Practico 2024 Lam Gram Utn

UNIVERSIDAD
TECNOLOGICA
NACIONAL
FACULTAD REGIONAL ROSARIO
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA
CATEDRA DE BIOTECNOLOGIA
Trabajo práctico n° 4
“Tinción y observación de microorganismos.”
2009
Jefe de Cátedra: Ing. Eduardo Santambrosio

Jefe de Trabajos Prácticos: Ing. Marta Ortega
Auxiliar de 1a: Ing. Pablo A. Garibaldi
1. OBJETIVOS
El presente trabajo practico tiene por objetivo brindar al alumno herramientas

básicas en la confección y el manejo de extendidos y la tinción de los mismos de
acuerdo a la observación que se desee realizar.
2. FUNDAMENTO TEÓRICO
2.1. Tinción:
Es el proceso por el cual las moléculas de un colorante se adsorben a una

superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los
microorganismos y poder realizar la observación en microscopio óptico.
Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el
medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse
claramente sin algún tratamiento previo.
De acuerdo a la reacción que ocurre, existen diferentes tipos de tinción:
a) Tinción simple:
El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología celular.
División a lo largo del mismo plano,

División a lo largo de 3 planos
formando cadenas cortas forma
División a lo largo
esférica:
de 2 planos
se llama
diferentes:
2 cocos
4 - 20 en cadenas:
Tétradas regularmente:
irregularmente:
Coco
juntos:
Estreptococos
Sarcinas
Estafilococos
Diplococos
Empalizadas, Bacilos
Forma de vara: se
Dos bacilos juntos:
Cadenas de bacilos:
lado con lado o en figuras
llaman Bacilos
Diplobacilos
Estreptobacilos
en X, V o Y
b) Tinción diferencial:
El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre células bacterianas o
entre partes de una misma célula. Estas técnicas utilizan mas de un colorante
o bien ciertos reactivos complementarios para la tinción.
Ejemplos: Tinción de Gram, Tinción de Ziehl-Neelsen, etc.
2.2. Colorantes
Los colorantes más utilizados: azul de metileno, cristal violeta, safranina, son
catiónicos y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados
negativamente, como los ácidos nucleicos y los polisacaridos ácidos (las
envueltas externas de los microorganismos están por lo general cargadas
negativamente).
2.3. Tinción diferencial de Gram:
Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien
la desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las
bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en
este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga
eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de
bacterias). Descripta en forma breve, la secuencia de la tinción es la siguiente: el
Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se
cubre con solución Yodada durante 1 - 2 min. y se lava de nuevo con agua,
decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina
(color de contraste) durante 1 – 2 min. Lavar y secar.
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta
debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes
celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y
forma al organismo así como para
prevenir la lisis osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere
rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula gram-positiva es gruesa y
consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de
ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula gram-positiva
es peptidoglicano. La pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene
una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por
una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y
lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula gram-negativa es
peptidoglicano.
Descripción de la tinción de GRAM:

Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una
solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y
son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este estado,
todas las células, tanto las grampositivas como las gramnegativas, están
teñidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. El
ingrediente activo es aquí el I 2; el KI simplemente hace soluble el I 2 en agua. El
I 2 entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal
violeta. De nuevo tanto las células grampositivas como las gramnegativas se
encuentran en la misma situación.
Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-
acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I 2-cristal violeta. Algunos
organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros
(gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de
células está por tanto en su resistencia a la decoloración; esta resistencia se
debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas,
la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana
exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la membrana
citoplásmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de
peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la
célula se decolora. Las células grampositivas, a causa de sus paredes
celulares más espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son
permeables al disolvente, provocando que el de complejo cristal violeta-yodo
quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la decoloración las
células grampositivas son todavía azules, pero las gramnegativas son
incoloras.
Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de
contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la
fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células
gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas permanecen azules.
Bacillus
anthracis (Gram positivo) Pseudomonas aeruginosa (Gram negativo)

Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tinción de Gram:
1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El
yodo por sí solo tiene poca afinidad con las células.
2) EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo
preciso del tiempo para evitar que pierdan la tinción las células
grampositivas.
3) Cultivos de más de 24 horas de teñidos pueden perder su habilidad de
retener el complejo cristal violeta - yodo.
2.4. Tinción diferencial: Método ácido resistente (ZIEHL-NEELSEN)
Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos

grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que
les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido,
después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-
alcohol resistentes.
El frotis se tiñe durante unos 5 min con Fucsina fenicada aplicando calor suave.
Lavar con agua. Decolorar con alcohol etílico 95% con un 3% de ClH
concentrado. Lavar y teñir durante 30-60 seg con Azul de Metileno (color de
contraste). Lavar y secar.
2.5. Tinción diferencial para revelar estructuras celulares. Método de Wirtz.
Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus,

producen en su interior formas de resistencia denominadas esporas. Se
producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento
de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos,
etc.) formándose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso
de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior.
Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva
forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante años.
La tinción específica de esporas requiere dos colorantes:
1.- Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.
2.- Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.
Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado
con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el
segundo colorante.
3. TRABAJO EN EL LABORATORIO
3.1. Materiales
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Microscopio óptico
• Solución de cristal violeta al 1 %
• Solución de azul de metileno al 1 %
• Solución de safranina al 1 %
• Solución decolorante (alcohol etílico y acetona 1:1)
• Solución de I2 / I- (yodo / yoduro al 0.1 %)
• Cultivo (caldo o agar) a teñir.
• Ansa de punta y ansa de aro.
• Mecheros
• Alcohol etílico
• Gasa
3.2. Preparación del extendido previa a la coloración
• Se toma un portaobjetos previamente desengrasado y se coloca en el centro del

mismo una gota del cultivo líquido, mediante ansa de platino.
Si el cultivo es sólido, se coloca primero una gota de solución fisiológica o agua
destilada estéril sobre el portaobjeto. Luego, con ansa de platino se toma una
colonia del medio sólido y se emulsiona con la solución fisiológica. Se extiende
con el ansa en forma de capa delgada y uniforme.
• Se procede a la fijación del extendido. Para ello se pasa lentamente el

portaobjeto, en forma horizontal, sobre la llama del mechero manteniendo el
extendido hacia arriba. La operación se repite hasta sequedad total, cuidando
evitar la combustión del extendido.
3.3. Tinción
3.3.1. Tinción simple
Sobre el extendido seco se colocan unas gotas de azul de metileno y

se deja actuar unos minutos.
Se elimina el exceso de colorante lavando con agua de forma suave, con
ayuda de piseta. Se seca el extendido de la forma descripta en 3.2.
Se observa al microscopio.
3.3.2. Tinción diferencial. Método de Gram
Sobre el extendido realizado en el punto 3.2., se realiza el siguiente tratamiento:

Paso del proceso REACCION Y COLORACION DE LAS BACTERIAS
GRAM POSITIVAS GRAM NEGATIVAS
Solución de Cristal Células color violeta

Violeta al 1%.
Se deja actuar 1 minuto Células color violeta
Solución Yodo- Formación del Formación del

Iodurada. Se deja complejo Yodo – complejo Yodo –
actuar 1 a 2 Cristal Violeta en el Cristal Violeta
minutos interior de las células en el interior de las
Las células células Las células
permanecen violetas permanecen violetas
Solución de alcohol El complejo Yodo – El complejo Yodo –
Acetona. Se deja actuar Cristal Violeta no sale Cristal Violeta se separa
20 de las Células, las que de las Células, las que
Segundos conservan el color pierden el Color y no
violeta. pueden observarse
Solución de Las células Las células

Safranina. Se conservan el Color decoloradas se Tiñen
deja actuar 1 a 2 Violeta. de rojo.
Minutos.
Lavar, secar y observar al microscopío.

Practico 2024 Lam Gram Utn

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Practico 2024 Lam Gram Utn

Cargado por

Información del documento

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Practico 2024 Lam Gram Utn

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

UNIVERSIDAD

Jefe de Cátedra: Ing. Eduardo Santambrosio

El presente trabajo practico tiene por objetivo brindar al alumno herramientas

Es el proceso por el cual las moléculas de un colorante se adsorben a una

División a lo largo del mismo plano,

2.3. Tinción diferencial de Gram:

Descripción de la tinción de GRAM:

anthracis (Gram positivo) Pseudomonas aeruginosa (Gram negativo)

2.4. Tinción diferencial: Método ácido resistente (ZIEHL-NEELSEN)

Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos

2.5. Tinción diferencial para revelar estructuras celulares. Método de Wirtz.

Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus,

3.2. Preparación del extendido previa a la coloración

• Se toma un portaobjetos previamente desengrasado y se coloca en el centro del

• Se procede a la fijación del extendido. Para ello se pasa lentamente el

3.3.1. Tinción simple

Sobre el extendido seco se colocan unas gotas de azul de metileno y

3.3.2. Tinción diferencial. Método de Gram

Sobre el extendido realizado en el punto 3.2., se realiza el siguiente tratamiento:

GRAM POSITIVAS GRAM NEGATIVAS

Solución de Cristal Células color violeta

Solución Yodo- Formación del Formación del

Solución de Las células Las células

Lavar, secar y observar al microscopío.

También podría gustarte