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U.5 T.hibridación

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UNIDAD 5

TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

1. LAS TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN.


Las técnicas de hibridación se pueden clasificar tomando como criterio el medio o soporte en
que se llevan a cabo. A partir de este criterio podemos diferenciar tres grupos de técnicas: en
soporte sólido, en medio líquido e in situ.

2. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN EN SOPORTE SÓLIDO.


Las técnicas de hibridación en soporte sólido se caracterizan porque una de las dos moléculas
implicadas, la secuencia diana o la sonda, previamente a la hibridación se inmoviliza sobre un
soporte sólido.
Lo habitual es fijar al soporte la muestra con la secuencia diana e incubar posteriormente con la
sonda marcada para formar el híbrido. En esta metodología se basan las técnicas de dot blot,
southern blot y nothern blot.
En otras ocasiones se obtiene más información fijando al soporte la sonda e incubando
posteriormente con el ácido nucleico que se estudia, previamente marcado. En esta metodología
se basan por ejemplo, los microarrays.

2.1. DOT BLOT


El dot blot es una técnica de hibridación simple que utiliza membranas de nitrocelulosa o nailon
como soporte sólido y que permite detectar secuencias de ácidos nucleicos, ADN o ARN, en una
mezcla compleja sin aportar ninguna información adicional.
Es la forma más simple de hibridación. Sobre las membranas de nitrocelulosa o de nailon se
coloca directamente una gota de la muestra que se va a analizar, que puede ser un ácido
nucleico purificado, un listado celular, un producto de amplificación de PCR, etc…
Esta técnica permite el estudio simultáneo de varias muestras, aplicando cada muestra en una
zona distinta de la membrana y se puede realizar con sondas radiactivas o con sondas marcadas
con haptenos. Si las aplicaciones se realizan en forma de banda en lugar de en forma circular, la
técnica se denomina slot bot.
La técnica se lleva a cabo incubando secuencialmente as membranas con los reactivos con
inmersión en cubetas, en bolsas de plástico termosellables o con cierre hermético o en frascos
con tapón de rosca.

APLICACIONES DEL DOT BLOT.


De forma genérica, el dot blot se puede utilizar como técnica de rastreo o screening para detectar
secuencias de interés en múltiples muestras simultáneamente. Además, se han desarrollado
también aplicaciones concretas del dot blot, con nombres específicos: ASO dot blot, dot blot
inverso, hibridación de colonias e hibridación de placas virales.

2.2. SOUTHERN BLOT.


El southern blot es una técnica de hibridación que permite identificar fragmentos de
ADN separados por electroforesis en gel y transferidos a una membrana de
nitrocelulosa o nailon.
A diferencia del dot blot, permite la detección simultánea de varias secuencias diana
de distintos tamaños con una única hibridación. Típicamente se utilizan sondas
radiactivas, aunque pueden emplearse otros marcajes. Con sondas marcadas con
32P se pueden detectar cantidades inferiores a 0,1 pg de ADN.

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APLICACIONES DEL SOUTHERN BLOT.
Las múltiples aplicaciones del southern blot están siendo sustituidas por técnicas como la PCR,
que aportan mayor sensibilidad y rapidez. Entre las principales aplicaciones destacan, la
elaboración de huellas genéticas, el estudio de mutaciones estructurales (traslocaciones,
deleciones, inserciones, inversiones) y la detección de secuencias adquiridas.

2.3. NORTHERN BLOT.


El northern blot es una técnica de hibridación que permite detectar moléculas de ARN separadas
por electroforesis en gel y transferidas a una membrana de nitrocelulosa o nailon.
Es decir, es una técnica similar al southern blot, pero optimizada para estudiar ARN.

APLICACIONES DEL NORTHERN BLOT.


Las principales aplicaciones del Northern blot incluyen el análisis de expresión génica, la
detección de mutaciones y estudios de corte y empalme o splicing alternativos.

2.4. MICROARRAYS.
Los microarrays de ADN o biochips son conjuntos o colecciones de fragmentos de
ADN (sondas) distintos fijados a una superficie sólida (vidrio, plástico o silicio).
Partiendo de una única muestra y realizando un único proceso de hibridación, un
microarray detecta simultáneamente miles de secuencias distintas , cualitativa y
cuantitativamente. La inmensa cantidad de información que aportan en una única
reacción los convierte en potentes herramientas para estudios genómicos y de
expresión génica.
Las sondas ancladas en el biochip son monocatenarias y no están marcadas. Se
marca con fluorocromos la muestra que se va a estudiar. La lectura del resultado
obtenido tras la hibridación requiere un escáner de lectura basado en tecnología láser
y un potente software de análisis.

APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS.


Se han descrito múltiples aplicaciones de la tecnología de microarrays, pero las dos más
importantes son la hibridación genómica comparada y los estudios de
expresión génica.

HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARADA EN ARRAYS (aCGH).


La hibridación genómica comparada en arrays permite detectar e identificar
alteraciones genéticas consistentes en pérdida (deleciones y
microdeleciones) o ganancia (duplicaciones y microduplicaciones) de
material genético mediante la comparación del ADN de una muestra con un
ADN de referencia.

ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GENÉTICA.


La hibridación en microarrays hace posible análisis detallados de perfiles de expresión génica de
poblaciones celulares, al estudiar simultáneamente la expresión de miles de genes.

OTRAS APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS.


Los microarrays son útiles para estudiar a gran escala todo tipo de
polimorfismos y mutaciones con una gran repercusión en el
diagnóstico, pronóstico y evolución de las enfermedades, así como de
la predisposición a padecerlas. Otros ejemplos de aplicaciones son la
detección de microorganismos contaminantes en alimentos y muestras
biológicas, el estudio de splicing alternativos de ARN, detección de
genes fusión, etc…

3. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO.


En las técnicas de hibridación en medio líquido, el híbrido sonda/secuencia diana se forma en
solución, normalmente en pocillos de una placa microtiter, y posteriormente se fija a la pared del
pocillo para proceder a su detección.
Una característica de estas técnicas es que habitualmente no se marca ni la sonda ni la muestra.
El híbrido se detecta por métodos indirectos más o menos complejos.

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Estas técnicas se han desarrollado fundamentalmente para diagnóstico microbiológico y
especialmente para la detección de virus.
Su realización es similar a la de los inmunoensayos tipo ELISA, permitiendo analizar múltiples
muestras simultáneamente y son fácilmente automatizables. Las más importantes son la técnica
de captura del híbrido y la técnica del ADN ramificado.

3.1. TÉCNICA DE CAPTURA DEL HÍBRIDO


La técnica de hibridación de captura del híbrido se basa en la formación de híbridos ARN/ADN
que serán reconocidos o capturados por anticuerpos específicos.
Si la secuencia diana es ADN, la sonda será de ARN y si la secuencia es de ARN la sonda será de
ADN.
La captura del híbrido ARN/ADN se produce mediante anticuerpos específicos que reconocen
estos heterodúplex y que se hallan fijados en las paredes de pocillos de la placa microtiter.
Esta técnica se desarrollo inicialmente para detectar el virus del papiloma humano (VPH) en
muestras cervicales (cuello uterino) aunque en la actualidad permite detectar múltiples agentes
infecciosos.
Siguiendo con el ejemplo del VPH, que es un virus ADN, los pasos que se siguen, partiendo de
una muestra cervical.

3.2. TÉCNICA DEL ADN RAMIFICADO


La técnica del ADN ramificado consiste en un sistema de amplificación de señal, basado en la
unión de la secuencia diana a un macrocomplejo de ADN, de tipo arborescente, mediante
sucesivas hibridaciones.
La técnica de ADN ramificado, bDNA, se diseño para aumentar la sensibilidad de las técnicas de
captura del híbrido, haciendo posible, además, su cuantificación. Una de sus principales
aplicaciones es la cuantificación de cargas virales en muestras biológicas.

4. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN IN SITU


Las técnicas de hibridación in situ permiten detectar y localizar secuencias de ácidos nucleicos
(ADN y ARN) sobre cromosomas metafásicos, células y tejidos.
Las técnicas de hibridación in situ (ISH) son las técnicas en las que la hibridación de los ácidos
nucleicos se realiza directamente sobre extensiones mitológicas o secciones de tejido y el
resultado obtenido se analiza microscópicamente en el contexto de detalles morfológicos.
Algunas características de la tecnica de hibridación in situ:
No requiere la extracción y purificación previa de los ácidos nucleicos.
Es relativamente rapida y sencilla, con un coste economico moderado.
Se puede realizar sobre material fresco, congelado e incluso fijado en formol e incluido en
parafina.
Permite obtener información a nivel de célula individual en relación con el resto del tejido.
Posibilita la realización de estudios retrospectivos.
Utiliza sondas no radiactivas, tanto de ADN como de ARN y PNA.
Dependiendo del marcados empleado, se diferencian dos tipos de ISH, la hibridación in situ
fluorescente y la hibridación in situ cromogénica. Ambos procesos se han automatizado,
existiendo en el mercado varios inmunoteñidores adaptados a la realización de FISH.

4.1. TIPOS DE MUESTRAS PARA ISH


En esta tecnica, la expresión in situ significa que la secuencia diana se va a localizar en el sitio en
que se encuentra fisiológicamente, es decir, en los cromosomas o núcleos interfásicos en el caso
de ADN y en el citoplasma en el caso de ARN.
Por lo tanto, para poder realizar esta tecnica hat que colocar estructuras celulares o titulares en
forma de monocapa sobre un portaobjetos de cristal, que realiza la función de soporte solido
sobre el que realizar la hibridación. Concretamente, la ISH se puede realizar sobre preparaciones
citogénicas de metafases o núcleos interfásicos desnudos, extensiones citológicas y secciones
de tejidos.

PREPARACIONES DE CROMOSOMAS EN METAFASE


La obtención de preparaciones citogenéticas de metafase cromosómicas se realiza a partir de
cultivos de sangre periférica, medula ósea, liquido amniótico, etc, deteniendo las mitosis en el
estadio de la metadase mediante el empleo de colchicina.

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PREPARACIONES DE NÚCLEOS INTERFÁSICOS DESNUDOS
En este tipo de preparaciones se pretende obtener una extensión de núcleos en interfase sobre
los que realizar la hibridación, sin que la membrana citoplasmatica suponga una barrera para que
las sondas alcancen su secuencia diana.

EXTENSIONES CITOLÓGICAS
Se obtienen a partir de fluis biológicos con ellas en suspensión, que se extienden intactas sobre
un portaobjetos en forma de monocapa, bien directamente depositando una gota de fluido y
extendiéndola manualmente, bien previo lavado con una solución tampón. Existen también
aparatos automáticos que realizan este proceso.

SECCIONES DE TEJIDOS
El tejido puede estar conservado mediante congelación o mediante fijación en formol e inclusión
en parafina.

4.2. ISH FLUORESCENTE (FISH)


La hibridación in situ fluorescente se basa en el empleo de sondas marcadas con fluorocromos,
que son detectadas visualizando las preparaciones con un microscopio se fluorescencia
mediante filtros adecuados.
Su principal aplicación es la detección de alteraciones cromosómicas, tanto numéricas
(monosomías, trisomías, poliploidías) como estructúrales (traslocaciones, deleciones, inserciones,
inversiones y duplicaciones) en relación con el diagnóstico y pronóstico de patologías
oncológicas o con base genética.
En muchas ocasiones complementa los resultados obtenidos con técnicas citogenéticas
tradicionales (cariotipo), aportando información adicional, sobre todo en casos con cariotipos
aparentemente normales o con metafases de baja calidad o cariotipos complejos de difícil
interpretación.

FISH INTERFÁSICA
La técnica de FISH interfásica consiste en la detección de secuencias de ADN en núcleos en
interfase, bien sobre preparaciones citogenéticas de núcleos desnudos, bien en extensiones
citológicas o secciones de tejido.

FISH METAFÁSICA
La técnica de FISH metafásica consiste en la detección de secuencias de ADN directamente en
los cromosomas sobre extensiones citogenéticas de metafases.
Como en FISH interfásica, se utilizan sondas centroméricas para detectar anomalías numéricas y
sondas específicas de locus para detectar anomalias estructurales.

4.3. ISH CROMOGÉNICA (CISH)


La hibridación in situ cromogénica (CISH) se caracteriza porque el híbrido se detecta mediante
una reacción inmunohistoquímica que produce un producto coloreado visible con un microscopio
óptico convencional de luz transmitida.
Se realiza principlemtne sobre secciones de tejido FFPE, porque las muestras que se han fijado
en formol adquieren cierto nivel de autoflorescencia por lo que muchos casos la interpretación de
una técnica FISH sobre este tipo de muestras es muy problemática.
Es una técnica muy utilizada en los laboratorios de anatomía patológica en situaciones en las que
las técnicas habituales de inmunohistoquímica no aportan suficiente información. En este sentido,
las aplicaciones de la CISH se orientan más a la detección de secuencias que permitan precisar
el diagnóstico anatomopatológico o aporten información pronóstica, que a la detección de
alteraciones cromosómicas.
Aplicaciones concretas serian las siguientes:
Detección de secuencias génicas de virus oncológicos, como el VPH o el virus de Epstein-Barr.
Detección de ARNm de las cadenas y de ls inmunoglobulinas para estudiar la clonalidad de
infiltrados linfocitarios.
Estudios de la expreso génica, mediante la detección de ARNm concretos, muy útiles por
ejemplo para analizar la sobreexpresión de oncogenes en determinadas lesiones.

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