UST

Universidad Santo Tomás

Facultad de la Salud
Escuela de Tecnología
Médica

GUIA PRÁCTICA DE MICROBIOLOGÍA

BÁSICA TECNOLOGÍA MÉDICA
1-2023

Equipo Docente: Equipo Microbiología

Autores: TM MCs Ana María Salinas, TM MCs Tamara Garay,

TM MCs María Antonieta Nuñez, TM MCs Paulina
Meza

Fotografías: Equipo docente

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INDICE

OBJETIVOS DEL CURSO…………………………………………………………………………..3

REGLAS GENERALES DEL TRABAJO PRÁCTICO ............................................................. 4

GUIA DE BIOSEGURIDAD EN MICROBIOLOGÍA .................................................................. 5

PROCEDIMIENTOS BÁSICOS ......................................................................................... ….20

TINCIONES: OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE BACTERIAS……………………………27

MORFOLOGÍA BACTERIANA ............................................................................................. 38

MICROBIOTA HABITUAL ...................................................................................................... 41

GÉNERO STAPHYLOCOCCUS .............................................................................................. 45

GÉNERO STREPTOCOCCUS Y
ENTEROCOCCUS ................................................................................................................... 55

COCOBACILOS Y DIPLOCOCOS GRAM (-), BACILOS (+) ................................................. 62

ENTEROBACTERALES Y BACILOS NO
FERMENTADORES ................................................................................................................. 71

MICOLOGÍA .............................................................................................................................. 80

SUSCEPTIBILIDAD A AGENTES ANTIMICROBIANOS ........................................................ 87

Anexo N°1 MEDIOS DE CULTIVO ........................................................................................... 95

Anexo N°2 FUNDAMENTOS DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS Y

MEDIOS DIFERENCIALES PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACILOS
GRAM NEGATIVOS ............................................................................................................... 103

Anexo N°3 EFECTO DE LOS AGENTES FÍSICOS, QUÍMICOS

Y MECÁNICOS SOBRE
BACTERIAS ......................................................................................... 111

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OBJETIVOS DEL CURSO:

Al término del curso, el alumno será capaz de:

1. Identificar el material utilizado habitualmente en la práctica de Microbiología

2. Realizar procedimientos en el laboratorio de Microbiología según protocolos

de bioseguridad

3. Aislar y propagar microorganismos manipulando con destreza y esterilidad

los materiales de laboratorio y cultivo de microorganismos

4. Emplear técnicas de tinción para identificar formas y agrupaciones

microscópicas, así como reconocer las características macroscópicas de las
colonias de los principales géneros bacterianos

5. Aislar y caracterizar los principales microorganismos patógenos del

ser humano

6. Conocer diferentes test de susceptibilidad antimicrobiana y realizar un

método cualitativo para determinar la sensibilidad de un microorganismo

7. Reconocer y diferenciar la morfología macroscópica y microscópica de

levaduras y hongos filamentosos

3
 REGLAS GENERALES DEL TRABAJO PRÁCTICO

1) Los estudiantes deben usar obligatoriamente delantal blanco, pechera

manga larga para proteger su ropa del material infeccioso y de reactivos
de tinción.
2) Los estudiantes deben asistir al trabajo en el laboratorio, con una
presentación personal adecuada: cabello tomado, sin anillos, sin
pañuelos o bufandas, zapatos cerrados y las manos con las uñas
cortas.
3) Por normas de bioseguridad está prohibido: uso de celulares, comer,
beber o maquillarse, en la sala de trabajos prácticos.
4) Los estudiantes no pueden desplazarse con material cortopunzante
y deberán trabajar en forma ordenada y en SILENCIO.
5) Cada estudiante tendrá un puesto de trabajo en el mesón, el cual debe
mantener limpio y ordenado. Será responsable del microscopio y del
material que se le asigne.
6) En caso de ruptura de tubos o placas conteniendo un cultivo bacteriano,
debe comunicarse inmediatamente al encargado de laboratorio o los
docentes
7) Los pasos prácticos se iniciarán a la hora indicada NO SE PERMITIRÁ
LA ENTRADA DE ESTUDIANTES ATRASADOS.
7) La guía debe ser leída previamente y se realizará interrogación oral o
control escrito antes de iniciar cada paso práctico.

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 Sesión 1
GUIA DE BIOSEGURIDAD EN MICROBIOLOGÍA

INTRODUCCIÓN

Se define BIOSEGURIDAD como un conjunto de medidas preventivas

destinadas a proteger la salud del personal de los riesgos por agentes
biológicos, físicos o químicos en el laboratorio, así como también
indirectamente la protección del ambiente.
Durante el trabajo diario en microbiología, se dan situaciones de
potenciales riesgos que varían según el agente infeccioso y los procedimientos
utilizados. Esta guía de bioseguridad pretende reducir a un nivel aceptable el
riesgo inherente a la manipulación de material peligroso.
Todos los estudiantes deben estar en conocimiento de la guía antes del
inicio de los trabajos prácticos para poder reconocer las diferentes situaciones
de riesgos y adoptar las medidas de protección necesarias
El trabajo en el laboratorio de microbiología es, como en la mayoría de
las otras secciones del Laboratorio Clínico, un trabajo en equipo. La actitud
ante las prácticas seguras de cada uno de los integrantes del grupo,
determinan su propia seguridad, así como la de sus compañeros y la de la
colectividad del laboratorio.

El propósito de esta guía es describir la metodología a seguir en un

programa de bioseguridad en microbiología, de modo que sea una guía para
el trabajo seguro en el laboratorio que involucra a microorganismos
potencialmente peligrosos.

A. SITUACIONES DE RIESGO EN EL LABORATORIO

DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA:

El personal puede estar expuesto a situaciones de riesgo entre las que

se distinguen:

1.1 Riesgos por Agentes Químicos:

Por la manipulación inadecuada de agentes químicos se está expuesto a:
Ingestión, inhalación y/o contacto con la piel, tejidos, mucosas y ojos, de
sustancias tóxicas, irritantes, corrosivas y/o nocivas. Algunos agentes
químicos son fundamentalmente volátiles, por lo tanto, aumentan el riesgo
de exposición a ellos.

1.2 Riesgos por Agentes Físicos:

El riesgo a que se está expuesto por la manipulación o ingestión de gases
o partículas radioactivas; exposición a radiaciones ionizantes y/o no
ionizantes; exposición a ruidos y vibraciones o a una carga calórica sobre la
superficie corporal y quemaduras, especialmente aquellas que están sin
protección. También deben considerarse aquellas heridas cortopunzantes

5
 sin riesgo biológico. En el laboratorio de microbiología el principal riesgo
son quemaduras por el uso de mecheros y autoclave.

1.3 Riesgos por Agentes Biológicos:

- Por microorganismos
La infección por microorganismos se puede adquirir por distintas vías:
Inhalación, ingestión, contacto directo, a través de la piel o mucosas
erosionadas y/o sanas y a través de la conjuntiva.

- Por animales de laboratorio

El riesgo de transmisión de agentes biológicos desde animales de
laboratorio se puede producir por: inhalación de polvo contaminado con el
desecho de los animales o pelos, mordeduras, rasguños o autoinoculación
durante la manipulación de ellos.

En el Laboratorio de microbiología estaremos expuestos a

microorganismos cuya peligrosidad está directamente relacionada con el
tipo de microorganismo y la manipulación a la que se está sometido. Por ello
es básico:

a) Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen

en el laboratorio
b) Conocer la metodología de trabajo del laboratorio
c) Conocer el equipamiento del laboratorio (controles, mantenimiento y
uso de ellos)
d) Conocer las medidas a tomar en caso de accidentes
e) Respetar y hacer cumplir todo lo anterior

Para que se produzca un accidente por agente biológico deben

concurrir básicamente cuatro elementos:

1. Un hospedero susceptible
2. Un agente infeccioso
3. Una concentración suficiente de éste
4. Una ruta de transmisión apropiada.

De todos ellos, el que mejor se puede controlar en el laboratorio es la ruta

de transmisión.
Las rutas de transmisión más comunes en el laboratorio son la aérea y la
inoculación directa, muy por encima de todas las demás, aunque la oral, la
percutánea y el contacto directo con la piel o las mucosas también son
posibles.

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B- MEDIDAS GENERALES EN EL TRABAJO DE LABORATORIO

Las siguientes medidas son obligatorias en cualquier área del

laboratorio sea este de enseñanza universitaria o asistencial:

• El acceso al laboratorio estará limitado al personal autorizado

• Los artículos personales deben guardarse en casilleros fuera del área

técnica del trabajo.

• El personal del laboratorio debe comprometerse en el cumplimiento de

las normas de seguridad
• Todas las áreas estarán debidamente marcadas con la señal de riesgo
biológico y su nivel de contención
• Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas para mantener la
adecuada contención biológica
• Las superficies del laboratorio como: paredes, suelo y cielo, deben ser
de fácil limpieza, lavado y descontaminación.

Todas las superficies de trabajo se limpiarán y desinfectarán diariamente con

Alcohol etílico al 70% y siempre que se produzca un derrame con Hipoclorito
sódico al 0.5% (ver PLAN DE EMERGENCIAS DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA CLÍNICA, Derrames y salpicaduras)

• Los residuos y muestras peligrosas que van a ser incinerados fuera del
laboratorio deben ser transportados en contenedores cerrados,
resistentes e impermeables siguiendo las normas específicas para cada
tipo de residuo
• El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado y no es aconsejable
utilizar los pasillos como almacén. Siempre debe quedar un espacio
libre
• Todo el personal y/o estudiantes deben poner especial cuidado en evitar
el contacto de la piel con materiales potencialmente infecciosos. Con
este fin deben usarse guantes cuando se manipulen muestras o cultivos
que contengan posibles patógenos. Los guantes siempre serán
desechados antes de salir del área de trabajo. Jamás se saldrá de la
misma con los guantes puestos, ni con ellos se tomará el teléfono, se
tocarán las hojas de examen, cuadernos, manillas de las puertas, etc.
Tras quitarse los guantes, estos se eliminan en cajas de desechos
biológicos y luego se realizará un exhaustivo lavado de manos. (ver nota
al final)
• El uso de delantal debidamente abrochado es obligatorio
• Se usarán gafas (antiparras) protectoras o protectores faciales y
mascarillas en todo momento (por contingencia sanitaria COVID-19)
riesgo de salpicaduras y/o aerosoles.
• Se pondrá extremo cuidado en minimizar el riesgo de autoinoculación y
de generación de aerosoles.
• Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente en
este caso al profesor encargado
• Está prohibido pipetear con la boca. Se realizará pipeteo automático con
material adecuado y cada trabajador/estudiante será instruido para

7
 manejarlo debidamente.
• En la zona de trabajo no debe colocarse material de escritorio ni
libros ya que el papel contaminado es de muy difícil esterilización.
• El personal y/o estudiantes con el cabello largo deben llevarlo recogido.
• Comer, beber, fumar y aplicarse cosméticos está prohibido en el área
de trabajo del laboratorio, así como el almacenamiento de comida o
bebida.
• El personal y/o estudiantes deben lavarse las manos frecuentemente
durante las actividades rutinarias, tras acabar la jornada práctica y
siempre antes de abandonar el laboratorio. Se usará jabón
antiséptico y el secado se realizará con papel.
• Las heridas y cortes en las manos serán comunicados al profesor que
evaluará la situación y si el considera conveniente le indicará vendar y
usar guantes.

NOTA: Lavado de manos:

El lavado de manos es una de las etapas más importantes en la
manipulación tanto de agentes biológicos, físicos o químicos, es por esto
que se detalla de manera explícita el correcto lavado de manos.
Las manos y otras superficies de la piel se deben lavar lo más pronto
posible, el uso de guantes no excluye ni reemplaza el lavado de manos.
Las manos deben lavarse:
- Siempre que exista contaminación con sangre, líquidos biológicos,
cepas microbiológicas y/o cultivos.
- Después de completar el trabajo y antes de abandonar el
laboratorio.
- Después de sacarse los guantes.
- Antes y después del uso de servicios higiénicos.
- Antes de cualquier otra actividad en la cual exista contacto con
membranas mucosas, ojos, piel con lesiones.
Técnica de lavado de manos: Según OMS 2017
- Duración mínima: 40-60 segundos para ser efectivo.
- Abra la llave del agua y mantenga el agua corriendo.
- Moje bien las manos y muñecas y aplique jabón o antiséptico.
- Lave bien los espacios interdigitales, friccione dedos y uñas. Frótese
las muñecas.
- Séquese con toalla de papel desechable. Cierre llave con la toalla
de papel con la cual se secó

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 C- CLASIFICACIÓN DE LOS AGENTES BIOLÓGICOS POR GRUPO
DE RIESGO

Agente biológico del grupo 1

Se refiere a aquél que resulta poco probable que cause una enfermedad
en el Ser Humano.
Ejemplos: Bacillus subtilis, Escherichia coli K12, Saccharomyces sp.

Agente biológico del grupo 2

Es aquél que puede causar una enfermedad en el Ser Humano y puede
suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se
propague a la colectividad y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento
eficaz.
Ejemplos: Actinomyces sp, Bacteroides sp, Enterobacterales, Shigella
sp, Candida sp, Cryptococcus neoformans.

Agente biológico del grupo 3

Aquél que puede causar una enfermedad grave en el Ser Humano y
presenta un serio peligro para los trabajadores, con riesgo de que se
propague a la colectividad y existiendo frente a él generalmente profilaxis o
tratamiento eficaz.
Ejemplos: Mycobacterium tuberculosis y bovis, Histoplasma capsulatum,
Neisseria meningitidis, Chlamydia psittaci, Brucella spp

Agente biológico del grupo 4

Se refiere a aquél que causando una enfermedad grave en el Ser
Humano supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas
probabilidades de que se propague a la colectividad y sin que exista
generalmente frente a él profilaxis o tratamiento eficaz.
Ejemplos: Virus de Lassa, Machupo, y Ébola

D- NIVELES DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO

En las siguientes tabla s se describen los niveles de bioseguridad
según grupo, tipo de laboratorio y tipos de microorganismos

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10
 NIVELES DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Nivel de Grupo Clasificación Ejemplos de Ejemplos de Prácticas y Equipos de

bioseguridad de de laboratorio microorganismos Técnicas seguridad
riesgo laboratorio especiales

1  Básico Entrenamie Bacillus Prácticas Ninguno: protección

nt o básico corrientes de primaria dada por las
subtilis
(universida microbiología técnicas habituales de
d) Escheric trabajo en mesón.
hia
2  Básico Hospital Salmonella Typhi Las de Nivel 1 En ciertos casos:
más: Acceso
de Diagnóstico Virus hepatitis B Equipos de protección
limitado. Uso
complejos (gabinetes
de delantal,
de bioseguridad , )
pechera y
antiparras.
Descontamina
ción del
material
descartado.
Señales de
Riesgo
Biológico
3  de Laboratorio Histoplasma Las de Nivel Equipos de protección
Contención especializado capsulatum, 2 más: complejos se utilizan
virus Hanta, en la manipulación de
Acceso
Mycobacterium todo el material
controlado
spp contaminado.
Ropa (gabinetes de
especial de bioseguridad
ingreso, .)
mascarilla
N95.
Sistemas
de
ventilación
especial.
(presión
negativa)
4 V de Unidades Virus Las de Nivel 3 Equipos de
Contención de más: contención máxima
Lassa
Máxima patógenos
Entrada a (Gabinetes , o
de Alto Virus aislamiento del
través de un
Riesgo trabajador con trajes
Marburg pre-recinto
para cambiase especiales a presión
Ébola de ropa. positiva de cuerpo
Sistema de completo).
ventilación
separado.
Ducha a la
entrada.
Sistemas de
descontaminaci
ó n del aire
eliminado.

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 E- NORMAS DE SEGURIDAD EN LA UTILIZACIÓN DE

EQUIPOS E-1. NORMAS GENERALES

Los equipos y aparatos nunca deben colocarse en zonas de paso, en particular

en los pasillos del laboratorio.
Todos los aparatos con toma eléctrica deberán cumplir las normativas de
seguridad correspondientes. Nunca deben utilizarse en zonas mal aisladas y
expuestas a la humedad.
Las fuentes de calor (calentadores, termobloques, etc.), sobre todo si se
alcanzan temperaturas elevadas, deberán estar debidamente señalizadas
para evitar quemaduras accidentales.
Cada laboratorio debe contar con carpetas con información de cada equipo a
modo de hoja de vida con descripción de: modelo, marca, proveedor,
asistencia técnica, fechas de mantenimiento preventivo y su respectivo inserto
en español para el uso correcto.
Además, cada equipo debe tener una hoja de revisión diaria y/o semanal.

E-2. REFRIGERADOR

El adecuado mantenimiento, limpieza y desinfección sistemáticos de los

aparatos reduce considerablemente los riesgos asociados a su utilización. Sin
embargo, aún en estas condiciones, hay que tener en cuenta lo siguiente:
- Los insumos del laboratorio se deben almacenar en refrigerador
exclusivo y no mezclar con muestras biológicas.
- Los cultivos de microorganismos patógenos deben almacenarse en
recipientes que estén convenientemente cerrados por riesgo de
inhalación, especialmente si la cámara tiene un sistema de circulación
de aire.
- No deben almacenarse reactivos que contengan compuestos volátiles
inflamables (éter etílico, por ejemplo) en neveras que no posean un
sistema de protección. En los aparatos de tipo doméstico que se utilizan
en el laboratorio debe anularse la lámpara de la luz.
- Las placas sembradas, deben ser guardadas envueltas en parafilms a
fin de evitar desecación y/o contaminación.

E-3. CONGELADORES

La congelación es un proceso que mantiene la viabilidad de muchos

agentes infecciosos, de ahí un potencial riesgo y las siguientes
recomendaciones:
- Tratar de identificar en ficheros, listas, etc. el contenido de lo
almacenado y sus riesgos potenciales.
- El material potencialmente infeccioso debe colocarse en tubos,
recipientes, etc. bien cerrados. No se llenarán completamente, para
evitar que rebosen por efecto del aumento de volumen tras la
congelación.
- Descongelar periódicamente, limpiar y desinfectar si fuese
procedente.

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 - Utilizar guantes para manipular el contenido. Si la temperatura es baja
(por ejemplo -70ºC o inferior), los guantes representan una protección
adicional.

E-4. INCUBADORAS

La limpieza y la desinfección, periódicas y sistemáticas, son el método

recomendable para reducir los riesgos derivados de la contaminación
accidental del personal del laboratorio.

E-5. MICROONDAS

Los microondas cada vez son más populares en el Laboratorio de

Microbiología y constituyen una nueva fuente de accidentes como son las
explosiones que se genera al calentar medios con agar, ya que la diferencia
de velocidad de calentamiento produce burbujas que pueden estallar. Por ello
se debe tener presente:
- Las botellas o matraces deben tener el tapón aflojado, ya que si está
cerrado estallan fácilmente.
- Estar siempre presente, con la ropa y pantalla facial adecuadas, y
controlar la intensidad del aparato, que sólo puede ser la máxima con
agua y la mínima si se usa con agar.
- Los microondas interfieren con los marcapasos. No deben ser
colocados a una distancia inferior a 2 mt. de las personas que sean
portadoras de uno de estos dispositivos.

E-6. AUTOCLAVES

El manejo de este equipo debe ser realizado por personal certificado. No

deben usarse si no se conocen perfectamente todos los mandos y su
fundamento
Las autoclaves deben poseer manómetro y termostato, así como válvula de
seguridad, sistema de desconexión rápido y la salida del vapor ha de realizarse
a un recipiente con agua, jamás directamente al exterior.
Usar guantes especiales para protegerse del calor.
No abrir jamás si el manómetro no está a "0" y la válvula de salida del vapor
no ha sido abierta.
Controlar una vez al mes su capacidad de desinfección mediante esporas, no
siendo suficiente el método químico. El uso de registros de presión y
temperatura de cada proceso y la instauración de un programa de
mantenimiento también puede ser una alternativa válida al control mediante
esporas. El agua debe ser cambiada regularmente.

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 E-7. CENTRÍFUGAS

Los mayores riesgos derivan, sobre todo, de la contaminación por los

aerosoles generados durante la centrifugación de materiales biológicos y, en
menor medida, de los traumatismos accidentales. Se recomienda:
- Cuando se centrifugue material biológico potencialmente infeccioso
deben utilizarse tubos cerrados; la centrífuga debe disponer de rotores
o cestillos de seguridad que protejan al operador de los posibles
aerosoles.
- No se debe abrir inmediatamente finalizado el ciclo de centrifugación.
- La rotura accidental de un tubo y su vertido en la cubeta representa una
incidencia importante que debe ser comunicada inmediatamente al

Supervisor o responsable, de forma que se proceda a la

l i m p i e z a y desinfección segura del aparato.
- No se deben utilizar centrífugas antiguas que no posean sistema de
cierre de seguridad, del que disponen todos los aparatos actuales, ni
manipular éstas de forma que permitan su apertura mientras están en
funcionamiento.
- Si el laboratorio dispone de ultracentrífuga, el equilibrado cuidadoso
del rotor es fundamental.

E-8. Gabinete de seguridad biológica (CSB)

Las CSB son equipos utilizados para proteger al profesional, al producto que
está siendo manipulado y al ambiente del laboratorio de los aerosoles
potencialmente infecciosos que se pueden propagar durante la manipulación
de muestras biológicas o cultivos.
Es importante recalcar que este equipo no es útil para manejar sustancias
radioactivas o sustancias toxicas.
Existen 3 tipos principales de cabinas de seguridad biológica:
• Clase I: protege al operador y al medio ambiente
• Clase II (A, B1, BII, BIII): protege al operador, al material manipulado y al
medio ambiente. De uso habitual en laboratorios clínicos
asistenciales.
• Clase III: ofrece total seguridad al operador, material manipulado y al
medio ambiente. El aire es estéril.

F – PLAN DE EMERGENCIAS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

CLÍNICA

Los riesgos en el Laboratorio de Microbiología se dividen en riesgos no

biológicos, comunes a otros laboratorios, y riesgos biológicos o específicos.Los
no biológicos pueden ser químicos, físicos, eléctricos o fuego.
Entre los riesgos biológicos no se hace referencia a las infecciones adquiridas
en el laboratorio, ya que la mayoría es un proceso que pasa inadvertido. Lo
más importante ante un accidente en el laboratorio es tenerlo previsto, simular
uno como mínimo una vez al año, discutir las medidas a tomar y sacar las
conclusiones pertinentes; en definitiva, no dejar nada a la improvisación y
disponer del material necesario para actuar.

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 Los accidentes biológicos se producen generalmente por:
1. Inoculación accidental.
2. Heridas causadas por animales de laboratorio.
3. Ingesta accidental.
4. Derrames y salpicaduras:
Derrames en la recepción de muestras. Salpicaduras en cara y ojos.
Salpicaduras y contacto directo. Salpicaduras en la superficie de trabajo.
Salpicaduras fuera de la zona de trabajo.
5. Aerosoles.
6. Por el aire.
7. Deliberados y de origen desconocido.

En el laboratorio de microbiología los accidentes potencialmente más

frecuentes son las heridas causadas por objetos punzantes o cortantes
(pinchazo y herida sangrante).
Las centrífugas actuales tienen mecanismos básicos de seguridad, pero
no es infrecuente encontrar todavía algunas que, debido a lo antiguo de su
diseño, permiten ser abiertas antes de su parada completa, hecho inaceptable
con las normativas actuales. Así pues, se pueden producir accidentes al
frenarlas manualmente, con el consiguiente riesgo de lesión por la enorme
fuerza centrífuga de las mismas.
Las quemaduras por vapor procedente de las autoclaves, así como las
producidas por salpicaduras de los microondas, se tratarán tópicamente.

F-1. DERRAMES Y SALPICADURAS

Es uno de los apartados más importantes por su frecuencia. Los

derrames y salpicaduras pueden ser de muchos tipos: por pérdida de los
diferentes envases, generalmente porque estén mal cerrados (ya que se
supone que son los adecuados), por rotura de estos, vuelco, etc. Para actuar
correctamente son muy recomendables seguir estos pasos:

Lavado. Primero se eliminan los restos groseros de cristal, plástico, agar, etc.,
después se lava con abundante agua y un detergente acuoso y a continuación
se inicia la desinfección. Hay que tener en cuenta que cualquier sustancia
orgánica (agar, sangre, restos de peptona, etc.) es extraordinariamente
bloqueante de la capacidad oxidativa del hipoclorito sódico y de la capacidad
de actuación de los iodóforos; por ello, la norma es primero limpiar y después
desinfectar.
Desinfección. Se empleará un desinfectante preferentemente líquido. Los
más útiles en el laboratorio son:
1. Hipoclorito sódico (presentación comercial 5% y se diluye a 0.5%
diariamente) De elección para suelos, cerámicas, etc. No debe usarse en
superficies metálicas. Se vierte haciendo un círculo alrededor del derrame, o
mejor sobre papel absorbente, y se deja actuar 20 minutos.

16
2. Iodóforo. Se utiliza a la dilución indicada por el fabricante. Adecuado en
superficies metálicas.
3. Alcohol etílico al 70%. Se utilizará diariamente para limpiar los
mesones después de finalizar el trabajo
4. Productos detergentes desinfectantes, de fácil manejo, no corrosivo, no
irritante, especialmente activo en presencia de materia orgánica y que cambia
de color cuando deja de ser activo ej. Dextran

F-2. TUBOS ROTOS EN LA CENTRIFUGA

En ocasiones se puede detectar el accidente antes de abrir la centrífuga,
si se ha estado presente durante el proceso de centrifugación, por el cambio
de ruido en el funcionamiento de la máquina. Como esto no siempre sucede,
deberá existir un entrenamiento. Si al abrir la centrífuga, se observa que hubo
un accidente, se debe cerrar la centrífuga, hacer salir inmediatamente a todo
el personal prescindible del área, cerrar la habitación, y el personal encargado
se debe poner guantes y antiparras para luego:
- Desinfectar la centrífuga por fuera
- Esperar 20 minutos
- Abrir la centrífuga muy suavemente
- Colocar todas las muestras no rotas en una gradilla o recipiente
hermético (bolsa de autoclave) y llevarlas a una campana de
bioseguridad para manipularlas allí.
- Limpiar, sacar los restos con pinzas y meterlos en bolsas de autoclave
o safebox. Llevar las cubetas o cestillos con desinfectante y el rotor, si
es posible, a la autoclave.
- Desinfectar la centrífuga por dentro y dejar actuar 20 minutos
- Limpiar las cubetas con alcohol etílico al 70%.

F-3. AEROSOLES

Los aerosoles son la causa más frecuente e importante de accidente biológico

y su origen es muy variado. Muchas veces pasan inadvertidos, por lo que
siempre hay que dar por hecho que existen cuando se producen derrames o
salpicaduras.
La mala práctica es la fuente más común de los aerosoles: enfriar asas
calientes hundiéndolas en el agar, utilizar centrífugas no herméticas,

17
centrifugar con tubos abiertos o mal cerrados, agitar cultivos con el asa
dentro del tubo, pipetear con demasiada fuerza, oler las placas, etc.
Las medidas a tomar para evitar los aerosoles son cambiar los hábitos.

G- ELIMINACIÓN DE LOS RESIDUOS PELIGROSOS EN EL

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

G-1. GENERALIDADES

La eliminación de residuos debe ser considerada como una parte muy

importante de la seguridad en el Laboratorio de Microbiología. Muchos de los
desechos que se generan pueden estar contaminados por microorganismos o
contener sustancias químicas tóxicas y peligrosas.
De una forma conceptual, podemos considerar que un residuo
infeccioso es todo aquel material capaz de producir una enfermedad
infecciosa. Sin embargo, a diferencia de los residuos químicos y radiactivos,
los desechos infecciosos y sus riesgos asociados no pueden ser identificados
de una forma objetiva. La posibilidad de contraer infecciones en el laboratorio
a través de los cultivos microbiológicos desechados o tras una punción o herida
accidental es algo bien conocido. No ocurre lo mismo a la hora de evaluar el
riesgo que las actividades del laboratorio puedan tener sobre la salud de la
comunidad. Por ejemplo, no existen evidencias epidemiológicas que asocien
las infecciones en la comunidad con los residuos hospitalarios, de la misma
manera que no se ha demostrado que los desechos de los hospitales tengan
más capacidad infecciosa que los residuos urbanos generales. Es necesario
tener en cuenta aspectos epidemiológicos como la vía de transmisión, la puerta
de entrada, la virulencia del patógeno y la susceptibilidad del huésped, entre
otros. A pesar de todo, la mayor extensión y gravedad de hipotéticos brotes, la
alarma social que crearía y razones de tipo estético obligan a un tratamiento
particularizado de los residuos infecciosos antes de ser eliminados como
residuos urbanos.

G-2 MANIPULACIÓN DE LOS RESIDUOS INFECCIOSOS

a) Residuos líquidos
La sangre, líquidos orgánicos, secreciones, etc. pueden eliminarse
directamente por el desagüe con agua abundante, según aceptan diversas
reglamentaciones específicas y los manuales generales. Por lo que se refiere
a los líquidos infecciosos que genera el propio laboratorio, como los
sobrenadantes de los cultivos, etc., es aconsejable recogerlos en un recipiente
que contenga una solución de hipoclorito sódico recién preparada. Debe
calcularse el volumen máximo aceptable para asegurar la eficacia del
desinfectante. Luego podrían ser eliminados por los desagües. No obstante,
muchos laboratorios someten a los residuos líquidos, sangre incluida, a un
tratamiento en la autoclave, lo que es de mayor importancia si se trata de
residuos procedentes de las áreas de micobacteriología o virología.

18
b) Residuos sólidos
Las formas más frecuentes de tratamiento de los residuos sólidos son la
incineración y la esterilización por autoclave. Por lo que respecta a la
incineración realizada en los propios hospitales, es una actividad cada vez más
restringida, debido a la contaminación que origina en las zonas urbanas donde
están implantados. Más frecuente es transferir los residuos a empresas
autorizadas, lo que debe hacerse en recipientes rígidos que deberán ser
transportados de forma regulada.
La esterilización en autoclave es la manera más común de tratar este tipo de
residuos en el propio laboratorio que los genera. Hay que asegurarse que el
ciclo de la autoclave permita la esterilización en toda la masa de los residuos.
Los programas para materiales limpios no sirven para los desechos, siendo
aconsejable prolongar el tiempo y aumentar la presión del proceso de
autoclavado. La utilización de indicadores químicos no es suficiente para el
control de la eficacia, que dependerá del tipo de material, volumen, etc. Las
suspensiones de esporas de Bacillus tampoco pueden asegurar en todas las
circunstancias que el tratamiento térmico es suficiente en las zonas más
internas de la masa de material a esterilizar, pues muchas veces no pueden
ser colocadas en el lugar que sería apropiado. Algunos expertos recomiendan
no utilizarlas, para evitar una falsa seguridad; alternativamente, consideran
más apropiado el control riguroso sistemático en cada proceso (por ejemplo,
registros de presión y temperatura) y el mantenimiento apropiado de la
autoclave.
Bibliografía:
• Manual de bioseguridad de laboratorios clínicos: UDA Lab. Clínicos PUC:
Dra. P. García, Dra T. Quiroga
• GUIA DE BIOSEGURIDAD PARA LABORATORIOS CLINICOS, ISPCH,2013

19
 Sesión 1
PROCEDIMIENTOS
BÁSICOS

I- OBJETIVOS
1- Conocer el laboratorio de Microbiología y aplicar normas de bioseguridad
en los procedimientos a realizar por el estudiante.
2- Identificar material utilizado en la práctica bacteriológica
3- Adquirir destreza para manipular materiales y cultivos, cuidando la
esterilidad
4- Reconocer como se preparan los medios de cultivo
5- Visualizar crecimiento bacteriano, en medios de cultivo sólidos y líquidos
6- Practicar diferentes tipos de siembra y diferentes tipos de aislamiento
bacteriano
7-Conocer el concepto de microbiota normal y su importancia

II. MATERIALES
- Asas de nicrón (anillo y punta)
- Pipetas Pasteur
- Tubos con agar nutritivo semitendido
- Tubos con agar semisólido (MIO)
- Placas de agar sangre y agar chocolate
- Placas de agar Mc Conkey
- Agar en tubo con cultivos bacterianos
- Tórulas estériles
- Baja lenguas
- Porta objetos
- Baterías para tinción de Gram
- Microscopio y accesorios
- Guantes

III. PROCEDIMIENTO
El estudio de las bacterias en el laboratorio implica el empleo de
diversos métodos. Algunos de éstos serán conocidos y practicados en el
laboratorio.

20
1. Esterilización:

El conocimiento de las características de una especie determinada de

bacterias se logra si previamente ésta se estudia en un cultivo puro, para esto
es necesario e indispensable emplear material completamente estéril.
Esterilización de asas y pipetas:
Cada vez que se desee utilizar asas de nicron, pipetas capilares o aforadas,
deben esterilizarse a la llama del mechero. Para esterilizar el asa, se coloca el
alambre en posición semivertical sobre la llama hasta que se ponga color rojo
vivo, inmediatamente se completa la esterilización flameando la parte metálica
del mango.
La esterilización de asas y pipetas capilares se realiza antes y después de
haberlas usado con bacterias.
Para tomar bacterias es preciso esterilizar previamente el asa y esperar hasta
que esté totalmente fría. El asa se enfría tocando las paredes del vidrio del
tubo, la tapa de la placa de petri, o bien la zona del medio en que no haya
bacterias. Luego se procede a tomar la muestra.
En el caso de las pipetas de tipo capilar para sembrar muestras clínicas y/o
cultivos líquidos, esta debe deslizarse sobre la llama girándola suavemente en
una extensión muy superior a la que se introducirá en el tubo, luego se enfría
del mismo modo que el asa de platino. En el caso de cultivos sólidos la pipeta
se quema en su extremo de modo que quede sellada y con una forma
adecuada para realizar la siembra.
Las pipetas aforadas pueden estar en cilindros metálicos o envueltas en papel
ya estériles. En el primer caso, se debe poner el cilindro en forma horizontal,
destaparlo y sacar una pipeta sin tocar con los dedos las otras, en el segundo
caso se debe desenvolver la pipeta, de manera de no tocar su extremo inferior,
luego se pueden pasar por la llama como en el caso de la pipeta capilar.

Esterilización de tubos de ensayo:

Cada vez que se destape un tubo estéril, se debe flamear su boca y repetir la
operación inmediatamente antes de volver a cerrarlo. Este procedimiento
pretende evitar la entrada de microorganismos del aire al interior del tubo.
1.1. Infórmese acerca del concepto de “esterilización” e “incineración”.
1.2. Siguiendo las indicaciones, practique la esterilización del siguiente
material de laboratorio: asa de nicron, pipeta Pasteur, tubos de ensayo.

2. Siembra o cultivo y aislamiento

Consiste en colocar a los microorganismos en un ambiente adecuado para que
se desarrollen y multipliquen. En el laboratorio este medio ambiente lo
constituyen los medios de cultivos corrientes o básicos y especiales.

El material que se siembra puede contener varias especies bacterianas, por lo

tanto, para estudiar las características de una especie, es necesario obtenerla
aislada en un cultivo puro.

21
2.1 Observe y reconozca los medios de cultivo más frecuentemente usados
en el laboratorio de Microbiología:
- Agar sangre de cordero

- Agar MacConkey

- Agar semitendido (agar corriente)

- Agar semisólido

METODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO

Debido a su rápida multiplicación, la mayoría de las bacterias deben ser

resembradas constantemente de un medio de cultivo a otro con el fin de
mantener su viabilidad y su vitalidad. Esta siembra a su vez debe ser hecha en
medios de cultivo adecuados para la bacteria y en estrictas condiciones de
asepsia para evitar contaminación con otros microorganismos.
Por aislamiento bacteriano se entiende la separación, en cultivos puros,
de las diferentes bacterias que se encuentran en cultivos o productos
polimicrobianos. En general, el microbiota de productos o ambientes naturales
(agua, alimentos, suelo etc.) y de materiales patológicos es heterogénea y por
lo tanto, el aislamiento constituye una etapa fundamental para la gran mayoría
de los estudios microbiológicos.
Las modalidades de siembra más empleadas en la práctica con fines de
aislamiento bacteriano son las siguientes:
Siembra en superficie
Se realiza en placas Petri, esta es la modalidad más empleada y existen
diferentes métodos para su realización. Se presentan tres de ellas.

1. Por agotamiento: Se toma el asa con la muestra, se realiza una línea

vertical de borde a borde y se procede a hacer una estría en zig-zag
desde un extremo a otro de la placa o el tubo. (Figura A)
2. En pentágono: Se toma la placa con la mano izquierda y se distribuye
la muestra o bacteria en una pequeña área junto a su borde. Se
esteriliza el asa, se enfría y se arrastra un poco de la muestra ya
sembrada hasta otra zona de la placa, deslizando el asa con movimiento
en zig-zag, evitando tocar nuevamente la siembra original. Se continúan
los movimientos hasta ocupar toda la superficie de la placa. (Figura B)
3. Para sembrar más de una muestra la placa se puede dividir hasta en 8
sectores debidamente rotulado. Se siembra con el asa que posee la
muestra, efectuando movimientos en zig- zag. Se esteriliza muy bien el
asa entre cada muestra (Figura C)

22
 Fig. A Fig. B Fig. C

Ej: Urocultivo o LBA Ej: Secreciones Ej: Mayor

cantidad de
cepas

Siembra en agar en picadura o en profundidad

Se utiliza asa en punta la que se carga con la bacteria y se pincha
verticalmente en el centro del agar.

Siembra de medio sólido a líquido y viceversa y de líquido a

líquido

Consiste en trasladar las bacterias de un medio a otro medio, con el

asa o pipeta pasteur, manteniendo las condiciones de asepsia para evitar la
contaminación.

2.2 Realice los siguientes tipos de siembras y aislamiento

Sólido a sólido:
Desde el tubo con cultivo bacteriano sembrar a:

- Placa de agar Sangre y placa MacConkey (asa en anillo

→ estrías en diferentes sectores de la placa) figura B

23
- Tubo con agar semitendido (asa en anillo o pipeta Pasteur
→ estrías en zig-zag)

Nota: Siempre debe rotular adecuadamente antes de sembrar placas y tubos

(con plumón permanente o etiqueta de identificación). Las placas se rotulan en
la base donde está el medio de cultivo y se dejan con la tapa hacia abajo.

2.3 Para realizar la siembra del material en distintos medios proceda

de la siguiente forma:

a) A partir de siembra en tubo, siembre en Placa de Petri

- Rotule la placa con los datos correspondientes
- Flamee el asa para su esterilización
- Enfríe el asa en las paredes internas del tubo o en el
líquido de Condensación
- Tome un pequeño inóculo del tubo problema o muestra
clínica
- Efectúe la siembra del tubo problema en el medio de cultivo de la
placa de Petri en forma estéril
- Levante la tapa de la placa lo necesario para introducir el
asa
- Imprima al asa un movimiento de zig-zag, tocando
superficialmente el medio de cultivo, procurando no romper el
agar (figura B)
- Tape la placa y flamee el asa para su esterilización
- Incube la placa sembrada en la estufa a la temperatura de 35-
37ºC

24
 b) A partir de siembra en tubo, siembre en tubo semitendido
- Rotule el tubo con los datos correspondientes
- Flamee el asa para su esterilización

- Enfríe el asa en las paredes internas del tubo o en el líquido

de condensación.
- Tome un inóculo del tubo problema
- Destape el tubo estéril e introduzca el asa cargada sin tocar las
paredes, hasta el fondo. Ascienda el asa imprimiéndole un movimiento
de zig-zag tocando superficialmente el medio de cultivo, procurando no
romper ni arrastrar el agar.
- Flamee la boca del tubo y tápela
- Flamee el asa para su esterilización
- Incube el tubo sembrado en la estufa a la temperatura de 35-37ºC

NOTA: En caso de utilizar pipetas Pasteur de vidrio para la siembra, estas

deberán ser descartadas en una caja de desecho de material corto
punzante (Safe box), ubicadas en cada mesón.

¡No se desplace por el laboratorio con material contaminado!

25
 Cuestionario

1. Realice los cálculos necesarios para preparar 300 ml de agar Mc Conkey

indicando todos los pasos que realizará para obtenerlo en placas petri.
Para su preparación lea las instrucciones de la etiqueta del frasco.

2. Indique como prepararía 150 ml de agar sangre cordero. Realice los

cálculos necesarios y lea las instrucciones de la etiqueta del frasco.

3. Vea las instrucciones de la preparación del agar chocolate. ¿Qué

diferencia hay con la preparación del agar sangre?

4. Indique la diferencia que existe entre la preparación del medio Mc Conkey

y del medio SS.

5. Defina:
a. Colonia:
b. Siembra
c. Resiembra
d. Inóculo
e. Medios de cultivos
i. Medio de cultivo Nutritivo y de 1 ejemplo
ii. Medio de cultivo Enriquecido y de 1 ejemplo
iii. Medio de cultivo Selectivo y de 1 ejemplo
iv. Medio de cultivo Diferencial y de 1 ejemplo
v. Medio de cultivo de transporte y de 1 ejemplo

26
 Sesión 2
TINCIONES: OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE BACTERIAS

Algunas consideraciones en el uso del microscopio

Debido al pequeño tamaño que tienen las bacterias, para observarlas es

necesario recurrir a la ayuda de un microscopio. Existen dos clases de
microscopios: el microscopio óptico y el electrónico. El primer grupo utiliza
un sistema de lentes ópticos (microscopios de luz) y comprende diferentes
tipos tales como:

- M. de campo claro, de uso habitual en el laboratorio

- M. de campo oscuro, en este caso los microorganismos aparecen claros
en un fondo oscuro. Se utiliza para observación de bacterias difíciles de
colorear, como por ejemplo Treponema pallidum, agente de la Sífilis.
- M. de contraste de fases, aquí, como en el caso anterior, se visualizan
bacterias sin técnicas de coloración.
- M. de luz ultravioleta, utiliza como fuente de luz la ultravioleta,
presentando mayor poder de resolución por tener menor longitud de onda,
de uso más restringido, con fines especiales
- M. de fluorescencia, de gran sensibilidad y especificidad.

El microscopio electrónico emplea en vez de ondas luminosas un haz de

electrones que cuando pasan a través de la preparación algunos son
difractados creando una imagen que se lee en una pantalla sensible a los
electrones la resolución obtenida por este microscopio es mayor que por el
microscopio óptico (MO) (puede apreciar partículas de 10 nm en vez de 200
nm del MO)

Microscopio de campo claro

El microscopio de campo claro será el que se utilizará en el trabajo práctico,
por lo que deberá familiarizarse con su estructura y manejo.

Estructura: El MO de campo claro consta de:

a) Dos sistemas de lentes convergentes
- Uno próximo al objeto llamado objetivo. Generalmente los microscopios
vienen con varios objetivos que se pueden usar indistintamente,
constituyendo la "pieza revólver". Estos objetivos pueden ser de poco
aumento (10X), mediano aumento (40X) o de inmersión (100X), siendo
el más usado en Bacteriología. Este lente se sumerge en la lámina
recubierta de aceite para visualizar, y al tener este mayor índice de
refracción que el aire, se aumenta el poder de resolución.
- Uno próximo al ojo llamado ocular que aumenta en diez veces la imagen
obtenida por el objetivo.
b) Una fuente de luz uniforme que puede ser externa al microscopio o venir
incluida en él.
c) Un condensador móvil.
d) Un espejo plano que refleje la luz.
e) Un diafragma.
f) La platina con pinzas para colocar la lámina y movilizarla.
g) Un mecanismo de ajuste para enfocar el sistema de lentes sobre el

27
 objeto que consta de:
- Un macrométrico de ajuste grosero. Se desplaza en cm. y coloca el
objeto próximo al foco.
- Un micrométrico de ajuste fino que opera en distancia de mm y otorga
el enfoque final.

MANEJO DEL MICROSCOPIO

- Utilizar el máximo de luz
- Subir el condensador al máximo
- Abrir completamente el diafragma.
- Colocar la lámina en la platina con una gota de aceite de inmersión.
- Utilizar el objetivo de inmersión (100X, con una línea negra).
- Enfocar bajando con el macrométrico el tubo, mirando desde afuera
hasta que el objetivo se sumerja en el aceite.
- Ahora mirar por el ocular y levantar el tubo lentamente hasta que sea
visible la imagen del objeto.
- Ajustar con el micrométrico. Si el preparado a visualizar ya está enfocado
utilizar únicamente el micrométrico para ajuste fino. Se recomienda mantener
los dos ojos abiertos para disminuir el esfuerzo visual. Este examen
microscópico puede realizarse, ya sea en fresco o después de fijación y
coloración, siendo ello lo más usado en el laboratorio clínico.

1= ocular
2= objetivos
3= platina
4= pinzas
5= macrométrico
6= micrométrico
7= diafragma
8= condensador
9= botón de
condensador 10=
tornillos de ajuste de
condensador
11= fuente de luz
12= control de la
luz
13-14-15- alternativos

La observación microscópica permite conocer algunas características de las

bacterias como ser: afinidad tintorial, forma, disposición o agrupación,
presencia o ausencia de cápsula, esporas, flagelos, movilidad, etc. Constituye

28
la primera etapa del estudio de las bacterias y del diagnóstico bacteriológico.

Observación con bacterias vivas: - al fresco

- en fondo oscuro

• Observación al fresco

Esta técnica nos permite apreciar la existencia de bacterias, su morfología; y

si presentan la propiedad de movilidad. Ello, a pesar de ser de gran
importancia, puede resultar dificultoso de diferenciar del movimiento browniano
típico de las bacterias o de las corrientes líquidas presentes en la preparación,
por lo que generalmente se utilizan otras técnicas para detectar esta
propiedad.

Se realiza colocando el material a estudiar entre porta (lámina) y cubre objetos

(laminilla), observándose posteriormente en objetivo de mediano aumento
(40X) o sea, sin aceite de inmersión. Un hecho a tener en cuenta es que se
trabaja con bacterias vivas, que no sufren artificio de fijación ni coloración, por
lo que se deben extremar los cuidados para evitar la contaminación. El examen
en fresco también puede ser utilizado con técnicas especiales, por ejemplo, la
tinción con tinta china nos permite identificar la presencia de una bacteria
capsulada.

• Observación con campo oscuro

Esta técnica no es de uso rutinario en los laboratorios porque las bacterias son
difíciles de visualizar debido a que su citoplasma es incoloro y presenta poca
diferencia con el índice de refracción del vidrio y del agua. Para la observación
se sustituye el condensador de abbé por el condensador de fondo oscuro, se
les emplea en la observación de bacterias muy pequeñas o de aquellas que
difícilmente se observan al microscopio corriente por su falta de contraste con
el medio como es el Treponema pallidum.

Observación con bacterias muertas: - Tinción simple

- Tinciones diferenciales
- Tinciones especiales

Para realizar la observación de bacterias muertas estas deben fijarse en un

frotis o porta objeto y luego aplicar la tinción deseada

Preparación de un frotis

Previo a la coloración de la muestra se deben realizar pasos fundamentales

como es la preparación y fijación del frotis. Antes de comenzar con la tinción
se debe tener todo el material necesario a la mano. Para preparar un frotis se
deben realizar tres etapas:

29
Extensión, secado y fijación

- Extensión: Depositar con el asa una gota de agua en el centro de la

lámina y suspender la colonia recogida en la gota de agua y esparcir con
la misma asa en forma homogénea hasta obtener un extendido delgado
(cuando es de medio sólido). En el caso de medio líquido se esparce
directamente la muestra en el portaobjeto.
- Secado: Puede dejarse secar a temperatura ambiente (desecación
espontánea) o para apresurar este paso conviene pasar la lámina varias
veces y en forma rápida sobre el mechero, en la zona de aire caliente
(alto).
- Fijación: Con este paso se pretende que el material se adhiera
firmemente a la lámina de manera que no se desprenda durante los
lavados, además, es necesario matar las bacterias antes de la coloración
esto para la conservación de su morfología. La muerte se debe a la
coagulación rápida de las proteínas de las células bacterianas. Como
fijadores se utilizan el calor seco, éter, metanol etc. La fijación por calor
es la más usada en Bacteriología. Consiste en pasar en forma rápida la
lámina con la cara conteniendo el frotis mirando hacia arriba, tres veces
por la parte más caliente de la llama del mechero.

La fijación por metanol también es utilizada en algunos tipos de muestras

como las líquidas, muestras para concentrar células, meconio u otras con gran
cantidad de grasa.

Se colocan unas gotas de metanol sobre la lámina por 1 minuto y se escurre

el exceso en un papel secante (toalla nova) y se deja secar al aire nuevamente.
No usar calor antes de teñir.

Los procedimientos de coloración cumplen con el objetivo de aumentar el

contraste entre las células y su medio ambiente, implican desde luego, la
muerte de ellas y por lo tanto alteraciones en su constitución. Existen diferentes
tipos de coloraciones:

Tinción simple: Se basa en el empleo de un solo colorante que recubre la

superficie bacteriana, de tal forma que todas ellas se observan del mismo color,
generalmente se usan colorantes de carácter básico, por ejemplo, Azul de
Metileno. Esta técnica nos permite apreciar forma y agrupación bacteriana.

Tinción Diferencial: Utiliza diferentes colorantes por lo que además de aportar

la información dada por la técnica anterior nos permite diferenciar a las
bacterias. Las tinciones diferenciales se basan en la aplicación de 2 colorantes,
en etapas sucesivas, entre las cuales se aplican mordientes y sustancia
decolorante, así las bacterias de diferente afinidad tintorial se observan
finalmente teñidas de diferente color. Las tinciones diferenciales más
importantes son: Tinción de Gram y Tinción de Ziehl Neelsen, las cuales
permiten agrupar a las bacterias en tres grandes grupos: Gram positivas (+),
Gram negativas (-) y ácido alcohol resistentes.

30
 El estudiante debe familiarizarse con estas técnicas que usará en
las prácticas de laboratorio:
Tinción de Gram:

Esta tinción diferencial fue desarrollada en 1882 y publicada el año 1884

por el histólogo Christian Gram, discípulo de Robert Koch, como un método
para la tinción de bacterias en tejidos. Mediante esta tinción las bacterias se
pueden clasificar en bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas. La
característica diferencial se basa en la estructura y composición de la pared
celular de bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Cuando la pared bacteriana se tiñe con el complejo cristal violeta – yodo, este
complejo queda atrapado dentro de los organismos Gram positivos y no
puede ser retirado fácilmente por el solvente alcohólico, debido a la naturaleza
físico -química de sus paredes celulares; se sabe que las paredes celulares
Gram positivas son menos permeables debido a la mayor cantidad de
peptidoglicano. Sin embargo, la diferente naturaleza de las bacterias Gram
negativas permite eliminar el complejo colorante-yodo por tratamiento con
alcohol y mediante una tinción de contraste observarlas de color rojo.
La fase de decoloración con alcohol constituye la etapa más importante de
la tinción de Gram y en ella reside su carácter diferencial. Las bacterias que
retienen el colorante se denominan Gram positivas y se observan de color
azul. Las bacterias que se decoloran con el alcohol y se tiñen con la
safranina se denominan Gram negativas y se observan de color rojo.

Técnica:
- Realizar un frotis

- Cubrir la preparación con cristal violeta y dejarlo en reposo por 1 min

- Lavar con agua (chorro suave de la llave)

- Agregar solución de lugol y dejar por 1 min.

- Lavar con agua (chorro suave de la llave)

- Decolorar rápidamente, dejando escurrir en forma alternada alcohol-

acetona y agua de la llave (chorro suave) 2 veces, escurrir el agua

- Cubrir el frotis con el colorante de contraste, safranina al 1% por 15

segundos

- Lavar con agua (chorro suave de la llave), dejar secar y observar

con aceite de inmersión.

31
Tinción de Ziehl Neelsen

Es una tinción que se utiliza para identificar las bacterias denominadas Bacilos
alcohol-ácido resistente (BAAR) que pertenecen al género Mycobacterium.
Perteneciente a este género bacteriano destacan el bacilo de la tuberculosis y
de la lepra. Esta tinción se emplea en el diagnóstico y control de tratamiento
de la tuberculosis, examinando diferentes muestras tales como: expectoración,
orina, sangre, LCR, etc.
La fucsina, que es un colorante básico, forma un complejo con los ácidos
micólicos de la pared de las micobacterias. Este complejo es resistente a la
decoloración con alcohol-ácido (alcohol y ácido clorhídrico) permaneciendo de
color fucsia a diferencia de las otras bacterias que se decoloran. El azul de
metileno se usa como tinción de contraste.

Técnica:
- Cubrir la preparación con fucsina fenicada durante 5 min. Aplicar calor
por 5 minutos o hasta emitir 3 veces vapores (máximo), evitando
sobrecalentar o quemar la muestra.
- Eliminar el colorante y lavar bajo un chorro suave de agua corriente
hasta que todo el exceso de colorante sea arrastrado por el agua.
- Decolorar con alcohol-ácido, lavar con agua y decolorar nuevamente
hasta que las partes más gruesas conserven sólo un tinte rosado (2-3 min).
- Lavar nuevamente con agua
- Cubrir la preparación con el colorante de contraste azul de metileno por
1-2 min.
- Lavar con agua
- Dejar secar a temperatura ambiente y observar al microscopio con el
objetivo de inmersión.

32
Los bacilos ácido-alcohol resistentes son aquellas que no pierden la
coloración inicial con la fucsina por acción del alcohol-ácido y se observarán
de color rojo. El resto de la preparación se observará de color azul.

Tinciones especiales: Permiten visualizar diferentes estructuras bacterianas,

como por ejemplo flagelos, esporas, cápsula, corpúsculos citoplasmáticos, etc.

Formas y agrupaciones bacterianas

La forma de la célula bacteriana es una característica que está determinada

genéticamente, por ello es constante para cada especie (a pesar de que
existen pequeñas variaciones durante los ciclos reproductivos) y es una
característica fundamental en taxonomía e identificación de especies a nivel
de laboratorio.

Las bacterias según su morfología se pueden clasificar en:

a) Cocos (esféricas)

Presentan forma esférica o casi esférica ya que sus diámetros (largo y ancho)
son casi iguales. En algunos casos se observan formas ovoides, arriñonadas,
o lanceoladas. La forma celular está directamente relacionada con las
estructuras de envoltura de la célula.

Los cocos se pueden clasificar según su agrupación en:

• Aisladas: no presentan agrupación aparente
• Diplococos: células agrupadas en pares
• Cadenas: células agrupadas en cadenas cortas (2-6) y largas (10-20)
debido a la división celular en plano vertical.
• Racimos: las células se dividen en plano horizontal y vertical en forma
simultánea originando una agrupación de células en forma de racimo.
• Tétrada: la división celular ocurre en diversos planos produciéndose la
formación de verdaderos cubos de células. Ej.: sarcina

b) Bacilos o Bastones

Estas células poseen una morfología más variable y se caracterizan porque

uno de los ejes o diámetro es notablemente mayor que el otro, por ello se
observan como bastoncitos de diferente ancho y longitud. Al observar algunas
especies bacterianas, éstas presentan diferentes formas durante su
multiplicación siendo posible observar células filamentosas, bacilos cortos,
ovoides, etc.; a esta propiedad se le denomina pleomorfismo o polimorfismo
(ejemplo: Haemophilus sp). En otros casos las formas bacilares se acortan en
forma notable llegando casi a adoptar la forma ovoide (morfología cocobacilar).

33
Los bacilos pueden presentarse de diferentes formas:
• Sin agrupación
• Diplobacilos: células aisladas en parejas, ejemplo Klebsiella pneumoniae.
• En cadenas: células bacilares en cadenas, ejemplo: Lactobacillus.
• Empalizada: disposición celular, una al lado de la otra, ejemplo:
Corynebacterium
• Curvos: Las hay en forma de gaviota Ej.: Campylobacter sp o en forma de
coma Ej.: Mobiluncus sp
• Espiriladas (Helicoidales): Generalmente de presentación aislada; las
células son muy largas en relación con su ancho y se observa una torción
alrededor de su eje (espiras) en un número característico para cada
especie ejemplo: Treponema, Leptospira. Las bacterias cortas y de espira
incompleta se denominan bacterias coma o vibriones
• Bacilos miceliares: Entre las bacterias, existen algunas capaces de
desarrollar en un comienzo un micelio rudimentario, el que luego se
fragmenta, ejemplo: Streptomyces sp., Nocardia, etc.

Bacilos

Cocos

Diplococaceas

Cocáceas en cadena

Cocáceas en racimo

Bacilos curvos

Bacilos espirilados

34
Observación microscópica:

• Enfoque, observe y dibuje lo observado en las preparaciones

teñidas e identifique la forma, agrupación y afinidad tintorial

……………………………………………………………..

……………………………………………………………..

……………………………………………………………..

……………………………………………………………..

……………………………………………………………

……………………………………………………………

• Trabaje con preparaciones frescas y observe formas bacterianas

y movilidad

• Prepare 1 frotis con las bacterias que se le indiquen. Para esto

proceda del siguiente modo:
a) Flamee la lámina rápidamente
b) Coloque una gota de agua en el centro de la lámina. (Sólo si la
muestra o cultivo es sólido).
c) Transfiera con un asa en anillo estéril una pequeña cantidad de
cultivo o de muestra y mezcle con la gota de agua formando una
suspensión, apenas opalescente. ¡No olvide esterilizar el asa antes
y después de su uso!

d) Fije el frotis exponiéndolo brevemente a la llama de un mechero hasta

que esté completamente seco. Pruebe el calor de la lámina sobre el dorso
de su mano (si está demasiado caliente se alterará la morfología
bacteriana)

35
 • Proceda a teñir los frotis con tinción simple:
a) Cubra con azul de metileno y deje reposar por 3-4 min.
b) Lave con un chorro suave de agua
c) Seque su frotis con papel absorbente y observe con aceite de inmersión

NOTA: acuérdese de lavar también el dorso de la lámina, al secar la

lámina tener la precaución de no arrasar con la preparación.

La tinción diferencial se basa en la afinidad relativa de distintas bacterias o

de sus estructuras, por los reactivos empleados (colorantes). Entre los
métodos diferenciales, la tinción de Gram es la más usada en bacteriología

• Tiña un frotis empleando la tinción de Gram

• Caracterice el frotis realizado por usted y el entregado por docente de

acuerdo con: forma, agrupación bacteriana y afinidad tintorial. Dibuje:

Tinción de Esporas: Esta tinción No se realizará en el práctico

- Realice un frotis en la forma habitual

- Cubra con verde de malaquita y caliente suavemente durante 1-2 min.

(sólo emisión de vapores evite que hierva)

- Lave con agua de la llave

- Cubra su frotis con safranina por 30 seg.

- Lave, seque y observe con inmersión

Tinción para cápsula: (Esta tinción no se realizará en el práctico)

- Coloque una gota moderada de tinta china sobre una lámina y

emulsione sobre ella la bacteria en estudio.

- Extienda la suspensión de manera que el frotis resulte delgado

36
- Deje secar y fije

- Cubra con fucsina

- Lave, seque y observe con inmersión.

Cuestionario:
1) ¿Qué es la metahemoglobina, en qué tipo de agar se puede observar y
por qué?

2) ¿Cuál es el límite de resolución del microscopio óptico y del

microscopio electrónico?

3) ¿Cuál es el tamaño aproximado de los siguientes microorganismos?:

Candida albicans
…………………………………

Streptococcus agalactiae…………………….
Escherichia coli
…………………………………..
VIH………………………………………….

Complete el siguiente cuadro

Agente Afinidad forma agrupación Tinción dibujo

infeccioso tintorial diferencial
Staphylococcus
Streptococcus
Escherichia coli
Mycobacterium
Campylobacter
Candida

37
 SESIÓN 3
S
MORFOLOGÍA BACTERIANA

1) Describir y comparar la morfología de las colonias bacterianas

desarrolladas en placas de agar sembradas anteriormente

2) Reconocer los distintos tipos de colonias y hemólisis

3) Realizar frotis y teñir con tinción de Gram

4) Identificar el movimiento de las bacterias, la morfología y

agrupación microscópicas

I- MATERIALES
- Asas de nicron en punta y en aro
- Pipetas Pasteur de vidrio
- Placas sembradas por alumnos
- Placas preparadas por docente
- Láminas con tinciones fijadas
- Microscopios
- Aceite de inmersión
- Xilol
- Portaobjetos y cubreobjetos
- Kit de colorantes para tinción de Gram

II- PROCEDIMIENTO

Una etapa importante y básica en el estudio de las características de

una bacteria, es la observación directa de su morfología macroscópica y
microscópica

38
Observación macroscópica de bacterias:
Las bacterias se pueden analizar en base a su morfología
macroscópica y esta descripción abarca los siguientes aspectos:

 La Forma de la colonia bacteriana: - Puntiforme

- Circular
- Irregular
- Filamentosa
- Rizoide
- Fusiforme

 Los Bordes de la colonia: - Liso

- Ondulado
- Lobulado
- Filamentoso
- Algodonosa

 La Elevación de la colonia: - Plana

- Elevada
- Forma de gota o pulvinada
- Umbilicada
- Convexa

 La Textura de la colonia: - Seca

- Mucosa
- Chiclosa
- Rugosa
- Escamosa

 El Color de la colonia: - Amarilla

- Blanca
- Rosada
- Transparente
- Opaca
- Brillante etc.

39
 Hemólisis: Una característica especial de algunos tipos bacterianos y que
nos ayuda a describirlas en forma más completa es la Hemólisis, que es la
capacidad que tienen algunas bacterias de lisar los glóbulos rojos presentes
en las placas de Agar sangre, esto es muy usado con fines diagnósticos.
Esta característica se describirá en detalle en capítulos posteriores. Según
el tipo de hemólisis las colonias se clasifican en: beta hemolíticas (donde
hay destrucción de la totalidad de glóbulos rojos), alfa hemolíticas (donde
la hemólisis es parcial y se observa un precipitado verde denominado
metahemoglobina), sin hemólisis (antiguamente llamada gamma
hemolítica).

Observación macroscópica:

Describa y compare las colonias desarrolladas en estos medios

considerando los siguientes aspectos: forma, borde, elevación,
características físicas (textura, color, tamaño)

Agar Sangre Agar Mc Conkey

40
 SESIÓN 4 y 5
MICROBIOTA HABITUAL

Los microorganismos interaccionan con los humanos en una gran variedad

de formas, a veces beneficiosas y a veces perjudiciales. Desde las pocas horas
después del nacimiento somos colonizados por bacterias que vivirán con
nosotros durante toda la vida, estas bacterias colonizan toda la piel, tracto
digestivo, vías respiratorias altas, oídos y algunos otros tejidos.

Estas bacterias están presentes ya que cumplen algunas funciones

importantes tales como: fabricar nutrientes para nuestro organismo, por
ejemplo, las bacterias coliformes del intestino producen vitamina K y otras
bacterias aportan otro tipo de nutrientes. Las bacterias del microbiota normal
también mantienen controlados a otros microorganismos nocivos, ya que, de no
ser así, seríamos invadidos por bacterias que nos causarían daño. Por
ejemplo, con el uso de antibióticos de amplio espectro que elimina parte del
microbiota normal, no es rara la aparición de infecciones por bacterias nocivas
que normalmente crecen de forma limitada o bien bacterias externas que llegan
a un ambiente donde pueden colonizar sin restricciones. También se sabe que
la microbiota normal estimula el desarrollo del sistema inmune y que puede
ayudar a proteger de otras infecciones. Sin embargo, sabemos que algunas de
estas bacterias con las que convivimos diariamente pueden representar un
riesgo para nuestra salud, principalmente en las siguientes situaciones:

- Cuando crecen de forma anormalmente alta

- Cuando existen bacterias en un sitio anormal al que les corresponde
- Cuando existen bacterias en un sitio normalmente estéril

Como podemos suponer el cuerpo es un delicado ecosistema en donde

viven simbióticamente un gran número de bacterias y el huésped humano
mantiene una relación en donde estas bacterias representan un riesgo
potencial cuando este equilibrio se rompe, ya sea por alteración del ecosistema
bacteriano o por factores del hospedero que favorezcan la disminución de la
inmunidad (defensas) y que permiten que las bacterias normales invadan y
ataquen a su hospedero humano.

- Localización de la microbiota

Los microorganismos se encuentran en aquellas partes del cuerpo

expuestas al medio ambiente o que lo comunican con él como, por ejemplo:
piel, nariz, boca, intestino y tracto urogenital, etc. Los órganos y tejidos internos
son habitualmente estériles. Las áreas colonizadas con el mayor número de
microorganismos se muestran en la Tabla 1 y en la Tabla 2, se muestran los
microorganismos más representativos de esta.

41
 Tabla 1: Áreas más colonizadas del organismo
Ubicación Sitio anatómico específico
Áreas húmedas: región inguinal,
Piel región axilar, espacio interdigital de
los pies.
Tracto respiratorio fosas nasales, faringe
Tracto digestivo boca, intestino grueso
Tracto genital vagina

Tabla 2: Microorganismos más representativos de la microbiota

Lugar anatómico Organismo (*)
Piel
Staphylococcus, Corineformes,
Cutibacterium acnes, Levaduras,
Streptococcus,
Peptococcus
(micrococos anaeróbicos)
Enterococcus, Bacteroides

Boca y Faringe Streptococcus, Lactobacillus,

Neisseria, Corineformes,
Actinomycetes, Staphylococcus,
Levaduras

Fosas nasales Staphylococcus, Neisseria,

Streptococcus, Microbiota de piel

Tracto gastrointestinal Enterococcus, Micrococcus,

Lactobacilus, Enterobacterales,
Streptococcus, Bacteroides, en
Intestino grueso 90-95% son
anaerobios estrictos
Tracto genital Escherichia coli, Lactobacillus,
Staphylococcus, bacterias
anaeróbicas, Proteus, levaduras

(*) Muchos de los géneros indicados contienen también especies patógenas para el Ser
Humano en circunstancias determinadas y no todos los microorganismos se encuentran en
todos los individuos.

42
 En otras zonas del cuerpo existen cantidades menores de
microorganismos, a menudo en tránsito (parte del aparato digestivo y
respiratorio, vejiga, útero). El hallazgo de microorganismos patógenos en estos
sitios es altamente sugerente de enfermedad.
También existen zonas denominadas zonas estériles donde la
presencia de microorganismos se considera de importancia clínica, por
ejemplo: sangre, líquido cefalorraquídeo (LCR), líquido de cavidades estériles
(Liq. Sinovial, pleural, ascítico, etc.) y tejidos profundos en general.

PROCEDIMIENTOS PARA TOMA DE MUESTRAS

Previamente realizar lavado de manos

a) Fosas nasales:

- Obtención de la muestra: La tórula se introduce en una fosa nasal,

profundamente, sobrepasando el meato medio, en dirección al piso de la
fosa nasal.
- Se frota girando la tórula suavemente.
Evitar que la tórula toque cualquier superficie que no sea la fosa nasal

Procesamiento:
- Sembrar de inmediato en placas de agar chocolate
- Incubar a 35-37°C, con 5% CO2 por (jarra con vela), por 24 horas a 48
horas
- Individualizar colonias
- Estudio macroscópico
- Estudio microscópico
- Realice las pruebas bioquímicas que le indique el profesor

b) Faringe:

- Obtención de la muestra:
1. Colocar a la persona que será objeto de estudio en posición cómoda y
con buena iluminación
2. Hacer pronunciar la letra A
3. Bajar suavemente la lengua con la bajalengua
4. Frotar la tórula con firmeza, pero con suavidad por ambas caras de
las amígdalas y luego, por la pared posterior de la faringe
Evitar que la tórula toque cualquier superficie que no sea la faringe

Procesamiento:
- Sembrar de inmediato en placa de agar sangre
- Incubar de inmediato a 35-37°C en atmósfera normal por 24 horas
- Individualizar colonias
- Estudio macroscópico
- Estudio microscópico
- Realice las pruebas bioquímicas que le indique el profesor

43
c) Deposiciones:

Obtención de la muestra: La tórula se introduce en el recto,

aproximadamente 1 cm y se hace girar suavemente.

- Sembrar de inmediato la muestra en placa de agar Mc Conkey

- Incubar de inmediato a 37°C por 24 horas
- Individualizar colonias
- Estudio macroscópico
- Realice las pruebas según indicación

- CUESTIONARIO:

1.- ¿Qué se entiende por:

a) Microbiota normal

b) Microbiota transitoria o temporal

2. Enumere 3 efectos benéficos de la Microbiota l

3.- ¿Cuál es la acción de antibióticos de amplio espectro sobre la

microbiota intestinal?

4.- Mencione 2 cuadros patológicos en los cuales microorganismos

constituyentes de la microbiota habitual al ser introducidos en otras
localizaciones y si existen factores predisponentes del hospedero, podrían
actuar como patógenos.

5.- Enumere los principales microorganismos que constituyen la microbiota

habitual de: piel, boca, faringe, fosas nasales y tracto gastrointestinal

44
 Sesión 6 y 7

FAMILIA STAPHYLOCOCCACEAE
GENERO STAPHYLOCOCCUS

OBJETIVOS

1) Identificar las características microscópicas y macroscópicas del

género
Staphylococcus

2) Reconocer las pruebas bioquímicas para la identificación del género y

especie de Staphylococcus

3) Escribir correctamente los nombres de las cocáceas Gram positivas

de importancia médica

INTRODUCCION

Características generales

Cocos Gram positivos de 0,5-1,5 µ de diámetro, agrupados

irregularmente o en racimos, más raramente en pares o tétradas. Son catalasa
positiva, inmóviles, anaerobios facultativos (excepto Staphylococcus
saccharolyticcus, que es anaerobio estricto). Utilizan la glucosa en aerobiosis
y anaerobiosis, siendo esta última una de las características más usadas para
diferenciarlos del género Micrococcus (Familia Micrococcaceae), el cual
solamente oxida la glucosa. Son bacterias halófilas, propiedad que se
aprovecha para su aislamiento con altas concentraciones de cloruro de sodio
(6-15%).
El género Staphylococcus está constituido actualmente por 47 especies,
siendo las de mayor importancia para el Ser Humano S. aureus, S.
epidermidis,
S. saprophyticus y S. lugdunensis.

Características morfológicas

Los Staphylococcus en placa de agar sangre (incubada 18-24 hrs. a 35ºC)

aparecen como colonias redondas, lisas, blancas o amarillas con o sin
hemólisis. Crece bien en medios corrientes. A la tinción de Gram, los
Staphylococcus se ven como cocáceas Gram positivas, redondas, de un
mismo tamaño, aisladas, en diplo o agrupadas en racimo o en cadenas cortas.
La especie más frecuentemente aislada en humanos, en cuadros supurativos
es Staphylococcus aureus y es un importante agente de infección
intrahospitalaria.

45
II- Procedimiento de identificación de Cocáceas Gram positivas

Morfología de colonia
y/o
Tinción de Gram

Cocáceas Gram (+)

Catalasa

ositiva ativa

taphylococcus treptococcus
Micrococcus nterococcus

47
 Staphylococcus
Micrococcus

Sensible Resistente

Micrococcus Staphylococcus

Positiva Negativa

S.aureus S. coagulasa (-)

*S.pseudintermedius
*S hyicus
*S schleiferi

Sensible Resistente

S.saprophyticus
S. coagulasa (-)

Por ejemplo: S
epidermidis S
lugdunensis etc.

* Staphylococcus de origen animal que puede infectar al Ser Humano

** La prueba de Novobiocina se realiza SOLO en Staphylococcus aislados de orina

DIFERENCIACION DE LAS ESPECIES DE STAPHYLOCOCCUS

S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus
Color de las colonias Amarillo-blanco Blanco Blan
co
Hemólisis en agar sangre cordero + + -
/-
Crecimiento anaerobio + + +/-
Coagulasa en tubo + - -
Fermentación de la glucosa + + +
Fermentación del manitol + - -
Fermentación de la threalosa + - +
Novobiocina Sensible Sensible Resistente

48
 Pruebas convencionales usadas en la identificación

Prueba de la catalasa:
La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H₂O₂)
en agua y oxígeno. La mayor parte de las bacterias aerobias y anaerobias
facultativas poseen actividad catalasa a excepción de los Estreptococos. La
prueba de la catalasa se usa con mucha frecuencia para diferenciar
miembros de la familia Staphylococcaceae de miembros de la familia
Streptococcaceae.

Procedimiento:
En un portaobjeto agregar una gota de peróxido de hidrógeno al 3% Con una
pipeta Pasteur o palillo de madera, transferir parte de una colonia sobre el
peróxido y observar la formación inmediata de burbujas.

Resultado:
La aparición rápida y sostenida de burbujas o efervescencia indica reacción
positiva. Existen bacterias que poseen enzimas distintas a catalasa que pueden
descomponer el peróxido, la observación de unas pocas burbujas después de 20
a 30 segundos no se considera reacción positiva.
Control de calidad
Positivo: Staphylococcus spp
Negativo: Streptococcus spp

Nota: Los eritrocitos poseen catalasa, por esto tener cuidado al hacer la prueba
desde placas de agar sangre pues dará una reacción falsa positiva. Las asas
metálicas también pueden dar resultados falsos positivos

Prueba de bacitracina (0,04 U):

El disco de bacitracina es un método que permite diferenciar
estafilococos de micrococos. Los estafilococos son resistentes al
compuesto, mientras que los micrococos son sensibles.

Procedimiento:
- Preparar una suspensión de la cepa en estudio en S.F., esta
suspensión debe tener una turbidez semejante al estándar 0,5 Mc
Farland
- Con una tórula, sembrar en césped (distribuir en 3 direcciones
diferentes parte de la suspensión) sobre la mitad de la placa o en la
placa entera de agar sangre.
- Colocar en forma aséptica un disco de bacitracina en el centro del área
sembrada. Presionar suavemente el disco sobre la placa e incubar en
aerobiosis a 36 ± 1ºC durante 18-24 hrs. Al cabo de ese tiempo se mide
el halo de inhibición alrededor del disco.

Resultado:
- Halo de inhibición ≥ 10 mm Micrococcus
- Halo de inhibición < 10 mm Staphylococcus

49
 Control de calidad
Positivo (Sensible): Micrococcus spp
Negativo (Resistente): Staphylococcus spp

- Prueba de la coagulasa:
La coagulasa es una proteína, que tiene actividad similar a la
protrombina, es capaz de convertir el fibrinógeno en fibrina, lo que da
como resultado la formación de un coágulo. La prueba de la coagulasa
se utiliza para identificar Staphylococcus aureus y diferenciarlo de otras
especies de estafilococos.

Procedimiento:
- Emulsionar con asa en argolla o loop una pequeña cantidad de colonia
del microorganismo en un tubo que contenga 0,5 ml de plasma de
conejo o humano, incubar el tubo a 36 ± 1ºC durante 4 horas y ver
formación de coágulo, si no se observa dejar a Tº ambiente y leer
después de 18 hrs.
Control de calidad
Positivo: Staphylococcus aureus
Negativo: Staphylococcus epidermidis

Prueba de la
Novobiocina:
Procedimiento:
- Preparar una suspensión del microorganismo en caldo o suero
fisiológico (S.F.) similar a 0,5 Mac Farland
- Con una tórula, sembrar en césped (distribuir en 3 direcciones diferentes
parte de la suspensión) sobre la mitad de la placa o en la placa entera
de agar sangre.
- Colocar un disco de novobiocina (en forma aséptica) en el centro del
área sembrada.
- Incubar en aerobiosis a 36 ± 1ºC durante 18 a 24 hrs

Resultado:
- S. saprophyticus es resistente a la novobiocina y
presentará ausencia de halo de inhibición o bien halos de
hasta 12 mm.
- Otros Staphylococus son sensibles a la novobiocina y
presentarán halos de inhibición de 16 mm o mayores

Control de calidad
Positivo (Resistente): Staphylococcus saprophyticus
Negativo (Sensible): Staphylococcus epidermidis

50
Colonias medianas, de aspecto cremoso, bordes lisos, color crema o gris.
Generalmente presentan β hemólisis

51
Colonias más pequeñas que las de S. aureus, de aspecto cremoso, color blanco
y generalmente sin hemólisis

52
Describa las características macroscópicas de las placas entregadas por el docente

………………………………………………………………………………………………………………
…

………………………………………………………………………………………………………………
…

………………………………………………………………………………………………………………
…

………………………………………………………………………………………………………………
…

53
Dibuje la morfología y agrupación observada en el microscopio óptico de 2 tinciones de Gram:

54
 GÉNERO STREPTOCOCCUS Y ENTEROCOCCUS

OBJETIVOS

1) Identificar las características microscópicas y macroscópicas de los

Géneros Streptococcus y Enterococcus

2) Reconocer las pruebas bioquímicas para la identificación de los

ambos géneros

3) Reconocer los distintos tipos de hemólisis producido por las especies

de estos géneros

4) Escribir correctamente los nombres de las cocáceas Gram positivas

de importancia médica

INTRODUCCION

Características generales:

El género Streptococcus pertenece a la familia Streptococcaceae. Está

conformado por cocos Gram positivos, catalasa negativos que tienden a crecer
en pares o en cadenas, inmóviles, poseen un metabolismo anaeróbico
facultativo. Dentro de la familia los géneros Streptococcus y Enterococcus
ocupan un importante rol como patógenos para el ser humano y animales.
Existen otros géneros dentro de la familia que pueden ser encontrados en
infecciones en el Ser Humano tales como los géneros Peptococcus y
Peptostreptococcus (ambos anaerobios estrictos). El género Enterococcus
está igualmente conformado por cocos Gram positivos, que se encuentran
aislados, en pares o cadenas cortas, pero pueden mostrarse cocobacilares en
medios sólidos, algunas especies de este género son móviles.

Características morfológicas:

Las especies del género Streptococcus son bacterias relativamente

fastidiosas con requerimientos nutricionales que varían según las e s p e c i e s.
Crecen en agar sangre, algunas especies requieren CO₂ (5-10%). Las
colonias
aisladas miden de 0,3 a 2 mm de diámetro, son opacas, blanquecinas,
circulares, y presentan hemólisis variable. Los Streptococcus se clasifican en
serogrupos según Lancefield A, B, C, D, E, F, G siendo los más importantes
clínicamente el grupo A (S. pyogenes), B (S. agalactiae) ambos β-hemolíticos.
Streptococcus grupo viridans y Streptococcus pneumoniae presentan α
hemólisis.

55
La especie Streptococcus pneumoniae (Neumococo alfa hemolítico) crecen en
placas de agar sangre y agar chocolate con colonias pequeñas, grisáceas y
mucoides (claras como el agua), y están rodeadas de una zona verdosa de α
hemólisis. Las colonias jóvenes de neumococo y de Streptococcus grupo
viridans aparecen levantadas; sin embargo, después de 24-48 hrs., el centro
de las colonias de neumococo se vuelve deprimido, con una apariencia
umbilicada, mientras que Streptococcus grupo viridans no.

Las especies de Enterococcus pueden crecer en un amplio rango de

Tº (10-45ºC), crecen en caldo NaCl 6,5% e hidrolizan la esculina en presencia
de sales biliares. Las colonias en agar sangre son lisas, pequeñas,
blanquecinas o grises y de hemólisis variable

Pruebas convencionales para su identificación:

• Hemólisis:
El agar sangre de cordero 5%, es un medio enriquecido utilizado
para la siembra de la mayoría de las muestras clínicas que permite el
crecimiento de bacterias poco exigentes como exigentes y además
permite detectar la producción de hemolisinas que son enzimas
bacterianas que provocan la lisis de eritrocitos. Existen 3 tipos de
hemólisis: alfa (hemólisis parcial), beta (hemólisis total) y sin
hemólisis, que son útiles en el diagnóstico del género Streptococcus.

• Prueba de sensibilidad a bacitracina (0,04 U)

La susceptibilidad a bajas concentraciones del antibiótico
bacitracina proporciona un método sencillo y económico para la
identificación presuntiva de los estreptococos β-hemolíticos del grupo
A.
Los estreptococos del grupo A son sensibles a concentraciones
relativamente bajas de bacitracina. Los estreptococos de los otros
grupos suelen ser resistentes a la bacitracina

Procedimiento:
- Tomar 3 o 4 colonias aisladas de estreptococos β-hemolíticos y estriar
el inóculo hasta el centro de la mitad de una placa de agar sangre ó
preparar una suspensión de la cepa en estudio en S.F., esta suspensión
debe tener una turbidez semejante al estándar 0,5 Mc Farland
- Con una tórula, sembrar en césped (distribuir en 3 direcciones
diferentes parte de la suspensión) sobre la mitad de la placa o en la
placa entera de agar sangre.
- Colocar un disco de bacitracina (0,04 U) sobre el área sembrada
- Incubar la placa por 18-24 hrs a 36 ± 1ºC en microaerofilia (5-10% CO2)

Resultado:
- Sensible Cualquier tamaño del halo alrededor del disco
- Resistente Desarrollo hasta el borde del disco
Control de calidad
Positivo (Resistente): Streptococcus agalactiae
Negativo (Sensible): Sreptococcus pyogenes
Nota: deben probarse solamente los estreptococos β hemolíticos, ya que muchos estreptococos alfa hemolíticos
(incluidos los neumococos) son sensibles a bajas concentraciones de bacitracina

56
• Prueba de CAMP
Esta prueba permite separar a Streptococcus agalactiae (St.
Grupo B) de los demás Streptococcus β-hemolíticos. El Streptococcus
agalactiae produce un factor llamado CAMP (factor de monofosfato de
adenina cíclica) que aumenta la zona de hemólisis producida por un
estafilococo productor de β-lisina

Procedimiento:
- Estriar en forma vertical una estría de Staphylococcus aureus
productor de β-lisina en agar sangre de cordero al 5% y estriar de
forma perpendicular 1 o 2 colonias β-hemolíticas en estudio, sin
que se toquen ambas estrías (dejar 1 mm aprox de distancia)
- Incubar por 18 -24 hrs. a 36 ± 1ºC en microaerofilia (5-10% CO2).

• Incluir siempre control positivo y negativo

Resultado:
- Una reacción positiva se evidencia por la presencia de una zona
de potenciación de la hemólisis en forma de punta de flecha en el
lugar donde se contactan las 2 estrías
Control de calidad
Positivo: Streptococcus agalactiae
Negativo: Streptococcus pyogenes

• Prueba de la sensibilidad a optoquina:

Se realiza con un disco de 6 mm, con 5 µg de optoquina y tiene
por objeto diferenciar las cepas de S. pneumoniae de las de
Streptococcus grupo viridans. El clorhidrato de etilhidrocupreína
(optoquina), un derivado de la quinina, inhiben en forma selectiva el
crecimiento de Streptococcus pneumoniae a muy bajas concentraciones
(5 ug/ml o menos). Asimismo, la optoquina puede inhibir otros
Streptococcus grupo viridans, pero sólo a concentraciones mucho más
altas. La prueba tiene una sensibilidad de más del 95%, es barata y fácil
de realizar.

Procedimiento:
- Con un asa seleccionar 3 o 4 colonias bien aisladas del microorganismo
a probar y estriarlas en mitad de la placa ó preparar una suspensión de
57
 la cepa en estudio en S.F., esta suspensión debe tener una turbidez
semejante al estándar 0,5 Mc Farland
- Colocar un disco de optoquina e incubar a 36 ± 1ºC durante 18-
24 hrs. en jarra con vela o en estufa con 5-10% de CO₂.
- Lea, registre e intérprete los resultados

Resultado:
• Halo de inhibición de 14 mm o mayor presuntivo S.
pneumoniae
• Halo de menor inhibición Realizar solubilidad en bilis
Control de calidad
Positivo (Sensible): Streptococcus pneumoniae
Negativo (Resistente): Streptococcus mutans

58
• Prueba de tolerancia a la sal:

La capacidad de desarrollarse en presencia de cantidades

variables de cloruro de sodio es una propiedad que ha sido utilizado para
caracterizar varias bacterias. Sin embargo, es de particular utilidad para
la identificación presuntiva del género Enterococcus y Streptococcus
grupo D, que poseen la capacidad específica de desarrollarse en
presencia de NaCl al 6,5%, incorporado a medios líquidos o sólidos. Esta
prueba junto con la de agar bilis-esculina (BE) se utiliza para distinguir
especies de Enterococcus de los Streptococcus grupo D (bovis y
equinus). El caldo infusión cerebro-corazón es un caldo nutritivo de uso
general que se utiliza para el cultivo de muchas bacterias. Normalmente
contiene 0,5% de NaCl. Si se aumenta la concentración de NaCl al 6,5%
el medio se hace semiselectivo para el desarrollo de Enterococcus.

Procedimiento:

- Sembrar en caldo hasta alcanzar turbidez y traspasar al caldo

sal 2-3 gotas
- Incubar a 36 ± 1ºC por 24 hrs
en aerobiosis.
Resultado:
Reacción positiva Desarrollo bacteriano en el medio
(turbidez), con cambio o sin de color
Si el microorganismo es BE positivo y se desarrolla en caldo
NaCl 6,5%, pertenece al género Enterococcus
Si es BE positiva, pero no se desarrolla en caldo NaCl 6,5%, es
Streptococcus del grupo D

Control de calidad
Positivo: Enterococcus faecalis
Negativo: Streptococcus gallolyticus

• Prueba de bilis-esculina
Esta prueba permite separar los estreptococos del grupo D de
los demás grupos de estreptococos. Se basa en la capacidad de los
estreptococos grupo D de crecer en un medio de cultivo que contiene
40% de bilis y de hidrolizar la esculina a esculetina, la cual se combina
con el citrato ferroso que posee el medio, dando un complejo de color
negro

Control de calidad
Positivo: Enterococcus faecalis
Negativo: Streptococcus pyogenes

59
 Características diferenciales de Streptococcus de los grupos
de Lancefield

Característica Grupo A Grupo B Grupo C,F y Grupo D

G
Hemólisis β Β β α, β y sin
hemólisis
Prueba de - + - -
CAMP con
S.aureus (ß-lisina)
Sensibilidad a + - V -
bacitracina
(0.04 U)
Resistencia a + + + +
optoquin
Crecimiento en - V - +/
NaCl -
6.5%
Hidrólisis de - - - +
esculina
en presencia de
bilis
PYR + - - +

• Describa las características microscópicas y macroscópicas y tipos

de hemólisis de las colonias de las placas entregadas por los
docentes. Registre sus resultados

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

• Realice las pruebas bioquímicas para la identificación de Streptococcus

y Enterococcus. Registre sus resultados:

60
Colonias pequeñas de color gris, aspecto húmedo o secas y con
gran β hemólisis y miden ≥ 0,5 mm

Colonias pequeñas de color blanco a gris, aspecto húmedo

y β hemolisis acotada, rodeando estrechamente la colonia.
Miden ≥ 0,5 mm

61
Colonias α hemolíticas (verdosas), pequeñas o medianas, de color gris,
aspecto mucoso, seco umbilicado

Colonias pequeñas o medianas, de color gris, γ hemolíticas (no

presentan hemólisis)

62
 Sesiones 8

Cocobacilos, Diplococos Gram Negativo y Bacilos Gram Positivo

OBJETIVOS

1. Identificar las características microscópicas y macroscópicas de

cocobacilos Gram negativos, cocáceas Gram negativo y bacilos Gram
positivo de importancia médica

2. Reconocer las pruebas bioquímicas para la identificación de los

diferentes géneros

INTRODUCCION

Género Haemophilus

Características generales

El género Haemophilus se compone de cocobacilos Gram negativo

anaerobios facultativos. Su crecimiento es generalmente óptimo cuando se
incuba a 35-37°C en una atmósfera con 5-10% de CO2. A la mayoría de las
especies se les considera nutricionalmente fastidiosas porque requieren para
su crecimiento medios enriquecidos con NAD (factor V) y/o hemina (factor X),
por lo que usualmente no crecen en agar sangre, el cual contiene adecuadas
cantidades de hemina, pero contiene factor V únicamente dentro de los
eritrocitos. Sin embargo, Haemophilus puede crecer en agar sangre alrededor
de otras bacterias, como Staphylococcus aureus, que proporcionan el factor V.
A este fenómeno se le conoce como satelitismo.
En el género Haemophilus se han descrito nueve especies que se
asocian al ser humano, ya sea como flora normal en el tracto respiratorio
superior o como agentes de infecciones
Las especies que pueden estar asociadas a infecciones en el ser
humano incluyen H. ducreyi (Familia Pasteurellaceae, H. parainfluenzae, H.
aphrophilus (hoy conocida como Agregatibacter aphrophilus). Sin embargo, la
especie más importante desde el punto de vista de las infecciones en el ser
humano es H. influenzae.

Características morfológicas

Las especies de Haemophilus no crecen en placas de agar sangre,

excepto cuando se produce satelitismo, observándose como colonias
puntiformes. Un medio enriquecido que proporciona los factores necesarios
para su crecimiento óptimo es el agar chocolate, en el cual se observan
colonias pequeñas a medianas, lisas, color gris a crema. Microscópicamente
son cocobacilos Gram negativos que pueden presentar además pleomorfismo
celular, dependiendo de la edad del cultivo y el medio que se utiliza. En los
cultivos más viejos se observan células bacterianas con formas bacilares,

63
mientras que en los cultivos más jóvenes se encuentran formas cocoides
o cocobacilares.

Pruebas convencionales para la identificación de especies

3. Prueba de requerimientos de factores X y V

El factor X (hemina) y el factor V (NAD) son necesarios, ya sea
en forma aislada o en combinación, para soportar el desarrollo de
diferentes especies de Haemophilus en medios sólidos. Los discos
impregnados con estos factores se colocan sobre la superficie de un
medio deficiente en ellos (Müeller Hinton, soya tripticasa etc.) que ha
sido sembrado en superficie con el microorganismo a probar.

Procedimiento:
- Preparar una suspensión (Mac Farland 1) de un cultivo puro
del microorganismo a identificar
- Sembrar en placa de agar Mueller Hinton con la
suspensión preparada
- Colocar discos o tiras, uno con el factor V, otro con el factor X y
otro con los dos, en la superficie del agar (alejados unos de otros)
e incubar a 36 ± 1ºC durante 18 a 24 hrs en microaerofilia (CO₂
5-10%)

Resultados:
- Inspeccionar la superficie del agar observando la aparición de
desarrollo visible entre o alrededor de uno o más de los discos

Control de calidad
Haemophilus parainfluenzae: crecimiento alrededor solo factor V
Haemophilus influenzae: crecimiento alrededor del disco con
factor X y V o entre factores X y V

4. Serotipificación para H. influenzae

La cápsula de muchas especies de bacterias es un factor de
virulencia y permite la serotipificación. Las cepas capsuladas de
Haemophilus se pueden identificar por tipificación serológica, en base a
la composición química del polisacárido capsular.

Género Neisseria

Características generales

Juntamente con los géneros Moraxella (incluyendo Branhamella

catarrhalis, actualmente Moraxella catarrhalis), y Kingella conforman la familia
Neisseriaceae. Las especies de Neisseria se caracterizan por ser de
metabolismo aerobio, inmóviles y el crecimiento de las especies patógenas se

64
 ve favorecido mediante incubación en una atmósfera altamente
húmeda y enriquecida a 5-10% de CO2. Su temperatura de
crecimiento es óptima entre los 36 ± 1ºC y tienen requerimientos
nutricionales complejos.
Las especies patógenas primarias para el ser
humano son N. gonorrhoeae N. meningitidis
y Moraxella catarrhalis (colonia seca)
M. catarrhalis es considerada como parte de la microbiota normal en
la vía respiratoria y se ha relacionado como agente causante de
infecciones pulmonares y de oído medio. Esta es una bacteria no
fastidiosa que crece tanto en agar chocolate como en agar sangre,
dando una morfología microscópica similar a las de Neisseria, pero
que puede ser fácilmente diferenciada de las especies de Neisseria
mediante la prueba de DNasa.

Características morfológicas

Las colonias difieren dependiendo de la especie, N.

gonorrhoeae presenta colonias pequeñas, de color gris hasta
blanco, de consistencia latiguda, brillantes y convexas. N
meningitidis presenta colonias de mayor tamaño, convexas, lisas,
brillantes y grisáceas.
El género Neisseria incluye bacterias con morfología de
diplococos Gram negativo arriñonados, con reacción positiva a las
pruebas de catalasa y oxidasa.

Características diferenciales de los géneros de la familia

Neisseriaceae
Género Características
Morfología Oxidasa Catalasa Ácido a partir de
celular glucosa DNAsa
Diplococos¹ + + V _
Neisseria
Moraxella Diplococos + + — +
Kíngella Cocobacilos + — + _

¹ N. elongata tiene forma bacilar.

La producción de ácido depende de cada una de las especies del género.

65
Bacilos Gram positivos de importancia Médica:

Listeria monocytogenes es una bacteria ampliamente distribuida en la

naturaleza. La listeriosis se considera una zoonosis, aunque la mayoría de las
infecciones se producen en forma indirecta por contaminación de productos
animales o vegetales ingeridos sin un procesamiento que permita eliminar el
agente. A pesar de ser una bacteria ubicua y de alta resistencia a condiciones
ambientales adversas, es un patógeno poco frecuente en la población general,
atacando de preferencia a personas en edades extremas de la vida, mujeres
embarazadas y pacientes inmunodeprimidos. L. monocytogenes es de
notificación obligatoria a través de la vigilancia de laboratorio, se deben enviar
al Instituto de Salud Pública (ISP) las cepas de enfermedad invasiva.

66
 Características fenotípicas de los géneros Listeria y Corynebacterium

Característica
Listeria spp Corynebacterium spp
Morfología BG+, cortos o rectos, BG+, ligeramente curvos, tipo
microscópica¹ individuales o en letra-china o en empalizadas
cadenas. Pueden ser
bacilos Gram variable
Catalasa + +

Ureasa — V

Motilidad (25 ºC) + —

Producción de ácido de + +²
glucosa
Producción de H2S — —
NO3 NO2 —³ V
Hemólisis Β γ

¹ BG+, bacilos Gram positivos.

² Algunas especies no utilizan la glucosa.
³ L. murrayi reduce nitratos.

BACILOS GRAM POSITIVOS ESPORULADOS

Características generales

Los bacilos Gram positivos esporulados corresponden a los

géneros Bacillus y Clostridioides (ex Clostridium). Debido a que forman
esporas pueden sobrevivir en el ambiente por muchos años. El género
Bacillus es aerobio, en tanto que el género Clostridioides es anaerobio
obligado. La gran mayoría de las especies de ambos géneros no causan
enfermedad, sin embargo, existen algunas que causan enfermedades
importantes en el Ser Humano. B. anthracis es el agente causal de
ántrax y se asocia a Bioterrorismo, Clostridioides causa por su parte
varias enfermedades graves mediadas por toxinas: C. tetani (tétanos),
C. botulinum (botulismo), C. perfringens (gangrena gaseosa) y C.
difficile (colitis pseudomembranosa).

Especie Colonia Movilidad Hemólisis Sensibilidad Presencia de

Penicilina cápsula
B. anthracis Blanca-gris _ _ + +
B. grupo Leve tinte + + _ _
cereus verde

67
Bacillus grupo cereus, colonias Bacillus anthracis, colonias grises,
verdosas, grandes, con bordes grandes, con bordes irregulares,
irregulares, β hemolíticas sin hemólisis

Colonias medianas, secas, bordes lisos, color gris

70
 Sesión 9 y 10

FISIOTAXONOMIA BACTERIANA y DIAGNÓSTICO DE

ENTEROBACTERALES y BACILOS GRAM
NEGATIVOS NO FERMENTADORES

OBJETIVOS:

1) Practicar siembra de bacterias en diferentes medios de

cultivo

2) Reconocer los c a m b i o s producidas en los medios de cultivo, por la

presencia de productos intermediarios del metabolismo, debido a la
acción bacteriana

3) Identificar género y especie de bacilos Gram negativos a través de

su comportamiento en diferentes medios de cultivo

INTRODUCCIÓN:

El Laboratorio de Microbiología clínica tiene un rol fundamental en la

identificación de bacterias en una muestra determinada.
El análisis microbiológico de una muestra, por lo general sigue la siguiente
secuencia:
a.- Observación directa al microscopio
b.- Cultivo
c. - Identificación fisiotaxonómica (pruebas o batería bioquímicas)
d. - Estudios de susceptibilidad a agentes antimicrobianos

La observación directa de la muestra teñida con Gram entrega información

sobre su contenido bacteriano. Los cultivos permiten observar la morfología de
las colonias bacterianas en un medio determinado. Ambos estudios
orientativos se complementarán con los análisis de identificación del
microorganismo (género y especie) mediante pruebas o baterías bioquímicas
y el tratamiento del paciente con un agente antimicrobiano se orienta con las
pruebas de susceptibilidad

71
Fisiotaxonomia bacteriana:

La fisiología bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas a

través de las alteraciones que producen en el medio de cultivo. Estas
manifestaciones han permitido establecer diferencias entre ellas las que han
sido utilizadas en su clasificación en diferentes géneros y especies
Las técnicas de identificación bioquímica de las bacterias diferencian géneros
y especies bacterianos en base a la detección de:

• Utilización de fuentes de carbono:

Glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol, citrato.
• Formación de productos finales o intermediarios del metabolismo
microbiano:
Ácido sulfhídrico (H2S), indol, CO2, acetilmetilcarbinol, etc.
• Presencia de enzimas:
Catalasa, ureasa, oxidasa, coagulasa, triptofanasa, etc.
• Sensibilidad a algunos compuestos químicos o antibióticos:
Bacitracina, novobiocina, optoquina, etc.

Nota: Ver fundamento de medios y pruebas bioquímicas en anexos: 1 y 2

PROCEDIMIENTOS:
1.- Siembra de la batería bioquímica convencional con asa en punta: Tome
una colonia aislada para sembrar todos los tubos de la batería de la siguiente
manera:
- Los medios semitendidos (TSI, LIA) siembre atravesándolos hasta el fondo

72
 con el asa 2-3 veces para el TSI y 2 veces para el LIA y luego estriar en zig-
zag en superficie (tendido) de cada tubo.

- Para el medio MIO realice una inoculación en el centro del agar y casi
hasta el fondo del tubo (3/4 del tubo).

- Para el citrato sembrar con estrías en zig-zag en la superficie (tendido) del tubo

- Para el agar Urea sembrar con estrías en zig-zag en la superficie del tubo, si
es caldo urea, tomar una colonia del medio de cultivo y homogenizar en el
caldo.

LECTURA DE RESULTADOS:

1.- Batería bioquímica:

El conjunto de reacciones bioquímicas detectables en una batería de
medios de cultivo permite la identificación de diferentes especies de
bacterias.
Proceda a leer cuidadosamente la reacción que presenta cada uno de los
tubos.

a) Agar TSI: El medio de cultivo se torna color amarillo, es decir, hay

fermentación del medio y producción de acidez →reacción positiva. Un color
fucsia indica alcalinidad del medio, no hay fermentación de azúcares →
reacción negativa.

Interpretación:
1. TSI control
2. A/A,+,-
3. K/A,-,+
4. K/A,-,++
5. A/A,+,+
6. K/A,+,+
7. K/A,-,-

73
b) Agar LIA:

El medio de cultivo puede presentarse violeta-gris y se observa

descarboxilación o desaminación de la lisina y producción de H2S.
Cuando hay descarboxilación de la lisina→ reacción positiva color violeta
Un color amarillo parcial → reacción negativa
Un color rojo vinoso en el tendido→ desaminación de la lisina

Interpretación:
1. LIA control
2. K/K,-,+
3. K/A,-,-
4. K/A,+,-
5. K/K,-,-
6. R/A,+,-
7. R/A,-,+
1 2 3 4 5 6 7 8
8. R/A,-,-

c) Agar MIO:
Este medio permite evidenciar 3 condiciones: movilidad, descarboxilación de
la ornitina y producción de indol.
- La movilidad la evidenciamos por el crecimiento homogéneo del medio
mostrando turbidez y en el caso de ser inmóvil, se aprecia crecimiento
bacteriano solamente en la línea de picadura.
- La descarboxilación de la ornitina se aprecia por un color violeta en el
medio, una reacción negativa sería un color amarillo.
- La prueba del indol se detecta al agregar el reactivo de kovacs, una
reacción positiva sería la formación de un anillo en la superficie de color
rojo o rosado.

Interpretación:
1. MIO: -,+,-
2. MIO: +,-,+
3. MIO: +,+,+

74
d) Agar citrato:

Una reacción positiva sería la aparición de color azul, producto de la

alcalinización del medio, si la bacteria no es capaz de utilizar el citrato como
única fuente de carbono se verá del mismo color del medio (verde).

e) Caldo Urea:
- Color fucsia: Indica reacción (+). La bacteria posee ureasa, metaboliza
el sustrato y esto provoca alcalinidad del medio al producir amoníaco.
- No hay cambio en el medio: reacción (-).

75
Lactosa (+) Lactosa (-)

AGAR MC CONKEY

76
Escherichia spp. Klebsiella spp.

Shigella spp. Salmonella sp

Proteus spp. Citrobacter spp.

77
BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES

Características generales:

Se considera dentro de este grupo a los bacilos gramnegativos no

esporulados, aeróbicos que no utilizan los carbohidratos como fuente de
energía o los degradan por una vía distinta a la fermentación, es decir oxidan
algunos carbohidratos.
Pseudomonas, Acinetobacter y otras forman parte de este grupo,
se distribuyen ampliamente en el suelo y en el agua.
Existen algunas pruebas de laboratorio que orientan a la sospecha
de estos agentes, dentro de estas tenemos:

• Prueba de la oxidasa:
Esta prueba se basa en la capacidad de la enzima citocromo-
oxidasa de oxidar el sustrato tetrametil-para fenilendiamina dihidroclórico, (un
aceptor de electrones) en presencia de oxígeno, formando un producto final de
color púrpura oscuro, el indofenol.
Procedimiento
- Tomar una colonia de un cultivo de 18- 24 horas a partir de agar sangre o
Mueller-Hinton ( no de un medio selectivo).
- Agregar una pequeña cantidad de la colonia a un papel impregnado con el
sustrato o a tiras preparadas comercialmente.
- La reacción tiene un tiempo de 10 segundos.
Control de calidad
Positivo: Pseudomonas aeruginosa
Negativo: Escherichia coli

• Motilidad:
Es posible observar la motilidad al microscopio tomando una gota
de un cultivo en caldo incubado a 25 °C por 6-24 horas (lámina y laminilla)

• Producción de pigmento:
Algunas especies como es el caso de P. aeruginosa producen
distintos pigmentos hidrosolubles y que difunden al medio, lo que permiten
reconocer fácilmente estos microorganismos. Estos pigmentos se conocen
como: Pioverdina (verde), Piocianina (azul), Piorubina (rojo), Piomelanina
(café-negruzco)

78
 Pseudomonas spp.

Pigmentos de Pseudomonas aeruginosa

Acinetobacter spp.

79
 Sesión 11
MICOLOGIA

OBJETIVOS:

1) Reconocer y diferenciar la morfología macroscópica y microscópica de

hongos filamentosos y levaduras

2) Conocer pruebas de identificación de levaduras y hongos filamentosos

MATERIALES
- Placas con cultivos de hongos y levaduras en medio Sabouraud.
- Porta y cubre objetos
- Asas de nicrón
- Pipetas Pasteur
- Preparaciones fijadas
- Microscopio, aceite de inmersión, xilol, etc.
- Microcultivos
- Tubos con plasma de conejo

INTRODUCCIÓN

1.- Hongos unicelulares (levaduras)

Las levaduras son organismos fúngicos unicelulares que generalmente se

reproducen asexualmente por gemación (uni o multilateral) y sexualmente por
ascosporas y teliosporas. Son anaeróbicas facultativas y pueden ser saprófitas
o parásitas. Los criterios usados para el diagnóstico son fundamentalmente
morfológicos (macroscópicos y microscópicos).

Existen varios géneros de levaduras de importancia clínica, entre ellos se

encuentra el género Candida . De las especies del género Candida es Candida
albicans la más frecuentemente aislada en muestras clínicas.

Candida albicans: levadura capaz de filamentar y, lo que le otorga un

mecanismo de virulencia. Su identificación se basa en la capacidad de formar
un tubo germinativo al ser incubada en plasma a 36 ± 1°C durante 2 horas.

Aspecto macroscópico: Colonias blancas, cremosas, brillantes.

Aspecto microscópico: Células ovoides y presencia de
pseudomicelios

Importancia Clínica: De las variadas especies de Candida sólo unas pocas se

consideran importantes como patógenos humanos, siendo Candida albicans la
que con mayor frecuencia se relaciona con infecciones en humanos, las que
pueden ir desde un simple compromiso superficial de la piel y mucosas hasta
cuadros profundos del tipo invasivo en pacientes inmunocomprometidos.

80
2.- Hongos Filamentosos

Los dermatófitos son un grupo homogéneo de hongos queratinófilos, que son

responsables de la mayoría de las infecciones cutáneas del humano y
animales. Son hongos similares que se relacionan tan íntimamente que causan
una variedad muy amplia de cuadros clínicos. Una sola especie puede
participar en varios tipos de enfermedades, cada una con su patología
característica. Este grupo de enfermedades se conoce como dermatofitosis o
“tiña”. En Chile, estos hongos son el grupo de agentes infecciosos que con
mayor frecuencia causa micosis superficial.
Dentro de este grupo de hongos destacan: Trichophyton (rubrum,
mentagrophytes), Microsporum (canis, gypseum) y
Epidermophyton.

Aspecto macroscópico: colonias algodonosas, pulverulentas, etc. Color según

la especie (blanco, beige, amarillo, etc.) con o sin producción de pigmentos
que difunden en el medio de cultivo.
Aspecto microscópico: los diversos géneros y especies pueden presentar hifas
hialinas en bambú, raqueta de tenis, en espiral, etc. Las esporas externas
pueden presentarse como microconidias (conidias pequeñas) que nacen a lo
largo de la hifa y como macroconidias (conidias de gran tamaño).

Los hongos oportunistas son un grupo de hongos con variadas características,

algunos son considerados patógenos oportunistas (Ej.: Aspergillus), otros
contaminan el ambiente (Ej.: Penicillium).

Penicillium por ejemplo se considera un contaminante ambiental, se

desarrolla en 3-4 días.
Aspecto macroscópico: colonias verde-azuladas o verde-amarillas. Su
superficie es estriada o lisa, su textura es aterciopelada, lanosa, con el reverso
incoloro o amarillo.
Aspectos microscópicos: presenta hifas hialinas septadas de las que se origina
una prolongación (conidióforo) que en su extremo distal presenta células
conidiogénicas con forma de botella (fiálides). Las fiálides producen los
conidios (espora asexuada externa) que tienen forma redondeada y los que
disponen en cadenas que corresponden a estructuras de fructificación.

Aspergillus por su parte es un hongo patógeno oportunista de crecimiento

rápido (aprox. 48 hrs.)
Aspecto macroscópico: colonias aterciopeladas, algodonosas o pulverulentas,
coloreadas (crema, verde, café y negras)
Aspecto microscópico: presenta hifas hialinas septadas de las que nace una
prolongación no septada (conidióforo), el cual se dilata en su extremo distal
(vesícula) rodeándose allí de células conidiogénicas (fiálides). Las fiálides
producen conidios los que se disponen en forma de cadenas. El conjunto
vesícula, fiálide y conidios se conoce como “cabeza aspergilar”

Importancia Clínica: El género Aspergillus puede producir reacciones alérgicas

por la inhalación de sus esporas; colonización de vías aéreas; invasión de
tejidos en sujetos con enfermedades de base.

81
82
 Dermatofitos

Hifas en espirales T.
mentagrophytes

83
PROCEDIMIENTO

1. Examen macroscópico

Observe y registre las características de las colonias, comparando

superficie, borde, pigmentación, textura, color.
Cada mesón contará con cultivos de los siguientes
microorganismos:
Candida a!bicans
Aspergillus
Penicillium
Rhizopus
Dermatofitos

2. Examen microscópico

a) Para observación al fresco de levaduras, en un portaobjeto prepare una

emulsión con una gota de agua y una colonia de levadura, coloque un
cubreobjeto y observe al microscopio con aumento de 40X

b) Prepare un frotis en la forma habitual con la cepa de levadura y realice

tinción de Gram. Observe al microscopio con inmersión

84
85
CUESTIONARIO

1. ¿Por qué el medio Sabouraud es adecuado para el cultivo de hongos?

2. Averigüe el tipo de reproducción asexual de las levaduras

3. ¿Qué aspecto microscópico presentan: PeniciIIium y Aspergillus?

4. ¿Cómo procede para diagnosticar una micosis a partir de una muestra

infectada?

5. ¿Qué entiende por hifas “en raqueta”? ¿Cuál es su valor diagnóstico?

6. ¿qué entiende por Micelio aéreo, Micelio reproductivo y Micelio

vegetativo?

7. Infórmese de las características microscópicas de los hongos y levaduras

que se observarán en este paso práctico.

86
 Sesiones 12 y 13

SUSCEPTIBILIDAD AGENTES

ANTIMICROBIANOS

OBJETIVOS:

1) Conocer los métodos de estudio de susceptibilidad a agentes

antimicrobianos y comprender la acción de diferentes antibióticos
sobre una misma especie bacteriana

2) Realizar la lectura de un antibiograma de difusión en disco e

interpretar el resultado

MATERIALES:
− Placas de antibiogramas entregadas por docente
− Agar Müeller Hinton
− Mac farland 0.5
− Suero Fisiológico
− Tórulas estériles
− Sensidiscos
− Tabla de registro para antibiograma

INTRODUCCIÓN:

Estudios de susceptibilidad antimicrobiana:

Los métodos de susceptibilidad antimicrobiana o antibiogramas bajo

condiciones de laboratorio específicas y estandarizadas, son métodos in vitro
que determinan la susceptibilidad de los microorganismos a una variedad de
agentes antimicrobianos.

La meta principal del estudio de susceptibilidad es proveer al clínico algunas

recomendaciones sobre la terapia que puede ser más apropiada en pacientes
con una infección específica. No obstante, la correlación exacta entre los
resultados in vitro y la respuesta clínica es muchas veces difícil de predecir, ya
que existen numerosos factores que influencian la interacción de agentes
antimicrobianos y microorganismos en un determinado paciente.

La metodología usada para realizar el estudio de susceptibilidad toma en

consideración algunos de estos factores para determinar más eficientemente
cómo un microorganismo podría responder in vivo a un determinado
antibiótico.

87
Los antibióticos son agentes terapéuticos producidos por organismos vivos o
sintéticos, que inhiben o destruyen a los agentes infecciosos.

Indicaciones para el estudio de susceptibilidad antimicrobiana

Debido a que los microorganismos tienen susceptibilidad variable a los agentes

antimicrobianos, es necesario tener una herramienta que permita determinar
la susceptibilidad del microorganismo causante de la infección.

Cada vez son menos los organismos que tienen susceptibilidad predecible, por
lo que debemos hacer estudio de susceptibilidad en la mayoría de los
microorganismos aislados. Hasta hace unos años atrás, los laboratorios de
microbiología NO realizaban estudios de susceptibilidad en S. pneumoniae o
S. pyogenes porque se consideraban generalmente susceptibles a los
antibióticos usados para tratar infecciones causadas por estos organismos.

Desafortunadamente, al igual que en el resto del mundo, en nuestro país han

sido aisladas cepas de S. pneumoniae resistentes a penicilina y S. pyogenes
resistentes a eritromicina.

La indicación primaria para el estudio de susceptibilidad es determinar el

antibiótico más apropiado para iniciar la terapia en un paciente con un proceso
infeccioso. En la mayoría de los casos, cuando el paciente comienza su
enfermedad se indica un antibiótico de amplio espectro (o una combinación de
antibióticos) hasta obtener resultados acerca de la identificación del germen
causal de la infección. Posteriormente, cuando los resultados del antibiograma
están disponibles, puede indicarse un antibiótico más específico.

En los diversos test de susceptibilidad antimicrobiana, se determina la

mínima concentración de antibiótico que inhibe el crecimiento de un
microorganismo in vitro (CIM).

a) Difusión en agar (por disco): A diferencia del resto de los métodos, este
es cualitativo. En este caso un microorganismo se inocula en la superficie de
una placa de agar y luego se colocan discos de papel impregnados con una
concentración conocida del antibiótico. Durante la incubación el antibiótico
difunde desde el disco radialmente a través del agar y la concentración va
disminuyendo a medida que se aleja del disco. En un punto determinado, la
concentración del antibiótico en el medio es incapaz de inhibir al
microorganismo en estudio y se produce una zona circular de inhibición. El
diámetro del área de inhibición alrededor del disco puede ser convertido a las
categorías de susceptible intermedio o resistente de acuerdo con las tablas
publicadas por el Clinical Laboratory and Standards Institute (CLSI). Si las
recomendaciones para realizar este método son fielmente seguidas, las
categorías S, I o R se correlacionan muy bien con los resultados de los otros
métodos. Este método es el más comúnmente usado.

88
 79

b) Dilución en agar: Es considerado el método de referencia. Consiste en

inocular placas conteniendo una determinada concentración de un antibiótico
con el microorganismo en estudio. Después de la incubación (16 a 18 horas),
se examina si el organismo crece o no en cada una de las placas y se
determina la concentración inhibitoria mínima (CIM) para el antibiótico en
estudio. Por ejemplo: si una cepa de S. aureus crece en una placa que contiene
una concentración de oxacilina de 0.06 µg/ml, pero no crece en una placa con
una concentración de oxacilina de 0.12 µg/ml, significa que la concentración
mínima de oxacilina que se requiere para inhibir a ese organismo es 0.12
µg/ml.

c) Dilución en caldo: En este caso, tubos (macrodilución) o microplacas

(microdilución) contienen concentraciones crecientes de un determinado
antibiótico. El organismo en estudio es inoculado en los diferentes tubos o
pocillos de la microplaca y la concentración inhibitoria mínima es determinada
después de la incubación, de la misma forma descrita anteriormente para el
método de dilución en agar.

d) Epsilometria: Es un método más simple que otros para obtener una CIM.
Utiliza una tira de plástico que contiene concentraciones crecientes de un
determinado antibiótico que van desde 0.016 µg/ml hasta 256 µg/ml. Esta tira
se pone sobre una placa de agar que ha sido inoculada con el organismo en
estudio. Después de incubar la placa por 16 a 18 horas, se forma un área de
inhibición en forma elíptica y la concentración inhibitoria mínima (CIM) se lee
directamente.

89
 Este es el método de elección para hacer estudios de susceptibilidad en
microorganismos fastidiosos o con requerimientos especiales, como por
ejemplo: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Haemophilus
influenzae y microorganismos anaeróbicos.

Representación esquemática del método del Epsilometria. La flecha indica la

zona donde se lee la Concentración Inhibitoria Mínima

e) Métodos automatizados: En este momento existen varios sistemas que

ofrecen distintos niveles de automatización y que pueden ser usados por los
laboratorios de microbiología para el estudio de susceptibilidad. Los
instrumentos en el mercado utilizan una medición turbidimétrica o
fluorométrica para detectar crecimiento bacteriano en un medio líquido. La
mayoría de ellos utilizan el método de microdilución y períodos de incubación
menores que los habituales. Estos métodos son bastante confiables para el
estudio de enterobacterias y otros gérmenes de crecimiento rápido, pero
generalmente no son adecuados para microorganismos de crecimiento lento
o requerimientos especiales.

MÉTODOS PARA EL ESTUDIO DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA

Método Categorías CIM µg/ml

Difusión en agar (discos) S, I, R No

Dilución en agar S, I, R Sí

Dilución en caldo S, I, R Sí

Métodos automatizados S, I, R Sí

Epsilometria S, I, R Sí

S:Susceptible; I: Susceptibilidad Intermedia; R:Resistente

90
Puntos de corte

El punto de corte se refiere a la CIM (si se ha usado un método de dilución)

o el diámetro de inhibición (si se ha usado difusión por disco) con los cuales
un organismo puede ser clasificado como S, I o R. Estos puntos han sido
determinados de acuerdo a estudios microbiológicos que incluyen
información sobre la distribución de los diámetros de inhibición a las CIM para
un determinado antibiótico en variadas poblaciones bacterianas. El factor
más importante para definir las categorías es la concentración que alcanza
un antibiótico en el plasma. Obviamente, un organismo no puede ser definido
como susceptible si las concentraciones que se necesitan para inhibir este
organismo son mayores que aquellas que alcanzadas en el suero.

IV-PROCEDIMIENTOS:
a) En los antibiogramas entregados:
- Observe y mida el diámetro del halo formado alrededor de los
sensidiscos. Según la tabla adjunta, determine sensibilidad o resistencia al
antibiótico.

Tabla 1. Patrones estándar del halo de inhibición, puntos de corte equivalente a la CMI
para enterobacteriasa y diámetro del halo de inhibición para la cepa E. coli ATCC25922
empleada como control de calidad
Punto de corte E. coli
Diámetro del halo de Equivalente ala
Carga inhibición (mm) ATCC 25922
CMI(µg/ml)
G Antimicrobiano del intervalo b
R disco Resistente Intermedia Sensible Resistente Sensible
U (µg)
P
O
A Ampicilina a,c 10 <13 14-16 >17 >32 <8 15-22
Ciprofloxacino 5 <21 22-25 >26 >1 <0,25 29-37
Cefazolina c,d 30 <19 20-22 >23 >8 <2 21-27
Gentamicina 10 <12 13-14 >15 >16 <4 19-26
c

- Los diversos tamaños de los halos de inhibición producidos por

antibióticos diferentes para una misma especie bacteriana NO PUEDEN SER
COMPARADOS ENTRE SI. Por ejemplo: un halo de inhibición de 30 mm.
para Penicilina no indica mayor sensibilidad que un halo de 20 mm. para
Tetraciclina.

91
TIPOS DE ZONA QUE PUEDEN DESARROLLARSE ALREDEDOR DE LOS
DISCOS:
a) Resistente: No hay zona de inhibición o si existe es muy estrecha, o
sea, la bacteria es capaz de crecer cerca del disco.

b) Intermedio: Hay una estrecha zona libre de crecimiento

bacteriano alrededor del disco.

c) Sensible: Hay una amplia zona libre de crecimiento bacteriano

alrededor del disco.

Mutantes resistentes; El inóculo contiene una pequeña proporción de

células mutantes que fueron capaces de formar colonias, bajo
condiciones en que las otras células (no mutantes) fueron inhibidas.
Las mutantes comúnmente son células resistentes a antibiótico.

d) Contaminación; El inóculo contiene una mezcla de microorganismos y

al menos uno de ellos es resistente al antibiótico.

e) Sinergismo: Los dos discos contienen diferentes antibióticos. La zona

muestra un efecto inhibitorio del crecimiento bacteriano que es más
grande que la suma de los efectos de cada antibiótico por separado.
Esto significa que los antibióticos actúan sinérgicamente. Un ejemplo de
sinergismo es el Cotrimoxazol, que es una combinación de trimetoprim
y sulfonamida sulfametoxazol, dos drogas que bloquean diferentes
reacciones de la misma vía metabólica.

f) Antagonismo: Los dos discos contienen diferentes antibióticos. La

presencia de un antibiótico inhibe la actividad del otro. Por ejemplo, los
antibióticos que inhiben el crecimiento (cloranfenicol) antagonizan con
los antibióticos que actúan sólo cuando las células están creciendo (B-
lactámicos).

INTERPRETACIÓN DEL ANTIBIOGRAMA

Definiciones

Susceptible. Significa que la infección causada por ese organismo puede ser
apropiadamente tratada con las dosis habituales del antibiótico estudiado.

Susceptibilidad intermedia. Esta categoría incluye organismos que son

inhibidos por concentraciones del antibiótico que están muy cercanas a las
alcanzadas en el plasma, por lo que pueden responder pobremente a la
terapia. Esta categoría, además, implica que ese antibiótico puede ser usado
si la infección está localizada en sitios donde el fármaco es fisiológicamente
concentrado (por ejemplo, las quinolonas en vías urinarias), o cuando pueden
ser usadas altas dosis (ejemplo Penicilina).

92
 Resistente. Significa que el organismo no sería inhibido por el antibiótico en
las dosis habituales o que el organismo tiene mecanismos de resistencia
contra ese determinado antibiótico.

MÉTODOS ADICIONALES PARA DETERMINAR SUSCEPTIBILIDAD

MICROBIANA

Algunos de los métodos que se mencionarán a continuación, como la

determinación de producción de beta-lactamasa, son usados rutinariamente
por los laboratorios, ya que proporcionan valiosa información al clínico en corto
tiempo. Otros son empleados sólo en laboratorios especializados.

Presencia de beta-lactamasa. Las beta-lactamasas son enzimas producidas

por algunos microorganismos, capaces de hidrolizar penicilina y cefalosporinas.
La detección de beta-lactamasas es muy importante en el caso de bacterias
como Neisseria gonorrheae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis y
algunos anaerobios. Si estos organismos producen beta-lactamasa, son
resistentes a penicilina, ampicilina y amoxicilina; combinaciones de estos
agentes con un inhibidor de beta lactamasa, como ácido clavulánico o
sulbactam, pueden ser más apropiados en este caso.

Beta lactamasas de espectro extendido. En el último tiempo, ha habido un

aumento en el número de cepas de Klebsiella pneumoniae, E. coli y otros
bacilos Gram negativos que producen beta-lactamasas que no sólo hidrolizan
a las penicilinas, sino que además hidrolizan cefalosporinas de tercera
generación. Ceftazidima y aztreonam son más vulnerables a la acción de este
tipo de beta-lactamasas, por lo que pueden servir como marcadores para
determinar su presencia. Estas cepas son susceptibles al imipenem y pueden
ser susceptibles a combinaciones de un beta-lactámico con un inhibidor de
beta-lactamasas.

Métodos genéticos de detección de resistencia

En este momento existen varios métodos basados en la biología molecular que

pueden ser usados para detectar resistencia específica a varios
antimicrobianos, pero su uso de rutina no está indicado. Estos métodos son
principalmente usados con fines epidemiológicos, para monitorear resistencia
a antibióticos. Por ejemplo, estos métodos han sido fundamentales para
entender los mecanismos de resistencia a meticilina en S. aureus, lo cual
permitió modificar las técnicas de detección usadas en el laboratorio, y también
han ayudado a documentar la diseminación de enterococos resistentes a
vancomicina en Estados Unidos. En el futuro, ellos pueden ser muy
importantes para determinar resistencia antimicrobiana en Mycobacterium
tuberculosis. Actualmente existen métodos que detectan resistencia a
rifampicina en este patógeno, lo que tiene gran importancia clínica, ya que
estas cepas son generalmente multiresistentes, las cuales, afortunadamente,
no son frecuentes en nuestro país, pero sí representan un grave problema en
otros lugares.

93
A pesar de los múltiples factores que intervienen en el estudio de
susceptibilidad antimicrobiana, los resultados tienen buena correlación con la
respuesta clínica, ya que esta correlación es verdadera e independiente del
método de estudio empleado. Existen, sin embargo, situaciones en las cuales
deben usarse métodos especiales: los laboratorios deben estar preparados
para ejecutar estos nuevos métodos y los clínicos para interpretar esta
nueva tecnología en beneficio de sus pacientes.

94
Anexo N°1

MEDIOS DE CULTIVO

La introducción y posterior perfeccionamiento de los medios de cultivo en

bacteriología ha significado un adelanto fundamental pues permite el
aislamiento, estudio y tipificación de las bacterias.

Se entiende por medio de cultivo a todo sustrato estéril que contiene los
elementos nutritivos, suministrados en forma apropiada y que son necesarios
para la multiplicación bacteriana.

Un medio de cultivo debe presentar las siguientes condiciones:

- Esterilidad
- Nutrientes
- Concentración de sales adecuada
- pH adecuado.

Los medios de cultivo pueden ser distribuidos ya sea en tubos de ensayo,

matraces, placas de Petri o botellas, dependiendo del método de inoculación
que se desee usar.
Un medio de cultivo puede ser líquido o sólido, y debe parecerse lo más posible
al sustrato en el cual el microorganismo se desarrolla (el suero sanguíneo para
los patógenos animales, leche para los microorganismos de la leche, etc.).
Cualquiera sea el medio de cultivo y la variedad de microorganismos que se
desea cultivar, deberá incluir necesariamente:
a) Agua
b) Componentes nitrogenados, es decir, proteínas, aminoácidos y/o sales
inorgánicas que contengan nitrógeno
c) Fuentes de energía, es decir, carbohidratos, proteínas o sales inorgánicas
Un medio de cultivo es una preparación sólida o líquida hecha específicamente
para el crecimiento, almacenamiento o transporte de bacterias. Los medios
líquidos pueden ser usados en tubos de ensayo o en botellas de vidrio. Los
medios sólidos se obtienen de una solución de nutrientes solidificada con agar
(polisacárido obtenido de ciertas algas marinas que actúa como agente

95
gelificante) o gelatina y se usan en placas de Petri. El agar es el agente
gelificante más comúnmente usado ya que no es atacado por la mayoría de
las bacterias y no se funde a 37°C (temperatura usada para la incubación de
las bacterias).

Ingredientes para preparar medios de cultivo.

Según la finalidad, el medio de cultivo puede tener en su composición los

siguientes ingredientes:

1. Peptonas; hidrolizados de proteínas

2. Extractos e infusiones
3. Productos biliados
4. Carbohidratos
5. Productos bioquímicos
6. Colorantes e indicadores

1.- Peptonas o hidrolizados de proteínas

Las peptonas se preparan por hidrólisis enzimática de proteínas naturales
(tejidos animales, sangre, gelatina, caseína, poroto soya etc.). Como agentes
hidrolíticos se utilizan enzimas animales y vegetales, como, por ejemplo:
pepsina, papaína, enzimas pancreáticas etc.

Todos los productos intermedios de la hidrólisis de proteínas naturales es lo

que conocemos con el nombre de peptonas, tales como: polipéptidos,
dipéptidos y aminoácidos libres.

Las diferentes enzimas provocan el corte de la proteína a nivel de

determinados aminoácidos esenciales, aminoácidos que posteriormente
metabolizan las bacterias y sirven para su desarrollo o para su identificación,
como sucede con los digeridos pancreáticos de caseína, ricos en triptófano y
al ser metabolizado por las bacterias permiten practicar la prueba del indol.

2.- Extractos e infusiones

a) Extractos
Son concentrados de tipo acuoso, obtenidos bajo calentamiento, luego de
evaporados en recipientes abiertos o al vacío, se vuelven espesos y forman
los llamados extractos, que al llevarse a sequedad se obtienen en polvo.
Debido a su riqueza en compuestos proteicos de bajo peso molecular y en
factores de crecimiento constituyen valiosas bases de medio de cultivo. Ej.:
extractos de carne, extractos de levadura

b) Infusiones
Se obtienen por tratamiento de los órganos desgrasados, frescos y molidos,
más agua destilada, se dejan macerar 12 a 24 horas en cámara fría a 4C y
posteriormente, se someten a un calentamiento de 30 minutos para

96
coagular las proteínas (sangre, coloides etc.). Luego se filtran y se envasan en
frascos de vidrio, se tapona y se esteriliza en la autoclave, para llegar a polvo
se concentran las infusiones al vacío y se deshidratan por atomización. Ej.:
Infusión de hígado, infusión de carne, corazón, cerebro etc.

3.- Productos biliados

g) Bilis de buey deshidratada

Se obtiene de la bilis fresca de buey recolectada en envases de vidrio, acero
o plástico, la que se somete a un proceso de precipitación para eliminar
numerosas sustancias coloidales (proteínas) y grasas (colesterol)
posteriormente, se concentra al vacío y se deshidrata.
La bilis se utiliza como agente inhibitorio selectivo en numerosos medios
biliados que se utilizan para detectar y propagar microorganismos
intestinales. Una solución de 8 a 10% del producto deshidratado equivale a
la bilis fresca.

h) Sales biliares
Son mezclas de glicolato sódico y taurocolato sódico preparada y obtenida a
partir de la bilis fresca de buey, a la cual se le ha eliminado proteínas, grasas
y posterior precipitación de pigmentos biliares (biliverdina y bilirrubina),
concentración al vacío y deshidratación. Se emplea como agente selectivo en
varios medios de cultivo.

4.- Carbohidratos (Agentes solidificantes)

a) Agar-agar
La introducción del agar-agar como agente solidificante, espesante o
gelificante de cultivo significó un gran avance en la bacteriología. Koch utilizó
primero placas de gelatina o de suero sanguíneo coagulado. Sobre este último
medio aisló el bacilo tuberculoso en 1882.
El agar-agar es un polisacárido natural, de peso molecular elevado, producto
de 2 tipos de algas marinas (Gracilaria y Gelidium). Está integrado por
unidades de D-galactosa en uniones - 1,3 glucosídica, con ramificaciones
constituidas probablemente por residuos de éster sulfúrico de L- galactosa. Sus
propiedades son idóneas para su uso en microbiología, ya que forma geles
transparentes, estables, químicamente inertes, y no modifica el pH de las
soluciones con las que se mezcla. El agar-agar incorporado al medio nutritivo,
no modifica las propiedades de éste y la mayoría de los microorganismos no
la metabolizan.

97
Insoluble en agua fría y alcohol. El agar por su alta fuerza de gelatinización se
disuelve sólo a temperaturas de ebullición (100C), enfriado hasta
aproximadamente 40C se solidifica en forma de gel estable. El agar es la más
perfecta gelatina en cuanto a reversibilidad, es decir, que después de la
primera gelatinización sólo vuelve a licuarse a los 80- 98C endureciéndose
nuevamente aproximadamente a los 40C sin perder su condición primitiva.

El agar agar resiste perfectamente esterilizaciones en autoclave a 120C. Por

su capacidad de retener agua, el agar gelatinizado no pierde liquido con
facilidad, de ahí que los medios de cultivo en base agar agar puedan
conservarse por largo tiempo a una temperatura de 4C.
La técnica bacteriológica encontró así en el agar un material ideal que desde
entonces ha sido insustituible.

b) Gelatina
Es una proteína que se prepara hidrolizando colágeno (pellejos, tendones,
ligamentos, huesos etc.) No es soluble en agua fría, pero se hincha y se
ablanda al sumergirla en ella, se disuelve bien en agua hirviendo y al enfriarse
forma una jalea sólida transparente.

La gelatina no puede reemplazar al agar agar en la preparación de medios

sólidos, porque la atacan y descomponen muchas bacterias, funde entre 26-
30C. Se añade a los medios de cultivo para probar si los microorganismos son
capaces de licuar la gelatina.

Nutricionalmente la gelatina es una proteína incompleta, carece de triptófano y

otros importantes aminoácidos. Se utiliza a concentraciones de 12 % a 15% en
medios de cultivo. Los medios a base de gelatina deben conservarse a 4C
porque en períodos de verano es fácil confundirse con una gelatinosis
(licuación de la gelatina por hidrólisis enzimática).

5.- Productos bioquímicos

a) Cloruro de sodio
Se utiliza para controlar la presión osmótica. La concentración utilizada es
generalmente de 5 gr/lt.

b) Agua
El agua no puede faltar en ningún medio de cultivo. Se utiliza agua destilada
para evitar que contenga elementos letales para las bacterias como cloro, etc.

98
 6.- Indicadores más utilizados en microbiología clínica:

Indicadores Color
Acido Alcalino
Púrpura de Amarillo Púrpura
bromocresol
Azul de bromotimol Amarillo Azul
Rojo fenol Amarillo Rojo
Rojo de metilo Rojo Amarillo
Rojo neutro Rojo Amarillo
Fenoftaleína Incoloro Rojo
Azul de timol Amarillo Azul
Rojo cresol Amarillo Rojo

TIPOS DE MEDIO DE CULTIVO

1.- Desde un punto de vista físico:

a.- Sólidos: En general solidificados por adición de agar al medio líquido o

de alguna proteína coagulada.
b.- Líquidos: Sin incorporación de agar al medio
c.- Semisólido: La adición de agar al medio está en menor concentración que
la adicionada al medio sólido.

2.- Desde un punto de vista nutricional y práctico

a.- Corrientes o básicos: Se caracterizan por ser pobres en materiales

nutritivos, se desarrollan bacterias poco exigentes y constituyen la base para
preparar otros medios. Ej.: agar base, caldo peptonado, agar y caldo
tripticasa, agar Mueller- Hinton.
b.- Mejorados o enriquecidos: Son los mismos básicos a los que se les agrega
una sustancia enriquecedora como sangre, suero etc. Ej.: agar sangre, agar
chocolate

c.- Diferenciales o indicadores: Estos medios se emplean para demostrar

alguna propiedad bioquímica de la bacteria como ser, degradación de
carbohidratos, proteínas, hidrólisis de urea, productos finales del metabolismo

99
etc., estas propiedades facilitan la identificación bacteriana. Como se trata de
fenómenos metabólicos, el estudio en medios diferenciales debe hacerse
empleando cepas bacterianas puras. Ej. TSI, LIA, Citrato de Simmons. (Ver
anexo N° 3)

d.- Selectivos: Se llaman así a medios de cultivo que contienen sustancias que
impiden o limitan el crecimiento de algunas bacterias y permiten el desarrollo
de otras. La selección se efectúa mediante el control de los ingredientes del
medio. Ej.: cristal violeta es selectivamente bacteriostático para las bacterias
Gram positivas, por lo tanto este colorante puede ser incorporado a un medio
para examinar patógenos entéricos que son predominantemente bacilos Gram
negativos. Este tipo de medios de cultivo tiene gran aplicación en el diagnóstico
bacteriológico, en que el problema corriente consiste en aislar un
microorganismo de un producto que contiene numerosas especies
bacterianas.
Ej.: Agar sangre kanamicina

e.- Selectivo-diferencial: Existen medios que reúnen ambas propiedades: ser

selectivos y diferenciales. Son medios selectivos a los cuales se les ha
adicionado un sustrato, generalmente un azúcar para demostrar la actividad
fermentativa de la bacteria sobre esta sustancia. La actividad metabólica se
revela por el cambio de color de un indicador que lleva incorporado el medio.
Ej.: Agar Mc Conkey

Medios de cultivo Inhibidor Aislamiento de:

Agar cristal violeta Cristal violeta bacilos Gram (-)

Agar telurito de K Telurito de potasio Corynebacterium

Agar sulfito bismuto Verde brillante y Salmonella

Sulfito de bismuto

Agar Thayer Martin Vancomicina, colistin Neisseria

Nistatina

100
Los medios selectivos más utilizados en la práctica clínica son:

Agar sangre kanamicina Kanamicina bacterias anaerobias

Agar cetrimida cetiltrimetilamoniobromuro Pseudomonas

(cetrimida)

Agar azida sangre azida

Streptococcus
y Staphylococcus

Agar Skirrow vancomicina, polimixina Campylobacter

Trimetopri
m

Los medios selectivos-diferenciales más utilizados en la práctica clínica son:

Medio de cultivo Inhibidores Actividad Indicador Aislamiento

Metabólica de:

Agar Mac Conkey Sales biliares Fermentación Rojo neutro Bacilos Gram
Cristal violeta de la Lactosa (-) entéricos.

Agar SS Sales biliares Fermentación Rojo neutro Bacilos Gram

de la Lactosa (-) entéricos

Agar XLD Desoxicolato Descarboxil. Rojo fenol Bacilos Gram

de sodio Lisina. Ferm. Tiosulfato (-) entéricos
Xilosa y de sodio
Sacarosa
Agar Chapman (110) 7.5% NaCl Fermentación ----
Staphylococcus
de manitol y

Licuación de gelatina

100
 En este curso se usarán principalmente tres medios de cultivo que son:
- Agar nutritivo (corriente): es un medio básico usado con propósitos
generales para el cultivo de muchos tipos de bacterias. Puede ser
enriquecido o hacerse selectivo por la adición de sustancias
adecuadas.
- Agar sangre: es un medio en base a agar nutriente enriquecido con 5-
10% de sangre. Es usado para el cultivo de bacterias nutricionalmente
exigentes, como Bordetella pertussis (agente causal de tos convulsiva)
y también para detectar hemólisis. Al calentar el agar sangre a 70-80°C
hasta obtener un color café se obtiene otro medio de cultivo denominado
agar chocolate, que es más apropiado que el agar sangre para el
crecimiento de ciertos patógenos, como por ejemplo Neisseria
meningitidis, Haemophilus
- Agar McConkey: es un medio selectivo-diferencial, ya que contiene
sales biliares y cristal violeta para inhibir el crecimiento de Gram +
(selectivo) y lactosa para distinguir aquellas bacterias que la fermentan
de las que no (diferencial). En agar McConkey las bacterias entéricas
que utilizan lactosa (tales como E.coli) forman colonias rojas debido a
que los productos acídicos que se forman a partir de lactosa afectan el
indicador de pH del medio (rojo neutro); en cambio, las especies
entéricas que no usan lactosa (por ejemplo muchas cepas de
Salmonella) forman colonias incoloras

PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Muchos medios se obtienen comercialmente en forma deshidratada

(en polvo). Tales medios deben ser disueltos en un volumen adecuado de
agua, esterilizados y colocados en recipientes estériles.

Las placas de agar nutritivo se preparan mezclando el medio en polvo con

agua en un matraz y calentando para disolver el agar, luego el matraz se
esteriliza en un autoclave y se enfría a 45C aprox. (a esta T el agar
permanece fundido). Unos 15-20 ml de agar fundido se colocan en una placa
de Petri estéril y se distribuye para que quede homogéneamente repartido.

Las placas de agar sangre se hacen mezclando agar nutritivo fundido (a 45-
50C) con 5-10%, en volumen, de sangre citratada antes de agregarlo a las
placas.

101
 Algunos tipos de medio no deben ser esterilizados en autoclave, debido a que
uno o más de sus componentes se destruyen a las temperaturas alcanzadas
en la autoclave, por ejemplo, los medios que contienen glucosa u otros
azúcares lábiles al calor. En estos medios la solución de azúcar se esteriliza
separadamente por filtración antes de ser agregada al resto del medio (auto
clavado)

102
Anexo N°2

FUNDAMENTOS DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS Y MEDIOS

DIFERENCIALES PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM
NEGATIVOS

Agar TSI (Agar Hierro triple azúcares) y Agar Kligler (Agar Hierro Dos
azúcares)

Principio:
Determina la capacidad de un microorganismo de degradar uno o más de los
carbohidratos específicos incorporados a un medio de crecimiento básico, con
producción o no de gas, junto con la determinación de posible producción de
H2S.
Modo de acción e interpretación:
La utilización de un carbohidrato con formación de ácido se comprueba
por el viraje del indicador de pH (rojo fenol) de anaranjado rojizo a amarillo. La
alcalinización se aprecia por viraje a rojo oscuro. Por acción de algunos
microorganismos el tiosulfato es reducido a H2S, el que reacciona con la sal
férrica produciendo sulfuro de hierro produciendo un precipitado negro en el
agar.
La degradación de la glucosa a ácido produce cambio de color sólo en
la zona columnar (base) del medio de cultivo, ya que, por la baja concentración
de glucosa, la cantidad de ácido formado en la superficie inclinada del agar es
escasa y se evapora rápidamente.
Cuando son utilizadas la lactosa (en el medio Kligler) y la lactosa y/o
sacarosa (en el medio TSI) que se encuentran en mayor concentración se
produce un viraje al amarillo, tanto en la base como en la superficie inclinada
del agar. La formación de gas se observa por grietas y cavidades en el medio.

103
Composición Medio Kligler Medio TSI
Extracto de carne 3 gr 3 gr
Extracto de levadura 3 gr 3 gr
Peptona de caseína 15 gr 15 gr
Peptona de carne 5 gr 5 gr
Lactosa 10 gr 10 gr
Sacarosa -- 10 gr
Glucosa 1 gr 1 gr
Cloruro de sodio 5 gr 5 gr
Tiosulfato sódico 0.5 gr 0.3 gr
Citrato de amonio y hierro II 0.5 gr 0.5 gr
Rojo fenol 0.024 gr 0.024 gr
Agar 12 gr 12 gr
Agua destilada 1000 ml 1000 ml
Ajustar a pH 7.4

103
Medio LIA (Agar lisina-hierro)

Principio:
La lisina puede ser descarboxilada por microorganismos (productores de
descarboxilasa de lisina) que la transforman en la amina cadaverina. Esto
produce un viraje al violeta del indicador de pH púrpura de bromocresol. Puesto
que la descarboxilación sólo tiene lugar en medio ácido (pH inferior a 6) es
necesario que se produzca previamente la acidificación del medio de cultivo,
por fermentación de la glucosa. Por este motivo, este medio sólo puede
utilizarse para la diferenciación de cultivos que fermentan la glucosa.

CH-CH2-CH2-CH2-CH-COOH --------------> CH2-CH2-CH2-CH2-CH2 +

co2| | | |
NH2 NH2 descarboxilasa NH2 NH2

Lisina Cadaverina

Los microorganismos que no descarboxilan la lisina, pero fermentan la

glucosa, producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. La
incubación prolongada puede ocasionar una alcalinización en la zona de la
superficie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un viraje al
violeta.

La formación de H2S produce una coloración negra debido al sulfuro de hierro

producido.

Las cepas del género Proteus, Providencia, con excepción de algunas cepas
de Morganella morganii, desaminan la lisina a ácido alfa- cetocarbónico. Este
último forma compuestos pardo-rojizos en la región superficial del medio de
cultivo con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno.

Medio MIO (Movilidad – Indol – Ornitina)

Este medio se emplea para evidenciar, movilidad bacteriana, producción de
indol y descarboxilación de la ornitina. La movilidad se pone de manifiesto por
la turbidez difusa del medio de cultivo alrededor de la línea de la picadura. La
no motilidad se caracteriza por el crecimiento producido exclusivamente a lo
largo del trazo de siembra por picadura.
Son inmóviles los géneros Klebsiella y Shigella.

El mecanismo por el cual se forma el indol en un cultivo microbiano involucra

la oxidación de una molécula de triptófano a una molécula de indol con la
producción de 1 mol de amonio y 1 mol de ácido pirúvico. Este proceso es
acompañado por la extracción de 5 moles de O2 los cuales son empleados en
el rompimiento de la molécula de ácido pirúvico. La formación de indol es así
un proceso aeróbico llevado a cabo por una enzima, la Triptofanasa que actúa
en un pH neutro o levemente alcalino. Esto explica que el indol no se produce
en medios que contengan carbohidratos fermentables

104
El indol se detecta al agregar al medio gotas del reactivo Kovacs. La aparición
de un color rosa a rojo en la parte superior del tubo se interpreta como indol
positivo.
La bacteria al descarboxilar la ornitina forma putrescina y Co2.

CH-CH2-CH2-CH-COOH ---------------> CH2-CH2-CH2-CH2 + Co2

| | descarboxilasa | |
NH2 NH2 NH2 NH2

Ornitina Putrescina

Si existe descarboxilación, el medio queda del mismo color (púrpura) ya que

inicialmente este se presenta de color amarillo debido a la ocupación de la
glucosa, más tarde la descarboxilasa de la bacteria actúa sobre el aminoácido
y como producto de la descarboxilación se forman sustancias alcalinas que
hacen que el medio vuelva a tomar su color inicial.

Interpretación:
El color púrpura indica reacción de descarboxilación
positiva. El color amarillo indica descarboxilación negativa

Citrato de Simmons

Principio:
La prueba del citrato permite determinar si un microorganismo es capaz de
utilizar citrato como única fuente de carbono para su metabolismo.
Esta prueba ayuda a diferenciar entre géneros bacterianos: Ej.: Klebsiella,
Enterobacter (generalmente positivos) de Escherichia (siempre negativo);
Morganella (negativo) de Providencia (positivo).

Algunas bacterias pueden obtener su energía en ausencia de fermentación o

producción de ácido láctico, empleando el citrato como única fuente de
carbono.

En las bacterias el desdoblamiento del citrato es un sistema enzimático sin la

intervención de la coenzima A. Esta enzima se denomina citratasa o citrato
desmolasa y requiere de un catión bivalente para su actividad, suministrado
por el magnesio o el manganeso. El medio usado para la utilización del citrato
contiene sales de amonio inorgánicos. Un microorganismo capaz de utilizar el
citrato como única fuente de carbono utiliza también sales de amonio como
única fuente de N2. Las sales de amonio se desdoblan en amoníaco
produciendo alcalinidad del medio.

105
Interpretación:
Reacción positiva: Crecimiento con producción de color azul intenso
(alcalinización pH 7.6 o más)
Reacción negativa: No se observa crecimiento ni viraje del indicador. El medio
permanece de color verde pH 6.8

Ureasa

La mayoría de los medios empleados para buscar la actividad de una ureasa

incorporan al medio urea y un indicador de pH. Un resultado positivo está dado
por un alza de pH como resultado de la hidrólisis de la urea a amonio.

NH2
| ureasa
C=O ----------------> 2 NH3 + Co2 + 2 H2O --------> NH4OH -
Co2
|
NH
2

Urea alcaliniza el medio

En general, el medio debe tener una baja capacidad de buffer, aunque esto no
tiene importancia para el Proteus, el cual dará positivo aún en los medios con
mayor capacidad buffer. Los medios más empleados son: caldo urea Stuart y
caldo o agar urea de Christensen.

- Caldo urea de Stuart

El caldo urea Stuart está fuertemente amortiguado con sales de fosfato con un
pH 6.8. El microorganismo debe formar una cantidad relativamente grande de
amoníaco para superar el sistema buffer y llevar el pH encima de 8 para
producir un cambio de color del indicador. Por lo anterior, el caldo urea stuart
es altamente selectivo para el género Proteus.

- Caldo urea de Christensen

La urea de Christensen está menos amortiguada y contiene peptona y glucosa.
Este medio enriquecido permite el crecimiento de muchas especies
bacterianas que no crecen en caldo Stuart. Aquellos microorganismos que
producen menos cantidad de ureasa destacan los siguientes géneros:
Klebsiella, Enterobacter, Brucella.
El caldo urea de Christensen se utiliza para identificar Helicobacter pylori a
partir de biopsias gástricas. H. pylori está relacionado con gastritis, úlcera
péptica y cáncer gástrico.

Interpretación:
Los cultivos ureasa positivos alcalinizan el medio con aparición de un
color rojo. (el indicador es originalmente amarillo).

106
Producción de sulfuro de hidrógeno

La capacidad de ciertas especies bacterianas de liberar azufre en la forma de

H2S es una característica importante para su identificación. La producción de
H2S puede detectarse en sistemas de prueba si se hallan las siguientes
condiciones:

- Hay una fuente de azufre en el medio:

Los diversos complejos proteicos incluidos en los medios contienen suficiente
cantidad de los aminoácidos cisteína y metionina (que contiene azufre) para
la producción de H2S. El tiosulfato de sodio es un compuesto inorgánico que
por lo común se agrega a los medios como una fuente suplementaria de
azufre.
- Hay un indicador de H2S en el medio:
El sulfato ferroso, citrato férrico, sulfato o citrato de hierro y amonio, hierro
peptonizado y acetato de plomo son los indicadores de sulfuro más
comúnmente incluidos en los medios, para detectar H2S.
- El medio permite el crecimiento de la bacteria en estudio
- La bacteria posee los sistemas enzimáticos productores de H2S
Se cree que la secuencia de pasos que llevan a la producción y detección
de H2S en un sistema de prueba es el siguiente:

- Liberación de sulfuro de cisteína o tiosulfato por acción enzimática

bacteriana
- Acople del sulfuro (S) con un ion hidrógeno (H) para formar H2S.
- Detección de H2S por hierro, bismuto o plomo para producir sulfuros
con metales pesados insolubles que se ven como un precipitado
negro.
Las diferencias en la detección de H2S en los diferentes medios son resultado
de la alteración de una o más de estas condiciones. El H2S detectado en un
medio puede no detectarse en otro, y es necesario conocer el sistema de
prueba usado cuando se interpreten los resultados. El medio SIM es más
sensible para la detección de H2S que el agar Kligler, presumiblemente debido
a su consistencia semisólida, falta de carbohidratos para suprimir la formación
de H2S y uso de hierro peptonado como indicador.

Otras pruebas bioquímicas en bacteriología:

Prueba de citocromooxidasa (Oxidasa)

Los citocromos, hemoproteínas que contienen hierro, actúan como el último

vinculo en la cadena de la respiración aerobia transfiriendo electrones
(hidrógeno) al oxigeno con la formación de agua. El sistema de citocromos se
halla en microorganismos aerobios, o microaerófilos y anaerobios
facultativos, de modo que la prueba de oxidasa es importante para identificar
microorganismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados.
La prueba es muy útil para evaluar colonias que se sospecha pertenecen a
los Enterobacterales (todas negativas) y para identificar colonias que se
sospecha que pertenecen a otros géneros como: Pseudomonas,
Aeromonas, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, etc.

107
Principio
En la prueba de citocromooxidasa se utilizan ciertos colorantes reactivos como
clorhidrato de p-fenilendiamina que sustituyen al oxigeno como aceptores de
electrones. En estado reducido el colorante es incoloro; sin embargo, en
presencia de citocromooxidasa y oxigeno atmosférico, la para-fenilendiamina es
oxidada y forma azul de indofenol.
Para la prueba se puede utilizar cualquiera de los
siguientes reactivos

- clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina,al 1 % en agua, (Reactivo de

Kovacs).Es incoloro, más estable.

- Clorhidrato de dimetil-p-fenilendiamina al 1% en agua, (Reactivo de Gordon y

HcLeod). Menos estable.
Ambos reactivos deben almacenarse protegidos de la luz.

Procedimiento

Existe un método directo en la placa, en la que 2 o 3 gotas del reactivo se

agregan directamente a colonias bacterianas.
El procedimiento indirecto con tira de papel, en el cual se agregan unas pocas
gotas del reactivo a una tira de papel filtro o se usan tiras o discos comerciales
impregnados con el reactivo desecado.

Las colonias bacterianas que tienen actividad de citocromooxidasa desarrollan

un color azul oscuro en el sitio de la inoculación en 10 segundos.

Nota: No deben usarse asas de acero para esta prueba porque productos de
oxidación superficial formados al esterilizar el asa pueden dar resultados falsos
positivos.
Control de calidad
Positivo: Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter spp, Neisseria spp
Negativo: Acinetobacter spp,Stenotrophomonas maltophilia, Escherichia coli

Reacción Negativa

Reacción Positiva

108
Reducción de Nitratos a Nitritos

La reducción de nitrato (NO3) en nitrito (NO2) y en gas nitrógeno (N2) tiene

lugar en condiciones anaerobias, en las que la bacteria obtiene el oxígeno
degradando el nitrato.
La reducción de nitrato a nitrito se detecta porque estos forman compuestos
diazoico en presencia de ácido sulfanílico y alfa- naftilamina.

Técnica:
Sembrar en picadura en medio Nitrato (semisólido) con la bacteria en estudio.
Incubar durante 24 horas a 37ºC. La reacción se lee agregando al medio partes
iguales de alfa- naftilamina y ácido sulfanílico. La reacción positiva de reducción de
nitrato a nitrito es la aparición de color rojo a los 30 segundos.
En la reacción negativa no hay aparición de color, en reacciones negativas se
debe agregar polvos de Zinc para verificar si los nitratos del medio están intactos
o han sido reducidos hasta N2 o amonio. Una reacción positiva al agregar el Zn
es de color rojo (el Zn activó los nitratos intactos del medio reduciéndolos a nitritos)

PYR

La enzima Pyrrolidonyl Arylamidase (PYR) está presente en Streptococcus

pyogenes, Enterococcus spp, Citrobacter spp y Klebsiella spp, y para detectarla
existe en el mercado un test rápido colorimétrico que indica en forma cualitativa la
presencia de esta enzima.
El principio de la reacción se basa en el uso de discos de papel absorbente
impregnados con L pyrrolidonil β naphthylamida que en presencia de la enzima
pyrrolidonil arylamidasa (PYRasa) se hidroliza dando como resultado producción
de β naftilamina que se manifiesta con la presencia de un color rojo por la adición
de una solución reveladora p-dimethylamino cinnamaldehydo en un lapso de 4
minutos aproximadamente.
Resultado:
Positiva: presencia de color fucsia o morado-violeta al minuto de agregar el
reactivo revelador. Negativo: el disco permanece del mismo color o presenta color
rosado pálido al minuto de agregar el reactivo revelador.

109
Control de calidad
Positivo: Streptococcus pyogenes, Citrobacter freundii, Enterococcus faecalis
Negativo: Streptococcus bovis, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli

110
Anexo 3
EFECTO DE LOS AGENTES FÍSICOS, QUÍMICOS Y MECÁNICOS SOBRE
BACTERIAS

2- DEFINICIONES:

La esterilización: elimina todas las formas viables de las bacterias, virus y hongos,
así como de sus formas de resistencia (esporas).

La desinfección: sólo elimina las formas patógenas, de objetos inanimados y

superficies.

Asepsia: condiciones en las cuales hay ausencia de patógenos

Sustancias bacteriostáticas: aquellas que inhiben el desarrollo de bacterias.
Sustancias bactericidas: aquellas que matan a bacterias.

La esterilización y desinfección conllevan generalmente a la destrucción,

eliminación o inhibición de los microorganismos y constituyen los principales
medios para prevenir infecciones en los hospitales. Generalmente se realiza
mediante tres tipos de agentes:

1) Agentes Físicos
2) Agentes Químicos
3) Agentes Mecánicos

111
1.- AGENTES FÍSICOS

A) Temperatura
B)
1. Calor húmedo

a) Hervido: Por 2 a 10 minutos eventualmente eliminará las formas patógenas de

hongos y bacterias. Sin embargo, no matará esporas de hongos (conidios), ni
tampoco destruirá el virus de la hepatitis.
b) Vapor a presión: Para destruir esporas la temperatura debiera ser elevada a
121°C. El uso de la autoclave permite elevar la temperatura a 121°C (15 libras
de presión) y debe mantenerse en esta por un periodo no inferior a 15 minutos,
contados desde que se alcanza la temperatura.
c) Pasteurización: La leche se somete a este proceso. Consiste en calentar ésta
a 62º C por 30 minutos, o bien elevar la temperatura a 71°C por 15 segundos
para matar todas las formas vegetativas de las bacterias patógenas presentes
en la leche; elimina el 100% del Bacilo de Koch, Salmonellas, Streptococcus y
Brucellas. La muerte por altas temperaturas se debe a denaturalización de las
proteínas (coagulación o hidrólisis) y destrucción de la membrana celular.

2. Calor seco.

a) Horno: Esteriliza cuando los materiales sometidos a este procedimiento

están a una temperatura de 160°C a 170°C por un periodo mínimo de 120
minutos. La muerte se debe a coagulación de las proteínas. Con este
procedimiento se eliminan esporas y el virus de la hepatitis.
b) Incineración: Es una forma de esterilización terminal. Los materiales son
destruidos completamente por la acción del calor. También suele utilizarse para
esterilizar el asa de platino destinada a la transferencia de bacterias.

3. Congelación.

Ciclos de congelación y descongelación reducirán considerablemente el número

de bacterias viables. Método que es inoperante contra las esporas. La muerte es
debida a rotura de la membrana celular.

4. Liofilización.
Consiste en coagular y deshidratar violentamente una muestra. Hay reducción del
número de bacterias viables. Sin embargo, este procedimiento más bien es
utilizado para conservar bacterias y otras formas vivas. La reducción inicial del
número de bacterias no afecta considerablemente la recuperación cuando se
trabaja con números tan inmensamente grandes.

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C) Radiaciones.
1. Irradiaciones ultravioletas (UV).
Los rayos UV inciden en los ácidos nucleicos, produciendo mutaciones letales o
modificaciones químicas (dímeros de timina). Hay desprendimiento de peróxido
que también puede jugar algún rol. Las bacterias así tratadas pueden
recuperarse por fotoreactivación y/o mecanismos de reparación en oscuridad. La
UV no tiene poder de penetración por lo que es efectiva sólo en superficie.
2. Rayos X:
Este tipo de irradiación es letal a toda célula viva. Es utilizada en la industria
alimenticia. Acción sobre radicales libres, oxidación y reducción de sitios
sensibles.

II.- AGENTES MECÁNICOS

A) Ondas ultrasónicas: Destruyen a las bacterias por un proceso de cavitación.

Se realiza sólo en suspensión de líquidos. Utilizados para limpieza, no para la
esterilización.
B) Filtración: Es la remoción de bacterias u otras partículas de la suspensión en
líquidos.
1. Filtración: Con filtros de asbesto: ayuda a la retención de las bacterias
debido a la carga eléctrica de estas sustancias
2. Filtro de membranas (Millipore): Son filtros de acetato de celulosa de poros
de tamaño uniforme (0,45 y 0,2 micrones). Las bacterias son retenidas en
el filtro El efluente está libre de bacterias Los virus pasan a través de los
filtros que ordinariamente retienen bacterias. Lo mismo ocurre con las
formas bacterianas privadas de pared celular.

III.- AGENTES QUÍMICOS

A) Halógenos.
1. Cloro: Efectivo pero tóxico. Usado en la desinfección del agua de beber y en
las piscinas.
2. Hipoclorito de calcio: Solución acuosa de 1 a 5% es un desinfectante general
de excelente calidad.
3. Hipoclorito de sodio: También es un desinfectante efectivo.
4. Tintura de yodo: Solución alcohólica de yodo (2 a 2,5% de yodo en alcohol de
70%). Muy efectivo para la piel y heridas menores. Tiñe y es tóxico; puede causar
serias quemaduras. Se combina en forma irreversible con proteínas. Es un
oxidante.
5. Compuestos orgánicos de yodo: Son los yodóforos, Betadinex.

B) Detergentes y Jabones: Agentes activos de superficie.

1. Detergentes aniónicos: Son sintéticos, lauril sulfato de sodio.
2. Detergentes catiónicos:
Son derivados del amonio cuaternario. Son activos contra la mayoría de las

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bacterias. No matan el Bacilo de Koch. Usados para desinfección y antisepsia de
la piel, también para sanitización. Destruyen la membrana celular. Deja un film de
depósito sobre las superficies, lo que hace duradera su acción.
3. Jabones: Excelente agente activo de superficie disuelve las grasas.

C) Fenoles:
Denatura proteínas, destruye membranas, fenol, cresol, bifenoles halogenados,
hexaclorofeno. Acción bacteriostática en altas diluciones. Se le agrega al jabón o
a cremas bases con detergentes.

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