Bohórquez-Quintero et al. Actual Biol 38 (104): 23-36, 2016 | DOI: 10.17533/udea.acbi.

v38n104a03

Propagación in vitro de Espeletia paipana S. Díaz y Pedraza,

frailejón endémico en peligro de extinción
Propagation in vitro of Espeletia paipana S. Díaz and Pedraza, a critically endangered
endemic frailejon

María A. Bohórquez-Quintero1, 2, Eyda J. Araque-Barrera1, 3, José C. Pacheco-Maldonado1, 4

Resumen
En la presente investigación se estableció un protocolo de micropropagación para Espeletia paipana S. Díaz
y Pedraza, especie en peligro de extinción con una población actual de 26 plantas adultas. Los explantes
primarios (semillas) fueron desinfectados superficialmente con hipoclorito de sodio (NaOCl) o hipoclorito
de calcio [Ca(ClO)2]. Los embriones asépticos se cultivaron en medio MS con macroelementos a diferentes
concentraciones, con y sin ácido giberélico (GA3), kinetina (KIN) y 3-ácido indolbutírico (AIB), también se
estudió el efecto de luz y temperatura sobre la germinación; para la multiplicación de brotes se utilizó
MS suplementado con AIB y bencil amino purina (BA). Para el enraizamiento se probó AIB+BA, AIB y ácido
naftalenacético (ANA) y para el endurecimiento de plántulas se ensayaron diferentes mezclas de capote,
tierra y arena. Los resultados mostraron que el mayor porcentaje de embriones asépticos (66%) se obtuvo
utilizando 1% de Ca(ClO)2. El mayor porcentaje de embriones germinados (50%) se registró en medio basal
MS/4 suplementado con 1 mg l-1 de GA3 y la mayor cantidad de embriones reactivos y de plántulas viables
se obtuvo a 24 ºC e iluminación continua. Los mejores resultados de proliferación de brotes se cuantificaron
en MS con 0,5 mg l-1 AIB + 0,05 mg l-1 de BA, mientras que el 85% de enraizamiento se logró en MS con 5 mg l-1
de AIB. El mayor porcentaje de plántulas viables (65%) en invernadero se cuantificó utilizando una mezcla
de capote y tierra, proporción 3:1. El protocolo establecido es aplicable para desarrollar programas de
propagación masiva que permitan evitar la extinción de E. paipana.
Palabras clave: Asteraceae, conservación, germinación, micropropagación, páramos, reguladores de
crecimiento

Abstract
In this study we established a micropropagation protocol for Espeletia paipana S. Díaz and Pedraza, a
critically endangered species with a current population size of 26 adult plants. The primary explants
(seeds) used were superficially disinfected with sodium or calcium hypochlorite. The aseptic embryos were
cultured on MS media with macroelements at different concentrations, with and without gibberellic acid
(GA3), kinetin (KIN), and indole-3-butyric acid (IBA). The effects of temperature and light on germination
also were examined. For multiplying shoots, we used MS supplemented with IBA and benzylaminopurine
(BA). Shoot rooting was attempted by using IBA + BA, IBA, and 1-naphthalene acetic acid (NAA), and different
mixtures of peat, mulch and sand were tested for hardening of the seedlings. The results showed that
the highest percentage (66%) of aseptic embryos was obtained using 1% calcium hypochlorite. The highest
percentage (50%) of germinated embryos was registered using the MS/4 supplement with 1 mg l-1 GA3,
and the highest quantity of reactive embryos and viable seedlings were obtained at 24 ºC with continual
illumination. The best shoot proliferation results were achieved on MS with 0.5 mg l-1 IBA + 0.05 mg l-1 BA,
while 85% rooting was achieved on MS with 5 mg l-1 IBA. The highest percentage (65%) of viable seedlings
in a growing house was obtained using a mixture of soil enriched with organic matter and mulch in a 3:1
proportion. The proposed protocol may be employed to develop massive propagation programs, which could
reverse the trend toward extinction of E. paipana.

Key words: Asteraceae, conservation, germination, growth regulators, micropropagation, paramos

Recibido: marzo 2015; aceptado: noviembre 2015.

1 Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales BIOPLASMA-UPTC. Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia. A. A. 1094. Tunja

(Boyacá), Colombia.
Correos electrónicos: 2 <mariadelosangeles.bohorquez@uptc.edu.co>; 3 <eyda.araque@uptc.edu.co>; 4 <constantino.pacheco@uptc.edu.co >.

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INTRODUCCIÓN extrajeron los aquenios; posteriormente, al estereoscopio,

se seleccionaron aquellos que contenían embrión.
Colombia es uno de los cinco países del mundo con
ecosistemas de páramo poseyendo el 98% de la totalidad Además, utilizando cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio
de los mismos (SOGEOCOL 2003). En el país, Boyacá es (TTC) (Vázquez et al. 1997), se realizaron pruebas de
el departamento con la mayor extensión, 18,3%, de zonas viabilidad a lotes de 120, 80 y 100 embriones extraídos de
paramunas (Anónimo 2002). Los páramos colombianos aquenios recién recolectados (en diciembre, septiembre y
presentan alto grado de amenaza y vulnerabilidad biológica noviembre, respectivamente), así como a 300 embriones no
(García y León 2004), con aumento acelerado de la reactivos después de 30 días de cultivo in vitro en medio
desaparición de especies; como es el caso de Espeletia de germinación.
paipana Díaz y Pedraza 2001, considerada especie
en peligro de extinción, que solo crece en una zona Etapa de establecimiento. Los aquenios con embrión se
restringida de Boyacá con probabilidad de extinción en separaron en dos grupos: uno desinfectado directamente
el futuro cercano (López 2004); Sánchez (2004) registró para escarificar y luego extraer los embriones; el
76 individuos, Morales et al. (2011) 55 y 28 en 2011 y otro escarificado, para obtener los embriones y luego
2012 y, en 2013 se registraron 26 individuos. Los pocos desinfectarlos. De los embriones asépticos se seleccionaron
individuos que han alcanzado mayor desarrollo ya no aquellos que no presentaban heridas y se encontraban
crecen ni prosperan debido al debilitamiento de los tallos intactos de color ámbar y con cotiledones turgentes.
causado por la fricción del ganado (caprino y bovino), a la
presencia de roedores en la necromasa, así como insectos La asepsia de aquenios y embriones se ensayó utilizando
y larvas que depredan los capítulos florales (Calderón et hipoclorito de sodio (NaOCl de 5,25% p/v) al 1% (v/v)
al. 2005, Morales et al. 2011a). por 2 y 3 min y al 3% (v/v) por 10 min e hipoclorito de
calcio [Ca(ClO)2] al 1% (p/v) y al 0,5% (p/v) por 5 min.
La pérdida acelerada de recursos genéticos vegetales ha La asepsia se realizó en cámara de flujo laminar y los
urgido el desarrollo de nuevos métodos de conservación aquenios y embriones (50 unidades por tratamiento) se
ex situ; algunos de estos nuevos procedimientos manipularon en lotes de no más de 20, contenidos en bolsas
son biotecnologías que permiten la conservación de de muselina estériles.
germoplasma vegetal. El cultivo de tejidos vegetales
in vitro ofrece alternativas para la conservación de Para la germinación de embriones se utilizó el medio basal
la diversidad biológica, permitiendo, por ejemplo, la (MS) (Murashige y Skoog 1962); el pH en todos los medios
multiplicación de especies en peligro de extinción, que empleados se ajustó a 5,7 con HCl y/o NaOH 1N, luego se
presentan poblaciones extremadamente pequeñas o con utilizó el autoclave para su esterilización a 15 psi y 121 °C
limitaciones para su reproducción (Bramwell 1990). durante 20 min. Los embriones cultivados se incubaron a
24 ± 1 °C con fotoperiodo de 16/8 h (iluminación de 70-
Con el fin de contribuir tanto a la recuperación como a la 80 µmol m-2 s-1).
conservación de especies en peligro de extinción, el propósito
de esta investigación fue establecer un procedimiento que De la recolecta de diciembre 2011, los embriones
facilite la micropropagación de E. paipana. seleccionados se cultivaron durante 30 días en MS
suplementado con 0,01, 0,05, 0,1 y 0,2 mg l-1 de 3-ácido
indolbutírico (AIB); en MS, MS/2 y MS/4 sin reguladores
MATERIALES Y MÉTODOS de crecimiento o suplementados con ácido giberélico (GA3)
y kinetina (KIN) en concentraciones de 1, 3 y 5 mg l-1,
Material vegetal. La población de E. paipana, objeto de adicionadas a los medios individualmente o combinadas.
este trabajo, está localizada en el Parque Natural Municipal En cada medio ensayado se cultivaron 20 embriones. En
“Ranchería” en Paipa, Boyacá, sector La Cuchilla (5° 5’ esta etapa se evaluó durante 30 días el efecto de: i) la
09,7” N, 73° 08’ 38,2” O), ocupa alrededor de 657 ha a composición del medio de cultivo; ii) fotoperiodo de
una altura entre 3.200 y 3.600 m (Morales et al. 2011, 16/8 h, e iluminación y oscuridad continuas; iii) diferentes
Sánchez y Cely 2003). Para obtener el material vegetal, temperaturas: 4 y 24 ºC continuos, 4 y 24 ºC de forma
en el transcurso de un año (diciembre 2011-diciembre alternada cada 12 h. En esta etapa se evaluó: reactividad
2012) se realizaron siete recolectas de capítulos florales de embriones, contaminación por hongos y bacterias,
de los cuales en el laboratorio, con pinzas de punta fina, se viabilidad y apariencia de plántulas desarrolladas.

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El medio en el que se cuantificó el mayor porcentaje de Para el Ensayo II, la tapa de aluminio de los recipientes
germinación fue utilizado para el cultivo de los embriones con brotes enraizados se reemplazó por una tapa de
obtenidos en las recolectas posteriores. plástico extensible; progresivamente, durante diez días,
la tapa plástica se perforó hasta un 70% de su área total.
Etapa de multiplicación de brotes axilares. Con el Luego, las plántulas se extrajeron de los recipientes, sus
fin de producir brotes suficientes para los ensayos de raíces se enjuagaron con agua corriente y se transfirieron
proliferación, las pocas plántulas obtenidas en la fase a bandejas de poliestireno de 21 x 20 x 4 cm con una
anterior se cultivaron durante tres meses en el medio mezcla de capote:tierra (3:1). Cada bandeja se colocó en
propuesto por Rache y Pacheco (2009) para Espeletiopsis una cubeta plástica de 34 x 29 x 13 cm y se cubrió con
muiska [MS + 2,46 µM de AIB + 0,004 µM de bencil plástico extensible perforado 70% de su superficie; las
amino purina (BA)]. Posteriormente, los brotes obtenidos cubetas se mantuvieron 30 días en cuarto de incubación y
se cultivaron durante 30 días en MS suplementado con 30 días en invernadero, con un riego diario por aspersión
0,1, 0,2, 0,5, 2 y 3 mg l-1 de AIB, adicionados a los medios manual; finalmente, las plántulas se transfirieron a macetas
individualmente o combinados con 0,01, 0,02, 0,05, 0,1 y plásticas individuales con el mismo sustrato utilizado en
0,2 mg l-1 de BA. En cada medio se cultivaron 50 brotes en las bandejas y se mantuvieron en invernadero.
recipientes de 200 ml con 20 ml de medio y se determinó:
tasa de proliferación, apariencia y longitudes de brotes Análisis de datos. Los datos obtenidos se procesaron
y tallo principal, hábito de crecimiento y formación de mediante el programa Statgraphics plus 5,1. Se realizaron
callo basal. Se determinó la combinación hormonal más análisis de varianza univariado (ANOVA) y pruebas de
adecuada para multiplicación de brotes y se utilizó para el comparación múltiple de diferencia mínima significativa
mantenimiento de cadenas proliferativas subcultivándolas (LSD). Además, para analizar el comportamiento multivariable
cada 30 días. La tasa de proliferación (TP) se estimó de los datos obtenidos en las etapas de proliferación y
mediante la relación TP = (Bi – B0) / B0 (B0 = brotes enraizamiento se realizó un análisis de componentes
iniciales y Bi = brotes individualizables) a través de nueve principales (ACP).
subcultivos consecutivos.

Enraizamiento de brotes. Al final de cada subcultivo se RESULTADOS

seleccionaron brotes de longitud ≥ 2 cm y se cultivaron
durante 60 días en MS sin reguladores, MS suplementado Material vegetal. A través del año de estudio se observó
con: 0,5, 1, 1,5, 2,0, 3,0 y 5,0 mg l-1 de AIB o, con 0,1, 0,3 que solo 14 de las 26 plantas existentes desarrollaron
y 0,5 mg l-1 de ácido naftalenacético (ANA). En esta etapa inflorescencias; de estas se recolectaron 290 capítulos de
se determinó: porcentaje de brotes enraizados, número y los cuales se extrajeron 10.427 aquenios y se recuperaron
longitud de raíces y formación de callo basal en los brotes. 7.223 embriones; finalmente, se seleccionaron 4.370
embriones aptos para cultivo in vitro (tabla 1). El número
Endurecimiento de plántulas. Durante la fase de de embriones seleccionados solo alcanzó el 60,5%
endurecimiento se realizaron dos ensayos: Ensayo I: según del total de embriones extraídos; el 39,5% restante se
el protocolo establecido por Rache y Pacheco (2009), consideró como embriones no funcionales, deshidratados,
los brotes enraizados se extrajeron de los recipientes de con tejidos necróticos o colonizados por hongos o larvas
cultivo, las raíces se enjuagaron con agua corriente para de insectos (figura 1A).
eliminar el agar y, posteriormente, se transfirieron a vasos
plásticos de 100 ml. Los sustratos utilizados fueron mezclas En las pruebas con TTC se estimó una viabilidad promedio
de capote (mantillo de bosque), turba y tierra. Los vasos de 29% (62,50, 1,00 y 23,75%) en los tres lotes de
se colocaron en recipientes de vidrio de 50 x 30 x 10 cm embriones de aquenios recién recolectados; mientras que
cerrados con plástico extensible y se mantuvieron en cuarto en embriones no reactivos (77%) después de 30 días del
de incubación (23 °C, luz continua y 97% de humedad cultivo in vitro la viabilidad fue nula.
relativa) durante 30 días, con un riego diario por aspersión
manual. Luego se trasladaron a invernadero y, de forma Establecimiento de cultivos in vitro. Asepsia superficial
progresiva, durante 15 días, se disminuyó la humedad de aquenios y embriones. Los porcentajes de embriones
eliminando la cubierta de plástico. En el invernadero el asépticos recuperados después de aplicados los tratamientos
riego de las plántulas también se realizó cada 24 h por de asepsia, así como los porcentajes de embriones reactivos
aspersión manual. cuantificados en los medios de germinación no dependieron de

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Tabla 1. Capítulos recolectados y respuesta germinativa in vitro de embriones de Espeletia paipana S. Díaz y Pedraza
(* = ausencia de capítulos con flores en antesis; # cap rec = número de capítulos recolectados; X cap = promedio de
capítulos; # ext = número de extraídos)

Colecciones Aquenios # de embriones # de plántulas

(meses) # cap rec cap # ext extraídos cultivados reactivos viables

Diciembre 73 45,78 3.342 1.916 1.160 433 90

Febrero* — — — — — — —
Marzo 15 31,78 477 235 220 0 0
Mayo 6 60,17 361 167 96 5 5
Julio 22 58,55 12.88 1.050 985 0 0
Septiembre 113 22,16 2.504 1.638 1.124 2 2
Noviembre 61 40,26 2.455 2.217 785 241 45
Total 290 258,68 10.427 7.223 4.370 681 142

Figura 1. Embriones de Espeletia paipana S. Díaz y Pedraza. A. No viable; B. Con cubierta seminal; C. Desprovisto
de cubierta seminal; D. Con cotiledones distinguibles; E. Germinando, con cotiledones clorofílicos; F. En proceso de
crecimiento y desarrollo: 1. Cubierta seminal; 2. Cotiledones; 3. Primordio foliar en desarrollo; 4. Radícula

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si se desinfectaron aquenios o embriones (tabla 2); por tanto, ensayados, solo en los 23 registrados en la figura 2 se observó
el contacto directo del hipoclorito con los tejidos del embrión reactivación de embriones; en los 29 restantes, los embriones
no afectó su viabilidad. El mayor porcentaje de embriones cultivados apenas cambiaron su coloración tornándose más
superficialmente asépticos (66%) y reactivos (50%) se blanquecina. Además, los resultados cuantificados a 30 días de
cuantificó aplicando Ca(ClO)2 al 1% durante 5 min (tabla 2). cultivo, mostraron que la reducción de macroelementos del MS
basal favoreció la germinación de embriones, registrándose
Germinación de embriones. Después de 30 días de cultivo en mayor porcentaje (50%), de embriones germinados en MS/4
los medios de germinación, de 1.160 embriones seleccionados suplementado con 1 mg l-1 de GA3 (figura 2).
para cultivo in vitro, 433 fueron reactivos y presentaron
elongación, hinchamiento o expansión cotiledonar, escasa En condiciones de luz se observaron embriones reactivos
emergencia radicular y elongación hipocotiledonar, así como (luz continua: 42% y fotoperiodo de 16/8 h: 20%) sin
una incipiente actividad de la yema apical y baja actividad embargo, no se encontraron diferencias estadísticamente
clorofílica. Solo 90 embriones desarrollaron plántulas viables significativas entre los embriones mantenidos en oscuridad
(tabla 1, figura 1A-F), cuantificación consistente con los datos (44% embriones reactivos y 44% plántulas viables) y/o
de las pruebas de viabilidad con TTC. mantenidos con iluminación contínua (42% embriones
reactivos y 34% de plántulas viables), pero si se observaron
En embriones recién recolectados, el mayor porcentaje de diferencias morfológicas tanto entre embriones reactivos
viabilidad esperado, 62,5% (de acuerdo a la prueba con como entre las plántulas desarrolladas (figura 3). Los
TTC, diciembre 2011), y a 30 días de cultivo, 37,3% (433 embriones desarrollados en ausencia de luz tendieron
embriones, diciembre 2011) (tabla 1), permiten establecer a presentar menor contaminación y se caracterizaron
que los capítulos recolectados en diciembre contienen por su coloración blanquecina (casi hialina), elongación
mayor número de embriones reactivos con capacidad para acusada de los cotiledones, hojas y radícula (figura 3
germinar. Sin embargo, el porcentaje de viabilidad a 30 días A-C), presentando una apariencia propia de estructuras
de cultivo difiere del porcentaje de viabilidad estimado, etioladas. La etiolación redujo la incidencia de necrosis
evidenciándose una pérdida de viabilidad de un 50% de y oxidación de embriones, efecto contrario al observado
los embriones obtenidos y cultivados in vitro. en los embriones germinados en condiciones de luz, de
aspecto clorofílico, en los cuales se registraron pérdidas
Comparando el efecto del medio de cultivo sobre la causadas por oxidación de tejidos (figura 3 F) después de
germinación de embriones, de un total de 52 tratamientos 15 días de cultivo.

Tabla 2. Porcentaje de embriones asépticos y reactivos de Espeletia paipana S. Díaz y Pedraza después de la acción
desinfectante del hipoclorito de sodio (NaOCl) y calcio [Ca(ClO)2] (* = unidades por tratamiento: 50)

Agente Concentración Tiempo % de embriones

Explantes desinfectante (%) (min) asépticos reactivos
1,0 2 50 51
NaOCl 1,0 3 52 49
Aquenios 3,0 10 65 46
1,0 5 58 48
Ca(ClO)2
0,5 5 51 48
1,0 2 58 45
NaOCl 1,0 3 62 40
Embriones 3,0 10 68 43
1,0 5 66 50
Ca(ClO)2
0,5 5 53 52

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Figura 2. Embriones de Espeletia paipana S. Díaz y Pedraza germinados en diferentes medios de cultivo [letras distintas
entre barras indican diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos según la prueba de comparación
múltiple de diferencia mínima significativa (LSD) (P ≤ 0,05)]

Figura 3. Embriones de Espeletia paipana S. Díaz y Pedraza germinados en condiciones de luz y oscuridad a 30 días de
cultivo. A, B y C. Oscuridad continua; D y E. Iluminación contínua; F. Plántula fenolizada: 1. Hojas; 2. Cotiledones;
3. Radícula

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En el tratamiento incubado a 24 ºC se cuantificaron las

mejores respuestas, 42% de embriones reactivos y 34%
de plántulas viables, marcando diferencias significativas
con los tratamientos realizados a las otras temperaturas
ensayadas, 4 °C continua: 4% de embriones reactivos y
0% plántulas viables y, 4 °C por 12 h/24 °C por 12 h: 0%
tanto de embriones reactivos como de plántulas viables.

Multiplicación de brotes axilares. Se presentaron

diferencias estadísticamente significativas (P < 0,05)
entre los tratamientos en todos los parámetros estudiados
en esta etapa. El análisis ACP para correlacionar los Figura 5. Promedio de brotes individualizables de
Espeletia paipana S. Díaz y Pedraza por explantes
datos de número de brotes/explante, longitud de brotes
producidos en medio basal (MS) suplementado con
neoformados, longitud de tallo principal, brotes con hojas 3-ácido indolbutírico (AIB) solo o combinado con
dispuestas en roseta, brotes con hojas alternas y formación bencil amino purina (BA) [letras distintas entre barras
de callo basal, permitió establecer que el tratamiento siete indican diferencias estadísticamente significativas entre
(figura 4), MS suplementado con 0,5 mg l-1 de AIB + 0,05 tratamientos según la prueba de comparación múltiple de
mg l-1 de BA, fue el más adecuado tanto para inducción de diferencia mínima significativa (LSD) (P ≤ 0,05)]
nuevas yemas axilares como para promover el crecimiento
y desarrollo de brotes (figura 5). Aunque en los tratamientos En los medios suplementados con 3 mg l-1 de AIB o con 0,5
ocho y nueve se cuantificó el mayor número de brotes/ mg l-1 de AIB + 0,05 mg l-1 de BA, tanto los tallos principales
explante, se observó formación de callo basal (en 12-13% de los brotes en proliferación como de los nuevos brotes
de brotes) (figura 4 y 5). desarrollados alcanzaron sus mayores longitudes, 0,478 cm
y 0,41 cm y, 2,56 cm y 2,60 cm, respectivamente. Además,
la longitud total de los brotes disminuyó progresivamente
cuando se redujeron las concentraciones de la auxina y la
citoquinina, cuantificándose la menor longitud (1,09 cm) en
los brotes cultivados en MS libre de reguladores (tabla 3).

Tabla 3. Longitud de tallo principal y de brotes

individualizables cuantificada en explantes de Espeletia
paipana S. Díaz y Pedraza en el medio basal (MS) en
presencia de 3-ácido indolbutírico (AIB) y bencil amino
purina (BA), al cabo de 30 días de cultivo [promedios con
letras distintas en la misma columna indican diferencia
significativa según la prueba de comparación múltiple de
diferencia mínima significativa (LSD) (P ≤ 0,05)]
Reguladores
Longitud (cm)
(mg l-1)
AIB BA brotes tallo
0,2 — 1,38 ± 0,19e 0,328 ± 0,17c
Figura 4. Análisis de componentes principales para 2,0 — 2,10 ± 0,26b 0,364 ± 0,20b, c
proliferación in vitro de brotes de Espeletia paipana
3,0 — 2,56 ± 0,17a 0,478 ± 0,18a
S. Díaz y Pedraza cultivados en medio basal (MS) (los
números indican los tratamientos de proliferación y entre 0,1 0,02 1,16 ± 0,22f 0,146 ± 0,05d
paréntesis se indican los reguladores en mg l-1: 1. MS 0,5 0,01 1,74 ± 0,32d 0,134 ± 0,04d
(testigo); 2. 3-ácido indolbutírico (AIB; 2); 3. AIB (3); 4.
0,5 0,05 2,60 ± 0,59a 0,410 ± 0,19b
AIB (0,2); 5. AIB (0,1) + bencil amino purina (BA; 0,02);
6. AIB (0,5) + BA (0,01); 7. AIB (0,5) + BA (0,05); 8. AIB 0,5 0,10 1,90 ± 0,38c 0,107 ± 0,02d
(0,5) + BA (0,1); 9. AIB (0,5) + BA (0,2) 0,5 0,20 2,05 ± 0,28b 0,100 ± 0,00d
Control 1,09 ± 0,20f 0,100 ± 0,00d

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Los brotes con aspecto de roseta presentaron tallos

muy cortos, mientras que los de aspecto elongado se
caracterizaron por tallos más largos y hojas alternas
(figura 6). Los porcentajes promedio de brotes en roseta
presentaron diferencias estadísticamente significativas
con los porcentajes de brotes con hojas alternas, siendo
evidente que en la mayoría de los tratamientos los nuevos
brotes desarrollados únicamente presentaron aspecto
en roseta; en los demás tratamientos se observó que los
brotes en proliferación desarrollaron simultáneamente Figura 7. Tasa de proliferación de brotes de Espeletia
brotes en roseta y brotes con hojas alternas (figura 6 A-D). paipana S. Díaz y Pedraza mantenidos en cadenas
Además, el desarrollo de brotes con hojas pubescentes proliferativas con subcultivos cada 30 días en medio
fue notoriamente mayor en brotes en roseta que en brotes basal (MS) suplementado con AIB y BA [MS + 0,5 mg l-1
con hojas alternas en los que, también, se observó un de 3-ácido indolbutírico (AIB) + 0,05 mg l-1 de bencil
amino purina (BA)]
crecimiento y desarrollo de hojas más lento.

El mayor porcentaje (85%), de brotes enraizados se registró

en el medio suplementado con 5 mg l-1 de AIB, aunque
estadísticamente esta respuesta fue similar a la obtenida en
los tratamientos con 3 mg l-1 de AIB y 0,3 mg l-1 de ANA
(tabla 4). En cuanto a número de raíces/brote (tabla 3), en
los medios suplementados con 5 mg l-1 de AIB o 0,5 mg l-1
de ANA se registraron los promedios más altos (grupo a).

Después de 30 días de cultivo, entre los datos de

enraizamiento registrados en los medios suplementados
con 2, 3 ó 5 mg l-1 de AIB y con 0,1, 0,3 ó 0,5 mg l-1
Figura 6. Brotes de Espeletia paipana S. Díaz y Pedraza de ANA no se presentaron diferencias estadísticamente
en fase de proliferación. A. Explante con brotes axilares; significativas y se registraron longitudes máximas de
B. Brote de aspecto en roseta; C. Brote de aspecto
raíz muy semejantes, aunque en presencia de ANA son
elongado; D. Explante con brotes de aspecto en roseta
y aspecto elongado (* = callo basal) mayores. Sin embargo, las longitudes mínimas de las raíces
desarrolladas en los tratamientos con AIB son mayores que
En el medio MS con 0,5 mg l-1 de AIB + 0,05 mg l-1 de las alcanzadas en los tratamientos con ANA (tabla 4). Las
BA se cuantificaron tasas variables de proliferación por raíces desarrolladas en presencia de AIB fueron delgadas
subcultivo y una tasa acumulada de 1:7 brotes a través y más largas (figura 9 A-C), en contraste con las que se
de nueve subcultivos consecutivos; se determinó que desarrollaron en presencia de ANA las cuales, además,
cada ciclo completo de proliferación comprendió tres presentaron engrosamiento el cual fue más notorio en
subcultivos siendo el intermedio el que presentó una tasa aquellas de menor longitud (figura 9 D-F).
de proliferación más elevada (figura 7).
Endurecimiento de plántulas. Se observó que todos los
Enraizamiento de brotes. El análisis de ACP que brotes enraizados con ANA murieron después de cinco a
correlaciona porcentaje de brotes enraizados, número seis días de su transferencia a sustrato sólido en condiciones
de raíces/brote, longitud mínima y máxima de raíces y de cuarto de incubación. En el Ensayo I, después de
frecuencia de formación de callo basal, permitió establecer 90 días, en las plántulas transferidas del recipiente de
que el medio más adecuado para enraizamiento fue MS enraizamiento directamente a sustrato sólido (figura 10
suplementado con 5 mg l-1 de AIB (figura 8.5), seguido A, B) se cuantificó 2% de plántulas viables; las demás
de los tratamientos suplementados con 0,3 y 0,5 mg l-1 de presentaron necrosis foliar progresiva desde el ápice hasta
ANA (figura 8.7, 8.8); en estos últimos tratamientos los la base. En el Ensayo II, el cambio de las tapas de aluminio
brotes formaron callo basal y el número de raíces/brote de los recipientes de enraizamiento, por tapas de papel
disminuyó. extensible (perforadas gradualmente, durante diez días)

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Tabla 4. Efecto del 3-ácido indolbutírico (AIB), ácido naftalenacético (ANA) y 3-ácido indolbutírico (AIB) + bencil amino
purina (BA) sobre el desarrollo radical de brotes de Espeletia paipana S. Díaz y Pedraza cultivados en medio basal (MS)
[promedios con letras distintas en la misma columna indican diferencia significativa según la prueba de comparación
múltiple de diferencia mínima significativa (LSD) (P ≤ 0,05)]

Reguladores % de brotes de Longitud Longitud

Reguladores [mg l-1] enraizados raíz/brote mínima (cm) máxima (cm)
0,5 0 ±0,00f — — —
1 16 ±0,37e 1 ±0,00e 3,4 ±1,06d, e 3,4 ±1,06b, c
1,5 16 ±0,37e 1,5 ±0,53e 1,5 ±0,53e 2,1 ±0,64c
AIB
2 49,2 ±0,50d 4,29 ±2,17d, e 6 ±3,57b, c 11,5 ±4,93a
3 76,7 ±0,42a, b 5,33 ±3,41d 8,1 ±4,35a 13 ±5,56a
5 85 ±0,36a 9,76 ±6,04a 7,3 ±4,19a, b 13,1 ±4,11a
0,1 60,5 ±0,49c, d 5,91 ±4,53c, d 3,5 ±2,46d, e 11,6 ±7,08a
ANA 0,3 75,4 ±0,43 a, b, c 7,52 ±6,19b, c 3,7 ±2,65d, e 12,6 ±6,84a
0,5 63,6 ±0,48b, c 8,98 ±5,6a, b 4,4 ±2,35c, d 13,8 ±6,64a
AIB + BA 0,5+0,05 10 ±0,30f 1,67 ±1,21d, e 9,2 ±5,41a 9,3 ±6,28a, b
MS 0 ±0,00f — — —

propició un acondicionamiento lento y progresivo de las

plántulas a los nuevos niveles de luz, humedad y aireación
(figura 10 C).

Después de 30 días de endurecimiento en el cuarto de

incubación, se cuantificó un 78% de plántulas viables
(figura 10 D) y al cabo de 30 días en invernadero se
cuantificó un 65% (figura 10 E, F). Posteriormente,
las plántulas transferidas a recipientes individuales en
condiciones de invernadero (figura 10 G, H) alcanzaron,
en promedio, longitud de 7 cm, 13 hojas (de 3 cm de
longitud x 0,5 cm de ancho) color verde oscuro con
abundante pubescencia, sistema radical vigoroso (con
siete raíces gruesas y 20 raíces más delgadas), raíces
de longitud mínima de 9 cm y máxima de 17 cm, y
abundantes pelos absorbentes. El tamaño y número de
hojas aumentó, notándose un incremento de la pubescencia
y una intensificación del color, mientras que el crecimiento
caulinar fue lento, casi imperceptible.
Figura 8. Análisis de componentes principales para
los datos de enraizamiento in vitro de brotes de
Espeletia paipana S. Díaz y Pedraza cultivados en en
DISCUSIÓN
medio basal (MS) (los números indican los tratamientos
de enraizamiento y entre paréntesis se indica la
concentración de los reguladores en mg l-1: 1. 3-ácido El procedimiento para micropropagación de E. paipana
indolbutírico (AIB; 1); 2. AIB (1,5); 3. AIB (2); 4. AIB (3); puede iniciarse a partir de aquenios o de embriones tratados
5. AIB (5); 6. ácido naftalenacético (ANA; 0,1); 7. ANA con Ca(ClO)2, agente desinfectante eficaz para eliminar
(0,3); 8. ANA (0,5); 9. AIB (0,5) + bencil amino purina hongos y bacterias superficiales de los explantes y cuya
(BA; 0,05) acción es, según García et al. (2008), menos fitotóxica

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Figura 9. Brotes de Espeletia paipana S. Díaz y Pedraza enraizados. A, B y C. en presencia de 3-ácido indolbutírico
(AIB); D, E y F. en presencia de ácido naftalenacético (ANA)

Figura 10. Endurecimiento de plántulas de Espeletia paipana S. Díaz y Pedraza. A y B. Plántulas en sustrato sólido,
en cuarto de incubación; C. Plántulas en recipientes con tapa de papel extensible; D y E. Plántulas en bandejas de
poliestireno, en cuarto de incubación y en invernadero, respectivamente; F. Plántulas en bandejas, sin cubierta en
invernadero; G. Plántula a 60 días en sustrato sólido; H. Plántula en sustrato sólido a 100 días de endurecimiento

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que la del NaOCl, tal como lo comprobó García et al. Las condiciones de luz y temperatura utilizadas afectaron
(2008) en semillas de Oryza sativa L. y Jaakola et al. de manera variable la germinación de embriones de E.
(2001) en semillas de Vaccinium meridionale Sw. Aunque paipana, observándose que el porcentaje de embriones
el hipoclorito utilizado para la desinfección no afecto la germinados fue mayor bajo luz continua a 24 ºC; además,
viabilidad, la capacidad germinativa de los embriones en estas condiciones la apariencia de las estructuras en
si disminuyó; este efecto negativo también se presentó desarrollo fue normal; estas observaciones son semejantes
en los ensayos de germinación y latencia de semillas de a las realizadas en Marchantia polymorpha L. (Pedroza-
Annona cherimola L. y Annona muricata L. (Lobo et Manrique y Caballero 2009), en las que la germinación
al. 2007). Sin embargo, los porcentajes de viabilidad de fue considerablemente superior a mayor temperatura
embriones obtenidos en este trabajo son más elevados que (20-25 oC y máxima de 30 ºC).
los indicados por Morales et al. (2011), quienes además
registraron 89% de aquenios sin embrión y 3% de aquenios En algunas especies se ha observado un efecto aditivo entre
viables cuando fueron germinados en invernadero. el tratamiento con frío y el acido giberélico (Watkinson y
Pill 1998) y aunque E. paipana es propia de un ecosistema
Teniendo en cuenta el total de embriones cultivados paramuno, en los tratamientos realizados a temperaturas
(1.160), el bajo número de embriones reactivos (433) y el bajas se cuantificaron bajos porcentajes de germinación.
escaso número de embriones germinados (90), es evidente Al respecto, Engelmann (1991) indicó que si los explantes
la baja capacidad de germinación que dichos embriones cultivados in vitro se mantienen a temperaturas bajas
demuestran en condiciones in vitro; no obstante, el medio durante períodos prolongados, pueden presentarse daños
MS/4 suplementado con GA3, fue el que mejor estimuló fisiológicos causados por el frío, que inciden en cambios
tanto la iniciación del proceso germinativo como los en el metabolismo, en el contenido de proteínas y en la
procesos morfogenéticos de los embriones cultivados, composición y funcionamiento de las membranas celulares.
observándose que dicha estimulación incrementó a
medida que disminuyó la concentración de GA3 en el Durante la etapa de multiplicación de brotes se observó
medio de cultivo. Por tanto, es evidente que el efecto que una característica particular del medio establecido para
del GA3 dependió tanto de la concentración en el medio proliferación es que la relación AIB:BA = 1:10 difiere de
como de la viabilidad de los embriones, concordando con las relaciones comúnmente utilizadas para proliferación,
las observaciones en otras especies como Theobroma pero es semejante a la utilizada para E. muiska (Rache y
cacao L. (Cárdenas et al. 2010) y Jaltomata procumbens Pacheco 2009). Schumülling (2004) sostiene que mayor
Cav. (Saldívar et al. 2010). A pesar de que algunos pocos concentración de citoquinina respecto a la de auxina debe
embriones de E. paipana (6 a 10%), germinaron en los promover la formación de brotes y que en las plantas
medios MS, MS/2 y MS/4 sin reguladores (controles), la superiores estos balances generalmente están presentes,
reactividad fue más lenta y el desarrollo y crecimiento de razón por la cual no requieren altas concentraciones
plántulas más retardado en comparación con lo observado de reguladores en el medio para establecimiento y
en los medios suplementados con GA3. No obstante, multiplicación in vitro; esto último explicaría, en parte, el
se debe tener en cuenta que el porcentaje de embriones éxito del medio establecido en la proliferación de brotes
viables es bajo y que dicha viabilidad no puede ser de E. paipana.
detectada en los embriones a cultivar, lo cual explicaría
la semejanza de repuesta germinativa entre la mayoría de La producción de brotes alcanzada en presencia de la
los tratamientos realizados (figura 2). Los datos registrados combinación AIB+BA, establecida para proliferación
sobre germinación de embriones concuerdan claramente de brotes de E. paipana, pone en evidencia su eficacia
con la reducida capacidad de reproducción natural y para estimular tanto la formación de yemas como el
supervivencia de plantas de E. paipana; al respecto, Arciga crecimiento y desarrollo caulinar; además, la semejanza de
(2011) y Arditti (1992, citado en Arciga 2011) señalan que las respuestas registradas en los diferentes tratamientos de
aun cuando se obtengan porcentajes bajos de germinación, proliferación, indica alta efectividad del BA aún en bajas
estos resultados pueden no ser significativos puesto que a concentraciones en el medio de cultivo.
través de cultivo de tejidos, las pocas plántulas obtenidas
se pueden propagar rápidamente, asegurando ciertos Con relación al enraizamiento de brotes de E. paipana,
porcentajes de sobrevivencia puesto que dado los cultivos se observó que la presencia de auxinas en el medio es
se realizan en condiciones asépticas en medios establecidos indispensable para estimular el desarrollo radical y,
para cada especie. que tanto el ANA como el AIB, son efectivos para este

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proceso. Sin embargo, cuando se utilizó ANA, de forma como del ambiente de cultivo, incide drásticamente
generalizada los brotes formaron callo basal lo cual sobre la adaptación y las respuestas morfofisiológicas
dificulta el funcionamiento adecuado de las raíces y, de las plántulas. González et al. (2002) consideran el
además, puede ser causa de inviabilidad de las plántulas endurecimiento como uno de los pasos críticos en la
durante el proceso de endurecimiento tal como lo proponen propagación in vitro de plantas debido a que los cambios
Ríos et al. (2005). bruscos que se producen, constituyen causas de estrés y
pérdida de plántulas al finalizar la micropropagación.
Si bien, los brotes de E. paipana producidos in vitro
podrían catalogarse como estructuras de fácil y rápido De manera semejante a lo determinado para E. paipana,
enraizamiento puesto que activan y ponen en marcha Rache y Pacheco (2009) enfatizan que la etapa de
su capacidad rizogénica aún en presencia de bajas endurecimiento de vitroplantas de E. muiska exige
concentraciones de auxina, en su ausencia o en dosis un control minucioso de la temperatura, humedad e
limitadas no ocurrió enraizamiento. Esta observación iluminación y que debe ser realizado progresivamente;
concuerda con los planteamientos de Martínez et al. (2007) además, indican que las plántulas transferidas de los
y Uribe et al. (2011), quienes indicaron que la aplicación recipientes de cultivo directamente a condiciones de
exógena de agentes inductores de enraizamiento, como las invernadero no son viables. En frailejones, determinar con
auxinas en concentraciones elevadas, favorece la iniciación precisión las condiciones específicas de endurecimiento
y desarrollo de raíces. Además, Gutiérrez (1988) sugiere es un proceso bastante complejo, en el cual intervienen
que debe tenerse en cuenta que la facilidad de un brote para numerosas variables que seguramente guardan una estrecha
desarrollar raíces adventicias, se debe al genotipo de la relación con las condiciones naturales muy particulares
especie en estudio, condiciones fisiológicas y ambientales, de los ecosistemas paramunos en los que subsisten estas
además de algunos factores bioquímicos. especies.

La adición de 5 mg l-1 de AIB al medio permitió obtener Los resultados exitosos de enraizamiento de brotes de E.
no solo los mayores porcentajes de brotes enraizados sino paipana obtenidos en este trabajo confirman lo planteado
el mayor número de raíces por explante; estos resultados por Fujii et al. (1990) quienes sostienen que la capacidad
quedan enmarcados dentro de los planteamientos de para obtener in vitro plantas con raíces, no es necesariamente
Saucedo et al. (2008) quienes señalaron que es importante un indicador generalizado de crecimiento y desarrollo en
obtener un alto número de raíces, aún de poca longitud, condiciones ex vitro. Sin embargo, la mezcla de capote-
ya que las plántulas obtenidas in vitro requieren un buen tierra utilizada como sustrato, en conjunto con las demás
sistema radical para tener éxito durante el trasplante y condiciones tenidas en cuenta durante el endurecimiento
transferencia a condiciones de invernadero. favoreció la viabilidad de plántulas de E. paipana.

Rache y Pacheco (2009) probaron la acción de AIB en el El estudio realizado establece el primer protocolo para
enraizamiento in vitro de brotes de E. muiska y al cabo propagación in vitro de E. paipana el cual permite la
de 30 días de cultivo, observaron que a medida que se producción de plántulas a partir de embriones cigóticos
incrementó la concentración de AIB, también aumentó el en medio MS/4 suplementado con 1 mg l-1 de GA3. Las
porcentaje de brotes enraizados y el promedio de raíces plántulas obtenidas se pueden multiplicar a través de
por explante, tal como ocurrió en E. paipana; mientras que cadenas proliferativas mantenidas en MS suplementado
en estudios realizados por Suárez et al. (2006) en Stevia con 0,5 mg l-1 de AIB + 0,05 mg l-1 de BA y 85% de los
rebaudiana, a medida que se aumentó la concentración brotes producidos se pueden enraizar en MS suplementado
de AIB en el medio de cultivo la formación de raíces con 5 mg l-1 de AIB, recuperándose, finalmente, 65% de
disminuyó. plántulas viables después de la etapa de endurecimiento.

Por otro lado, los porcentajes de viabilidad de plántulas El protocolo establecido es un logro biotecnológico
cuantificados durante la etapa de endurecimiento, indican utilizable como alternativa adecuada para contribuir al
claramente que la transferencia de brotes enraizados in vitro aumento de la pequeña población de E. paipana, puesto
a sustrato sólido en invernadero es uno de los procesos más que permite la propagación masiva de plántulas con fines
determinantes para el éxito de la micropropagación de E. de replantación y conservación y, además, constituye la
paipana; téngase en cuenta que el acondicionamiento lento base para adelantar futuros estudios en otras asteráceas
y progresivo a las nuevas condiciones tanto del sustrato paramunas.

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