Discusión

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA
MOLECULAR
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE INGENIERIA

CAMPUS GUANAJUATO (UPIIG)
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR 1

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE INGENIERÍA CAMPUS GUANAJUATO
MOLECULAR
INGERNIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR

MOLECULAR
PRÁCTICA 9
DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS
EQUIPO #4

MOLECULAR
ARIAS ARENAS, ANGEL ENRIQUE
GARCÍA LOPEZ, ANDREA LOAMI
MENDOZA VÁZQUEZ, HELIA SUJEI
RAMOS HERNÁNDEZ, JOSÉ DAVID
VALTIERRA MURILLO, ESTEFANIA

MOLECULAR
Resultados
Para realizar la curva estándar para la cuantificación de proteína por Bradford se realizó la
preparación de las soluciones stock, tomando como referencia la albúmina.

MOLECULAR
Tabla 1. Preparación de la solución stock para la cuantificación de proteínas.
Tubo No. Solucion stock (µl) Agua destilada (µl) Concentración

(µg/ml)
1 0 1000 0
2 20 980 20
3 40 960 40
4 60 940 60
5 80 920 80

MOLECULAR
6 100 900 100
En un tubo de 5 mL se adicionó 0.2 mL de solución stock y 0.8 mL del reactivo de

Bradford y así sucesivamente, como se indica en el protocolo para realizar la curva
estándar.
Se dejó incubar por 5 minutos y cada muestra fue leída en el espectrofotómetro a una
longitud de onda de 595 nm.

MOLECULAR
Con los resultado de la absorbancia se graficó (Figura 1), la concentración de proteína (eje
x) contra absorbancia (eje y). En la taba 2 se muestran las concentraciones y las
absorbancias para cada muestra, para obtener la ecuación de la recta.
Para la concentración de proteínas tenemos que:
20 (
μg 1 mL
mL 1000 μl )
( 20 μl )=0.4 μg

MOLECULAR
Tabla 2. Concentraciones y absorbancias obtenidas para la curva estándar.
Tubo No. Concentración de Absorbancia (Eje Y)

proteína µg (Eje X)
1 0 -0.012
2 0.4 -0.018
3 1.6 0.068
4 3.6 0.044
5 6.4 0.025

MOLECULAR
6 10 0.193

MOLECULAR
Curva estándar para el ensayo de

Bradford
0.25
0.2
Absorbancias
0.15 Bradford
f(x) = 0.0164531414531415 x − 0.0103281853281853
Linear (Bradford )
0.1 R² = 0.687794355442004
0.05
0
0 2 4 LABORATORIO
6 8 DE10
BIOTECNOLOGÍA
12 MOLECULAR 11
-0.05 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE INGENIERÍA
Concentración de proteína (µg) CAMPUS GUANAJUATO
MOLECULAR
Figura 1. Curva estándar para el ensayo de Bradford.
Para la muestra A1, se tomaron 200 µl de muestra y 800µl del reactivo Bradford en un tubo
de 5 ml, la muestra A2 está compuesta de 100 µl de muestra, 800µl del reactivo Bradford y
100 µl de agua. Para el caso de la muestra B1 se compone de 100 µl de muestra y 900µl del
reactivo Bradford y para la muestra B2 son 50 µl de muestra, 900µl del reactivo Bradford y
50 µl de agua (tabla 3).

MOLECULAR
Se midió la absorbancia de las muestras en el espectrofotómetro con una longitud de onda

de 595nm, para las cuales los resultados de absorbancia se muestran en la tabla 3.
Tabla 3. Absorbancias de las muestras de leche utilizadas.
Tubo Muestra Agua Reactivo Absorbancia

(µl) destilada Bradford (µg)
(µl)
A1 200 800 0.107

MOLECULAR
A2 100 100 800 0.045
B1 100 900 0.065
B2 50 50 900 0.013
Para determinar la concentración de proteínas contenida en las muestras, a partir de la

ecuación de la curva estándar:

MOLECULAR
( Absorbancia muestra ) +0.0103

x=
0.0165
Se sustituyeron los valores de absorbancias obtenidas de las muestras problemas y se

sustituyeron en la ecuación de la recta, tabla 2, las concentraciones finales de las muestras
se muestran en la tabla 4.

MOLECULAR
( 0.045 ) +0.0103
x=
0.0165
∴ x=3.3515 μg /ml

MOLECULAR
Tabla 4. Concentración de proteína contenida en cada muestra analizada.
Muestra Absorbancia Concentración

(µg/ml)
A1 0.107 3.3515
A2 0.045 7.1091
B1 0.013 1.4121

MOLECULAR
B2 0.065 4.5636
Discusión de Resultados
Los datos arrojados del espectrofotómetro, no dan una secuencia lógica de lo que se esperaba de
las muestras. Debido a que el colorante es sensible a la presencia de contaminantes como restos
de detergente y metanol (Fiorentina y otros, 1994), las absorbancias pudieron ser afectadas por

MOLECULAR
algunos de estos agentes o debido al manejo de las muestras, ya que las diluciones que se hicieron
fueron de 1:100. También, debido a que no se purifico una proteína especifica de la leche, el
colorante no formo los complejos colorantes- proteína, al tener la presencia de otras moléculas.
Comparando los resultados de las mismas muestras de la técnica de SDS-PAGE de la practica
anterior, se observaron dos bandas tenues correspondientes a proteínas, por lo que la
concentración de proteína calculada, es baja debido a que la muestra de leche está muy diluida.

MOLECULAR
Conclusión
Cuestionario

MOLECULAR
1. Menciona que rango de concentración de proteínas puedes detectar con el método

de Lowry, si la muestra se lee a una longitud de onda de 500, 660 y 750 nm.
Longitud de onda (nm) Concentración de proteínas (µg)
500 25-100
660 2-30
750 1-2
Según reporta (Fernández Reyes & Galván Cejudo).
2. Mencionas ventajas y desventajas en el uso del método de Lowry.

MOLECULAR
3. Escribe el fundamento de los métodos de Bradford y el del ácido bicinconínico

(BCA) utilizados en la determinación de la concentración de proteínas.
El método de Bradford se basa en el equilibrio entre tres formas del colorante Azul
de Comassie. En condiciones fuertemente ácidas, el colorante es más estable, y opta
por una forma de color rojo pálido. La forma aniónica del colorante de forma no
covalente puede unirse a las proteínas a través de reaccionar con los residuos de
aminoácidos básicos y aromáticos de las proteínas. La unión proteína- colorante, se
puede detectar a 595 nm en el ensayo utilizando un espectrofotómetro.

MOLECULAR
El método del ácido bicinconínico (BCA), se basa en la reducción cuantitativa en

medio alcalino del Cu (II) a Cu (I) por parte de las proteínas, y de la reacción
acoplada del BCA que forma con el Cu (I) un complejo púrpura que presenta un
máximo de absorción a 562 nm (Fiorentina y otros, 1994).

MOLECULAR

MOLECULAR
Figura 2.- Formación del complejo púrpura con BCA e ión cuproso generado por la
reacción de Biuret.
4. Menciona que compuestos que pueden interferir en el ensayo de Lowry y en el de
Bradford

MOLECULAR
Bibliografía
Fiorentino Gómez, S., Gutiérrez Fernández M., & Rueda Ardila N. La inmunología en el diagnóstico
clínico. 1 edición. Centro Editorial Javeriano. Colombia. Paginas 120- 135.
Fernández Reyes, E., & Galván Cejudo, A. (s.f.). Universidad de Córdoba. Recuperado el 17 de
noviembre de 2012, de Universidad de Córdoba:
http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-mol/pdfs/27%20M%C3%89TODOS
%20PARA%20LA%20CUANTIFICACI%C3%93N%20DE%20PROTE%C3%8DNAS.pdf

MOLECULAR
Concentración Sol. Stock

20 (
μg 1 mL
mL 1000 μl )
( 20 μl )=0.4 μg


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Tabla 1. Preparación de la solución stock para la cuantificación de proteínas.

Tubo No. Solucion stock (µl) Agua destilada (µl) Concentración

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6 100 900 100

En un tubo de 5 mL se adicionó 0.2 mL de solución stock y 0.8 mL del reactivo de

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Tabla 2. Concentraciones y absorbancias obtenidas para la curva estándar.

Tubo No. Concentración de Absorbancia (Eje Y)

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Curva estándar para el ensayo de

Figura 1. Curva estándar para el ensayo de Bradford.

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Se midió la absorbancia de las muestras en el espectrofotómetro con una longitud de onda

Tabla 3. Absorbancias de las muestras de leche utilizadas.

Tubo Muestra Agua Reactivo Absorbancia

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A2 100 100 800 0.045

B1 100 900 0.065

Para determinar la concentración de proteínas contenida en las muestras, a partir de la

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( Absorbancia muestra ) +0.0103

Se sustituyeron los valores de absorbancias obtenidas de las muestras problemas y se

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Tabla 4. Concentración de proteína contenida en cada muestra analizada.

Muestra Absorbancia Concentración

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LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR 20

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2. Mencionas ventajas y desventajas en el uso del método de Lowry.

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Concentración Sol. Stock

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