Vázquez Alejandra P10

PRÁCTICA 10:
RECUENTO DE
LEUCOCITOS
Alejandra Vázquez Ortiz.
20/03/2024
1ºLABCB
Biologia molecular y
citogenética.
1
1. FUNDAMENTOS.
Con una suspensión celular de partida, es decir, una suspensión donde se encuentren
células suspendidas en un líquido (bien sea medio de cultivo, sangre, líquidos
orgánicos), se puede obtener lo que se denomina un cultivo celular.
Un cultivo celular es el conjunto de procedimientos que hacen posible el
mantenimiento de células de organismos pluricelulares in vitro, preservando al máximo
sus características fisiológicas, bioquímicas y genéticas.
Para ello, la suspensión se introduce en un recipiente adecuado junto con un medio de
cultivo y se incuban en las condiciones óptimas para que las células proliferen. Sin
embargo, es necesario realizar un paso previo antes de hacer un cultivo, denominado
recuento celular, para determinar su densidad celular, es decir, el número de células
por mL.
El recuento celular consiste en un contaje, es decir, el proceso de recuento de células
totales.
Este proceso se lleva a cabo en la cámara de contaje celular o hemocitómetro, siendo
la más utilizada la cámara de Neubauer.
Después, se recontarán las células viables, es decir, las células vivas con las que si se
podrá hacer un cultivo. Para ello, se necesitará la acción de un colorante denominado
azul tripán, que se diluirá con la muestra en una proporción 1/2 . Las células que
queden teñidas de azul serán las células muertas ya que el azul tripán penetra en la
membrana de estas.
Dependiendo de la naturaleza de la suspensión, el recuento celular será de un tipo de
células u otro.
En este caso, al ser la suspensión inicial una muestra sanguínea, las células que se
podrán contar son glóbulos blancos o leucocitos.
El recuento de leucocitos (WBC) consiste en la determinación del número de
leucocitos presentes en un volumen determinado de sangre (generalmente en 1 mm3),
siendo un recuento manual en una cámara de contaje.
2. OBJETIVOS.
Poner en práctica el recuento celular total en el microscopio óptico con la cámara de
contaje en una muestra de sangre para conteo de leucocitos.
Aprender el uso y manejo del microscopio óptico.
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3. MATERIALES Y REACTIVOS.
- Pipeta 2 mL.
- Auxiliar de pipeta.
- Micropipeta de 10 a 100 microL.
- Puntas de pipeta.
- Tubo de ensayo pequeño para contener la dilución.
- Cámara de recuento.
- Microscopio óptico.
- Gradilla.
- Papel de filtro.
- Líquido de Turk , el más utilizado (compuesto por 2 mL de ácido acético glacial
que produce la lisis de los eritrocitos sin alterar los leucocitos, 1 mL de solución
acuosa de violeta de genciana o azul de metileno al 1% que tiñe el núcleo de
los leucocitos para que se puedan observar mejor, y 100 mL de agua destilada)
- Sangre venosa procedente de una punción venosa y anticoagulada con EDTA.
4. CÁLCULOS.
Los cálculos para esta práctica fueron los siguientes:
En el primer cuadrante (esquina superior izquierda) se hizo el recuento de leucocitos
por conteo manual en cada cuadrado pequeño que compone el cuadrante de 9x9.
Por ello, se sumó el resultado obtenido en cada cuadrado pequeño, siendo el cálculo:
C1 = A1+A2+A3+A4+A5+A6+A7+A8+A9
Imagen 1: Esquema del cuadrante para entender el conteo.
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C1= 13+10+8+10+10+9+2+6= 76 células.
Para el resto de cuadrantes, se realizó el recuento sin contar las células por cada
cuadrado pequeño que lo componían, sino que se contó directamente toda la
superficie del cuadrante, siguiendo el correcto procedimiento en zigzag (imagen 4).
C2= 59 células.
C3= 77 células.
C4= 64 células.
Una vez obtenidos el número de células por cada cuadrante, se aplicó la fórmula para
poder calcular el número de leucocitos expresado en células/microL, siendo:
WBC= L/4 x 10 x D.
L: sumatorio del número de leucocitos contados en cada cuadrante.
D: factor de dilución (20).
10: para determinar el número de leucocitos existentes en 1mm3 o en 1 microL.
Por lo que sería:
WBC: 276/4 x 10 x 20 = 13.800 células/microL.
Por otro lado, para poder calcular la densidad celular en células/mL, se aplicó la
misma fórmula que en el caso anterior pero se sustituyó el 10 que reflejaba el
resultado en microL por 104 que expresa este resultado en células/mL:
WBC: 276/4 x 104 x 20 = 1,38x107 células/microL.
5. PROCEDIMIENTO.
1. Pipetear 100 microL de sangre y mezclar en el tubo de ensayo con 1,9 mL de
líquido de Turck para obtener una dilución 1/20.
2. Depositar una gota de dilución resuspendiendo previamente en el retículo de la
cámara. Esto se realiza colocando la punta de la pipeta con 10 o 20 microL de
dilución en la apertura entre el cubre que viene incorporado a la cámara y el
suelo del retículo (con forma de medialuna), y dejando que el líquido penetre
por capilaridad. Hay que evitar que se formen burbujas y que rebose el líquido
por fuera.
3. Para ello se coloca la pipeta vertical, se sitúa la punta en ese espacio, se deja
salir algo de líquido y se retira justo antes de que se llene completamente el
espacio.
4. Dejar reposar durante unos minutos para que las células puedan sedimentarse.
4
5. Enfocar el retículo con el objetivo de 4x y 10x y verificar que la distribución de
leucocitos es homogénea.
6. Contar los leucocitos presentes en los 4 cuadrados grandes de las esquinas del
retículo (estando a su vez dividido en 9 o 16 cuadrados dependiendo del tipo de
cámara usada).
Si los leucocitos se ven bien, se pueden contar con el objetivo de 10x.
6. RESULTADOS.
Una vez preparada la dilución con sangre y líquido de Turck, se procedió al recuento
manual de leucocitos al microscopio óptico.
En este caso, se utilizó una cámara con 10 retículos.
Se llenó solo 1 retículo para realizar el conteo y otros 4 para practicar el llenado
correctamente.
Imagen 2
Al colocar la muestra en el microscopio, la imagen observada fue la siguiente:
Imagen 3: Imagen en objetivo 10x.

5
Cada retículo posee una cuadrícula grande, dividido en 9 cuadrantes, de los cuales
sólo se contaron los cuatro cuadrantes de cada esquina, es decir, se omitieron los
cuadrantes de la fila y la columna de la mitad. Cada cuadrante, a su vez, se dividía en
9 cuadrados más pequeños, en los cuales se hizo el recuento uno por uno para el
primer cuadrante de la esquina superior izquierda, y después se sumó para poder
aplicar la fórmula para el cálculo de número de células totales.
En los otros tres cuadrantes (esquina superior derecha y esquina inferior izquierda y
derecha), se conteo directamente el número de células totales del cuadrante, en el
orden adecuado (como un zigzag), no se contó cada cuadrado pequeño y luego se
sumó como en el caso de la primera esquina.
Imagen 4: Ejemplo esquematizado de cómo se realiza el conteo de células.

Una vez se realizó el conteo manual, se aplicaron los cálculos matemáticos para
obtener el número total de células por mL de la muestra (cálculos en el apartado de
cálculos).
El resultado obtenido fue:
• Expresado en células/microL: 1,38x104 células/microL.
• Expresado en células/mL: 1,38x107 células/mL.
Para poder interpretar este resultado, se debe conocer que un valor normal de WBC
está comprendido entre 5.000 y 11.000 células/mm3 , expresado de otra manera:
células/microL.
Por lo tanto, al ser el resultado obtenido de 13.800 células/microL, y al estar por
encima de los valores considerados como normales, se consideraría como una
leucocitosis.
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De ser el caso contrario y estar por debajo de los valores normales, se produciría una
leucopenia.
Sin embargo, al tener en cuenta los resultados del resto de ensayos, y al observar que
los resultados variaban, siendo unos pocos altos, otros pocos bajos, pero en general
todos se encontraban comprendidos entre los valores de normalidad, se estima y se
supone que realmente la muestra si se encuentra en los valores correctos, solo que el
recuento manual supone un 20% de error, con lo que esas pequeñas variaciones en
los resultados pueden verse afectadas por este margen de error.
7. INDICENCIAS U OBSERVACIONES.
No hubo incidencias en la práctica.
No obstante, cabe destacar las variaciones en los resultados del recuento de
leucocitos, ya que, aunque de 11 ensayos que se realizaron la mayoría fueron acorde
a las condiciones normales del recuento, unos pocos fueron altos o bajos, no por
mucha diferencia, pero si existió variación.
8. GESTIÓN DE RESIDUOS.
El líquido de Turk es un reactivo utilizado para el recuento de leucocitos en cámara de
recuento.
El producto no está clasificado como peligroso y no dispone de pictogramas de
seguridad.
Se debe mantener alejado de fuentes de calor, chispas y llamas libres.
Se debe reutilizar si es posible y en caso de tener que desecharlo, los residuos del
producto han de considerarse desechos especiales no peligrosos, por lo que deberá
encargarse una empresa autorizada para la gestión de basuras, no desecharlo por el
desagüe ya que se debe tener en cuenta su composición de ácido acético glacial,
dañino para el medio ambiente.
Finalmente, al contener la cámara una muestra de sangre, considerada como riesgo
biológico, deberá desecharse en los cubos de residuos de tipo III (cubo amarillo de tipo
papelera para residuos biológicos punzantes).
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Imagen 1: Esquema del cuadrante para entender el conteo.

Imagen 3: Imagen en objetivo 10x.

Imagen 4: Ejemplo esquematizado de cómo se realiza el conteo de células.

• Expresado en células/microL: 1,38x104 células/microL.

• Expresado en células/mL: 1,38x107 células/mL.

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