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    Geréz Julio
    Este documento estudia la efectividad y modo de acción de la nisina sobre Lactobacillus fructivorans a diferentes pH. Los resultados mostraron que a pH 6.5, cercano a la neutralidad, la nisina tiene un modo de acción bacteriolítico, mientras que a pH 3.5 es bactericida. El modo de acción de la nisina se debe a su capacidad de permeabilizar la membrana celular.

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    Este documento estudia la efectividad y modo de acción de la nisina sobre Lactobacillus fructivorans a diferentes pH. Los resultados mostraron que a pH 6.5, cercano a la neutralidad, la nisina tiene un modo de acción bacteriolítico, mientras que a pH 3.5 es bactericida. El modo de acción de la nisina se debe a su capacidad de permeabilizar la membrana celular.

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    Este documento estudia la efectividad y modo de acción de la nisina sobre Lactobacillus fructivorans a diferentes pH. Los resultados mostraron que a pH 6.5, cercano a la neutralidad, la nisina tiene un modo de acción bacteriolítico, mientras que a pH 3.5 es bactericida. El modo de acción de la nisina se debe a su capacidad de permeabilizar la membrana celular.

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    Efectividad y Modo de Acción

    de Nisina sobre Lactobacillus fructivorans


    Nuñez, Griselda A. - Cayré, María. E. - Castro, Marcela P. - Garro, Oscar A.*

    Antecedentes tecnología se basa en el uso de un nú- tipo de alimentos, no se ha reportado


    Determinadas cepas bacterianas ge- mero de factores intrínsecos (e.g., tra- en la bibliografía el modo de acción y la
    neran pequeñas proteínas conocidas como tamiento térmico, pH, sales, otros efectividad de esta bacteriocina sobre
    bacteriocinas. Estos biocompuestos fun- preservadores) y extrínsecos (e.g., tem- L. fructivorans.
    cionan como antibióticos de reducido es- peratura de almacenamiento, atmósfe-
    pectro ya que tienden a dañar solo a ra del empaque) que actúan como «ba- El objetivo de este trabajo fue de-
    aquellos microorganismos similares a las rreras u obstáculos» frente al crecimien- terminar la efectividad de nisina sobre
    bacterias que los producen. La nisina es to o supervivencia de microorganismos L. fructivorans a valores de pH cercano
    uno de estos compuestos. Aislada en patógenos o causantes de deterioro del a la neutralidad y ácido (3,5), así como
    1928, comenzó a utilizarse como alimento. A mayor cantidad de barre- también establecer el modo de acción
    antimicrobiano en algunos alimentos en ras, mayor es la dificultad del microor- de esta bacteriocina sobre dicho micro-
    la década del ’50 y actualmente reviste ganismo a crecer o sobrevivir (Leistner, organismo en esas condiciones.
    la categoría de GRAS («Generally 1994). Contrariamente a las barreras
    Recognized As Safe»: reconocido gene- biostáticas, las cuales sólo inhiben el Materiales y Métodos
    Tecnología

    ralmente como seguro) por la FDA (Food crecimiento de los microorganismos con-
    and Drug Administration, USA). taminantes, las bacteriocinas pueden Preparación del inóculo
    servir como barreras bactericidas y ayu- L. fructivorans CRL 941 conserva-
    La nisina es una sustancia dar a reducir el espectro de do en líquido crioprotector fue suspen-
    polipeptídica producida por Lactococcus microorganismos que pudieran desarro- dido en medio nutritivo líquido MRS
    lactis a partir de una fermentación en llarse en el alimento (Muriana, 1996). (Biokar Diagnostics, Beauvais, France)
    medio lácteo modificado. Presenta acti- e incubado durante 24 h a 30ºC. Se-
    vidad antimicrobiana contra un rango li- El efecto de distintos factores físico- guidamente se realizaron dos repiques
    mitado de bacterias Gram-positivas, par- químicos sobre la actividad de una adicionales de la cepa antes de ser ino-
    ticularmente sobre aquellas formadoras bacteriocina no sólo tiene el fin de culada a los sistemas en estudio. En
    de esporas. La molécula es acídica y por caracterizarla, sino también sirve para cada caso, estos repiques se realiza-
    tanto exhibe su mayor estabilidad bajo inferir su posible aplicación industrial, ya ron en medio líquido nutritivo ajusta-
    condiciones ácidas (Delves-Broughton, que las altas temperaturas y las amplias do al valor de pH correspondiente con
    1990). Es también más soluble a pH bajo variaciones de pH son, entre otras, al- una solución 500 g/l de ácido cítrico.
    (Hurst, 1981). El uso propuesto de las gunas de las condiciones que debe re- Las lecturas de pH se realizaron con
    bacteriocinas como preservadores po- sistir una bacteriocina para ser útil como un medidor con electrodo de vidrio
    tenciales de alimentos no se entiende potencial agente inhibidor de (Accumet, Fischer, USA).
    como un medio primario de preserva- microorganismos no deseados en pro-
    ción. La mayoría de los investigadores cesos alimenticios (fermentaciones de Preparación de la solución de
    consideran que las bacteriocinas contri- leche, maduración de quesos, curado bacteriocina
    buyen a la tecnología de «obstáculos» de encurtidos, etc.) (Farías, 1996). Se utilizó una solución concentrada
    («hurdle approach») para la seguridad de nisina de 10000 ppm. El diluyente se
    y preservación de los alimentos. Esta El microorganismo Lactobacillus preparó con 0,83 ml de HCl 12,1N y 3,75
    fructivorans se halla dentro de la g de NaCl suspendidos en agua destila-
    *Cátedra Microbiología de Alimentos - Fa- microflora alterante de salsas y adere- da c.s.p. 500ml. En estas condiciones el
    cultad de Agroindustrias - UNNE. Comandan- zos. La acidez de estos productos oscila pH es lo suficientemente bajo para ase-
    te Fernández 755 - (3700) Pcia. Roque Sáenz entre 2,9 y 4,4 unidades de pH (Smittle, gurar la estabilidad de la bacteriocina
    Peña - Chaco - Argentina.
    Tel./Fax: +54 (03732) 420137 1982). Si bien se halla aprobado el uso durante la esterilización a 115,6°C
    E-mail: ganunez@fai.unne.edu.ar de nisina como preservador para este (Tramer, 1964)

    28 Mundo Lácteo y Cárnico Marzo/Abril 2007 info@mundolacteoycarnico.com


    Determinación de la efectividad y modo de acción de la consiguiente la DO se mantiene constante. El modo de ac-
    nisina ción bacteriostático no produce muerte celular pero detie-
    El monitoreo de la evolución del microorganismo en los ne el crecimiento, por lo cual, sin muerte celular, el conteo
    sistemas ensayados se realizó mediante mediciones de densi- de colonias y la DO se mantienen constantes.
    dad óptica (DO) a 580 nm, contra blanco de medio de cultivo
    sin inocular, y recuento en placa sobre agar MRS (Biokar Resultados y Discusion
    Diagnostics, Beauvais, France), durante 53 h. El inóculo ini- En la Figura 1 puede observarse el efecto producido por
    cial agregado fue el necesario para alcanzar un recuento de el agregado de nisina en ambos sistemas. La figura 1(a)
    105 UFC/ml. Este número de células se corresponde con una exhibe el modo de acción de la bacteriocina a pH 6.5, don-
    lectura de DO al inicio del rango de detección. Se prepararon de claramente se visualiza la disminución de la DO poste-
    dos sistemas modelo a distintos valores de pH: 3,5 y 6,5. Las rior al agregado de la misma. En dicho momento, los re-
    corridas se realizaron por cuadruplicado con sistemas testi- cuentos obtenidos fueron de 1,7x108UFC/ml. A las 24 ho-
    go, a los cuales no fue agregado el biopreservador. El agrega- ras de la adición de nisina, el número de microorganismos
    do de la solución de nisina se realizó durante la fase exponencial presentes fue menor a 103 UFC/ml. De lo expuesto prece-
    de crecimiento del microorganismo en c.s.p. alcanzar una con- dentemente se infiere que el modo de acción de nisina so-
    centración final en los sistemas modelo de 2000 ppm. bre L. fructivorans a pH cercano a la neutralidad es
    bacteriolítico. La figura 1(b) muestra cómo el agregado de
    El modo de acción de una sustancia inhibidora frente a la bacteriocina provoca que las lecturas de DO se mantengan
    una célula sensible puede ser bacteriolítico, bacteriostático o constantes en el tiempo de experimentación. Del recuento en
    bactericida. El primero implica muerte celular seguida de lisis, placa surge que el modo de acción de nisina sobre L. fructivorans
    con la concomitante disminución de la DO. El modo de acción a pH 3,5 es bactericida ya que el número de microorganismos
    bactericida produce también muerte celular que se manifiesta disminuyó con el transcurso del tiempo.
    en la disminución en el conteo de colonias pero sin lisis y por
    Basados en las características catiónicas e hidrofílicas de
    la nisina, dos son los mecanismos que explican el modo de
    Figura 1. Crecimiento de Lactobacillus fructivorans a pH
    6,5 (a) y 3,5 (b) sin el biopreservador (o) y en presencia
    de2000 ppm de nisina ().

    info@mundolacteoycarnico.com Mundo Lácteo y Cárnico Marzo/Abril 2007 29


    acción de la nisina sobre la bacteriocina por molécula de lípido de- Farías, M.E. 1996. Estudios bioquímicos
    permeabilización de la membrana celu- termina el grado de eflujo de ATP y genéticos de bacteriocinas producidas por
    lar: 1) las bacteriocinas actúan como un intracelualar que lleva a la muerte celular bacterias lácticas. Tesis doctoral. Univ. Na-
    complejo de poración en el cual los y que a pH neutro se requieren menos cional de Tucumán.
    monómeros de la misma se unen, in- moléculas de bacteriocinas (Gao y col.
    sertan y oligomerizan en la membra- 1991, Garcerá y col., 1993). FDA. 1988. Nisin preparation: Affirmation
    na citoplasmática para formar un poro of GRAS status as a direct human food
    y 2) las bacteriocinas desestabilizan la En base a lo citado podría entender- ingredient. Food and Drug Admin., Fed. Reg.
    membrana a modo de un detergente se el efecto bacteriolítico ejercido por 53: 11247.
    (Abee y col., 1995; Muriana, 1996). nisina a pH 6,5 sobre Lactobacillus
    Los resultados de muchos estudios fructivorans como resultado de una FDA. 1989. Food and Drug Admin., Fed.
    tienden a apoyar el modelo de la for- masiva poración de la membrana ya que, Reg. 54: 6120.
    mación de poros sobre el que propone en estas condiciones, la adsorción de
    una acción tipo detergente. nisina a la bicapa se vería favorecida. A Gao, F.H., Abee T.L. y Koonings W.N.
    pH 3,5 las interacciones electrostáticas 1991. Mechanism of action of the peptide
    Un esquema del modelo de poración que se establecen entre el antibiotic nisin in liposome and cytochrome
    se presenta en la fig. 2. Los monómeros biopreservador y la membrana celular C oxidase containing proteoliposomes. Appl.
    de nisina se unen a la membrana se afectarían de modo que la concen- Environ. Microbiol., 57: 2164-2170.
    citoplasmática a través de uniones tración de nisina usada, si bien causa la
    electrostáticas con los fosfolípidos car- muerte bacteriana, no sería suficiente Garcerá, M.J., Elfernik, M.L., Driessen,
    gados negativamente, luego se inser- para promover la lisis celular. A.J. and Koonings, W.N. 1993. In vitro pore
    t a n e n l a m e m b ra n a c o n u n a forming ability of lantibiotic nisin role of
    reorientación que depende del poten- Conclusiones proton motive force and lipid composition.
    Tecnología

    cial de membrana. Este potencial po- Los resultados expuestos muestran Eur. J. Biochem., 212: 417-422.
    dría estar influenciado por el pH y la que 2000 ppm de nisina comercial tie-
    c o m p o s i c i ó n fo s fo li p í d i c a . L o s nen efecto bacteriolítico sobre L. Hurst, A. 1981. Nisin. Adv. Appl.
    monómeros se agregan resultando en fructivorans a pH 6,5, mientras que a Microbiol. 27: 85.
    la formación de un poro en la mem- pH 3,5 presenta un modo de acción
    brana, hacia adentro de la región de bactericida. Los estudios realizados Leistner, L. 1994. Further developments
    fosfolípidos se ubican los residuos sobre la efectividad del biopreservador in the utilization of hurdle technology for food
    h i d r o f í l i c o s y h a c i a fu e ra l o s se complementarán con ensayos a dis- preservation. J. Food eng. 22: 421-432.
    hidrofóbicos, con la consecuente sali- tintos valores de pH y concentración Muriana, P.M. 1996.Bacteriocins for con-
    da de iones y la pérdida de la fuerza de nisina a fin de proponer un modelo trol of Listeria spp. in food. J. Food Protection,
    protón motriz (FPM) a la que le sigue integral sobre sus mecanismos de ac- suppl.: 54-63.
    la muerte celular. ción. El estudio de las propiedades fí-
    sicas y químicas, modos de acción y Smittle, R.B. y Flowers, R.S. 1982. Acid
    Por otro lado, estudios realizados con relaciones entre estructura y función tolerant microorganisms involved in the
    espectroscopía de fluorescencia sobre la de las bacteriocinas es necesario a fin spoilage of salad dressings. J. Food
    interacción de nisina con la bicapa lipídica de evaluar sus potenciales aplicaciones Protection, 45, 10, 997-983.
    demostraron que la concentración de en alimentos (Abee y col., 1995).
    Tramer, J.(1964) The inhibitory action of
    Referencias nisin on Bacillus stearothermophilus. In
    Figura 2. Interacción de los
    Abee T., Krockel L., Hill C. 1995. «Microbial Inhibitions in Foods», ed. N. Molin,
    monómeros de bacteriocina con la
    Bacteriocins: modes of action and potentials p. 25. Almqvist and Wiksell, Stockholm,
    membrana citoplasmática: modelo de
    in food preservation and control of food Sweden.
    complejo de poración. (Farías, 1996).
    poisoning. Int. J. Food Microbiol. 28, 169-185.

    Delves-Broughton, J. 1990. Nisin and its


    uses as a food preservative. J. Food Technol.,
    100-117.

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