), and FOICAM
52.5C – 0.5C and the latency to commence paw licking was (Spanish research association). We thank Dr. Jaime Carvajal
measured, with a cutoff of 30 s. For the tail flick test, a ther- (CABD-CSIC-Universidad Pablo de Olavide) for critical
mostatic water bath was maintained at a temperature of reading and editing of the manuscript.
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CS ¼ citrate synthase
FIQ ¼ fibromyalgia impact questionnaire
Address correspondence to: FM ¼ fibromyalgia
Prof. Mario D. Cordero HPLC ¼ high-performance liquid chromatogra-
Dpto. Citologı́a e Histologı́a Normal y Patológica phy
IL-(1b,18) ¼ interleukins
Facultad de Medicina
LPS ¼ lipopolysaccharide
MDA ¼ malondialdehyde
Avda. Sánchez-Pizjuán s/n
mtDNA ¼ mitochondrial DNA
Sevilla 41009
NLRP3 ¼ NOD-like receptor family, pyrin domain
Spain containing 3
E-mail: mdcormor@us.es OGG-1 ¼ 8-oxoguanine glycosylase
PABA ¼ P-aminobenzoate
ROS ¼ reactive oxygen species
Date of first submission to ARS Central, January 13, 2013; date TNF ¼ tumor necrosis factor
of final revised submission, July 8, 2013; date of acceptance, VAS ¼ visual analogues scale
July 25, 2013.
Biochimica et Biophysica Acta 1852 (2015) 1257–1267
Contents lists available at ScienceDirect
Biochimica et Biophysica Acta
journal homepage: www.elsevier.com/locate/bbadis
Metformin and caloric restriction induce an AMPK-dependent

restoration of mitochondrial dysfunction in fibroblasts from
Fibromyalgia patients
Elísabet Alcocer-Gómez a,b, Juan Garrido-Maraver b, Pedro Bullón a,c, Fabiola Marín-Aguilar a, David Cotán b,
Angel M. Carrión d, José Miguel Alvarez-Suarez e,f,g, Francesca Giampieri h, José Antonio Sánchez-Alcazar b,
Maurizio Battino e,i, Mario D. Cordero a,⁎
a
Research Laboratory, Oral Medicine Department, Universidad de Sevilla, Sevilla, Spain
b
Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD), Universidad Pablo de Olavide-CSIC-Junta de Andalucía and Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER), ISCIII,
41013 Sevilla, Spain
c
Dept. of Periodontology, Dental School, University of Sevilla, Spain
d
División de Neurociencias, Universidad Pablo de Olavide de Sevilla, Carretera de Utrera Km. 1, 41013 Sevilla, Spain
e
Dipartimento di Scienze Cliniche Specialistiche ed Odontostomatologiche (DISCO)-Sez. Biochimica, Facoltà di Medicina, Università Politecnica delle Marche, Ancona 60131, Italy
f
Area de Nutrición y Salud, Universidad Internacional Iberoamericana (UNINI), Campeche C.P.24040, Mexico
g
Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Nacional de Chimborazo, Riobamba, Ecuador
h
Dipartimento di Scienze Agrarie, Alimentari e Ambientali (D3A), Università Politecnica delle Marche, Via Ranieri 65, Ancona 60131, Italy
i
Director Centre for Nutrition & Health, Universidad Europea del Atlantico (UEA), Santander 39011, Spain
a r t i c l e i n f o a b s t r a c t
Article history: Impaired AMPK is associated with a wide spectrum of clinical and pathological conditions, ranging from obesity,
Received 20 December 2014 altered responses to exercise or metabolic syndrome, to inflammation, disturbed mitochondrial biogenesis and
Received in revised form 4 March 2015 defective response to energy stress. Fibromyalgia (FM) is a world-wide diffused musculoskeletal chronic pain
Accepted 7 March 2015
condition that affects up to 5% of the general population and comprises all the above mentioned pathophysiolog-
Available online 14 March 2015
ical states. Here, we tested the involvement of AMPK activation in fibroblasts derived from FM patients. AMPK
Keywords:
was not phosphorylated in fibroblasts from FM patients and was associated with decreased mitochondrial
Fibromyalgia biogenesis, reduced oxygen consumption, decreased antioxidant enzymes expression levels and mitochondrial
AMPK dysfunction. However, mtDNA sequencing analysis did not show any important alterations which could justify
Mitochondria the mitochondrial defects. AMPK activation in FM fibroblast was impaired in response to moderate oxidative
Oxidative stress stress. In contrast, AMPK activation by metformin or incubation with serum from caloric restricted mice
Metformin improved the response to moderate oxidative stress and mitochondrial metabolism in FM fibroblasts. These re-
Caloric restriction sults suggest that AMPK plays an essential role in FM pathophysiology and could represent the basis for a valuable
new therapeutic target/strategy. Furthermore, both metformin and caloric restriction could be an interesting
therapeutic approach in FM.
© 2015 Elsevier B.V. All rights reserved.
1. Introduction effect mediated by ROS themselves on the same organelles [2]. In eu-
karyotic cells, mitochondrial biogenesis is triggered through modula-
Mitochondria are essential organelles present in virtually all eukary- tion of the ATP/ADP ratio, activation of adenosine monophosphate
otic cells. One of the primary functions of mitochondria is ATP produc- activated protein kinase (AMPK) and the subsequent expression of per-
tion via the oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathway. Moreover, oxisomal proliferator activator receptor γ co-activator 1α (PGC-1α) and
they play crucial roles in many other metabolic, regulatory and develop- nuclear respiratory factor-1 (NRF1) transcription factors. The AMPK cas-
mental processes [1]. The involvement of mitochondria in a variety of cade is one of the intracellular pathways that have evolved to ensure
pathological mechanisms has been partially ascribed to their central that energy homoeostasis is maintained even under pathological condi-
role in reactive oxygen species (ROS) production and to the damaging tions or stress [3]. AMPK has also been involved in the cellular defense
against oxidative stress damage induced by mitochondrial ROS through
the increase of MnSOD and catalase expression levels [4].
⁎ Corresponding author at: Research Laboratory, Oral Medicine Department.
Universidad de Sevilla, C/Avicena s/n, 41009 Sevilla, Spain. Tel.: + 34 954 481120;
Fibromyalgia (FM) is a common chronic pain syndrome accompa-
fax: +34 954 486784. nied by other symptoms such as fatigue, headache, sleep disturbances,
E-mail address: mdcormor@us.es (M.D. Cordero). and depression. Despite the fact that it affects up to 5% of the general
http://dx.doi.org/10.1016/j.bbadis.2015.03.005
0925-4439/© 2015 Elsevier B.V. All rights reserved.
1258 E. Alcocer-Gómez et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1852 (2015) 1257–1267
population worldwide, its pathogenic mechanism remains elusive. 2.3. Reagents

Because not all FM patients have a mitochondrial dysfunction, it has
recently been hypothesized that oxidative stress and mitochondrial Trypsin and metformin were purchased from Sigma Chemical Co.,
dysfunction may be important events in pathogenesis of a subgroup of (St. Louis, Missouri). Monoclonal Antibodies specific for mitochondrial
FM patients [5–9]. There is evidence supporting this hypothesis, and respiratory chain complex subunits [Anti-human Complex I (39 kDa
thus, reduced mitochondrial mass and impaired bioenergetics have subunit), Complex II (30 kDa subunit I), Complex III (Core 1 subunit)
been described in blood cells derived from FM patients [8–10]. Further- and Complex IV (COX II)], MitosoxTM, PicoGreen, and Hoechst 3342,
more, different antioxidant enzymes have been observed to be drasti- were purchased from Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, Oregon).
cally reduced in FM patients [5–7,9,11]. Recently, we have also found Anti-cytochrome c antibodies were purchased from PharMingen (BD
reduced AMPK gene expression levels in blood mononuclear cells Bioscience, San Jose, California). Anti-GAPDH monoclonal antibody,
(BMCs) from FM patients [9]. clone 6C5, was purchased from Research Diagnostic, Inc., (Flanders,
As AMPK has a central regulatory role in cell metabolism, mitochon- New Jersey). Complex I 8 kDa subunit and Complex II 70 kDa subunit,
drial biogenesis and oxidative stress response, we evaluate if AMPK anti-PGC1-alpha and OGG-1 antibodies were from Abcam (Cambridge,
down-regulation could be at least in part responsible for the impaired UK); anti-AMPK-p antibodies were from Santa Cruz Biotechnology
oxidative stress response and mitochondrial dysfunction observed in (Santa Cruz, CA, USA); and MnSOD antibody was purchased from
FM. Here, we assessed this hypothesis in cultured skin fibroblasts from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). A cocktail of protease inhib-
patients enrolled in a trial concerning the study of inflammation and itors (complete cocktail) was purchased from Boehringer Mannheim
mitochondrial dysfunction in BMCs (all patients had mitochondrial (Indianapolis, IN). The ImmunStar HRP substrate kit was from Bio-Rad
dysfunction in BMCs) [8]. Laboratories Inc. (Hercules, CA).
2. Material and methods 2.4. Caloric restriction assay
2.1. Ethical statements For all experiments, only male mice were used. Eight-week-old male
C57/BL6/J mice weighing 25–30 g were maintained on a 12 h light/dark
The approval of the ethical committee of the University of Seville cycle. All studies were performed in accordance with the European
was obtained, according to the principles of the Declaration of Helsinki Union guidelines (86/609/EU) and Spanish regulations for the use of
and all the International Conferences on Harmonization and Good laboratory animals in chronic experiments (BOE 67/8509-12, 1988).
Clinical Practice Guidelines. All participants in the study gave their All experiments were approved by the local institutional animal care
written informed consent before initiating it. committee. Calorie restriction (CR) regimen was progressively imple-
mented: it was initiated with 10% restriction diet during the first
week, followed by 20 and 30% during the second and third weeks,
2.2. Patients respectively, and maintained at 30% until the end of treatment. After
testing, mice were sacrificed by decapitation. Blood samples were
The inclusion criterion was Fibromyalgia, based on current ACR diag- collected frozen at − 80 °C. In several experiments, fibroblasts were
nostic criteria [9], and diagnosed 2 to 3 years previously. The clinical cultured using 10% mice serum fed ad libitum (AL) or CR. Cells were
characteristics of each group are shown in Supplementary Table 1. incubated at 37 °C in a 5% CO2 atmosphere. Serum was heat activated
Exclusion criteria were: acute infectious disease within the previous for 30 min at 55 °C.
3 weeks; past or present neurological, psychiatric, metabolic, autoim-
mune, allergy-related, dermal or chronic inflammatory disease; unde-
sired habits (e.g., smoking and alcohol); medical conditions that 2.5. Behavioral assays
required glucocorticoid treatment, analgesics or antidepressant drugs;
past or current substance abuse or dependence; pregnancy or current Behavioral analyses were performed in a testing room with homoge-
breastfeeding. Three FM female patients and two healthy female volun- neous noise and light levels. The testing apparatus was cleaned with
teers matched for age range, gender, ethnicity and demographic 70% ethanol (Panreac Química S.A.U.) between trials to eliminate any
features (completion of at least 9 years of education and member of influence of animal odor on the exploratory behavior.
the middle socioeconomic class), were included in the study. Healthy
controls had no signs or symptoms of FM and had not taken any medi-
cation for at least 3 weeks prior to commencing the study. None of the 2.6. Pain assay
patients or controls had taken any drug or vitamin/nutritional supple-
ments during the 3 weeks prior to blood sample collection. All patients For the hot-plate test, a glass cylinder (16 cm high, 16 cm in diame-
and controls followed a standard balanced diet (carbohydrate 50–60%, ter) was used to constrain the mice to the heated surface of the plate.
protein 10–20% and fat 20–30%) for 3 weeks prior to blood collection, The plate surface was maintained at 50–55 ± 0.5 °C and the latency to
as established by a diet program. Clinical data were obtained from a paw-licking was measured, with a cut-off of 30 s.
physical examination and subjects were evaluated using the Fibromyal-
gia Impact Questionnaire (FIQ), the visual analogues scale (VAS) and
depression with the Beck Depression Inventory (BDI). Tender points 2.7. Fibroblast cultures
were identified by digital pressure at the 18 locations recommended
by ACR which included a minimum of 11 out of 18. Coagulated blood Control fibroblasts were human primary fibroblasts from healthy
samples were collected from patients and controls after 12 h fasting, volunteers. Samples from patients and controls were obtained accord-
centrifuged at 3800 ×g for 5 min, and the serum was stored at −80 °C ing to the Helsinki Declarations of 1964, as revised in 2001. Fibroblasts
until testing. Serum biochemical parameters were assayed by routine were cultured in DMEM media (4500 mg/L glucose, L-glutamine,
analytical methods. Routine laboratory test yielded normal results piruvate), (Gibco, Invitrogen, Eugene, OR, USA) supplemented with
for glucose, uric acid, creatine kinase, aspartate aminotransferase, ala- 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco, Invitrogen, Eugene, OR, USA)
nine aminotransferase, cholesterol, and triglycerides (Supplementary and antibiotics (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Cells were
Table 2). incubated at 37 °C in a 5% CO2 atmosphere.
E. Alcocer-Gómez et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1852 (2015) 1257–1267 1259
2.8. Treatment 2.14. Mitochondrial ROS production
2 mM metformin (Sigma Aldrich) and/or 100 μM of H2O2 at 48 h Mitochondrial ROS generation in BMCs and fibroblasts were
were used for in vitro experiments. assessed by MitoSOX™ Red, a red mitochondrial superoxide indicator.
MitoSOX Red is a novel fluorogenic dye recently developed and validat-
ed for highly selective detection of superoxide in the mitochondria of
2.9. Mitochondrial respiratory chain enzyme activities
live cells. MitoSOX™ Red reagent is live-cell permeant and is rapidly
and selectively targeted to the mitochondria. Once in the mitochondria,
Activities of NADH:coenzyme Q1 oxidoreductase (complex I),
MitoSOX™ Red reagent is oxidized by superoxide and exhibits red
succinate deshydrogenase (complex II), ubiquinol:cytochrome c oxidore-
fluorescence.
ductase (complex III), cytochrome c oxidase (complex IV), NADH: cyto-
chrome c reductase (complex I + III), succinate:cytochrome c reductase
(complex II + complex III) and citrate synthase (CS) were determined 2.14.1. Fluorescence microscopy
in sonicated-permeabilized fibroblasts using spectrophotometric Cells grown on microscope slides in 6-well plates for 24 h were incu-
methods. Results are expressed as Units/CS (mean ± SD). Proteins of bated with MitoSOX™ Red for 30 min at 37 °C, washed twice in PBS,
fibroblast homogenates were analyzed by the Lowry procedure. fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 0.5–1 h at room tempera-
ture, and washed twice with PBS. After that, cells were incubated for
10 min at 37 °C with anti-cytochrome c antibody (Invitrogen, Barcelona,
2.10. Western blotting Spain) to label mitochondria. Slides were analyzed by immunofluores-
cence microscopy.
Whole cellular lysate from fibroblasts was prepared by gentle shak-
ing with a buffer containing 0.9% NaCl, 20 mMTris-ClH, pH 7.6, 0.1% tri- 2.14.2. Flow cytometry
ton X-100, 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride and 0.01% leupeptine. Approximately 1 × 106 cells were incubated with 1 μM MitoSOXTM
Electrophoresis was carried out in a 10–15% acrylamide SDS/PAGE. Red for 30 min at 37 °C, washed twice with PBS, resuspended in
Proteins were transferred to Immobilon membranes (Amersham 500 μL of PBS and analyzed by flow cytometry in an Epics XL cytometer,
Pharmacia, Piscataway, NJ). Mouse anti-Complex I (8 and 39 kDa sub- Beckman Coultier, Brea, California, USA (excitation at 510 nm and fluo-
unit), mouse anti-complex II (30 kDa subunit I), mouse anti-Complex rescence detection at 580 nm).
III (Core 1 subunit), mouse anti-complex IV (COX II), AMPK-P, PGC-1
α, MnSOD, catalase and DNA repair enzyme 8-oxoguanine DNA
2.15. Oxygen consumption rate (OCR)
glycolase-1 (OGG-1) antibodies were used to detect proteins by West-
ern blotting. Proteins were electrophoresed, transferred to nitrocellu-
The oxygen consumption rate (OCR) was assessed in real-time using
lose membranes and, after blocking over night at 4 °C, incubated with
the 24 well Extracellular Flux Analyzer XF-24 (Seahorse Bioscience,
the respective antibody solution, diluted at 1:1000. Membranes were
North Billerica, MA, USA) according to the manufacturer's protocol,
then probed with their respective secondary antibody (1:2500).
which allows measuring OCR changes after up to four sequential addi-
Immunolabeled proteins were detected by using a chemiluminescence
tions of compounds. Cells (5 × 104/well) were seeded for 16 h in the
method (Immun Star HRP substrate kit, Bio-Rad Laboratories Inc.,
XF-24 plate before the experiment in a DMEM/10% serum medium
Hercules, CA). Protein was determined by the Bradford method.
and then incubated for 24 h with the different compounds studied.
Before starting measurements, cells were placed in a running DMEM
2.11. Measurement of CoQ levels medium (supplemented with 25 mM glucose, 2 mM glutamine, 1 mM
sodium Pyruvate, and without serum) and pre-incubated for 20 min
CoQ levels in cultured fibroblasts were performed using a method at 37 °C in the absence of CO2 in the XF Prep Station incubator (Seahorse
previously described by our group [8]. Bioscience, Billerica MA, USA). Cells were transferred to an XF-24 Extra-
cellular Flux Analyzer and after an OCR baseline measurement a profil-
ing of mitochondrial function was performed by sequential injection
2.12. Antioxidant enzyme activity of four compounds that affect bioenergetics, as follows: 55 μL of
oligomycin (final concentration 2.5 μg/mL) at injection in port A, 61 μL
Catalase activity was determined in cellular lysate by monitoring of 2,4-dinitrophenol (2,4-DNP) (final concentration 1 mM) at injection
H2O2 decomposition at 240 nm [12]. SOD activity was determined on in port B, and 68 μL of antimycin/rotenone (final concentration 10 μM/
the basis of the inhibition of the formation of NADH—phenazine 1 μM) at injection in port C. A minimum of five wells was utilized per
methosulfate-nitroblue tetrazolium formazan [13]. condition in any given experiment. Data are expressed as pMol of O2 con-
sumed per minute normalized to 1000 cells (pMol O2/1000 cells/min).
2.13. Quantification of mtDNA
2.16. Lipid peroxidation
Nucleic acids were extracted from fibroblasts by standard cellular
lysis. The primers used were: mtF3212 (5′-CACCCAAGAACAGGGTTT Fibroblasts were cultured on coverslips and incubated with 1 μM
GT-3′) and mtR3319 (5′-TGGCCATGGGTATGTTGTTAA-3′) for mtDNA, C11-Bodipy (BODIPY® 581/591 C11) for 30 min at 37 °C. Coverslips
and, 18S rRNA gene 18S1546F (5′-TAGAGGGACAAGTGGCGTTC-3′) were then rinsed with PBS and mounted onto slides as described
and 18S1650R (5′-CGCTGAGCCAGTCAGTGT3′) for nDNA for loading above for analysis with a fluorescence microscope. Fluorescent intensity
normalization. Arbitrary units were computed as the ratio between was measured using the Image J software (National Institutes of Health,
the optical density band corresponding to the mtDNA studied in the Bethesda, Maryland, USA).
20–30th cycle and that of the nDNA in the 15th amplification cycle. Lipid peroxidation in serum from mice was detected by measuring
One unit was considered to be the ratio corresponding to the control pa- the concentration of TBARS in fluorescence at 532 nm (F7000, HITACHI),
tient. For imaging of mtDNA in living cells, control and FM fibroblasts using a TBARS detection kit according to the manufacturer's instruc-
cells were cultured in dishes with a glass bottom (MatTek Corporation, tions. Absorbance of samples was measured at 535 nm. TBARS concen-
Ashland, MA) and stained with PicoGreen (3 μL/mL) for 1 h at 37 °C. trations of the samples were calculated using the extinction co-efficient
TMRM (100 nM) staining was used to visualize mitochondria. of 156,000 M−1 cm−1.
2.17. PCR Amplification and mtDNA sequencing carried out using the Staden package. For this purpose the revised
human mtDNA Cambridge reference sequence (www.mitomap.org/
The complete mtDNA was amplified from total DNA in 24 overlapping mitoseq.html) was used. The whole process was carried out at
800–1000-bp-long PCR fragments. Primers were carefully designed using Secugen (Madrid, Spain).
the revised human mtDNA Cambridge reference sequence (www.
mitomap.org/mitoseq.html).
The PCR fragments were sequenced in both strands in an 2.18. Analysis of apoptosis and viable cells
ABI 3730 (Applied Biosystems; www.appliedbiosystems.com;
Foster City, CA) sequencer using a BigDye v3.1 sequencing kit Viable cells were determined from their normal cell and nuclear
(Applied Biosystems; www.appliedbiosystems.com; Foster City, morphology and exclusion of propidium iodide. In each case 10 random
CA). Assembly and identification of variations in the mtDNA were fields and more than 500 cells were counted.
A Complex I Complex II Complex III

250 80 80
200 60 60
U/CS
U/CS
U/CS
150
100 *
40
* * * 40
* * *
* *
50 20 20
0 0 0
Control FM1 FM2 FM3 Control FM1 FM2 FM3 Control FM1 FM2 FM3
Complex IV Complex I+III Complex II+III

400 200 25
300 150 20
**
U/CS
U/CS
U/CS
** ** 15 *
200 100 * * 10
* *
100
* 50 5
0 0 0
Control FM1 FM2 FM3 Control FM1 FM2 FM3 Control FM1 FM2 FM3
100 70
90
IOD Complex I (39kDa) /
60
IOD Complex I (8kDa)/
80
B 70 50
Control FM1 FM2 FM3 60
GADPH
40
GADPH
50 *
Complex I 40 * * 30
30 20 *
8kDa subunit 20 *
10
10 *
Complex I 0 0
39kDa subunit 120
90
IOD Complex II (30kDa) /
80
IOD Complex II (70kDa) /
Complex II 100
30kDa subunit
70 *** 80 ***
60
*
GADPH
GADPH
50 60
Complex II 40 * *
70kDa subunit 30 40
20
Complex III 10
20 *
Core I subunit 0 0
Complex IV 70 90
Cox II subunit
IOD Complex III / GADPH
IOD Complex IV / GADPH
60 80
70
50
60
***
GADPH 40 50
* * * 40
30 *
20
30 *
20
10 10
0 0
Fig. 1. Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from FM patients. (A) Mitochondrial enzymatic activities were determined as described in Material and methods. Results (mean ± SD)
are expressed in U/CS (units per citrate synthase). (B) Protein expression levels of mitochondrial subunits of complex I, II, III and complex IV. (C) Protein levels were determined by den-
sitometric analysis (IOD, integrated optical intensity) of three different Western blots and normalized to GADPH signal, using fibroblasts from three representative FM patients, compared
with a pool of fibroblasts from 5 healthy age- and sex-matched control subjects. *P b 0.001; **P b 0.01; ***P b 0.05 between control and FM patients.
A B *
4,0
OCR (pmol O 2/1000 cells/min)

4.50 Oligomycin 2,4-DNP Rotenone/Antimycin 3,5
4.00 3,0
OCR (pmol O2/1000 cells/min)
Control 2,5
3.50
FM1 2,0
3.00 1,5
FM2
2.50 FM3 1,0
2.00 0,5
0,0
1.50 Control FM1 FM2 FM3
1.00
0.50
C
0,7 *
Spare respiratory capacity (pmol

0.00 0,6
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48
O 2/1000 cells/min)
0,5
Time (min)
0,4
0,3
0,2
D 0,1
200 0,0
pMolQ10/mgProtein
Control FM1 FM2 FM3
150
100 G Control
50 *
* *
0
E
1.5 FM1
mtDNA/gDNA
1
* **
0.5
*
0
Control 1 Control 2 Control 3 FM1 FM2 FM3 FM2
F
250
PicoGreen Foci
200
* * *
150 FM3
100
50
0
Fig. 2. Abnormalities in various aspects of bioenergetic function of mitochondria. Oxygen consumption rate (OCR) in cells from control and FM patients. (A) OCR was monitored using the
Seahorse XF-24 Extracellular Flux Analyzer with the sequential injection of oligomycin (1 μg/mL), 2,4-DNP (100 μM), rotenone (1 μM) at the indicated time point (B) The basal OCR was
markedly affected in cells from FM compared to control. (C) The spare respiratory capacity (SRC) of FM fibroblasts showed a significant decrease with respect to control fibroblasts.
(D) CoQ10 levels in control and FM cells. (E) mtDNA copy number was measured by RT-PCR as described in Material and methods. (F and G) mtDNA imaging by PicoGreen staining
and quantification of PicoGreen foci in control and FM fibroblasts. For the control cells, data are the means ± SD for experiments performed on two different control cell lines. Data
represent the mean ± SD of three separate experiments. Bar = 15 μm.*P b 0.001; **P b 0.01 between control and FM patients.
2.19. Statistical analysis 3. Results
Data in figures is given as mean ± SD. Data between different groups 3.1. Mitochondrial metabolism
were analyzed statistically by using ANOVA on Ranks with Sigma Plot
and Sigma Stat statistical software (SPSS for Windows, 19, 2010, SPSS As AMPK signaling has been previously reported to be altered in BMCs
Inc. Chicago, IL, USA). For cell-culture studies, Student's t test was used from FM patients [9], we have next studied the role of AMPK in FM path-
for data analyses. A value of P b 0.05 was considered significant. ophysiology using isolated fibroblasts from three representative FM
A B
120 80
* *
Mitochondrial ROS Production
70 a a
100 a
Arbitrary units (a.u.)

Lipid Peroxidarion
60
Fluorescence (a.u.)
80 50
Reduced
60 a 40 Oxidated
30
40
*
20 * *
20
10
0 0
Control 1 Control 2 Control 3 FM1 FM2 FM3 Control 1 Control 2 Control 3 FM1 FM2 FM3
C 60
IOD OGG-1 / GADPH
Control FM1 FM2 FM3

50
* * *
40
OGG-1
30
20
GADPH 10
0
Control FM1 FM2 FM3
D E Red Green
Mitosox Cyto c Merge fluorescence fluorescence Merge
Control
Control
FM1
FM1
FM2
FM2
FM3
FM3
Fig. 3. Oxidative stress and oxidative damage levels in fibroblasts from FM patients. (A) Mitochondrial ROS production was analyzed in BMCs from control and FM patients by flow cytom-
etry as described in Material and Methods. (B) Quantification of lipid peroxidation in control and FM fibroblasts. Data represent the oxidized lipid/reduced lipid ratio. Data represent the
mean ± SD of three separate experiments.*P b 0.001, aP b 0.01 between control and FM patients. (C) Protein expression levels of 8-oxoguanine glycosylase (OGG-1, a DNA glycosylase
enzyme responsible for the excision of 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG)). (D) Mitochondrial ROS generation in fibroblasts cultured for 72 h in normal growth medium prior to analysis.
MitoSOX Red staining revealed increased superoxide anion. MitoSOX Red colocalized with subunit II of cytochrome c oxidase (COX II) in merged images, indicating that superoxide anion
production was mainly in mitochondria. (E) Lipid peroxidation in control and FM fibroblasts using C11-Bodipy staining. Red fluorescence represents non-oxidized lipids, and green fluo-
rescence represents oxidized lipids. Scale bar 30 μm.
patients. FM fibroblasts displayed a significant reduction in the activities 3.2. AMPK is implicated in oxidative stress response in FM
of mitochondrial respiratory enzymes compared to control fibroblasts
(Fig. 1A). Mitochondrial protein expression levels correlated with the de- Mitochondrial superoxide production was significantly increased in
pressed activities found in respiratory enzymes (Fig. 1B). Next, we inves- FM fibroblasts compared to controls (P b 0.001), accompanied by high
tigated mitochondrial function by measuring the OCR values in control levels of lipid peroxidation (Figs. 3A, B, D and E). To confirm these
and FM fibroblasts, exposed sequentially to each of four modulators of results, the expression of an additional oxidative stress marker such as
oxidative phosphorylation (OXPHOS): oligomycin (an inhibitor of F1Fo- 8-oxoguanine glycosylase (OGG1) was also determined. FM fibroblasts
ATPase or complex V), 2,4-DNP (uncoupling of the OXPHOS electron showed high levels of OGG1 (Fig. 3C).
transport chain) and antimycin/rotenone (complex I and III inhibitors re- As AMPK induces PGC-1α phosphorylation which leads to increased
spectively) (Fig. 2A). The basal OCR was markedly affected in fibroblasts antioxidant enzymes expression levels and mitochondrial biogenesis,
from FM patients compared to controls (Fig. 2B). The spare respiratory we analyzed AMPK protein expression levels and activation in FM
capacity (SRC) of cells was obtained by calculating the mean of OCR fibroblasts. Results showed low expression levels of active phosphory-
values after injection of 2,4-DNP minus the basal respiration and could lated AMPK, PGC-1α and MnSOD (Fig. 4A), suggesting that AMPK-
be used as an indicator of how close a cell is operating to its bioenergetic dependent activation of PGC-1α was indeed impaired in FM fibroblasts.
limit. Fibroblasts from FM patients showed a significant decrease of SRC As reduced antioxidant enzyme levels have been previously described
compared to control cells (Fig. 2C). Furthermore, similarly to what was in FM [5,6,11], we next investigated the response to moderate oxidative
previously found in BMCs [8], FM fibroblasts also showed decreased stress induced by exogenous addition of H2O2 in FM fibroblasts. Incuba-
CoQ10 levels when compared to controls (Fig. 2D). CoQ10 content of fibro- tion of FM fibroblasts with H2O2 failed to activate AMPK and PGC-1α
blasts from patient 1 was reduced by 70%, from patient 2 by 78% and from and to increase MnSOD expression levels (Fig. 4A). As a consequence
patient 3 by 82%. FM fibroblasts also had a smaller number of mitochon- of an impaired defensive response to oxidative stress, cell death
dria; we measured mtDNA content and compared it with control values. increased in FM fibroblasts treated with H2O2 (Fig. 4B).
Results showed that mtDNA content was 30–50% lower in fibroblasts Under oxidative stress condition, AMPK was found to lead to an
from FM (Fig. 2E). This finding was further confirmed by visualizing the increase in the NADPH generation [14]. However, as FM fibroblasts
number of mtDNA nucleoids per cell using PicoGreen staining and fluo- had reduced activity of phosphorylated AMPK, we found low levels of
rescence microscopy. Mitochondrial nucleoids were significantly reduced NADPH. Interestingly, metformin, an AMP mimetic that directly acti-
in FM fibroblasts (Figs. 2F and G). vates AMPK, induced an increase of NADPH levels and the activity of
Since mitochondrial respiratory chain defects are usually associated SOD and catalase (Figs. 5A–C).
with mtDNA mutations or deletions, we next sequenced the complete FM fibroblasts under moderate oxidative stress conditions mediated
mtDNA from FM patients. Sequence analysis did not show any impor- by H2O2 treatment or induction of AMPK by metformin showed PGC-
tant alterations as mutations or deletions which could justify the mito- 1alpha activation (Fig. 5D) which increased protection against H2O2
chondrial defects. We only found mitochondrial polymorphisms which exposure and reduced cell death (Fig. 5E). These results suggest that
are also observed in control fibroblasts (Table S1). the induction of AMPK phosphorylation could to be an interesting
A 350000
Arbitrary Units (a.u.)
300000
250000
200000
150000 * p-AMPKα
PGC-1α
100000
MnSOD
50000
B
70
N/T
* *
60 *
H2O2
50
%apoptosis
40
30
20
10
0
Control FM1 FM2 FM3
Fig. 4. Comparison of oxidative stress levels and metabolic response to H2O2 treatment of skin fibroblasts between FM patients and healthy subjects. (A) Protein expression levels of phos-
phorylated AMPK, PGC-1α, and MnSOD after incubation with 100 mM H2O2 for 48 h. Protein levels were determined by densitometric analysis (IOD, integrated optical intensity) of three
different Western blots and normalized to GADPH signal. *P b 0.001 between control and FM patients. (B) Percentage of apoptosis in control and FM fibroblasts after incubation with
100 mM H2O2 for at 48 h. *P b 0.001 between control and FM patients.
A 16
B 30
C
* 80 **
SOD activity (U/mg protein/min)

NADPH levels (pMol/106 cells)
CAT activity (U/mg protein/min)

14
** 25 70
12 ≠
≠ ≠ 60
20
10 ≠ ≠
50
8 15
aa 40
6 a a a a
10 30
4 20
5
2 10
0 0 0
D
200000
180000
Arbitrary Units (a.u.)

160000
140000
PGC-1α 120000
100000
80000
GAPDH 60000
40000
20000
0
E
70
60 * *
*
50
% Apoptosis
40 N/T
H2O2
30
H2O2+Metformin
20
10
0
Control FM1 FM2 FM3
Fig. 5. Effects of metformin treatment on antioxidant defense and oxidative stress response of fibroblasts from FM patients. (A, B and C) NADPH levels and antioxidant enzymes SOD and
catalase (CAT) activities in FM fibroblasts treated with metformin (Met). *P b 0.001 and **P b 0.05 between control and control with Met. aP b 0.001 and aaP b 0.005 between FM and control.
≠
P b 0.001 between FM and FM with Met. (D) Levels of phosphorylated PGC-α in FM fibroblasts after 100 mM H2O2 and 2 mM Met treatments for 48 h (representative subset is shown).
(E) Percentage of apoptosis in control and FM fibroblasts after incubation with 100 mM H2O2 and 2 mM Met for 48 h. *P b 0.001 between control and FM patients and between H2O2 and
H2O2 + Met.
therapeutic approach in FM. Given that it has been speculated that the when compared with ad libitum (AL) fed mice (Fig. 6A) accompanied
beneficial effects of caloric restriction (CR) could be mediated by by AMPK phosphorylation (Fig. 6B) and reduced levels of serum oxida-
AMPK [3], CR could be a promising method to alleviate oxidative dam- tive stress (Fig. 6C). To determine the potential effect of improvement of
age in FM. Taken into account the possible role of AMPK in FM patho- AMPK by CR, fibroblasts from FM patients were cultured with serum
physiology and the results with metformin treatment, we next studied from AL and CR mice, and cell growth, ATP and mitochondrial mass
the implication of AMPK in the protective effect of CR on FM fibroblasts. were assessed. Serum from CR mice improved cell growth in controls
Thus, we performed an experiment with a mouse model of CR. Sev- and FM fibroblasts (Fig. 6D), accompanied by an increase in ATP levels
eral mice were fed with a normal diet and with CR for one month. Mice and mitochondrial mass (determined by increased citrate synthase
submitted to the CR diet for one month developed a marked analgesia activity) and cell morphology normalization (Figs. 6E–G).
A Temperature 55ºC
B 3
C
45 pAMPK/GADPH 12
Fold change relative to control

(normalized to total protein)
Withdrawal latencies (s) 40 2.5 ** 10
35
TBARS µMol/mL
2 8
30
25 AL 1.5 6 *
20
CR
15 1 4
10
0.5 2
5
0 0 0
Day 30 Day 32 Day 34 Day 36 AL CR AL RC
D E F
ATP levels (nMol/mg

60 10
*
8 *
50
protein)
Relative cell growth
6
CTL
40 4
CTL
CTL AL
30 2
CTL CR
0
20 FM CTL AL CTL CR FM AL FM CR
FM AL
10
G
FM FBS
FM CR
0 40
Citrate Synthase
Specific activity
0 48 72 96 120 ** *
30
Time of growth (hours)
FBS AL CR 20
10
FM AL
0
CTL
CTL AL CTL CR FM AL FM CR
FM AL FM CR
FM CR
FM
Fig. 6. Effects of caloric restriction on bioenergetics function of mice and skin fibroblasts from FM patients. (A) Evolution of pain sensitivity in ad libitum (AL) and caloric restriction (CR)
mice evaluated in the hot plate test at 55 °C. (B) Phosphorylation of AMPK after CR. (C) Oxidative stress in serum evaluated by TBARS levels. (D) Cell growth with AL and CR serum de-
termined in healthy and FM fibroblasts. (E) Morphological changes of fibroblasts incubated with FBS or serum from AL or CR mice. (F) ATP levels in control and FM fibroblasts.
(G) Mitochondrial mass determined by measuring citrate synthase levels and cytochrome c levels by immnunofluorescence in control and FM fibroblasts. Data represents the
means ± SD of three separate experiments. *P b 0.001 AL or CR; **P b 0.01 between AL or CR in control fibroblasts.
4. Discussion disease biochemistry and molecular studies [1]. Skin fibroblasts repre-
sent a useful biological model in which defined mutations and the
Despite decades of intense research, the basic pathophysiological cumulative cellular damage can be examined. We found reduced mito-
mechanisms of FM still remain elusive. Several important pathophysio- chondrial chain enzimatic activities and proteins, CoQ10 levels, mito-
logical processes in FM onset and development have been described: chondrial mass and ATP levels, accompanied by increased oxidative
oxidative stress, mitochondrial dysfunction, bioenergetic alterations damage. We found no specific mutation after mtDNA sequencing; how-
and inflammation processes are only some of the most important mech- ever, we cannot rule out the presence of mutations in nDNA or potential
anisms that have been postulated [5–11]. AMPK has been reported to mtDNA mutations in other patients not included in this study.
play a master regulatory role in all these cellular processes and its dys- Moreover, we observed reduced levels of phosphorylated PGC-1α
regulation has been described in several other diseases [15]. Recently, accompanied by low levels of antioxidant MnSOD and impaired oxida-
we have reported alterations in AMPK signaling in BMCs from FM pa- tive stress response which are protective mechanisms controlled by
tients. However, the role of AMPK in FM remains unknown. In this AMPK. Furthermore, reduced levels of active phosphorylated AMPK
study, we found a marked mitochondrial dysfunction in fibroblasts de- were observed in FM fibroblasts. These data are interesting because
rived from 3 FM patients. It is interesting to remark that until now, all AMPK has been involved in the control of peripheral sensitization of
the studies in FM have explored the pathophysiological processes only nociceptors, providing evidence of AMPK activation as a novel treat-
in biological samples isolated directly from patients, e.g. BMCs, platelets, ment avenue for acute and chronic pain states [16]. In addition, the
serum, plasma, saliva, muscle. In this work we have used human dermal exposition of fibroblasts to moderate oxidative stress, as induced by
fibroblasts that have a long track record of utility in mitochondrial exogenously added H2O2, fails to up-regulate AMPK, PGC-1α and
antioxidant enzymes. Concerning this, AMPK has been deeply involved OGG1 8-oxoguanine glycosylase
in the regulation of oxidative stress and mitochondrial dysfunction PGC-1α peroxisomal proliferator activator receptor γ co-activator 1α
[17–19]. In this sense, AMPK phosphorylation by metformin treatment NRF1 nuclear respiratory factor-1
induced activation of PGC-1α accompanied by increased antioxidant ROS reactive oxygen species
enzyme activities and, as a consequence, protection of FM fibroblasts SOD superoxide dismutase
against stress exposure. PGC-1α is a key player in the ROS-induced mi- TBARS thiobarbituric acid reactive substances
tochondrial biogenesis, along with the NRF-1 and the mitochondrial
transcription factor Tfam [20]. According to our data, metformin could Author disclosure statement
induce PGC-1α activation by AMPK phosphorylation. Furthermore,
PGC-1α has a key role in the antioxidant enzymes biosynthesis, and All the Authors declare that no conflict of interest exists for any of
its genetic deletion has shown an inhibitory effect in SOD2 and catalase them.
expression levels [4,20]. Furthermore, it has been shown that PGC-1α
induction by phosphorylation of AMPK increases SOD2 and catalase Author contributions
expression levels [21]. Our data show that PGC-1α activation by metfor-
min induces increased mitochondrial biogenesis and antioxidant en- E.A.G.. and M.D.C. conceived of the study and wrote the manuscript.
zymes expression levels, and, as a consequence, a more physiological A.M.C., E.A.G., F.M.A., and DC. performed mouse experiments. E.A.G.,
response to oxidative stress. A chronic exposure to oxidative stress J.G.M., J.M.A.S., F.G. P.B. and J.A.S.A. performed cell culture experiments.
and dysregulation of the stress response are accepted causative factors J.A.S.A. conducted patient evaluations and skin biopsies isolation.
involved in the pathophysiology of FM [11,22–24]. Our results could All authors analyzed and discussed the data and commented on the
represent the basis for a valuable new therapeutic target/strategy. We manuscript.
found in FM fibroblasts: (i) a lack of AMPK phosphorylation and (ii) res-
toration of its phosphorylation by AMPK activators, such as metformin.
Acknowledgments
These findings suggest that AMPK plays a central role in FM pathophys-
iology and stress response. Identification of AMPK as a regulating factor
This work has been supported by Federación Andaluza de
in FM would have implications for patient management and treatment.
Fibromialgia y Fatiga Crónica (ALBA Andalucía) and Grupo de
We can hypothesize that the loss of sensitivity of AMPK activation is re-
Investigacion Junta de Andalucia CTS113. Authors are indebted
sponsible for increased oxidative stress and impaired bioenergetics in
with Ms Monica Glebocki for extensive editing of the manuscript.
FM patients. Furthermore, other metabolic events have been related
with AMPK down-regulation. Reduced AMPK activity has been found
Appendix A. Supplementary data
in obesity or metabolic syndrome [3], both reported to be implicated
in FM [25,26]. AMPK dysfunction seems to explain many of the patho-
Supplementary data to this article can be found online at http://dx.
physiological alterations found in FM. In this sense, activation of AMPK
doi.org/10.1016/j.bbadis.2015.03.005.
with other activators having similar effects to metformin must induce
similar beneficial effects. To investigate whether AMPK could be respon-
sible for the ability of CR to improve the cells of FM patients, we used an References
in vitro cell culture model that recapitulates key in vivo proliferative and [1] R.H. Haas, S. Parikh, M.J. Falk, R. Saneto, N.I. Wolf, N. Darin, L.J. Wong, B.H. Cohen, R.K.
phenotypic features of CR [27]. In this model, cells from patients were Naviaux, The in-depth evaluation of suspected mitochondrial disease, Mol. Genet.
cultured in the presence of serum from caloric restricted mice resulting Metab. 94 (2008) 16–37.
[2] J.F. Turrens, Mitochondrial formation of reactive oxygen species, J. Physiol. 552
in an important improvement in FM fibroblasts alterations. Future re- (2003) 335–441.
search should be focused on studying the significance of AMPK in FM [3] G.R. Steinberg, B.E. Kemp, AMPK in health and disease, Physiol. Rev. 89 (2009)
etiology and as a therapeutic target. Furthermore, an important chal- 1025–1078.
[4] S.L. Colombo, S. Moncada, AMPKalpha1 regulates the antioxidant status of vascular
lenge in FM is the moderate effectiveness of pharmacological therapies;
endothelial cells, Biochem. J. 421 (2009) 163–169.
in this sense, AMPK activators, such as AICAR, metformin, CoQ10, resver- [5] O. Altindag, H. Celik, Total antioxidant capacity and the severity of the pain in
atrol, CR or physical activity, can provide new therapeutic opportunities patients with fibromyalgia, Redox Rep. 11 (2006) 131–135.
[6] S. Bagis, L. Tamer, G. Sahin, R. Bilgin, H. Guler, B. Ercan, C. Erdogan, Free radicals
[3]. As not all patients have a mitochondrial dysfunction, our results
and antioxidants in primary fibromyalgia: an oxidative stress disorder? Rheumatol.
could help to characterize a subgroup of patients in which mitochondri- Int. 25 (2005) 188–190.
al target treatment could be the most appropriate strategy. In this sense, [7] S. Ozgocmen, H. Ozyurt, S. Sogut, O. Akyol, Current concepts in the pathophysiology
mitochondrial protector drugs or mitochondrial biogenesis activators of fibromyalgia: the potential role of oxidative stress and nitric oxide, Rheumatol.
Int. 26 (2006) 585–597.
may also be considered as new possible therapeutic approach in FM. [8] M.D. Cordero, E. Díaz-Parrado, A.M. Carrión, S. Alfonsi, J.A. Sánchez-Alcazar, P.
Nevertheless, more research is needed in order to establish a possible Bullón, M. Battino, M. de Miguel, Is inflammation a mitochondrial dysfunction-
primary causation link between AMPK and FM. dependent event in fibromyalgia? Antioxid. Redox Signal. 18 (2013) 800–807.
[9] M.D. Cordero, E. Alcocer-Gómez, M. de Miguel, O. Culic, A.M. Carrión, J.M. Alvarez-
The results described in this article could serve as a new way of Suarez, P. Bullón, M. Battino, A. Fernández-Rodríguez, J.A. Sánchez-Alcazar, Can co-
designing experiments to better understand the influence of oxidative enzyme Q10 improve clinical and molecular parameter in fibromyalgia? Antioxid.
stress on the development of FM and generate new therapeutic strategies. Redox Signal. 19 (2013) 1356–1361.
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Journal of Medical Genetics
Co
nf
Mutation in Cytochrome b gene of mitochondrial DNA in a
family with Fibromyalgia is associated with NLRP3-
Inflammasome activation
id
en
Journal: Journal of Medical Genetics
Manuscript ID jmedgenet-2015-103392.R1
t
Article Type: Original Article
ia
Date Submitted by the Author: 05-Oct-2015
Complete List of Authors: Cordero, Mario D.; IBiS Institute of Biomedicine of Seville, University
l:
Hospital Virgen del Rocío-CSIC-University of Seville, Spain,

Alcocer-Gómez, Elisabet; Centro Andaluz de Biología del Desarrollo
(CABD), Universidad Pablo de Olavide-CSIC-Junta de Andalucía,
Fo
Marín-Aguilar, Fabiola; IBiS Institute of Biomedicine of Seville, University

Hospital Virgen del Rocío-CSIC-University of Seville, Spain,
Rybkina, Tatyana; División de Neurociencias, Universidad Pablo de Olavide
de Sevilla, Carretera de Utrera Km. 1, Sevilla, Spain.,
Cotan, David; Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD),
rR
Universidad Pablo de Olavide-CSIC-Junta de Andalucía,

Pérez-Pulido, Antonio; Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD),
Universidad Pablo de Olavide-CSIC-Junta de Andalucía,
Alvarez-Suarez, Jose M.; Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad
Nacional de Chimborazo, Riobamba, Ecuador,
ev
Battino, Maurizio; Dipartimento di Scienze Cliniche Specialistiche ed

Odontostomatologiche – Sez. Biochimica, Università Politecnica delle
Marche, 60100, Ancona, Italy.,
Sánchez-Alcázar, José A.; Centro Andaluz de Biología del Desarrollo
ie
(CABD), Universidad Pablo de Olavide-CSIC-Junta de Andalucía,

Carrion, Angel M.; División de Neurociencias, Universidad Pablo de Olavide
de Sevilla, Carretera de Utrera Km. 1, Sevilla, Spain.,
w
Culic, Ognjen; Faculty of Pharmacy and Biochemistry, University of Zagreb,

A. Kovacica 1, 10000 Zagreb, Croatia.,
Navarro-Pando, José M.; Unidad de Reproducción Humana y Cirugía
Endoscópica, Instituto para el Estudio de la Biología de la Reproducción
On
Humana (INEBIR).
Bullon, Pedro; IBiS Institute of Biomedicine of Seville, University Hospital
Virgen del Rocío-CSIC-University of Seville, Spain,
Keywords: Muscle disease, Immunology (including allergy)

ly
https://mc.manuscriptcentral.com/jmedgenet
Page 1 of 42 Journal of Medical Genetics
1
2
3
4
5
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33
34
35
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2
3 Mutation in Cytochrome b gene of mitochondrial DNA in a family with
4
5 Fibromyalgia is associated with NLRP3-Inflammasome activation
6
7
8 Mario D. Cordero1,2, Elísabet Alcocer-Gómez3,4, Fabiola Marín-Aguilar1, Tatyana
Co
9
10 Rybkina5, David Cotán3,4, Antonio Pérez-Pulido3, José Miguel Alvarez-Suarez6,
11
12
Maurizio Battino7, José Antonio Sánchez-Alcazar3,4, Angel M. Carrión5, Ognjen Culic8,
nf
13
14
15 José M Navarro-Pando9, Pedro Bullón1,2
id
16
17 1
18
IBiS Institute of Biomedicine of Seville, University Hospital Virgen del Rocío-CSIC-
en
19 University of Seville, Spain
20
2
21 Research Laboratory, Oral Medicine Department, University of Sevilla, Sevilla, Spain
22
t
3
23 Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD), Universidad Pablo de Olavide-
ia
24 CSIC-Junta de Andalucía
25
26
l:
4
Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER),
27
28 ISCIII, Sevilla, Spain.
Fo
29 5
30 División de Neurociencias, Universidad Pablo de Olavide de Sevilla, Carretera de
31 Utrera Km. 1, Sevilla, Spain.
32
6
rR
33 Escuela de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Facultad de Ciencias de la Salud,

34 Universidad de Las Américas, Campus Udlapark, via a Nayón, Quito, Ecuador.
35
36 7
Dipartimento di Scienze Cliniche Specialistiche ed Odontostomatologiche – Sez.
37
ev
38 Biochimica, Università Politecnica delle Marche, 60100, Ancona, Italy.

39 8
40 Faculty of Pharmacy and Biochemistry, University of Zagreb, A. Kovacica 1, 10000
ie
41 Zagreb, Croatia.
42
43 9
Unidad de Reproducción Humana y Cirugía Endoscópica, Instituto para el Estudio de
w
44
la Biología de la Reproducción Humana (INEBIR).
45
46
Running Title: Mitochondrial diseases and inflammasome
On
47
48
49 All authors declare no Conflict of Interests
50
51 Word count: 3477
ly
52
53 † Corresponding Author:
54
55
Mario D. Cordero
56
57 IBiS Institute of Biomedicine of Seville, Universidad de Sevilla,
58 C/ Calle Antonio Maura Montaner s/n, 41013 –Sevilla, SPAIN.
59
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Cordero et al
1
2
3 Tel.: +34 954 481120
4 Fax: +34 954 486784
5
Email: mdcormor@us.es
6
7
8
Co
9
10 Abstract
11
12 Background: Fibromyalgia (FM) is a world-wide diffuse musculoskeletal chronic pain
nf
13
condition that affects up to 5% of the general population. Many symptoms associated
14
15 with mitochondrial diseases are reported in FM patients such as exercise intolerance,
id
16 fatigue, myopathy and mitochondrial dysfunction. In this study, we report a mutation
17 cytochrome b gene of mitochondrial DNA in a family with FM with inflammasome-
18
en
19 complex activation.
20
21 Methods: mtDNA from blood cells of five patients with FM were sequenced. We
22 clinically and genetically characterized a FM patient and family with a new mutation in
t
23 mtCYB. Mitochondrial mutation phenotypes were determined in skin fibroblasts and

ia
24
25
transmitochondrial cybrids.
26
l:
27 Results: After mtDNA sequence in FM patients, we found a mitochondrial

28 homoplasmic mutation m.15804T>C, in the mtCYB gene in a patient and family which
Fo
29 was maternally transmitted. Mutation was observed in several tissues and skin
30
fibroblasts showed a very significant mitochondrial dysfunction and oxidative stress.
31
32 Increased NLRP3-inflammasome complex activation was observed in blood cells from
rR
33 patient and family.

34
35 Conclusions: We propose further studies on mtDNA sequence analysis in FM patients
36 with evidences for maternal inheritance. The presence of similar symptoms in
37
ev
38 mitochondrial myopathies could unmask mitochondrial diseases among FM patients.

39 On the other hand, the inflammasome complex activation by mitochondrial dysfunction
40 could be implicated in the pathophysiology of mitochondrial diseases.
ie
41
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43
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44
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58
59
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1
2
3 Introduction
4
5
6 Mitochondria are essential organelles present in virtually all eukaryotic cells. One of the
7
8 primary functions of mitochondria is ATP production via the oxidative phosphorylation
Co
9
10 system through a series of reactions mediated by complexes encoded by both nuclear
11
12
and mitochondrial DNA (mtDNA) (1,2). Moreover, mitochondria play crucial roles in
nf
13
14
15 many other metabolic, regulatory and developmental processes and in a variety of
id
16
17 pathological mechanisms (2,3).
18
en
19
20 Fibromyalgia (FM) is a common chronic pain syndrome accompanied by other
21
22 symptoms such as fatigue, headache, sleep disorders, and depression. Despite the fact
t
23
ia
24
25
that it affects up to 5% of the general population worldwide, its pathogenic mechanism
26
l:
27 remains still largely elusive. In recent years, oxidative stress and mitochondrial
28
Fo
29 dysfunction have been found to be important in FM pathogenesis (4-6). Supporting

30
31 these hypothesis, cells from FM patients have reduced mitochondrial mass, reduced
32
rR
33
mitochondrial respiratory chain activity and impaired bioenergetics (6-12). Furthermore,
34
35
36 cytokines, especially IL1β, may play a role in FM (11-14) and ROS have also been
37
ev
38 shown to be an important activator of inflammasome-mediated inflammation (15).

39
40
Mutations in mtDNA have been associated with a wide range of human pathologies
ie
41
42
43 related with exercise intolerance, musculoskeletal and nervous system alterations (2).
w
44
45 To understand the implication of mtDNA in the pathophysiology of FM, we explored
46
On
47
48 alterations of mtDNA in peripheral blood mononuclear cells (BMCs) from five FM
49
50 patients. The current study describes a mutation in the cytochrome b gene (mtCYB), a
51
ly
52 mitochondrial DNA (mtDNA) gene, in one patient and several family members
53
54 diagnosed with FM. Functional analysis in cybrids cells carrying the mitochondrial
55
56
mutation revealed the pathogenic role of the mutation and the activation of
57
58
59
60 3
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1
2
3 inflammasome. Interestingly, NLRP3-inflammasome activation was observed in
4
5 Mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis, and stroke (MELAS)
6
7 syndrome with 3243 A>G mutation in the tRNALeu (UUR) gene, Myoclonic epilepsy
8
Co
9
10 with ragged-red fibers (MERRF) with 8344A>G mutation in the gene MT-TK, and
11
12 Leber hereditary optic neuropathy (LHON) with 11778G>A in the gene MT-ND4.
nf
13
14
15 MATERIAL AND METHODS
id
16
17
18 Ethical Statements
en
19
20
21 The approval of the ethical committee of University of Seville was obtained, according
22
t
23 to the principles of the Declaration of Helsinki and all the International Conferences on
ia
24
25 Harmonization and Good Clinical Practice Guidelines. All the participants into the
26
l:
27
28 study gave their written informed consent before initiating the study.
Fo
29
30
31 Reagents.
32
rR
33
34 Trypsin was purchased from Sigma Chemical Co., (St. Louis, Missouri). Anti-GAPDH
35
36 monoclonal antibody from Calbiochem-Merck Chemicals Ltd. (Nottingham, UK). Anti-
37
ev
38 NLRP3 antibody from Adipogen (San Diego, USA) and anti-IL-1β (p17) from Santa
39
40 Cruz Biotechnology. Anti-active caspase-1 was obtained from Cell Signaling
ie
41
42
43
Technology. A cocktail of protease inhibitors (complete cocktail) was purchased from
w
44
45 Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN). The Immun Star HRP substrate kit was from
46
Bio-Rad Laboratories Inc. (Hercules, CA).
On
47
48
49
50 Fibroblast cultures
51
ly
52 Patient and control fibroblasts were obtained according to the Helsinki Declarations of
53
54 1964, as revised in 2001. Fibroblasts were cultured in D-MEM media (4500 mg/L
55
56
57
glucose, L-glutamine, piruvate), (Gibco, Invitrogen, Eugene, OR, USA) supplemented
58
59
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1
2
3 with 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco, Invitrogen, Eugene, OR, USA) and
4
5 antibiotics (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Cells were incubated at 37ºC in
6
7 a 5% CO2 atmosphere.
8
Co
9
10 Mitochondrial disease fibroblasts
11
12 MELAS cultured fibroblasts were derived from a patient who harbored a heteroplasmic
nf
13
14 A to G mutation at nucleotide 3243 in the tRNALeu(UUR) gene. Clinically, the patient
15
id
16 had encephalopmyopathy, stroke-like episodes, and lactic acidosis, plus short stature,
17
18
deafness diabetes mellitus, dementia, and ataxia. The level of the m.3243G>A mutation
en
19
20
21 was 43% in fibroblasts. Molecular pathophysiology is described in reference 16.
22
t
23 Merrf cultured fibroblasts were derived from a patient harboring a heteroplasmic

ia
24
25 m.8344A>G mutation (57%). Molecular pathophysiology is described in reference 17.
26
l:
27 LHON cultured fibroblasts were derived from a patient harboring a 11778G>A

28
Fo
29
30 mutation which has not yet been characterized.
31
32
Biological samples
rR
33
34
35
36 Blood, urine, skin biopsy and saliva samples were collected from all of the probands
37
ev
38 and their maternal relatives. DNA was extracted from peripheral leukocytes by the
39
40 method of Miller et al. (1988) (18). The first morning urine sample of 30–40 ml was
ie
41
42 collected in a clean 50 ml centrifuge tube (produced by CORNING) and centrifuged at
43
w
44
45
1000 rpm for 10 min to obtain sediment. Total DNA was then extracted from urine, and
46
saliva by the silica method (19). Total skin DNA was obtained by the phenol–
On
47
48
49 chloroform extraction method.
50
51
ly
52 PCR Amplification and Sequencing

53
54
55
56
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58
59
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1
2
3 Complete mtDNA was amplified from total DNA in 24 overlapping 800–1,000-bp-long
4
5 PCR fragments. Primers were carefully designed using the revised human mitochondrial
6
7 DNA Cambridge reference sequence (www.mitomap.org/mitoseq.html).
8
Co
9
10 PCR fragments were sequenced in both strands in an ABI 3730 (Applied Biosystems;
11
12
www.appliedbiosystems.com; Foster City, CA) sequencer using a BigDye v3.1
nf
13
14
15 sequencing kit (Applied Biosystems; www.appliedbiosystems.com; Foster City, CA).
id
16
17 Assembling and identification of variations in the mitochondrial DNA was carried out
18
en
19 using the Staden package (20). For this purpose the revised human mitochondrial DNA
20
21
22
Cambridge reference sequence (www.mitomap.org/mitoseq.html) was used. The whole
t
23
ia
24 process was carried out at Secugen (Madrid, Spain).

25
26 Mitochondrial respiratory chain enzyme activities
l:
27
28 Activities of NADH:coenzyme Q1 oxidoreductase (complex I), succinate
Fo
29
30 deshydrogenase (complex II), ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase (complex III),
31
32
cytochrome c oxidase (complex IV), NADH: cytochrome c reductase (complex I+III),
rR
33
34
35 succinate:cytochrome c reductase (complex II +complex III) and citrate synthase (CS)
36
37 were determined on sonicated permeabilized fibroblasts using previously described
ev
38
39 spectrophotometric methods (21). Results are expressed as Units/CS (mean±SD).
40
ie
41
42
Proteins of fibroblast homogenates were analyzed by the Lowry procedure (22).
43
w
44 Western Blotting for mitochondrial protein

45
46 Whole cellular lysate from fibroblasts was prepared by gentle shaking with a buffer
On
47
48 containing 0.9% NaCl, 20 mM Tris-ClH, pH 7.6, 0.1% triton X-100, 1 mM
49
50 phenylmethylsulfonylfluoride and 0.01% leupeptine. Electrophoresis was carried out in
51
ly
52
53 a 10–15% acrylamide SDS/PAGE. Proteins were transferred to Immobilon membranes
54
55 (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). Proteins were electrophoresed, transferred to
56
57 nitrocellulose membranes and, after blocking over night at 4°C, incubated with the
58
59
60 6
Cordero et al
1
2
3 respective antibody solution, diluted at 1:1000. Membranes were then probed with their
4
5 respective secondary antibody (1:2500). Immunolabeled proteins were detected using a
6
7 chemiluminescence method (Immun Star HRP substrate kit, Bio-Rad Laboratories Inc.,
8
Co
9
10 Hercules, CA). Protein was determined by the Bradford method (23). Western blot
11
12 image was quantified using ImageJ software (see:
nf
13
14 http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html).
15
id
16 Measurement of CoQ levels
17
18
CoQ levels were performed using a method previously described by our group (11).
en
19
20
21
22
IL-1β and IL-18 levels
t
23
ia
24
25
IL-1β (GenWay, San Diego CA, USA) and IL-18 (Biosensis, Australia) levels in serum
26
l:
27 or culture mediums were assayed in duplicates by commercial ELISA kits.

28
Fo
29 ATP levels
30
31 ATP levels were determined by a bioluminescence assay using an ATP determination
32
rR
33
kit from Invitrogen-Molecular Probes (Eugene, OR, USA) following the instructions of
34
35
36 the manufacturer.
37
ev
38 Quantification of mtDNA
39
40 Nucleic acids were extracted from fibroblasts by standard cellular lysis. The primers
ie
41
42 used were: for mitochondrial DNA, mtF3212 (5'-CACCCAAGAACAGGGTTTGT-3')
43
w
44
45
and mtR3319 (5'-TGGCCATGGGTATGTTGTTAA-3') and those for nuclear DNA for
46
loading normalization, 18S rRNA gene 18S1546F (5'-
On
47
48
49 TAGAGGGACAAGTGGCGTTC-3') and 18S1650R (5'-
50
51 CGCTGAGCCAGTCAGTGT3'). Arbitrary units were computed as the ratio between
ly
52
53
the optical density band corresponding to the mitochondrial DNA studied in the 20–
54
55
56 30th cycle and that of the nuclear DNA in the 15th amplification cycle. One unit was
57
58 considered to be the ratio corresponding to the control patient. For live cell imaging of
59
60 7
Cordero et al
1
2
3 mtDNA, control and FM fibroblasts cells were cultured in dishes with a glass bottom
4
5 (MatTek Corporation, Ashland, MA) and stained with PicoGreen (3 l/ml) for 1 h at
6
7 37°C. TMRM (100 nM) staining was used to visualize mitochondria.
8
Co
9
10 Patients and cybrids mutation genotyping
11
12 Once DNA was extracted, PCR amplification of the mtCYB fragment containing the
nf
13
14 mutation, from 15700 to 16003 nucleotides of mtDNA, was performed using the
15
id
16 following primers: 5’-TCCATCAGGGTATCCTCTCC-3’ and 5’-
17
18
GGAGGCAAGCATAAGACTGG -3’, yielding a 300 bp product. Amplification
en
19
20
21 products were then digested with BbvI enzyme and fractionated in a 2.5% agarose gel.
22
t
23 After DNA gel electrophoresis non-mutant and mutant mtDNA fragments could be
ia
24
25 discriminated because in BbvI restriction assay they generated differential band patterns
26
l:
27 (non-mutant mtDNA: 300 bp fragment; and mutant mtDNA: 181 and 119 bp
28
Fo
29
30 fragments).
31
32 Mitochondrial ROS production
rR
33
34 Mitochondrial ROS generation in BMCs and fibroblasts was assessed by MitoSOX™
35
36 red, a red mitochondrial superoxide indicator. MitoSOX Red is a novel fluorogenic dye
37
ev
38
recently developed and validated for highly selective detection of superoxide in the
39
40
mitochondria of live cells. MitoSOX™ Red reagent is live-cell permeant and is rapidly
ie
41
42
43 and selectively targeted to the mitochondria. Once in the mitochondria, MitoSOX™
w
44
45 Red reagent is oxidized by superoxide and exhibits red fluorescence.
46
On
47
48 Flow cytometry. Approximately 1 x 106 cells were incubated with 1µM MitoSOXTM
49
50 red for 30 min at 37°C, washed twice with PBS, resuspended in 500 µl of PBS and
51
ly
52
53 analyzed by flow cytometry in an Epics XL cytometer, Beckman Coulter, Brea,
54
55 California, USA (excitation at 510 nm and fluorescence detection at 580 nm).
56
57
58 Oxygen consumption rate (OCR)
59
60 8
Cordero et al
1
2
3 Oxygen consumption rate (OCR) was assessed in real-time using the 24 well
4
5 Extracellular Flux Analyzer XF-24 (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA, USA)
6
7 according to the manufacturer’s protocol, which allows to measure OCR changes after
8
Co
9
10 up to four sequential additions of compounds. Cells (5 x104/well) were seeded for 16
11
12 hours in the XF-24 plate before the experiment in a DMEM/10% serum medium and
nf
13
14 then incubated for 24 hours with the different compounds studied. Before starting
15
id
16 measurements, cells were placed in a running DMEM medium (supplemented with 25
17
18
mM glucose, 2 mM glutamine, 1 mM sodium Pyruvate, and without serum) and pre-
en
19
20
21 incubated for 20 min at 37°C in the absence of CO2 in the XF Prep Station incubator
22
t
23 (Seahorse Bioscience, Billerica MA, USA). Cells were transferred to an XF-24

ia
24
25 Extracellular Flux Analyzer and after an OCR baseline measurement a profiling of
26
l:
27 mitochondrial function was performed by sequential injection of four compounds that

28
Fo
29
30 affect bioenergetics, as follows: 55 µl of oligomycin (final concentration 2.5 µg/mL) at
31
32 injection in port A, 61 µl of 2,4-dinitrophenol (2,4-DNP) (final concentration 1 mM) at
rR
33
34 injection in port B, and 68 µl of antimycin/rotenone (final concentration 10 µM/1µM) at
35
36 injection in port C. A minimum of five wells were utilized per condition in any given
37
ev
38
experiment. Data are expressed as pMol of O2 consumed per minute normalized to 1000
39
40
cells (pMol O2/1000 cells/min).
ie
41
42
43
w
44 Structure and sequence conservation analysis

45
46
To obtain the structure for both CYB and COXIII proteins, the Swiss-Model server was
On
47
48
49 used (24) with default parameters and they were visualized with the Rasmol program.
50
51 Logo diagrams were created using Skylign to show the residue conservation in the
ly
52
53
surroundings of the studied mutation (25).
54
55
56
Statistical Analysis
57
58
59
60 9
Cordero et al
1
2
3 Data in figures is given as mean ± SD. Data between different groups were analyzed
4
5 statistically by using ANOVA on Ranks with Sigma Plot and Sigma Stat statistical
6
7 software (SPSS for Windows, 19, 2010, SPSS Inc. Chicago, IL, USA). For cell-culture
8
Co
9
10 studies, Student’s t test was used for data analyses. A value of p<0.05 was considered
11
12 significant.
nf
13
14
15 Results
id
16
17
18 To assess if mitochondrial dysfunction is associated with mutations in mitochondrial
en
19
20 genes in FM, mtDNA from blood cells of five patients with FM and intolerance exercise
21
22 were sequenced. Mean age of the FM group was 44 ± 2 years. The mean duration of
t
23
ia
24
25
symptoms in the FM group was 6.2 ± 1.7 years. Clinical data are shown in Table S1.
26
l:
27 Sequence analysis of the entire mitochondrial genome revealed several known

28
Fo
29 polymorphic variants similar in all patients compared with the revised Cambridge
30
31 Reference Sequence (Table S2), and one homoplasmic mutation in patient 3:
32
rR
33
m.15804T>C, in the mtCYB gene, predicting the substitution of the valine at codon 353
34
35
36 with an alanine (p.V353A). This is the only suspected change observed in patient 3 and
37
ev
38 family not observed in other patients and controls. It was absent in the other 60 patients
39
40 and 40 controls, suggesting that it could be associated to the disease in this particular
ie
41
42 family.
43
w
44
45 We next analyzed the pathological implications of this mutation in patient 3 and her
46
On
47
48 family.
49
50
51 Molecular analysis
ly
52
53
54 The T→C transition in patient 3 generated a new restriction site for the BbvI enzyme
55
56 that allowed us to design a PCR assay for the diagnosis of the m.15.805 mutation (Fig,
57
58 1A). Molecular analysis in patient 3, a woman of 45 years old, showed that the 15804
59
60 10
Cordero et al
1
2
3 mutation was homoplasmic in blood cells, urine, and saliva samples (Fig. 1B). In
4
5 addition, we evaluated several patient 3 family members from three generations (Fig.
6
7 1C). The pedigree clearly showed a typical pattern of maternal inheritance.
8
Co
9
10 Furthermore, the mutation was present in several members with typical clinical
11
12 manifestation of FM whose diagnosis was established by an experienced rheumatologist
nf
13
14 according to ACR criteria. Laboratory evaluation in patient 3 was normal, including
15
id
16 blood lactate, electrolytes, creatine kinase, and lipid profile (Table S3).
17
18
en
19 Pathophysiological studies
20
21
22 Consistent with the fact that the new mutation was detected in a complex III protein,
t
23
ia
24
25
skin fibroblasts from patient 3 showed reduced levels of complex III activity (Figure
26
l:
27 2A) associated with CoQ10 deficiency (Figure 2B), reduced ATP levels, high levels of
28
Fo
29 mitochondrial ROS, reduced mtDNA contents (Figure 2C-E) and low rate proliferation
30
31 of the cells (Figure 2F). Evaluation of the effect of the amino acid change on the
32
rR
33
protein structure showed that the mutation (yellow) was localized in an opposite area of
34
35
36 the ubiquinone binding site (green) (Figure 2G). Similar pathophysiological alterations
37
ev
38 was observed in other biological samples from patient 3 such as blood cells, urine,
39
40 saliva samples and platelets (Table S4).
ie
41
42
43 Mitochondrial dysfunction in FM fibroblasts was also assessed by a reduced oxygen
w
44
45 consumption rate (OCR) determined by exposition of cells sequentially to each of four
46
On
47
48 modulators of oxidative phosphorylation (OXPHOS) such as oligomycin (an inhibitor
49
50 of F1Fo-ATPase or complex V), 2,4-DNP (uncoupling of the OXPHOS electron
51
ly
52 transport chain) and antimycin/rotenone (complex I and III inhibitors respectively)

53
54 (Figure 2H-J).
55
56
57
58
59
60 11
Cordero et al
1
2
3 Under oxidative stress conditions, mitochondria can be damaged resulting in cellular
4
5 dysfunction and inflammation (11). Inhibition of complex I or III of the mitochondrial
6
7 respiratory chain has been shown to induce ROS production and NLRP3 inflammasome
8
Co
9
10 activation (15,26,27). Therefore, we analyzed the activation of inflammasome related
11
12 proteins in patient 3 samples. We found increased NLRP3, active caspase 1 (p20) and
nf
13
14 IL-1β (p17) protein expression levels in patient 3 fibroblasts (Figure 3A) and increased
15
id
16 levels of IL-1β and IL-18 in serum from the patient suggesting inflammasome
17
18
activation (Figure 3B and C). To examine the effect of inflammasome activation in cell
en
19
20
21 metabolism, patient 3 fibroblasts were treated with 16673-34-0 (5-chloro-2-methoxy-N-
22
t
23 [2-(4-sulfamoylphenyl)ethyl] benzamide (Fig 3D), a new specific inhibitor of NLRP3

ia
24
25 (28), and cellular growth was evaluated. Inhibition of NLRP3 induced an increase of
26
l:
27 cell growth in patient fibroblasts (Figure 3D). Interestingly, blood mononuclear cells
28
Fo
29
30 (BMCs), lymphocytes and monocytes, from the family members harboring the mutation
31
32 also showed increased IL-1β (p17) protein expression levels as well as increased L-1β
rR
33
34 serum levels (Figure 3E and F). We also analyzed the activation of NLRP3-
35
36 inflammasome in fibroblasts from other mitochondrial diseases such as MELAS, Merrf
37
ev
38
and LHON. Our data show increased NLRP3 and IL-1β (p17) protein expression levels
39
40
in fibroblasts from these diseases (Figure 3G).
ie
41
42
43
w
44 To confirm the pathological condition of this mutation independently of the nuclear

45
46 background, we generated transmitochondrial cell lines (cytoplasmic hybrids or
On
47
48 cybrids) using the osteosarcoma 143B206 rho0 cell line (29) and platelet mitochondria
49
50 from patient 3. Control cybrids were also generated by using platelet mitochondria from
51
ly
52
53 healthy individual. Then, we confirmed that control and mutant cybrids clones harbored
54
55 mtDNA from the corresponding donor platelets (Figure 4A). Complex III activity and
56
57 ATP levels in mutant cybrids were lower than in control cybrids (Figure 4B and C).
58
59
60 12
Cordero et al
1
2
3 Mitochondrial ROS levels in mutant cybrids were also significantly higher than in
4
5 control cybrids (Figure 4D). Interestingly, active caspase 1 (p20) and IL-1β (p17)
6
7 protein expression levels were increased in mutant cybrids (Figure 4E). These results
8
Co
9
10 strongly suggest that the mutated mtDNAs are indeed responsible for the biochemical
11
12 alterations occurring in patient cells.
nf
13
14
15 CoQ10 deficiency has been commonly associated with mitochondrial diseases (30), and
id
16
17 its supplementation has been documented as an effective treatment in several clinical
18
en
19 cases (31,32,33). Given that we previously showed that CoQ10 treatment induces a
20
21
22
marked clinical improvement in FM patients (34,35), and considering the favorable
t
23
ia
24 effects of CoQ10 on pathological cells, the patient started oral treatment with CoQ10
25
26 (5mg/Kg/day). After 7 months, the patient showed a significant improvement in FM
l:
27
28 clinical symptoms associated with restoration of altered biochemical parameters to
Fo
29
30
normal levels (Table S4).
31
32
rR
33
Structure and amino acid sequence analysis
34
35
36
The mutation in CYB protein substitutes a partially conserved valine residue with an
37
ev
38
39 alanine. This is a conservative change which does not seem to impair the function or
40
structure. But this same change has been previously found in another protein of the
ie
41
42
43 mitochondrial respiratory chain, COXIII, where it was associated with Leigh syndrome
w
44
45 (36). Comparing the residues around the change and their conservation, we showed that
46
On
47
48 there is a high similarity in that region between both proteins (Figure 5). In both
49
50 proteins the valine residue appears in the middle of a trans membrane helix enriched in
51
ly
52 hydrophobic residues with similar characteristics.

53
54
55 Discussion
56
57
58
59
60 13
Cordero et al
1
2
3 Mitochondrial disorders are an important group of genetic conditions characterized by
4
5 impaired oxidative phosphorylation and bioenergetics which present a great variability
6
7 of symptoms, organ involvement, and clinical course. Furthermore, these diseases
8
Co
9
10 considerably impact the quality of life of the patients and quite often shorten their life
11
12 expectancy. Many symptoms associated with mitochondrial diseases are commonly
nf
13
14 presented in FM patients: exercise intolerance, fatigue, myopathy and various
15
id
16 neurological complaints (37).
17
18
en
19 Moreover, mitochondrial diseases have been usually related to maternal inheritance (2).
20
21
22
However, in FM patients, although the inheritance factor has been documented, the
t
23
ia
24 absence of known pathogenic mechanisms complicates family studies. Familial

25
26 aggregation studies revealed high possibilities of inherited factors in FM. Thus, Arnold
l:
27
28 and coworkers compared FM with other pain diseases such as arthritis rheumatoid and
Fo
29
30 they found a higher inherited factor in the FM group (38). In this respect, Buskila and
31
32
coworkers observed a high prevalence with FM among offspring of FM mothers (39).
rR
33
34
35 Supporting these findings, in our study we show for the first time a mutation in mtDNA
36
37 in a family diagnosed of FM. As expected, the mutation was maternally transmitted and
ev
38
39 was present in all family members with typical clinical manifestation of FM.
40
ie
41
42
Pathophysiological studies showed evidences of a mitochondrial dysfunction in patient
43
w
44 cells that was restored by CoQ10 treatment. The mutation was absent in the other
45
46 patients and healthy controls included in the study so, although more healthy controls
On
47
48 must be examined to confirm these results, our data suggests that it could be associated
49
50 to the disease in this family. The mutation found in our study converted a highly
51
ly
52
53 conserved valine at position 353 to alanine in the transmembrane functional domain of
54
55 mtCYB, which could affect transfer of electrons from ubiquinol (reduced CoQ10) to
56
57
58
59
60 14
Cordero et al
1
2
3 cytochrome c, impair the utilization of energy to translocate protons from inside the
4
5 mitochondrial inner membrane the outside and increases ROS production (40).
6
7
8 Mitochondrial dysfunction in FM has been widely documented. Thus, studies in muscle
Co
9
10 biopsies have demonstrated the presence of inflammatory markers, subsarcolemmal
11
12
mitochondrial accumulation, abnormal mitochondria, higher incidence of ragged red
nf
13
14
15 fibers, and defects of cytochrome-c-oxidase (complex IV of oxidative phosphorylation)
id
16
17 (41,42,43). It is interesting to mention that ragged red fibers, subsarcolemmal
18
en
19 mitochondrial accumulation and alteration in ultrastructure, number and size of
20
21
22
mitochondria are typical defects and markers found in genuine mitochondrial diseases
t
23
ia
24 (such as MELAS, MERRF, Kearns-Sayre syndrome, Pearson syndrome, Leigh

25
26 syndrome, etc) (2). Recently, we have studied mitochondrial dysfunction in skin
l:
27
28 fibroblasts from FM patients (44). Despite a marked mitochondrial impairment in FM
Fo
29
30 patient cells, the mtDNA sequence analysis did not show any important alterations such
31
32
as mutations or deletions that could justify the mitochondrial defects. Therefore, it is
rR
33
34
35 reasonable to postulate that mitochondrial DNA alterations can be only detected in a
36
37 reduced subgroup of patients diagnosed of FM. Mitochondrial dysfunction is implicated
ev
38
39 in many diseases in a direct or indirect form (1,2). Mitochondrial diseases are a group of
40
ie
41
42
diseases with a reduced prevalence (5.7 per 100,000 in the population over 14 years of
43
w
44 age) (45), and the symptoms can be confounded with other diseases and frequently
45
46 labelled as fibromyalgia or chronic fatigue syndrome (46). In this respect, Villanova and
On
47
48 coworkers reported in 1999 the case of a 45-year-old woman with FM and mtDNA
49
50 deletion of about 4 kb and propose the presence of patients with mitochondrial diseases
51
ly
52
53 among labelled FM patients (47). In this sense, our data confirm this previous report in
54
55 a new family case.
56
57
58
59
60 15
Cordero et al
1
2
3 In this study, we also propose the implication of the inflammasome complex in the
4
5 pathophysiology of mitochondrial diseases. Inflammasome has emerged recently as an
6
7 unexpected sensor for metabolic stress and it has been implicated in several diseases in
8
Co
9
10 which mitochondria play a central pathogenic role (48). Inhibition of complex I or III of
11
12 the mitochondrial respiratory chain has been shown to induce ROS production and
nf
13
14 NLRP3 inflammasome activation (15). Furthermore, inflammation has been proposed to
15
id
16 participate in the pathophysiological mechanisms of mitochondrial disorders (49). In
17
18
addition, inflammatory events has been observed in patients with a 3251A > G mutation
en
19
20
21 supporting the hypothesis that mitochondrial diseases induce a pathologic inflammatory
22
t
23 response (50). In this sense, we show the inflammasome activation implicated with
ia
24
25 fibroblasts of three known mitochondrial diseases with mutation in Complex I,
26
l:
27 mitochondrial tRNALeu(UUR) gene and MT-TK genes and our new mutation. So,
28
Fo
29
30 NLRP3-inflammasome could be induced for different mitochondrial mutations in which
31
32 oxidative stress has been involved. Another interesting result showed in this study is the
rR
33
34 effect of the NLRP3 inhibition in the fibroblasts from the patient. A correct cell growth
35
36 is an important marker of metabolic status in the cell. Fibroblasts from mitochondrial
37
ev
38
diseases have been shown to have a relatively reduced growth (51), so the increment of
39
40
cell growth of the fibroblasts from patient 3 is shows a possible improvement in cellular
ie
41
42
43 metabolism. Furthermore, this improvement demonstrates that inflammasome activation
w
44
45 has a pathophysiological role in the phenotype of fibroblasts from patient 3. As
46
On
47 inflammation has been shown to induce mitochondrial dysfunction (11), an inhibition of

48
49
50 several cytokines could prevent mitochondrial damage and cell death. According to this,
51
ly
52 the inhibition of inflammasome could be a new pharmacological target in mitochondrial

53
54 diseases.
55
56
57
58
59
60 16
Cordero et al
1
2
3 We have to take account that 15804T>C polymorphism is a rare variant identified in
4
5 20/29,867 sequences in Mitomap’s GeneBank set (www.mitomap,org). Epidemiologic
6
7 studies have associated mitochondrial haplogroups to mitochondrial diseases.
8
Co
9
10 Therefore, it is very difficult to find the etiology of these diseases due to its
11
12 multifactorial facet in which we find the combination of genetic and environmental
nf
13
14 factors (52). All these factor individually contribute only in a small part to the
15
id
16 development of the illness. Thus, the haplogroup-defining mutations might behave as
17
18
susceptibility factors, but they could have only a small effect on the physiopathology.
en
19
20
21 Because the effects of these changes would be highly dependent on the ‘context’ in
22
t
23 which the genetic variant is acting, the activation of inflammatory events could help to
ia
24
25 explain the pathological context induced by a haplogroup-defining mutations. In this
26
l:
27 respect, a cellular approach is available that involves the use of what is known as
28
Fo
29
30 ‘cybrids’ (52). In our study, cybrids showed the same pathophysiological events of
31
32 fibroblasts and inflammasome activation.
rR
33
34
35 The most significant implication of these data could be the potential role of
36
37 inflammasome complex activation and the subsequent IL-1β release in the different
ev
38
39 affected tissues in mitochondrial diseases (brain, muscle, kidney, heart, eye) (53,54).
40
ie
41
42
Probably, a high content of defective mitochondria could induce NLRP3-inflammasome
43
w
44 activation by increased ROS production. In this sense, inflammasome inhibition could

45
46 represent an interesting new therapeutic option in mitochondrial diseases. However,
On
47
48 taken into account that ROS serve as important inflammasome activating signals,
49
50 antioxidant treatment can also be effective in these diseases (54). Pharmacological
51
ly
52
53 approach in mitochondrial diseases is based on removing noxious metabolites, using
54
55 reactive oxygen species scavengers and administering different compounds as CoQ10
56
57 (55). Indeed, mitochondria-targeted lipophilic antioxidants selectively block
58
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1
2
3 mitochondrial oxidative damage and prevent some types of cell death. Consequently,
4
5 inflammasome complex which is activated by mitochondrial ROS production could be
6
7 selectively inhibited by lipophilic antioxidants. Interestingly, it has been reported that
8
Co
9
10 CoQ10 inhibits NLRP3-inflammasome activation in FM patients (12). Furthermore,
11
12 MitoQ, a mitochondria-targeted derivative of CoQ10, has also been reported to inhibit
nf
13
14 NLRP3-inflammasome (56). As CoQ10 is a common treatment for mitochondrial
15
id
16 diseases (30,31,32,57,58), here we report another potential mechanism by which CoQ10
17
18
treatment can be effective in these patients.
en
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21
22
In conclusion, we propose the indication of mtDNA sequence analysis in FM patients
t
23
ia
24 with evidences for maternal inheritance. The presence of symptoms similar to

25
26 mitochondrial myopathies could unmask mitochondrial diseases among FM patients
l:
27
28 who could benefit from genetic diagnostic testing by mtDNA sequence analysis and be
Fo
29
30 elegible for treatment with CoQ10 and/or another mitochondrial targeting compound.
31
32
Furthermore, the implication of inflammasome complex as a stress sensor could to
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33
34
35 encourage the damage and impairing the symptoms in mitochondrial diseases.
36
37
ev
38 Acknowledgments
39
40 This work has been supported by Federación Andaluza de Fibromialgia y Fatiga
ie
41
42 Crónica (ALBA Andalucía), Federación Onubense de Fibromialgia y Fatiga Crónica,
43
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grants from the Fundación Ramón Areces and DGICYT (Departamento Gubernamental
46
de Investigaciones Científicas y Tecnológicas: BFU2011-27207), Grupo de
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49 Investigacion Junta de Andalucia CTS113 and Consejería de Salud of the Junta de
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51 Andalucia (PI-0036-2014).
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56 Conflict of Interest: The authors report no conflict of interest.
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3 Author Contributions
4
5
6 P.B. and M.D.C. conceived of the study and wrote the manuscript. E.A.G., F.M.A.,
7
8 T.R., J.M.N.P., and D.C. performed cell experiments. J.A.S.A. and A.P.P performed
Co
9
10 bioinformatics approximation. J.M.A.S. and M.B. performed oxygen consumption rate
11
12
and bioenergetics experiments. A.M.C., and O.C. performed cybrids experiments. P.B.
nf
13
14
15 and M.D.C. conducted patient evaluations. All authors analyzed and discussed data and
id
16
17 commented on the manuscript.
18
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rR
33
34 mediated inflammatory cytokines. BMC Med 2013;11:178.
35
36 58. Montini G, Malaventura C, Salviati L. Early coenzyme Q10 supplementation in
37
ev
38
primary coenzyme Q10 deficiency. N Engl J Med 2008;358:2849-50.
39
40
ie
41
42
43
w
44
45
46 Figure legends
On
47
48
49 Figure 1. Genotyping analysis of mtCYB mutation. A, Illustration of the mutation
50
51 found in patient 3 mtCYB gene. The transition m15.804 C→T generates a new
ly
52
53 restriction site (GCAGC) for the BbvI enzyme. PCR amplification of genomic DNA
54
55 samples of patient 3 and patient without m15.803 C→T mutation with specific primers
56
57
58 followed by digestion of the amplification products with the BbvI enzyme allows to
59
60 27
Cordero et al
1
2
3 identify a haplotype specific pattern by DNA agarose gel electrophoresis. B, Molecular
4
5 analysis in patient 3 showed that the m15.804 mutation was homoplasmic in blood cells,
6
7 urine, and saliva samples. C, Pedigree analysis of patient 3 family along three
8
Co
9
10 generations. Black and white symbols denote people with or without FM symptoms,
11
12 respectively. Squares: man, circles: woman.
nf
13
14
15 Figure 2. Pathophysiology of mutant fibroblasts from patient 3. A, Respiratory
id
16
17 complex activity in fibroblasts from patient 3 compared to control. B, CoQ10 levels were
18
en
19 measured by high-performance liquid chromatography, as described in Materials and
20
21
22
Methods. C, Bioenergetic levels of fibroblasts showed by ATP determination. D,
t
23
ia
24 Mitochondrial ROS production was analyzed in fibroblasts by flow cytometry as

25
26 described in Material and Methods. E, Reduced mtDNA contents in fibroblasts from
l:
27
28 FM patient compared with healthy control. F, Cell growth with CoQ10 determined in
Fo
29
30 healthy and FM fibroblasts. G, The three dimensional structure of the human mtCYB
31
32
show mutation (yellow) localized in area opposite the ubiquinone binding site (green).
rR
33
34
35 H, OCR was monitored through Seahorse XF-24 Extracellular Flux Analyzer with the
36
37 sequential injection of Oligomycin (1 µg/mL), 2,4-DNP (100 µM), Rotenone (1 µM) at
ev
38
39 the indicated time point into each well, after baseline rate measurement. I, The basal
40
ie
41
42
OCR was markedly affected in cells from patient, and improved with CoQ10. J, The
43
w
44 spare respiratory capacity (SRC) in FM fibroblasts showed a significant decrease. Data

45
46 represent the mean – SD of three separate experiments. *p < 0.001; **p < 0.005
On
47
48 between controls and FM patient.
49
50
51 Figure 3.- Inflammasome activation in fibroblasts and pro-inflammatory cytokines
ly
52
53
in serum from FM patient. A, NLRP3 protein levels, active caspase 1 (p20) and IL-1β
54
55
56 (p17) were analysed by Western blotting. Protein levels were determined by
57
58 densitometric analysis (IOD, integrated optical intensity) of three different western blots
59
60 28
Cordero et al
1
2
3 and normalized to GADPH signal compared with a pool of 5 healthy age- and sex-
4
5 matched control subjects. B and C, IL-1β and IL-18 levels in serum from control and
6
7
FM patient were determined by ELISA as described in Material and Methods. D, Cell
8
Co
9
10 growth with CoQ10 determined in healthy and FM fibroblasts. E and F, IL-1β (p17)
11
12 levels in blood mononuclear cells (BMCs), lymphocytes and monocytes and IL-1β
nf
13
14 serum levels were determined in several members of three generations from the
15
id
16
17
patient´s family. Pedigree image shows affected family members with the mutation.
18
en
19 Squares: man, circles: woman. G, NLRP3 protein levels and IL-1β (p17) were analyzed
20
21 in fibroblasts from MELAS, Merrf and LHON by Western blotting. Protein levels were
22
t
23 determined by densitometric analysis (IOD, integrated optical intensity) of three

ia
24
25
different western blots and normalized to GADPH signal compared with a pool of 5
26
l:
27
28 healthy age- and sex-matched control subjects. Data represent the mean±SD of three
Fo
29
30 separate experiments. *p < 0.001; **p < 0.005 between controls and FM patient.
31
32
rR
33 Figure 4. Genotyping analysis of cybrids. A, Molecular analysis of cybrids generated

34
35 from osteosarcoma 143B206 rho0 cell line (C), as the common nuclear background, and
36
37
ev
platelets from patient 3 (cy 1 and 2). The m15.804 mutation only was introduced in cy2
38
39
40 cells. B, Mitochondrial complex III activity, C, Cellular bioenergetics of mutant cybrids
ie
41
42 was assessed by ATP determination. D, Mitochondrial ROS production was analyzed in
43
w
44 cybrids by flow cytometry as described in Material and Methods. E, Active caspase 1

45
46 (p20) and IL-1β (p17) were analysed by Western blotting. Data represent the mean – SD
On
47
48
of three separate experiments. *p < 0.001 between controls and FM cybrids.
49
50
51
ly
52
Figure 5. Conservation and structure similarity of the mutation VaL-Ala between
53
54 CYB and COXIII. A, Logos showing the conservation of the mutation surrounding (6
55
56 residues on each side) the two proteins. The height of the stack corresponds to the
57
58 conservation at that position (information content), and the height of each letter is
59
60 29
Cordero et al
1
2
3 related on the frequency of that letter at that position. The occupancy is the probability
4
5 of observing a letter at one position, and the insert probability and length depends on
6
7 putative inserts in the alignment. The mutation appears in different Pfam domains from
8
Co
9
10 the two proteins: Cytochrome b C-terminal for CYB, and Cytochrome C oxidase
11
12 subunit III for COXIII. B, Enlarged mutation position showing residue probability. C,
nf
13
14 Region structure from the two proteins, corresponding to part of a transmembrane helix.
15
id
16 The valine residue is highlighted in red color.
17
18
en
19 .
20
21
22
t
23
ia
24
25
26
l:
27
28
Fo
29
30
31
32
rR
33
34
35
36
37
ev
38
39
40
ie
41
42
43
w
44
45
46
On
47
48
49
50
51
ly
52
53
54
55
56
57
58
59
60 30
1
2
3
4
5
6
7
8
Co
9
10
11
12
nf
13
14
15
id
16
17
18
en
19
20
21
22
t
23
ia
24
25
26
l:
27
28
Fo
29
30
31
32
rR
33
34
35
36 190x158mm (300 x 300 DPI)
37
ev
38
39
40
ie
41
42
43
w
44
45
46
On
47
48
49
50
51
ly
52
53
54
55
56
57
58
59
60
1
2
3
4
5
6
7
8
Co
9
10
11
12
nf
13
14
15
id
16
17
18
en
19
20
21
22
t
23
ia
24
25
26
l:
27
28
Fo
29
30
31
32
rR
33
34
35
36
37
ev
38
39
40
ie
41
42
43
w
44
45
46
229x269mm (300 x 300 DPI)
On
47
48
49
50
51
ly
52
53
54
55
56
57
58
59
60
1
2
3
4
5
6
7
8
Co
9
10
11
12
nf
13
14
15
id
16
17
18
en
19
20
21
22
t
23
ia
24
25
26
l:
27
28
Fo
29
30
31
32
rR
33
34
35
36
37
ev
38
39
40
ie
41
42
43
w
44
45
46
229x270mm (300 x 300 DPI)
On
47
48
49
50
51
ly
52
53
54
55
56
57
58
59
60
1
2
3
4
5
6
7
8
Co
9
10
11
12
nf
13
14
15
id
16
17
18
en
19
20
21
22
t
23
ia
24
25
26
l:
27
28
Fo
29
30
31
32
rR
33
34
35
36
37
ev
38
39
40
ie
41
42
43
w
44
45
46
229x270mm (300 x 300 DPI)
On
47
48
49
50
51
ly
52
53
54
55
56
57
58
59
60
1
2
3
4
5
6
7
8
Co
9
10
11
12
nf
13
14
15
id
16
17
18
en
19
20
21
22
t
23
ia
24
25
26
l:
27
28
Fo
29
30
31
32
rR
33
34
35
36
37
ev
38
39
40
ie
41
42
43
w
44
45
46
On
47
48
49
50
51
ly
52
53
54
55
56
57
58
59
60
1
2
3
4
5
6 Co
Table S1. Symptomatic parameters in FM patients.
7
8
nf
Parameter Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Patient 5
9
10
11
Age (years)
Tender points
ide 45
15
46
14
43
12
41
11
45
13
nt
12
13 Disease duration (years) 6 8 5 4 8
ial
14
15 Sex Female Female Female Female Female
16 BMI (kg/m )2
23.2 22.9 24.9 22.1 23.8
17
18
19
FIQ Total score, range 0-80
:F
68 70 66 71 75
or
20
Pain 7 6 8 4 5
21 Fatigue 8 9 7 8 6
22
23
24
25
Morning tiredness
Stiffness
8
7
8
8 Re 5
9
4
9
5
5
26
27
28
Anxiety
Depression
7
7
10
6 vie
6
7
7
2
2
2
29
30
VAS Pain Total score 0-10 7 6 8
w 7 6
On
31
32
33
ly
34 BMI, Body Mass Index; FIQ, Fibromyalgia Impact Questionnaire; VAS, Visual Analogical Scale.
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45 https://mc.manuscriptcentral.com/jmedgenet
46
47
1
2
3 Table S2. Summary of sequencing results in blood cells from FM patients.
4
5
6 FM1 FM2 FM3 FM4 FM5
7 MT-RNR1 A750G G709A A750G G709A A750G
8 A1438G A750G A1438G A750G A1438G
9 A1438G A1438G
Co
10 MT-RNR2 G3010A G1888A G1888A
11 A2706G A2706G
12
13 MT-ND1 G3834A G3834A
14 T4216C T4216C
nf
15 MT-ND2 A4769G A4769G A4769G A4769G A4769G
16 A4917G A4917G
17 T5105C T5105C
id
18
MT-TW
19
20 MT-CO1 C7028T T6776C C7028T T6776C
en
21 MT-CO2 A8014G
22 MT-ATP6 A8860G G8697A A8860G G8697A A8860G
23 A8701G A8701G
24
tia
A8860G A8860G
25
26
MT-CO3
27 MT-ND4 A11251G A11251G
28 G11719A G11719A
l:
29 MT-ND5 C12633A C12633A

30 G13368A G13368A
31
Fo
MT-CYB A15326G C14766T A15326G C14766T A15326G

32
33
G14905A T15804C G14905A
34 A15326G A15326G
35 C15452A C15452A
rR
36 A15607G A15607G
37 MT-TT G15928A G15928A
38 MT-DLOOP T16519C T16126C T16519C T16126C T16519C
39
A263G A16163G A263G A16163G A263G
ev
40
41 302insCC- C16186T T152C C16186T T152C
42 CCC T16189C 310insC T16189C 310insC
43 310insC C16294T C16294T
iew
44 514inCA T16519C T16519C

45 A73G A73G
46
A263G A263G
47
48 302insCC 302insCC
49 310insC 310insC
On
50 514inCA 514inCA
51
52
53
54
ly
55
56
57
58
59
60
1
2
3 Table S3. Serum biochemical parameters in FM patient 3.
4
5
6 Biochemical parameter Patient Range
7 Glucose (mg/dL) 99 76-110
8
9 Urea (mg/dL) 17 10-50
Co
10
11 Total protein (g/dL) 6.8 6.6-8.7
12
13 Na (mEq/L) 142 135-145
14
nf
15
K (mEq/L) 4.2 3.5-5
16 Uric acid (mg/dL) 3.9 2.4-5.7
17
id
18 Creatinine (mg/dL) 0.71 0.5-0.9

19
20 Ca (mg/dL) 9.4 8.5-10.5
en
21
22 Phosphate (mg/dL) 3.44 2.7-4.5
23 Bilirubin (mg/dL) 0.39 0.2-1
24
tia
25 Alcaline phosphatase (U/L) 55 35-104

26
27 Aspartate aminotransferase (mU/mL) 21.9 5-37
28
l:
29 Alanine aminotransferase (mU/mL) 23.5 5-41

30
Creatine kinase (U/L) 73 10-190
31
Fo
32 Cholesterol (mg/dL) 155 80-200

33
34 HDL Cholesterol (mg/dL) 65 50-100
35
rR
36 LDL Cholesterol (mg/dL) 69 <120

37
38
Triglycerides (mg/dL) 50 50-150
39
ev
40
41
42
43
iew
44
45
46
47
48
49
On
50
51
52
53
54
ly
55
56
57
58
59
60
1
2
3 Table S4. Biochemical data in several biological samples from patients 3. Data show
4
5 percentage of change respect to controls.
6
7 Blood cells Urine cells Salivary cells Platelets
8 Complex III 49% 28% 33% 45%
9 CoQ10 40% 31% 60% 50%
Co
10 ATP 42% 36% 36% 70%
11
mtDNA/nDNA 37% 30% 32% 47%
12
13
14
nf
15
16
17
id
18
19
20
en
21
22
23
24
tia
25
26
27
28
l:
29
30
31
Fo
32
33
34
35
rR
36
37
38
39
ev
40
41
42
43
iew
44
45
46
47
48
49
On
50
51
52
53
54
ly
55
56
57
58
59
60
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Co
10
11
12
13
14
nf
15
16
17
id
18
19
20
en
21
22
23
24
tia
25
26
27
28
l:
29
30
31
Fo
32
33
34
35
rR
36
37
38
39
ev
40
41
42
43
iew
44
45
46
47 Figure S1. Pathophysiology of mutant fibroblasts from patient 3 after CoQ10
48
49 treatment. A, CoQ10 levels were measured by high-performance liquid
On
50 chromatography, as described in Materials and Methods. B, Bioenergetics levels of

51 fibroblasts showed by ATP determination. C, Mitochondrial ROS production was
52
53 analyzed in fibroblasts by flow cytometry as described in Material and Methods. D,
54 Reduced mtDNA contents in fibroblasts from FM patient compared with healthy
ly
55 control. E, Cell growth with CoQ10 determined in healthy and FM fibroblasts. F, OCR
56
57 was monitored through Seahorse XF-24 Extracellular Flux Analyzer with the sequential
58 injection of Oligomycin (1 μg/mL), 2,4-DNP (100 μM), Rotenone (1 μM) at the
59
indicated time point into each well, after baseline rate measurement. G, The basal OCR
60
was markedly affected in cells from patient, and improved with CoQ10. H, The spare
respiratory capacity (SRC) in FM fibroblasts showed a significant decrease which was
1
2
3 improved by CoQ10. Data represent the mean – SD of three separate experiments. *p <
4
5 0.001; **p < 0.005 between controls and FM patient. ap < 0.001 between FM patients
6 and treatment with CoQ10
7
8
9
Co
10
11
12
13
14
nf
15
16
17
id
18
19
20
en
21
22
23
24
tia
25
26
27
28
l:
29
30
31
Fo
32
33
34
35
rR
36
37
38
39
ev
40
41
42
43
iew
44
45
46
47
48
49
On
50
51
52
53
54
ly
55
56
57
58
59
60
1
2
3
4
5
6 Co
Table S5. Laboratory and clinical changes in the patient 3 (proband) and mutated family members (identified related to pedigree in figure 4) after
7
8
nf
seven months of oral CoQ10 treatment.
9
10
11 ide Proband Patient 2 Patient 3 Patient 4 Patient 5 Patient 6
nt
12
13
Parameter Pre Post Pre Post Pre Post Pre Post Pre Post Pre Post
ial
14
Tender points
15 12 6 14 7 11 7 13 5 11 4 13 3
16
:F
FIQ Total score, range 0-80
17 66 21 69 20 64 22 67 20 57 18 51 16
18
Pain 8 3 8 4 8 2 9 4 7 2 7 2
19
Fatigue
20
21
Morning tiredness
22
7
5
3
2
8
5
2
2 or8
6
4
2
8
6
1
1
8
6
1
1
8
5
3
2
23
Stiffness
24
Anxiety
25
9
6
2
3
7
7
3
3
8
7 Re 2
2
7
8
2
3
6
7
3
2
4
5
2
1
26
Depression
27
VAS Pain Total score 0-10
28
7
8
2
3
6
9
3
3
8
7
2
3
vie
8
9
4
4
5
7
2
3
4
8
1
1
29
VAS Fatigue Total score 0-10
30 7 3 7 3 8 2 8
w 2 8 1 7 2
On
31
Citrate synthase (specific activity) 4.7 18.3 3.7 15.6 4.1 15.9 3.8 16.6 8.1 21.3 6.3 19.1
32
ATP levels (nMol/mgProtein)
33 5.2 20.4 4.1 19.4 5.8 17.4 3.9 22.1 5.4 26.4 3.7 23.4
ly
34
IL-1β (pg/ml) 24.3 5.4 26.1 6.1 21.3 7.1 26.3 4.8 25.2 4.4 27.1 3.4
35
36
mtDNA copy number(nDNA/mtDNA) 0.4 0.9 0.5 0.8 0.6 0.9 0.3 0.7 0.3 1 0.3 0.9
37
38
39
40
41
42
43
44
45 https://mc.manuscriptcentral.com/jmedgenet
46
47

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Departamento de Estomatología

Implicación de la mitocondria y del

Mario David Cordero Morales

Implicación de la mitocondria y del complejo

Memoria de tesis presentada por Mario David Cordero Morales, Graduado

Pedro Bullón Fernández José Antonio Sánchez Alcázar

Sevilla, a 26 de Octubre de 2015

D. JOSÉ ANTONIO SÁNCHEZ ALCÁZAR, DOCTOR EN MEDICINA POR LA

Para que conste, firman la presente en Sevilla, a 26 de Octubre de 2015

Dr. Pedro Bullón Fernández Dr. José Antonio Sánchez Alcázar

Santiago Ramón y Cajal

Tengo grabado en mi memoria los recuerdos de mi infancia en mi Triana del alma, de

Tras un silencio en mi vida, pasé a estudiar el módulo de técnico de laboratorio, un

La fibromialgia (FM) es un síndrome de dolor crónico generalizado de alta prevalencia

mundial que supone un verdadero enigma clínico dado su heterogeneidad y su

desconocida etiología. Su fisiopatología ha sido ampliamente investigada y se han

propuesto varias hipótesis biológicas entre las cuales, la inflamación, la disfunción

profundizado en el papel de la disfunción mitocondrial mediante el uso de un modelo in

de la cadena respiratoria mitocondrial, una deficiencia de CoQ10, así como un incremento

del daño oxidativo. Además, esta disfunción mitocondrial provocada la activación de un

complejo multiproteico denominado, complejo NLRP3-inflamasoma el cual, es

responsable se la inflamación sistémica.

FM que presentan disfunción mitocondrial. En este estudio, mostramos una mutación en

el gen citocromo b del ADN mitocondrial (ADNmt) en una familia con FM y la

implicación del complejo NLRP3-inflamasoma en varias mutaciones mitocondriales.

mitocondrial homoplásmica m.15804T > C en el gen mtCYB en un paciente transmitida

La mutación estaba presente en varios tejidos de la paciente. Los fibroblastos de piel de

la paciente mostraron disfunción mitocondrial y estrés oxidativo asociado a la activación

fisiopatológicas observadas en los fibroblastos de la paciente con FM. Interesantemente,

la activación del complejo NLRP3-inflamasoma también se observó en líneas de

fibroblastos derivados de pacientes con otras enfermedades mitocondriales como

Miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis láctica y accidentes cerebrovasculares

en el ADNmt responsable de la disfunción mitocondrial, el estrés oxidativo y la activación

datos, se propone el análisis de secuencias del ADNmt en pacientes con FM con

evidencias de herencia materna como una posible herramienta de diagnóstico. Además,

la activación NLRP3-inflamasoma como consecuencia de la disfunción mitocondrial

podría estar implicada en la fisiopatología de las enfermedades mitocondriales.

16673-34-0: 5-cloro-2-metoxi-N- [2- (4-sulfamoilfenil) etil] benzamida

ACR: Colegio Americano de Reumatología

ADNmt: ADN mitocondrial

ADNn: ADN nuclear

ATP: Adenosín trifosfato

ASC: Proteína adaptadora

BMCs: Células mononucleares de sangre periférica

BMI: Índice de masa corporal

CS: Citrato sintasa

CoQ10: Coenzima Q10

CPEO: Oftalmoplejia externa progresiva crónica

Cu/ZnSOD: Superóxido de cobre/zinc dismutasa

DCPIP: 2,6-Dicloroindofenol sodio hidratado

DTNB: 5,5′-Dithiobis (2-ácido nitrobenzoico)

FBS: Suero fetal bovino

FIQ: Cuestionario de Impacto de Fibromialgia

GPX: Glutation peroxidasa

H2O2: Peróxido de hidrógeno

HRP: Peroxidasa de rábano picante

IMC: Índice de masa corporal

IOD: Intensidad óptica integrada

LHON: Neuropatía óptica hereditaria de Leber

LRR: Leucine rich region