U.5 T.hibridación
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TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN
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APLICACIONES DEL SOUTHERN BLOT.
Las múltiples aplicaciones del southern blot están siendo sustituidas por técnicas como la PCR,
que aportan mayor sensibilidad y rapidez. Entre las principales aplicaciones destacan, la
elaboración de huellas genéticas, el estudio de mutaciones estructurales (traslocaciones,
deleciones, inserciones, inversiones) y la detección de secuencias adquiridas.
2.4. MICROARRAYS.
Los microarrays de ADN o biochips son conjuntos o colecciones de fragmentos de
ADN (sondas) distintos fijados a una superficie sólida (vidrio, plástico o silicio).
Partiendo de una única muestra y realizando un único proceso de hibridación, un
microarray detecta simultáneamente miles de secuencias distintas , cualitativa y
cuantitativamente. La inmensa cantidad de información que aportan en una única
reacción los convierte en potentes herramientas para estudios genómicos y de
expresión génica.
Las sondas ancladas en el biochip son monocatenarias y no están marcadas. Se
marca con fluorocromos la muestra que se va a estudiar. La lectura del resultado
obtenido tras la hibridación requiere un escáner de lectura basado en tecnología láser
y un potente software de análisis.
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Estas técnicas se han desarrollado fundamentalmente para diagnóstico microbiológico y
especialmente para la detección de virus.
Su realización es similar a la de los inmunoensayos tipo ELISA, permitiendo analizar múltiples
muestras simultáneamente y son fácilmente automatizables. Las más importantes son la técnica
de captura del híbrido y la técnica del ADN ramificado.
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PREPARACIONES DE NÚCLEOS INTERFÁSICOS DESNUDOS
En este tipo de preparaciones se pretende obtener una extensión de núcleos en interfase sobre
los que realizar la hibridación, sin que la membrana citoplasmatica suponga una barrera para que
las sondas alcancen su secuencia diana.
EXTENSIONES CITOLÓGICAS
Se obtienen a partir de fluis biológicos con ellas en suspensión, que se extienden intactas sobre
un portaobjetos en forma de monocapa, bien directamente depositando una gota de fluido y
extendiéndola manualmente, bien previo lavado con una solución tampón. Existen también
aparatos automáticos que realizan este proceso.
SECCIONES DE TEJIDOS
El tejido puede estar conservado mediante congelación o mediante fijación en formol e inclusión
en parafina.
FISH INTERFÁSICA
La técnica de FISH interfásica consiste en la detección de secuencias de ADN en núcleos en
interfase, bien sobre preparaciones citogenéticas de núcleos desnudos, bien en extensiones
citológicas o secciones de tejido.
FISH METAFÁSICA
La técnica de FISH metafásica consiste en la detección de secuencias de ADN directamente en
los cromosomas sobre extensiones citogenéticas de metafases.
Como en FISH interfásica, se utilizan sondas centroméricas para detectar anomalías numéricas y
sondas específicas de locus para detectar anomalias estructurales.