Guia Laboratorio Carbohidratos y ADN

UNIVERSIDAD DE LA SALLE
ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS Y APLICADAS

BIOQUÍMICA GENERAL
FRACCIONAMIENTO DE TEJIDOS: CARBOHIDRATOS Y ADN
OBJETIVOS
1. Comprobar la presencia de carbohidratos en tubérculos utilizando reacciones específicas

2. Comprobar la presencia de ácidos nucleicos en levaduras
INTRODUCCIÓN
Los carbohidratos, en especial la glucosa, son esenciales para casi todos los organismos vivos, ya
que, a partir de su metabolismo o transformación química, las células aprovechan la energía que se
libera para el desarrollo de sus funciones vitales o para su almacenamiento en casos de necesidad
energética posterior. Los animales vertebrados mantienen los niveles de glucosa estable en sangre
con el propósito de suministrar de este combustible a órganos vitales como el cerebro. Los
carbohidratos los obtenemos de los alimentos como el pan, los tubérculos, los granos, los frutos
secos, las frutas y la leche entre otros.
Los carbohidratos se clasifican en simples y complejos. Los primeros, conocidos como

monosacáridos, presentan una única unidad monomérica. Los monosacáridos son aldehídos
polihidroxilados (aldosas) o cetonas polihidroxiladas (cetosas). Según el número de átomos de
carbono que posean pueden ser triosas, tetrosas, pentosas, hexosas, etc. Por su parte, los
carbohidratos complejos presentan más de una unidad monomérica. A ellos pertenecen los
disacáridos (lactosa, maltosa, sacarosa, etc.) y polisacáridos (glucógeno, almidón, mureina, quitina,
etc.).
Según sus propiedades químicas, los carbohidratos pueden ser diferenciados mediante reacciones
químicas específicas como la prueba de Lugol, Molisch y Benedict.
Por otra parte, Los ácidos nucleicos son biomoléculas poliméricas compuestas de nucleótidos. Las
funciones de los ácidos nucleicos incluyen el almacenamiento, transmisión y utilización de la
información genética, esencial para el funcionamiento de todos los seres vivos. El ácido
desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN), son los dos grupos en los que se clasifican
estas biomoléculas.
Un nucleótido individual consta de tres partes: una base nitrogenada derivada de la pirimidina o de
la purina, una pentosa y un grupo fosfato. Las pentosas presentes en el ADN y ARN se denominan
desoxirribosa y ribosa, respectivamente.
En el ADN la doble hélice está unida por interacciones tipo puente de hidrogeno que se dan entre
los pares Adenina=Timina (A=T) y los pares GuaninaΞCitocina (GΞC). Los grupos fosfato y los
azúcares se organizan hacia el exterior de la estructura, mientras que las bases nitrogenadas se
disponen hacia el interior de esta.
Las bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos absorben luz UV, por ello tanto el ADN como el ARN
se puede cuantificar usando un espectrofotómetro. El pico de absorción de los nucleótidos es en
260nm mientras que el de las proteínas es a 280nm. La relación 260/280 nm es una medida de la
pureza del ADN e indica lo siguiente:
A260/A280 1.8-2 ADN puro
A260/A280 < 1.8 Contaminación con proteínas o sustancias aromáticas
A260/A280 > 2 Contaminación con ARN
Los grupos fosfato de los ácidos nucleicos pueden reconocerse por la reacción de Fiske-Subbarow.
La desnaturalización térmica del ADN puede evaluarse por medición de su absorción a 260 nm, la
cual aumenta debido a la separación de las dos cadenas de polinucleótidos por ruptura de los
puentes de hidrógeno, exponiendo las bases nitrogenadas a la interacción con la radiación
incidente. Este fenómeno se denomina Efecto Hipercrómico. Cuando el sistema se enfría
rápidamente, las cadenas permanecen separadas.
ACTIVIDADES PRELABORATORIO
Consultar la guía para realizar el preinforme.
MATERIAL QUE DEBEN TRAER LOS ESTUDIANTES POR GRUPOS DE TRABAJO

1. Una papa mediana y un utensilio de cocina para pelarla
2. Levadura (aprox 2g)
REACTIVOS
Acetato de potasio 5 M, Acido ascórbico 1 mg/mL, recién preparado, Acido molíbdico 20 Mm,
Acido sulfúrico (H2SO4) concentrado, Buffer de extracción: Tris 100 mM, EDTA 50 mM, NaCl 500
mM, pH 8.0, Dodecil sulfato de sodio (SDS) 20% (P/V), HCl concentrado (37%), Isopropanol,
Patrón de almidón 2% (P/V), Patrón de glucosa 2% (P/V), Reactivo de Lugol, Reactivo de Molisch,
recién preparado, Reactivo de Benedict, Solución de citrato de sodio 1.5 mM-NaCl 15 mM.
PROCEDIMIENTO
1. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS Y OBTENCIÓN DE EXTRACTOS
1.1. Carbohidratos
Pelar y licuar una papa mediana con 200 mL de agua destilada. Proceder rápidamente
para evitar reacciones de oscurecimiento. Filtrar el licuado a través de 2 capas de gasa o
papel filtro para eliminar el residuo sólido del tejido. Decantar 10 mL del filtrado durante
15 minutos, empleando un tubo Falcon de 50 mL. Eliminar el sobrenadante y resuspender
el precipitado (almidón) en 5 mL de agua destilada. Marcar como C.
1.2. Ácidos nucleicos
Pesar 0.5 g de levadura y macerar en un mortero previamente hasta obtener un polvo

homogéneo. Adicionar 8 mL de buffer de extracción frío y macerar de nuevo. Trasvasar la
suspensión a un tubo Falcon de 15 mL y adicionar 0.5 mL de SDS 20% (P/V), mezclar con
agitación vigorosa por 2 minutos e incubar a 65ºC por 10 minutos. Adicionar 3 mL de
acetato de potasio 5 M , agitar e incubar en baño de hielo por 10 minutos. Centrifugar a
4500 rpm por 10 minutos. Medir 0.3 mL del sobrenadante obtenido y adicionarlo a un
tubo falcon que contiene 3 mL de isopropanol. Incubar la mezcla en baño de hielo por 15
minutos y centrifugar a 4500 rpm por 10 minutos. Resuspender el precipitado en 6 mL de
solución de citrato de sodio 1.5 mM - NaCl 15 mM y filtrar si observa partículas en
suspensión. Marcar como Solución A.
2. PRUEBAS DE RECONOCIMIENTO
2.1. Carbohidratos
• Prueba de Lugol (Muestras a analizar: C, patrones de glucosa y almidón, control
negativo): colocar 0,5 mL de cada una de las muestras en tubos de ensayo y adicionar 1
gota del reactivo de Lugol. Observar las coloraciones generadas.
• Prueba de Lugol ácida (Muestras a analizar: C, patrones de glucosa y almidón, control

negativo): colocar 0,5 mL de cada una de las muestras en tubos de ensayo, adicionar 10
gotas de HCl concentrado e incubar en baño maría durante 15 minutos. Enfriar y agregar
1 gota del reactivo de Lugol. Observar las coloraciones generadas.
• Prueba de Molisch (Muestras a analizar: C, patrones de glucosa y almidón, control

negativo): colocar 0,5 mL de cada una de las muestras en tubos de ensayo, agregar 2
gotas del reactivo de Molish, mezclar y agregar cuidadosamente 1 mL (20 gotas) de
H2SO4 concentrado, manteniendo los tubos inclinados. No agitar. Observar el color del
anillo formado en la interfase.
• Prueba de Benedict (Muestras a analizar: C, patrones de glucosa y almidón, control

negativo): colocar 0,5 mL de cada una de las muestras en tubos de ensayo, agregar 10
gotas del reactivo de Benedict e incubar en baño maría durante 2 minutos. Observar las
coloraciones generadas y continuar incubando por 10 minutos adicionales. Observar de
nuevo los resultados finales.
2.2. Ácidos nucleicos
• Medidas espectrofotométricas (Muestra a analizar: Solución A): registrar la

absorbancia de la muestra a 260 y 280 nm. Emplear la solución de citrato de sodio 1.5
mM - NaCl 15 mM como blanco.
• Efecto Hipercrómico (Muestra a analizar: Solución A): adicionar 3 mL de la muestra

en un tubo de ensayo e incubar en el termostato a 80ºC durante 10 minutos. Registrar
inmediatamente la absorbancia de la muestra a 260 nm. Emplear la solución de citrato
de sodio 1.5 mM - NaCl 15 mM como blanco. Comparar los resultados obtenidos con
aquellos de la prueba 1 (Medidas espectrofotométricas).
• Prueba para fosfatos (Muestra a analizar: Solución A): adicionar 1 mL de la muestra
en un tubo de ensayo y agregar 10 gotas de ácido molíbdico. Agitar y dejar en reposo
por 3 minutos. Adicionar 10 gotas de ácido ascórbico, mezclar e incubar en baño maría
por 5 minutos. Observar la coloración generada.
INFORME DE LABORATORIO
Para su informe de laboratorio debe:
1. Explicar la función de los reactivos o solventes empleados para la extracción y obtención

de la muestra C y la solución A.
2. Realizar tablas donde se muestren los resultados obtenidos para cada una de las muestras
(incluyendo patrones y control) en las diferentes pruebas realizadas.
3. Mostrar en tabla y calcular la cantidad de ADN obtenido (μg/mL), teniendo en cuenta que
1 unidad de absorbancia a 260 nm equivale a una solución de 50 μg/mL de ADN de doble
cadena usando una cubeta de cuarzo de 1 cm.
4. Comparar los valores de absorbancia a 260 nm antes y después del calentamiento
5. Realizar la correspondiente discusión de resultados.
6. Hacer recomendaciones que mejoren el resultado de la práctica.
BIBLIOGRAFIA
Guías de laboratorio de Principios de Bioquímica, 2019, Departamento de Química, Facultad de

Ciencias, Universidad Nacional de Colombia.
López Rico E, Anzola Velasco C. Guías de Laboratorio de Bioquímica para la Carrera de

Química. 2ª edición. Colección Notas de Clase. Universidad Nacional de Colombia. 2013.
Bogotá, Colombia. Práctica 3 (Página 55)
Roche. Lab FAQs. Find a Quick Solution. 4th Edition. Roche Diagnostics GmbH. 2011.
Mannheim, Germany. Capítulo 1 (Página 8)
Sadava D, Hillis DM, Heller HC, Berenbaum MY. Life. The Science of Biology. 10th edition.
Sinauer Associates, Inc. 2014. MA, USA. Capítulos 3 y 4

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1. Comprobar la presencia de carbohidratos en tubérculos utilizando reacciones específicas

Los carbohidratos se clasifican en simples y complejos. Los primeros, conocidos como

Consultar la guía para realizar el preinforme.

MATERIAL QUE DEBEN TRAER LOS ESTUDIANTES POR GRUPOS DE TRABAJO

1. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS Y OBTENCIÓN DE EXTRACTOS

1.2. Ácidos nucleicos

Pesar 0.5 g de levadura y macerar en un mortero previamente hasta obtener un polvo

• Prueba de Lugol ácida (Muestras a analizar: C, patrones de glucosa y almidón, control

• Prueba de Molisch (Muestras a analizar: C, patrones de glucosa y almidón, control

• Prueba de Benedict (Muestras a analizar: C, patrones de glucosa y almidón, control

2.2. Ácidos nucleicos

• Medidas espectrofotométricas (Muestra a analizar: Solución A): registrar la

• Efecto Hipercrómico (Muestra a analizar: Solución A): adicionar 3 mL de la muestra

Para su informe de laboratorio debe:

1. Explicar la función de los reactivos o solventes empleados para la extracción y obtención

Guías de laboratorio de Principios de Bioquímica, 2019, Departamento de Química, Facultad de

López Rico E, Anzola Velasco C. Guías de Laboratorio de Bioquímica para la Carrera de

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